CN111122722B - 一种快速测定果汁中苹果酸δ13C值的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速测定果汁中苹果酸δ¹³C值的方法，其包括以下步骤：a.取果汁样品，将其稀释150～250倍，过滤，得到滤液；和b.用液相色谱‑稳定同位素比值质谱测定苹果酸δ¹³C值，其中，所述液相色谱‑稳定同位素比值质谱使用的色谱柱是亲水性反相C18色谱柱。本发明无需复杂的样品前处理过程，只需对样品简单稀释过滤，依靠色谱柱的分离效能对苹果酸进行自动分离和纯化，实现苹果酸δ¹³C快速、直接测定的目的，为果汁产品的掺假检测研究提供了一种不经前处理而直接测定苹果酸δ¹³C的新方法。

Description

一种快速测定果汁中苹果酸δ13C值的方法

技术领域

本发明涉及一种快速测定苹果汁中苹果酸δ¹³C值的方法，具体而言，本发明涉及测定果汁、特别是苹果汁中苹果酸稳定碳同位素比值(记作δ¹³C)的方法，属于稳定同位素分析技术领域。

背景技术

苹果汁中含有糖、有机酸、维生素、氨基酸、黄酮类化合物等物质，具有较高的营养价值。国际食品法典委员会(CAC)规定(CODEX STAN 247-2005)：纯正果汁中若添加了糖或有机酸，需在标签上注明；同样，我国《预包装食品标签通则》(GB 7718-2011)也规定产品的配料表中必须列出食品制造或加工时所使用的并存在于产品中的任何物质，并且添加的物质有含量限制。2012年欧盟理事会通过了一项果汁新指令，指令规定“果汁中不允许添加糖类成分”，出口欧盟的果汁中将不再允许添加任何糖类成分。由此可见，苹果汁中加入廉价的糖或有机酸而不标注属于“食品欺诈”，超出规定的添加则属于掺假行为。

我国是全球最大的苹果生产国，每年的苹果产量超过球总产量的50％。近年来我国浓缩苹果汁加工行业迅速发展，已成为全球最大的浓缩苹果汁生产和出口国，出口世界70多个国家和地区。截至目前，中国浓缩苹果汁年产量约有100万吨左右，年产量和出口量均占全球总量的60％左右，均居世界第一。苹果汁掺假问题是一个严重的经济问题和社会问题，不仅会造成消费者的经济利益损失，还会影响正规果汁企业的健康发展，造成果汁行业的秩序混乱，影响我国果汁的进出口贸易。因此，开发出灵敏有效的鉴别苹果汁掺假的方法具有重要意义。

近年来，稳定同位素技术已经发展为解决食品掺假及产地溯源问题的一个强有力手段(参见下述非专利文献1)，应用碳同位素技术可以鉴别果汁中是否含有外源添加的甘蔗糖或玉米糖浆，而为准确检测苹果汁的真伪，需以果汁中苹果酸的δ¹³C值为参照(参见下述非专利文献2和3)。然而，由于苹果汁中含有多种有机物，测定苹果酸δ¹³C值时需将苹果酸纯化处理，Jamin等人通过离子交换树脂分离糖类和有机酸，然后用制备型液相色谱分离得到高纯苹果酸后再用元素分析-稳定同位素比值质谱进行转化、分析，该方法是目前测定苹果汁中苹果酸δ¹³C值的唯一有效方法，但是却存在着前处理复杂，需要另外增加一台制备液相的困境，操作难度大，实验成本高。根据下述非专利文献4-10可知，随着近年来科技的进步，已经可以实现大分子有机物δ¹³C值的在线分析：使用液相色谱-稳定同位素比值质谱联用技术分析饮料酒乙醇和甘油δ¹³C值、蜂蜜中葡萄糖、果糖和二糖δ¹³C值、蛋白质的可溶性氨基酸δ¹³C值等。然而由于液相色谱-稳定同位素比值质谱联用技术分析的局限，(不能使用有机相作为流动相)以及果汁中有机酸的色谱分离性能，尚未见有直接、快速分析苹果汁中苹果酸δ13C值的报道：Guyon等人发现液相色谱-稳定同位素比值质谱联用技术不能分离果汁中的各种有机酸，因此只能测定果汁中所有有机酸的δ13C值，祝伟霞(参见非专利文献11)也发现分析过程中果糖与苹果酸的色谱峰有重叠，而不能实现准确分析。

当前急需快速、直接测定苹果汁中苹果酸δ13C值的方法，本研究借鉴亲水性反相C18色谱柱的优越性和液相色谱仪-稳定同位素比值质谱仪的先进性，根据苹果酸的分析要求建立简单、直接测定果汁苹果酸δ13C值的方法，为果汁中苹果酸的来源分析提供技术支持。

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非专利文献11：祝伟霞，杨冀州，杨娜，等.液相色谱-同位素比值质谱法研究桔橙汁中苹果酸碳同位素比值[J].分析试验室，2014，33(12)：1402-1407。

发明内容

发明所要解决的课题

鉴于上述现有技术的问题，本发明的目的在于提供能够快速、直接测定果汁中苹果酸δ¹³C值的新型方法。

用于解决课题的手段

本发明人为了解决上述课题进行了反复深入的研究，结果发现，在液相色谱-稳定同位素比值质谱采用亲水性反相C18色谱柱，无需对样品进行复杂的前处理(例如提纯以除去果糖)，即能够以优异的分离效能对苹果酸进行自动分离和纯化，实现苹果酸δ¹³C快速、直接测定的目的。基于上述见解，完成了本发明。

简言之，针对当前果汁中苹果酸δ¹³C测定时需要复杂前处理过程提纯的问题，建立一种快速、直接的分析方法，为果汁中苹果酸δ¹³C的分析及其应用提供技术方法。

本发明根据苹果汁中苹果酸δ¹³C分析要求，根据亲水性反相C18色谱柱的分离能力和液相色谱-稳定同位素比值质谱仪的分析性能，开发简单、直接测定果汁苹果酸δ¹³C的方法，解决以往苹果酸δ¹³C测定时需纯化或排除某些有机组分干扰的问题。本发明为果汁苹果酸δ¹³C的快速、直接测定提供了行之有效的解决方案，将促进果汁苹果酸δ¹³C的研究与应用，为果汁真伪鉴别提供技术方法。

具体而言，本发明提供一种快速测定果汁中苹果酸δ¹³C值的方法，其包括以下步骤：

a.取果汁样品，将其稀释150～250倍，过滤，得到滤液；和

b.用液相色谱-稳定同位素比值质谱测定苹果酸δ¹³C值，

其中，所述液相色谱-稳定同位素比值质谱使用的色谱柱是亲水性反相C18 色谱柱。

在一个实施方式中，样品稀释时所用的溶剂为水，优选为超纯水。

在另一个实施方式中，在步骤a中所述过滤使用滤膜进行，所述滤膜的孔径为0.22μm或0.45μm，优选0.22μm。

在又一个实施方式中，所述亲水性反相C18色谱柱是ThermoFisher SyncronisAQ-C18色谱柱，或其等效色谱柱。

在一个优选实施方式中，液相色谱的流动相为0.0005mol/L的硫酸溶液，流速为0.20～0.6mL/min，优选为0.25mL/min；色谱柱温度为20～75℃，优选为30℃。

在一个优选实施方式中，所述液相色谱-稳定同位素比值质谱配备有IsoLink 氧化接口，所述IsoLink氧化接口使用磷酸和过二硫酸钠溶液为反应助剂。

在进一步的优选实施方式中，磷酸和过二硫酸钠溶液的浓度和流速使得m/z＝32的离子流信号强度为4000～18000mv，优选为8000mV。

在一个优选实施方式中，所述果汁来自以苹果酸作为重要风味特征组分的水果。

在一个优选实施方式中，所述果汁为苹果汁、桃汁、葡萄汁、桔汁、橙汁、梨汁、芒果汁、菠萝汁、木瓜汁或柠檬汁。

在进一步的优选实施方式中，所述果汁为苹果汁、桃汁或葡萄汁。

本发明的有益结果

本发明无需复杂的样品前处理过程，只需对样品简单稀释过滤，依靠色谱柱的分离效能对苹果酸进行自动分离和纯化，实现苹果酸δ¹³C快速、直接测定的目的，为果汁产品的掺假检测研究提供了一种不经前处理而直接测定苹果酸δ¹³C的新方法。

附图说明：

图1 LC-IRMS测定样品中苹果酸δ¹³C的离子流图；

图2 LC-IRMS测定苹果汁中苹果酸δ¹³C的离子流图。

具体实施方式

本发明使用亲水性反相C18色谱柱将样品中苹果酸与其他有机化合物分离，在线通过液相色谱-稳定同位素比值质谱转化并测定苹果酸δ¹³C。

更具体而言，本发明的直接测定果汁苹果酸δ¹³C值的方法，可以包括以下步骤：

1).色谱柱选型；

2).样品稀释过滤；

3).液相色谱-稳定同位素比值质谱测定。

以下对分别详细地介绍各步骤。

色谱柱选型

在第1)步骤中，色谱柱选型指的是为液相色谱-稳定同位素比值质谱配备亲水性反相C18色谱柱。

根据文献分析可知，影响果汁中苹果酸δ¹³C分析的因素主要是糖的干扰，尤其是果糖。因此，苹果酸的分离、纯化就成了δ¹³C测定的关键。现有技术中，需要对果汁样品进行复杂的前处理，以消除果汁中的糖类(特别是果糖)和其他有机物的影响。

本发明人惊奇的发现，亲水性反相C18色谱柱，例如ThermoFisher Syncronis AQ-C18色谱柱，能够良好地分离苹果酸与糖类物质以及果汁其他有机物，从而为通过液相色谱-稳定同位素比值质谱测定准确测定果汁中苹果酸δ¹³C提供了直接、快速的途径。当然，也可以采用与ThermoFisher Syncronis AQ-C18色谱柱等效的其他色谱柱。

样品稀释过滤

在进行测定时，需要首先将果汁样品稀释150～250倍。样品稀释时所用的溶剂为水，优选为超纯水。样品稀释的目的是将样品中的糖类、有机酸等有机物的含量降至合适范围，以供上样进行液相色谱-稳定同位素比值质谱测定。

然后对稀释后的溶液过滤。过滤使用滤膜进行，滤膜例如水系微孔滤膜，孔径为0.45μm或0.22μm，优选0.22μm。过滤的目的是因为液相色谱分析时要排除水不溶性杂质，防止大分子物质堵塞液相色谱柱。

稀释后样品的上样体积优选为50μL。

液相色谱-稳定同位素比值质谱测定

液相色谱-稳定同位素比值质谱测定，指的是使用亲水性反相C18色谱柱分离样品中各有机组分，流动相为pH＝2(即0.0005mol/L)的硫酸溶液，流速为 0.20～0.60mL/min，优选0.25mL/min；柱温为20～70℃，优选为25～30℃，更优选为30℃。

液相色谱分离完成的苹果酸需经过氧化才能生成仪器检测的二氧化碳，因此液相色谱-稳定同位素比值质谱配备有IsoLink氧化接口，所述IsoLink氧化接口使用磷酸和过二硫酸钠溶液为反应助剂，其中过二硫酸钠为氧化剂，磷酸为酸化剂。过二硫酸钠的浓度过高容易堵塞毛细管路系统，浓度过低则氧化能力不足。此外，氧化剂与酸化剂的流速大小也会影响氧化能力。经过研究，发现优选将调整反应助剂的浓度和流速至m/z＝32的离子流信号强度为4000～18000mv，优选至8000mV。在这种情况下，氧化能力符合仪器的分析要求。

任选地是，确认稳定同位素比值质谱仪的工作环境、气密性、离子室的真空度均符合要求，然后检验仪器测定CO₂中δ¹³C的精密度和稳定性，必要时调整离子源参数值。

本发明特别适合来自以苹果酸作为重要风味特征组分的水果的果汁，例如苹果汁、桃汁、葡萄汁、桔汁、橙汁、梨汁、芒果汁、菠萝汁、木瓜汁或柠檬汁，特别适用于苹果汁、桃汁或葡萄汁中苹果酸δ¹³C值的测定，从而能够鉴定掺假果汁。

实施例

下面将通过借助以下实施例来更详细地说明本发明。以下实施例仅是说明性的，应该明白，本发明并不受下述实施例的限制。

实施例1：

1.1仪器

液相色谱-稳定同位素比值质谱仪(LC-IRMS，配备氧化接口Isolink)；

1.2材料与试剂

苹果、蔗糖(分析纯)，葡萄糖(分析纯)，果糖(分析纯)，苹果酸(分析纯)；超纯水(Milli-Q系统制备)；正磷酸(纯度≥99％)与过二硫酸钠(纯度≥99％)；氦气(纯度≥99.999％)；0.22μm滤膜(水系)；硫酸(纯度≥99％)。

1.3色谱条件

Syncronis AQ-C18色谱柱(4.6×250mm/5μm)；流动相为0.005mol/L的硫酸溶液，流速为0.25mL/min；色谱柱温度为30℃。

1.4氧化接口工作条件

氧化接口(IsoLink)使用磷酸和过二硫酸钠溶液为反应助剂，用IRMS同时监测m/z＝32的离子流信号强度，调整磷酸和过儿硫酸钠溶液的浓度和流速确保 m/z＝32的离子流信号强度为8000mV。

1.5样品准备

以纯净水为溶剂，配制有机物浓度为0.12g/L的混合溶液(蔗糖：葡萄糖：果糖：苹果酸＝1∶1∶1∶1)，0.22μm滤膜过滤后待用。

苹果榨汁后稀释200倍，0.22μm滤膜过滤后待用。

1.6样品测定

调整液相色谱-稳定同位素比值质谱仪至工作状态后，取1.5中的混合溶液和苹果汁各50μL测定溶液中有机物的δ¹³C(每个样品测定5遍)，离子流图谱分别见附图1和附图2，苹果酸δ¹³C测定结果见表1。

1.7结果分析

根据碳同位素分析的要求，苹果汁中苹果酸δ¹³C的测定需避免果汁中其他有机物(主要是葡萄糖、果糖和蔗糖)。由单物质的分析图谱可知葡萄糖、果糖、蔗糖和苹果酸的保留时间分别为984s～1128s、988s～1135s、1165s～1302s和1307s～1456s，其中葡萄糖和果糖的保留时间相同，而苹果酸的保留时间与蔗糖相近，但是也有较高的分离度，满足同位素分析的要求。由附图2可知，本发明采用亲水性反相C18柱分离苹果汁中的苹果酸并在线测定δ¹³C值的方法是可行的。

表1苹果酸δ¹³C测定结果(‰)

由表1可知，苹果汁中苹果酸和化学品苹果酸各5次测定的标准偏差均小于0.15‰，说明本发明测定苹果酸δ¹³C值具有很高的稳定性。

实施例2

2.1仪器

液相色谱-稳定同位素比值质谱仪(LC-IRMS，配备氧化接口Isolink)；

2.2材料与试剂

新鲜苹果，苹果酸(分析纯)；超纯水(Milli-Q系统制备)；正磷酸(纯度≥99％) 与过二硫酸钠(纯度≥99％)；氦气(纯度≥99.999％)；0.22μm滤膜(水系)；硫酸 (纯度≥99％)。

2.3色谱条件

Syncronis AQ-C18色谱柱(4.6×250mm/5μm)；流动相为0.005mol/L的硫酸溶液，流速为0.25mL/min；色谱柱温度为30℃。

2.4氧化接口工作条件

氧化接口(IsoLink)使用磷酸和过二硫酸钠溶液为反应助剂，用IRMS同时监测m/z＝32、33和34的离子流信号强度，调整磷酸和过儿硫酸钠溶液的浓度和流速确保m/z＝32的离子流信号强度为8000mV。

2.5样品准备

新鲜苹果榨汁后测定苹果酸的含量。

以蒸馏水和化学品苹果酸(分析纯)为试验对象，按照苹果中的苹果酸含量配置同样浓度的苹果酸溶液。

按照20％、40％、60％和80％的比例向苹果汁中加入苹果酸水溶液以配制含有不同外源苹果酸的混合溶液，将混合溶液分别稀释200倍后用0.22μm滤膜过滤待用。

2.6测定

调整液相色谱-稳定同位素比值质谱仪至工作状态后，取稀释后的混合溶液各 50μL进样测定，各溶液苹果酸的δ¹³C测定结果见表2。

表2混合溶液的苹果酸δ¹³C测定结果(‰)

由表2可知，苹果酸溶液按比例加入苹果汁后，混合溶液中苹果酸δ¹³C值呈现逐渐偏正的趋势，以此可检测苹果汁中是否含有外源添加的苹果酸。而比较混合溶液中苹果酸δ¹³C的预测值和实测值，可知二者的偏差在0.2‰以内，表明本方法可以准确测定苹果汁中苹果酸的δ¹³C值。

最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (14)

1.一种快速测定果汁中苹果酸δ¹³C值的方法，其包括以下步骤：

a.取果汁样品，将其稀释150～250倍，过滤，得到滤液；和

b.用液相色谱-稳定同位素比值质谱测定苹果酸δ¹³C值，

其中，所述液相色谱-稳定同位素比值质谱使用的色谱柱是亲水性反相C18色谱柱，液相色谱的流动相为0.0005mol/L的硫酸溶液。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，样品稀释时所用的溶剂为水。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤a中所述过滤使用滤膜进行，所述滤膜的孔径为0.22μm或0.45μm。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲水性反相C18色谱柱是ThermoFisherSyncronis AQ-C18色谱柱。

5.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，流动相的流速为0.20～0.6mL/min；色谱柱温度为20～75℃。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱-稳定同位素比值质谱配备有IsoLink氧化接口，所述IsoLink氧化接口使用磷酸和过二硫酸钠溶液为反应助剂。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，磷酸和过二硫酸钠溶液的浓度和流速使得m/z＝32的离子流信号强度为4000～18000mv。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述果汁来自以苹果酸作为重要风味特征组分的水果。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述果汁为苹果汁、桃汁、葡萄汁、桔汁、橙汁、梨汁、芒果汁、菠萝汁、木瓜汁或柠檬汁。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述果汁为苹果汁、桃汁或葡萄汁。

11.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述水为超纯水。

12.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述滤膜的孔径为0.22μm。

13.如权利要求5所述的方法，其特征在于，液相色谱的流速为0.25mL/min；所述色谱柱温度为30℃。

14.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述离子流信号强度为8000mV。

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