KR20030074461A - 나노여과에 의해서 단백질 용액으로부터 바이러스를 분리제거하는 방법 - Google Patents

Abstract

나노여과에 의해서 단백질 용액으로부터 바이러스를 분리 제거하는 방법이 기재되어 있고, 여기서, 아르기닌, 구아니딘, 시트룰린, 우레아 또는 이의 유도체로 이루어진 그룹으로부터의 카오트로픽 물질, 또는 폴리에톡시소르비탄 에스테르 그룹으로부터의 화합물이 단백질 분자의 응집을 감소시키거나 예방하기 위해서 나노여과에 앞서 단백질 용액에 부가되고, 이어서 용액을 15 내지 25nm의 세공 크기의 여과기에 통과시킨다.

Description

나노여과에 의해서 단백질 용액으로부터 바이러스를 분리 제거하는 방법{Method for separating off viruses from a protein solution by means of nanofiltration}

본 발명은 단백질 용액의 나노여과에 관한 것으로, 이 방법에 의해서 바이러스를 실질적으로 완전하게 분리할 수 있다.

소단백질 분자의 경우, 나노여과는 바이러스를 제거하는데 매우 효과적인 방법이다. 이와 관련하여, 여과기의 세공 크기는 제거될 바이러스의 유효 직경보다 작아야한다. 또한, 온도, 물질의 특성 및 완충 조건은 나노여과를 수행할 때 결정적으로 중요하다. 종래 연구에서 파보바이러스는 15nm의 세공 직경의 여과기를 사용하여 용이하게 제거될 수 있다는 것이 이미 증명되었다. 또한, 나노여과는 인자 IX 제제로부터 A형 간염 바이러스 및 파보바이러스를 분리 제거하는데 이미 사용되어 왔고, Viresolve 70, Planova 15 N 및 Pall Ultipor DV20과 같은 여과기가 효과적인 것으로 증명되었다. 그러나, 혈액 응고 인자 IX는 56kDa의 저분자량이고, 따라서 나노여과를 위해 사용되는 막으로 유지되지 않는다. 그러나, 피브리노겐, 폰 빌레브란트 인자 및 인자 VIII와 같은 큰 단백질은 너무 커서 15 내지 35nm의 노드 사이즈의 나노여과기를 통하여 이들을 여과시키는 것에 의해 바이러스를 분리시킬 수 없는 것으로 지금까지 간주되어 왔다.

피브리노겐은 340kDa의 육량체(a₂b₂g₂) 당단백질이다. 천연 병아리 피브리노겐의 결정 구조는 46nm의 길이를 나타낸다. 전자 현미경 측정으로 피브리노겐이 47.5nm 길이 및 6.5nm의 노드 크기인 3-노드 구조를 갖는 것이 증명되었다. 추가로, 수화작용으로 인하여 피브리노겐 분자의 크기가 증가한다. 이러한 이유로, 지금까지 피브리노겐에 대한 여과 방법은 35nm의 여과기 세공 크기에 대해서만 기술되었다. 이들 방법은 세공 크기가 35nm인 경우, A형 간염 바이러스 및 파보바이러스와 같은 비교적 작은 비외피성 바이러스는 제거될 수 없다는 단점이 있다. A형 간염 바이러스 또는 파보바이러스를 제거하기 위해 사용될 수 있는 20nm 이하의 세공 크기인 나노여과기가 사용될 수 있다고 해도, 피브리노겐 분자가 상기 세공 크기에 대해 지나치게 거대한 것으로 간주되었으므로, 피브리노겐을 정제하는 경우 이들 여과기를 사용하는 것은 지금까지 불가능했다[참고문헌: Roberts, P., VoxSang, 1995; 69; 82-83].

그러나, 나노여과는 단백질 용액으로부터 바이러스를 제거하기 위한 특히 온화한 방법으로 단백질의 생물학적 활성이 이와 관련하여 완전하게 보존되므로,나노여과에 의해 단백질 용액으로부터 바이러스를 제거하는 방법을 개발하는 그 자체가 본 발명의 목적이고, 이 방법은 큰-부피의 단백질 분자에 조차 나노여과에 이용가능할 수 있도록 사용될 수 있다.

도 1은 나노여과에 의해 수득되는 바이러스가 없는 피브리노겐 용액의 양이, 한편으로는 여과기의 세공 크기, 다른 한편으로는 아르기닌 모노하이드로클로라이드의 부가에 따라 얼마나 좌우되는지를 도시한 것이다.

당해 목적은 아르기닌, 구아니딘, 시트룰린, 우레아 또는 이의 유도체로 이루어진 그룹으로부터의 카오트로픽 물질, 또는 폴리에톡시소르비탄 에스테르 그룹으로부터의 화합물을 단백질 분자의 응집, 또는 분자 둘레에 수화물 외막(sheath)의 형성을 감소시키거나 예방하기 위해서 나노여과에 앞서 단백질 용액에 부가하고, 이어서 용액을 15 내지 25nm의 세공 크기의 여과기를 통해 여과시키는 방법에 의해 이루어진다.

본 방법은 피브리노겐 용액으로부터, 또는 혈액 응고 인자, 예를 들어, 인자 VIII의 용액으로부터 바이러스를 분리 제거하는데 특히 적절하다.

본 방법은 열응력을 야기하는 실온에서 수행될 수 있고, 이와 관련된 단백질 분자의 생물학적 활성의 손실을 피할 수 있다. 이러한 방법으로, 15 내지 25nm의세공 크기를 사용하여 200 내지 340kDa의 분자량인 단백질로부터 바이러스를 분리시킬 수 있다. 특히, 18 내지 26nm의 구형의 입자 크기인 파보바이러스 패밀리의 구성원, 및 직경 6 내지 17nm 및 길이 약 48nm의 막대 모양 구조의 A형 간염 바이러스를 이러한 방식으로 제거할 수 있다.

이에 부가하여, 본 발명에 따른 여과 방법은 통상적인 저온살균 방법과 매우 성공적으로 배합되어, 더욱 추가로 증가된 바이러스 고갈을 야기한다.

본 발명에 따른 방법에 사용되는 나노여과기는 시판중이고, 예를 들어, 상품명 DV-15 및 DV-20으로 구입할 수 있다.

첨부된 도 1은 나노여과에 의해 수득되는 바이러스가 없는 피브리노겐 용액의 양이, 한편으로 여과기의 세공 크기, 다른 한편으로는 아르기닌 모노하이드로클로라이드의 부가에 따라 얼마나 좌우되는지를 도시한 것이다. 아르기닌 모노하이드로클로라이드가 부가된 경우, 만족스러운 양의 피브리노겐 여과물이 세공 크기가 단지 15nm인 경우에 조차 수득될 수 있다는 것을 알 수 있었다.

단백질 용액에 아르기닌등의 카오트로픽제를 부가하여 나노여과하면, 단백질의 생물학적 활성을 유지시키면서 바이러스를 효과적으로 분리 제거할 수 있다.

Claims (4)

1. 아르기닌, 구아니딘, 시트룰린, 우레아 또는 이의 유도체로 이루어진 그룹으로부터의 카오트로픽 물질, 또는 폴리에톡시소르비탄 에스테르 그룹으로부터의 화합물을 단백질 분자의 응집을 감소시키거나 예방하기 위해서 나노여과에 앞서 단백질 용액에 부가하고, 이어서 용액을 15 내지 25nm의 세공 크기의 여과기를 통해 통과시키는 것을 특징으로 하는, 나노여과에 의해 단백질 용액으로부터 바이러스를 분리 제거하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 바이러스 분리가 피브리노겐 용액 또는 혈액 응고 인자의 용액에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 나노여과를 실온에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 나노여과 이외에 단백질 용액을 저온살균하는 것을 특징으로 하는 방법.