NO326670B1 - Metode for utseparering av virus fra en proteinlosning ved hjelp av nanofiltrering. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører nanofiltrering av proteinløsninger hvorved det er mulig å sepa-rere bort praktisk talt alle virus.

I tilfeller med små proteinmolekyler er nanofiltrering en meget effektiv metode for å fjerne virus. I denne sammenhengen må porestørrelsen på filteret være mindre enn den effektive diameter til viruset som skal bli fjernet. I tillegg er temperaturen, egenskapene til materialene og bufferbetingelsene av stor betydning for utførelse av nanofiltreringen.

Tidligere studier viser at parvovirus kan bli fjernet pålitelig ved å bruke filtre som har en porediameter på 15 nm. Nanofiltrering har allerede blitt brukt for utseparering av hepatitt A-virus og parvovirus fra faktor IX-preparater, hvor filtre slik som Viresolve 70, Planova 15 N og Pall Ultipor DV20 har vist seg å være effektive. Blodkoagulerings-faktor IX har imidlertid en lav molekyl vekt på 56 kDa og blir derfor ikke holdt tilbake av membranene anvendt for nanofiltrering. Store proteiner, slik som fibrinogen, von Willebrand-faktor og faktor VTII, har imidlertid så langt blitt ansett som for store til å bli frigjort fra virus ved filtrering gjennom et nanofilter med en porestørrelse fra 15 til 35 nm.

Fibrinogen er et 340 kDa heksamerisk (a2b2g2)-glykoprotein. Krystallstrukturen til na-turlig kyllingifbrinogen viser en lengde på 46 nm. Elektronmikroskopiske målinger har vist at fibrinogen har en tre-nodestruktur med en lengde på 47,5 nm og en nodestørrelse på 6,5 nm. I tillegg gjør hydrering at fibrinogenmolekylet øker i størrelse. Av denne grunn har filtreringsmetoder for fibrinogen bare blitt beskrevet for filterporestørrelse på 35 nm. Disse metodene har den ulempen at når porestørrelsen er 35 nm kan relativt små ikke-kappe virus, slik som hepatitt A-virus og parvovirus, ikke bli fjernet. Selv om nanofiltre med en porestørrelse på 20 nm eller mindre, som kan bli anvendt for å fjerne hepatitt A-virus og parvovirus, er tilgjengelig, så har det ikke vært mulig opptil nå å bruke disse filtrene for rensing av fibrinogen siden dette siste molekylet er ansett som for stort for denne porestørrelsen (Roberts, P., Vox Sang, 1995; 69: 82-83).

Fra W099/64441 er det kjent en fremgangsmåte for å fremstille en virustrygg farmasøytisk sammensetning ved anvendelse av ikke-ioniske detergenter, som for eksempel polyoksyetylen sorbitan ester, etterfulgt av nanofiltrering. Denne fremgangsmåten anvendes for proteiner, spesielt a-IFN, med en molekylvekt lavere enn 180kDa, spesielt omtrent 20 kDa.

US644774 vedrører stabiliserte protein preparater samt stabilisering av proteiner. Spesielt er det foreslått å tilsette en kaotropisk substans til nevnte protein preparat for å unngå eller redusere fibrinogen aggregering.

Ettersom nanofiltrering imidlertid er en spesielt mild metode for å fjerne virus fra prote-inløsninger, og den biologiske aktiviteten av proteinene fullt ut er preservert i denne sammenhengen, ble målet å utvikle en metode for å fjerne virus fra proteinløsninger ved hjelp av nanofiltrering, hvis metode kan bli anvendt til å gjøre til og med storvolum-proteinmolekyler tilgjengelige for nanofiltrering.

Dette målet er oppnådd ved hjelp av en metode hvor en kaotropisk substans fra gruppen omfattende arginin, guanidin, citrullin, urea eller deres derivater tilsettes proteinløsningen før nanofiltrering for å minske eller motvirke aggregering av proteinmolekyler, hvor løsningen så blir ført gjennom et filter med en porestørrelse på mellom 15 og 25 nm.

Metoden er spesielt egnet for utseparering av virus fra en fibrinogen løsning eller fra en løsning av en blodkoaguleirngsfaktor, for eksempel faktor Vffi.

Metoden kan bli utført ved romtemperatur slik at termisk stress og tap av proteinmolekylenes biologisk aktivitet unngås. På denne måten er det mulig for proteiner med molekylvekt fra 200 til 340 kDa å bli frigjort fra virus ved å bruke en porestørrelse fra 15 til 25 nm. Spesielt kan medlemmer av parvovirusfamilien, som har en globulær partikkelstørrelse fra 18 til 26 nm, og hepatitt A-virus, som har en stavformet struktur fra 6 til 17 nm i diameter og omkring 48 nm i lengde, bli fjernet på denne måten.

I tillegg til dette kan filtreringsmetoden i henhold til oppfinnelsen bli meget fordelaktig kombinert med en konvensjonell pasteuriseirngsmetode, resulterende i økt virusfjer-ning.

Nanofiltrene som er brukt i metoden i henhold til oppfinnelsen er tilgjengelig kommer-sielt og kan kjøpes, f.eks., under betegnelsene DV-15 og DV-20.

Figur 1, som er vedlagt som anneks, viser hvordan mengden av virusfritt fibrinogenløs-ning, som er oppnådd ved hjelp av nanofiltrering, på den ene side er avhengig av porestørrelsen på filteret og på den andre side på tilsetning av arginin-monohydroklorid.

Det kan ses at når arginin-monohydroklorid er tilsatt, så er tilfredsstillende mengder av fibrinogenfiltrat oppnådd selv når porestørrelsen bare er 15 nm.

Claims (4)

1. Metode for utseparering av virus fra en proteinløsning, hvor proteinene har en molekylvekt fra 200 til 340 kDa, ved hjelp av nanofiltrering, karakterisert ved at en kaotropisk substans fra gruppen omfattende arginin, guanidin, citruUin, urea eller deres derivater tilsettes proteinløsningen før nanofiltrering for å minske eller motvirke aggregering av proteinmolekyler, hvor løsningen så blir ført gjennom et filter med en porestørrelse på mellom 15 og 25 nm.

2. Metode i henhold til krav 1, karakterisert ved at virusseparasjonen blir utført i en fibrinogenløsning eller i en løsning av blodkoaguleringsfaktorer.

3. Metode i henhold til kravene log2, karakterisert ved at nanofiltreringen blir utført ved romtemperatur.

4. Metode i henhold til kravene 1 til 3, karakterisert ved at, i tillegg til nanofiltreringen, er proteinløsningen underlagt pasteurisering.