JPH05113439A - 単糖類から少糖類までの一斉分析方法 - Google Patents
単糖類から少糖類までの一斉分析方法Info
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- JPH05113439A JPH05113439A JP8096691A JP8096691A JPH05113439A JP H05113439 A JPH05113439 A JP H05113439A JP 8096691 A JP8096691 A JP 8096691A JP 8096691 A JP8096691 A JP 8096691A JP H05113439 A JPH05113439 A JP H05113439A
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- oligosaccharides
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- monosaccharides
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 単糖類と少糖類とを含む試料から、単糖類の
各成分相互間及び少糖類の各成分相互間を確実に分離
し、各成分を一斉に高感度で効率良く分離分析すること
のできる分析方法を提供する。 【構成】 単糖類と少糖類とを含む試料を、２種以上の
異なる溶離液１ａ、２ｂを用いて液体クロマトグラフィ
ーの分離用カラム７によって分離し、分離した各成分を
カラム７から検出器１６に送るまでの間に反応槽１４に
てオンラインで反応試薬９ａ、１０ａと反応させて誘導
体化し、検出器１６において検出する。
各成分相互間及び少糖類の各成分相互間を確実に分離
し、各成分を一斉に高感度で効率良く分離分析すること
のできる分析方法を提供する。 【構成】 単糖類と少糖類とを含む試料を、２種以上の
異なる溶離液１ａ、２ｂを用いて液体クロマトグラフィ
ーの分離用カラム７によって分離し、分離した各成分を
カラム７から検出器１６に送るまでの間に反応槽１４に
てオンラインで反応試薬９ａ、１０ａと反応させて誘導
体化し、検出器１６において検出する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は高速液体クロマトグラフ
ィーによって単糖類及び少糖類を含む試料中から各成分
を分離して分析することができる、単糖類から少糖類ま
での一斉分析方法に関する。
ィーによって単糖類及び少糖類を含む試料中から各成分
を分離して分析することができる、単糖類から少糖類ま
での一斉分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】単糖類
や少糖類等の糖質を分析する方法として、ゲル濾過クロ
マトグラフィー法や順相クロマトグラフィー法が知られ
ている。従来これらの方法において、蛍光や紫外線吸
収、可視部吸収がない試料の検出には示差屈折計が用い
られており、単糖類や少糖類の検出は示差屈折計によっ
ていた。しかしながら、ゲル濾過クロマトグラフィー法
では単糖類と少糖類との分離は可能であっても、単糖類
相互の分離や少糖類相互の分離を行うことは困難であっ
た。また順相クロマトグラフィー法の場合も、示差屈折
計によって検出を行う場合には均一組成の移動相しか使
用できず、均一組成の移動相を用いた場合には少糖類の
完全溶出か、単糖類相互の分離のいずれかを犠牲にしな
ければならない問題があった。
や少糖類等の糖質を分析する方法として、ゲル濾過クロ
マトグラフィー法や順相クロマトグラフィー法が知られ
ている。従来これらの方法において、蛍光や紫外線吸
収、可視部吸収がない試料の検出には示差屈折計が用い
られており、単糖類や少糖類の検出は示差屈折計によっ
ていた。しかしながら、ゲル濾過クロマトグラフィー法
では単糖類と少糖類との分離は可能であっても、単糖類
相互の分離や少糖類相互の分離を行うことは困難であっ
た。また順相クロマトグラフィー法の場合も、示差屈折
計によって検出を行う場合には均一組成の移動相しか使
用できず、均一組成の移動相を用いた場合には少糖類の
完全溶出か、単糖類相互の分離のいずれかを犠牲にしな
ければならない問題があった。
【０００３】一方、試料を前処理して各成分を誘導体化
して各成分に蛍光特性や紫外部吸収特性を付与した後、
高速液体クロマトグラフィーを用いて分離し、蛍光検出
器や紫外線吸収検出器により検出する方法も知られてい
る。この方法によれば移動相の組成を変化させて溶離を
行うことができ、均一組成の移動相を用いる場合に比べ
て単糖類や少糖類の各成分相互を分離することも可能と
なるが、誘導体化による分子量増大等のために各成分の
分離状態が悪くなり（ピークがブロード状となったり、
各成分のピークが重なる等）、この結果、各成分の検出
感度が低下するという問題があった。本発明者らは上記
の点に鑑み鋭意研究した結果、２以上の異なる移動相を
用いて分離を行った後に、各成分の誘導体化を行い、こ
の誘導体を検出器で検出することにより、上記従来技術
の欠点を解決できることを見出し本発明を完成するに到
った。
して各成分に蛍光特性や紫外部吸収特性を付与した後、
高速液体クロマトグラフィーを用いて分離し、蛍光検出
器や紫外線吸収検出器により検出する方法も知られてい
る。この方法によれば移動相の組成を変化させて溶離を
行うことができ、均一組成の移動相を用いる場合に比べ
て単糖類や少糖類の各成分相互を分離することも可能と
なるが、誘導体化による分子量増大等のために各成分の
分離状態が悪くなり（ピークがブロード状となったり、
各成分のピークが重なる等）、この結果、各成分の検出
感度が低下するという問題があった。本発明者らは上記
の点に鑑み鋭意研究した結果、２以上の異なる移動相を
用いて分離を行った後に、各成分の誘導体化を行い、こ
の誘導体を検出器で検出することにより、上記従来技術
の欠点を解決できることを見出し本発明を完成するに到
った。
【０００４】
【課題を解決するための手段】即ち本発明の単糖類から
少糖類までの一斉分析方法は、単糖類及び少糖類を含む
試料を、２種類以上の異なる移動相を用いて液体クロマ
トグラフィー用カラムによって各成分に分離する工程、
分離した各成分をカラムから検出器に送るまでの間にお
いてオンラインで誘導体化する工程、各成分の誘導体を
検出器で検出する工程よりなることを特徴とする。
少糖類までの一斉分析方法は、単糖類及び少糖類を含む
試料を、２種類以上の異なる移動相を用いて液体クロマ
トグラフィー用カラムによって各成分に分離する工程、
分離した各成分をカラムから検出器に送るまでの間にお
いてオンラインで誘導体化する工程、各成分の誘導体を
検出器で検出する工程よりなることを特徴とする。
【０００５】本発明方法は、リキソース、フルクトー
ス、グルコース等の単糖類と、マルトース、マルトトリ
オース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マ
ルトヘキサオース、マルトヘプタオース等の少糖類とを
含む試料から、これらの各成分を相互に分離して分析す
る方法であるが、このような単糖類と少糖類とを含む試
料としては、例えば、ガム、飴等の菓子類、ジュース、
豆乳等の飲料等が挙げられる。本発明において少糖類と
は分子量５０００以下のものをいう。
ス、グルコース等の単糖類と、マルトース、マルトトリ
オース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マ
ルトヘキサオース、マルトヘプタオース等の少糖類とを
含む試料から、これらの各成分を相互に分離して分析す
る方法であるが、このような単糖類と少糖類とを含む試
料としては、例えば、ガム、飴等の菓子類、ジュース、
豆乳等の飲料等が挙げられる。本発明において少糖類と
は分子量５０００以下のものをいう。
【０００６】本発明方法において、液体クロマトグラフ
ィー用カラムとして、イオン交換クロマトグラフィー用
カラム、逆相クロマトグラフィー用カラム、順相クロマ
トグラフィー用カラム等を用いることができるが、糖の
保持力が分子量に略比例しているためや、分子量の大き
な糖（分子量５０００〜１００００程度）まで分析でき
る点で特に順相クロマトグラフィー用カラムが好まし
い。イオン交換クロマトグラフィー用カラムとしては、
例えばＴＳＫｇｅｌ ＳｕｇａｒＡＸＩ（東ソー（株）
製）、ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｇａｒＡＸＧ（東ソー（株）
製）、ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｇａｒＳＣＸ（東ソー（株）
製）、ＴＳＫｇｅｌ ＳＡＸ（東ソー（株）製）等が挙
げられる。逆相クロマトグラフィー用カラムとしては、
例えばＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｍ（東ソー（株）
製）、ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−１２０Ｔ（東ソー（株）
製）、ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−１２０Ａ（東ソー（株）
製）等が挙げられる。また順相クロマトグラフィー用カ
ラムとしては、例えばＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０
（東ソー（株）製）、ＴＳＫｇｅｌ ＮＨ２−６０（東
ソー（株）製）等が挙げられる。
ィー用カラムとして、イオン交換クロマトグラフィー用
カラム、逆相クロマトグラフィー用カラム、順相クロマ
トグラフィー用カラム等を用いることができるが、糖の
保持力が分子量に略比例しているためや、分子量の大き
な糖（分子量５０００〜１００００程度）まで分析でき
る点で特に順相クロマトグラフィー用カラムが好まし
い。イオン交換クロマトグラフィー用カラムとしては、
例えばＴＳＫｇｅｌ ＳｕｇａｒＡＸＩ（東ソー（株）
製）、ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｇａｒＡＸＧ（東ソー（株）
製）、ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｇａｒＳＣＸ（東ソー（株）
製）、ＴＳＫｇｅｌ ＳＡＸ（東ソー（株）製）等が挙
げられる。逆相クロマトグラフィー用カラムとしては、
例えばＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｍ（東ソー（株）
製）、ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−１２０Ｔ（東ソー（株）
製）、ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−１２０Ａ（東ソー（株）
製）等が挙げられる。また順相クロマトグラフィー用カ
ラムとしては、例えばＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０
（東ソー（株）製）、ＴＳＫｇｅｌ ＮＨ２−６０（東
ソー（株）製）等が挙げられる。
【０００７】本発明において、移動相としての溶離液は
流速0.２〜1.５ml／分で送液することが好ましい。使用
する溶離液はカラムの違いによっても異なるが、順相ク
ロマトグラフィー用カラムを用いる場合、アセトニトリ
ル／水、アセトン／水、1,4-ジオキサン／水、メタノー
ル／水、エタノール／水、ｎ−ヘキサン／エタノール、
ｎ−ヘキサン／アセトン、ｎ−ヘキサン／1,4-ジオキサ
ン等の２成分系の混合溶媒、アセトニトリル／メタノー
ル／水、ｎ−ヘキサン／クロロホルム／1,4-ジオキサン
等の３成分系の混合溶媒等を用いることができる。更に
これらに蟻酸アンモニウム、燐酸二水素カリウム、酢酸
−トリエチルアミン塩等の塩類やトリヒドロキシメチル
アミノメタン、エタノールアミン、トリエチルアミン、
トリ−ｎ−ブチルアミン、ジエチルアミノエタノール等
の塩基を含むもの等も用いることができる。なかでもア
セトニトリル／水、アセトン／水の２成分系の混合溶媒
が好ましい。上記塩類、塩基等はよりシャープなピーク
を得る目的で溶離液に少量添加する。添加量は検出法の
違いによっても異なるが、蛍光検出器を用いる場合には
溶離液中の濃度として１００〜７００ｍＭ程度、紫外線
吸収や可視吸収検出器を用いる場合には１００ｍＭ程度
以下が好ましい。
流速0.２〜1.５ml／分で送液することが好ましい。使用
する溶離液はカラムの違いによっても異なるが、順相ク
ロマトグラフィー用カラムを用いる場合、アセトニトリ
ル／水、アセトン／水、1,4-ジオキサン／水、メタノー
ル／水、エタノール／水、ｎ−ヘキサン／エタノール、
ｎ−ヘキサン／アセトン、ｎ−ヘキサン／1,4-ジオキサ
ン等の２成分系の混合溶媒、アセトニトリル／メタノー
ル／水、ｎ−ヘキサン／クロロホルム／1,4-ジオキサン
等の３成分系の混合溶媒等を用いることができる。更に
これらに蟻酸アンモニウム、燐酸二水素カリウム、酢酸
−トリエチルアミン塩等の塩類やトリヒドロキシメチル
アミノメタン、エタノールアミン、トリエチルアミン、
トリ−ｎ−ブチルアミン、ジエチルアミノエタノール等
の塩基を含むもの等も用いることができる。なかでもア
セトニトリル／水、アセトン／水の２成分系の混合溶媒
が好ましい。上記塩類、塩基等はよりシャープなピーク
を得る目的で溶離液に少量添加する。添加量は検出法の
違いによっても異なるが、蛍光検出器を用いる場合には
溶離液中の濃度として１００〜７００ｍＭ程度、紫外線
吸収や可視吸収検出器を用いる場合には１００ｍＭ程度
以下が好ましい。
【０００８】本発明においては移動相として異なる２種
類以上の溶離液を用いるが、特に好ましい溶離液の具体
的な組み合わせ例としては、アセトニトリル／蒸留水＝
８０／２０（体積比）混合液とアセトニトリル／蒸留水
＝６０／４０（体積比）混合物が挙げられる。本発明方
法においては、溶離液を段階的に切り換える段階溶離
法、溶離液の成分の濃度を勾配を持たせて変化させるグ
ラディエント溶離法等のいずれの方法も採用することが
できる。
類以上の溶離液を用いるが、特に好ましい溶離液の具体
的な組み合わせ例としては、アセトニトリル／蒸留水＝
８０／２０（体積比）混合液とアセトニトリル／蒸留水
＝６０／４０（体積比）混合物が挙げられる。本発明方
法においては、溶離液を段階的に切り換える段階溶離
法、溶離液の成分の濃度を勾配を持たせて変化させるグ
ラディエント溶離法等のいずれの方法も採用することが
できる。
【０００９】液体クロマトグラフィー用カラムで分離さ
れた各成分は、検出器に送るまでの間にオンラインで誘
導体化される。各成分の誘導体化に用いる反応試薬とし
ては例えば、エチレンジアミン、エタノールアミン、２
−シアノアセトアミド、タウリン、ベンズアミジン、４
−メトキシベンズアミジン、フェノール／硫酸、アミノ
安息香酸等を用いることができる。上記反応試薬による
誘導体化反応は、反応試薬として、４−アミノ安息香酸
を用いる場合には強アルカリ性で、エチレンジアミン、
エタノールアミン、２−シアノアセトアミド、ベンズア
ミジン、４−メトキシベンズアミジンを用いる場合には
弱アルカリ性で、タウリンを用いる場合には中性で、フ
ェノール／硫酸を用いる場合には強酸性で行う。反応試
薬は試薬の種類別に最適な割合を検討し添加することが
好ましい。液体クロマトグラフィー用カラムとして順相
クロマトグラフィー用カラムを用いる場合、順相クロマ
トグラフィー用の移動相への溶解性の上から、上記反応
試薬のうち２−シアノアセトアミド、ベンズアミジン、
４−メトキシベンズアミジン等の溶解度の高い反応試薬
が好ましい。
れた各成分は、検出器に送るまでの間にオンラインで誘
導体化される。各成分の誘導体化に用いる反応試薬とし
ては例えば、エチレンジアミン、エタノールアミン、２
−シアノアセトアミド、タウリン、ベンズアミジン、４
−メトキシベンズアミジン、フェノール／硫酸、アミノ
安息香酸等を用いることができる。上記反応試薬による
誘導体化反応は、反応試薬として、４−アミノ安息香酸
を用いる場合には強アルカリ性で、エチレンジアミン、
エタノールアミン、２−シアノアセトアミド、ベンズア
ミジン、４−メトキシベンズアミジンを用いる場合には
弱アルカリ性で、タウリンを用いる場合には中性で、フ
ェノール／硫酸を用いる場合には強酸性で行う。反応試
薬は試薬の種類別に最適な割合を検討し添加することが
好ましい。液体クロマトグラフィー用カラムとして順相
クロマトグラフィー用カラムを用いる場合、順相クロマ
トグラフィー用の移動相への溶解性の上から、上記反応
試薬のうち２−シアノアセトアミド、ベンズアミジン、
４−メトキシベンズアミジン等の溶解度の高い反応試薬
が好ましい。
【００１０】検出器としては、蛍光検出器、紫外線吸収
検出器、可視吸収検出器等を用いることができるが、使
用し得る検出器及び測定波長は用いる反応試薬や移動相
の種類等によって異なる。各反応試薬に適した検出器は
以下の通りである（検出器の種類の後の括弧内にクロマ
トグラフィーの種類の例と検出波長の一例を示す。）。
反応試薬がエチレンジアミンの場合には蛍光検出器（イ
オン交換クロマトグラフィー：励起波長３６０nm、測定
波長３８３nm、４５５nm）、エタノールアミンの場合に
は蛍光検出器（イオン交換クロマトグラフィー：励起波
長３５７nm、測定波長４３６nm）、２−シアノアセトア
ミドの場合には蛍光検出器（イオン交換クロマトグラフ
ィー：励起波長３３１nm、測定波長３８３nm）及び紫外
線吸収検出器（イオン交換クロマトグラフィー、逆相ク
ロマトグラフィー、配位子交換クロマトグラフィー等：
測定波長２７５〜２８０nm）、タウリンの場合には蛍光
検出器（イオン交換クロマトグラフィー等：励起波長３
５７nm、測定波長４４０nm）、ベンズアミジンの場合に
は蛍光検出器（イオン交換クロマトグラフィー、順相ク
ロマトグラフィー等：励起波長２８８nm、測定波長３６
５nm、４７０nm）、４−メトキシベンズアミジンの場合
には蛍光検出器（イオン交換クロマトグラフィー、順相
クロマトグラフィー等：励起波長３１０nm、検出波長４
７０nm）、フェノール／硫酸の場合には可視吸収検出器
（ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグ
ラフィー等：測定波長４８０〜４９０nm）、アミノ安息
香酸の場合には可視吸収検出器（逆相クロマトグラフィ
ー：測定波長４１０nm）が用いられる。
検出器、可視吸収検出器等を用いることができるが、使
用し得る検出器及び測定波長は用いる反応試薬や移動相
の種類等によって異なる。各反応試薬に適した検出器は
以下の通りである（検出器の種類の後の括弧内にクロマ
トグラフィーの種類の例と検出波長の一例を示す。）。
反応試薬がエチレンジアミンの場合には蛍光検出器（イ
オン交換クロマトグラフィー：励起波長３６０nm、測定
波長３８３nm、４５５nm）、エタノールアミンの場合に
は蛍光検出器（イオン交換クロマトグラフィー：励起波
長３５７nm、測定波長４３６nm）、２−シアノアセトア
ミドの場合には蛍光検出器（イオン交換クロマトグラフ
ィー：励起波長３３１nm、測定波長３８３nm）及び紫外
線吸収検出器（イオン交換クロマトグラフィー、逆相ク
ロマトグラフィー、配位子交換クロマトグラフィー等：
測定波長２７５〜２８０nm）、タウリンの場合には蛍光
検出器（イオン交換クロマトグラフィー等：励起波長３
５７nm、測定波長４４０nm）、ベンズアミジンの場合に
は蛍光検出器（イオン交換クロマトグラフィー、順相ク
ロマトグラフィー等：励起波長２８８nm、測定波長３６
５nm、４７０nm）、４−メトキシベンズアミジンの場合
には蛍光検出器（イオン交換クロマトグラフィー、順相
クロマトグラフィー等：励起波長３１０nm、検出波長４
７０nm）、フェノール／硫酸の場合には可視吸収検出器
（ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグ
ラフィー等：測定波長４８０〜４９０nm）、アミノ安息
香酸の場合には可視吸収検出器（逆相クロマトグラフィ
ー：測定波長４１０nm）が用いられる。
【００１１】図１は本発明方法を実施するための装置の
基本構成を示す。図１において、１、２は移動相液溜、
３ａ、３ｂは定流速送液ポンプ、４はミキサーで、グラ
ディエント溶離法の場合には該ミキサー４において移動
相液溜１からポンプ３ａによって送液される溶離液１ａ
と、移動相液溜２からポンプ３ｂによって送液される溶
離液２ａが混合される。試料注入バルブ５より注入され
た試料は溶離液によって保護用のプレカラム６を経て分
離用カラム７に導入され各成分に分離される。プレカラ
ム６、分離用カラム７は恒温槽８内で一定温度に保持さ
れている。９、１０は分離した各成分を誘導体化するた
めの反応試薬液溜、１１、１２は各反応試薬液溜９、１
０内の反応試薬９ａ、１０ａを送液するための定流速送
液ポンプである。反応試薬液溜は反応試薬を誘導体化す
べき成分の違いに応じて適宜交換し得るように通常複数
設けられる。分離用カラム７において分離された各成分
は反応試薬と混合され、反応槽１４の反応コイル１３内
を通過する間に誘導体化され、冷却コイル１５内で冷却
された後、検出器１６において検出されるように構成さ
れている。尚、上記の例では移動相液溜、反応試薬液溜
をそれぞれ２つ設けた場合について示したが、３つ以上
の移動相液溜、反応試薬液溜を設け３種以上の溶離液や
反応試薬を用い得るように構成することもできる。
基本構成を示す。図１において、１、２は移動相液溜、
３ａ、３ｂは定流速送液ポンプ、４はミキサーで、グラ
ディエント溶離法の場合には該ミキサー４において移動
相液溜１からポンプ３ａによって送液される溶離液１ａ
と、移動相液溜２からポンプ３ｂによって送液される溶
離液２ａが混合される。試料注入バルブ５より注入され
た試料は溶離液によって保護用のプレカラム６を経て分
離用カラム７に導入され各成分に分離される。プレカラ
ム６、分離用カラム７は恒温槽８内で一定温度に保持さ
れている。９、１０は分離した各成分を誘導体化するた
めの反応試薬液溜、１１、１２は各反応試薬液溜９、１
０内の反応試薬９ａ、１０ａを送液するための定流速送
液ポンプである。反応試薬液溜は反応試薬を誘導体化す
べき成分の違いに応じて適宜交換し得るように通常複数
設けられる。分離用カラム７において分離された各成分
は反応試薬と混合され、反応槽１４の反応コイル１３内
を通過する間に誘導体化され、冷却コイル１５内で冷却
された後、検出器１６において検出されるように構成さ
れている。尚、上記の例では移動相液溜、反応試薬液溜
をそれぞれ２つ設けた場合について示したが、３つ以上
の移動相液溜、反応試薬液溜を設け３種以上の溶離液や
反応試薬を用い得るように構成することもできる。
【００１２】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明する。
明する。
【００１３】実施例１ 図１に示す構成の装置において溶離液１ａとしてアセト
ニトリル／蒸留水＝８０／２０（体積比）混合液、溶離
液２ａとしてアセトニトリル／蒸留水＝６０／４０（体
積比）混合液を用い、プレカラム６としてＴＳＫｇｅｌ
Ａｍｉｄｅ−８０（東ソー（株）製）、内径3.２mm、
長さ１５mm、分離用カラム７としてＴＳＫｇｅｌ Ａｍ
ｉｄｅ−８０（東ソー（株）製）、内径4.６mm、長さ２
５cmを用い、恒温槽８内温度を８０℃に保持した。試料
としてリキソース（0.０３mg／ml）、フルクトース（0.
０３mg／ml）、グルコース（0.０３mg／ml）、マルトー
ス（0.０３mg／ml）、マルトトリオース（0.０３mg／m
l）、マルトテトラオース（0.０３mg／ml）、マルトペ
ンタオース（0.０３mg／ml）、マルトヘキサオース（0.
０３mg／ml）、マルトヘプタオース（0.０３mg／ml）を
含む溶液を用い、この試料溶液２０μｌを試料注入バル
ブ５より注入した。溶離法としては予め溶離液１ａが１
００％となるように送液してカラムを平衡化しておき、
試料注入直後に溶離液２ａの混合を開始し、試料注入後
３7.５分後に溶離液２ａが１００％となるように組成変
化させるグラディエント溶離法を採用した。試料注入
後、３7.５分経過した後は溶離液２ａのみを送液して溶
離を行った。溶離液の送液速度は0.４ml／分とした。反
応試薬９ａとして1.０Ｍ水酸化カリウムを流速0.３ml／
分で、反応試薬１０ａとして１００ｍＭベンズアミジン
塩酸溶液を流速0.３ml／分で送液してカラム７で分離さ
れた成分の誘導体化反応を反応槽１４内の温度を１１０
℃に保持して行った。反応終了後、反応物を冷却コイル
１５内で冷却した後、検出器１６において検出した。
尚、反応コイル１３としては内径0.４mm、長さ８ｍのス
テンレス製コイルを、冷却コイルとしては内径0.２５m
m、長さ２ｍのステンレス製コイルを用いた。また検出
器は東ソー（株）製のＦＳ−８０００型蛍光検出器を、
各定流速送液ポンプは東ソー（株）製の定流速送液ポン
プＣＣＰＭ型を用いた。得られたクロマトグラムを図２
に示す。図２において、ａ、ｂ、ｃは、それぞれ単糖類
のリキソース、フルクトース、グルコースを、ｄ、ｅ、
ｆ、ｇ、ｈ、ｉは、それぞれ少糖類のマルトース、マル
トトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオー
ス、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースを示す。
図２に示されるように各単糖類相互及び各少糖類相互が
完全に分離され、これらの完全溶出までに要した時間は
約１時間であった。
ニトリル／蒸留水＝８０／２０（体積比）混合液、溶離
液２ａとしてアセトニトリル／蒸留水＝６０／４０（体
積比）混合液を用い、プレカラム６としてＴＳＫｇｅｌ
Ａｍｉｄｅ−８０（東ソー（株）製）、内径3.２mm、
長さ１５mm、分離用カラム７としてＴＳＫｇｅｌ Ａｍ
ｉｄｅ−８０（東ソー（株）製）、内径4.６mm、長さ２
５cmを用い、恒温槽８内温度を８０℃に保持した。試料
としてリキソース（0.０３mg／ml）、フルクトース（0.
０３mg／ml）、グルコース（0.０３mg／ml）、マルトー
ス（0.０３mg／ml）、マルトトリオース（0.０３mg／m
l）、マルトテトラオース（0.０３mg／ml）、マルトペ
ンタオース（0.０３mg／ml）、マルトヘキサオース（0.
０３mg／ml）、マルトヘプタオース（0.０３mg／ml）を
含む溶液を用い、この試料溶液２０μｌを試料注入バル
ブ５より注入した。溶離法としては予め溶離液１ａが１
００％となるように送液してカラムを平衡化しておき、
試料注入直後に溶離液２ａの混合を開始し、試料注入後
３7.５分後に溶離液２ａが１００％となるように組成変
化させるグラディエント溶離法を採用した。試料注入
後、３7.５分経過した後は溶離液２ａのみを送液して溶
離を行った。溶離液の送液速度は0.４ml／分とした。反
応試薬９ａとして1.０Ｍ水酸化カリウムを流速0.３ml／
分で、反応試薬１０ａとして１００ｍＭベンズアミジン
塩酸溶液を流速0.３ml／分で送液してカラム７で分離さ
れた成分の誘導体化反応を反応槽１４内の温度を１１０
℃に保持して行った。反応終了後、反応物を冷却コイル
１５内で冷却した後、検出器１６において検出した。
尚、反応コイル１３としては内径0.４mm、長さ８ｍのス
テンレス製コイルを、冷却コイルとしては内径0.２５m
m、長さ２ｍのステンレス製コイルを用いた。また検出
器は東ソー（株）製のＦＳ−８０００型蛍光検出器を、
各定流速送液ポンプは東ソー（株）製の定流速送液ポン
プＣＣＰＭ型を用いた。得られたクロマトグラムを図２
に示す。図２において、ａ、ｂ、ｃは、それぞれ単糖類
のリキソース、フルクトース、グルコースを、ｄ、ｅ、
ｆ、ｇ、ｈ、ｉは、それぞれ少糖類のマルトース、マル
トトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオー
ス、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースを示す。
図２に示されるように各単糖類相互及び各少糖類相互が
完全に分離され、これらの完全溶出までに要した時間は
約１時間であった。
【００１４】
【発明の効果】以上説明したように本発明方法は、各成
分を誘導体化して検出する方法を採用したため、検出器
として蛍光検出器、紫外線吸収検出器、可視吸収検出器
等を使用でき、検出器として示差屈折検出器を用いる場
合のように一定組成の移動相を用いる必要がなく移動相
の組成を変化させて溶離を行うことが可能となった。本
発明方法では、異なる２以上の移動相を用いて各成分を
分離する方法を採用したことと、前記誘導体化を各成分
に分離した後に行う方法を採用したこととにより、分離
前に誘導体化を行う従来の方法に比べ、単糖類から少糖
類までの糖質を各成分に確実に分離して一斉に分析でき
るとともに、各成分の高感度な検出が可能となった。
分を誘導体化して検出する方法を採用したため、検出器
として蛍光検出器、紫外線吸収検出器、可視吸収検出器
等を使用でき、検出器として示差屈折検出器を用いる場
合のように一定組成の移動相を用いる必要がなく移動相
の組成を変化させて溶離を行うことが可能となった。本
発明方法では、異なる２以上の移動相を用いて各成分を
分離する方法を採用したことと、前記誘導体化を各成分
に分離した後に行う方法を採用したこととにより、分離
前に誘導体化を行う従来の方法に比べ、単糖類から少糖
類までの糖質を各成分に確実に分離して一斉に分析でき
るとともに、各成分の高感度な検出が可能となった。
【図１】本発明方法に用いる装置の基本構成を示す概略
図である。
図である。
【図２】実施例で得た試料のクロマトグラムである。
１ａ 溶離液 ２ａ 溶離液 ７ 分離用カラム ９ａ 反応試薬 10ａ 反応試薬 １４ 反応槽 １６ 検出器
Claims (2)
- 【請求項１】 単糖類及び少糖類を含む試料を、２種類
以上の異なる移動相を用いて液体クロマトグラフィー用
カラムによって各成分に分離する工程、分離した各成分
をカラムから検出器に送るまでの間においてオンライン
で誘導体化する工程、各成分の誘導体を検出器で検出す
る工程よりなることを特徴とする単糖類から少糖類まで
の一斉分析方法。 - 【請求項２】 液体クロマトグラフィー用カラムが、順
相クロマトグラフィー用カラムである請求項１記載の単
糖類から少糖類までの一斉分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8096691A JPH05113439A (ja) | 1991-03-19 | 1991-03-19 | 単糖類から少糖類までの一斉分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8096691A JPH05113439A (ja) | 1991-03-19 | 1991-03-19 | 単糖類から少糖類までの一斉分析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05113439A true JPH05113439A (ja) | 1993-05-07 |
Family
ID=13733258
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8096691A Pending JPH05113439A (ja) | 1991-03-19 | 1991-03-19 | 単糖類から少糖類までの一斉分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05113439A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6855555B2 (en) * | 2001-12-27 | 2005-02-15 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Method for simultaneous analysis of saccharide mixture and analytical apparatus system therefor |
| US7260261B2 (en) | 2003-02-20 | 2007-08-21 | Microsoft Corporation | Systems and methods for enhanced image adaptation |
| JP2018163004A (ja) * | 2017-03-24 | 2018-10-18 | 日立化成株式会社 | 分離材及びカラム |
-
1991
- 1991-03-19 JP JP8096691A patent/JPH05113439A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6855555B2 (en) * | 2001-12-27 | 2005-02-15 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Method for simultaneous analysis of saccharide mixture and analytical apparatus system therefor |
| US7260261B2 (en) | 2003-02-20 | 2007-08-21 | Microsoft Corporation | Systems and methods for enhanced image adaptation |
| JP2018163004A (ja) * | 2017-03-24 | 2018-10-18 | 日立化成株式会社 | 分離材及びカラム |
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