CN104215731B - 采用液相色谱-同位素质谱测定鉴别真假苹果汁的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及采用液相色谱-同位素质谱测定鉴别真假苹果汁的方法，可有效鉴别真假苹果汁，保证苹果汁产品质量的安全，方法是，将不同产地的苹果分别制成苹果汁样品液；对制备的苹果汁样品液植物糖进行分析，确立植物糖测定条件，对苹果汁中苹果酸进行分析，确立植物糖测定条件；对天然苹果汁进行分析建立苹果汁中植物糖δ13C比值与苹果酸的线性关系，作出苹果汁真假判定：苹果汁蔗糖δ13Csuc-19.09‰至-26.47‰之间，葡萄糖δ13Cglu-24.52‰至-30.50‰之间，果糖δ13Cfru-在25.22‰至31.96‰之间，植物糖间比值δ1在0.27至2.78之间，苹果酸δ13Cmal在-25.31‰至32.57‰之间，线性相关性系数R2＞0.7255为真，本发明方法测定结果准确、灵敏度高，有效保证了苹果汁的质量，防止掺假苹果汁对消费者造成的伤害，经济和社会效益巨大。
Description
技术领域
本发明涉及果汁，特别是一种采用液相色谱-同位素质谱测定鉴别真假苹果汁的方法。
背景技术
苹果汁由于其营养价值高，易于吸收利用，为消费者所喜爱的饮料。随着人们对天然果汁需求量越来越大，各种各样的天然或经加工的果汁应运而生。我国苹果汁资源丰富、种类繁多，在国民生产总值中占据重要的地位，也是出口的重要产品。为确保苹果汁质量和产品顺利出口，首先要提高苹果汁产品质量，完善我国对苹果汁质量检测，从加工源头把握好苹果汁质量关。目前市售苹果汁品种及其包装种类多，如100％果汁、浓缩果汁、含果肉果汁、果汁饮料等，各种各样的商品名称让消费者眼花缭乱，颇为疑惑。国家标准GB10789-2007《饮料通则》中，将饮料分为碳酸饮料类、果蔬菜汁类、蛋白饮料类、包装饮用水类、茶饮料类、咖啡饮料类、植物饮料类、风味饮料类、特殊用途饮料类、固体饮料类、其他饮料等11类。纯果汁是将新鲜水果加工制成非复原(NFC)果汁，复原(FC)果汁是在浓缩果汁中加入等量水分制成，其色泽、风味、理化指标与原水果相同，浓缩果汁可延长贮藏期，便于运输。天然苹果汁与浓缩苹果汁类产品禁止添加任何添加剂，天然苹果汁中添加任何外来物质都属于掺假。由于果汁的巨大市场诱惑力，一些不法厂商造假以牟取暴利，在果汁含量、标签上作假，使消费者利益和身体健康受到威胁。随着时代的发展，现代掺假水平越来越高，果汁掺假手段主要有6种方式：(1)添加水稀释纯果汁含量；(2)添加外源性特征成份，包括天然和人工合成的甜味剂(蔗糖、各种糖浆、人工合成甜味剂等)、酸味剂(柠檬酸、苹果酸等)、香精香料、增稠剂等；(3)添加化学成份，如色素、防腐剂等；(4)添加其它果汁或者果渣提取液；(5)以浓缩还原汁代替非浓缩还原汁；(6)原产地冒充。这些掺假手段均以模仿真实苹果汁体系中特征组分特性为目标，但掺假果汁的营养价值低，损坏消费者的利益和健康。
自上世纪70年代以来，国际食品法典、欧盟、美国、中国等食品机构均制定果汁相关法规，严格控制果汁掺假。我国GB10789-2007准确规定果汁与浓缩果汁中可溶性固性物、果汁含量。随着商品化掺假果汁技术的不断提高，相关的真伪鉴定方法也在不断更新完善，研究人员在不遗余力地研发准确、可靠的检测方法对其进行鉴别，但目前国内外还未发布一种有效鉴别苹果汁真伪的方法，对苹果汁真实天然成份的检测已成为政府监督部门和研究人员面临的严峻问题。因此，对苹果汁进行测定，建立有效苹果汁真伪判定的方法，己成为保证苹果汁质量安全的重要技术措施。
针对果汁的各种掺假手段，国内外已有很多相关报道，主要采用旋光、近红外光谱、气/液相色谱、核磁共振、稳定同位素比值质谱等技术分析其中理化参数、微生物成份、特征有机组份、天然同位素比、违禁添加剂。
稳定同位素比值质谱分析法是鉴别果汁真伪强有力的检测手段，在果汁真伪与原产地鉴别中广泛应用。由于植物的遗传特性不同，C3代谢植物与C4代谢植物的同位素比率有较大的差异，苹果汁属C3植物，而用于掺假的原料如甘蔗糖、高果玉米糖浆等主要来源于C4植物。苹果汁中掺入甘蔗糖或高果玉米糖浆后，果汁总糖中δ13C会出现升高现象。由于植物的不同光合作用途径及其碳稳定同位素的生物歧视效应，因此,利用来源不同的碳水化合物碳同位素比值的差异，以同位素质谱仪测定其碳同位素比值，就能鉴定出用化学法难以辨别的物质。糖份与有机酸是果汁中主要的风味营养物质，它的含量高低与果汁品质有极密切的关系。目前测定糖份有机酸含量的方法有常规化学滴定法、气相色谱法、离子色谱法等，因此根据天然苹果汁中不同成份中同位素数值，对于鉴定苹果汁真伪具有重要的意义。但至今未见有采用液相采用液相色谱-同位素质谱测定鉴别真假苹果汁的方法的公开报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种采用液相色谱-同位素质谱测定鉴别真假苹果汁的方法，可有效鉴别真假苹果汁，保证苹果汁产品质量的安全。
本发明解决的技术方案是，该方法包括以下步骤：
1、果汁制备
将不同产地的苹果分别制成苹果汁样品液；
2、对制备的苹果汁样品液植物糖进行分析，确立植物糖测定条件，方法是：
A、对苹果汁预处理，将苹果汁样品液分别取0.3g加入水定容50mL，再取200μL加水稀释至1mL，过滤后用液相色谱-同位素质谱仪测定，每隔10个测试样品至少测定一次质控标准溶液进行质量控制；
B、建立液相色谱-同位素质谱(LC-IRMS)测定条件，其测定条件为：氩气峰40中心杯小于84mV，氧的32峰达10000mV，CO2信号峰在1000-2000mV之间；
C、对液相色谱-同位素质谱进行稳定性测试：使其标准偏差小于0.3％，并对CO2参考气δ13C值进行标定；
D、对质控标品δ13C值的测定，得到质控标品果糖、葡萄糖、蔗糖的δ13C值，用于分析结果质控；
3、对苹果汁中苹果酸进行分析，确立植物糖测定条件；
4、对天然苹果汁进行分析建立苹果汁中植物糖δ13C比值与苹果酸的线性关系，作出苹果汁真假判定：苹果汁蔗糖δ13Csuc-19.09‰至-26.47‰之间，葡萄糖δ13Cglu-24.52‰至-30.50‰之间，果糖δ13Cfru-在25.22‰至31.96‰之间，植物糖间比值δ1在0.27至2.78之间，苹果酸δ13Cmal在-25.31‰至32.57‰之间，线性相关性系数R2＞0.7255为真，否则为假，从而实现对苹果汁真假的测定、鉴别。
本发明首创利用液相色谱-同位素质谱测定鉴别真假苹果汁，在经科学研究、试验和对实践总结，根据国内外苹果主产区不同产地苹果中果糖、葡萄糖、蔗糖、苹果酸δ13C同位素值的分布范围，及掺假苹果汁中的果糖、葡萄糖、蔗糖、苹果酸δ13C同位素比值变化范围，作为苹果汁基础数据应用于果汁掺假鉴别，本发明采用液相色谱-同位素质谱测定苹果汁中果糖、葡萄糖、蔗糖、苹果酸中δ13C值的分析方法、色谱分离和质谱条件等参数，创立了苹果汁中植物糖δ13C比值与苹果酸的线性相关性，可以根据其是否显著差异判断苹果汁的掺假；并经国际原子能机构标准品质控比对，证明该方法测定结果准确、灵敏度高，有效保证了苹果汁的质量，防止掺假苹果汁对消费者造成的伤害，经济和社会效益巨大。
附图说明
图1为不同产地苹果汁中蔗糖碳同位素分布图。
图2为不同产地苹果汁中果糖碳同位素分布图。
图3为不同产地苹果中葡萄糖同位素碳分布图。
图4为不同产地苹果中植物糖碳同位素比值分布图。
图5为不同产地苹果中苹果酸碳同位素比值分布图。
图6为苹果中苹果酸与碳同位素比值间的线性关系。
具体实施方式
以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施时，是由以下步骤实现：
1、果汁制备
制备天然苹果汁：将不同产地的234种苹果各取1-1.5kg，分别置于榨汁机内榨汁、离心，收集上清液，制成234种样品液，-18℃冷冻保存，防止氧化、变质；
2、对制备的苹果汁中植物糖进行分析，确立植物糖测定条件，所述的植物糖包括果糖、葡萄糖和蔗糖，方法是：
A、对苹果汁预处理，将制备的234种天然苹果汁样品液分别取0.3g加入水定容50mL，再取200μL加水稀释至1mL，过滤后用液相色谱-同位素质谱仪测定，每个样品进行10个二氧化碳(CO2)循环测定仪器稳定性，每隔10个测试样品至少测定1次混合标准工作溶液进行质量控制；
B、确立液相色谱-同位素质谱(LC-IRMS)分析条件：其条件是，色谱柱：Zobax Ca NP5300mm×7.8mm(i.d.)，粒度9μm；柱温：75℃；流动相：超纯水；流速：0.35mL/min；氧化反应炉温度：99.9℃；过二硫酸钠氧化剂流速：0.05mL/min；磷酸酸化剂流速：0.05mL/min的条件下进行测定；
C、LC-IRMS测定前的4个要求：首先保证不漏气，对LC-IRMS系统进行检漏，氩气峰40中心杯小于84mV；然后要使其有足够的氧化性，对氧化能力检验，使氧32峰达10000mV，；再者要防止有机碳对LC-IRMS的污染，使CO2信号峰在1000-2000mV之间，该信号值越低越好；最后要保证LC-IRMS仪器的稳定性，测定10个CO2循环，使其测定值标准偏差小于0.3％；
D、LC-IRMS所用CO2参气体δ13C值的标定：方法是，将国际原子能机构提供的蔗糖质控(IAEA-CH-6)给定的δ13C值-10.49‰输入计算机，标定CO2气体值，10个平行测定结果值平均，作为CO2参考气的δ13C值；每次开关机前应将IAEA-CH-6标准溶液测定一次进行质量控制，确保测得的δ13C值与证书标明数值相差±0.30‰内；
E、对质控标品δ13C值的测定：首先制备标准储备溶液，方法是，分别称取100mg果糖、葡萄糖、蔗糖标准品，用水定容至100mL，该标准储备溶液质量浓度为1mg/mL；然后配制混合标准工作溶液，方法是，吸取0.5mL果糖、葡萄糖标准储备溶液，0.2mL蔗糖标准储备溶液用水稀释并定容至10mL，配制成果糖、葡萄糖质量浓度为50μg/mL、蔗糖浓质量度为20μg/mL的混合标准工作溶液；最后是质控标品δ13C值的测定，将混合标准溶液按B步骤中规定的仪器条件下进行测定，将10个平行测定结果值平均，得到质控标品果糖、葡萄糖、蔗糖的δ13C值，用于分析结果的质量控制；
3、对苹果汁中苹果酸进行分析，确立苹果酸测定条件，方法是：
A、对苹果汁进行预处理：将步骤1制备的234种天然苹果汁各取20g分别加水稀释至100mL，过滤，每种取1mL过滤液进行高效液相色谱(HPLC)制备苹果酸，制备样液进行LC-IRMS分析，每个样品运行时进行10个二氧化碳循环测定仪器稳定性，每隔10个测试样品至少测定一次质控标准工作溶液进行质量控制；
B、确立HPLC制备苹果汁中苹果酸条件：其条件是，色谱柱：Zobax Ca NP5 300mm×7.8mm(i.d.)，粒度9μm；柱温：75℃；进样量：100μL；流动相：水；流速：0.35mL/min；馏分收集时间：10.0min-14.0min；
C、确立LC-IRMS分析条件：其条件是，色谱柱：ICSep Coregel-87H3氢型柱，300mm×7.8mm(i.d.)，粒度5.0μm；柱温：80℃；流动相：8mmol/L硫酸溶液；流速：0.35mL/min；氧化反应炉温度：99.9℃；过二硫酸钠氧化剂流速：0.045mL/min；磷酸酸化剂流速：0.045mL/min；
D、LC-IRMS测定前的4个要求：同步骤(2)中的C；
E、LC-IRMS所用CO2参气体δ13C值的标定：同步骤(2)中的D；
F、对质控标品δ13C值的测定：首先制备标准储备溶液，方法是，称取100mg苹果酸标准品，用水定容至100mL，该标准储备溶液质量浓度为1mg/mL；然后配制标准工作溶液，方法是，吸取0.4mL苹果酸标准储备溶液，用水稀释并定容至10mL，配制成质量浓度为40μg/mL的标准工作溶液；最后是质控标品δ13C值的测定，将混合标准溶液按3C步骤中规定的仪器条件下进行测定，将10个平行测定结果值平均，得到质控标品果糖、葡萄糖、蔗糖的δ13C值，用于分析结果的质量控制；
4、根据对天然苹果汁的分析结果，建立作出苹果汁真假判定：方法是，满足以下四个条件：一、蔗糖、葡萄糖、果糖、苹果酸δ13C测定值在范围之间，蔗糖δ13Csuc-19.09‰至-26.47‰之间，葡萄糖δ13Cglu-24.52‰至-30.50‰之间，果糖δ13Cfru-在25.22‰至31.96‰之间，植物糖间比值δ1在0.27至2.78之间，苹果酸δ13Cmal在-25.31‰至32.57‰之间；二、葡萄糖-蔗糖、果糖-蔗糖δ13C差值间的比值在0.27-2.78之间；三、苹果汁中蔗糖、葡萄糖、果糖、苹果酸δ13C最大差值在-10.48‰至-1.7‰之间；四、苹果汁的葡萄糖-蔗糖、果糖-蔗糖δ13C差值间的比值与苹果酸δ13C值具有线性相关性，符合线性方程Y＝-2.8186X-24.262，相关系数大于0.7255，满足以上四个条件为真，否则为假，从而实现对苹果汁真假的测定、鉴别。
为了保证使用效果，所述的国际原子能机构提供的蔗糖质控标准溶液IAEA-CH-6，每次使用前应将IAEA-CH-6标准溶液测定一次，确保测得的δ13C值与标准溶液证书标明的数值相差±0.30‰内；所述的液相色谱-同位素质谱仪为DELTA V Plus液相色谱-同位素质谱仪，配备Surveyor液相色谱与Isolink接口(美国Thermofisher公司)；1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)5810型离心机(日本日立公司)；飞利浦榨汁机HR1861/30(广州飞利浦公司)0.22μm水相一次性微孔滤膜(美国Agilent公司)；色谱柱：有机酸分析液相色谱柱ICSepCoregel-87H3(氢型)7.8×300mm，9μm(美国TRANSGENOMIC公司)；糖度计IAEA-CH-6,Sucrose标示值：δ13C-10.449‰VPDB(均购自于国际原子能机构)；水为Millipore纯水器制得超纯水，使用前抽空超声(美国Millipore公司)。
本发明方法先进，首创性的将液相色谱-同位素质谱技术用在苹果汁真假的鉴别，开创了苹果汁真假鉴别的新方法，与现有技术相比：
1、创建了国内外苹果主产区不同产地水果中植物糖、有机酸、总碳、总氮、总氧同位素值的分布范围，作为果汁基础数据应用于果汁掺假鉴别。
2、本发明采用液相色谱-同位素质谱测定苹果汁果糖、葡萄糖、蔗糖、苹果酸中δ13C值的分析方法，优化了最佳提取条件、有机酸净化制备方法、色谱分离和质谱条件等参数，对于苹果汁研究了植物糖δ13C比值与苹果酸的线性相关性。
2、本发明建立了鉴别真假果汁的方法，经国际原子能机构与国家标准质控比对，证明该方法测定结果准确、灵敏度高，是申请人经科学研究、试验和对实践总结作出的创造性劳动结晶，有关资料如下：
1.仪器和试剂
DELTA V Plus液相色谱-同位素质谱仪，配备Surveyor液相色谱与Isolink接口(美国Thermofisher公司)；1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)5810型离心机(日本日立公司)；飞利浦榨汁机HR1861/30(广州飞利浦公司)0.22μm水相一次性微孔滤膜(美国Agilent公司)。色谱柱：有机酸分析液相色谱柱ICSep Coregel-87H3(氢型)7.8*300mm，9μm(美国TRANSGENOMIC公司)；强阳离子钙型交换色谱柱Zobax Ca NP5 7.8*300mm钙型，9μm(美国Agilent公司)。糖度计
IAEA-CH-6,Sucrose标示值：δ13C-10.449‰VPDB(均购自于国际原子能机构)；过二硫酸钠，Na2S2O4(＞99％)；高纯磷酸，H3PO4(＞99％)；二水钨酸钠，Na2WO4·2H2O；浓硫酸，H2SO4；1.12mol/L过二硫酸钠溶液：称取20g(精确到0.01g)过二硫酸钠用水定容至250mL；0.33mol/L磷酸溶液：量取15mL高纯磷酸，用水定容至250mL；8mmol/L硫酸溶液：取29.6mL浓硫酸，用水稀释至1000mL；D-果糖、D-无水葡萄糖、蔗糖、苹果酸标准品购自美国Sigma公司、德国Dr.Ehrenstorfer公司；水为Millipore纯水器制得超纯水，使用前抽空超声(美国Millipore公司)。
2标准溶液的配制
蔗糖同位素标准溶液：称取10.0mg IAEA-CH-6(精确到0.01mg)同位素标准物质，用水定容至100mL，于0℃-4℃保存可使用一周。20μg/mL同位素标准工作溶液：准确吸取0.2mL同位素标准溶液，用水稀释并定容至1mL，配制成20μg/mL的同位素标准溶液，该溶液使用前配制。
D-果糖、D-无水葡萄糖、蔗糖标准溶液：分别称取100mg(精确到0.01mg)标准品，用水定容至100mL，于0℃-4℃保存可使用一周，该溶液浓度为1mg/mL。3种植物糖混合标准溶液：准确吸取0.5mL果糖、葡萄糖标准储备溶液，0.2mL蔗糖标准储备溶液用水稀释并定容至10mL，配制成果糖、葡萄糖浓度为50μg/mL、蔗糖浓度为20μg/mL的混合标准溶液，该溶液使用前配制。
苹果酸标准溶液：分别称取100mg(精确到0.01mg)标准品，用水定容至100mL，于0℃-4℃保存可使用一周，该溶液浓度为1mg/mL。40μg/mL苹果酸标准溶液：准确吸取0.4mL苹果酸标准储备溶液，用水稀释并定容至10mL，配制成40μg/mL的混合标准溶液，该溶液使用前配制。
3苹果汁制备
苹果洗净晾干，放入榨汁机内榨汁，收集果汁。取一定量果汁于离心管中在离心机上4000r/min离心5min，收集上清液于具塞塑料离心管，-18℃冷冻保存。
市售果汁：将果汁混匀后于离心管中，在离心机上4000r/min离心5min，收集上清液于具塞塑料离心管，-18℃冷冻保存。
掺假植物糖果汁的制作：取自榨苹果汁100mL适量加入果糖、蔗糖、葡萄糖制得。
掺假有机酸果汁的制作：取自榨苹果汁100mL分别适量加入苹果酸制得。
4植物糖分析
4.1前处理
称取均匀苹果汁(试样)0.3g(精确到0.001g)于50mL容量瓶中，用水定容。用移液器移取上述水溶液200μL于进样瓶中，用水稀释至1mL，过0.22μm微孔滤膜后，用液相色谱-同位素质谱仪测定。
4.2仪器条件
4.2.1同位素质谱仪的预调
操作前确认检测环境、气密性和真空度达到要求，然后检验仪器的稳定性和线性是否符合要求，必要时调整离子源参数。
4.2.2系统检漏
在氩气分析模式下，检验峰40中心杯小于84mV说明不漏气。
4.2.3氧化能力检验
进行液相色谱-同位素质谱测定前，调整氧化剂和酸化剂流速，确保体系的氧化能力达到要求。切换两相Oxid/acid混合泵至检测器，在O2分析模式下操作，等量调整Oxid/acid泵流速，使O2的32峰达10,000-15,000mV，使其有足够的氧化性。
4.2.4评价系统中有机碳的污染
切换至CO2分析模式，找开样品spilt开关，使CO2信号峰在1000-2000mV之间，该信号越低越好，如超过2000mV，说明系统中有机污染物超标，主要是流动相中水受有机碳污染。
4.2.5LC-IRMS稳定性测试
设定10个二氧化碳循环测定仪器稳定性，使其标准偏差小于0.3％。
4.2.6植物糖分析液相色谱-同位素质谱条件
a)色谱柱：Zobax Ca NP5 300mm×7.8mm(i.d.)，粒度9μm；
b)柱温：75℃；
c)流动相：超纯水；
d)流速：0.35mL/min；
e)进样量：10μL；
f)氧化反应炉温度：99.9℃；
g)氧化反应参考条件参见；
1)氧化剂：过二硫酸钠溶液
2)氧化剂流速：0.05mL/min
3)酸化剂：磷酸溶液
4)酸化剂流速：0.05mL/min
h)载气：氦气，纯度99.999％；
i)参考气：二氧化碳，纯度99.999％。
4.2.7对苹果汁进行测定
a)CO2参考气δ13C值的测定
在Conflo模式(即由万用接口同时把载气流量范围不同的多个样品前处理装置接到同一台同位素比质谱仪上)下将国际原子能机构IAEA-CH-6给定的DELTA值输入，标定CO2气体值，10个平行测定结果值平均，测得CO2参考气的δ13C值-19.37‰。b)质控苹果汁标品δ13C值的测定
将果糖配制成浓度为50μg/mL、葡萄糖浓度为50μg/mL、蔗糖浓度为20μg/mL的单个标准工作溶液，在液相色谱-同位素质谱仪条件下进行测定，将10个平行测定结果值平均，得到质控标品果糖、葡萄糖、蔗糖的δ13C值，用于分析结果质控。
质控标品测定值
SD为标准差(又称均方差或标准偏差，以下同)
c)苹果汁样品中植物糖的测定
所述的植物糖包括果糖、葡萄糖和蔗糖，按照上述液相色谱-同位素质谱条件测定苹果汁样品中果糖、葡萄糖、蔗糖δ13C值(δ13Cfru、δ13Cglu、δ13Csuc)。每个样品运行时进行10个二氧化碳循环测定仪器稳定性，每隔10个测试样品至少测定一次质控标准溶液进行质量控制。每次开关机前应将IAEA-CH-6标准溶液测定一次进行质量控制，确保测得的δ13C值与证书标明数值相差±0.30‰内。
5果汁中有机酸分析
5.1前处理
称取20.0g苹果汁(精确到0.001g)于100mL容量瓶中，用水定容，混匀后经0.22μm微孔滤膜过滤后，取1mL过滤液于进样瓶中，在：
a)色谱柱：Zobax Ca NP5 300mm×7.8mm(i.d.)，粒度9μm；
b)柱温：75℃；
c)进样量：100μL；
d)流动相：水；
e)流速：0.35mL/min
f)馏分收集时间：10.0min-14.0min的条件进行HPLC制备有机酸；
5.2有机酸液相色谱-同位素质谱分析，利用液相色谱-同位素质谱仪在a)色谱柱：ICSepCoregel-87H3(氢型)柱，300mm×7.8mm(i.d.)，粒度5.0μm；
b)柱温：80℃；
c)流动相：8mmol/L硫酸溶液；
d)流速：0.35mL/min；
e)进样量：10μL；
f)氧化反应炉温度：99.9℃；
g)氧化反应参考条件参见；
1)氧化剂：过二硫酸钠溶液
2)氧化剂流速：0.045mL/min
3)酸化剂：磷酸溶液
4)酸化剂流速：0.045mL/min
h)载气：氦气，纯度99.999％；
i)参考气：二氧化碳，纯度99.999％，对制备的有机酸进行液相色谱-同位素质谱测试分析；
5.3LC-IRMS的测试
5.3.1LC-IRMS的预调
进行操作前确认检测环境、气密性和真空度达到要求，然后检验仪器的稳定性和线性是否符合要求，必要时调整离子源参数。
5.3.2系统检漏
在氩气分析模式下，检验峰40中心杯小于84mV说明不漏气。
5.3.3氧化能力检验
进行液相色谱-同位素质谱测定前，调整氧化剂和酸化剂流速，确保体系的氧化能力达到要求。切换两相Oxid/acid混合泵至检测器，在O2分析模式下操作，等量调整Oxid/acid泵流速，使O2的32峰达10,000-15,000mV，使其有足够的氧化性
5.3.4评价系统中有机碳的污染
切换至CO2分析模式，找开样品spilt开关，使CO2信号峰在1000-2000mV之间，该信号越低越好，当超过2000mV，说明系统中有机污染物超标，主要是流动相中水受有机碳污染。
5.3.5LC-IRMS稳定性测试
设定10个二氧化碳循环测定仪器稳定性，使其标准偏差小于0.3％。
5.3.6质控苹果汁标品δ13C值的测定
吸取浓度为40μg/mL的苹果酸标准溶液，用液相色谱-同位素质谱仪器进行测定，将10个平行测定结果值平均，得到质控标品苹果酸的δ13C值-11.48‰，SD0.26％用于分析结果质控。
5.3.6苹果汁样品中有机酸的测定
将液相色谱制备液混匀后装入进样瓶中，按照上述液相色谱-同位素质谱条件测定苹果汁样品中苹果酸δ13C值。每个样品运行时进行10个二氧化碳循环测定仪器稳定性，每隔10个测试样品至少测定一次质控标准溶液进行质量控制。
6不同产地天然苹果汁糖度的测定
不同产地苹果中含有不同量的植物糖，为了优化果汁样品稀释倍数，在进行液相色谱-同位素质谱测定前，将不同产地的70批苹果进行天然纯苹果汁的糖度测定，见下表：
7加工方式对于苹果汁同位素值的影响
商品化的苹果汁要经过一定的加热、加压、过滤等操作工艺，为了评比加工过程碳同位素分析结果的变化，本实验采用自制天然新鲜苹果汁，在温度、时间两个变量间加热制成浓缩果汁，按本方法进行植物糖、有机酸δ13C值分析测定，由结果可以看出，果汁中碳稳定同位素值在不同的加热温度、不同时间时分析测定值误差小于1％，证明加工方式对于果汁同位值没影响。
不同加工方式对于果汁植物糖δ13C值的影响
不同加工方式对于果汁有机酸δ13C值的影响
由结果可以看出未对植物糖、有机酸δ13C值产生影响。
8市售的苹果汁商品化植物糖、有机酸δ13C分布
购买市售的20个不同生产厂家果糖、葡萄糖、蔗糖、苹果酸，采用本发明方法进行测定，其测定值见下表。由分析结果可以看出商品化植物糖与有机酸的碳同位不比值变化范围大，在-26.45‰至-10.16‰之间，证明糖份与有机酸来源不同，一部分来C4植物糖。
市售植物糖试剂碳同位素分布
市售有机酸试剂碳同位素分布
9苹果汁存放时间对于δ13C/12C值影响
商品化的苹果汁均有一定上货期，为了评价果汁在不同储存期间同位素值的变化，本方法将新鲜苹果汁、橙汁于无菌灌装密封保存6个月，表列出新鲜果汁与储存6个月后蔗糖、葡萄糖、果糖的δ13C/12C值，由结果可以看出，测定值未发生变化。
果汁储存6个月后植物糖同位素值对比结果
10掺假果汁δ13C变化
取自制苹果汁最终上样液中添加0、20％、40％、60％、80％、100％(体积比)蔗糖溶液，按本方法描述进行蔗糖δ13Csuc值测定。取自制苹果汁最终样液中添加0、20％、40％、60％、80％、100％(体积比)葡萄糖溶液，按本发明方法进行葡萄糖δ13Cglu值测定。取自制苹果汁最终样液中添加0、20％、40％、60％、80％、100％(体积比)果糖溶液，进行果糖δ13Cfru值测定，发现天然苹果汁中添加合成C4植物糖份蔗糖、葡萄糖、果糖后δ13C与添加量有线性关系。
11植物糖色谱条件的优化
为了分离蔗糖、果糖与葡萄糖3种化合物，方法考察了多种功能基团填料柱的效果，如酰胺基、氨基、氢型离子交换、钙型离子交换柱等。氢型离子交换柱用于3种糖类化合物分离时，分离度差；酰胺基与氨基色谱柱需要流动相中加入一定比例有机相，才能分离3种糖类化合物，但有机相不能用于同位素质谱系统。
强离子交换钙型色谱柱常用于测定糖类化合物，该柱测定糖时基于离子交换与样品的配体交换反应的实现分离，填料基于低交联度的PS/DVB粒子，经过磺酸基(-SO3H)表面修饰，再键合钙离子(Ca+2)而形成，低交联度使得离子交换表面与流动相充分接触，具有较大的表面积和柱容量，钙离子交换柱具有可用于宽pH范围(1-14)、高温>100℃、纯水流动相中使用，是一种理想的用于液相色谱-同位素质谱分析色谱柱。糖分子上每一个羟基都带有一个非常弱的负电荷,而端基异构碳上所带的羟基可被去质子化,从而带上一个很强的负电荷.糖分子上的这些负电荷与树脂表面上的金属离子的正电荷之间的相互作用使糖被保留,从而达到分离。平衡时间较长和反冲都是为了保证新柱能在分析使用之前得到足够的钙离子的平衡,只有柱子上面金属离子稳定且显活性才能对样品有保留。由于填料均匀性与粒径大小决定该柱分离糖类时的效率和分离度，比较了菲罗门、安捷伦、沃特斯3个不同商品化钙离子分析3种糖类化合物时间效率，结果表明安捷伦Ca NP用于果糖、葡萄糖、蔗糖分离时，在纯水流动相中分离度与色谱峰形最佳。
11有机酸分析色谱柱的选择
本发明方法采用强离子交换钙型色谱柱分离有机酸时发现，有机酸分离度与色谱峰形差，在纯水流动相中有机酸苹果酸、柠檬酸、草酸难分离，改变流动相组成仍不能将几种有机酸分离，因此又考察了氢型弱阳离子交换柱分离几种有机酸，结果发现在纯水流动相中，有机酸峰形拖尾，在流动相中加入稀硫酸后，有机酸峰形对称，分离度高，但采用该柱时蔗糖与柠檬酸、果糖与苹果酸的色谱分离难，更换流动相，分离情况未改善。为了有效地分离植物糖与有机酸，方法先采用钙离子色谱柱制备，馏分收集苹果酸与柠檬酸，最终采用氢型离子交换柱可以有效分离有机酸。
12参数定义
各参数定义
| 名称 | 参数 | 定义 |
| 果糖Fructose | δ13Cfru | 果糖的碳同位素13C与12C的丰度比值 |
| 葡萄糖Glucose | δ13Cglu | 葡萄糖的碳同位素13C与12C的丰度比值 |
| 蔗糖Sucrose | δ13Csuc | 蔗糖的碳同位素13C与12C的丰度比值 |
| 植物糖差值1 | Δδ13Cfru-suc | 果糖-蔗糖δ13C差值 |
| 植物糖差值2 | Δδ13Cglu-suc | 葡萄糖-蔗糖δ13C差值 |
| 苹果酸Malic acid | δ13Cmal | 苹果酸的碳同位素13C与12C的丰度比值 |
| 最大差值 | Δδ13Cmax | 分析对象间δ13C的最大差值 |
记录每个样品的果糖、葡萄糖、蔗糖、苹果酸δ13C值(δ13Cfru、δ13Cglu、δ13Csuc、δ13Cmal)。计算样品的果糖和葡萄糖δ13C值与蔗糖δ13C值的差值Δδ13Cfru-suc、Δδ13Cglu-suc、δ1(Δδ13Cfru-suc/Δδ13Cglu-suc)。
13本发明方法准确度、精密度的验证
取果糖、葡萄糖、蔗糖混合标准溶液，用水稀释到合适浓度，每种标准溶液进行10次平行测定；取10mL自制果汁用水稀释至合适浓度后进行10次平行测定；取10mL自制果汁分别添加适量果糖、葡萄糖、蔗糖加标回收试验，样液用水稀释过滤后按本方法步骤进行10次平行测定，得出方法重复性(日内)，测定值及标准偏差(SD)见表。
取苹果酸标准溶液，用水稀释到合适浓度，每种标准溶液进行10次平行测定；取10mL自制果汁用水稀释至合适浓度后进行10次平行测定；取10mL自制果汁分别添加适量苹果酸加标回收试验，样液用水稀释过滤后按本方法步骤进行10次平行测定，得出方法重复性(日内)，测定值及标准偏差(SD)见表。
同一实验人员在10天的实验周期内，重复标准溶液、果汁、果汁添加分析，完成10次分析测定，得出日间分析结果与SD见表。不同实验人员在10天的实验周期内，重复标准溶液、果汁、果汁添加分析，完成10次分析测定，人员比对分析结果与SD见表。
苹果汁中植物糖和有机酸δ13C测定准确度与精密度
14本发明方法线性范围与测定低限
以峰44响应为基数，其峰强度大于400为测定低限，测得蔗糖2μg/mL、果糖与葡萄糖为10μg/mL、苹果酸与柠檬酸为5μg/mL。
取1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL蔗糖标准溶液，5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL果糖和葡萄糖标准溶液，2.0μg/mL、5.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL、100.0μg/mL苹果酸标准溶液进行分析测定，测得其峰44响应与浓度成线性关系，相关系数大于0.999。
15实例验证，按本发明方法，在试验中对三门陕灵宝寺河山苹果进行了实际测定：
灵宝市东南深山区的寺河乡以盛产寺河山苹果而驰名于世，实验人员在2012年1月-2013年9月间在不同的采摘期、贮存期收集了55个寺河山苹果(红富士、新红星)进行植物糖和有机酸分析测定，两植物糖差值间比值δ1稳定1.46-2.08之间，苹果酸δ13C在-31.83‰至-26.64‰之间，同时植物糖δ13C比值与苹果酸δ13C之间具有较好相关系，相关系数达0.9135，因此可以依据以上数据鉴定三门峡苹果产地。
河南灵宝寺河山苹果植物糖δ13C值分布
16对不同产地苹果样品测定，建立苹果中植物糖与苹果酸的线性关系
按本发明方法主要测定国内外所产苹果δ13值分布，为了获得准确的产地信息，申请人在试验中共收集234个苹果样品，以富士品种为主，包括三门峡苹果55个，编号1-55；山东烟台红富士31个样品，编号56-86；山东烟台花花牛12个样品，编号87-98；山东沂源红富士16个样品，编号99-114；甘肃静宁14个，编号115-128；新疆阿克苏15个，编号129-143；新疆阿克苏西域香妃6个，编号144-149；陕西延安11个，编号150-160；陕西白水5个，编号161-165；陕西洛川7个，编号166-172；陕西彬县5个，编号173-177；山西运城10个，编号178-187；河北安平12个，编号188-199；辽宁省瓦房店9个，编号200-208；美国蛇果3个，编号209-211；美国青苹果4个，编号212-215；美国富士5个，编号216-220；日本富士14个，编号221-234。样品到达实验室后，直接榨汁后制得上清样液，于-18℃冷冻保存，测定前融化。测定结果显示苹果中各种天然物质碳同位素分布如下：蔗糖δ13Csuc-19.09‰至-26.47‰之间，葡萄糖δ13Cglu-24.52‰至-30.50‰之间，果糖δ13Cfru-在25.22‰至31.96‰之间，植物糖间比值δ1在0.27至2.78之间，苹果酸δ13Cmal在-25.31‰至32.57‰之间。统计数据表明不同产地的苹果植物糖间比值与苹果酸具有较好的线性相关性，根据线性关系鉴定苹果汁真伪，234个苹果样品中除三门峡苹果55个样品外，其余的测试结果如下表。
苹果中天然产物碳同位素分布
17样品结果分析
从结果可以看出，同一产地的苹果、桔子、橙子不同组分的δ13C仅存在微小差异，下表列出天然苹果、柑桔、橙子中各种分析对象结果范围，果汁真假鉴定必须同时满足两种结果：一、蔗糖、葡萄糖、果糖、苹果酸δ13C在范围之间；二、比较葡萄糖和果糖、蔗糖的δ13C的比值来判断是否掺假，比值在0-2.78之间时可鉴定为100％果汁；三、最大差值在-10.48‰至-1.7‰之间；四、植物糖比值与有机酸间存大较好线性相关性，相关系数大于0.7。
表天然苹果汁各种分析对象结果范围
18实际果汁样品测定
申请人分别在全国各大中小超市、生产厂家购买100％苹果果汁含量的商品50种，同一品牌不同生产批号产品，按本发明方法时进行分析测定，植物糖与苹果酸δ13C值见下表：
将上述测得的结果与本发明方法中给出的结果相对比，便可一目了解的鉴别出在50批果汁商品中谁真谁假的问题，结果显示，17种果汁产品合格，35种果汁产品不合格。
19结论
由上述资料可以看出，本发明方法采用液相色谱-同位素质谱建立了天然苹果汁植物糖与苹果酸同时分析的方法，对于苹果样品中蔗糖、葡萄糖、果糖等3种植物糖稀释后直接液色谱分离，苹果样品中苹果酸需经液相色谱制备后再进行分离，经方法法验证本方法灵敏度高、重现性好。收集了不同产地的苹果进行测定，建立植物糖、苹果酸、植物糖比值等碳同位素分布范围用于苹果汁真伪鉴定，快速、准确，解决了鉴别苹果汁的真假问题，保证了消费者的合法权益和产品质量，具有很强的实用性，是苹果汁真假鉴别上的一大创造，经济和社会效益巨大。
Claims (3)
1.一种采用液相色谱-同位素质谱测定鉴别真假苹果汁的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、果汁制备
制备天然苹果汁：将不同产地的234种苹果各取1-1.5kg，分别置于榨汁机内榨汁、离心，收集上清液，制成234种样品液，-18℃冷冻保存，防止氧化、变质；
（2）、对制备的苹果汁中植物糖进行分析，确立植物糖测定条件，所述的植物糖包括果糖、葡萄糖和蔗糖，方法是：
A、对苹果汁预处理，将制备的234种天然苹果汁样品液分别取0.3g加入水定容50 mL，再取200μL加水稀释至1mL，过滤后用液相色谱-同位素质谱仪测定，每个样品进行10个二氧化碳循环测定仪器稳定性，每隔10个测试样品至少测定1次混合标准工作溶液进行质量控制；
B、确立LC-IRMS分析条件：其条件是，色谱柱：Zobax Ca NP5 300 mm ×7.8 mm（i.d.），粒度9μm；柱温：75 ℃；流动相：超纯水；流速：0.35 mL/min；氧化反应炉温度：99.9 ℃；过二硫酸钠氧化剂流速：0.05 mL/min；磷酸酸化剂流速：0.05 mL/min的条件下进行测定；
C、LC-IRMS测定前的4个要求：首先保证不漏气，对LC-IRMS系统进行检漏，氩气峰40中心杯小于84mV；然后要使其有足够的氧化性，对氧化能力检验，使氧32峰达10000mV；再者要防止有机碳对LC-IRMS的污染，使CO2信号峰在1000-2000 mV之间，该信号值越低越好；最后要保证LC-IRMS仪器的稳定性，测定10个CO2循环，使其测定值标准偏差小于0.3%；
D、LC-IRMS所用CO2参气体δ13C值的标定：方法是，将国际原子能机构提供的蔗糖质控（IAEA-CH-6）给定的δ13C值-10.49‰输入计算机，标定CO2气体值，10个平行测定结果值平均，作为CO2参考气的δ13C值；每次开关机前应将IAEA-CH-6标准溶液测定一次进行质量控制，确保测得的δ13C值与证书标明数值相差±0.30 ‰内；
E、对质控标品δ13C值的测定：首先制备标准储备溶液，方法是，分别称取100 mg果糖、葡萄糖、蔗糖标准品，用水定容至100 mL，该标准储备溶液质量浓度为1 mg/ mL；然后配制混合标准工作溶液，方法是，吸取0.5 mL果糖、葡萄糖标准储备溶液，0.2 mL蔗糖标准储备溶液用水稀释并定容至10 mL，配制成果糖、葡萄糖质量浓度为50μg/ mL、蔗糖浓质量度为20μg/ mL的混合标准工作溶液；最后是质控标品δ13C值的测定，将混合标准溶液按B步骤中规定的仪器条件下进行测定，将10个平行测定结果值平均，得到质控标品果糖、葡萄糖、蔗糖的δ13C值，用于分析结果的质量控制；
（3）、对苹果汁中苹果酸进行分析，确立苹果酸测定条件，方法是：
A、对苹果汁进行预处理：将步骤1制备的234种天然苹果汁各取20g分别加水稀释至100mL，过滤，每种取1mL过滤液进行高效液相色谱制备苹果酸，制备样液进行LC-IRMS分析，每个样品运行时进行10个二氧化碳循环测定仪器稳定性，每隔10个测试样品至少测定一次质控标准工作溶液进行质量控制；
B、确立HPLC制备苹果汁中苹果酸条件：其条件是，色谱柱： Zobax Ca NP5 300 mm×7.8 mm（i.d.），粒度9μm；柱温：75℃；进样量：100 μL；流动相：水；流速：0.35 mL/min；馏分收集时间：10.0min-14.0min；
C、确立LC-IRMS分析条件：其条件是，色谱柱：ICSep Coregel-87H3氢型柱，300mm ×7.8 mm（i.d.），粒度5.0 μm；柱温：80℃；流动相：8mmol/L硫酸溶液；流速：0.35mL/min；氧化反应炉温度：99.9℃；过二硫酸钠氧化剂流速：0.045mL/min；磷酸酸化剂流速：0.045mL/min；
D、LC-IRMS测定前的4个要求：同步骤（2）中的C；
E、LC-IRMS所用CO2参气体δ13C值的标定：同步骤（2）中的D；
F、对质控标品δ13C值的测定：首先制备标准储备溶液，方法是，称取100 mg苹果酸标准品，用水定容至100 mL，成质量浓度为1 mg/ mL的苹果酸标准储备溶液；然后配制苹果酸标准溶液，配制方法是，吸取0.4 mL苹果酸标准储备溶液，用水稀释并定容至10 mL，配制成质量浓度为40μg/ mL的苹果酸标准溶液；最后是质控标品δ13C值的测定，吸取质量浓度40μg/ mL苹果酸标准溶液按步骤（3）中的C步骤规定的仪器条件下用液相色谱-同位素质谱仪进行测定，将10个平行测定结果值平均，得到质控标品苹果酸的δ13C值-11.48%、SD0.26%，用于分析结果的质量控制；
（4）、根据对天然苹果汁的分析结果，建立作出苹果汁真假判定：方法是，满足以下四个条件：一、蔗糖、葡萄糖、果糖、苹果酸δ13C测定值在范围之间，蔗糖δ13Csuc-19.09‰至-26.47‰之间，葡萄糖δ13Cglu-24.52‰至-30.50‰之间，果糖δ13Cfru-在25.22‰至31.96‰之间，植物糖间比值δ1在0.27至2.78之间，苹果酸δ13Cmal在-25.31‰至32.57‰之间；二、葡萄糖-蔗糖、果糖-蔗糖δ13C差值间的比值在0.27-2.78之间；三、苹果汁中蔗糖、葡萄糖、果糖、苹果酸δ13C最大差值在-10.48‰至-1.7‰之间；四、苹果汁的葡萄糖-蔗糖、果糖-蔗糖δ13C差值间的比值与苹果酸δ13C值具有线性相关性，符合线性方程Y=-2.8186X-24.262，相关系数大于0.7255，满足以上四个条件为真，否则为假，从而实现对苹果汁真假的测定、鉴别。
2.根据权利要求1所述的采用液相色谱-同位素质谱测定鉴别真假苹果汁的方法，其特征在于，所述的国际原子能机构提供的蔗糖质控标准溶液IAEA-CH-6，每次使用前应将IAEA-CH-6标准溶液测定一次，确保测得的δ13C值与标准溶液证书标明的数值相差±0.30 ‰内。
3.根据权利要求1所述的采用液相色谱-同位素质谱测定鉴别真假苹果汁的方法，其特征在于，所述的液相色谱-同位素质谱仪为DELTA V Plus液相色谱-同位素质谱仪，配备Surveyor液相色谱与Isolink接口；1200高效液相色谱仪、5810型离心机；飞利浦榨汁机HR1861/30、0.22 μm水相一次性微孔滤膜；Sucrose标示值：δ13C-10.449‰VPDB。
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Granted publication date: 20150916 Termination date: 20160918 |