JP2003194791A - 糖類混合物の同時分析方法及びそれに用いる分析装置 - Google Patents
糖類混合物の同時分析方法及びそれに用いる分析装置Info
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- Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
- Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
- Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 連続的に分析を行っても、分析回数の増加と
共に各成分の誘導体の検出感度や、ポンプの送液流量精
度が低下せず、再現性のよい分析結果を得ることが可能
な糖類混合物の同時分析方法及び同時分析装置を提供す
る。 【解決手段】 単糖類及び少糖類を含む糖類混合物を、
２種類以上の異なる移動相を用いた液体クロマトグラフ
ィー法により各成分に分離したのち、分離された各成分
ごとに反応試薬を反応させてその誘導体を形成させ、こ
の誘導体をセルに収容して検出する糖類混合物の同時分
析方法において、検出の際に用いたセルを検出ごとに洗
浄処理して分析する。また、糖類混合物を各成分に分離
するための液体クロマトグラフィー用分析カラム、分離
された各成分をそれぞれ誘導体化するための反応器、各
成分の誘導体を収容する検出器セル、検出器セルを装着
して検出処理するための検出器、検出終了後に検出用セ
ルに洗浄溶媒を供給するための溶媒供給機構、分析カラ
ムを再平衡化するための再生機構、及び分析カラム溶出
液の流路切り替え機構を包含した分析装置とする。
共に各成分の誘導体の検出感度や、ポンプの送液流量精
度が低下せず、再現性のよい分析結果を得ることが可能
な糖類混合物の同時分析方法及び同時分析装置を提供す
る。 【解決手段】 単糖類及び少糖類を含む糖類混合物を、
２種類以上の異なる移動相を用いた液体クロマトグラフ
ィー法により各成分に分離したのち、分離された各成分
ごとに反応試薬を反応させてその誘導体を形成させ、こ
の誘導体をセルに収容して検出する糖類混合物の同時分
析方法において、検出の際に用いたセルを検出ごとに洗
浄処理して分析する。また、糖類混合物を各成分に分離
するための液体クロマトグラフィー用分析カラム、分離
された各成分をそれぞれ誘導体化するための反応器、各
成分の誘導体を収容する検出器セル、検出器セルを装着
して検出処理するための検出器、検出終了後に検出用セ
ルに洗浄溶媒を供給するための溶媒供給機構、分析カラ
ムを再平衡化するための再生機構、及び分析カラム溶出
液の流路切り替え機構を包含した分析装置とする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、高速液体クロマト
グラフィー法により、単糖類及び少糖類を含む糖類混合
物から各成分を分離して同時に分析する方法及び装置の
改良に関するものである。
グラフィー法により、単糖類及び少糖類を含む糖類混合
物から各成分を分離して同時に分析する方法及び装置の
改良に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】単糖類や少糖類などの糖質を分析する方
法として、ゲルろ過クロマトグラフィー法や順相クロマ
トグラフィー法が知られている。これらの方法において
は、蛍光や紫外部吸収、可視部吸収がない試料の検出に
は示差屈折計を用いるのが常套手段であり、単糖類や少
糖類の検出も示差屈折計によっている。
法として、ゲルろ過クロマトグラフィー法や順相クロマ
トグラフィー法が知られている。これらの方法において
は、蛍光や紫外部吸収、可視部吸収がない試料の検出に
は示差屈折計を用いるのが常套手段であり、単糖類や少
糖類の検出も示差屈折計によっている。
【０００３】しかしながら、ゲルろ過クロマトグラフィ
ー法では単糖類と少糖類との分離は可能であっても、単
糖類相互の分離や同じ分子量を有する少糖類相互の分離
を行うことは困難である。また順相クロマトグラフィー
法の場合も、示差屈折計によって検出を行う場合には移
動相が均一組成に制限されるため、少糖類の完全溶出
か、単糖類相互の分離のいずれかを犠牲にしなければな
らないという欠点がある。
ー法では単糖類と少糖類との分離は可能であっても、単
糖類相互の分離や同じ分子量を有する少糖類相互の分離
を行うことは困難である。また順相クロマトグラフィー
法の場合も、示差屈折計によって検出を行う場合には移
動相が均一組成に制限されるため、少糖類の完全溶出
か、単糖類相互の分離のいずれかを犠牲にしなければな
らないという欠点がある。
【０００４】また、試料を前処理して各成分の誘導体を
形成させることにより各成分に蛍光特性や紫外部吸収特
性を付与した後、高速液体クロマトグラフィーを用いて
分離し、蛍光検出器や紫外部吸収検出器により検出する
方法が知られている。この方法によれば移動相の組成を
変化させて溶離を行うことができ、均一組成の移動相を
用いる場合に比べて単糖類や少糖類の各成分相互を分離
することも可能となるが、還元糖の誘導体化反応収率に
影響を及ぼす物質が分析試料中に混入していると正確な
分析値が得られなくなるため、この方法を食品等多成分
混合試料中の還元糖の高感度同時分析に応用する際には
定量的な面では必ずしも満足できるものではない。
形成させることにより各成分に蛍光特性や紫外部吸収特
性を付与した後、高速液体クロマトグラフィーを用いて
分離し、蛍光検出器や紫外部吸収検出器により検出する
方法が知られている。この方法によれば移動相の組成を
変化させて溶離を行うことができ、均一組成の移動相を
用いる場合に比べて単糖類や少糖類の各成分相互を分離
することも可能となるが、還元糖の誘導体化反応収率に
影響を及ぼす物質が分析試料中に混入していると正確な
分析値が得られなくなるため、この方法を食品等多成分
混合試料中の還元糖の高感度同時分析に応用する際には
定量的な面では必ずしも満足できるものではない。
【０００５】そのほか、２種類以上の異なる移動相を用
いて糖質の分離を行った後に、各成分の誘導体化を行
い、この誘導体を検出器で検出する方法（特開平５−１
１３４３９号公報）、［「食品衛生学雑誌」，第３９
巻，第５号，第３３３〜３４０ページ（１９９８年）］
が知られている。
いて糖質の分離を行った後に、各成分の誘導体化を行
い、この誘導体を検出器で検出する方法（特開平５−１
１３４３９号公報）、［「食品衛生学雑誌」，第３９
巻，第５号，第３３３〜３４０ページ（１９９８年）］
が知られている。
【０００６】しかしながら、これらの方法においては、
分析カラムで糖質を分離した後にオンラインで糖質と反
応試薬を混合し、誘導体に変換し検出器で検出するとい
う分析方法を採用しているために分析操作中に反応混合
物や反応試薬液が検出器セルを通過することにより検出
器セルが汚染され、この結果として分析回数の増加と共
に誘導体化物の検出感度（検出される蛍光強度）が低下
するという欠点がある。
分析カラムで糖質を分離した後にオンラインで糖質と反
応試薬を混合し、誘導体に変換し検出器で検出するとい
う分析方法を採用しているために分析操作中に反応混合
物や反応試薬液が検出器セルを通過することにより検出
器セルが汚染され、この結果として分析回数の増加と共
に誘導体化物の検出感度（検出される蛍光強度）が低下
するという欠点がある。
【０００７】この欠点を克服するには、検出器セルをそ
の都度洗浄することが考えられるが、検出器セルを洗浄
するには、分析カラムを取り外して検出器とポンプを直
結して洗浄溶媒を送液するか、分析カラムを連結したま
まで移動相送液ポンプから洗浄溶媒を送液するか、分析
カラム溶出液出口以降で接続した別のポンプから洗浄溶
媒を送液することが必要である。しかしながら、分析カ
ラムを取り外す方法では移動相送液ポンプが一旦停止す
ることになり、ポンプの停止は流量精度低下、それによ
る分析値の精度低下などの欠点があり、分析カラムを連
結したままで移動相送液ポンプから洗浄溶媒を送液する
方法では、分析カラムに充填された分離剤により洗浄溶
媒が限定されるという欠点があり、分析カラム溶出液出
口以降で接続したポンプから洗浄溶媒を送液する方法で
は、移動相送液ポンプを止めない限り洗浄溶媒に移動相
溶媒が混入するという欠点がある。
の都度洗浄することが考えられるが、検出器セルを洗浄
するには、分析カラムを取り外して検出器とポンプを直
結して洗浄溶媒を送液するか、分析カラムを連結したま
まで移動相送液ポンプから洗浄溶媒を送液するか、分析
カラム溶出液出口以降で接続した別のポンプから洗浄溶
媒を送液することが必要である。しかしながら、分析カ
ラムを取り外す方法では移動相送液ポンプが一旦停止す
ることになり、ポンプの停止は流量精度低下、それによ
る分析値の精度低下などの欠点があり、分析カラムを連
結したままで移動相送液ポンプから洗浄溶媒を送液する
方法では、分析カラムに充填された分離剤により洗浄溶
媒が限定されるという欠点があり、分析カラム溶出液出
口以降で接続したポンプから洗浄溶媒を送液する方法で
は、移動相送液ポンプを止めない限り洗浄溶媒に移動相
溶媒が混入するという欠点がある。
【０００８】また、使用する溶媒由来の気体（例えば空
気）が発生し、ポンプ内に留まり、ポンプの流量精度を
低下させ、分析再現性を低下させる原因になったり、あ
るいは発生した空気が検出器セル内に入り検出を妨害し
たりする問題が知られている。これは、特に有機溶媒含
有溶媒を使用して連続して分析を行う場合に多い。
気）が発生し、ポンプ内に留まり、ポンプの流量精度を
低下させ、分析再現性を低下させる原因になったり、あ
るいは発生した空気が検出器セル内に入り検出を妨害し
たりする問題が知られている。これは、特に有機溶媒含
有溶媒を使用して連続して分析を行う場合に多い。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
事情のもとで、連続的に分析を行っても、分析回数の増
加と共に各成分の誘導体の検出感度（検出される蛍光強
度）や、ポンプの送液流量精度が低下せず、再現性のよ
い分析結果を得ることが可能な糖類混合物の同時分析方
法及び同時分析装置を提供することを目的としてなされ
たものである。
事情のもとで、連続的に分析を行っても、分析回数の増
加と共に各成分の誘導体の検出感度（検出される蛍光強
度）や、ポンプの送液流量精度が低下せず、再現性のよ
い分析結果を得ることが可能な糖類混合物の同時分析方
法及び同時分析装置を提供することを目的としてなされ
たものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、糖類混合
物の同時分析方法について種々研究を重ねた結果、２種
類以上の異なる移動相を用いて液体クロマトグラフィー
用分析カラムによって各成分に分離を行った後で、分離
した各成分の誘導体化を行い、この誘導体を検出器で検
出して、糖類中の各成分を同時に分析する際に、１つの
検体の分析が終了するごとに分析カラム溶出液流路と検
出器セルを結んだ流路を切り離し、洗浄溶媒を用いた検
出器セル洗浄と分析カラム平衡化移動相（分析開始時の
移動相）を用いた分析カラムの再平衡化を行い、検出器
セル洗浄処理の終了後から次の分析試料添加までの間に
分析カラム溶出液流路を元に戻す処理を挿入することに
より、前記した欠点を克服しうることを見出し、この知
見に基づいて本発明をなすに至った。
物の同時分析方法について種々研究を重ねた結果、２種
類以上の異なる移動相を用いて液体クロマトグラフィー
用分析カラムによって各成分に分離を行った後で、分離
した各成分の誘導体化を行い、この誘導体を検出器で検
出して、糖類中の各成分を同時に分析する際に、１つの
検体の分析が終了するごとに分析カラム溶出液流路と検
出器セルを結んだ流路を切り離し、洗浄溶媒を用いた検
出器セル洗浄と分析カラム平衡化移動相（分析開始時の
移動相）を用いた分析カラムの再平衡化を行い、検出器
セル洗浄処理の終了後から次の分析試料添加までの間に
分析カラム溶出液流路を元に戻す処理を挿入することに
より、前記した欠点を克服しうることを見出し、この知
見に基づいて本発明をなすに至った。
【００１１】すなわち、本発明は、単糖類及び少糖類を
含む糖類混合物を、２種類以上の異なる移動相を用いた
液体クロマトグラフィー法により各成分に分離したの
ち、分離された各成分ごとに反応試薬を反応させてその
誘導体を形成させ、この誘導体をセルに収容して検出す
る糖類混合物の同時分析方法において、検出の際に用い
たセルを検出ごとに洗浄処理することを特徴とする分析
方法、及び糖類混合物を各成分に分離するための液体ク
ロマトグラフィー用分析カラム、分離された各成分をそ
れぞれ誘導体化するための反応器、各成分の誘導体を収
容する検出器セル、検出器セルを装着して検出処理する
ための検出器、検出終了後に検出用セルに洗浄溶媒を供
給するための溶媒供給機構、分析カラムを再平衡化する
ための再生機構、及び分析カラム溶出液の流路切り替え
機構を包含してなる糖類混合物の同時分析装置を提供す
るものである。
含む糖類混合物を、２種類以上の異なる移動相を用いた
液体クロマトグラフィー法により各成分に分離したの
ち、分離された各成分ごとに反応試薬を反応させてその
誘導体を形成させ、この誘導体をセルに収容して検出す
る糖類混合物の同時分析方法において、検出の際に用い
たセルを検出ごとに洗浄処理することを特徴とする分析
方法、及び糖類混合物を各成分に分離するための液体ク
ロマトグラフィー用分析カラム、分離された各成分をそ
れぞれ誘導体化するための反応器、各成分の誘導体を収
容する検出器セル、検出器セルを装着して検出処理する
ための検出器、検出終了後に検出用セルに洗浄溶媒を供
給するための溶媒供給機構、分析カラムを再平衡化する
ための再生機構、及び分析カラム溶出液の流路切り替え
機構を包含してなる糖類混合物の同時分析装置を提供す
るものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明方法は、リボース、フルク
トース、グルコースなどの単糖類と、ラミナリビオー
ス、ラミナリトリオース、ラミナリテトラオース、ラミ
ナリペンタオース、ラミナリヘキサオース、ラミナリヘ
プタオースなどの少糖類とを含む糖類混合物から、これ
らの各成分を相互に分離して分析する方法であるが、こ
のような単糖類と少糖類とを含む糖類混合物としては、
例えば、麦芽飲料、ジュースなどの飲料類、水飴、ゼリ
ーなどの菓子類、ハチミツ、しょうゆなどの食品類、ガ
ラクトース転化糖を含んだオリゴ糖、イソマルトオリゴ
糖を含んだオリゴ糖などのオリゴ糖製品類などを挙げる
ことができる。ここで少糖類とは分子量５０００以下の
ものをいう。
トース、グルコースなどの単糖類と、ラミナリビオー
ス、ラミナリトリオース、ラミナリテトラオース、ラミ
ナリペンタオース、ラミナリヘキサオース、ラミナリヘ
プタオースなどの少糖類とを含む糖類混合物から、これ
らの各成分を相互に分離して分析する方法であるが、こ
のような単糖類と少糖類とを含む糖類混合物としては、
例えば、麦芽飲料、ジュースなどの飲料類、水飴、ゼリ
ーなどの菓子類、ハチミツ、しょうゆなどの食品類、ガ
ラクトース転化糖を含んだオリゴ糖、イソマルトオリゴ
糖を含んだオリゴ糖などのオリゴ糖製品類などを挙げる
ことができる。ここで少糖類とは分子量５０００以下の
ものをいう。
【００１３】次に、本発明方法において、糖類混合物を
２種類以上の異なる移動相を用いた液体クロマトグラフ
ィー法により各成分に分離したのち、分離された各成分
ごとに反応試薬を反応させて、その誘導体を形成させ、
この誘導体をセルに収容して検出するまでの方法は、こ
れまで知られている方法、例えば特開平５−１１３４３
９号公報に記載された方法によって行うことができる。
２種類以上の異なる移動相を用いた液体クロマトグラフ
ィー法により各成分に分離したのち、分離された各成分
ごとに反応試薬を反応させて、その誘導体を形成させ、
この誘導体をセルに収容して検出するまでの方法は、こ
れまで知られている方法、例えば特開平５−１１３４３
９号公報に記載された方法によって行うことができる。
【００１４】図１は、上記の方法を実施するのに好適な
装置を示す工程図の１例であって、糖類混合物を各成分
に分離するための高速液体クロマトグラフィー法は、吸
着材料を充填した液体クロマトグラフィー用分析カラム
及び２種以上の異なる移動相を用いて行われる。
装置を示す工程図の１例であって、糖類混合物を各成分
に分離するための高速液体クロマトグラフィー法は、吸
着材料を充填した液体クロマトグラフィー用分析カラム
及び２種以上の異なる移動相を用いて行われる。
【００１５】この図１において、１、２は移動相液溜、
５，６は定流速送液ポンプ、７はミキサーで、グラディ
エント溶離法の場合には該ミキサー７において移動相液
溜１からポンプ５によって送液される溶離液１ａと、移
動相液溜２からポンプ６によって送液される溶離液２ａ
が混合される。試料注入バルブ８より注入された試料は
溶離液によって保護用のプレカラム９´を経て分析カラ
ム９に導入され各成分に分離される。プレカラム９´、
分析カラム９は恒温槽１０内で一定温度に保持されてい
る。１４、１５は分離した各成分を誘導体化するための
反応試薬液溜、１８、１９は各反応試薬液溜１４、１５
内の反応試薬１４ａ、１５ａを送液するための定流速送
液ポンプである。反応試薬液溜は反応試薬を誘導体化す
べき成分の違いに応じて適宜交換しうるように通常複数
設けられる。分析カラム９において分離された各成分は
反応試薬と混合され、反応槽１２の反応コイル２０内を
通過する間に誘導体化され、冷却コイル２２内で冷却さ
れた後、検出器２３において検出されるように構成され
ている。なお、上記の例では移動相液溜、反応試薬液溜
をそれぞれ２つ設けた場合について示したが、３つ以上
の移動相液溜、反応試薬液溜を設け３種以上の溶離液や
反応試薬を用いうるように構成することもできる。
５，６は定流速送液ポンプ、７はミキサーで、グラディ
エント溶離法の場合には該ミキサー７において移動相液
溜１からポンプ５によって送液される溶離液１ａと、移
動相液溜２からポンプ６によって送液される溶離液２ａ
が混合される。試料注入バルブ８より注入された試料は
溶離液によって保護用のプレカラム９´を経て分析カラ
ム９に導入され各成分に分離される。プレカラム９´、
分析カラム９は恒温槽１０内で一定温度に保持されてい
る。１４、１５は分離した各成分を誘導体化するための
反応試薬液溜、１８、１９は各反応試薬液溜１４、１５
内の反応試薬１４ａ、１５ａを送液するための定流速送
液ポンプである。反応試薬液溜は反応試薬を誘導体化す
べき成分の違いに応じて適宜交換しうるように通常複数
設けられる。分析カラム９において分離された各成分は
反応試薬と混合され、反応槽１２の反応コイル２０内を
通過する間に誘導体化され、冷却コイル２２内で冷却さ
れた後、検出器２３において検出されるように構成され
ている。なお、上記の例では移動相液溜、反応試薬液溜
をそれぞれ２つ設けた場合について示したが、３つ以上
の移動相液溜、反応試薬液溜を設け３種以上の溶離液や
反応試薬を用いうるように構成することもできる。
【００１６】上記の液体クロマトグラフィー用分析カラ
ムとして、イオン交換クロマトグラフィー用分析カラ
ム、逆相クロマトグラフィー用分析カラム、順相クロマ
トグラフィー用分析カラムなどを用いることができる
が、糖の保持力が分子量に比例している傾向がある点
や、分子量の大きな糖（分子量５０００〜１００００程
度）まで分析できる点で特に順相クロマトグラフィー用
分析カラムが好ましい。例えば順相クロマトグラフィー
用分析カラム用吸着材料としては、市販ゲル吸着剤「テ
ィー・エス・ケイ・ジェルアミド−８０（ＴＳＫｇｅｌ
Ａｍｉｄｅ−８０、東ソー社製、商品名）」が好まし
い。
ムとして、イオン交換クロマトグラフィー用分析カラ
ム、逆相クロマトグラフィー用分析カラム、順相クロマ
トグラフィー用分析カラムなどを用いることができる
が、糖の保持力が分子量に比例している傾向がある点
や、分子量の大きな糖（分子量５０００〜１００００程
度）まで分析できる点で特に順相クロマトグラフィー用
分析カラムが好ましい。例えば順相クロマトグラフィー
用分析カラム用吸着材料としては、市販ゲル吸着剤「テ
ィー・エス・ケイ・ジェルアミド−８０（ＴＳＫｇｅｌ
Ａｍｉｄｅ−８０、東ソー社製、商品名）」が好まし
い。
【００１７】本発明方法において、移動相として使用す
る溶媒は流速０．２〜１．６ｍｌ／分で送液するのが好
ましい。移動相として使用する溶媒は分析カラムによっ
ても異なるが、順相クロマトグラフィー用分析カラムを
用いる場合は、アセトニトリル／水（アセトニトリルと
水の混合溶媒を意味する。以下同じ）、アセトン／水、
１，４‐ジオキサン／水、メチルアルコール／水、エチ
ルアルコール／水などの２成分系の混合溶媒、アセトニ
トリル／メチルアルコール／水、アセトニトリル／エチ
ルアルコール／水などの３成分系の混合溶媒などを用い
ることができる。
る溶媒は流速０．２〜１．６ｍｌ／分で送液するのが好
ましい。移動相として使用する溶媒は分析カラムによっ
ても異なるが、順相クロマトグラフィー用分析カラムを
用いる場合は、アセトニトリル／水（アセトニトリルと
水の混合溶媒を意味する。以下同じ）、アセトン／水、
１，４‐ジオキサン／水、メチルアルコール／水、エチ
ルアルコール／水などの２成分系の混合溶媒、アセトニ
トリル／メチルアルコール／水、アセトニトリル／エチ
ルアルコール／水などの３成分系の混合溶媒などを用い
ることができる。
【００１８】さらに、これらにギ酸アンモニウム、リン
酸二水素カリウム、酢酸−トリエチルアミンなどの塩類
やトリヒドロキシメチルアミノメタン、エタノールアミ
ン、トリエチルアミンなどの塩基を含むものなども用い
ることができる。好ましいのは、アセトニトリル／水の
２成分系の混合溶媒である。これらは、よりシャープな
ピークを得る目的で移動相としての溶媒に１００ｍｍｏ
ｌ程度添加される。
酸二水素カリウム、酢酸−トリエチルアミンなどの塩類
やトリヒドロキシメチルアミノメタン、エタノールアミ
ン、トリエチルアミンなどの塩基を含むものなども用い
ることができる。好ましいのは、アセトニトリル／水の
２成分系の混合溶媒である。これらは、よりシャープな
ピークを得る目的で移動相としての溶媒に１００ｍｍｏ
ｌ程度添加される。
【００１９】本発明方法においては、移動相として異な
る２種類以上の溶媒を用いるが、特に好ましい溶媒の例
としては、アセトニトリル／蒸留水（体積比７９：２
１）混合溶媒とアセトニトリル／蒸留水（体積比５８：
４２）混合溶媒を挙げることができる。本発明方法にお
いては、移動相として使用する溶媒成分の濃度を段階的
に切り替える段階溶離法、移動相として使用する溶媒成
分の濃度を勾配を持たせて変化させるグラジエント溶離
法などの方法も採用することができる。
る２種類以上の溶媒を用いるが、特に好ましい溶媒の例
としては、アセトニトリル／蒸留水（体積比７９：２
１）混合溶媒とアセトニトリル／蒸留水（体積比５８：
４２）混合溶媒を挙げることができる。本発明方法にお
いては、移動相として使用する溶媒成分の濃度を段階的
に切り替える段階溶離法、移動相として使用する溶媒成
分の濃度を勾配を持たせて変化させるグラジエント溶離
法などの方法も採用することができる。
【００２０】このようにして、液体クロマトグラフィー
用分析カラムで分離された各成分は、検出器に送るまで
の間にオンラインで誘導体化される。各成分の誘導体化
に用いる反応試薬としては例えば、エチレンジアミン、
エタノールアミン、２−シアノアセトアミド、タウリ
ン、ベンズアミジン、４−メトキシベンズアミジン、フ
ェノール／硫酸、アミノ安息香酸などを用いることがで
きる。
用分析カラムで分離された各成分は、検出器に送るまで
の間にオンラインで誘導体化される。各成分の誘導体化
に用いる反応試薬としては例えば、エチレンジアミン、
エタノールアミン、２−シアノアセトアミド、タウリ
ン、ベンズアミジン、４−メトキシベンズアミジン、フ
ェノール／硫酸、アミノ安息香酸などを用いることがで
きる。
【００２１】上記反応試薬による誘導体化反応は、反応
試薬として４‐アミノ安息香酸を用いる場合には強アル
カリ性で、エチレンジアミン、エタノールアミン、２‐
シアノアセトアミド、ベンズアミジン、４‐メトキシベ
ンズアミジンを用いる場合には弱アルカリ性で、タウリ
ンを用いる場合には中性で、フェノール／硫酸を用いる
場合には強酸性で行う。反応試薬は試薬の種類別に最適
な割合を検討し添加することが好ましい。
試薬として４‐アミノ安息香酸を用いる場合には強アル
カリ性で、エチレンジアミン、エタノールアミン、２‐
シアノアセトアミド、ベンズアミジン、４‐メトキシベ
ンズアミジンを用いる場合には弱アルカリ性で、タウリ
ンを用いる場合には中性で、フェノール／硫酸を用いる
場合には強酸性で行う。反応試薬は試薬の種類別に最適
な割合を検討し添加することが好ましい。
【００２２】液体クロマトグラフィー用分析カラムとし
て順相クロマトグラフィー用分析カラムを用いる場合
は、順相クロマトグラフィー用の移動相への溶解度が高
く、かつホウ酸緩衝液の添加なしでも反応生成物である
蛍光誘導体が十分な蛍光強度を示すという点で、上記反
応試薬のうちベンズアミジン、４‐メトキシベンズアミ
ジンなどの芳香族アミジン類が好ましい。
て順相クロマトグラフィー用分析カラムを用いる場合
は、順相クロマトグラフィー用の移動相への溶解度が高
く、かつホウ酸緩衝液の添加なしでも反応生成物である
蛍光誘導体が十分な蛍光強度を示すという点で、上記反
応試薬のうちベンズアミジン、４‐メトキシベンズアミ
ジンなどの芳香族アミジン類が好ましい。
【００２３】本発明方法における検出器としては、蛍光
検出器、紫外部吸収検出器、可視吸収検出器などを用い
ることができるが、使用し得る検出器及び測定波長は用
いる反応試薬や移動相の種類などによって選択する必要
がある。
検出器、紫外部吸収検出器、可視吸収検出器などを用い
ることができるが、使用し得る検出器及び測定波長は用
いる反応試薬や移動相の種類などによって選択する必要
がある。
【００２４】すなわち、反応試薬がエチレンジアミンの
場合には蛍光検出器（イオン交換クロマトグラフィー：
励起波長３６０ｎｍ、測定波長３８３ｎｍ、４５５ｎ
ｍ）、エタノールアミンの場合には蛍光検出器（イオン
交換クロマトグラフィー：励起波長３５７ｎｍ、測定波
長４３６ｎｍ）、２‐シアノアセトアミドの場合には蛍
光検出器（イオン交換クロマトグラフィー：励起波長３
３１ｎｍ、測定波長３８３ｎｍ）及び紫外部吸収検出器
（イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフ
ィー、配位子交換クロマトグラフィー等：測定波長２７
５〜２８０ｎｍ）、タウリンの場合には蛍光検出器（イ
オン交換クロマトグラフィー等：励起波長３５７ｎｍ、
測定波長４４０ｎｍ）、ベンズアミジンの場合には蛍光
検出器（イオン交換クロマトグラフィー、順相クロマト
グラフィー等：励起波長２８８ｎｍ、測定波長３６０ｎ
ｍ、４７０ｎｍ）、４‐メトキシベンズアミジンの場合
には蛍光検出器（イオン交換クロマトグラフィー、順相
クロマトグラフィー等：励起波長３１０ｎｍ、測定波長
４７０ｎｍ）、フェノール／硫酸の場合には可視吸収検
出器（ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー等：測定波長４８０〜４９０ｎｍ）、４‐
アミノ安息香酸の場合には可視吸収検出器（逆相クロマ
トグラフィー：測定波長４１０ｎｍ）が用いられる。な
お、かっこ内は使用するクロマトグラフィーの種類及び
検出波長を示したものである。
場合には蛍光検出器（イオン交換クロマトグラフィー：
励起波長３６０ｎｍ、測定波長３８３ｎｍ、４５５ｎ
ｍ）、エタノールアミンの場合には蛍光検出器（イオン
交換クロマトグラフィー：励起波長３５７ｎｍ、測定波
長４３６ｎｍ）、２‐シアノアセトアミドの場合には蛍
光検出器（イオン交換クロマトグラフィー：励起波長３
３１ｎｍ、測定波長３８３ｎｍ）及び紫外部吸収検出器
（イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフ
ィー、配位子交換クロマトグラフィー等：測定波長２７
５〜２８０ｎｍ）、タウリンの場合には蛍光検出器（イ
オン交換クロマトグラフィー等：励起波長３５７ｎｍ、
測定波長４４０ｎｍ）、ベンズアミジンの場合には蛍光
検出器（イオン交換クロマトグラフィー、順相クロマト
グラフィー等：励起波長２８８ｎｍ、測定波長３６０ｎ
ｍ、４７０ｎｍ）、４‐メトキシベンズアミジンの場合
には蛍光検出器（イオン交換クロマトグラフィー、順相
クロマトグラフィー等：励起波長３１０ｎｍ、測定波長
４７０ｎｍ）、フェノール／硫酸の場合には可視吸収検
出器（ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー等：測定波長４８０〜４９０ｎｍ）、４‐
アミノ安息香酸の場合には可視吸収検出器（逆相クロマ
トグラフィー：測定波長４１０ｎｍ）が用いられる。な
お、かっこ内は使用するクロマトグラフィーの種類及び
検出波長を示したものである。
【００２５】本発明方法においては、上記の公知の操作
に加えて、１つの検体の検出操作が終了するごとに検出
器２３に装着する検体収容用セル（以下検出器セルとい
う）を洗浄溶媒を用いて洗浄することが必要である。
に加えて、１つの検体の検出操作が終了するごとに検出
器２３に装着する検体収容用セル（以下検出器セルとい
う）を洗浄溶媒を用いて洗浄することが必要である。
【００２６】この際の検出器セル洗浄溶媒としては、ア
セトン、アセトニトリル、エチルアルコール、メチルア
ルコール、イソプロパノールなどの有機溶媒、硝酸など
の酸、蒸留水などが挙げられる。本発明方法における検
出器セル洗浄溶媒としては、移動相として使用する溶媒
と組成が異なるものが用いられる。移動相として使用す
る溶媒、用いる反応試薬、分析する試料の種類によって
最適な洗浄溶媒を検討し使用することが好ましい。
セトン、アセトニトリル、エチルアルコール、メチルア
ルコール、イソプロパノールなどの有機溶媒、硝酸など
の酸、蒸留水などが挙げられる。本発明方法における検
出器セル洗浄溶媒としては、移動相として使用する溶媒
と組成が異なるものが用いられる。移動相として使用す
る溶媒、用いる反応試薬、分析する試料の種類によって
最適な洗浄溶媒を検討し使用することが好ましい。
【００２７】洗浄溶媒として使用する有機溶媒濃度は、
８５〜１００質量％が好ましく、９８質量％以上が特に
好ましい。洗浄溶媒として使用する硝酸濃度は、２〜６
モルが好ましい。検出器セル洗浄溶媒と検出器セル内溶
液が混和しない場合は、検出器セル内溶液及び洗浄溶媒
の両方とも混和する溶媒で検出器セル内を置換する操作
を追加することが好ましい。例えば２〜６モルの硝酸で
検出器セルを洗浄する場合は、硝酸洗浄の前後に蒸留水
での洗浄操作を追加する。
８５〜１００質量％が好ましく、９８質量％以上が特に
好ましい。洗浄溶媒として使用する硝酸濃度は、２〜６
モルが好ましい。検出器セル洗浄溶媒と検出器セル内溶
液が混和しない場合は、検出器セル内溶液及び洗浄溶媒
の両方とも混和する溶媒で検出器セル内を置換する操作
を追加することが好ましい。例えば２〜６モルの硝酸で
検出器セルを洗浄する場合は、硝酸洗浄の前後に蒸留水
での洗浄操作を追加する。
【００２８】そして、本発明方法における検出器セルの
洗浄では、洗浄溶媒による洗浄操作と、必要時に追加す
る混和性溶媒によるセル内溶媒置換の操作を行わなけれ
ばならない。この際の検出器セル洗浄溶媒の流速は、
０．２〜２．０ｍｌ／分の範囲内で選ばれるが、洗浄溶
媒の粘性、検出器セルの耐圧力を考慮して最適の流速を
設定することが好ましい。
洗浄では、洗浄溶媒による洗浄操作と、必要時に追加す
る混和性溶媒によるセル内溶媒置換の操作を行わなけれ
ばならない。この際の検出器セル洗浄溶媒の流速は、
０．２〜２．０ｍｌ／分の範囲内で選ばれるが、洗浄溶
媒の粘性、検出器セルの耐圧力を考慮して最適の流速を
設定することが好ましい。
【００２９】また、本発明方法においては、移動相とし
て使用する溶媒の種類、反応試薬の種類、反応試薬濃
度、流速、反応条件（反応時間や反応温度など）などを
考慮して検出器セル洗浄処理の挿入回数を任意の分析回
数ごとに設定することができるが、特に１つの検体の分
析が終了するたびに検出器セル洗浄処理を挿入するのが
好ましい。
て使用する溶媒の種類、反応試薬の種類、反応試薬濃
度、流速、反応条件（反応時間や反応温度など）などを
考慮して検出器セル洗浄処理の挿入回数を任意の分析回
数ごとに設定することができるが、特に１つの検体の分
析が終了するたびに検出器セル洗浄処理を挿入するのが
好ましい。
【００３０】本発明方法において、検出器セル洗浄時間
は、移動相として使用する溶媒の種類、反応試薬の種
類、反応試薬濃度、流速、反応条件（反応時間や反応温
度など）などを考慮して任意に設定することができる
が、液体クロマトグラフィー用分析カラムとして順相ク
ロマトグラフィー用分析カラムを使用し、反応試薬とし
て芳香族アミジンを使用した分析の場合は、アセトニト
リル（９８質量％以上）、アセトン（９９質量％以
上）、エチルアルコール（９９．５質量％以上）などを
洗浄溶媒として流速０．６〜２．０ｍｌ／分で１５〜６
０分間洗浄するのが好ましい。
は、移動相として使用する溶媒の種類、反応試薬の種
類、反応試薬濃度、流速、反応条件（反応時間や反応温
度など）などを考慮して任意に設定することができる
が、液体クロマトグラフィー用分析カラムとして順相ク
ロマトグラフィー用分析カラムを使用し、反応試薬とし
て芳香族アミジンを使用した分析の場合は、アセトニト
リル（９８質量％以上）、アセトン（９９質量％以
上）、エチルアルコール（９９．５質量％以上）などを
洗浄溶媒として流速０．６〜２．０ｍｌ／分で１５〜６
０分間洗浄するのが好ましい。
【００３１】本発明方法における検出器セル洗浄処理
は、分析カラム溶出液流路切り替えにより分析カラム溶
出液が検出器セルを通過しない状態になってから開始す
るのが好ましい。検出器セル洗浄処理が終了した後から
次回の試料注入までの間に、分析カラム溶出液流路切り
替えにより分析カラム溶出液は検出器セルを通過する状
態に復元される。
は、分析カラム溶出液流路切り替えにより分析カラム溶
出液が検出器セルを通過しない状態になってから開始す
るのが好ましい。検出器セル洗浄処理が終了した後から
次回の試料注入までの間に、分析カラム溶出液流路切り
替えにより分析カラム溶出液は検出器セルを通過する状
態に復元される。
【００３２】２種類以上の異なる移動相を用いた糖質分
析を連続で行う場合は、分析終了後に分析カラム平衡化
移動相（分析開始時の移動相）で分析カラムを再平衡化
する処理が必要である。本発明方法において、検出器セ
ル洗浄処理が行われている間でも分析カラムへ移動相と
して使用する溶媒の送液を中断する必要がないため、流
量変動の少ない条件での連続分析が可能となる。また、
検出器セル洗浄処理が行われている間に、分析カラム平
衡化移動相（分析開始時の移動相）で分析カラムを再平
衡化する処理が開始できることにより、連続分析におけ
る分析間の時間の短縮ができる。
析を連続で行う場合は、分析終了後に分析カラム平衡化
移動相（分析開始時の移動相）で分析カラムを再平衡化
する処理が必要である。本発明方法において、検出器セ
ル洗浄処理が行われている間でも分析カラムへ移動相と
して使用する溶媒の送液を中断する必要がないため、流
量変動の少ない条件での連続分析が可能となる。また、
検出器セル洗浄処理が行われている間に、分析カラム平
衡化移動相（分析開始時の移動相）で分析カラムを再平
衡化する処理が開始できることにより、連続分析におけ
る分析間の時間の短縮ができる。
【００３３】本発明方法において移動相として使用する
溶媒、反応試薬液、セル洗浄溶媒がそれぞれの送液ポン
プに入る前に、溶媒中の溶存気体を脱気する処理が挿入
されている。ただし、溶媒の溶存気体を脱気する処理で
使用する脱気装置（デガッサ）の接液部材料、接ガス部
材料を侵す可能性がある溶媒、例えば２モル硝酸などは
脱気装置を通さないで使用することが好ましい。溶媒中
の溶存気体を脱気する処理の挿入目的は、溶媒由来の気
体（例えば空気）の発生によるポンプ流量精度の低下や
検出器セルに入った気体による検出妨害などを防止する
ためである。
溶媒、反応試薬液、セル洗浄溶媒がそれぞれの送液ポン
プに入る前に、溶媒中の溶存気体を脱気する処理が挿入
されている。ただし、溶媒の溶存気体を脱気する処理で
使用する脱気装置（デガッサ）の接液部材料、接ガス部
材料を侵す可能性がある溶媒、例えば２モル硝酸などは
脱気装置を通さないで使用することが好ましい。溶媒中
の溶存気体を脱気する処理の挿入目的は、溶媒由来の気
体（例えば空気）の発生によるポンプ流量精度の低下や
検出器セルに入った気体による検出妨害などを防止する
ためである。
【００３４】次に、図１の公知方法に検出器カラムの洗
浄処理を付加した本発明方法について添付図面に従って
説明する。図２は本発明方法の全体的構成を示す工程図
であって、この図において、１、２は移動相溶媒溜、
３、４は脱気装置、５、６は送液ポンプ、７はミキサー
で、グラジエント溶離法の場合には当該ミキサー７にお
いて移動相溶媒溜１からポンプ５によって送液される溶
媒１ａと、移動相溶媒溜２からポンプ６によって送液さ
れる溶媒２ａが混合される。試料注入装置の試料注入バ
ルブ８より注入された試料、すなわち糖類混合物は移動
相によって分析カラム９に導入され各成分に分離され
る。分析カラムは恒温槽１０内で一定温度に保持されて
いる。分析カラム溶出液は、試料分析時には分析カラム
溶出液流路切り替え装置１１を通り、反応槽１２へ送ら
れる。
浄処理を付加した本発明方法について添付図面に従って
説明する。図２は本発明方法の全体的構成を示す工程図
であって、この図において、１、２は移動相溶媒溜、
３、４は脱気装置、５、６は送液ポンプ、７はミキサー
で、グラジエント溶離法の場合には当該ミキサー７にお
いて移動相溶媒溜１からポンプ５によって送液される溶
媒１ａと、移動相溶媒溜２からポンプ６によって送液さ
れる溶媒２ａが混合される。試料注入装置の試料注入バ
ルブ８より注入された試料、すなわち糖類混合物は移動
相によって分析カラム９に導入され各成分に分離され
る。分析カラムは恒温槽１０内で一定温度に保持されて
いる。分析カラム溶出液は、試料分析時には分析カラム
溶出液流路切り替え装置１１を通り、反応槽１２へ送ら
れる。
【００３５】分析カラム溶出液流路切り替え装置１１
は、図３に示すように、試料分析時には分析カラム溶出
液が反応槽１２へ流れる流路が連結されている状態
（ａ）に保たれている。試料１回分の分析終了後から検
出器セル洗浄処理開始までの間に、分析カラム溶出液切
り替え装置１１の流路切り替えが行われ、分析カラム溶
出液が反応槽１２へ流れる流路が遮断され、分析カラム
溶出液の流路は廃液溜１３へ流れる状態（ｂ）に変更さ
れる。検出器セル洗浄処理終了後から次回の試料注入ま
での間に、分析カラム溶出液切り替え装置１１の流路切
り替えが再度行われ、分析カラム溶出液の流路は反応槽
１２へ流れる状態（ａ）に戻される。
は、図３に示すように、試料分析時には分析カラム溶出
液が反応槽１２へ流れる流路が連結されている状態
（ａ）に保たれている。試料１回分の分析終了後から検
出器セル洗浄処理開始までの間に、分析カラム溶出液切
り替え装置１１の流路切り替えが行われ、分析カラム溶
出液が反応槽１２へ流れる流路が遮断され、分析カラム
溶出液の流路は廃液溜１３へ流れる状態（ｂ）に変更さ
れる。検出器セル洗浄処理終了後から次回の試料注入ま
での間に、分析カラム溶出液切り替え装置１１の流路切
り替えが再度行われ、分析カラム溶出液の流路は反応槽
１２へ流れる状態（ａ）に戻される。
【００３６】１４、１５は分離した各成分を誘導体化す
るための反応試薬液溜、１６、１７は各反応試薬液溜１
４、１５内の反応試薬液１４ａ、１５ａを脱気するため
の脱気装置、１８、１９は各反応試薬液溜１４、１５内
の反応試薬液１４ａ、１５ａを送液するための送液ポン
プである。
るための反応試薬液溜、１６、１７は各反応試薬液溜１
４、１５内の反応試薬液１４ａ、１５ａを脱気するため
の脱気装置、１８、１９は各反応試薬液溜１４、１５内
の反応試薬液１４ａ、１５ａを送液するための送液ポン
プである。
【００３７】反応試薬液溜は、誘導体化すべき成分の違
いによって反応試薬を適宜交換しうるように通常複数設
けられる。分析カラム９によって分離された各成分は反
応試薬液と混合され反応槽１２内の反応コイル２０を通
過する間に誘導体化され、冷却槽２１内で一定温度で保
たれた冷却コイル２２で冷却された後、検出器２３にお
いて検出される。検出信号はデーター処理装置２４で処
理される。検出器２３より溶出した廃液は、廃液溜２５
に集められる。
いによって反応試薬を適宜交換しうるように通常複数設
けられる。分析カラム９によって分離された各成分は反
応試薬液と混合され反応槽１２内の反応コイル２０を通
過する間に誘導体化され、冷却槽２１内で一定温度で保
たれた冷却コイル２２で冷却された後、検出器２３にお
いて検出される。検出信号はデーター処理装置２４で処
理される。検出器２３より溶出した廃液は、廃液溜２５
に集められる。
【００３８】２６、２７は検出器セルを洗浄するための
洗浄溶媒溜、２６ａ、２７ａは各洗浄溶媒溜内の洗浄溶
媒である。２８、２９は各洗浄溶媒溜２６、２７内の洗
浄溶媒２６ａ、２７ａを脱気するための脱気装置であ
る。
洗浄溶媒溜、２６ａ、２７ａは各洗浄溶媒溜内の洗浄溶
媒である。２８、２９は各洗浄溶媒溜２６、２７内の洗
浄溶媒２６ａ、２７ａを脱気するための脱気装置であ
る。
【００３９】３０は反応試薬液と洗浄溶媒との流路切り
替え装置で、反応試薬液溜１５が脱気装置１７を介して
送液ポンプ１９に連結する流路位置（図２ではＳＰ１と
記載）、洗浄溶媒溜２６が脱気装置２８を介して送液ポ
ンプ１９に連結する流路位置（図２ではＳＰ２と記
載）、洗浄溶媒溜２７が脱気装置２９を介して送液ポン
プ１９に連結する流路位置（図２ではＳＰ３と記載）の
合計３種の流路位置からいずれか１つの流路を選択し連
結する装置である。
替え装置で、反応試薬液溜１５が脱気装置１７を介して
送液ポンプ１９に連結する流路位置（図２ではＳＰ１と
記載）、洗浄溶媒溜２６が脱気装置２８を介して送液ポ
ンプ１９に連結する流路位置（図２ではＳＰ２と記
載）、洗浄溶媒溜２７が脱気装置２９を介して送液ポン
プ１９に連結する流路位置（図２ではＳＰ３と記載）の
合計３種の流路位置からいずれか１つの流路を選択し連
結する装置である。
【００４０】反応試薬液と洗浄溶媒との流路切り替え装
置３０は、試料分析時には反応試薬液溜１５が脱気装置
１７を介して送液ポンプ１９と連結されている流路位置
（図２ではＳＰ１と記載）にあり、ポンプ１９より反応
試薬液１５ａが送液されている。１つの検体の分析終了
後から検出器セル洗浄処理開始までの間に、流路切り替
え装置３０の流路切り替えが行われ、反応試薬液溜１５
が脱気装置１７を介して送液ポンプ１９に連結する流路
が遮断され、洗浄溶媒溜２６が脱気装置２８を介して送
液ポンプ１９に連結する流路又は洗浄溶媒溜２７が脱気
装置２９を介して送液ポンプ１９に連結する流路のどち
らか一方の流路が開かれ、ポンプ１９より洗浄溶媒２６
ａ又は２７ａが送液される。
置３０は、試料分析時には反応試薬液溜１５が脱気装置
１７を介して送液ポンプ１９と連結されている流路位置
（図２ではＳＰ１と記載）にあり、ポンプ１９より反応
試薬液１５ａが送液されている。１つの検体の分析終了
後から検出器セル洗浄処理開始までの間に、流路切り替
え装置３０の流路切り替えが行われ、反応試薬液溜１５
が脱気装置１７を介して送液ポンプ１９に連結する流路
が遮断され、洗浄溶媒溜２６が脱気装置２８を介して送
液ポンプ１９に連結する流路又は洗浄溶媒溜２７が脱気
装置２９を介して送液ポンプ１９に連結する流路のどち
らか一方の流路が開かれ、ポンプ１９より洗浄溶媒２６
ａ又は２７ａが送液される。
【００４１】検出器セル洗浄処理において２種類以上の
洗浄溶媒を使用して検出器セル洗浄を行う場合に、ポン
プ１９によって送液される洗浄溶媒の変更は流路切り替
え装置３０の流路切り替えによって行われる。検出器セ
ル洗浄処理終了後から次回の試料注入までの間に、流路
切り替え装置３０の流路切り替えが行われ、反応試薬液
溜１５が脱気装置１７を介して送液ポンプ１９に連結す
る流路（図２ではＳＰ１と記載）が再度開かれ、ポンプ
１９によって反応試薬液１５ａが送液される。図２には
２種類の洗浄溶媒２６ａ、２７ａで検出器セル洗浄を行
うように示されているが、洗浄溶媒は１種類でも可能な
場合がある。
洗浄溶媒を使用して検出器セル洗浄を行う場合に、ポン
プ１９によって送液される洗浄溶媒の変更は流路切り替
え装置３０の流路切り替えによって行われる。検出器セ
ル洗浄処理終了後から次回の試料注入までの間に、流路
切り替え装置３０の流路切り替えが行われ、反応試薬液
溜１５が脱気装置１７を介して送液ポンプ１９に連結す
る流路（図２ではＳＰ１と記載）が再度開かれ、ポンプ
１９によって反応試薬液１５ａが送液される。図２には
２種類の洗浄溶媒２６ａ、２７ａで検出器セル洗浄を行
うように示されているが、洗浄溶媒は１種類でも可能な
場合がある。
【００４２】また、１つの検体分の分析終了時の検出器
セル内溶液又は反応試薬液１５ａが検出器セル洗浄溶媒
と混和しない性質を有するときは、分析終了時の検出器
セル内溶液あるいは反応試薬液１５ａに対して混和する
性質を有し、かつ検出器セル洗浄溶媒とも混和する性質
を有する溶媒で検出器セル内及び流路を変換してから検
出器セル洗浄溶媒での検出器セル洗浄を行う必要がある
が、この場合、図２に示した洗浄溶媒溜２６，２７のい
ずれか一方を検出器セル内及び流路置換に用いる溶媒を
入れた置換溶媒溜として使用する。脱気装置１６と送液
ポンプ１８との間に流路切り替え装置３０と同等の流路
切り替え装置１基を挿入し、洗浄液２６ａ、２７ａと同
じ洗浄溶媒の入った洗浄溶媒溜を装着することにより２
つの送液ポンプ１８、１９を使用して検出器セル洗浄を
行うこともできる。
セル内溶液又は反応試薬液１５ａが検出器セル洗浄溶媒
と混和しない性質を有するときは、分析終了時の検出器
セル内溶液あるいは反応試薬液１５ａに対して混和する
性質を有し、かつ検出器セル洗浄溶媒とも混和する性質
を有する溶媒で検出器セル内及び流路を変換してから検
出器セル洗浄溶媒での検出器セル洗浄を行う必要がある
が、この場合、図２に示した洗浄溶媒溜２６，２７のい
ずれか一方を検出器セル内及び流路置換に用いる溶媒を
入れた置換溶媒溜として使用する。脱気装置１６と送液
ポンプ１８との間に流路切り替え装置３０と同等の流路
切り替え装置１基を挿入し、洗浄液２６ａ、２７ａと同
じ洗浄溶媒の入った洗浄溶媒溜を装着することにより２
つの送液ポンプ１８、１９を使用して検出器セル洗浄を
行うこともできる。
【００４３】なお、上記の例では移動相として使用する
溶媒溜、反応試薬液溜、検出器セル洗浄溶媒溜をそれぞ
れ２つ設けた場合について示したが、３つ以上の移動相
として使用する溶媒溜、反応試薬溶液溜、検出器セル洗
浄溶媒溜を設け３つ以上の移動相として使用する溶媒、
反応試薬液、検出器セル洗浄溶媒を用いうるように構成
することもできる。
溶媒溜、反応試薬液溜、検出器セル洗浄溶媒溜をそれぞ
れ２つ設けた場合について示したが、３つ以上の移動相
として使用する溶媒溜、反応試薬溶液溜、検出器セル洗
浄溶媒溜を設け３つ以上の移動相として使用する溶媒、
反応試薬液、検出器セル洗浄溶媒を用いうるように構成
することもできる。
【００４４】
【実施例】次に、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定され
るものではない。
明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定され
るものではない。
【００４５】実施例
図２において溶媒１ａとしてアセトニトリル／蒸留水
（体積比７９：２１）混合溶媒を、溶媒２ａとしてアセ
トニトリル／蒸留水（体積比５８：４２）混合溶媒を、
反応試薬液１４ａとして１．０Ｍ水酸化カリウム溶液
を、反応試薬液１５ａとしてアセトニトリル／蒸留水
（体積比４０：６０）混合溶媒に１００ｍＭベンズアミ
ジン塩酸塩一水和物を溶解した溶液を、検出器セル洗浄
溶媒２６ａとして蒸留水を、検出器セル洗浄溶媒２７ａ
としてアセトニトリル（９８質量％以上）をそれぞれ用
いた。
（体積比７９：２１）混合溶媒を、溶媒２ａとしてアセ
トニトリル／蒸留水（体積比５８：４２）混合溶媒を、
反応試薬液１４ａとして１．０Ｍ水酸化カリウム溶液
を、反応試薬液１５ａとしてアセトニトリル／蒸留水
（体積比４０：６０）混合溶媒に１００ｍＭベンズアミ
ジン塩酸塩一水和物を溶解した溶液を、検出器セル洗浄
溶媒２６ａとして蒸留水を、検出器セル洗浄溶媒２７ａ
としてアセトニトリル（９８質量％以上）をそれぞれ用
いた。
【００４６】各溶媒中の溶存気体の脱気装置３，４，１
６，１７，２８，２９としてオンライン式脱気装置（東
ソー社製）を用いた。移動相送液用送液ポンプ５，６と
して東ソー社製のＣＣＰＭ−ＩＩ型送液ポンプを使用し
て、ＰＸ−８０２０型ポンプコントローラーで制御して
溶媒１ａと溶媒２ａの高圧グラジエントを行った。
６，１７，２８，２９としてオンライン式脱気装置（東
ソー社製）を用いた。移動相送液用送液ポンプ５，６と
して東ソー社製のＣＣＰＭ−ＩＩ型送液ポンプを使用し
て、ＰＸ−８０２０型ポンプコントローラーで制御して
溶媒１ａと溶媒２ａの高圧グラジエントを行った。
【００４７】反応試薬液及び洗浄溶媒送液用送液ポンプ
１８，１９として東ソー社製のＣＣＰＭ−ＩＩ型送液ポ
ンプ樹脂仕様を使用して、ＰＸ−８０２０型ポンプコン
トローラーで制御した。ミキサー７として東ソー社製の
ＭＸ−８０１０型ダイナミックミキサーを使用した。試
料としてリボース（２．０μｇ／ｍｌ）、フルクトース
（２．０μｇ／ｍｌ）、グルコース（２．０μｇ／ｍ
ｌ）、ラミナリビオース（２．０μｇ／ｍｌ）、ラミナ
リトリオース（２．０μｇ／ｍｌ）、ラミナリテトラオ
ース（２．０μｇ／ｍｌ）、ラミナリペンタオース
（２．０μｇ／ｍｌ）、ラミナリヘキサオース（２．０
μｇ／ｍｌ）、ラミナリヘプタオース（２．０μｇ／ｍ
ｌ）を含む溶液を用い、この溶液１０μｌを試料注入装
置の試料注入バルブ８より注入した。試料注入装置とし
て東ソー社製のＡＳ−８０２０型オートサンプラーを使
用した。分析カラム９としては東ソー社製のＴＳＫｇｅ
ｌ Ａｍｉｄｅ−８０（内径４．６ｍｍ、長さ２５ｃ
ｍ）を、８０℃に温度制御した恒温槽１０内に設置して
使用した。恒温槽１０として東ソー社製のＣＯ−８０２
０型カラム恒温槽を用いた。
１８，１９として東ソー社製のＣＣＰＭ−ＩＩ型送液ポ
ンプ樹脂仕様を使用して、ＰＸ−８０２０型ポンプコン
トローラーで制御した。ミキサー７として東ソー社製の
ＭＸ−８０１０型ダイナミックミキサーを使用した。試
料としてリボース（２．０μｇ／ｍｌ）、フルクトース
（２．０μｇ／ｍｌ）、グルコース（２．０μｇ／ｍ
ｌ）、ラミナリビオース（２．０μｇ／ｍｌ）、ラミナ
リトリオース（２．０μｇ／ｍｌ）、ラミナリテトラオ
ース（２．０μｇ／ｍｌ）、ラミナリペンタオース
（２．０μｇ／ｍｌ）、ラミナリヘキサオース（２．０
μｇ／ｍｌ）、ラミナリヘプタオース（２．０μｇ／ｍ
ｌ）を含む溶液を用い、この溶液１０μｌを試料注入装
置の試料注入バルブ８より注入した。試料注入装置とし
て東ソー社製のＡＳ−８０２０型オートサンプラーを使
用した。分析カラム９としては東ソー社製のＴＳＫｇｅ
ｌ Ａｍｉｄｅ−８０（内径４．６ｍｍ、長さ２５ｃ
ｍ）を、８０℃に温度制御した恒温槽１０内に設置して
使用した。恒温槽１０として東ソー社製のＣＯ−８０２
０型カラム恒温槽を用いた。
【００４８】溶離法としては予め溶媒１ａが移動相中に
占める割合が１００％となるように送液してカラムを試
料注入前に平衡化しておき、試料注入直後に溶媒２ａの
混合を開始し、時間経過と比例して移動相中の溶媒２ａ
濃度を直線的に上昇させ、試料注入後３５．０分に移動
相中に占める溶媒２ａの割合が１００％となるように組
成変化させる溶媒２ａの直線勾配濃度上昇溶離法（グラ
ジエント溶離法）を採用した。
占める割合が１００％となるように送液してカラムを試
料注入前に平衡化しておき、試料注入直後に溶媒２ａの
混合を開始し、時間経過と比例して移動相中の溶媒２ａ
濃度を直線的に上昇させ、試料注入後３５．０分に移動
相中に占める溶媒２ａの割合が１００％となるように組
成変化させる溶媒２ａの直線勾配濃度上昇溶離法（グラ
ジエント溶離法）を採用した。
【００４９】試料注入後、３５．０分経過した後は移動
相中に占める溶媒２ａの割合が１００％の状態で送液を
継続した。移動相の送液速度は０．８ｍｌ／分、反応試
薬液１４ａの送液速度は流速０．６ｍｌ／分、反応試薬
液１５ａの送液速度は０．６ｍｌ／分にそれぞれ設定し
た。カラム９で分離された成分の誘導体化反応は反応槽
１２内に設置した反応コイル２０（内径０．４ｍｍ、長
さ２０ｍ、ステンレス鋼製）内で行った。反応槽２０と
して東ソー社製のＲＥ−８０２０型反応槽を９５℃に温
度制御して使用した。
相中に占める溶媒２ａの割合が１００％の状態で送液を
継続した。移動相の送液速度は０．８ｍｌ／分、反応試
薬液１４ａの送液速度は流速０．６ｍｌ／分、反応試薬
液１５ａの送液速度は０．６ｍｌ／分にそれぞれ設定し
た。カラム９で分離された成分の誘導体化反応は反応槽
１２内に設置した反応コイル２０（内径０．４ｍｍ、長
さ２０ｍ、ステンレス鋼製）内で行った。反応槽２０と
して東ソー社製のＲＥ−８０２０型反応槽を９５℃に温
度制御して使用した。
【００５０】反応コイル２０から溶出した反応混合物を
恒温槽２１内に設置した冷却コイル２２（内径０．２５
ｍｍ、長さ４ｍ、テフロン（登録商標）製）内で冷却し
た後、蛍光検出器２３において検出した。恒温槽２１と
してアドバンテック東洋社製のＬＣＨ−２０００型冷却
槽を９℃に温度制御して使用した。分析カラム９と反応
槽１２との間に装着する分析カラム溶出液流路切り替え
装置１１として東ソー社製のスイッチングバルブユニッ
トを装備したＶＣ−８０２０型バルブコントローラーを
使用した。
恒温槽２１内に設置した冷却コイル２２（内径０．２５
ｍｍ、長さ４ｍ、テフロン（登録商標）製）内で冷却し
た後、蛍光検出器２３において検出した。恒温槽２１と
してアドバンテック東洋社製のＬＣＨ−２０００型冷却
槽を９℃に温度制御して使用した。分析カラム９と反応
槽１２との間に装着する分析カラム溶出液流路切り替え
装置１１として東ソー社製のスイッチングバルブユニッ
トを装備したＶＣ−８０２０型バルブコントローラーを
使用した。
【００５１】分析カラム溶出液流路切り替え装置１１を
用いて、試料分析時には分析カラム溶出液が反応コイル
１２へ送液され［図３で状態（ａ）と記載］、検出器セ
ル洗浄処理には分析カラム溶出液が廃液溜１３へ送液さ
れるように［図３で状態（ｂ）と記載］分析カラム溶出
液流路切り替えを行った。データ収集時間を５０分、分
析終了から次回試料注入までの間隔を４０分に設定し、
９０分毎に試料注入を行った。１回の試料分析終了ごと
に検出器セルの洗浄を行った。
用いて、試料分析時には分析カラム溶出液が反応コイル
１２へ送液され［図３で状態（ａ）と記載］、検出器セ
ル洗浄処理には分析カラム溶出液が廃液溜１３へ送液さ
れるように［図３で状態（ｂ）と記載］分析カラム溶出
液流路切り替えを行った。データ収集時間を５０分、分
析終了から次回試料注入までの間隔を４０分に設定し、
９０分毎に試料注入を行った。１回の試料分析終了ごと
に検出器セルの洗浄を行った。
【００５２】送液ポンプ１９と脱気装置１７との間に装
着する反応試薬液と洗浄溶媒との流路切り替え装置３０
として東ソー社製のソレノイドバルブユニットを装備し
たＶＣ−８０２０型バルブコントローラーを使用した。
反応試薬液と洗浄溶媒との流路切り替え装置３０を用い
て、試料分析時には反応試薬液１５ａが送液ポンプ１９
によって送液され（図２で流路位置ＳＰ１と記載）、検
出器セル洗浄工程などでは洗浄溶媒２６ａ（図２で流路
位置ＳＰ２と記載）又は２７ａ（図２で流路位置ＳＰ３
と記載）が送液される流路位置になるように流路切り替
えを行った。
着する反応試薬液と洗浄溶媒との流路切り替え装置３０
として東ソー社製のソレノイドバルブユニットを装備し
たＶＣ−８０２０型バルブコントローラーを使用した。
反応試薬液と洗浄溶媒との流路切り替え装置３０を用い
て、試料分析時には反応試薬液１５ａが送液ポンプ１９
によって送液され（図２で流路位置ＳＰ１と記載）、検
出器セル洗浄工程などでは洗浄溶媒２６ａ（図２で流路
位置ＳＰ２と記載）又は２７ａ（図２で流路位置ＳＰ３
と記載）が送液される流路位置になるように流路切り替
えを行った。
【００５３】検出器セル洗浄処理は、最初に検出器セル
洗浄溶媒２６ａを流速２．０ｍｌ／分で２．８分間送
液、２番目に検出器セル洗浄溶媒２７ａを流速２．０ｍ
ｌ／分で１５分間送液、３番目にセル洗浄溶媒２６ａを
流速２．０ｍｌ／分で３分間送液することにより行っ
た。検出器セル洗浄処理開始後すぐに、移動相組成を溶
媒１ａ１００％に切り替えて送液することにより、分析
カラム平衡化移動相（分析開始時の移動相）で分析カラ
ムを再平衡化する処理を開始した。次回の試料注入まで
移動相組成を溶媒１ａ１００％で送液する状態を保持し
た。
洗浄溶媒２６ａを流速２．０ｍｌ／分で２．８分間送
液、２番目に検出器セル洗浄溶媒２７ａを流速２．０ｍ
ｌ／分で１５分間送液、３番目にセル洗浄溶媒２６ａを
流速２．０ｍｌ／分で３分間送液することにより行っ
た。検出器セル洗浄処理開始後すぐに、移動相組成を溶
媒１ａ１００％に切り替えて送液することにより、分析
カラム平衡化移動相（分析開始時の移動相）で分析カラ
ムを再平衡化する処理を開始した。次回の試料注入まで
移動相組成を溶媒１ａ１００％で送液する状態を保持し
た。
【００５４】また、検出器２３として東ソー社製のＦＳ
−８０２０型蛍光検出器を、データ処理装置２４として
東ソー社製のＬＣ−８０２０型データプロセッサをそれ
ぞれ用いた。各溶媒送液ポンプ５，６，１８，１９の流
速などの送液制御、分析カラム溶出液流路切り替え装置
１１及び反応試薬液と洗浄溶媒との流路切り替え装置３
０の分析開始から９０分までの制御プログラムを表１に
示す。
−８０２０型蛍光検出器を、データ処理装置２４として
東ソー社製のＬＣ−８０２０型データプロセッサをそれ
ぞれ用いた。各溶媒送液ポンプ５，６，１８，１９の流
速などの送液制御、分析カラム溶出液流路切り替え装置
１１及び反応試薬液と洗浄溶媒との流路切り替え装置３
０の分析開始から９０分までの制御プログラムを表１に
示す。
【００５５】この表において、［ ］内は送液している
溶媒を、（ ）内はその流速を意味する。移動相溶媒送
液ポンプの流速は０．８ｍｌ／分に固定し、データ収集
時間は試料注入後５０分間であり、分析終了から次の試
料注入までの間隔を４０分間とし、９０分ごとに試料注
入した。また、検出器セルの洗浄は分析終了ごとに行っ
た。
溶媒を、（ ）内はその流速を意味する。移動相溶媒送
液ポンプの流速は０．８ｍｌ／分に固定し、データ収集
時間は試料注入後５０分間であり、分析終了から次の試
料注入までの間隔を４０分間とし、９０分ごとに試料注
入した。また、検出器セルの洗浄は分析終了ごとに行っ
た。
【００５６】当該分析プログラムを用いて同一試料につ
いて１２回の連続分析を行った。得られたクロマトグラ
ムの一部を図４に示す。図４において、ａ、ｂ、ｃは、
それぞれ単糖類のリボース、フルクトース、グルコース
を、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉはそれぞれ少糖類のラミナ
リビオース、ラミナリトリオース、ラミナリテトラオー
ス、ラミナリペンタオース、ラミナリヘキサオース、ラ
ミナリヘプタオースを示す。
いて１２回の連続分析を行った。得られたクロマトグラ
ムの一部を図４に示す。図４において、ａ、ｂ、ｃは、
それぞれ単糖類のリボース、フルクトース、グルコース
を、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉはそれぞれ少糖類のラミナ
リビオース、ラミナリトリオース、ラミナリテトラオー
ス、ラミナリペンタオース、ラミナリヘキサオース、ラ
ミナリヘプタオースを示す。
【００５７】図４に示されるように各単糖相互及び各少
糖類相互が完全に分離され、これらの完全溶出までに要
した時間は４５分以内であった。分析した還元糖のうち
グルコースとラミナリビオースについて行った１２回の
分析の糖ピークの保持時間（分）とピークの高さ（蛍光
強度：ｍＶ）についての測定値を表２に示す。
糖類相互が完全に分離され、これらの完全溶出までに要
した時間は４５分以内であった。分析した還元糖のうち
グルコースとラミナリビオースについて行った１２回の
分析の糖ピークの保持時間（分）とピークの高さ（蛍光
強度：ｍＶ）についての測定値を表２に示す。
【００５８】グルコース及びラミナリビオースの各還元
糖に基づく保持時間の変動係数ＣＶ（相対標準偏差）は
それぞれ０．１１６％、０．１４３％、蛍光ピーク高さ
の変動係数ＣＶ（相対標準偏差）はそれぞれ０．９４２
％、１．１４％であった。なお、変動係数ＣＶ（相対標
準偏差）は、試料の標準偏差Ｓ（Ｓ＝σn-1）を試料の
平均ｘで割った値に１００を乗じて算出した。以上の結
果から、本発明方法によると、単糖類及び少糖類を含む
試料を高感度で検出可能であり、単糖類間の高度分離が
達成でき、かつ少糖類の短時間での完全溶出ができるこ
とが分る。さらに、変動係数ＣＶの結果から連続分析に
おいて得られた分析値の再現性も高いことが分る。
糖に基づく保持時間の変動係数ＣＶ（相対標準偏差）は
それぞれ０．１１６％、０．１４３％、蛍光ピーク高さ
の変動係数ＣＶ（相対標準偏差）はそれぞれ０．９４２
％、１．１４％であった。なお、変動係数ＣＶ（相対標
準偏差）は、試料の標準偏差Ｓ（Ｓ＝σn-1）を試料の
平均ｘで割った値に１００を乗じて算出した。以上の結
果から、本発明方法によると、単糖類及び少糖類を含む
試料を高感度で検出可能であり、単糖類間の高度分離が
達成でき、かつ少糖類の短時間での完全溶出ができるこ
とが分る。さらに、変動係数ＣＶの結果から連続分析に
おいて得られた分析値の再現性も高いことが分る。
【００５９】
【表１】
【００６０】
【表２】
【００６１】比較例１
検出器セル洗浄処理を行わずに、実施例１と同様の試料
を実施例１と同様の装置（図２）を用いて１２回連続し
て分析した。分析カラム溶出液流路切り替え装置１１は
状態（ａ）の状態に、反応試薬液と洗浄溶媒との流路切
り替え装置３０は流路位置ＳＰ１の状態に固定した。移
動相溶媒１ａ、移動相溶媒２ａ、反応試薬液１４ａ，反
応試薬液１５ａは実施例１と同様の溶媒を使用した。移
動相溶媒送液ポンプ５、６の制御は実施例１と同様のプ
ログラムを使用し、移動相は流速０．８ｍｌ／分で送液
した（表１参照）。連続分析の間、反応試薬液１４ａを
流速０．６ｍｌ／分で、反応試薬液１５ａを流速０．６
ｍｌ／分で送液した。その他の分析条件は実施例１と同
様であった。分析した還元糖のうちグルコースとラミナ
リビオースについて、ピークの高さ（蛍光強度：ｍＶ）
について表３に示す。
を実施例１と同様の装置（図２）を用いて１２回連続し
て分析した。分析カラム溶出液流路切り替え装置１１は
状態（ａ）の状態に、反応試薬液と洗浄溶媒との流路切
り替え装置３０は流路位置ＳＰ１の状態に固定した。移
動相溶媒１ａ、移動相溶媒２ａ、反応試薬液１４ａ，反
応試薬液１５ａは実施例１と同様の溶媒を使用した。移
動相溶媒送液ポンプ５、６の制御は実施例１と同様のプ
ログラムを使用し、移動相は流速０．８ｍｌ／分で送液
した（表１参照）。連続分析の間、反応試薬液１４ａを
流速０．６ｍｌ／分で、反応試薬液１５ａを流速０．６
ｍｌ／分で送液した。その他の分析条件は実施例１と同
様であった。分析した還元糖のうちグルコースとラミナ
リビオースについて、ピークの高さ（蛍光強度：ｍＶ）
について表３に示す。
【００６２】グルコース及びラミナリビオースの各還元
糖に基づく蛍光ピーク高さの変動係数ＣＶ（相対標準偏
差）は、それぞれ３．６５％、４．５８％であった。検
出器セル洗浄処理が含まれていない比較例１によって得
られたグルコースとラミナリビオースの変動係数ＣＶ値
は、実施例１の変動係数ＣＶ値のそれぞれ３．９倍と
４．０倍に相当した。なお、変動係数ＣＶ値は、小さい
ほど分析の再現性がよい。以上の結果から、検出器セル
洗浄処理を行わない比較例１では、分析値の再現性が実
施例１よりも低いことが分る。
糖に基づく蛍光ピーク高さの変動係数ＣＶ（相対標準偏
差）は、それぞれ３．６５％、４．５８％であった。検
出器セル洗浄処理が含まれていない比較例１によって得
られたグルコースとラミナリビオースの変動係数ＣＶ値
は、実施例１の変動係数ＣＶ値のそれぞれ３．９倍と
４．０倍に相当した。なお、変動係数ＣＶ値は、小さい
ほど分析の再現性がよい。以上の結果から、検出器セル
洗浄処理を行わない比較例１では、分析値の再現性が実
施例１よりも低いことが分る。
【００６３】
【表３】
【００６４】比較例２
実施例１で検出器セル洗浄処理において流路切り替え装
置による分析カラム溶出液流路切り替えを採用した代わ
りに、１回の試料分析ごとに検出器セル洗浄を行う際に
分析カラムを取り外して検出器セルを洗浄して、実施例
１と同様の試料を実施例１と同様の装置（図２）を用い
て１２回連続して分析した。分析カラム溶出液流路切り
替え装置１１は状態（ａ）の状態に、反応試薬液と洗浄
溶媒との流路切り替え装置３０は流路位置ＳＰ１の状態
に固定した。
置による分析カラム溶出液流路切り替えを採用した代わ
りに、１回の試料分析ごとに検出器セル洗浄を行う際に
分析カラムを取り外して検出器セルを洗浄して、実施例
１と同様の試料を実施例１と同様の装置（図２）を用い
て１２回連続して分析した。分析カラム溶出液流路切り
替え装置１１は状態（ａ）の状態に、反応試薬液と洗浄
溶媒との流路切り替え装置３０は流路位置ＳＰ１の状態
に固定した。
【００６５】移動相溶媒１ａ、移動相溶媒２ａ、反応試
薬液１４ａ，反応試薬液１５ａは実施例１と同様の溶媒
を使用した。移動相溶媒送液ポンプ５、６の制御は実施
例１と同様のプログラムを使用し、移動相は流速０．８
ｍｌ／分で送液した（表１参照）。連続分析の間、反応
試薬液１４ａを流速０．６ｍｌ／分で、反応試薬液１５
ａを流速０．６ｍｌ／分で送液した。
薬液１４ａ，反応試薬液１５ａは実施例１と同様の溶媒
を使用した。移動相溶媒送液ポンプ５、６の制御は実施
例１と同様のプログラムを使用し、移動相は流速０．８
ｍｌ／分で送液した（表１参照）。連続分析の間、反応
試薬液１４ａを流速０．６ｍｌ／分で、反応試薬液１５
ａを流速０．６ｍｌ／分で送液した。
【００６６】検出器セル洗浄は次のように行った。試料
注入後５０．０分経過しデータ収集が終了した後に、す
べての送液ポンプを停止し、分析カラムを取り外し、分
析カラムの代わりにステンレス鋼製チューブを取り付
け、検出器セル洗浄処理を行った。検出器セル洗浄処理
は、最初に検出器セル洗浄溶媒２６ａを流速２．０ｍｌ
／分で２．８分間送液、２番目に検出器セル洗浄溶媒２
７ａを流速２．０ｍｌ／分で１５分間送液、３番目にセ
ル洗浄溶媒２６ａを流速２．０ｍｌ／分で３分間送液す
ることにより行った。
注入後５０．０分経過しデータ収集が終了した後に、す
べての送液ポンプを停止し、分析カラムを取り外し、分
析カラムの代わりにステンレス鋼製チューブを取り付
け、検出器セル洗浄処理を行った。検出器セル洗浄処理
は、最初に検出器セル洗浄溶媒２６ａを流速２．０ｍｌ
／分で２．８分間送液、２番目に検出器セル洗浄溶媒２
７ａを流速２．０ｍｌ／分で１５分間送液、３番目にセ
ル洗浄溶媒２６ａを流速２．０ｍｌ／分で３分間送液す
ることにより行った。
【００６７】検出器セル洗浄処理開始後、ステンレス鋼
製チューブの代わりに分析カラムを取り付け、移動相組
成を溶媒１ａのみに切り替えて送液ポンプ５，６から送
液すると共に、反応試薬液１４ａを送液ポンプ１８で、
反応試薬液１５ａを送液ポンプ１９で送液を再開した。
分析カラム平衡化移動相（分析開始時の移動相）での分
析カラム再平衡化を３０分間行った後に、次回の試料注
入を行った。その他の分析条件は実施例１と同様の条件
で行った。分析した還元糖のうちグルコースとラミナリ
ビオースについての、保持時間（分）を表４に示した。
製チューブの代わりに分析カラムを取り付け、移動相組
成を溶媒１ａのみに切り替えて送液ポンプ５，６から送
液すると共に、反応試薬液１４ａを送液ポンプ１８で、
反応試薬液１５ａを送液ポンプ１９で送液を再開した。
分析カラム平衡化移動相（分析開始時の移動相）での分
析カラム再平衡化を３０分間行った後に、次回の試料注
入を行った。その他の分析条件は実施例１と同様の条件
で行った。分析した還元糖のうちグルコースとラミナリ
ビオースについての、保持時間（分）を表４に示した。
【００６８】グルコース及びラミナリビオースの各還元
糖の保持時間（分）に関する変動係数ＣＶ（相対標準偏
差）は、それぞれ０．１５７％、０．２４４％であっ
た。検出器セル洗浄工程の際に分析カラムを取り外す操
作を含んでいる（すなわち移動相送液ポンプが連続分析
中に停止、再始動を繰り返す）比較例２によって得られ
たグルコースとラミナリビオースの変動係数ＣＶ値は、
実施例１の変動係数ＣＶ値のそれぞれ１．４倍と１．７
倍に相当した。なお、変動係数ＣＶ値は、小さいほど分
析の再現性がよいことを示している。
糖の保持時間（分）に関する変動係数ＣＶ（相対標準偏
差）は、それぞれ０．１５７％、０．２４４％であっ
た。検出器セル洗浄工程の際に分析カラムを取り外す操
作を含んでいる（すなわち移動相送液ポンプが連続分析
中に停止、再始動を繰り返す）比較例２によって得られ
たグルコースとラミナリビオースの変動係数ＣＶ値は、
実施例１の変動係数ＣＶ値のそれぞれ１．４倍と１．７
倍に相当した。なお、変動係数ＣＶ値は、小さいほど分
析の再現性がよいことを示している。
【００６９】以上の結果から、検出器セル洗浄工程の際
に分析カラムを取り外す操作を含んでいる（すなわち移
動相送液ポンプが連続分析中に停止、再始動を繰り返
す）比較例２では、分析値の再現性が実施例１よりも低
下することが分る。また、比較例２では分析カラムの取
り外しや取り付け作業（約５分）、検出器セル洗浄作業
（約２０．８分）、分析カラム平衡化移動相での分析カ
ラム再平衡化作業（約３０分）などに約５５分ほどの時
間を必要とするため試料注入間隔は約１０５分であっ
た。この結果から、比較例２では一定時間での連続分析
における分析可能な試料数が実施例１に比べて少なくな
ることが分る。
に分析カラムを取り外す操作を含んでいる（すなわち移
動相送液ポンプが連続分析中に停止、再始動を繰り返
す）比較例２では、分析値の再現性が実施例１よりも低
下することが分る。また、比較例２では分析カラムの取
り外しや取り付け作業（約５分）、検出器セル洗浄作業
（約２０．８分）、分析カラム平衡化移動相での分析カ
ラム再平衡化作業（約３０分）などに約５５分ほどの時
間を必要とするため試料注入間隔は約１０５分であっ
た。この結果から、比較例２では一定時間での連続分析
における分析可能な試料数が実施例１に比べて少なくな
ることが分る。
【００７０】
【表４】
【００７１】比較例３
実施例１の溶離法を２種類以上の溶離液を使用せずに単
一組成の移動相を用いて行う以外は、実施例１と同様に
して分析を行った。単一組成の移動相としてアセトニト
リル／蒸留水（体積比７９：２１）を用いた。得られた
クロマトグラムを図５に示す。単糖間の分離は可能であ
ったが、分析時間１５０分までにラミナリペンタオース
までしか溶出せずに少糖類の完全溶出ができなかった。
１種類の移動相を用いた比較例３では、単糖類間の高度
分離と少糖類の短時間での完全溶出の両立は困難である
ことが分る。
一組成の移動相を用いて行う以外は、実施例１と同様に
して分析を行った。単一組成の移動相としてアセトニト
リル／蒸留水（体積比７９：２１）を用いた。得られた
クロマトグラムを図５に示す。単糖間の分離は可能であ
ったが、分析時間１５０分までにラミナリペンタオース
までしか溶出せずに少糖類の完全溶出ができなかった。
１種類の移動相を用いた比較例３では、単糖類間の高度
分離と少糖類の短時間での完全溶出の両立は困難である
ことが分る。
【００７２】比較例４
実施例１の溶離法を２種類以上の溶離液を使用せずに単
一組成の移動相を用いて行う以外は、実施例１と同様に
して分析を行った。単一組成の移動相としてアセトニト
リル／蒸留水（体積比５８：４２）を用いた。このよう
にして得たクロマトグラムを図６に示す。これより、ラ
ミナリプタオースまでが１５分間で溶出したが、単糖間
の分離が達成できなかった。１種類の移動相を用いた比
較例４では、単糖類間の高度分離と少糖類の短時間での
完全溶出の両立は困難であることが分る。
一組成の移動相を用いて行う以外は、実施例１と同様に
して分析を行った。単一組成の移動相としてアセトニト
リル／蒸留水（体積比５８：４２）を用いた。このよう
にして得たクロマトグラムを図６に示す。これより、ラ
ミナリプタオースまでが１５分間で溶出したが、単糖間
の分離が達成できなかった。１種類の移動相を用いた比
較例４では、単糖類間の高度分離と少糖類の短時間での
完全溶出の両立は困難であることが分る。
【００７３】
【発明の効果】本発明によると、高速液体クロマトグラ
フィー法を用い、分析回数の増加による検出感度やポン
プの送液流量精度の低下なしに、糖類混合物の各成分ご
との同時分析を、再現性よく、連続して行うことができ
る。
フィー法を用い、分析回数の増加による検出感度やポン
プの送液流量精度の低下なしに、糖類混合物の各成分ご
との同時分析を、再現性よく、連続して行うことができ
る。
【図１】 本発明方法で用いる公知部分の工程図。
【図２】 本発明方法全体の工程図。
【図３】 図２における流路切り替え機構の説明図。
【図４】 本発明方法により分析した１例の結果を示す
クロマトグラム。
クロマトグラム。
【図５】 比較例３における分析した結果を示すクロマ
トグラム。
トグラム。
【図６】 比較例４における分析した結果を示すクロマ
トグラム。
トグラム。
１、２ 移動相溶媒溜
３、４、１６、１７，２８、２９ 脱気装置
５、６、１８、１９ 送液ポンプ
７ ミキサー
９ 分析カラム
１０ 恒温槽
１１、３０ 流路切り替え装置
１２ 反応槽
１３、２５ 廃液溜
１４、１５ 反応試薬液溜
２０ 反応コイル
２１ 冷却槽
２２ 冷却コイル
２３ 検出器
２４ データ処理装置
２６、２７ 洗浄溶媒溜
【手続補正書】
【提出日】平成１５年３月７日（２００３．３．７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１５】この図１において、１、２は移動相液溜、
５，６は定流速送液ポンプ、７はミキサーで、グラジエ
ント溶離法の場合には該ミキサー７において移動相液溜
１からポンプ５によって送液される溶離液１ａと、移動
相液溜２からポンプ６によって送液される溶離液２ａが
混合される。試料注入バルブ８より注入された試料は溶
離液によって保護用のプレカラム９´を経て分析カラム
９に導入され各成分に分離される。プレカラム９´、分
析カラム９は恒温槽１０内で一定温度に保持されてい
る。１４、１５は分離した各成分を誘導体化するための
反応試薬液溜、１８、１９は各反応試薬液溜１４、１５
内の反応試薬１４ａ、１５ａを送液するための定流速送
液ポンプである。反応試薬液溜は反応試薬を誘導体化す
べき成分の違いに応じて適宜交換しうるように通常複数
設けられる。分析カラム９において分離された各成分は
反応試薬と混合され、反応槽１２の反応コイル２０内を
通過する間に誘導体化され、冷却コイル２２内で冷却さ
れた後、検出器２３において検出されるように構成され
ている。なお、上記の例では移動相液溜、反応試薬液溜
をそれぞれ２つ設けた場合について示したが、３つ以上
の移動相液溜、反応試薬液溜を設け３種以上の溶離液や
反応試薬を用いうるように構成することもできる。
５，６は定流速送液ポンプ、７はミキサーで、グラジエ
ント溶離法の場合には該ミキサー７において移動相液溜
１からポンプ５によって送液される溶離液１ａと、移動
相液溜２からポンプ６によって送液される溶離液２ａが
混合される。試料注入バルブ８より注入された試料は溶
離液によって保護用のプレカラム９´を経て分析カラム
９に導入され各成分に分離される。プレカラム９´、分
析カラム９は恒温槽１０内で一定温度に保持されてい
る。１４、１５は分離した各成分を誘導体化するための
反応試薬液溜、１８、１９は各反応試薬液溜１４、１５
内の反応試薬１４ａ、１５ａを送液するための定流速送
液ポンプである。反応試薬液溜は反応試薬を誘導体化す
べき成分の違いに応じて適宜交換しうるように通常複数
設けられる。分析カラム９において分離された各成分は
反応試薬と混合され、反応槽１２の反応コイル２０内を
通過する間に誘導体化され、冷却コイル２２内で冷却さ
れた後、検出器２３において検出されるように構成され
ている。なお、上記の例では移動相液溜、反応試薬液溜
をそれぞれ２つ設けた場合について示したが、３つ以上
の移動相液溜、反応試薬液溜を設け３種以上の溶離液や
反応試薬を用いうるように構成することもできる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５８】グルコース及びラミナリビオースの各還元
糖に基づく保持時間の変動係数ＣＶ（相対標準偏差）は
それぞれ０．１１６％、０．１４３％、蛍光ピーク高さ
の変動係数ＣＶ（相対標準偏差）はそれぞれ０．８６０
％、１．１４％であった。なお、変動係数ＣＶ（相対標
準偏差）は、試料の標準偏差Ｓ（Ｓ＝σn-1）を試料の
平均ｘで割った値に１００を乗じて算出した。以上の結
果から、本発明方法によると、単糖類及び少糖類を含む
試料を高感度で検出可能であり、単糖類間の高度分離が
達成でき、かつ少糖類の短時間での完全溶出ができるこ
とが分る。さらに、変動係数ＣＶの結果から連続分析に
おいて得られた分析値の再現性も高いことが分る。
糖に基づく保持時間の変動係数ＣＶ（相対標準偏差）は
それぞれ０．１１６％、０．１４３％、蛍光ピーク高さ
の変動係数ＣＶ（相対標準偏差）はそれぞれ０．８６０
％、１．１４％であった。なお、変動係数ＣＶ（相対標
準偏差）は、試料の標準偏差Ｓ（Ｓ＝σn-1）を試料の
平均ｘで割った値に１００を乗じて算出した。以上の結
果から、本発明方法によると、単糖類及び少糖類を含む
試料を高感度で検出可能であり、単糖類間の高度分離が
達成でき、かつ少糖類の短時間での完全溶出ができるこ
とが分る。さらに、変動係数ＣＶの結果から連続分析に
おいて得られた分析値の再現性も高いことが分る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６０】
【表２】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６２】グルコース及びラミナリビオースの各還元
糖に基づく蛍光ピーク高さの変動係数ＣＶ（相対標準偏
差）は、それぞれ３．６５％、４．５８％であった。検
出器セル洗浄処理が含まれていない比較例１によって得
られたグルコースとラミナリビオースの変動係数ＣＶ値
は、実施例１の変動係数ＣＶ値のそれぞれ４．２倍と
４．０倍に相当した。なお、変動係数ＣＶ値は、小さい
ほど分析の再現性がよい。以上の結果から、検出器セル
洗浄処理を行わない比較例１では、分析値の再現性が実
施例１よりも低いことが分る。
糖に基づく蛍光ピーク高さの変動係数ＣＶ（相対標準偏
差）は、それぞれ３．６５％、４．５８％であった。検
出器セル洗浄処理が含まれていない比較例１によって得
られたグルコースとラミナリビオースの変動係数ＣＶ値
は、実施例１の変動係数ＣＶ値のそれぞれ４．２倍と
４．０倍に相当した。なお、変動係数ＣＶ値は、小さい
ほど分析の再現性がよい。以上の結果から、検出器セル
洗浄処理を行わない比較例１では、分析値の再現性が実
施例１よりも低いことが分る。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６７】検出器セル洗浄処理後、ステンレス鋼製チ
ューブの代わりに分析カラムを取り付け、移動相組成を
溶媒１ａのみに切り替えて送液ポンプ５，６から送液す
ると共に、反応試薬液１４ａを送液ポンプ１８で、反応
試薬液１５ａを送液ポンプ１９で送液を再開した。分析
カラム平衡化移動相（分析開始時の移動相）での分析カ
ラム再平衡化を３０分間行った後に、次回の試料注入を
行った。その他の分析条件は実施例１と同様の条件で行
った。分析した還元糖のうちグルコースとラミナリビオ
ースについての、保持時間（分）を表４に示した。
ューブの代わりに分析カラムを取り付け、移動相組成を
溶媒１ａのみに切り替えて送液ポンプ５，６から送液す
ると共に、反応試薬液１４ａを送液ポンプ１８で、反応
試薬液１５ａを送液ポンプ１９で送液を再開した。分析
カラム平衡化移動相（分析開始時の移動相）での分析カ
ラム再平衡化を３０分間行った後に、次回の試料注入を
行った。その他の分析条件は実施例１と同様の条件で行
った。分析した還元糖のうちグルコースとラミナリビオ
ースについての、保持時間（分）を表４に示した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７２】比較例４
実施例１の溶離法を２種類以上の溶離液を使用せずに単
一組成の移動相を用いて行う以外は、実施例１と同様に
して分析を行った。単一組成の移動相としてアセトニト
リル／蒸留水（体積比５８：４２）を用いた。このよう
にして得たクロマトグラムを図６に示す。これより、ラ
ミナリヘプタオースまでが１５分間で溶出したが、単糖
間の分離が達成できなかった。１種類の移動相を用いた
比較例４では、単糖類間の高度分離と少糖類の短時間で
の完全溶出の両立は困難であることが分る。
一組成の移動相を用いて行う以外は、実施例１と同様に
して分析を行った。単一組成の移動相としてアセトニト
リル／蒸留水（体積比５８：４２）を用いた。このよう
にして得たクロマトグラムを図６に示す。これより、ラ
ミナリヘプタオースまでが１５分間で溶出したが、単糖
間の分離が達成できなかった。１種類の移動相を用いた
比較例４では、単糖類間の高度分離と少糖類の短時間で
の完全溶出の両立は困難であることが分る。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】符号の説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【符号の説明】
１、２ 移動相溶媒溜
３、４、１６、１７，２８、２９ 脱気装置
５、６、１８、１９ 送液ポンプ
７ ミキサー８ 試料注入バルブ
９ 分析カラム
１０ 恒温槽
１１、３０ 流路切り替え装置
１２ 反応槽
１３、２５ 廃液溜
１４、１５ 反応試薬液溜
２０ 反応コイル
２１ 冷却槽
２２ 冷却コイル
２３ 検出器
２４ データ処理装置
２６、２７ 洗浄溶媒溜
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 30/74 Ｇ０１Ｎ 30/74 Ｅ
Ｆ
Claims (4)
- 【請求項１】 単糖類及び少糖類を含む糖類混合物を、
２種類以上の異なる移動相を用いた液体クロマトグラフ
ィー法により各成分に分離したのち、分離された各成分
ごとに反応試薬を反応させてその誘導体を形成させ、こ
の誘導体をセルに収容して検出する糖類混合物の同時分
析方法において、検出の際に用いたセルを検出ごとに洗
浄処理することを特徴とする分析方法。 - 【請求項２】 洗浄処理を、分析カラムと検出器セルを
連絡する流路を遮断し、洗浄溶媒を用いた検出器セル洗
浄処理と、分析カラム平衡化移動相を用いた再平衡化処
理を行い、検出器セル洗浄処理終了後から次に分析すべ
き糖類混合物の導入までの間に分析カラム溶出液流路を
復元することにより行う請求項１記載の分析方法。 - 【請求項３】 糖類混合物を各成分に分離するための液
体クロマトグラフィー用分析カラム、分離された各成分
をそれぞれ誘導体化するための反応器、各成分の誘導体
を収容する検出器セル、検出器セルを装着して検出処理
するための検出器、検出終了後に検出用セルに洗浄溶媒
を供給するための溶媒供給機構、分析カラムを再平衡化
するための再生機構、及び分析カラム溶出液の流路切り
替え機構を包含してなる糖類混合物の同時分析装置。 - 【請求項４】 分析カラム溶出液の流路切り替え機構
が、分析カラムと検出器セルを連絡する流路を遮断し、
洗浄溶媒を用いた検出器セル洗浄処理と、分析カラム平
衡化移動相を用いた再平衡化処理を行い、検出器セル洗
浄処理終了後から次に分析すべき糖類混合物の導入まで
の間に分析カラム溶出液流路を復元する機能を有する請
求項３記載の糖類混合物の同時分析装置。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001398509A JP3735666B2 (ja) | 2001-12-27 | 2001-12-27 | 糖類混合物の同時分析方法及びそれに用いる分析装置 |
| EP02258910A EP1324039A3 (en) | 2001-12-27 | 2002-12-20 | Method for simultaneous analysis of saccharide mixture and analytical apparatus system therefor |
| US10/327,125 US6855555B2 (en) | 2001-12-27 | 2002-12-24 | Method for simultaneous analysis of saccharide mixture and analytical apparatus system therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001398509A JP3735666B2 (ja) | 2001-12-27 | 2001-12-27 | 糖類混合物の同時分析方法及びそれに用いる分析装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003194791A true JP2003194791A (ja) | 2003-07-09 |
| JP3735666B2 JP3735666B2 (ja) | 2006-01-18 |
Family
ID=19189353
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001398509A Expired - Lifetime JP3735666B2 (ja) | 2001-12-27 | 2001-12-27 | 糖類混合物の同時分析方法及びそれに用いる分析装置 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6855555B2 (ja) |
| EP (1) | EP1324039A3 (ja) |
| JP (1) | JP3735666B2 (ja) |
Cited By (1)
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| WO2011136165A1 (ja) * | 2010-04-28 | 2011-11-03 | 日本ケミカルリサーチ株式会社 | 糖類の分析装置及び分析方法 |
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| WO2005050190A2 (en) * | 2003-11-05 | 2005-06-02 | Agilent Technologies, Inc. | Chromatography system |
| CN101379393B (zh) * | 2006-02-09 | 2012-06-27 | 株式会社岛津制作所 | 基于液相色谱法的分析方法及装置 |
| JP2008139147A (ja) * | 2006-12-01 | 2008-06-19 | Hitachi High-Technologies Corp | 液体クロマトグラフ装置 |
| EP2033756A1 (en) * | 2007-09-05 | 2009-03-11 | Nederlandse Organisatie voor toegepast- natuurwetenschappelijk onderzoek TNO | A process for preparing a moulded product |
| CN103091423B (zh) * | 2013-01-18 | 2017-03-29 | 润德(山东)检测技术有限公司 | 苏丹红检测方法 |
| CN103235056A (zh) * | 2013-04-12 | 2013-08-07 | 润德(山东)检测技术有限公司 | 食物中鸟嘌呤和腺嘌呤检测方法 |
| CN105954445A (zh) * | 2016-05-10 | 2016-09-21 | 浙江大学 | 一种用于同步测定样品中三氯蔗糖和其他弱保留糖类的柱切换装置及方法 |
| CN108181403A (zh) * | 2018-01-31 | 2018-06-19 | 安徽泓顺源生物科技有限公司 | 一种快速定量蜂蜜品质的高效液相色谱方法 |
| CN111413451B (zh) * | 2020-04-03 | 2022-05-24 | 京博农化科技有限公司 | 一种反相高效液相色谱法检测氰基乙酰胺的方法 |
| CN113607837B (zh) * | 2021-07-28 | 2023-03-17 | 四川汇宇制药股份有限公司 | 氰基乙酰胺及其有关物质的检测方法 |
| KR20230116125A (ko) | 2022-01-27 | 2023-08-04 | 충남대학교산학협력단 | 점액성 물질 유래 중성 단당류 고감도 동시 정량방법 |
| CN117169386A (zh) * | 2023-09-26 | 2023-12-05 | 广东省科学院生物与医学工程研究所 | 一种保健品中昆布寡糖含量的检测方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL7804208A (nl) * | 1978-04-20 | 1979-10-23 | Cenco Instr Bv | Scheidings- analysewerkwijze. |
| JPS57125349A (en) * | 1981-01-28 | 1982-08-04 | Seishin Seiyaku Kk | Method and device for quantitative analysis of saccharide by liquid chromatograph |
| JPH0235355A (ja) * | 1988-07-25 | 1990-02-05 | Showa Denko Kk | 液体クロマトグラフィによる糖類の分折計 |
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| SE503669C2 (sv) * | 1994-09-14 | 1996-07-29 | Cma Microdialysis Holding Ab | Förfarande för analys samt anordning för genomförande av förfarandet |
| JP3345266B2 (ja) * | 1996-05-28 | 2002-11-18 | 横河電機株式会社 | 陰イオン界面活性剤測定装置 |
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-
2001
- 2001-12-27 JP JP2001398509A patent/JP3735666B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-12-20 EP EP02258910A patent/EP1324039A3/en not_active Withdrawn
- 2002-12-24 US US10/327,125 patent/US6855555B2/en not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN102859352A (zh) * | 2010-04-28 | 2013-01-02 | 日本化学研究株式会社 | 糖类的分析装置及分析方法 |
| US8673648B2 (en) | 2010-04-28 | 2014-03-18 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Sugar analysis device and analysis method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20030129761A1 (en) | 2003-07-10 |
| JP3735666B2 (ja) | 2006-01-18 |
| EP1324039A3 (en) | 2003-11-05 |
| US6855555B2 (en) | 2005-02-15 |
| EP1324039A2 (en) | 2003-07-02 |
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