JP2002525068A

JP2002525068A - ２−ケト−ｌ−グロン酸の産生のための細菌株

Info

Publication number: JP2002525068A
Application number: JP2000570354A
Authority: JP
Inventors: スティーブンエフ．ストッダード，; ハンミンジェイ．リャウ，; ジョンデリア，
Original assignee: ARCHER DANIELS MIDLANDCOMPANY
Current assignee: ARCHER DANIELS MIDLANDCOMPANY
Priority date: 1998-09-11
Filing date: 1999-09-10
Publication date: 2002-08-13
Also published as: BR9913563A; US6506583B1; EP1112344A2; ZA200102590B; WO2000015827A2; CA2342299A1; AU5818199A; US6316231B1; WO2000015827A3; US6562584B1; CN1317042A; KR20010075047A; AU762825B2; US6511820B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、２−ケト−Ｌ−グロン酸の産生に有用な新規細菌株に関する。本発明はさらに、Ｌ−ソルボースの発酵変換による２−ケト−Ｌ−グロン酸の産生のための、これらの株の使用に関する。本発明はさらに、ピロロキノリンキノンおよび非毒性リポポリサッカリドの産生のための、これらの新規細菌株の使用に関する。ベクターによって形質転換された本発明の株もまた、記載する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）（発明の分野）本発明は、２−ケト−Ｌ−グロン酸の産生に有用な新規細菌株に関する。本発
明はさらに、Ｌ−ソルボースの発酵変換による２−ケト−Ｌ−グロン酸の産生の
ための、これらの株の使用に関する。本発明はさらに、ピロロキノリンキノンお
よび非毒性リポポリサッカリドの産生のための、これらの新規細菌株の使用に関
する。ベクターによって形質転換された本発明の株もまた、記載する。

【０００２】（背景情報）２−ケト−Ｌ−グロン酸（「２−ＫＬＧ」）は、Ｌ−アスコルビン酸（ビタミ
ンＣ）（必須栄養素）の調製における、重要な中間体である。２−ＫＬＧは、Ｒ
ｅｉｃｈｓｔｅｉｎ法を用いて、工業的な規模で過去に合成されている（Ｈｅｌ
ｖｅｔｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ１７：３１１（１９３４））。しか
し、この方法は、大量の溶媒の使用および多数の複合反応工程の関与を含む、商
業的適用についての多くの不利な点を有する。

【０００３】従って、Ｒｅｉｃｈｓｔｅｉｎ法に対する代替法として、１つ以上の微生物を
使用する多数のプロセスが、発酵により２−ＫＬＧを産生するために開発されて
いる。米国特許第２，４２１，６１１号は、例えば、Ｄ−グルコースから５−ケ
ト−Ｄ−グルコン酸への微生物酸化、それに続くＬ−イドン酸（Ｌ−ｉｄｏｎｉ
ｃａｃｉｄ）への化学的還元または微生物還元、そして引き続く２−ＫＬＧへ
の微生物酸化を含む方法を開示する。日本国特許公報第３９−１４４９３号、同
第５３−２５０３３号、同第５６−１５８７７号、および同第５９−３５２９０
号は、例えば、Ｄ−グルコースの２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸への微生物酸
化、それに続く２−ＫＬＧへの微生物還元または化学的還元を含む類似のプロセ
スを開示する。

【０００４】しかし、これらの方法はまた、２−ＫＬＧの商業的産生におけるそれらの有用
性を減少する多くの不利な点を被っている。例えば、これらの方法における化学
的還元工程（すなわち、５−ケト−Ｄ−グルコン酸からＬ−イドン酸および２，
５−ジケト−Ｄ−グルコン酸から２−ＫＬＧへの還元）は、順に２−ＫＬＧの収
量を減少する還元の立体化学を制御する問題を付随する（従って、副産物として
、それぞれ、Ｄ−グルコン酸および２−ケト−Ｄ−グルコン酸を産生する）。あ
るいは、この還元が１つ以上の微生物によって行われる場合、過剰の糖が、この
還元のためのエネルギー源を提供するのに必要であり、これもまた、２−ＫＬＧ
の収量を減少する。

【０００５】これらの問題を考慮して、代替の経路が２−ＫＬＧの発酵産生について使用さ
れており、これはソルボゾン（ｓｏｒｂｏｓｏｎｅ）中間体を介する、Ｌ−ソル
ボースの２−ＫＬＧへの酸化のみを含む。この経路を使用する多数のプロセスが
開発されており、これらは、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙｄａｎｓ（米
国特許第４，９３５，３５９号；同第４，９６０，６９５号；同第５，３１２，
７４１号；および同第５，５４１，１０８号）のようなＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔ
ｅｒ属、Ｐｓｅｕｄｏｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｓａｃｃｈａｒｏｋｅｔｏ
ｇｅｎｅｓ（米国特許第４，８７７，７３５号；欧州特許第２２１７０７号）の
ようなＰｓｅｕｄｏｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｏｒｂｏｓｏｘｉｄａｎｓ（米国特許第４，９３３，２８９号および同第４，
８９２，８２３号）のようなＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来の広範な微生物、そ
してこれらの属ならびに他の属（例えば、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、およびＳｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ（米国特許第３，９１２，５９２号；同第３，９０７，６３９号；
および同第３，２３４，１０５号）由来の微生物の混合物を使用する。

【０００６】しかし、これらのプロセスは、２−ＫＬＧの商業的産生についてのそれらの有
用性を限定する特定の不利な点を被っている。例えば、Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓを使
用する上記に参照したプロセスはまた、商業的使用のために十分に高レベルの２
−ＫＬＧを産生するために、さらなる「ヘルパー（ｈｅｌｐｅｒ）」微生物株（
例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、または商業的に魅力的で
ない量の酵母もしくは酵母に由来する増殖成分の存在を必要とする。同様に、Ｐ
ｓｅｕｄｏｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒを使用するプロセスは、商業的に適切な
２−ＫＬＧ濃度およびソルボース基質の効率的な使用を達成するために、高価な
かつ珍しい希土塩類を補充した培地、またはヘルパー株（例えば、Ｂ．ｍｅｇａ
ｔｅｒｉｕｍ）の存在、および／または酵母の存在を必要とし得る。Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓｓｏｒｂｏｓｏｘｉｄａｎｓを使用する他のプロセスもまた、そ
の培地中に商業的に魅力的でない量の酵母または酵母抽出物を含む。

【０００７】ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）（２，７，９−トリカルボキシー１Ｈ−ピロ
ロ［２，３−ｆ］−キノ−リン−４，５−ジオン）は、メチロトローフ（メタノ
ール資化）細菌の培養物から最初に単離され、後に多くの動物組織中に存在する
ことが見出された。ＰＱＱの構造は、以下である：

【０００８】

【化１】ＰＱＱは、正常な成長および発達に必須であると考えられるので、新規なビタ
ミンであり得る。補助剤として動物に摂食させた場合、ＰＱＱは、通常生じる酸
化的変化を防止する。さらに、ＰＱＱは、マウス大グリア細胞（ａｓｔｒｏｇｉ
ａｌｃｅｌｌ）において神経成長因子合成を増加させ、そして脳における治療
的役割の可能性を有する（Ｂｉｓｈｏｐら、「Ｐｙｒｒｏｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎ
ｅＱｕｉｎｏｎｅ：ＡＮｏｖｅｌＶｉｔａｍｉｎ」Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ
Ｒｅｖｉｅｗｓ５６：２８７−２９３（１９９８）。

【０００９】有機化学合成は、ＰＱＱを生成するための従来の手段である。しかし、有機化
学合成は、多くの不利な点を有する。例えば、化学合成は、複数の、かつ時折複
雑な反応工程を必要とし、そして低収率で生成するので、不経済かつ時間浪費性
である。

【００１０】従って、ＰＱＱの生成のための化学合成技術の不利な点を克服する必要性が、
ＰＱＱの生成な有用な細菌株によって部分的満たされてきた（米国特許第４，９
９４，３８２号および同第５，３４４，７６８号）。しかし、より効率的かつ経
済的なＰＱＱ産生微生物株の必要性が、依然存在する。

【００１１】リポポリサッカリド（ＬＰＳ）は、多くのグラム陰性細菌の細胞壁成分である
両親媒性分子である。これは、ヒトおよび動物におけるグラム陰性感染に関連す
る多くの病態生理と関係している。Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉ
ｄｅｓ由来のＬＰＳは、非毒性であり、そして免疫調節剤および抗腫瘍剤として
いくつかの用途を有する。しかし、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉ
ｄｅｓを介する非毒性ＬＰＳの産生に関連するいくつかの不利な点（例えば、光
合成を必要とする培養の不便さ）が存在する。

【００１２】（発明の要旨）本発明は、２−ケト−Ｌ−グロン酸を効率的に産生する微生物株を提供する。

【００１３】本発明の別の実施態様は、ヘルパー株との協調下での２−ケト−Ｌ−グロン酸
の産生のための株に関する。

【００１４】本発明のさらなる実施態様は、ＰＱＱを産生するための方法を提供する。

【００１５】本発明の別の実施態様は、非毒性ＬＰＳを産生するための方法を提供すること
である。

【００１６】本発明のさらなる実施態様は、ベクターで形質転換された本発明の細菌株を提
供すること、およびその細菌株をベクターで形質転換する方法である。

【００１７】これら、および他の実施態様は、本発明の方法によって達成され、これらの方
法は、第１の実施態様において、微生物株ＡＤＭ２９１−１９（ＮＲＲＬＢ−
３００３５）、ＡＤＭ６２Ａ−１２Ａ（ＮＲＲＬＢ−３００３７Ｎ）、ＡＤＭ
２６６−１３Ｂ（ＮＲＲＬＢ−３００３６）、またはそれらの変異体のいずれ
かの培養物に関する。

【００１８】本発明の他の特徴および利点は、以下の好ましい実施態様の詳細な説明に示さ
れ、そしてこの説明から一部が明らかであるか、または本発明の実施によって理
解され得る。本発明のこれらの利点は、詳細な説明および本明細書の特許請求の
範囲で特に指摘される方法によって、実現かつ達成される。

【００１９】前述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は、単に例示的および説明
的なものであり、そして特許請求される本発明のさらなる説明を提供することが
意図されることが、理解されるべきである。

【００２０】（発明の詳細な説明）第１の実施態様において、本発明は、ＡＤＭ２９１−１９（ＮＲＲＬＢ−３
００３５）、ＡＤＭ６２Ａ−１２Ａ（ＮＲＲＬＢ−３００３７Ｎ）、ＡＤＭ
２６６−１３Ｂ（ＮＲＲＬＢ−３００３６）、またはそれらの変異体からな
る群より選択される株の同定特徴を有する微生物株の生物学的に純粋な培養物に
関する。本発明の実施態様の微生物株は、純粋培養（すなわち、１つ以上のさら
なる微生物株の非存在下）での発酵によって、Ｌ−ソルボースから２−ＫＬＧを
産生し得る。

【００２１】さらなる実施態様において、本発明の微生物株およびＡＤＭＸ６Ｌ株（ＮＲ
ＲＬＢ−２１６２７、米国特許第５，８３４，２３１号）は、適切な炭素源か
らＰＱＱを産生し得る。

【００２２】ＡＤＭ２９１−１９およびＡＤＭ２６６−１３Ｂ株は、Ａｇｒｉｃｕｌｔ
ｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈＳｅｒｖｉｃｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）（１８１５ＮｏｒｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｔｒ
ｅｅｔ，Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ６１６０４，ＵＳＡ）に、１
９９８年６月１８日に、ブタペスト条約の下に寄託され、そしてそれぞれ受託番
号ＮＲＲＬＢ−３００３５およびＮＲＲＬＢ−３００３６を割り当てられた
。ＡＤＭ６２Ａ−１２Ａ株は、１９９８年８月２５日にＮＲＲＬに寄託され、
そして受託番号ＮＲＲＬＢ３００３７Ｎを割り当てられた。ＮＲＲＬＢ−３
００３５、ＮＲＲＬＢ−３００３６およびＮＲＲＬＢ−３００３７Ｎ株の特
徴は以下を含むがそれらに限定されない：（１）細胞形態−グラム陰性；より古い培養においてグラム可変であり得る；小
さな桿菌（ｔｉｎｙｒｏｄ）または球桿菌；細胞は１つずつまたは対を示す；
汎形態性であり得る；短鎖または長い不規則な細胞を形成し得る；芽胞を形成し
ない；（２）コロニー形態−点状、凸状、全縁、平滑、バター様、および透明；同じ培
地上のより古いコロニーにおいて、ベージュまたは茶色の呈色；（３）色素−コロニーは、特に炭酸カルシウムを含み、炭素源としてフルクトー
スを含む富栄養培地上で、褐色の拡散可能な色素を産生する；（４）生理学的特徴：（ａ）カタラーゼ：ポジティブ；（ｂ）オキシダーゼ；ポジティブ（ｃ）ゼラチナーゼ；ネガティブ；（５）培養特徴：（ａ）ブレインハートインフュージョン寒天：増殖；（ｂ）ＮａＣｌを含まないＤＭ液体基本培地（表５）上、または寒天凝固ＤＭ
基本培地において増殖する；（ｃ）４．５〜５．０の範囲のｐＨのグルコースもしくはマンニトールブロス
静置培養において、２４時間以内に菌膜または環を形成しない；（ｄ）ＮａＣｌを含まないＤＭ液体基本培地（表５）において増殖、または寒
天凝固ＤＭ基本培地においては、４℃で増殖するが３７℃では増殖しない。至適
増殖温度は、ＮａＣｌを含まないＤＭ液体基本培地（表５）において、または寒
天凝固ＤＭ基本培地においては２５℃〜３０℃である；（ｅ）至適増殖ｐＨは、ＮａＣｌを含まないＤＭ液体基本培地（表５）上、ま
たは寒天凝固ＤＭ基本培地においてはｐＨ７．０とｐＨ８．０との間である；（６）抗生物質耐性−アミカシン、オーグメンチン（アモキシシリン＋クラブラ
ン酸（ｃｌａｖｕｌｏｎｉｃａｃｉｄ））、アンピシリン、セファゾリン、セ
フォキシチン、セフタジジム、セフチオフール、セファロチン、エンロフロキサ
シン、フロルフェニコール、ゲンタマイシン、イミペネム、カナマイシン、サラ
フロキサシン（ｓａｒａｆｌｏｘｉｃｉｎ）、テトラサイクリン、チカルシリン
、およびチルミコシンに対して感受性であるが、トリブリッセン（ｔｒｉｂｒｉ
ｓｓｅｎ）（オーグメンチン＋サルファメトゾール（ｓｕｌｆａｍｅｔｈｏｚｏ
ｌｅ））には耐性である（市販の「Ｐａｓｃｏシステム）を使用して、抗生物質
の生理学的に達成可能な濃度に基づいて、最小阻止濃度（ＭＩＣ）によって規定
した）；ならびに（７）ＲｉｂｏＰｒｉｎｔ（登録商標）分析：ＲｉｂｏＰｒｉｎｔ（登録商標）は、細菌の遺伝子フィンガープリントを生成し
そしてそれを分析する、自動化リボタイピングシステムである。遺伝子フィンガ
ープリントパターンは、各サンプルについての遺伝子データの正規化されたデジ
タル表示である。この方法によって得られるパターンは、異なる種の生物間のみ
でなく、同じ種の異なる株間の分化にも有用である。ＮＲＲＬＢ−３００３５
７（ＡＤＭ２９１−１９）、ＮＲＲＬＢ−３００３７Ｎ（ＡＤＭ６２Ａ−１
２Ａ）、およびＮＲＲＬＢ−３００３６（ＡＤＭ２６６−１３Ｂ）株、および
Ｌ−ソルボースから２−ＫＬＧを産生し得ることが公知の多数の比較株について
得られるＲｉｂｏＰｒｉｎｔ（登録商標）パターンは、図１に示される。

【００２３】細菌株の一意性は、これらのＲｉｂｏＰｒｉｎｔ（登録商標）パターンが異な
る場合に、それらのパターンから実証され得る。２つの株が区別可能ではないＲ
ｉｂｏＰｒｉｎｔ（登録商標）パターンを与える場合において、ＲｉｂｏＰｒｉ
ｎｔ（登録商標）データは結論に到達せず、株の一意性を示すために他の方法が
必要である。このような方法の１つは、ＤＮＡ解離であり、この方法では、細菌
染色体全体にわたる株の関連性の程度が評価される。これは、２つの株からの染
色体ＤＮＡの、定量的な相反交叉ハイブリダイゼーションによって行われ得る。
ＮＲＲＬＢ−３００３５（ＡＤＭ２９１−１９）およびＮＲＲＬＢ−３０
０３６（ＡＤＭ２６６−１３Ｂ）株の場合において、このような研究からの結
果は、７０％未満の染色体類似性（近代の細菌分類学においてしばしば別々の種
に属する株と関連する結果（Ｗａｙｎｅ，Ｌ．Ｇ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔｅ
ｍ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３７：４６３−４６４（１９８７）））を示した。従
って、ＤＮＡ解離データは、ＮＲＲＬＢ−３００３５（ＡＤＭ２９１−１９
）およびＮＲＲＬＢ−３００３６（ＡＤＭ２６６−１３Ｂ）株が独特であり
そして互いに異なることを明解に示す。

【００２４】発酵によってＬ−ソルボースから２−ＫＬＧを産生する細菌株ＡＤＭＸ６Ｌ
（ＮＲＲＬＢ−２１６２７）およびその変異体は、米国特許第５，８３４，２
３１号（１９９８年１１月１０日発行）および米国特許出願第０８／８９３，５
９８号（１９９７年７月１１日出願）にそれぞれ開示される。この出願に開示さ
れる株およびその変異体は、図１に示されるそれらのＲｉｂｏＰｒｉｎｔ（登録
商標）パターンの比較から見られ得るように、本発明におけるものとは異なる。

【００２５】生物学的に純粋な株であるＮＲＲＬＢ−３００３５（ＡＤＭ２９１−１９
）、ＮＲＲＬＢ−３００３７Ｎ（ＡＤＭ６２Ａ−１２Ａ）およびＮＲＲＬ
Ｂ−３００３６（ＡＤＭ２６６−１３Ｂ）に加えて、それらの変異もまた、こ
れらの変異体もまたＬ−ソルボースから２−ＫＬＧを産生し得る場合、２−ＫＬ
Ｇの産生に使用され得る。

【００２６】本発明の微生物株およびその変異体、ならびにＮＲＲＬＢ−２１６７（ＡＤ
ＭＸ６Ｌ）株およびその変異体もまた、これらの変異体がやはりＰＱＱを産生
し得る場合に、ＰＱＱの産生に使用され得る。

【００２７】本明細書中で使用される場合、「生物学的に純粋な」株とは、通常、自然に関
連する材料から分離される株を意味することが意図される。他の株と関連する株
、または通常には天然に見出されない化合物または材料と関連する株もなお、「
生物学的に純粋」として定義される。特定の株の単一培養物も、当然のことなが
ら、「生物学的に純粋」である。

【００２８】本明細書中で使用される場合、本発明の所定の株の変異体は、本発明の株、す
なわちＮＲＲＬＢ−３００３５（ＡＤＭ２９１−１９）、ＮＲＲＬＢ−３
００３７Ｎ（ＡＤＭ６２Ａ−１２Ａ）またはＮＲＲＬＢ−３００３６（ＡＤ
Ｍ２６６−１３Ｂ）もしくは微生物株ＮＲＲＬＢ−２１６２７（ＡＤＭＸ６
Ｌ）のうちの１つに由来する。

【００２９】本発明の微生物株の変異体を調製するための適切な方法の例示的な例は、以下
を含むがこれらに限定されない：紫外線光またはＸ線の照射による変異誘発、ま
たは化学変異原（例えば、ニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン）、メチルメタンスルホネート、ナイトロジェンマスター
ドなど）での処理による変異誘発；挿入エレメントもしくはトランスポゾンによ
って媒介される技術、または線状もしくは環状ＤＮＡ分子を形質転換する相同組
換えによる技術のような遺伝子組み込み技術；ならびにバクテリオファージによ
って媒介される形質導入。これらの方法は当該分野で周知であり、そして例えば
、Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＮｅｗＹｏｒ
ｋ（１９７２）；Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，ＡＳｈｏｒｔＣｏｕｒｓｅｉｎ
ＢａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９２）；Ｍ．ＳｉｎｇｅｒおよびＰ．Ｂｅｒｇ，
Ｇｅｎｅｓ＆Ｇｅｎｏｍｅｓ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｉｅｎｃｅＢｏ
ｏｋｓ，ＭｉｌｌＶａｌｌｅｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９１）；Ｊ．Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第
２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅ
ｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＮｅｗＹｏｒｋ（１９８９）
；Ｐ．Ｂ．Ｋａｕｆｍａｎら、ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ
ａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＭｅｔｈｏｄｓｉｎＢｉｏｌｏｇｙａｎｄ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄ
ａ（１９９５）；ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢ
ｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｒ．Ｇｌｉｃｋおよ
びＪ．Ｅ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ編、ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ
，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９９３）；ならびにＰ．Ｆ．Ｓｍｉｔｈ−Ｋｅａｒｙ，Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｉ，ＴｈｅＧｕｌｉｆｏｒｄＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ（１９
８９）に記載される。

【００３０】２−ＫＬＧを産生する変異体は、その変異体が２−ＫＬＧを産生する限りは、
親株または祖先株の同じ生物学的同定特徴を有していても有してなくてもよい。

【００３１】ＰＱＱを産生する変異体は、同様に、その変異体がＰＱＱを産生する限りは、
親株または祖先株の同じ生物学的同定特徴を有していても有してなくてもよい。

【００３２】本発明の生物ＮＲＲＬＢ−３００３５（ＡＤＭ２９１−１９）、ＮＲＲＬ
Ｂ−３００３７Ｎ（ＡＤＭ６２−１２Ａ）、もしくはＮＲＲＬＢ−３００３
６（ＡＤＭ２６６−１３Ｂ）に由来する変異株、または公知の方法を使用する
ＮＲＲＬＢ−２１６７（ＡＤＭＸ６Ｌ）由来の変異株は、次いで、好ましく
は、改良された２−ＫＬＧおよび／またはＰＱＱ産生能力について、あるいはＬ
−ソルボースから２−ＫＬＧを産生することにおけるそれらの有用性および／ま
たはＰＱＱを産生することにおけるそれらの有用性に関連する他の所望の特徴に
ついて、選択されるかまたはスクリーニングされる。

【００３３】本発明に従って、本発明の微生物株またはその変異体は、十分な時間Ｌ−ソル
ボースと接触され、次いで、蓄積した２−ＫＬＧが単離される。好ましくは、こ
の微生物株は、Ｌ−ソルボースを含有する天然または合成培地中で、２−ＫＬＧ
を産生するための時間にわたり培養され、そして蓄積した２−ＫＬＧが続いて単
離される。あるいは、この微生物株の細胞に由来する調製物は、十分な時間Ｌ−
ソルボールと接触され得、次いで蓄積された２−ＫＬＧが単離され得る。

【００３４】本発明に一致して、本発明の微生物株またはその変異体は、炭素源および窒素
源を含む培養培地中で培養される。炭素源は、様々な糖アルコール、ポリオール
、アルドール糖、またはケト糖であり得、これらには、アラビノース、セロビオ
ース、フルクトース、グルコース、グリセロール、イノシトール、ラクトース、
マルトース、マンニトール、マンノース、ラムノース、ラフィノース、ソルビト
ール、ソルボース、スクロース、トレハロース、ピルベート、スクシネート、も
しくはメチルアミン、または当業者によって決定され得る他の基質が挙げられる
がこれらに限定されない。培地は、好ましくは、ポリオールまたはアルドール糖
、さらにより好ましくは、マンニトール、イノシトール、ソルボース、グリセロ
ール、ソルビトール、ラクトースおよびアラビノースを、０．１％〜２０％（重
量で）の濃度で炭素源として含有する。全ての炭素減は、培養の開始前に培地に
添加され得るか、または工程毎もしくは培養の間に連続的に添加され得る。

【００３５】本明細書中で使用される場合、「細胞に由来する調製物」は、本発明の株また
はその変異体、アセトン乾燥細胞、支持体（例えば、ポリアクリルアミドゲル、
κカラゲナン、アルギン酸カルシウムなど）上またはその内部の固定化細胞、お
よび類似の調製物の培養ブロスからの細胞の任意および全ての抽出物を意味する
ことが意図される。

【００３６】このような手順の例示的な例は、適切な水性緩衝液（例えば、２−（Ｎ−メチ
ルモルホリノ）エタンスルホン酸（ｐＨ６．５；０．５Ｍ））中のＬ−ソルボー
スおよびＣａＣＯ₃を、振盪フラスコ中の微生物株の水性抽出物に添加すること
を含む。この反応は、好ましくは、６．０〜８．０の範囲のｐＨで、２０℃〜４
０℃の範囲の温度にて、約１〜１００時間進行する。Ｌ−ソルボースの濃度は、
約０．１〜１０％ｗ／ｖ、より好ましくは約０．３〜６％（ｗ／ｖ）であるべき
であり、そしてＮＲＲＬＢ−３００３５（ＡＤＭ２９１−１９）、ＮＲＲＬ
Ｂ−３００３７Ｎ（ＡＤＭ６２Ａ−１２Ａ）もしくはＮＲＲＬＢ−３００３
６（ＡＤＭ２６６−１３Ｂ）株またはその変異体の細胞に由来する調製物の量
は、約１〜３０ｍｇ／ｍｌであるべきである。２−ＫＬＧ収率を最大化すること
が経験的に決定された温度およびｐＨ条件下で、十分な時間振盪した後、蓄積し
た２−ＫＬＧは、従来の方法によって単離され得る。

【００３７】本明細書中で用いられる培地は、固体または液体、合成（すなわち、人工）ま
たは天然であり得、そして本発明の微生物株の培養に十分な栄養素を含む。好ま
しくは、使用される培地は、液体培地、より好ましくは合成液体培地である。

【００３８】本発明の方法（本明細書中で使用される場合、プロセスと同義）の種々の実施
態様において、開始物質（Ｌ−ソルボース）は、本発明の微生物株の導入前に培
地中に存在し得るか、あるいは株の導入後に、開始と同時に１回で、または培養
の経過にわたって連続してもしくは分割してのいずれかで、全てを培地に添加さ
れ得るか、あるいはＤ−ソルビトールの発酵転化によってインサイチュで作製さ
れ得る。使用されるＬ−ソルボースの量は、当業者によって経験的に決定され得
るが、その量は微生物株が少なくとも約４０ｇ／Ｌの２−ＫＬＧを産生するに少
なくとも十分である。好ましくは、Ｌ−ソルボースは、培養培地の３〜３０％（
ｗ／ｖ）、より好ましくは５〜２０％を含む。

【００３９】本発明の好ましい実施態様において、Ｌ−ソルボース開始物質は、適切な微生
物または微生物の混合を用いるＤ−ソルビトールの発酵転化によって、インサイ
チュで作製される。ＮＲＲＬＢ−３００３５（ＡＤＭ２９１−１９）、ＮＲ
ＲＬＢ−３００３７Ｎ（ＡＤＭ６２Ａ−１２Ａ）もしくはＮＲＲＬＢ−３０
０３６（ＡＤＭ２６６−１３Ｂ）またはその変異体の存在下でＤ−ソルビトー
ルからＬ−ソルボースに転化し得るが、Ｌ−ソルボースを２−ＫＬＧに転化する
その能力に悪影響を及ぼさない、任意の微生物または微生物の混合物が使用され
得る。好ましくは、使用される微生物は、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙ
ｄａｎｓの株、より好ましくはＧ．ｏｘｙｄａｎｓ株ＡＴＣＣ６２１またはＧ
．ｏｘｙｄａｎｓ株ＩＦＯ３２９３である。本発明のこの好ましい実施態様に
よって、Ｄ−ソルビトール開始物質は、１つ以上の微生物の導入の前に培地中に
存在し得るか、あるいは１つ以上の微生物の導入後に、開始と同時に１回で、ま
たは培養の経過にわたって連続してもしくは分割してのいずれかで、全てを培地
に添加され得る。

【００４０】上記または下記に記載される本発明の実施態様において使用される天然または
合成培養培地はまた、窒素源、適切な無機塩、および適切には、種々の微量栄養
素、微生物株の培養に適した増殖因子などを含み、そしてまた、少なくとも１つ
の補充炭素源を含み得る。使用されるべきこれらのさらなる成分の各々の量は、
好ましくは、２−ＫＬＧおよび／またはＰＱＱおよび／またはＬＰＳ産生を最大
にするために選択される。このような量は、当該分野で公知の種々の方法および
技術に従って、当業者によって経験的に決定され得る。

【００４１】本発明の特に好ましい実施態様において、２−ＫＬＧ産生のために使用される
培養培地は、約１０％（ｗ／ｖ）のＬ−ソルボース、約３％（ｗｔ、乾燥固体／
ｖ）のコーンスティープリカー、および約０．２％（ｗ／ｖ）のＭｇＳＯ₄・７
Ｈ₂Ｏを含み、ｐＨをＮＨ₄ＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）₂またはＣａＣＯ₃を用いて制御し
た。

【００４２】本発明の特に好ましい実施態様において、ＰＱＱ産生に使用される培養培地は
、約５〜４０ｇ／Ｌのマンニトール、グルコース、ソルボースまたはイノシトー
ル、好ましくは、１０〜２０ｇ／Ｌのマンニトール、グルコース、ソルボースま
たはイノシトールを含み、そしてその培養は、０℃〜４０℃、好ましくは２℃〜
３５℃、そしてさらにより好ましくは２０℃〜３５℃の間の温度で行われる。培
地のｐＨは、一般的には６〜９、好ましくは６．５〜８．０である。培養時間は
、一般には、２０〜１５０時間、好ましくは２０〜５０時間である。好ましい実
施態様において、ＰＱＱは、細胞中および／または培養培地中に蓄積される。Ａ
ＤＭＸ６Ｌ（ＮＲＲＬＢ−２１６２７）からのＰＱＱの産生のための培地の
例示的な例は、ＤＭ基本培地（表５）（ｐＨ６．０〜７．８）である。ＡＤＭ
６２Ａ−１２Ａ、２６６−１３Ｂ、および２９１−１９株の場合においては、Ｎ
ａＣｌを含まないＤＭ基本培地が使用される。マンニトールのかわりに、任意の
他のポリオールまたは糖アルコール（例えば、ｍｙｏ−イノシトール、ソルボー
スおよびグルコース）が使用され得る。

【００４３】種菌を調製する際に用いるための培地は、適切には、例えば、ペプトン、Ｎ−
Ｚアミン、酵素的ダイズ加水分解物、さらなる酵母抽出物、麦芽抽出物、補充炭
素源、および種々のビタミンのようなさらなる成分を含み得る。

【００４４】適切な補充炭素源の例示的な例としては、以下を含むがこれらに限定されない
：他の炭化水素（例えば、グルコース、フルクトース、マンニトール、デンプン
またはデンプン加水分解産物、セルロース加水分解産物、および糖蜜）；有機酸
（例えば、酢酸、プロピオン酸、乳酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、およびフマ
ル酸）；ならびにアルコール（例えば、グリセロール、イノシトール、マンニト
ールおよびソルビトール）。

【００４５】適切な窒素源の例示的な例としては、以下を含むがこれらに限定されない：ア
ンモニア（アンモニアガスおよびアンモニア水溶液を含む）；無機酸または有機
酸のアンモニウム塩（例えば、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、および酢酸アンモニウム）；尿素；硝酸塩また
は亜硝酸塩、ならびに他の窒素含有物質（純粋または粗調製物のいずれかとして
アミノ酸、肉抽出物、ペプトン、魚粉、魚加水分解産物、コーンスティープリカ
ー、カゼイン加水分解産物、大豆固形物（ｃａｋｅ）加水分解産物、酵母抽出物
、乾燥酵母、エタノール−酵母蒸留液、大豆粉末、綿実粕など）。

【００４６】適切な無機塩の例示的な例としては、以下を含むがこれらに限定されない：カ
リウム、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、コバルト、亜
鉛、銅、モリブデン、タングステンおよび他の微量元素とリン酸との塩。

【００４７】適切な微量栄養素、増殖因子などの例示な例としては、以下を含むがこれらに
限定されない：補酵素Ａ、パントテン酸、ピリドキシン−ＨＣｌ、ビオチン、チ
アミン、リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレ
オチド、ＤＬ−６，８−チオクト酸、葉酸、ビタミンＢ₁₂、他のビタミン、シス
テインおよびヒドロキシプロリンのようなアミノ酸、アデニン、ウラシル、グア
ニン、チミジンおよびシトシンのような塩基、チオ硫酸ナトリウム、ｐ−または
ｒ−アミノ安息香酸、ニコチンアミド、ニトリロ酢酸など。これらは純粋または
部分的に精製した化学化合物または天然物質に存在するかのいずれかである。本
発明の微生物株の培養は、当業者に公知の任意の液内発酵技術（例えば、エアー
リフト（ａｉｒｌｉｆｔ）、伝統的な散布−撹拌設計、または振盪培養において
）を用いて達成され得る。

【００４８】使用される培養条件（温度、ｐＨ、通気速度、撹拌速度、培養期間などを含む
）は、当業者によって、２−ＫＬＧおよび／またはＰＱＱの産生を最大にするよ
うに経験的に決定され得る。特定の培養条件の選択は、使用される特定の本発明
の微生物株、培地組成物および型、培養技術、ならびに同様の考慮のような因子
に依存する。本発明の特に好ましい実施態様において、ＮＲＲＬＢ−３００３
５（ＡＤＭ２９１−１９）、ＮＲＲＬＢ−３００３７Ｎ（ＡＤＭ６２Ａ−
１２Ａ）、ＮＲＲＬＢ−３００３６（ＡＤＭ２６６−１３Ｂ）、もしくはＮ
ＲＲＬＢ−２１６２７（ＡＤＭＸ６Ｌ）株またはその変異体を使用する場合
、培養は、２２℃〜３５℃の範囲の温度、好ましくは約３０℃で行われ、そして
６．０〜８．０の範囲のｐＨ、好ましくは５．５〜７．５の範囲のｐＨ、より好
ましくは約６．０〜７．５の範囲のｐＨで行われる。当然のことながら、使用さ
れる培養条件は、培養中の異なる時点で、適切に、２−ＫＬＧおよび／またはＰ
ＱＱの産生を最大にするように、公知の方法によって変更され得る。

【００４９】十分な時間（例えば、１０〜１５０時間）の培養後、細胞および／または培養
ブロス中に蓄積した２−ＫＬＧおよび／またはＰＱＱは、任意の公知の方法（イ
オン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、溶媒抽出、アフィニティークロマトグ
ラフィー、または任意のそれらの組み合わせを含む）に従って単離される。培養
に使用される条件に適切な任意の方法が使用され得る；２−ＫＬＧを回収するた
めの適切な方法の例示的な例は、米国特許第５，４７４，９２４号；同第５，３
１２，７４１号；同第４，９６０，６９５号；同第４，９３５，３５９号；同第
４，８７７，７３５号；同第４，９３３，２８９号；同第４，８９２，８２３号
；同第３，０４３，７４９号；同第３，９１２，５９２号；同第３，９０７，６
３９号、および同第３，２３４，１０５号に記載される。ＰＱＱを回収するため
の適切な方法の例示的な例は、米国特許第４，９９４，３８２号および同第５，
３４４，７６８号に記載される。

【００５０】ＰＱＱの除去のための１つのこのような方法に従って、固−液分離（例えば、
濾過および／または遠心分離）が培養ブロスに適用されて、細胞の除去をもたら
す。上清（細胞の除去後に得られる液体部分）または培養ブロス（細胞を含む）
のいずれかが、さらなる回収工程に使用され得る。上清または培養ブロスからの
ＰＱＱの回収は、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、溶媒抽出
、またはアフィニティークロマトグラフィーによってもたらされる。

【００５１】回収されたＰＱＱの同定は、例えば、ペーパークロマトグラフィー、薄層クロ
マトグラフィー、ゲル透過クロマトグラフィー、元素分析（例えば、質量分析）
、核磁気共鳴分光法、吸収分光法または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ
）、あるいはそれらの組み合わせを使用して、純粋標準物質（ＦｌｕｋａＰｒ
ｏｄｕｃｔＮｏ．６４６８２）との比較によってなされる。

【００５２】ＰＱＱの定量分析は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ａｍ
ｅｙａｍａら、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．１３０：１７９−１８３（１９８１））お
よびＥ．ｃｏｌｉ（Ａｍｅｙａｍａら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４９
：１２２７−１２３１（１９８５））のＤ−グルコースデヒドロゲナーゼ活性欠
失改変体、ＵＶ吸収スペクトル（Ｄｅｋｋｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．１２５：６９−７３（１９８２））、ＨＰＬＣ、質量分析と組み合わせたゲル
透過クロマトグラフィーまたはフーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）を使用して
なされ得る。

【００５３】２−ＫＬＧの回収のための１つのこのような方法によって、微生物は、公知の
方法（例えば、遠心分離または濾過）によって培養ブロスから最初に除去され、
そして得られた溶液は、減圧下で濃縮される。次いで、結晶性の２−ＫＬＧは、
濾過によって回収され、そして所望される場合、再結晶化によって精製される。
同様に、２−ＫＬＧは、イオン交換樹脂、溶媒抽出、沈殿、塩析などの使用のよ
うな公知の方法を用いて回収され得る。

【００５４】２−ＫＬＧが遊離酸として回収される場合、従来の方法を用いて、所望のよう
な、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、または同様のカチオン
との塩に転換され得る。あるいは、２−ＫＬＧが塩として回収される場合、従来
の方法を用いて、その遊離形態または異なる塩に転換され得る。

【００５５】本発明の代替の実施態様において、本発明の微生物は、１つ以上のヘルパー株
との混合培養において培養される。本明細書中で用いられるように、「ヘルパー
株」は、本発明のプロセスにおいて産生される２−ＫＬＧおよび／またはＰＱＱ
の量を増加させる微生物の株を意味することが意図される。適切なヘルパー株は
、当業者によって経験的に決定され得る。適切なヘルパー株の例示的な例として
は、以下の属のメンバーを含むがこれらに限定されない：Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ（好ましくは、Ａ．ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓまたはＡ．ｓａｐｅｒｄ
ａｅ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（好ましくは、Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇ
ｅｎｅｓまたはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ（好ましくは、Ｂ．ｌｉｎｅｎｓまたはＢ．ｆｌａｖｕｍ）、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｉｔ
ｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、およびＦｌａｖ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ。好ましくは、ヘルパー株は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ２１５４４である。

【００５６】ヘルパー株は、好ましくは、適切な培地中で、適切な条件下で、十分な時間、
十分な集団の培養物が得られるまで、インキュベートされる。次いで、このヘル
パー株種菌は、別々または本発明の微生物株と組み合わせて（すなわち、混合し
た種菌）のいずれかで、２−ＫＬＧおよび／またはＰＱＱを産生するための培養
培地に導入され得る。好ましくは、２−ＫＬＧの産生のために、ＮＲＲＬＢ−
３００３５（ＡＤＭ２９１−１９）、ＮＲＲＬＢ−３００３７Ｎ（ＡＤＭ
６２Ａ−１２Ａ）、またはＮＲＲＬＢ−３００３６（ＡＤＭ２６６−１３Ｂ
）株の量に対するヘルパー株の量の比は、１０：１〜１：１０，０００の範囲で
ある。好ましくは、ＰＱＱの産生のために、ＢＲＲＬＢ−２１６２７（ＡＤＭ
Ｘ６Ｌ）株の量に関連するヘルパー株の量の比は、１０：１〜１：１０，００
０の範囲である。

【００５７】本発明の別の実施態様は、２−ＫＬＧの産生のための発酵プロセスにおいて有
用である新規の微生物株に関する。

【００５８】本発明のさらなる実施態様は、ＮＲＲＬＢ−３００３５（ＡＤＭ２９１−
１９）、ＮＲＲＬＢ−３００３７Ｎ（ＡＤＭ６２Ａ−１２Ａ）、ＮＲＲＬ
Ｂ−３００３６（ＡＤＭ２６６−１３Ｂ）、またはＢＲＲＬＢ−２１６２７
（ＡＤＭＸ６Ｌ）もしくはその変異体から非毒性リポポリサッカリド（ＬＰＳ
）を単離する方法を提供する。この実施態様の状況において、変異体は、非毒性
リポポリサッカリドを産生する本発明の株の１つに由来する株として定義される
。

【００５９】ＬＰＳは、例えば、以下に記載される任意の公知の方法によって、本発明の株
から精製され得る：Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｅｒら、「ＮｏｎｔｏｘｉｃＬｉｐｏ
ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒｏｍＲｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｐｈａｅｒｏｉｄｓＡＴＣＣ１７０２３」、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１５５：１５３−１５８（１９８３）、Ｇａｌａｎｏｓ，Ｃ．ら、「Ａｎｅｗ
ｍｅｔｈｏｄｆｏｒｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＲｌｉｐｏｐｏｌｙ
ｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９：２４５−２４９
（１９６９）、およびＱｕｒｅｓｈｉら、「ＰｏｓｉｔｉｏｎｏｆＥｓｔｅ
ｒＧｒｏｕｐｓｉｎｔｈｅＬｉｐｉｄＡＢａｃｋｂｏｎｅｏｆ
ＬｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓＯｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍＳａ
ｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５
８：１２９４７−１２９５１（１９８３）。

【００６０】ＮＲＲＬＢ−３００３５（ＡＤＭ２９１−１９）、ＮＲＲＬＢ−３００３
７Ｎ（ＡＤＭ６２Ａ−１２Ａ）、ＮＲＲＬＢ−３００３６（ＡＤＭ２６６−１
３Ｂ）またはＮＲＲＬＢ−２１６２７（ＡＤＭＸ６Ｌ）からＬＰＳの産生およ
び精製のための方法の１つは、培地（１％ＤｉｆｃｏＳｏｙｔｏｎｅ、１％Ｄ
ｉｆｃｏＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ、０．５％ＤｉｆｃｏＭａｌｔＥｘ
ｔｒａｃｔ、０．５％ＮａＣｌ、０．２５％Ｋ₂ＨＰＯ₄、２％マンニトールまた
は、他の適切な炭素源、ｐＨ７．８を含む）中で培養することを含む。適切な炭
素源は、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、グルコー
スおよびフルクトースからなる群より選択され得る。ＡＤＭ６２Ａ−１２Ａ、２
６６−１３Ｂ、および２９１−１９宿主の場合には、ＮａＣｌなしの培地が使用
される。ＮａＯＨでｐＨを７．８に調製されたＴｙｐｔｉｃＳｏｙＢｒｏｔ
ｈ（Ｄｉｆｃｏ）もまた使用され得る。細胞塊は液体培地中で増殖し得るか、ま
たは１．３％ＤｉｆｃｏＢａｃｔｏＡｇｅｒで凝固させた培地上の表面培養
において増殖し得る。次いで、湿った細菌を少なくとも１回、約０．１〜５％の
酢酸を含むｎ−ブタノールで洗浄する。次いで、細菌をさらにエタノール、アセ
トンおよびエーテルで洗浄し、次いで、例えば、真空乾燥させる。次いで、その
細胞をフェノール−クロロホルム−石油エーテル抽出にかけ、そして得られたＬ
ＰＳを必要に応じて再びフェノール−クロロホルム−石油エーテルで処理する。

【００６１】本発明はまた、必要に応じて少なくとも１つのマーカー遺伝子を含むベクター
を用いて形質転換された本発明の菌株に関する。

【００６２】組換え構築物は、形質導入、トランスフェクション、接合およびエレクトロポ
レーションまたは他の形質転換方法のような周知の技術を使用して本発明の細菌
株に導入され得る。例えばベクターは、ファージ、プラスミド、コスミドまたは
ミニ染色体であり得る。

【００６３】本明細書にて定義される場合、「宿主」および「宿主細胞」は、本発明の微生
物株の細胞と同じ意味である。

【００６４】目的のポリヌクレオチドは、宿主の伝播について選択可能なマーカーを含むべ
クターと結合され得る。プラスミドベクターが、沈澱物（例えば、リン酸カルシ
ウム沈澱）または荷電した脂質との複合体に導入され得る。

【００６５】目的のポリヌクレオチドに対してシス作用制御領域を含むベクターが好ましい
。適切なトランス作用因子は、宿主により供給され得るか、相補ベクターにより
供給され得るか、または宿主に導入される際にベクター自体により供給され得る
。

【００６６】この点に関する特定の好ましい実施態様において、ベクターは特異的な発現を
提供し、これは誘導的、変異特異的および／または条件特異的であり得る。その
ようなベクターの中で特に好ましいベクターは、操作が簡単な環境因子（例えば
、温度、栄養添加物または化学添加物）により誘導可能なベクターである。他の
適切な環境因子は、当業者に対して容易に明らかである。

【００６７】本発明に有用な発現ベクターは、染色体性ベクター、エピソームベクター(例
えば、プラスミド、バクテリオファージ由来のベクター、それらの組み合わせ由
来のベクター（例えば、コスミドおよびファージミド））を含む。

【００６８】目的のＤＮＡインサートは、適切なプロモーター（これは宿主由来のプロモー
ターが好ましい）と作動可能に連結される。発現構築物は、転写開始のための部
位、転写終結のための部位、および転写された領域内に翻訳のためのリボゾーム
結合部位をさらに含む。この構築物により発現された成熟転写物のコード部分は
、始めにその宿主に対して適切な翻訳開始コドンおよび翻訳されるべきポリペプ
チドの末端に適切に位置付けられる終結コドンを含む。

【００６９】示されたように、好ましくは、この発現ベクターは、選択され得るか、または
スクリーニングされ得る少なくとも１つのマーカーを含む。そのようなマーカー
には、アミカシン、オーグメンチン（アモキシリン）、およびクラブラン酸（ｃ
ｌａｖｕｌｏｎｉｃａｃｉｄ）、アンピシリン、セファゾリン、セフォキシチ
ン、セフタジジム、セフチオフール、セファロチン、クロラムフェニコール、エ
ンフロキサシン、エリスロマイシン、フロルフェニコール、ゲンタマイシン、イ
ミペネム、カナマイシン、ペニシリン、サラフロキシン（ｓａｒａｆｌｏｘｉｃ
ｉｎ）、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、チカル
シリン、またはチルミコシン耐性遺伝子が挙げられる。好ましいマーカーには、
アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ペニ
シリン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、および／またはテトラサイ
クリンか挙げられる。他の適切なマーカーは当業者に容易に明らかである。

【００７０】好ましいベクターは、ｐＭＦ１０１４−α（Ｍ．Ｔ．Ｆｏｌｌｅｔｔｉｅ、「
ＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｇｙｆｏｒＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌ
ｕｔａｍｉｃｕｍ：ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔ
ｉｏｎｏｆＡｍｉｎｏＡｃｉｄＢｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃＧｅｎｅｓ
，」博士論文、ＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｅｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（１９
８９））、これは、ｐＳＲ１−αレプリコンおよびカナマイシン耐性決定基を含
む。特に、ｐＭＦ１０１４−αはｐＳＲ１レプリコン（Ａｒｃｈｅｒ，Ｊ．Ａ．
ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９：１７５３〜１７５９（１９９３
））、およびＥ．ｃｏｌｉ宿主内でプラスミドの複製的維持が可能なｐＳＲ１−
α変異（ＦｏｌｌｅｔｔｉｅＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ、１９８９）、および
プラスミドｐＵＣ４ＫからのＴｎ９０３由来カナマイシン耐性遺伝子（Ｔａｙｌ
ａｒ，Ｌ．Ａ．ら、ＮｕｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．１６：３５８（１９９８
））を含む。本発明は、本発明の菌株またはその変異体（ｐＭＦ１０１４−αを
含む）を提供する。本発明は、微生物菌株ＮＲＲＬＢ−２１６７またはその変
異体（ｐＭＦ１０１４−αを含む）の生物学的に純粋な培養物を提供する。

【００７１】宿主細胞へのこの構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、
ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランス
フェクション、エレクトロポレーション、および他の形質転換方法、形質導入、
感染、または他の方法によりもたらされ得る。このような方法は、多くの標準的
実験マニュアルに記載される（例えば、Ｄａｖｉｓら、「ＢａｓｉｃＭｅｔｈ
ｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌｅｒＢｉｏｌｏｇｙ，」（１９８６））。

【００７２】本明細書中で使用および記載される方法は、当該分野において周知であり、例
えば、Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｅｒ、ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａ
ｒＧｅｎｅｔｉｃｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｂｏｒ、ＮｅｗＹｏｒ
ｋ（１９７２）；Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ、ＡＳｈｏｒｔＣｏｕｒｓｅｉｎ
ＢａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｂｏ
ｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｂｏｒ
、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９２）；Ｍ．ＳｉｎｇｅｒおよびＰ．Ｂｅｒｇ、Ｇｅ
ｎｅｓ＆Ｇｅｎｏｍｅｓ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｉｅｎｃｅＢｏｏｋｓ
、ＭｉｌｌＶａｌｌｅｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９１）；Ｊ．Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版、
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８９）；Ｐ
．Ｂ．Ｋａｕｆｍａｎら、ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎ
ｄＣｅｌｌｕｌａｒＭｅｔｈｏｄｓｉｎＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｅ
ｄｉｃｉｎｅ、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、ＢｏｃａＲａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ（
１９９５）；ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏ
ｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂ．Ｒ．ＧｌｉｃｋおよびＪ
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．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８：２９〜５２（１９９３）においてより詳細に記
載される。

【００７３】以下の実施例は例示するのみであり、そして添付の請求の範囲によって規定さ
れるような本発明の範囲を限定することを意図されない。当業者には、種々の改
変および変更が、本発明の方法において、本発明の精神および範囲を逸脱せずに
なされ得ることは明らかである。従って、本発明の改変および変更が、添付の請
求の範囲の範囲およびそれらの等価物内にあるならば、本発明がそれらを含むこ
とが意図される。

【００７４】本明細書中に参照される全ての特許および刊行物は、参考として明白に援用さ
れる。

【００７５】（実施例）実施例１：ＮＲＲＬＢ−３００３５（ＡＤＭ２９１−１９）株、ＮＲＲＬ
Ｂ−３００３７Ｎ（ＡＤＭ６２Ａ−１２Ａ）株およびＮＲＲＬＢ−３００３６
（ＡＤＭ２６６−１３Ｂ）の単離（Ａ．土壌サンプルの起源、濃縮、およびスクリーニング）環境試料を振盪フラスコ中で微生物濃縮に供した。得られた混合培地をスクリ
ーニングして、L-ソルボースから２−ＫＬＧを産生し得る少なくとも１つの微生
物株を含むものを同定した。湿潤土壌、砂、堆積物、果物、液果、腐植、および
他の環境試料を、アメリカ合衆国の種々の地域から採集した。各試料を、冷却換
気湿潤容器中に即座に保存した。濃縮は、１グラムの土壌または試料を、２５０
ｍＬバッフル振盪フラスコ中の３０ｍＬの培地Ａ（表１）に添加し、続いて３０
℃にて２３０ｒｐｍ、約２日間の振盪インキュベーションすることによって開始
した。

【００７６】発酵による濃縮をスクリーニングするために、各濃縮物の０．５〜０．７５ｍ
Ｌを、３０ｍＬの新鮮な培地Ｂ（表１）を含む２５０ｍＬバッフルフラスコに移
した。混合培地発酵の一部を２−ＫＬＧ含量について分析した後、これらのフラ
スコを、３０℃にて２３０ｒｐｍ、約３日間振盪し、低温保存した。保存のため
に、各培養物の２．０ｍＬを、１．０ｍＬの４０％滅菌グリセロール水と混合し
、次いで−７０℃で保存した。

【００７７】フラスコを、ＷｈａｔｍａｎＬＫ５ＳｉｌｉｃａＧｅｌ１５０プレー
ト（２５０ｍｍ厚）（カタログ番号４８５５−８２０）の薄層クロマトグラフィ
ーを用いて、２−ＫＬＧ産生についてスクリーニングした。プレートを、５μＬ
の遠心分離した培養ブロスでスポットし、そして溶媒中（１５７ｍＬのｎ−プロ
パノール；３９ｍＬの脱イオン水；４ｍＬの１％リン酸；０．４ｍＬの氷酢酸）
で５〜６時間発色させた。プレートを風乾し、次いで２５ｍＬのメタノールおよ
び２５ｍＬの６Ｎ水酸化ナトリウム中に溶解した０．１２５ｇの塩化テトラゾリ
ウムブルーをスプレーした。その後、それを６０℃にて５分間焼いた。ソルボー
スおよび２−ＫＬＧを、完成したプレート上で紫色のスポットとして可視化し、
そして２−ＫＬＧおよびＬ−ソルボースの各々１０ｇ／Ｌを含む標準との比較に
よって同定した。

【００７８】２−ＫＬＧの産生を、ＨＰＬＣによって定量した。サンプルを、移動相中の１
：１０希釈、続いて０．４５μｍ多孔性膜を通して濾過することによって調製し
た。移動相は、Ｍｉｌｉ−Ｑ水を用いて４．０Ｌに希釈した、１．１ｍＬのＡＣ
Ｓグレードのスルホン酸を含む。１００μＬのサンプルの各々を、６００ｍｍの
全カラム長を提供するために（同じ樹脂のガードカラムを前に）一続きに配列し
た２つの２ｍｍ×３００ｍｍ×７．８ｍｍＡｍｉｎｅｘＨＰＸ−８７Ｈカラ
ム（ＢｉｏＲａｄ）にロードした。カラムを、０．６ｍＬ／分の流速を用いて５
５℃にて実行した。Ｌ−ソルボースおよび２−ＫＬＧを、ＷａｔｅｒｓＭｏｄ
ｅｌＮｏ．４１０示差屈折計を用いて検出し、そして２−ＫＬＧおよびＬ−ソ
ルボースを含む標準に対して比較することによって同定した。

【００７９】３３の混合した培養発酵は、１．８〜９．３ｇ／Ｌの範囲の量の２−ＫＬＧを
産生した。ＮＲＲＬＢ−３００３５（ＡＤＭ２９１−１９）株、ＮＲＲＬＢ
−３００３７Ｎ（ＡＤＭ６２Ａ−１２Ａ）株およびＮＲＲＬＢ−３００３６（
ＡＤＭ２６６−１３Ｂ）株が後から単離された（実施例１Ｂ）混合培養発酵は、
それぞれ６．９ｇ／Ｌ、９．３ｇ／Ｌおよび５．４ｇ／Ｌの２−ＫＬＧを産生し
た。

【００８０】（Ｂ．単培養の単離および試験）Ｌ−ソルボースから２−ＫＬＧを産生し得る微生物の純粋培養物（単培養また
は他の微生物との混合培養のいずれかにおいて）を、上記の濃縮物から単離した
。実施例１Ａからの１１の混合培養濃縮物を、それらの優れた２−ＫＬＧ産生に
基づいて選択した。これらを解凍し、そして培地Ａを用いて１０倍ずつ連続希釈
し、その後、各希釈物の０．１ｍＬを、培地Ａ寒天プレートの表面に広げた。プ
レートを、３０℃にて２４時間インキュベートし、次いで８〜４０倍の拡大率で
試験した。最小の最遅増殖コロニーが、希釈プレートから２−ＫＬＧ産生株を回
収するために必要であったことに留意する。各コロニーの型およびサイズのいく
つかの例を選択し、そして新鮮な培地Ａのプレートで継代培養し、その後、この
希釈プレートを２４時間３０℃に戻した。さらなる遅増殖コロニーを、希釈プレ
ートから選択し、そして二次インキュベーション期間の後、継代培養した。各株
を、各培地ＡプレートまたはＰＹＭプレート（１０ｇ／Ｌペプトン；１０ｇ／Ｌ
酵母抽出物；０．５ｇ／Ｌグリセロール；３０ｇ／Ｌマンニトール；２０ｇ／Ｌ
寒天）のいずれかで、１〜３サイクル画線精製した。純粋な株を、２０％グリセ
ロールを含むＰＹＭ液体培地中で、−７０℃にて低温保存した。全１１８の純粋
な株を、１１の濃縮混合物から回収した。

【００８１】１１８の新しい株を、振盪フラスコにおいてＬ−ソルボースを２−ＫＬＧに変
換するそれらの能力について、試験した。２−ＫＬＧ産生が、２つ以上の微生物
の合わせた活性を要求し得る可能性について説明するために、各新しい単離物を
、同じ濃縮物に起源する全ての他の株との対の組合せにおいて、ならびに純粋培
養において試験した。種菌を調製するために、各株を、ＰＹＭ寒天で２４時間培
養し、その後、細胞の巨大なループを、５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．４％塩
化ナトリウム、および０．０５％マンニトールを含む滅菌緩衝液（ｐＨ７．２）
に懸濁した。各純粋株または対の株の試験のために、３０ｍＬの培地Ｃ（表１）
を含む２５０ｍＬバッフルフラスコに、各々の関連株の０．２ｍＬの細胞懸濁物
を接種した。これらのフラスコを、３０℃にて２３０ｒｐｍ、２４時間振盪し、
その後、１．０ｍＬを３０ｍＬの発酵培地Ｄ（表１）に移した。発酵フラスコを
、３０℃にて２３０ｒｐｍ、３日間振盪し、次いで培養液を２−ＫＬＧ含有量お
よびソルボース含有量について、ＴＬＣおよびＨＰＬＣを用いて分析した。ＮＲ
ＲＬＢ−３００３５（ＡＤＭ２９１−１９）株、ＮＲＲＬＢ−３００３７Ｎ
（ＡＤＭ６２Ａ−１２Ａ）株およびＮＲＲＬＢ−３００３６（ＡＤＭ２６６−
１３Ｂ）株を含むフラスコが、これらの菌株を含まないフラスコよりも高い２−
ＫＬＧレベルの全体パターンを示した。これらの菌株は、２−ＫＬＧ産生候補と
してさらなる研究のために選抜された。

【００８２】

【表１】（実施例２：振盪フラスコにおけるＮＲＲＬＢ−３００３５（ＡＤＭ２９１
−１９）株、ＮＲＲＬＢ−３００３７Ｎ（ＡＤＭ６２Ａ−１２Ａ）株、および
ＮＲＲＬＢ−３００３６（ＡＤＭ２６６−１３Ｂ）株によるＬ−ソルボースか
らの２−ＫＬＧの産生）各々の試験される株について、寒天培地上で生育させた新鮮な培養物を白金耳
で１回とり、２０ｍＬの種培地ＡまたはＢ（表２）を含む２５０ｍＬバッフル振
盪フラスコに接種した。これを、３０℃で２２〜２４時間、２４０ｒｐｍで振盪
した。種培養の内容物の２ｍｌを使用して、２５０ｍＬバッフル振盪フラスコ中
の２５ｍＬの発酵培地ＣまたはＤ（表２）に接種し、３０℃にて７２〜９２時間
２４０ｒｐｍで振盪した。引き続いて、そのブロスを回収し、ＨＰＬＣによって
分析した。２−ＫＬＧ産生の結果を表３に示す。

【００８３】

【表２】

【００８４】

【表３】（実施例３：第２の生物を用いる同時培養におけるＮＲＲＬＢ−３００３５
（ＡＤＭ２９１−１９）産生株、またはＮＲＲＬＢ−３００３７Ｎ（ＡＤＭ６
２Ａ−１２Ａ）産生株、またはＮＲＲＬＢ−３００３６（ＡＤＭ２６６−１３
Ｂ）産生株からなる混合培養によるＬ−ソルボースからの２−ＫＬＧの産生）各々の産生株について、寒天培地上で生育させた新鮮な培養物を白金耳で１回
とり、２０ｍｌの培地Ａ（表２）を含む２５０ｍＬバッフル振盪フラスコに接種
し、続いて直ちに１００μＬのＡｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｉｑｕｅｆａ
ｃｉｅｎｓ株Ｘ６Ｓの凍結培養物で接種した。このフラスコを２４０ｒｐｍで、
３０℃で２２〜２４時間振盪した。２ｍＬのこの培養物を２５ｍＬの培地Ｃを含
む２５０ｍＬバッフル振盪フラスコに移し、次いで３０℃にて７２〜９２時間、
２４０ｒｐｍで振盪した。そのブロスを引き続いて回収し、そしてＨＰＬＣによ
って分析した。２−ＫＬＧ産生の結果を、表４に示す。

【００８５】

【表４】（実施例４：振盪フラスコにおけるＮＲＲＬＢ−３００３５（ＡＤＭ２９１
−１９）株、ＮＲＲＬＢ−３００３７Ｎ（ＡＤＭ６２Ａ−１２Ａ）株、ＮＲＲ
ＬＢ−３００３６（ＡＤＭ２６６−１３Ｂ）株、およびＮＲＲＬＢ−２１６
２７（ＡＤＭＸ６Ｌ）株によるＰＱＱの産生）ＮＲＲＬＢ−３００３５（ＡＤＭ２９１−１９）株、ＮＲＲＬＢ−３００
３７Ｎ（ＡＤＭ６２Ａ−１２Ａ）株、ＮＲＲＬＢ−３００３６（ＡＤＭ２６６
−１３Ｂ）株、またはＮＲＲＬＢ−２１６２７（ＡＤＭＸ６Ｌ）株を、１０
ｍｌのＤＭ基本培地（表５）、ｐＨ７．８に接種し、そして６００ｎｍにおける
最大光学密度に達するまで、３０℃にて３００ｒｐｍで振盪した。ＡＤＭ６２Ａ
−１２Ａ、２６６−１３Ｂ、および２９１−１９の場合、ＮａＣｌを含まない培
地を使用した。５ｍｌのこの培養物を、２Ｌバッフルフラスコ中の５００ｍｌの
新鮮な培地に移した。これを、６００ｎｍの波長における最大光学密度に達する
に十分な時間、３００ｒｐｍで振盪しながら３０℃でインキュベートした。

【００８６】培地中のＰＱＱの量を決定するために、サンプルを所定の時間に取り出し、そ
して遠心分離して上清を得た。この上清を、米国特許第４，９９４，３８２号お
よび／または同第５，３４４，７６８号の方法に従って、または質量分析法と結
びつけたゲル浸透クロマトグラフィーによって分析する。

【００８７】（実施例５：ＮＲＲＬＢ−３００３５（ＡＤＭ２９１−１９）株、ＮＲＲＬ
Ｂ−３００３７Ｎ（ＡＤＭ６２Ａ−１２Ａ）株、ＮＲＲＬＢ−３００３６（
ＡＤＭ２６６−１３Ｂ）株、およびＮＲＲＬＢ−２１６２７（ＡＤＭＸ６Ｌ
）株からの非毒性リポポリサッカリドの抽出）ＮＲＲＬＢ−３００３５（ＡＤＭ２９１−１９）株、ＮＲＲＬＢ−３００
３７Ｎ（ＡＤＭ６２Ａ−１２Ａ）株、ＮＲＲＬＢ−３００３６（ＡＤＭ２６６
−１３Ｂ）株、またはＮＲＲＬＢ−２１６２７（ＡＤＭＸ６Ｌ）株を、１％
ＤｉｆｃｏＳｏｙｔｏｎｅ、１％ＤｉｆｃｏＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃ
ｔ、０．５％ＤｉｆｃｏＭａｌｔＥｘｔｒａｃｔ、０．５％ＮａＣｌ、
０．２５％Ｋ₂ＨＰＯ₄、２％マンニトール、２％ミオ−イノシトール、ま
たは２％グルコース、あるいは他の適切な炭素源、ｐＨ７．８を含む培地中
で培養し、そして３０℃にて３００ｒｐｍで振盪する。ＮＲＲＬＢ−３００３
５（ＡＤＭ２９１−１９）株、ＮＲＲＬＢ−３００３７Ｎ（ＡＤＭ６２Ａ−１
２Ａ）株、ＮＲＲＬＢ−３００３６（ＡＤＭ２６６−１３Ｂ）株の場合には、
ＮａＣｌを含まない培地を使用する。次いで、細胞を収集し、次いで水で３回洗
浄する。次いで、１２０ｇの湿重量の細菌を、各回約１％酢酸を含む６００ｍｌ
のｎ−ブタノールで３回洗浄する。次いで、その細菌を、エタノール、アセトン
、およびエーテルでさらに洗浄し（それぞれについて６００ｍｌで３回）、真空
乾燥する。

【００８８】乾燥させた細菌を、遠心分離容器に配置し、そして抽出混合液（２００ｍｌ）
を添加する。抽出混合液は、液体フェノール（９０ｇの乾燥フェノール＋１１ｍ
ｌ水）、クロロホルム、および石油エーテル（沸点４０〜６０℃）を、それぞれ
２：５：８の容量比で含む。この混合物は、使用されるフェノールが乾燥してい
る場合、単層になる。水がもともとのフェノール調製物中に存在する場合、その
混合物は濁り、そして固体フェノールの添加によって清澄化し得る。次いで、こ
の懸濁液を、温度が５℃〜２０℃を維持するように、２分間冷却しながらホモジ
ナイズする。この処理は、細菌を破壊することではなく、微細な懸濁液中で細菌
を得ることを意味する。細菌がすでに微細に懸濁されていた場合、数分間の混合
物の攪拌が十分である。時として、懸濁液は、ホモジナイズの後で非常に粘性で
ある。この場合、より多くの抽出混合液が添加される。次いで、細菌は遠心分離
され（５０００回転／分、１５分間）、そしてリポポリサッカリドを含んだ上清
を、濾紙を通して丸底フラスコに濾過する。細菌の残渣を、等量の抽出混合液を
用いてもう１回抽出し、攪拌し、そして上記のように遠心分離して、そして上清
は最初の抽出物に添加される。抽出を３回反復し得る。

【００８９】プールした上清溶液は、明るい黄色から暗い茶色の色を有する。次いで、石油
エーテルおよびクロロホルムを３０〜４０℃で（または高真空では０℃未満で）
、ロータリーエバポレーターで完全に除去する。もし残存するフェノールがここ
で結晶化するならば、十分な水を添加してそれを溶解させる。溶液をガラス遠心
分離ポットに移し、そしてリポポリサッカリドが沈殿するまで水を滴下する。混
合液を１〜２分間静置させた後にリポポリサッカリドが沈殿し始めたときに、水
の添加を停止する。リポポリサッカリドの沈殿は、フェノールが水で飽和するず
っと前に完了するが、水を添加しすぎないように注意を払わなくてはならない。
なぜなら、これは２つの相の形成を引き起こすからである。次いで、沈殿したリ
ポポリサッカリドを遠心分離して（３０００回転／分、１０分）、上清をデカン
トし、そしてチューブを逆さまにして２〜３分間静置させる。次いで、濾紙で内
側を拭う。沈殿を、少量の８０％フェノール（約５ｍｌ）で３回洗浄し、そして
チューブの内側を、上清のデカンテーション後に濾紙で拭う。最後に、沈殿を３
回エーテルで洗浄して、残存するすべてのフェノールを除去し、そして真空乾燥
させる。リポポリサッカリドを蒸留水（５０ｍｌ）に取り込み、４５℃に加熱し
、そして空気を取り除くために吸引を注意深く適用する。次いで、数分間振盪さ
せ、それによって粘性（時には非常に粘性）の溶液を得る。その粘性は、５分間
ｕｌｔｒａｖｉｂｒａｔｏｒ中に溶液を置くことによって低下させ得る。リポ
ポリサッカリド溶液を、１回、高速で遠心分離する（１００，０００×ｇ、４時
間）。得られる沈殿物は、清澄かつ透明であり、その結果、時には上清をデカン
トするまで認識することが困難である。リポポリサッカリドは、水中に再溶解さ
れ、そして凍結乾燥される。

【００９０】

【表５】（実施例６：ベクターを用いる株の形質転換）細菌宿主株ＡＤＭＸ６Ｌを、プラスミドベクターｐＭＦ１０１４−α（これ
は、ｐＳＲ１−ａレプリコンおよびカナマイシン耐性決定因子を含む）を用いて
、エレクトロポレーションによって形質転換した。次いで、ｐＭＦ１０１４−α
プラスミドを、得られるＡＤＭＸ６Ｌ形質転換体から再単離し、引き続いてＥ
．ｃｏｌｉ宿主を形質転換するために使用した。この実施例は、ベクターを用い
るＡＤＭ株の形質転換、ＡＤＭ宿主中でのカナマイシン耐性の発現による形質転
換体の選択、ＡＤＭ宿主中での染色体外エレメントとしてのプラスミドの維持、
および新規なＥ．ｃｏｌｉ／ＡＤＭ宿主株シャトルベクターとしてのｐＭＦ１０
１４−αの使用を実証する。

【００９１】プラスミドｐＭＦ１０１４−α（Ｍ．Ｔ．Ｆｏｌｌｅｔｔｉｅ，「ＤＮＡＴ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍ
ｉｃｕｍ：ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｇｅｎｅｓ」、博士
論文、ＭＩＴ、Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９８９）ＤＮＡを、「ＷｉｚａｒｄＰｌｕｓ
Ｍｉｄｉｐｒｅｐｓ」ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）において提供さ
れる材料および手順を使用して、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン硫酸塩を有する
Ｌｕｒｉａブロス（１％ＤｉｆｃｏＴｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％Ｄｉｆｃ
ｏＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ、０．５％ＮａＣｌ）で培養したＥ．ｃｏｌ
ｉＤＨ５αＭＣＲ／ｐＭＦ１０１４−αの５０ｍｌのオーバーナイト培養物か
ら単離した。

【００９２】コンピテントなＡＤＭＸ６Ｌ宿主細胞を調製するために、ＡＤＭＸ６Ｌの
単一コロニーを、１０ｍｌのＸ６Ｌ培地（１％ＤｉｆｃｏＳｏｙｔｏｎｅ、
１％ＤｕｆｃｏＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ、０．５％ＤｉｆｃｏＭａ
ｌｔＥｘｔｒａｃｔ、０．５％ＮａＣｌ、０．２５％Ｋ２ＨＰＯ４、２％
マンニトール、ｐＨ７．８）に接種し、そして０．８の吸収単位のＯＤ₆₀₀
に達するまで、３０℃、３００ｒｐｍで振盪した。ＡＤＭ６２Ａ−１２Ａ、２
６６−１３Ｂ、および２９１−１９宿主の場合、ＮａＣｌを含まないＸ６Ｌ培地
を使用する。５ｍｌのこの培養物を、２Ｌバッフルフラスコ中の５００ｍｌの新
鮮なＸ６Ｌ培地に移し、これを、１．０の吸収単位のＯＤ₆₀₀に達するに十分な
時間、３００ｒｐｍで振盪しながら３０℃でインキュベートした。成熟培養物を
急速に冷却し、そして２〜４℃の温度を引き続く工程の間維持した。細胞を、遠
心分離によって収集し、そして２サイクルの５００ｍｌの氷冷水中への再懸濁、
続いて再遠心分離によって洗浄した。第２の洗浄からのペレットを、４０ｍｌの
氷冷１０％グリセロール中に懸濁させ、混合し、そして再遠心分離した。この
ペレットの体積を見積もり、そしてこのペレットを等量の氷冷１０％グリセロ
ール中に懸濁した。得られる形質転換コンピテント細胞懸濁物を、微量遠心分離
チューブ中に、チューブあたり４０μＬアリコートとしてとり、そして−８０℃
で保存した。

【００９３】水中に１４０μｇ／ｍｌの精製したｐＭＦ１０４−α ＤＮＡを含む２μＬの
冷溶液を、４０μＬの冷コンピテントＡＤＭＸ６Ｌ細胞に添加し、そして混合
した。この細胞−ＤＮＡ混合物を、あらかじめ冷却したエレクトロポレーション
キュベット（１ｍｍキュベット、カタログ番号９４０−００−１００−５、Ｅｐ
ｐｅｎｄｏｒｆＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）に移し、迅速に「ＢｉｏＲ
ａｄＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＩＩ」エレクトロポレーション装置に移し、そ
して１．５ｋＶ、２５μＦ、２００オームでパルスした。パルスの直後に、１ｍ
ｌの室温のＸ６Ｌ培地をパルスした細胞に添加し、そして混合液を１０ｍｌ滅菌
試験管に移し、そして３００ｒｐｍで振盪しながら３０℃でインキュベートした
。インキュベーションの２時間後、カナマイシン耐性の発現を可能にするために
、１．０４ｍｌの細胞懸濁液を除去し、そして１４，０００ｒｐｍで２分間、微
量遠心分離を行った。０．９ｍｌの上清を除去し、細胞ペレットを残存する上清
中で懸濁させ、そして細胞懸濁物を、２０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび１．３
％ＤｉｆｃｏＢａｃｔｏＡｇａｒを含むＸ６Ｌ培地のペトリプレート上で広
げた。そのプレートを、３０℃で２日間インキュベートした。２０個のカナマイ
シン耐性ＡＤＭＸ６Ｍ形質転換体コロニーを、この手順によって得た。

【００９４】Ｘ６Ｌ形質転換体は、染色体外エレメントとしてｐＭＦ１０１４−αプラスミ
ドを維持した。これを実証するために、プラスミドＤＮＡを、形質転換したＸ６
Ｌ細胞が、４０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＸ６Ｌ培地中で増殖した以外はＥ
．ｃｏｌｉについて上記に概説された手順を用いて、Ｘ６Ｌ形質転換体から再単
離した。Ｘ６Ｌ形質転換体から単離したプラスミドＤＮＡは、アガロースゲル電
気泳動によって実証されたように、もともとのｐＭＦ１０１４−αプラスミドと
同じサイズを有した。Ｘ６Ｌ形質転換体から単離されたプラスミドは、なおカナ
マイシン耐性遺伝子およびＥ．ｃｏｌｉ複製決定因子を有した。これを実証する
ために、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を、ＬｅｔｔｅｒｂｅｒｇおよびＣｏｈ
ｅｎの方法（Ｊ．Ｂａｃｔ．１１９：１０７２−１０７４、１９６４）によって
調製し、そしてＤ．Ａ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｊ．Ｂａｃｔ．１３２：３４
９−３５１、１９７７）を用いてＸ６Ｌ形質転換体からのプラスミドＤＮＡを用
いて形質転換した。この方法によって形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞はカナマ
イシン耐性を獲得し、そしてもともとのプラスミドｐＭＦ１０１４−αと同じサ
イズを有するプラスミドの存在を示した。

【００９５】

【表６】

【００９６】

【表７】

【００９７】

【表８】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、Ｌ−ソルボースから２−ＫＬＧを産生し得る細菌株のＲｉｂｏＰｒｉ
ｎｔ（登録商標）パターンの図である。ＲｉｂｏＰｒｉｎｔ（登録商標）パター
ンを、以下の細胞株から得た：ＡＤＭＸ６Ｌ（ＮＲＲＬＢ−２１６２７）、
ＡＤＭ２９１−１９（ＮＲＲＬＢ−３００３５）、ＡＤＭ２６６−１３Ｂ（Ｎ
ＲＲＬＢ−３００３６）、ＡＤＭ６２Ａ−１２Ａ（ＮＲＲＬＢ−３００３７
Ｎ）、ＤＳＭ４０２５Ｃ（混合培養寄託物ＤＳＭ４０２７の小コロニー成分
株の再単離物（ｒｅｉｓｏｌａｔｅ）、米国特許第４，９３５，３５９号）、Ｐ
ｓｅｕｄｏｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｓａｃｃｈａｒｏｋｅｔｏｇｅｎｅｓ
株ＩＦＯ１４４８４およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｏｒｂｏｓｏｘｉｄａｎ
株ＩＦＯ１４５０２。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 19/44 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01）Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 7/60 (Ｃ１２Ｐ 7/60 Ｃ１２Ｒ 1:01）Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 17/12 (Ｃ１２Ｐ 17/12 Ｃ１２Ｒ 1:01）Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 19/44 (Ｃ１２Ｐ 19/44 Ｃ１２Ｒ 1:01）Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 19/44 (Ｃ１２Ｐ 19/44 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者リャウ，ハンミンジェイ．アメリカ合衆国イリノイ 61821，キャンペーン，ガレンドライブ 1013 (72)発明者デリア，ジョンアメリカ合衆国イリノイ 61821，キャンペーン，フィリポブストリート 1903 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 BA80 CA03 DA06 EA04 FA15 GA14 GA19 HA01 4B064 AD54 AE49 AF11 CA02 CA19 CB11 CC24 CD09 DA01 DA20 4B065 AA01X AA01Y AA15X AA22X AA24X AA25X AA26X AA27X AA40X AA41X AA56X AB01 AC14 BA03 BA25 BB15 BC01 BD14 CA10 CA18 CA22 CA44 CA60

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＮＲＲＬＢ−３００３５（ＡＤＭ２９１−１９）、ＮＲＲ
ＬＢ−３００３７Ｎ（ＡＤＭ６２Ａ−１２Ａ）およびＮＲＲＬＢ−３００３
６（ＡＤＭ２６６−１３Ｂ）からなる群より選択される株を同定する特徴を含む
微生物株または該株に由来するその変異体の生物学的に純粋な培養物。
【請求項２】微生物株ＮＲＲＬＢ−３００３５（ＡＤＭ２９１−１９）
または該株に由来するその変異体を含む、請求項１に記載の生物学的に純粋な培
養物。
【請求項３】微生物株ＮＲＲＬＢ−３００３７Ｎ（ＡＤＭ６２Ａ−１２
Ａ）または該株に由来するその変異体を含む、請求項１に記載の生物学的に純粋
な培養物。
【請求項４】微生物株ＮＲＲＬＢ−３００３６（ＡＤＭ２６６−１３Ｂ
）または該株に由来されるその変異体を含む、請求項１に記載の生物学的に純粋
な培養物。
【請求項５】２−ケト−Ｌ−グロン酸を産生するための方法であって、請
求項１に記載の株をＬ−ソルボースを含む培地中で、該Ｌ−ソルボースが２−ケ
ト−Ｌ−グロン酸に変換されるのに十分な時間培養する工程；および該２−ケト
−Ｌ−グロン酸を回収する工程を包含する、方法。
【請求項６】前記２−ケト−Ｌ−グロン酸を、アスコルビン酸またはその
塩に変換する工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】前記株が、少なくとも約４０ｇ／Ｌの２−ケト−Ｌ−グロン
酸を、アスコルビン酸またはその塩に産生し得る、請求項６に記載の方法。
【請求項８】前記培養工程が、約６．０〜８．０のｐＨで行われる、請求
項５に記載の方法。
【請求項９】前記培養工程が、約２２℃〜約３５℃の温度で行われる、請
求項５に記載の方法。
【請求項１０】前記微生物が、純粋培養で培養される、請求項５に記載の
方法。
【請求項１１】前記微生物株が、少なくとも１つのさらなる微生物株を含
む混合培養で培養される、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】前記さらなる微生物株が、Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅ
ｒ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓおよび
Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍからなる群より選択される属のメンバーである、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】前記Ｌ−ソルボースが、Ｄ−ソルビトールの発酵変換によ
って生成される、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】前記Ｌ−ソルボースが、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏ
ｘｙｄａｎｓを使用するＤ−ソルビトールの発酵変換によって生成される、請求
項１３に記載の方法。
【請求項１５】前記Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙｄａｎｓが、株
ＡＴＣＣ６２１または株ＩＦＯ３２９３、あるいはそれらの変異体である、請
求項１４に記載の方法。
【請求項１６】２−ケト−Ｌ−グロン酸を産生するための方法であって、
請求項１に記載の株を、Ｄ−ソルビトールを含む培地中でＤ−ソルビトールをＬ
−ソルボースに変換し得る微生物株との混合培養中で、該Ｄ−ソルビトールが２
−ケト−Ｌ−グロン酸に変換されるのに十分な時間培養する工程；および該２−
ケト−Ｌ−グロン酸を回収する工程を包含する、方法。
【請求項１７】前記さらなる微生物株が、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属
またはＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属のメンバーである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】前記さらなる微生物株が、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ
ｏｘｙｄａｎｓＡＴＣＣ６２１またはＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙ
ｄａｎｓＩＦＯ３２９３、あるいはそれらの変異体のいずれかである、請求項
１７に記載の方法。
【請求項１９】ＰＱＱを単離する方法であって、以下：請求項１に記載の株を、グルコース、ソルボース、グリセロール、マンニトー
ル、ソルビトールまたはイノシトールを含む培養培地中で培養する工程；および該ＰＱＱを単離する工程、を包含する、方法。
【請求項２０】ＰＱＱを単離する方法であって、以下：微生物株ＮＲＲＬＢ−２１６２７またはその変異体を、グルコース、ソルボ
ース、グリセロール、マンニトール、ソルビトールまたはイノシトールを含む培
養培地中で培養する工程；および該ＰＱＱを単離する工程、を包含する、方法。
【請求項２１】前記微生物株またはその変異体が、少なくとも１つのさら
なる株を含む混合培養物中で培養される、請求項１９または請求項２０に記載の
方法。
【請求項２２】非毒性リポポリサッカリドを単離する方法であって、請求
項１に記載の株を、グリセロール、グルコース、フルクトース、マンニトール、
ソルビトールまたはイノシトールを含む培地中で培養する工程、および該リポポ
リサッカリドを単離する工程を包含する、方法。
【請求項２３】非毒性リポポリサッカリドを単離する方法であって、微生
物株ＮＲＲＬＢ−２１６２７を、グリセロール、グルコース、フルクトース、
マンニトール、ソルビトールまたはイノシトールを含む培地中で培養する工程、
および該リポポリサッカリドを単離する工程を包含する、方法。
【請求項２４】前記株が、ベクターを含む、請求項１に記載の培養物。
【請求項２５】前記ベクターが、ｐＭＦ１０１４−αである、請求項２４
の培養物。
【請求項２６】ｐＭＦ１０１４−αを含む、微生物株ＮＲＲＬＢ−２１
６２７またはその変異体の、生物学的に純粋な培養物。
【請求項２７】前記ベクターが、マーカー遺伝子を含む、請求項２４に記
載の培養物。
【請求項２８】前記マーカー遺伝子が、宿主細胞中で抗生物質耐性を付与
するタンパク質の合成を指向するように作用するヌクレオチド配列を含む、請求
項２７に記載の培養物。
【請求項２９】前記抗生物質耐性が、アンピシリン、クロラムフェニコー
ル、エリスロマイシン、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシ
ンおよびテトラサイクリンに対する耐性を含む、請求項２８に記載の培養物。
【請求項３０】請求項２４に記載の培養物であって、前記ベクターが、以
下：（ａ）外因性転写ターミネーター；（ｂ）外因性プロモーター；および（ｃ）該プロモーターと該ターミネーターとの間にある、別々の一連の制限エ
ンドヌクレアーゼ認識部位、を含む、培養物。
【請求項３１】請求項１に記載の株を形質転換するための方法であって、
該株内にベクターを挿入する工程を包含する、方法。