CN104321340B

CN104321340B - 用于生产纤维蛋白原的改进工艺及其生产的纤维蛋白原

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Publication number: CN104321340B
Application number: CN201380013042.2A
Authority: CN
Inventors: 佩特拉·舒尔茨; 维尔纳·格林格; 弗里德里希·舍恩; 卡罗琳·赖丁格; 乔根·诺米生; 莱纳·佩普
Original assignee: Octapharma AG
Current assignee: Octapharma AG
Priority date: 2012-03-13
Filing date: 2013-03-12
Publication date: 2018-11-09
Anticipated expiration: 2033-03-12
Also published as: CN104321340A; AU2013231321B2; EP2825555B1; WO2013135684A1; MX351340B; US10112972B2; ES2642383T3; AU2013231321A1; MX2014010492A; US20190016755A1; EP2825555A1; US20150045539A1; RU2663792C2; RU2014139974A; US11401300B2

Abstract

一种工艺，其通过在一种或多种螯合剂的存在下利用沉淀剂从含有纤维蛋白原的溶液中沉淀纤维蛋白原并且从纤维蛋白原糊剂中除去上清液而用于从含有纤维蛋白原的来源中纯化纤维蛋白原，特征在于，从形成含有纤维蛋白原的液体级分的糊剂和与液体分离的未溶解的残余物中提取纤维蛋白原。

Description

用于生产纤维蛋白原的改进工艺及其生产的纤维蛋白原

技术领域

本发明涉及一种用于从含有纤维蛋白原的来源中纯化纤维蛋白原的工艺、一种可根据本发明的工艺而获得的纤维蛋白原产物以及一种选自由支撑材料组成的组团(group)的、用于纯化或制造纤维蛋白原产物的阴离子交换树脂，其中该支撑材料包括具有接枝的叔氨基或季氨基的羟基化聚合物主链。

背景技术

纤维蛋白原也被称为凝血因子I，在止血和伤口愈合中起到关键作用。它是在肝脏中合成的糖蛋白，表观分子量为340,000Da，由两个二聚体组成，其中，每个二聚体由三对不同的由二硫键链接的称为Aα、Bβ和γ多肽链构成。纤维蛋白原在浓度约为1.5mg/ml～4.0mg/ml的条件下于血流中循环。当血管受损时，血小板被激活，并形成栓。纤维蛋白原就通过促进被激活的血小板的交联，而参与到初期止血。

引发了凝血连锁反应的并行激活。纤维蛋白原作为终点，通过由凝血酶对血纤维蛋白肽A和血纤维蛋白肽B(以较慢的速率)进行的蛋白水解释放，而被转化为纤维蛋白。该可溶性纤维蛋白单体被聚集到双链绞合原纤维。随后，这些原纤维以横向方式排列，使纤维变粗。然后，这些纤维通过FXIIIa交联到纤维蛋白网，其通过被激活的血小板和纤维蛋白之间相互作用稳定血小板栓，从而获得稳定的凝块。

疾病和缺陷

先天性异常纤维蛋白原血症(afibrinogenemia)是一种罕见的出血性疾病，由于缺乏纤维蛋白原或纤维蛋白原异常，使患者凝血不足。这种疾病在轻微创伤之后或在介入治疗期间，可能会导致自发性出血事件或出血过多。

纤维蛋白原中的获得性缺陷比先天性异常纤维蛋白原血症更加常见，并且可能是由血液稀释或其它诸如在手术过程中的失血、外伤、弥散性血管内凝血(DIC)或败血症之类的事件诱发的。

纤维蛋白原缺陷能够使用静脉注射新鲜冷冻血浆或冷沉淀物通过替代疗法被校正到血浆中约1.5g/l～4g/l的正常纤维蛋白原水平。然而，这些治疗伴随着将病毒或朊病毒等病原体引入到患者体内的风险，并由此引发其他疾病。因此，最好以静脉内施用病毒灭活的纤维蛋白原组合物采用保存方式来恢复生理水平上的纤维蛋白原。

虽然称为纤维蛋白胶、纤维蛋白原粘合剂、组织胶等的制剂中存在纤维蛋白原，但是这些制剂作为粉末、糊剂、泡沫剂或与织物结合作为膏药在伤口上局部使用，由于其粘稠度以及组成会在被注射时立即引发血栓形成事件，所以，它们不能用于静脉内施用。另外，这些制剂还含有凝血酶、钙盐以及较高量的凝血因子XIII。这种制剂的示例包括US-A1-2008/003272，WO-A-95/22316或US-A1-2008/181878。

纤维蛋白原的生产工艺源自EP-A1-1 240 200，其涉及一种从含纤维蛋白原的溶液中纯化纤维蛋白原的方法，包括：在纤维蛋白原结合到基质上的这种条件下将含纤维蛋白原的溶液施用到离子交换基质，使用包括至少一种ω-氨基酸的缓冲溶液(buffersolution)洗涤离子交换基质，使用由10mM的Tris、10mM的柠檬酸，45mM的蔗糖和浓度为200mM～1.0M的NaCl组成的缓冲液(buffer)从基质中洗脱纤维蛋白原，以及可选地从洗出液中回收纤维蛋白原。

EP-A1-0 771 324是指一种用于生产无病毒的纤维蛋白原浓缩物的工艺，该浓缩物是通过如下方式获得的：将溶解的含有纤维蛋白原的血浆级分进行化学病毒灭活处理，即S/D或溶剂/去污剂处理，在酸性pH下在含有氨基酸的溶液中将所得病毒灭活的级分进行沉淀，得到上清液，过滤上清液，得到纯化的纤维蛋白原浓缩物，并回收纯化的纤维蛋白原浓缩物。对所回收的纤维蛋白原浓缩物进行紫外线辐射用于第二次病毒灭活。在第三次病毒灭活步骤之前稳定并且冻干产物。

EP-A1-1 519 944提出在纤维蛋白原和纤溶酶原结合到基质上的条件下使用固定化金属离子亲和色谱分析基质，以及选择性地分别从基质中洗脱纤维蛋白原以及93％的纤溶酶原。

EP-A1-0 555 135公开了一种基于包括季铵基的交联琼脂糖通过借助于阴离子交换凝胶纯化纤维蛋白原溶液来生产纤维蛋白原的方法。所生产的纤维蛋白原据称不含因子VIIIc。

EP-A1-1 457 497是指一种用于除去纤维蛋白原溶液中的病毒的工艺，其特征在于对溶液进行稳定和冷冻以及随后的解冻。在稀释蛋白质之前分离未溶解的物质，随后，使用孔径小于35nm的过滤器纳滤所得溶液。

US-A1-2006/0009376也公开了一种用于制造纤维蛋白原的方法，包括对纤维蛋白原进行反复溶解和沉淀以除去因子XIII。

WO-A2-2009/155626是指一种通过在3℃～5℃的温度范围内在EDTA溶液中溶解冷沉淀物或Cohn级分I、然后在2℃～4℃的温度范围内进行分级沉淀以及在EDTA溶液中溶解最后的沉淀物来纯化纤维蛋白原的工艺。在EDTA存在的情况下，使用S/D试剂进行病毒灭活，并进行纳滤来提高病原体的安全性。通过添加AT-III、肝素辅因子II和C1酯酶抑制剂，来完成抑制所生产的浓缩物中残余量的蛋白酶。

US-B2-7,919,592介绍了一种通过添加选自精氨酸、胍、瓜氨酸和尿素、其盐类或衍生物的离液序列高的物质和随后通过各种孔径的纳米过滤器的过滤从纤维蛋白原溶液中除去病毒的方法。

Goheen，S.C.等人在色谱分析法杂志A辑(Journal of Chromatography A)816(1998)89-96中报道了关于在含有季胺基或磺丙基官能团的无孔柱材料上对血浆蛋白质白蛋白、纤维蛋白原和免疫球蛋白(G)进行的HPLC离子交换色谱分析。

发明内容

本发明的一个目的是提供在生产工艺中使用专用病原体消除和/或灭活步骤制造的纤维蛋白原浓缩物，从而克服病原体相关疾病的不良反应或发展。所述的病原体选自细菌、病毒和朊病毒(诸如朊病毒蛋白瘙痒病(PrP^sc))的组团。

一般而言，纳滤是一种从通过纳米过滤器的蛋白质中除去病毒的方法，然而，因为纤维蛋白原是一种非常大且粘稠的蛋白质，常常堵塞过滤器孔并导致产物的最终损耗，所以通过纳滤从纤维蛋白原中分离病毒是富有挑战性的。如US-B2-7,919,592所提出的，克服这种问题的一种途径是添加离液序列高的物质来改善过滤性，而根据国际申请WO-A1-2012/038410的工艺所生产的稀释的纤维蛋白原溶液的纳滤，在未添加离液序列高的物质的情况下显示了可比的过滤性。根据本发明的离液序列高的物质正如作为参考并入的US-B2-7,919,592中所限定的，指的是精氨酸、胍、瓜氨酸和脲，及其盐类或衍生物。

本申请的另一个目的是提供一种以工业水平(即几百至数千升诸如血液或血浆之类的原料)制造浓缩物的工艺，当然，1/10升到若干升的小规模生产也是可能的。

这些和其它目的是通过一种权利要求1至18所述的工艺、一种可通过本发明的工艺获得的如权利要求19至24所要求保护的产物以及权利要求25所述的用途来完成的。

图1描绘了在非还原条件下的SDS-Page，图2描述了在相同样品的还原条件下的SDS-Page。

根据本发明，令人惊奇的发现，通过在一种或多种螯合物的存在下沉淀中间产物纤维蛋白原糊剂，然后从中间产物提取纤维蛋白原，只要纤维蛋白原溶液的过滤性优于通过WO-A1-2012/038410的工艺生产的纤维蛋白原溶液的过滤性。

此外，还令人惊奇的发现，即使使用可以保留小于35nm的颗粒的纳米过滤器，只要在沉淀之前一次添加非常少量的至少一种螯合剂使螯合剂的总浓度约为3mM～10mM，仍然足以让本发明实现良好的产率和过滤性。可以在下游除去剩余量的螯合剂来提供最终产物，即在低于用于EDTA的0.08μg/ml的检测限内不含螯合剂的纤维蛋白原浓缩物。优选一种不含螯合剂的产物，这是因为例如EDTA是一种已知的抗凝血剂。因此，大量存在的EDTA对纤维蛋白原产物的效果起到相反的作用。

因此，所有在沉淀下游使用的缓冲液(例如用于色谱分析的平衡缓冲液、洗涤缓冲液以及洗脱缓冲液或在通过超滤/渗滤进行浓缩期间使用的缓冲液)不应含Ca²⁺螯合剂，这在下文进行说明。最终存在的残余量的螯合剂可以通过超滤/渗滤从含有纤维蛋白原的溶液中除去。如果这种除去应当有必要，则在该工艺结束的时候特别是在浓缩或配制期间通过超滤/渗滤来执行是有利的。通过静脉通道全身施用这种不含螯合剂的纤维蛋白原可以治疗先天性异常纤维蛋白原血症和获得性纤维蛋白原缺陷。施用该标准化的纤维蛋白原浓缩物可以在紧急情况下进行快速治疗而不用费时解冻新鲜冰冻血浆，降低容量负荷，并且由于组成基本不变所以具有可靠的凝结特性。与在WO-A1-2012/038410中公开的产物相比，增加浓度的凝血因子XIII也支持伤口的局部给药或用作组织胶。

此外，还令人惊奇地发现，当在一种或多种螯合物存在下沉淀中间产物纤维蛋白原糊剂时，无需在本发明的工艺的任何步骤添加蛋白酶抑制剂。从现有技术文献得知，使用蛋白酶抑制剂(诸如C1蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂、凝血酶抑制剂、抗凝血酶III(AT-III)、肝素辅因子II、抑蛋白酶肽、抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽和特别是ε-氨基己酸(ε-ACA))来避免纤维蛋白原的降解。本发明的纤维蛋白原浓缩物既未显示出可测量的蛋白水解活性也未显示出可测量的AT-III浓度。

通常，本发明的用于从含有纤维蛋白原的来源中纯化或制造纤维蛋白原的工艺，包括步骤：

-在含有纤维蛋白原的来源中添加至少一种沉淀剂之前，通过添加螯合剂而形成富含纤维蛋白原的沉淀物；

-例如通过所述沉淀物的离心而分离富含纤维蛋白原的沉淀物；

-在不含螯合剂的水介质中从富含纤维蛋白原的沉淀物中提取纤维蛋白原，从而形成含有纤维蛋白原的溶液，接着可选地进行过滤和/或超滤/渗滤；

-在纤维蛋白原结合到具有强阴离子交换剂基团的固定相的条件下，通过使所述溶液与所述相接触，在所述相上对含有纤维蛋白原的溶液进行色谱分析；

-接着，借助具有比上述步骤的离子强度高的离子强度的水溶液从固定相中洗脱纤维蛋白原，得到富含纤维蛋白原的级分，其中该级分被收集；

-接着，可选地进行随后的富含纤维蛋白原的级分的稀释和/或浓缩步骤；

-以及，可选地，将富含纤维蛋白原的级分灌装到合适的小瓶中，同时省去添加蛋白酶抑制剂。

在本发明的制造工艺的一个实施例中，含有纤维蛋白原的来源选自由血浆、血浆级分(诸如级分I，或冷沉淀物)、生产纤维蛋白原的细胞培养物和/或所述细胞培养物的上清液组成的组团。如果不使用冷沉淀物作为原料，那么通过Cohn、Kistler-Nitschmann所公开的公知方法及其修改而生产作为原材料的含有纤维蛋白原的中间产物。

为了获得药学上可用的产物，对含有纤维蛋白原的来源进行至少一种病毒灭活工艺(例如作为参考并入的EP-A1-0 131 740所公开的溶剂去污剂工艺)是有利的。

根据本发明的另一个实施例，在形成富含纤维蛋白原的沉淀物之前，执行病毒灭活。然而，也可以在不同的阶段进行病毒灭活。

根据本发明的又一个实施例，使用强阴离子交换剂通过油提取和/或色谱分析来除去病毒灭活物质。另一种病毒除去方法是纳滤，由于纤维蛋白原提取之后聚合物的含量低，所以同样也能很好地使用小于35nm的过滤器执行纳滤，而无需添加离液序列高的物质。

本发明的制造工艺中使用的通常的沉淀剂选自由诸如甘氨酸的氨基酸、聚乙二醇或高盐浓度组成的组团，其中盐含有一价金属离子，该沉淀剂更特别是选自碱金属、或铵的组团。

根据本发明的又一实施例，使用pH为7.5～8.5的缓冲液从富含纤维蛋白原的沉淀物中提取纤维蛋白原10分钟～120分钟。

根据本发明的再一实施例，该固定相具有叔氨基或季氨基。

本发明的制造工艺中的层析步骤可以特别地在柱中执行。

通常地，所灌装的富含纤维蛋白原的级分的储存形式为液体状态、冷冻状态(温度优选小于-15℃，最优选低于-30℃)、或冻干形式。

本发明的工艺具体地包括步骤：

a)溶解冷沉淀物，其在大约中性pH下溶解，

b)使用Al(OH)₃吸附溶液并除去所得凝胶，

c)对在步骤b)中所得的溶液通过溶剂/去污剂(S/D)处理而进行病毒灭活，使用植物油萃取S/D试剂，并使水相与TMAE树脂接触，

d)在步骤c)中所得的水相中添加至少一种螯合剂，以获得例如为3mM～100mM的螯合剂浓度，

e)通过添加甘氨酸，从步骤d)中的含有螯合剂的水相中沉淀纤维蛋白原，直至达到大约1M甘氨酸的最终浓度，并分离所得的纤维蛋白原糊剂，

f)通过pH为约8.0的20mM的TRIS缓冲液从纤维蛋白原糊剂中提取纤维蛋白原，过滤，以及

g)将步骤f)的所过滤的溶液上样到阴离子交换树脂上，并使用电导率约为12.0mS/cm的洗涤缓冲液洗去松散结合的物质，其中该阴离子交换树脂包括通过连接基团接枝到羟基化的甲基丙烯酸聚合物主链上的三甲基氨基，

h)使用洗脱缓冲液来洗脱纤维蛋白原，该洗脱缓冲液含有约1.5g/l的柠檬酸钠、约7.0g/L的氯化钠和约10.0g/l的甘氨酸，特别是被调节到pH约为7.0和电导率为13.1mS/cm～15mS/cm，

i)在至少一个纳米过滤器上进行过滤，

j)浓缩、配制、无菌过滤灌装和可选地冻干。

本发明的主题也是一种能够根据本发明的制造工艺而获得的富含纤维蛋白原的级分。

纤维蛋白原浓缩物在无菌过滤后被灌装到最终容器中，其可以采用液体、液体冷冻或冻干形式进行存储。合适的容器是指小玻璃瓶或瓶或塑料袋，该塑料袋最终包括膜，当袋子被紧密地密封用于流体时，该膜允许冻干。

根据本工艺生产的纤维蛋白原的特征是杂质含量非常低，其确保了产物的生成并允许对有需要的人进行长期治疗。在所含有的浓度下优选FXIII，因为它有助于所形成的血纤维蛋白的稳定，同时避免了这种转谷氨酰胺酶的过载。

术语″包括(comprising)″、″包括(comprise)″或″包括(comprises)″也可以被替换成″由......组成(consisting)″、″由......组成(consist)″或″由......组成(consists)″，而不更改说明书的公开。

具体实施例

一般而言，虽然根据本发明，所有含有纤维蛋白原的来源都可以使用，但冷沉淀物是优选来源，并且下文在本发明的制造工艺的进一步的描述中冷沉淀物用作纤维蛋白原的通常来源。

通常地，在合适的缓冲液的条件下特别是在约为中性pH【例如在含有柠檬酸钠和NaCl的溶液缓冲(solution buffer)中为6.9～7.0】下重组或溶解冷沉淀物，特别是使用Al(OH)₃对其吸附，并且(例如)通过离心除去所得凝胶。然后，上清液可以通过(例如)溶剂/去污剂(S/D)处理进行病毒灭活。该方法被本领域技术人员所熟知，并且已经最初在EP-A1-131 740中描述过。S/D化合物【诸如Triton(辛基苯氧基聚乙氧乙醇)和TnBP(磷酸三丁酯)】特别是使用蓖麻油通过萃取来除去。为进一步纯化，可对水相进行色谱分析工艺。通常地，这可以通过使水相与强阴离子交换凝胶接触来执行，该强阴离子交换凝胶即接枝在基质材料(诸如EMD-TMAE)上的三甲基氨乙基(TMAE)。如果使用pH值为6.9～7.1以及渗透压重量摩尔浓度为570mosmol/1～610mosmol/l的缓冲液执行色谱分析，则可达到良好的结果。在纤维蛋白原没有结合到固定相上进而在直流或上清液中被发现的这些条件下，如果是分批色谱分析工艺，则后者被执行。

使用含有至少一种螯合剂的缓冲液来将未结合的纤维蛋白原溶液【通常含有约40g/l(克劳斯浊度分析方法)】调节到pH为7.0～8.0，特别是7.3～7.5。合适的螯合剂为Ca²⁺螯合剂，特别是浓度为3mM～100mM(特别是5mM～50mM，甚至更特别是5mM～20mM)的1，2-双(邻氨基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(BAPTA)、二乙三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)和次氮基三乙酸(NTA)。此后添加合适的沉淀剂例如甘氨酸直到最终浓度为0.8M～1.2M，特别是0.9M～1.1M，可以将所得溶液搅拌60分钟～120分钟以沉淀纤维蛋白原。如果省去低温沉淀，那么在+4.1℃～+40℃的温度范围内，特别是在+5℃～37℃的温度范围内，更特别是在5.1℃～30℃的温度范围内，甚至更特别是在10℃～20℃的温度范围内，可以执行沉淀。然后，可以通过离心来分离含有纤维蛋白原的沉淀物，该中间产物纤维蛋白原糊剂可以在温度小于等于-60℃下优选在-100℃～-65℃的温度范围内存储至少6个月，但是如果不立即处理中间产物纤维蛋白原糊剂，则优选的储存时间为一天至6个月。例如使用甘氨酸的单次沉淀已经提供了一种纤维蛋白原糊剂，其纯度足以用于进一步加工。

然后，使用pH值为7.5～8.5的10mM～30mM的不含螯合剂的三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液(Tris缓冲液)，特别是pH为7.5～8.5的15mM～25mM的Tris缓冲液，从由此制备的中间产物中提取纤维蛋白原。在搅拌期间进行提取10分钟～120分钟，特别是15分钟～90分钟，甚至更特别是20分钟～60分钟。然后，可以过滤掉所获得的悬液，并且例如使用5倍的相同或不同的缓冲液的悬液体积对所获得悬液进行超滤/透滤。

然后，将所得的含有纤维蛋白原的溶液上样到优选选自叔氨基或季氨基的组团作为配体接枝到基质上的阴离子交换凝胶。所述官能团选自公知的二乙氨基乙醇(DEAE)或，在强阴离子交换凝胶的情况下，选自三甲基氨基、三甲基氨乙基(TMAE)和其他基团等组团，而该载体材料可以由纤维素、琼脂糖、硅石、聚合物或陶瓷材料构成。可以使用通过连接基团(诸如GigaCapQ-)接枝到羟基化的甲基丙烯酸聚合物的三甲基氨基上来获得特别是在纤连蛋白和玻连蛋白的还原中的良好的结果。这非常令人吃惊，因为化学性质相似的Marco-Prep High 在所述两种蛋白的还原中效率较低，其中，Marco-Prep High 是由二乙二醇二甲基丙烯酸酯/甲基丙烯酸缩水甘油酯构成的甲基丙烯酸共聚物，同样具有三甲基氨基配体，但在聚合物主链上没有羟基官能性。粘性纤连蛋白的有效减少对可选的过滤(超滤/渗滤或纳滤)都非常有利，这是由于堵塞减少延长了过滤器的寿命。如果该工艺要包括纳滤，优选使用稀释的溶液特别是使用级联的纳米过滤器执行该工艺。在施用纤维蛋白原溶液之前，当用于重悬中间产物纤维蛋白原糊剂时，特别使用相同的缓冲液来预平衡色谱分析凝胶或树脂。先后使用平衡缓冲液和洗涤缓冲液(1.5g/l柠檬酸钠、6.0g/l氯化钠，调节到pH为6.8～7.2，优选6.9～7.1，并在室温20℃～25℃下具有11.0mS/cm～13.0mS/cm的电导率)洗去松散结合的物质。

然后，可以使用洗脱缓冲液从色谱分析柱中洗脱纤维蛋白原，该洗脱缓冲液含有1.5g/l的柠檬酸钠，和10.0g/l的甘氨酸(特别是例如通过HCl和/或NaOH被调节到pH为与洗涤缓冲液相同的pH范围并且在室温20℃～25℃下使用大约7.0g/l的NaCl被调节到电导率为13.1mS/cm～15mS/cm)。从洗出液中回收施用到柱上的大约74％的纤维蛋白原，同时纤连蛋白几乎被完全从含有纤维蛋白原的洗出液中除去。有利的是，执行过滤特别是纳滤。

所过滤的纤维蛋白原溶液还可以通过超滤/渗滤被浓缩至大约20g/l～26g/l并且使用标称孔径小于等于0.2μm的膜进行无菌过滤。本领域技术人员知道还可以达到其它浓度(诸如1g/l～19.9g/l或26.01g/l～30g/l或甚至更高)。本发明的纤维蛋白原浓缩物也可以使用本领域技术人员已知的添加剂比如稳定剂(诸如糖类，例如蔗糖、海藻糖；氨基酸，例如甘氨酸、组氨酸、丙氨酸、精氨酸；和清洁剂，例如聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯())来配制。在进行第二次无菌过滤并且灌入最终容器之前，以及在可选地在冷冻干燥或直接灌入最终容器之前，以及在可选地在冷冻干燥而不需要第二次无菌过滤之前，这种无菌过滤的原液在-60℃或更低的温度下特别是在-65℃～-80℃下进行储存。

不必要添加其他缓冲液、稳定剂、蛋白酶抑制剂(比如AT-III、肝素辅因子II和C1酯酶抑制剂)，或其它化合物【比如凝固因子XIII(F)】。凝血因子XIII存在于浓缩物中，活性为大于等于0.05IU/mg纤维蛋白原(克劳斯法)，特别是0.05IU/mg～0.30IU/mg纤维蛋白原。本发明的纤维蛋白原浓缩物的特征还在于分子量比纤维蛋白原(HMW)的分子量高的化合物含量较低，其含量在280nm处通过尺寸排阻色谱分析测得的占总面积的百分比。当螯合剂的浓度为至少3mmol/L时，本发明的纤维蛋白原浓缩物含有小于11％，特别是2％～10％的HMW。使用浓度为至少5mmol/L的螯合剂使HMW含量减少到2％～6％。某些白蛋白也可以在浓度约为16ng/mg纤维蛋白原下存在。抗凝血酶III(AT-III)和蛋白水解活性检测不到，即AT-III浓度小于0.2IU/ml和蛋白水解活性小于2U/l(＜2U/l)，当在浓度为20mg/ml的含有纤维蛋白原的最终产物的溶液中被测量时，其等同于小于0.01IU AT-III/mg纤维蛋白原和小于0.1mU蛋白水解活性/mg纤维蛋白原。通过以下非限制性示例来进一步解释本发明。

示例I：

在大约中性pH下重组或溶解通过已建立的方法从血浆产生的冷沉淀物，并且对其使用Al(OH)₃吸附，以及通过离心来除去所得凝胶。然后，将上清液通过溶剂/去污剂(S/D)处理进行病毒灭活。根据EP-A1-131 740，S/D化合物使用植物油萃取，并使用EMD-TMAE与水相接触。在纤维蛋白原没有结合到该凝胶上，进而在直流或上清液中被发现的情况下，采用色谱分析条件(pH值为6.9～7.1，渗透压重量摩尔浓度为570mosmol/l～610mosmol/l)。

将未结合的纤维蛋白原的溶液与EDTA混合直至EDTA浓度达到10mM，并且在添加甘氨酸(最终浓度为1mol/l以及pH为7.4)之后，将含有EDTA的纤维蛋白原溶液在约15℃下搅拌约60分钟以沉淀纤维蛋白原。然后，含纤维蛋白原的沉淀物通过离心进行分离，从而得到中间产物纤维蛋白原糊剂。

使用20mM不含螯合剂的Tris缓冲液(pH约为8.0)，通过搅拌约30分钟从由此制备的中间产物中提取纤维蛋白原，然后将所获得的悬液过滤，并且进行超滤/渗滤。

然后，将所得的含有纤维蛋白原的溶液上样到GigaCapQ-，并且当在施用纤维蛋白原溶液之前用于再悬浮时，使用相同的Tris缓冲液来预平衡色谱分析凝胶或树脂。先后使用平衡缓冲液和洗涤缓冲液(1.5g/l的柠檬酸钠、6.0g/l的氯化钠，被调节到pH约为7.0，电导率约为12.0mS/cm)洗去松散结合的物质。然后使用洗脱缓冲液(1.5g/l的柠檬酸钠，和被调节到与洗涤缓冲液相同的pH并使用约7.0g/L的NaCl为调节到电导率为13.1mS/cm～15mS/cm的10.0g/l甘氨酸)从色谱分析柱洗脱纤维蛋白原。在孔径从75nm逐渐减少到小于35nm的纳米过滤器上，通过连续通道对纤维蛋白原溶液进行纳滤。

浓缩、配制，无菌过滤所得的纤维蛋白原溶液。在第二次无菌过滤并且灌装入最终容器之前，这种无菌过滤的原液在-80℃下储存5天。最终容器的一部分被冻干，同时另一部分被保持为液体制剂。在冻干产物或液体浓缩物中观察不到可检测量的螯合剂。

冻干物的重组是通过在冻干之前添加注射用水(WFI)直到所述浓度来完成的。

示例II～XII的执行方式与示例I相同，但其包括在螯合剂的类型和浓度以及提取时间上的变化。虽然当被标准化成1mg纤维蛋白原时，参数(比如蛋白质含量、纤维蛋白原抗原含量或纤维蛋白肽A含量)没有明显地受这些变化的影响，但是观察发现，由尺寸排阻色谱分析测定的分子量(HMW)比纤维蛋白原的分子量高的化合物的含量，在所述络合剂的浓度小于3mmol/l时，超过10％。实施例XIII是根据WO-A1-2012/038410的工艺制备，即在纯化工艺中没有任何螯合剂存在。这些变化的结果总结在表1中。

表1

执行一组实验以便测定合适的提取时间范围作为所提取的纤维蛋白原中间产物的产率和纯度之间的折中。当较短提取时间以纤维蛋白原的产率为代价提供了非常纯的中间产物时，测定合适的提取时间范围为10分钟～120分钟，同时在提取时间超过120分钟时，观察发现，一些杂质开始重新溶解，而纤维蛋白原的产率没有明显的增益。

与WO-A1-2012/038410的对比。

本发明和WO-A1-2012/038410的区别表现在通过在利用合适的沉淀剂(比如甘氨酸)沉淀纤维蛋白原之前添加螯合剂以及WO-A1-2012/038410中的随后的再悬浮步骤替换为提取。所述修改造成本发明的最终产物中的凝血因子XIII活性的非预期的增加，即高达0.30IU/mg纤维蛋白原(纤维蛋白原浓度为20mg/ml～25mg/ml；利用克劳斯法测定)，以及产率增加。

图1描绘了与专利申请WO-A1-2012/038410的产物相比(第2至5道还示为″-″)在显示根据本发明的工艺生产的通常产物(第6至11道还示为″+″)中的少量的高分子量的化合物的非还原条件下的SDS-Page。最接近250kD的蛋白质带代表纤维蛋白原，而位于纤维蛋白原带上方的是较高分子量的化合物。在约50kD处的蛋白带代表白蛋白。第1道显示分子量标记。

图2描绘了还原条件下的SDS-Page。测试的产物与图1中相同，并且顺序也相同，因而它们以与图1中相同的方式所示，即″+”用于根据本发明的工艺制备的产物，而″-”示为根据WO-A1-2012/038410的工艺制备的产物。在约50kD～70kD处的主要带代表纤维蛋白原α链、β链和Y链。在大约100kD处的蛋白带代表纤维蛋白原Y链的二聚体。在约30kD处的模糊带是由纤维蛋白原片段导致的。第1道显示分子量标记。

与WO-A2-2009/155626的对比。

通过分析WO-A2-2009/155626的工艺制备的产物，特别是通过组合所公开的示例1和6研究本发明的产物和WO-A2-2009/155626的产物的区别，获得了纳滤冻干产物。观察发现，WO-A2-2009/155626的产物含有1％的分子量比纤维蛋白原的分子量更高的化合物，其通过尺寸排阻色谱分析来测定，以及凝血因子XIII的活性约为0.41IU/mg纤维蛋白原。

Claims

1.一种工艺，其通过在一种或多种螯合剂的存在下利用沉淀剂从含有纤维蛋白原的溶液中沉淀纤维蛋白原并且从纤维蛋白原糊剂中除去上清液而用于从含有纤维蛋白原的来源中纯化纤维蛋白原，特征在于，从形成含有纤维蛋白原的液体级分的糊剂和与液体分离的未溶解的残余物中提取纤维蛋白原，同时省去添加一种或多种蛋白酶抑制剂，其中螯合剂的浓度为至少5mM；

其中从形成含有纤维蛋白原的液体级分的糊剂和与液体分离的未溶解的残余物中提取纤维蛋白原包括：

使用pH为7.5～8.5的不含螯合剂的水介质提取纤维蛋白原糊剂10分钟～120分钟，以得到液体分级。

2.权利要求1所述的工艺，其中该一种或多种蛋白酶抑制剂选自C1蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂、凝血酶抑制剂、抗凝血酶III(AT-III)、肝素辅因子II、抑蛋白酶肽、抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽和ε-氨基己酸。

3.权利要求1或2所述的工艺，其中该一种或多种螯合剂是Ca²⁺螯合剂，该Ca²⁺螯合剂选自1，2-双(邻氨基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(BAPTA)、二乙三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)和次氮基三乙酸(NTA)。

4.权利要求1所述的工艺，其中该螯合剂的浓度在5mM～50mM的范围内。

5.权利要求1所述的工艺，其中该螯合剂的浓度在5mM～20mM的范围内。

6.权利要求1所述的工艺，其中在4.1℃～40℃的温度范围内利用沉淀剂来沉淀纤维蛋白原。

7.权利要求6所述的工艺，其中在5℃～37℃的温度范围内利用沉淀剂来沉淀纤维蛋白原。

8.权利要求6所述的工艺，其中沉淀剂选自由氨基酸、聚乙二醇或高浓度的盐或其组合组成的组团，其中盐含有一价金属离子。

9.权利要求6所述的工艺，其中沉淀剂选自碱金属、或铵的组团。

10.权利要求6所述的工艺，其中该沉淀剂是一种氨基酸。

11.权利要求10所述的工艺，其中氨基酸是0.8～1.2M的甘氨酸。

12.权利要求1所述的工艺，其中该纤维蛋白原糊剂在pH为7.5～8.5下用10～30mMTRIS缓冲液提取。

13.权利要求1所述的工艺，其中所获得的液体级分被过滤，以得到滤液，该滤液与阴离子交换树脂接触，并且使用洗涤缓冲液洗去松散结合的物质，其中该阴离子交换树脂包括通过连接基团接枝到羟基化的甲基丙烯酸聚合物主链上的三甲基氨基。

14.权利要求13所述的工艺，其中用于洗去松散结合的物质的洗涤缓冲液具有11.0～13.0mS/cm的电导率。

15.权利要求13所述的工艺，其中借助于洗脱缓冲液，纤维蛋白原从所述强阴离子交换树脂中解吸，该洗脱缓冲液含有柠檬酸钠、氯化钠和甘氨酸，并且该洗脱缓冲液的电导率为13.1mS/cm～15mS/cm。

16.权利要求15所述的工艺，其中该洗脱缓冲液含有1.5g/l的柠檬酸钠、7.0g/l的氯化钠和10.0g/l的甘氨酸。

17.权利要求16所述的工艺，其中该洗脱缓冲液被调节到pH为6.8～7.2。

18.权利要求15所述的工艺，其中所解吸的纤维蛋白原溶液被纳滤，以获得纳滤的级分。

19.权利要求15所述的工艺，其中所获得的级分被浓缩、配制、无菌过滤和/或灌装到合适的最终容器内。

20.权利要求19所述的工艺，其中该最终容器选自小玻璃瓶或瓶或塑料袋，该塑料袋最终包括膜。

21.权利要求18所述的工艺，其中所获得的级分被冻干。

22.权利要求1至21任一项所述的工艺，其包括步骤：

a)溶解冷沉淀物，其在中性pH下溶解，

b)使用Al(OH)₃吸附所述溶液并除去所得凝胶，

c)对在步骤b)中所得的溶液通过溶剂/去污剂(S/D)处理而进行病毒灭活，使用植物油萃取S/D试剂，并且在pH值为6.9～7.1以及渗透压重量摩尔浓度为570mosmol/l～610mosmol/l下使水相与TMAE树脂接触，

d)向步骤c)中所得的水相添加至少一种螯合剂，

e)通过添加甘氨酸，从步骤d)中的含有螯合剂的水相中沉淀纤维蛋白原，直至达到0.8～1.2M甘氨酸的最终浓度，并且分离所得的纤维蛋白原糊剂，

f)利用pH为7.5～8.5的10～30mM TRIS缓冲液从纤维蛋白原糊剂中提取纤维蛋白原，过滤，以及，

g)将步骤f)的所过滤的溶液上样到阴离子交换树脂上，并且使用电导率为11.0mS/cm～13.0mS/cm的洗涤缓冲液来洗去松散结合的物质，其中该阴离子交换树脂包括通过连接基团接枝到羟基化的甲基丙烯酸聚合物主链上的三甲基氨基，

h)使用洗脱缓冲液洗脱纤维蛋白原，该洗脱缓冲液含有1.5g/l的柠檬酸钠、7.0g/L的氯化钠和10.0g/l的甘氨酸，调节到pH为6.8～7.2以及洗脱缓冲液的电导率为13.1mS/cm～15mS/cm，

i)在至少一个纳米过滤器上过滤，

j)浓缩、配制、无菌过滤灌装和可选地冻干。

23.权利要求22所述的工艺，其中该螯合剂在水相中的浓度为5mM～100mM。

24.能够根据权利要求23而获得的纤维蛋白原产物，其具有分子量比纤维蛋白原的分子量更高的小于11％的化合物，该含量是在280nm处通过尺寸排阻层析测定的占总面积的百分比。

25.能够根据权利要求23而获得的纤维蛋白原产物，其具有分子量比纤维蛋白原的分子量更高的2％～10％的化合物。

26.能够根据权利要求23而获得的纤维蛋白原产物，其具有分子量比纤维蛋白原的分子量更高的2％～6％的化合物。

27.权利要求24-26任一项所述的纤维蛋白原产物，其在浓度为0.05IU/mg～0.30IU/mg的纤维蛋白原下具有凝血因子XIII活性。

28.权利要求24-26任一项所述的纤维蛋白原产物，其没有可检测量的抗凝血酶III(AT-III)或蛋白水解活性，即AT-III的浓度小于0.2IU/ml和蛋白水解活性小于2U/l(<2U/l)，当在浓度为20mg/ml的含有纤维蛋白原的最终产物的溶液中被测量时，其等同于小于0.01IU AT-III每mg纤维蛋白原和小于0.1mU蛋白水解活性每mg纤维蛋白原。

29.权利要求24-26任一项所述的纤维蛋白原产物，其特征在于它被冻干。