RU2158130C1 - Способ получения фибриногена - Google Patents
Способ получения фибриногена Download PDFInfo
- Publication number
- RU2158130C1 RU2158130C1 RU99126612A RU99126612A RU2158130C1 RU 2158130 C1 RU2158130 C1 RU 2158130C1 RU 99126612 A RU99126612 A RU 99126612A RU 99126612 A RU99126612 A RU 99126612A RU 2158130 C1 RU2158130 C1 RU 2158130C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- solution
- fibrinogen
- sorbent
- acetate buffer
- precipitate
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, в частности к биохимии. Спиртовый осадок 1 плазмы крови по схеме Кона растворяют в ацетатном буферном растворе, содержащем антикоагулирующий агент; в раствор осадка добавляют катионообменный сорбент до полного связывания фибриногена, в раствор вносят детергент и органические растворители, проводят инкубацию раствора в течение 8-24 ч при 25-35°С, отмывают сорбент от детергента и несвязавшегося белка; элюируют фибриноген с сорбента с помощью ацетатного буферного раствора, корректируют рН раствора и концентрацию белка, проводят стерилизующую фильтрацию, розлив и лиофильное высушивание препарата. Технический результат: получение вирусологически безопасного препарата фибриногена, уменьшение количества солей в конечном продукте. 2 з.п. ф-лы.
Description
Изобретение относится к медицине, в частности к биохимии, и может быть использовано для получения препарата фибриногена для обработки ран.
Известны способы получения препарата фибриногена, описанные в сборнике "Препараты крови. Инструктивно-методические материалы по контролю и производству". - М., 1976, стр.145-202.
Способы заключаются в получении препарата фибриногена путем растворения спиртового осадка 1 плазмы крови по схеме Кона в буферных растворах, содержащих цитрат натрия, глюкозу, хлорид натрия, pH 6,1-7,4; отделении нерастворившегося белка, стерилизующей фильтрации, розливе и лиофильном высушивании препарата.
Недостатком всех описанных способов является отсутствие стадии противовирусной обработки и, как следствие, высокая вирусологическая опасность препаратов; низкая концентрация белка в полуфабрикате препарата, предназначенном для розлива, высокое содержание солей в конечном продукте.
Наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигнутому результату является способ, изложенный в вышеуказанном сборнике "Препараты крови. Инструктивно-методические материалы по контролю и производству". - М. , 1976, стр.145-164.
Способ предусматривает растворение спиртового осадка 1 плазмы крови в 0,9% растворе хлорида натрия, содержащем 200 мл/л геля гидроокиси алюминия, отделении нерастворимого осадка центрифугированием, осветляющей фильтрации, установлении pH в пределах 6,7-7,4, определении концентрации фибриногена, стерилизующей фильтрации, розливе, лиофильном высушивании препарата.
Недостатком способа является отсутствие стадии противовирусной обработки, что в настоящее время исключает возможность использования в клинической практике препарата, полученного данным способом. Полученный препарат содержит большое количество соли 700-900 мг/мг белка. На стадии разведения осадка не используются антикоагулирующие реагенты, что не позволяет предотвратить процесс самопроизвольного формирования нерастворимого фибрина.
Задача, решаемая настоящим изобретением, - совершенствование способа получения фибриногена.
Технический результат от использования изобретения заключается в получении вирусологически безопасного препарата фибриногена, уменьшении количества солей в конечном продукте.
Указанный результат достигается тем, что спиртовый осадок 1 плазмы крови по схеме Кона растворяют в ацетатном буферном растворе, содержащем антикоагулирующий реагент - цитрат натрия; в раствор осадка добавляют катионообменный сорбент до полного связывания фибриногена, в раствор вносят детергент (Твин-80) и органические растворители (хлороформ или трибутилфосфат), проводят инкубацию раствора в течение 8-24 часов при температуре 25-35oC, отмывают сорбент от детергента и несвязавшегося белка; элюируют фибриноген с сорбента с помощью ацетатного буферного раствора со щелочным значением pH, установленным с помощью аммиака; корректируют pH раствора и концентрацию белка, проводят стерилизующую фильтрацию, розлив и лиофильное высушивание препарата.
Способ осуществляют следующим образом. Спиртовый осадок 1 плазмы крови растворяют в буферном растворе состава: ацетат натрия 21 г/л, ледяная уксусная кислота 11,5 мл/л, pH 4,5 ± 0,5, дополнительно содержащем 2 - 8 г/л цитрата натрия. Данные значения pH и количество солей и кислоты является оптимальным, поскольку дальнейшее изменение pH в кислую сторону может привести к денатурации белка, а при более щелочных значениях pH затрудняется последующее связывание фибриногена с катионообменным сорбентом. Уменьшение концентрации вносимого в раствор цитрата натрия может привести к выпадению нерастворимого фибрина, а повышение концентрации соли затрудняет процесс сорбции на катионообменном сорбенте. Использованный ацетатный буфер относится к летучим, т.е. компоненты его удаляются при лиофильном высушивании.
Определяют концентрацию фибриногена в растворе общепринятыми методами. Она должна быть не ниже 1%, в противном случае извлечение фибриногена является экономически невыгодным. В раствор добавляют подготовленную суспензию катионообменного сорбента (карбоксиметил-целлюлозы, карбоксиметил-сефарозы или карбоксиметил-сефадекса) в Н-форме, уравновешенную ацетатным буферным раствором. Контролируют содержание фибриногена в растворе. Суспензию катионообменного сорбента добавляют до полного исчезновения фибриногена в растворе. Затем в раствор добавляют детергент Твин-80 до конечной концентрации 1 ± 0,2% и органический растворитель - хлороформ или трибутилфосфат до конечной концентрации 1%. Данные концентрации являются оптимальными, поскольку, по данным литературы, дальнейшее их повышение не ведет к увеличению вируснейтрализующих свойств. Раствор инкубируют в течение 8-24 часов при температуре 25-35oC. Снижение времени и температуры инкубации ниже указанных уменьшает эффективность проводимой процедуры вирусной инактивации, а их повышение может привести к денатурации фибриногена. По истечении инкубации отделяют сорбент от раствора и промывают 3-5 кратным по отношению к начальному объемом ацетатного буферного раствора до достижения полного удаления детергента. Содержание детергента определяют путем измерения оптической плотности промывных вод при длине волны 540 нм. Оптическая плотность при толщине оптического слоя 10 мм должна быть не выше 0,1. Отделяют сорбент и заливают его злюирующим ацетатным буфером, pH которого предварительно доводят до 8,5 ± 0,5 раствором аммиака. Данный реагент также является летучим, и содержание солей в препарате не возрастает. Объем буферного раствора равен 1/5-1/10 от объема исходного раствора осадка 1. Устанавливают pH раствора равным 7,0 ± 0,5 с помощью аммиака. Данные значения pH являются физиологическими, и изменение их в конечном препарате не является целесообразным. Инкубируют раствор с катионообменным сорбентом в течение 20-40 минут при непрерывном перемешивании. Уменьшение времени инкубации ведет к неполной злюции фибриногена, а его увеличение может привести к выпадению нерастворимого фибрина. Устанавливают концентрацию фибриногена в растворе равной 50-100 мг/мл. Проводят стерилизующую фильтрацию, розлив препарата в ампулы и лиофильное высушивание, как описано в сборнике "Препараты крови. Инструктивно-методические материалы по контролю и производству". - М., 1976, стр. 145-164.
Полученный препарат вирусологически безопасен, содержание солей не свыше 0,1 мг/мг белка.
Пример 1. К 1 кг осадка 1 прибавляют 10 литров ацетатного буфера, содержащего 2 г/л цитрата натрия. Устанавливают pH равным 4,5 ± 0,5. Добавляют предварительно приготовленную суспензию карбоксиметилцеллюлозы. Контролируют содержание несвязавшегося фибриногена общепринятыми методами, например путем определения оптической плотности раствора фибриногена при 280 нм, толщине оптического слоя 10 мм, до (Д0) и после формирования фибринового сгустка (Д1). Концентрация фибриногена, мг/мл = (Д0-Д1)/1,38. На 1 кг осадка уходит в среднем около 1 л суспензии КМ-целлюлозы. Добавляют Твин-80 и хлороформ до конечной концентрации 1%. Инкубируют 24 часа при температуре 25oC. По истечении времени инкубации отделяют сорбент от раствора и промывают 25 литрами ацетатного буфера. Отделяют сорбент и добавляют к его суспензии 2 литра ацетатного буфера, pH 8,5. Устанавливают pH смеси равным 7,0 с помощью аммиака. Инкубируют 40 минут при непрерывном перемешивании. Отделяют сорбент и устанавливают концентрацию белка равной 50-100 мг/мл добавлением того же буферного раствора. Проводят стерилизующую фильтрацию, розлив и лиофильное высушивание препарата. Полученный препарат фибриногена не содержит HBs-антигена, определяемого методом иммуноферментного анализа, количество солей, определяемое по МУК 4.1/4.2.588-96 "Методы контроля иммунобиологических препаратов, вводимых людям", Минздрав России, Москва, 1998, с.109, не выше 100 мг/г белка.
Пример 2. Растворяют 1 кг осадка 1 в 5 литрах ацетатного буферного раствора, содержащего 8 г/л цитрата натрия. Вносят суспензию карбоксиметил-сефадекса и устанавливают pH раствора равным 4,5. Объем суспензии сорбента, необходимый для связывания фибриногена, около 100 мл. Добавляют в раствор Твин-80 и трибутилфосфат до конечной концентрации 1,0%. Инкубируют 8 часов при температуре 35oC. Отделяют сорбент и промывают его 25 литрами ацетатного буферного раствора. Добавляют к суспензии сорбента злюирующий ацетатный буферный раствор, pH 8,5. Устанавливают pH смеси равным 7,0. Инкубируют 20 минут при непрерывном перемешивании. Отделяют сорбент, определяют концентрацию фибриногена, как описано в примере 1, и устанавливают ее равной 50-100 мг/мл. Проводят стерильную фильтрацию, розлив и лиофильное высушивание препарата. Готовый препарат не содержит HBs-антигена, количество соли не более 100 мг/г белка.
Использование метода обработки раствора белка с помощью комбинации органического растворителя и детергента позволяет добиться вирусологической безопасности препарата. Использование летучих буферных растворов, компоненты которых удаляются в процессе лиофильного высушивания, позволяет уменьшить содержание солей в готовом препарате с 700-900 до 100 мг/г белка. Использование цитрата натрия в качестве ингибитора коагуляции позволяет предотвратить самопроизвольное выпадение осадка нерастворимого фибрина на начальных стадиях процесса выделения фибриногена.
Claims (3)
1. Способ получения фибриногена из спиртового осадка 1 плазмы крови человека по схеме Кона путем его разведения, стерилизующей фильтрации и лиофильного высушивания, отличающийся тем, что спиртовый осадок 1 плазмы крови растворяют в ацетатном буферном растворе, дополнительно содержащем антикоагулирующий реагент - цитрат натрия, в раствор осадка добавляют катионообменный сорбент до полного связывания фибриногена, в раствор вносят детергент и органические растворители, проводят инкубацию раствора в течение 8 - 24 ч при 25 - 35oC, отмывают сорбент от детергента и несвязавшегося белка, элюируют фибриноген с сорбента с помощью ацетатного буферного раствора со щелочным значением рН, установленным с помощью аммиака.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве детергента используют Твин-80.
3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что в качестве органических растворителей используют хлороформ или трибутилфосфат.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU99126612A RU2158130C1 (ru) | 1999-12-17 | 1999-12-17 | Способ получения фибриногена |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU99126612A RU2158130C1 (ru) | 1999-12-17 | 1999-12-17 | Способ получения фибриногена |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2158130C1 true RU2158130C1 (ru) | 2000-10-27 |
Family
ID=20228257
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU99126612A RU2158130C1 (ru) | 1999-12-17 | 1999-12-17 | Способ получения фибриногена |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2158130C1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2556804C2 (ru) * | 2013-12-17 | 2015-07-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение Гематологический научный центр Министерства здравоохранения РФ | Способ получения концентрата фибриногена |
RU2663792C2 (ru) * | 2012-03-13 | 2018-08-09 | Октафарма Аг | Способ очистки фибриногена, продукт фибриногена и средство для очистки или производства продукта фибриногена |
-
1999
- 1999-12-17 RU RU99126612A patent/RU2158130C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
1. Препараты крови. Инструктивно-методические материалы по контролю и производству. - М., 1976, с.145 - 164. 2. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2663792C2 (ru) * | 2012-03-13 | 2018-08-09 | Октафарма Аг | Способ очистки фибриногена, продукт фибриногена и средство для очистки или производства продукта фибриногена |
RU2556804C2 (ru) * | 2013-12-17 | 2015-07-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение Гематологический научный центр Министерства здравоохранения РФ | Способ получения концентрата фибриногена |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4394373A (en) | Method of achieving hemostasis | |
Dworkin et al. | Hemodynamic basis for glomerular injury in rats with desoxycorticosterone-salt hypertension. | |
US3652530A (en) | Antihemophilic factor prepared from blood plasma using polyethylene glycol | |
US3984539A (en) | Bovine immunoglobulin isolation process | |
DK155568B (da) | Fremgangsmaade til stabilisering af koagulationsfaktorerne ii, viii, xiii og antithrombin iii samt plasminogen, og saaledes at disse er fibrinogen-fri og fri for risiko for en hepatitis-overfoering | |
SU1002356A1 (ru) | Способ получени иммобилизованного фибринолизина | |
RU2000113224A (ru) | Способ продуцирования в высокой степени вирусобезопасных компонентов для получения фибринового клея из пула плазмы человека | |
RU96119971A (ru) | Способ получения биологического клея, изготовленного из концентрированных коагулирующих факторов посредством "высаливания" | |
JPH01193229A (ja) | 抗血液凝固剤 | |
JPH0323528B2 (ru) | ||
KR960007922B1 (ko) | 조직단백질 pp4의 저온살균법 | |
NO138145B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av et enzympreparat | |
JPH03243601A (ja) | 血液凝固の制御能をもつムコ多糖組成物およびその製造方法 | |
EP1671129A1 (en) | Compounds and methods for promoting angiogenesis by using a gamma-secretase inhibitor or inhibiting the gamma-secretase pathway | |
JPH0424360B2 (ru) | ||
RU2158130C1 (ru) | Способ получения фибриногена | |
JPS6042207B2 (ja) | 胎盤よりプラスミノ−ゲン型活性化合物を抽出する方法 | |
US4608254A (en) | Method for the production of therapeutically administrable plasma derivatives filled in final containers | |
JP2002533473A (ja) | 微生物起源のヒアルロン酸分解酵素を含有する薬学的配合物 | |
JPH11500619A (ja) | トロンビンの調製 | |
Nakamura et al. | Study on dissolution and disintegration of calcium bilirubinate stone | |
US3993585A (en) | Elevated human lipids control | |
RU2457248C2 (ru) | Способ промышленного получения тромбина | |
US5064758A (en) | Method of preparing a mixture of ribonucleotides | |
RU2648517C1 (ru) | Способ получения лиофилизированного препарата активированного протромбинового комплекса, обладающего фактор viii-шунтирующей активностью |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20071218 |