JP2003274941A - ナノろ過によってタンパク溶液からウイルスを分離する方法 - Google Patents

ナノろ過によってタンパク溶液からウイルスを分離する方法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ナノろ過によってタンパク溶液からウイルス
を分離する方法の提供。 【解決手段】 この方法は、アルギニン、グアニジン、
シトルリン、尿素もしくはそれらの誘導体からなる群か
らのカオトロピック物質またはポリエトキシソルビタン
エステル群からの化合物をナノろ過前にタンパク溶液に
添加し、上記タンパク分子の会合を減少または防止し、
ついで上記溶液を15と25nmとの間である細孔径を有
するフィルターに通すことを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】本発明は、実質的に完全なウイルスの分離
を可能とするタンパク溶液のナノろ過に関する。
【0002】小タンパク分子の場合、ナノろ過はウイル
スを取り除くのに非常に有効な方法である。この点で言
えば、フィルターの細孔径は、取り除かれるべきウイル
スの実際の直径より小さくなければならない。さらに、
ナノろ過を実施する場合、温度、材料の特性および緩衝
作用条件が極めて重要である。以前の研究により、パル
ボウイルスが15nmの細孔直径を有するフィルターを使
用して確実に取り除き得ることはすでに示されていた。
ナノろ過はまた、フィルター、例えば、効果的であるこ
とが証明されているViresolve 70、 Planova 15Nおよび
Pall Ultipor DV20を用いてA型肝炎ウイルスおよびパ
ルボウイルスを第IX因子調製物から分離することにすで
に使用されていた。しかし、血液凝固第IX因子は56kD
aの低分子量を有し、したがって、ナノろ過のために使
用される膜によっては保持されない。しかし、巨大タン
パク質(例えばフィブリノーゲン、フォンビルブラント
因子および第VIII因子は、15〜35nmの大きさの節を
有するナノフィルターによってそのタンパク質をろ過し
てウイルスを除去するにはあまりにも大きすぎると考え
られていた。
【0003】フィブリノーゲンは、340kDaの六量体
(a2b2g2)の糖タンパク質である。天然のニワトリのフ
ィブリノーゲンの結晶構造は、46nmの長さを示す。顕
微鏡計測では、フィブリノーゲンが47.5nmの長さお
よび6.5nmの大きさの節をもつ3節構造を有すること
を示している。さらに水和は、フィブリノーゲン分子の
大きさの増大を導く。このために、フィブリノーゲンの
ためのろ過法は、35nmのフィルターの細孔径について
記載されているだけであった。これらの方法は、細孔径
が35nmである場合、比較的小さいA型肝炎ウイルスの
ような外膜をもたないウイルスおよびパルボウイルスを
取り除くことができないという不都合がある。したがっ
て、A型肝炎ウイルスまたはパルボウイルスも同様に取
り除くために用いることができる20nm以下の細孔径を
有するナノフィルターがたとえ利用可能であっても、現
在までこれらのフィルターをフィブリノーゲンを精製す
る場合に使用することは不可能であった。なぜなら、こ
の後者の分子はその細孔径に対してはあまりに大きすぎ
ると考えられるからである(Roberts, P., Vox Sang,199
5; 69: 82-83)。
【0004】しかしナノろ過は、タンパク溶液からウイ
ルスを取り除くのに特に穏やかな方法であり、そしてタ
ンパク質の生物学的活性度はこの点で十分に保持される
ため、ここに示された目的は、ナノろ過によってタンパ
ク溶液からウイルスを取り除く方法を発展させることに
あり、この方法は、ナノろ過のためにより大容積のタン
パク分子でも使用し得るようにすることである。
【0005】本目的は、アルギニン、グアニジン、シト
ルリン、尿素もしくはそれらの誘導体からなる群からの
カオトロピック物質またはポリエトキシソルビタンエス
テル群からの化合物が、タンパク分子の会合または上記
タンパク分子周囲の水和物の被覆の形成を減少または予
防するためにナノろ過前にタンパク溶液に添加され、次
いで上記溶液が15と25nmとの間の細孔径を有するフ
ィルターを通してろ過されることにより達成される。
【0006】本方法は、ウイルスをフィブリノーゲン溶
液からまたは血液凝固因子、例えば第VIII因子)の溶液
から分離することに特に適している。本方法は室温で実
施することができ、熱ストレスおよびそれと関連するタ
ンパク分子の生物学的活性度の損失を招くことが避けら
れる。このようにして、200〜340kDaの分子量を
有するタンパク質を15〜25nmの細孔径を使用してウ
イルスを含まないものとすることを可能とする。特に、
18〜26nmの球状の粒径を有するパルボウイルス科の
メンバーならびに6〜17nmの直径および約48nmの長
さの桿菌形の構造を有するA型肝炎ウイルスを取り除く
ことができる。
【0007】これに加えて、本発明によるろ過法は、非
常に成功裡に従来の低温殺菌法と組み合わせることがで
き、ウイルスの除去をなおさらに増大させる結果を生じ
る。本発明による方法のために使用されるナノフィルタ
ーは市販されており、例えば、とりわけ、名称DV-15お
よびDV-20で購入することができる。
【0008】添付の図1は、ナノろ過によって得られる
ウイルスを含まないフィブリノーゲン溶液の量が、一方
はフィルターの細孔径に、そして他方はアルギニン一塩
酸塩の添加にどれほど依存するかを示している。アルギ
ニン一塩酸塩が添加される場合、細孔径が15nmだけであ
る場合でも、満足な量のフィブリノーゲンのろ液が得ら
れることを示すことができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】ナノろ過によって得られるウイルスを含まない
フィブリノーゲン溶液の量がフィルターの細孔径と添加
されたアルギニン一塩酸塩にどれほど依存するかを示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハインリッヒ・シュナイダー ドイツ連邦共和国35094ラーンタール.イ ム・シュテレフェルト20 Fターム(参考) 4B065 AA95X BD18 BD22 BD33 BD34 BD38

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 アルギニン、グアニジン、シトルリン、
    尿素もしくはそれらの誘導体からなる群からのカオトロ
    ピック物質またはポリエトキシソルビタンエステル群か
    らの化合物が、タンパク分子の会合を減少または防止す
    るためにナノろ過前にタンパク溶液に添加され、そして
    上記溶液が15と25nmとの間の細孔径を有するフィル
    ターに通されることを特徴とする、ナノろ過によってタ
    ンパク溶液からウイルスを分離する方法。
  2. 【請求項2】 ウイルス分離がフィブリノーゲン溶液に
    おいてまたは血液凝固因子の溶液において実施されるこ
    とを特徴とする請求項1に記載の方法。
  3. 【請求項3】 ナノろ過が室温で実施されることを特徴
    とする請求項1または2に記載の方法。
  4. 【請求項4】 ナノろ過に加えて、タンパク溶液を低温
    殺菌法に付する請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
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