JP2002523030A - 精製された抗原特異的抗体を用いるレジオネラ菌の検出法 - Google Patents

精製された抗原特異的抗体を用いるレジオネラ菌の検出法

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Abstract

(57)【要約】 本質的にタンパク質非含有のO-糖質抗原またはO-多糖質抗原は、レジオネラ属の細菌の種、または種の血清群から分離され、かつ活性化されたクロマトグラフィーカラムに結合される。このようにして調製されたカラムは、レジオネラの同一の種または種の血清群に対する粗抗体の精製のために使用される。得られる抗原特異的抗体は、レジオネラ症、ポンティアック熱およびその他のレジオネラが起因した疾患の検出のため、ならびに環境試料中のレジオネラ菌の検出のための免疫化学的アッセイ法において使用される。免疫クロマトグラフィー試験装置において行われるレジオネラ・ニューモフィラ血清群1の迅速で高い特異性および感度を有する免疫アッセイ法が詳細に説明されている。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、レジオネラ属の細菌、特にレジオネラ・ニューモフィラの血清群お
よび／または菌株から分離された本質的にタンパク質非含有の糖質抗原および多
糖質抗原に関しており、特に、L.ニューモフィラ血清群1のO-多糖質抗原を含む
ものに関し、ならびにレジオネラ生物に対応する多価抗体のアフィニティ精製に
おけるこれらの抗原の使用に関する。より詳細に述べると、本発明は、活性化さ
れたクロマトグラフィーカラムへレジオネラ菌から分離された糖質または多糖質
抗原が結合する段階、ならびにレジオネラと同一の種、または同一の種の血清群
に対するポリクローナル抗体をアフィニティ精製するためにそのカラムを使用す
る段階を包含している。本発明はさらに、例えばヒト患者におけるレジオネラ症
およびポンティアック熱のようなレジオネラに起因した疾患の検出、ならびにレ
ジオネラ感染物質の環境起源の検出のための免疫化学アッセイ法において、製造
されたアフィニティ精製多価抗体の使用を包含している。
【０００２】背景 グラム陰性菌であるレジオネラ属により起因される肺炎様ヒト感染症であるレ
ジオネラ症は、肺炎および他の類似した肺感染症から、信頼できる臨床的基礎(
臨床検査以外の患者の症状の評価を含む)に基づいて鑑別診断することが事実上
不可能である。本疾患は肺の膿傷、他の体内器官の感染症、または菌血症を生じ
ることがあり、かつ適切な治療開始の遅れによりその死亡率は著しく上昇するの
で、迅速かつ信頼できる診断法が必要とされているが、現時点では部分的に条件
を満たすのみである。Stout, J.E.およびYu, V.L.、Legionellosis、N. Eng. J.
Med.337:682-687 (1997)。このような試験法を開発する試みは、多くのレジオ
ネラ種が存在し、少なくともその一部は多くの個別の血清群を有することが既知
であり、この事実により妨げられている。
【０００３】 レジオネラ症は、1976年夏に最初に発見され、かつ現時点で症例の90％を占め
ることが分かっている（StoutおよびYu、前掲）レジオネラ(「L」）ニューモフ
ィラを検出する多くの技術が、その間に開発されている。概してこれらの試験法
は、時間がかかり、現在までに分かっているL.ニューモフィラ種に属する15種の
血清群において1種より多くの血清群を同定することは不可能である。しかし前
掲のStoutおよびYuの論文により報告されたように、レジオネラ症の報告された
症例の80％より多くがL.ニューモフィラ血清群1に起因していることは注目すべ
き点であり、この事実は、特に重要な存在に関する迅速で信頼できる免疫アッセ
イ法の開発をもたらし、かつ研究者らは優先的にこれを集中的に研究している。
【０００４】 レジオネラ症の原因物質の同一性を確立するための初期の試みは、5〜6日間の
細菌培養と培養物の顕微鏡検査とに大きく依存していた。同定過程を迅速化する
努力は、感度および特異性が変動する非常に多くの免疫化学試験をもたらし、こ
れはとりわけ現在市販されているEQUATE（登録商標）放射免疫アッセイ法(「RIA
」)、およびBinax酵素免疫アッセイ法(「EIA」)を含んでおり、共に、出願人の
譲受人であるBinax社からキットの形で販売されている。Hackman, B. A.らの論
文、「レジオネラ・ニューモフィラ血清群I抗原の検出用のBinaxレジオネラ属尿
中抗原EIAキットとBinaxRIA尿中抗原キットとの比較（Comparision of Binax Le
gionella Urinary Antigen EIA Kit with Binax RIA Urinary Antigen Kit for
Detection of Legionella pneumophila Serogroup I Antigen）」、J. Clin. Mi
crobiol.、34:1579-1580 (1996)に示されたように、これらのアッセイは共に、L
.ニューモフィラ血清群I抗原を特異的に検出している。報告されたEIAの感度は7
7％であり；RIAの感度はより高かった。この論文は、各々を開始から終了まで「
3時間未満で」実行することができることを指摘しており；Binax独自の試験では
実行に各々少なくとも2.5時間を要した。EIAアッセイに関する更なる情報は、Ka
zandijian, D.らの論文、「レジオネラ・ニューモフィラ血清群1感染症のBinax
酵素免疫アッセイ尿中抗原試験による迅速な診断（Diagnosis of Legionella pn
eumophila）」、J. Clin. Immunobiol.、35:954-956 (1997)に見ることができる
。
【０００５】発明の簡単な説明 おそらく、本明細書に記された免疫クロマトグラフィー試験(「ICT」)の最も
有意義な利点は、L.ニューモフィラ血清群1（またはその抗原）が存在するか否
かについて15分という時間内で試験結果を出し、その結果は高い特異性および感
度を有しているという能力であると思われる。高い特異性および感度を伴う結果
を得るために本試験を信頼をもって行うことができるような迅速さは、本発明に
従い調製されたアフィニティ精製抗体の強力な反応性によると考えられる。その
結果これらの抗体の優れた反応特性は、同じく本発明の一部であるL.ニューモフ
ィラ血清群1の新規の本質的にタンパク質非含有のO-多糖質抗原におけるアフィ
ニティ精製による使用に帰するとと考えられる。
【０００６】 別のICT試験は、本発明のタンパク質性でなく糖質の性質であり、かつ複数のL
.ニューモフィラの血清群に共通であるような、L.ニューモフィラ血清群5抗原の
分離により可能である。このような共通抗原の存在は、科学文献において示され
ている：例えば、Nolte, F. S.ら、「レジオネラ-ニューモフィラのリポ多糖類
の電気泳動的および血清学的特徴決定（Electrophoretic and Serological Char
acterization of the Lipopolysaccharides of of Legionella pneumophila）」
、Infection and Immunity、52:676-681 (1986)；Otten, S.ら、「レジオネラ・
ニューモフィラの血清特異的抗原（Serospecific Antigens of Legionella pneu
mophila）」、J. Bacteriol、167:893-904 (1986)；Barthe, Cら、「モノクロー
ナル抗体により認識されたレジオネラ・ニューモフィラのリポ多糖類の共通エピ
トープ（Common Epitope on the Lipopolysaccaride of Legionella pneumophil
a Recognized by Monoclonal Antibody）」、J. Clin. Microbiol.、26:1016-10
23 (1988)；Knirel, Y. A.ら、「レジオネラ・ニューモフィラ血清群1のO-特異
的鎖の構造（The Structure of the O-specific Chain of Legionella pneumoph
ila Serogroup I）」、Eur. J. Biochem.、227:239-245 (1994)を参照のこと。
これまでは、有用な広域スペクトルの免疫化学アッセイ法の開発に使用するため
のこのような抗原の如何なる分離も明らかにした報告はない。
【０００７】 本発明は、任意のレジオネラ菌に由来し、特に、本質的にタンパク質非含有の
多糖質または糖質抗原のレジオネラ菌における任意の血清群の細菌に由来する抽
出、この抗原とスペーサータンパク質との複合体の調製、この複合体のアフィニ
ティカラムへの結合、対応するレジオネラ菌、例えばL.ニューモフィラ血清群の
細菌に対する多価抗体の精製のためのこのカラムの使用、ならびにこのようにし
てICT免疫アッセイ法で精製された抗体において、レジオネラ菌またはその抗原
でのL.ニューモフィラ血清群もしくはそれらに対応する細菌の抗原を含む、検出
のための使用を含み、これについては以下でより詳細に説明する。
【０００８】 特に本発明は、L.ニューモフィラ血清群1に特異的な本質的にタンパク質非含
有のO-ポリ多糖質抗原の分離、同細菌に特異的な多価抗体のアフィニティ精製に
おけるその使用、ならびに15分以内に実行可能な高特異性および高感度を持つIC
T免疫アッセイ法におけるアフィニティ精製抗体の使用を含んでいる。
【０００９】 別の態様において、本発明は、本質的にタンパク質非含有の糖質抗原のL.ニュ
ーモフィラ血清群5からの分離、およびL.ニューモフィラ血清群5抗原に特異的な
ポリクローナル抗体（すなわち、該抗原により免疫処置されたウサギから得られ
た抗体）のアフィニティ精製におけるその使用を含み；この抗体は、L.ニューモ
フィラ血清型5抗原に加え血清型1、2および4抗原と交差反応する能力を示してい
る。
【００１０】発明の詳細な説明 商標EQUATEで販売されているL.ニューモフィラ血清群1抗原のBinax RIAアッセ
イおよび同抗原のBinax EIA測定による実験を含む当技術分野の先行する実験は
、様々なL.ニューモフィラ血清群の抗原を含む、レジオネラ種の抗原が、レジオ
ネラ菌に感染した患者の尿検体中において、血液、痰、または他の液体の検体中
よりもより簡便に検出可能であることを示している。この理由は一部は、レジオ
ネラ抗原が、通常、ヒト患者の感染後1〜3日で尿中に出現するのに対して、血中
の検出可能なレベルでの出現はこれよりも遅いこと、さらに一部はレジオネラ症
に感染した患者は余り痰を吐かないことが多いことである。本発明の一部を構成
しているICT試験は、血液、痰もしくは脳脊髄液のような他の液体のいくつかに
ついて、または環境を起源とする水性試料について動作するように設計すること
ができる。ヒト患者の診断にとって、尿が一般に好ましい液体試料であり、なぜ
なら尿は、例え診療所であっても、非侵襲的かつ容易に得られ、および例えば無
害であるが得られた結果に影響を及ぼし得るような痰中に存在する口内微生物叢
のように他の細菌により容易に汚染されないことが注目される。
【００１１】 概して、厳密にいうと本発明の一部であるL.ニューモフィラ血清群1抗原のICT
試験は、当技術分野において開示された任意の公知の使い捨てICT装置において
動作するように設計することができる。好ましくは、この試験は、現在の診断分
野−すなわち呼吸器系疾患を含む用途の広域の領域において、Howard Chandler
の同時係属出願である米国特許出願第07/706,639号、またはその一部係属出願で
あり全てSmith-Kline Diagnostics社に譲渡されているが、Binax社に独占的に実
施許諾されている出願に開示されている種類のICT装置を用いて実行される。こ
の装置は、L.ニューモフィラ血清群1抗原の抗原特異性を有する、本明細書にお
いて開示されたアフィニティ精製多価抗体で適当に含浸されている。この測定に
おける陽性の結果は、適宜標識された抗体と抗原との反応時の呈色によって示さ
れる。適当な標識物は、それに結合した抗体が抗原と反応した場合に可視色を呈
するような、当技術分野において公知のもののいずれかであってもよく、これは
細かく粉砕された金属および様々な他の標識材料を含む。金コロイドが好ましい
標識物である。
【００１２】 本発明により、本質的にタンパク質非含有の糖質抗原または多糖質抗原が、他
のレジオネラ種の菌由来、およびL.ニューモフィラの他の血清群の菌由来である
ことを含む、レジオネラ菌の各々から同様に分離することができること、このよ
うな抗原は、対応するレジオネラ種または血清群の菌およびその抗原に対する多
価抗体のアフィニティ精製に同様に利用することができること、ならびにこれら
のアフィニティ精製抗体は、L.ニューモフィラ血清群1に対するアフィニティ精
製抗体について本明細書において詳細に説明されたICTおよび他の免疫アッセイ
法に利用することができることが考察されている。
【００１３】 この装置の調製に先立ち、抗体を得て、かつそれらのアフィニティ精製を行う
。本発明において使用することができる抗体は、レジオネラ抗原、例えば周知の
血清群のL.ニューモフィラ抗原に対して、ウサギ、ヤギまたは他の動物を免疫処
置する段階、および所望の抗体を含有する血清を得るために適当な時間経過後の
動物から採血する段階における周知の方法から得られた通常の多価(「ポリクロ
ーナル」とも称される)抗体である。例えば、Cherry, U.B.およびMcKinney, R.M
.、「「レジオネラ」の疾患、細菌および方法（"Lgionnaires" the disease, th
e bacterium and the methodlogy）」、91-104ページ、Jones, G.L.およびHerbe
rt, G.A. (編)、(疾病管理センター(CDC)、アトランタ、1919年)を参照のこと。
本発明においては、本明細書で明らかにされたL.ニューモフィラ血清群1に関す
るICT免疫アッセイ法に関して、ウサギまたは他の動物が、L.ニューモフィラ血
清群1抗原に対して免疫処置され、かつその血液から回収された多価抗体は、L.
ニューモフィラ血清群1に対する抗体である。
【００１４】 本発明において使用される多価抗体はさらに、抗体が精製剤として反応性であ
るような抗体に対して、同一の細菌の本質的にタンパク質非含有の糖質抗原また
は多糖質抗原を用いて特異的に調製されたクロマトグラフィーカラム上でアフィ
ニティ精製される。
【００１５】 従って抗体のアフィニティ精製に先立ち、本発明は、所望の種または種の血清
群の公知のレジオネラ菌の培養物から、本質的にタンパク質非含有の精製された
糖質抗原または多糖質抗原を調製することが必要とされる。
【００１６】 下記の実施例IおよびIIは、精製されたタンパク質非含有多糖質抗原または糖
質抗原を得るための方法について説明する。
【００１７】実施例I L.ニューモフィラ血清群1の細菌(フィラデルフィア-1株)を、疾病管理予防セ
ンター(CDC)(アトランタ、GA)から入手し、Northeast Laboratory社(ウォタービ
ル、ME)から入手した活性炭添加酵母抽出物(charcoal-yeast extract：CYE)寒天
プレート上で、37℃で72時間培養した。細胞を、0.2％のNaN3を含有するリン酸
緩衝生理食塩水(「PBS」)pH 7.2とともに回収し、かつ8000rpmで25分間遠心処理
して回収した。得られた細胞ペレットを、使用時まで-20℃で貯蔵した。
【００１８】 このペレットからの湿潤細胞を、湿潤細胞1g当たり20mlの0.1M NaOHで懸濁し
、かつ室温で45分間攪拌した。その後溶液を、濃酢酸でpH 3.0に調整し、かつ溶
液を8000rpmで20分間遠心処理にかけた。この工程から得られた上清を、次にNaO
H水溶液で中和し、かつ蒸留水に対して透析した。
【００１９】 得られた透析物を、回転減圧蒸発装置において10倍に濃縮し、その後超音波浴
中で5分間音波処理した。
【００２０】 プロテイナーゼKを濃縮生成物1ml当たり0.2mgの濃度で添加し、残留タンパク
質を消化し、さらに混合物を一晩40℃でインキュベーションした。次の工程では
さらにプロテイナーゼKを混合物1ml当たり0.1mgの濃度で添加し、引き続きさら
に一晩40℃でインキュベーションした。この第二のインキュベーションの後、生
成物を回転蒸発装置において濃縮し小容量とし、0.2％トリエチルアミンでpH 10
〜11に調整し、こうして処理された混合物をPharmacia社のSephacryl S-200の0.
02％トリエチルアミンで平衡化したカラムに流した。最初のピークで溶離した物
質をプールし、0.1N NHClでほぼ中性のpHに調整し、かつ蒸留水に対して18時間
透析し、その後凍結乾燥した。
【００２１】 L.ニューモフィラ血清群1株フィラデルフィア-1の湿潤細胞16.5gからのO-多糖
質抗原の収量は、62mgであった。
【００２２】 プロテイナーゼKの代わりに、任意の広域のスペクトルのプロテアーゼ酵素調
製物を使用することができることに注目すべきである。この方法において重要な
ことは、妥当な制限時間内の実現可能性をできる限り最大化するために、抗原か
らタンパク質を除去することである。
【００２３】実施例II 実施例Iを、培養工程の細菌としてL.ニューモフィラ血清群5株ダラスIEを用い
て繰り返した。湿重量11.5gで、糖質抗原21mgを得た。後にこの方法を、培養工
程の細菌としてL.ニューモフィラ血清群5(U8W株)を用い、再度繰り返した。
【００２４】 本質的にタンパク質性物質を含まない糖質抗原を得るために、本明細書におい
て説明した培養工程および抽出工程を、任意の他のレジオネラ菌について、およ
び特に任意の他のL.ニューモフィラ血清群、すなわち血清群2、3、4および6〜15
を含む細菌について繰り返すことは、本発明の範囲内である。
【００２５】 抽出された多糖質抗原または糖質抗原がに由来する対応する細菌に対する多価
抗体のアフィニティ精製において使用するためのクロマトグラフィーカラムに、
実施例Iの本質的にタンパク質非含有のO-多糖質生成物または実施例IIの糖質を
結合させるためには、多糖質抗原または糖質抗原およびカラムの両方が安定して
結合し、かつそれ自身はアフィニティ精製工程期間は不活性であり続けることを
確実にするために適当に調製されたタンパク質スペーサー分子と、カラムを結合
することが必要である。好ましいスペーサー分子として、変性されたウシ血清ア
ルブミン(「BSA」)が選択され、かつ実施例IIIのように調製された。
【００２６】実施例III -- タンパク質スペーサー分子の調製 Aldrich Chemical社(ミルウォーキー、WI)から入手したヒドラジンニ塩酸塩の
0.5M水溶液を調製し、無水NaOHでpH 5.2に調整した。その後この溶液を、Sigma
Chemical社の無水BSAと混合し、最終濃度25mg／BSA mlとした。BSAを完全に溶解
した後、Fluka Chemical社(セントルイス、MO)から入手したN-(ジメチルアミノ
プロピル)-N1-エチルカルボジイミド塩酸塩を、最終濃度2.5mg/mlとなるよう添
加した。この混合物を、周囲温度で一晩攪拌し、次におよそ5日間蒸留水に対し
て4℃で、毎日水を交換しながら透析した。
【００２７】 この変性したBSAの代わりに、他の適当なスペーサー分子を使用することがで
きることが考察されている。
【００２８】 L.ニューモフィラ血清群1からのO-多糖質抗原のスペーサー分子への結合は、
以下のように行った。
【００２９】実施例IV - O-多糖質抗原のスペーサー分子への結合 L.ニューモフィラ血清群1の本質的にタンパク質非含有のO-多糖質抗原を、蒸
留水に濃度4〜5mg/mlとなるよう溶解し、かつ1M HClでpH 5.0に調整した。実施
例IIIで調製した変性したBSA溶液を、1M HClでpH5.0に調整し、かつこれにO-多
糖質抗原溶液を重量比4:1となるよう静かに添加した。5分間攪拌した後、実施例
IIIにおいて言及したN-(ジメチルアミノ-プロピル)-N1-エチルカルボジイミド塩
酸塩を含有する蒸留水約100〜200mclを、O-多糖質抗原／BSA溶液の重量比1:2で
添加した。得られた混合物を、周囲温度で一晩攪拌した。
【００３０】 若干の未反応物質が存在するものからO-多糖質抗原と変性したBSAとの複合体
を分離するために、反応混合物を、緩衝液0.1M NaH2PO4：0.5M NaClで平衡化し
たSepharose CL-4Bカラム上でクロマトグラフィーにかけた。クロマトグラフィ
ーの全ての画分について、先に言及した市販のBinax EIA試験を用いて抗原活性
を試験した。試験した抗原活性を示す全ての画分をプールし、かつ実施例Vに示
されるようなアフィニティカラム調製に使用した。
【００３１】実施例V -- 活性化されたクロマトグラフィーカラムへの複合体の結合 免疫吸着剤ゲルを、常法に従い臭化シアンで活性化しているSepharose CL-4B
により調製した。実施例IVにおいて調製されたO-多糖質抗原と変性したBSAのリ
ガンドを、例えばHermanson, G.T.ら、Immobilized Affinity Ligand Technique
s、53-56ページ(Academic Press社、1992年)に記されているような、当技術分野
において公知の方法を用いてこれに結合した。その後ゲルをカラムに充填し、連
続して5〜10容量／ゲル容量のPBS(pH7.2)、3倍強度(triple strength)のPBS(pH7
.2)および0.2Mグリシン-HCl(pH2.5)で洗浄した。得られた活性化カラムを下記の
ように、L.ニューモフィラ血清群1抗原に対する多価抗体のアフィニティ精製の
ために使用した。溶離後カラムを、PBSまたは他の中性緩衝液中で、使用時まで
保存した。
【００３２】 この工程では、臭化シアンで活性化されたSepharoseの代わりに、スフェレロ
ース(spherelose)および様々な市販の活性化されたカラムを使用することができ
る。
【００３３】実施例VI -- 抗体のアフィニティ精製 Harlow E.およびLane, Dの著書「抗体：実験マニュアル（Antibodies: A Labo
ratory Manual）」の313〜315ページ(Cold Spring Harbor Laboratory、1988年)
に記された方法に従い、実施例Vに説明した活性化カラムを、L.ニューモフィラ
血清型1抗原に対するウサギ-抗-L.ニューモフィラ血清群1多価抗体のアフィニテ
ィクロマトグラフィーに使用した。カラムからの抗体の溶離は、0.2Mグリシン-H
Cl緩衝液(pH2.5)で行った。別の溶離液、例えば3M NaSCNまたは0.1M Et3Nに置き
換えることができる。
【００３４】 これらのアフィニティ精製抗体を、下記実施例に説明したように、L.ニューモ
フィラ血清群1に特異的なICT試験に用いた。
【００３５】実施例VII -- ICT装置およびその調製A.試験装置の調製 ： 試験結果と対照結果の両方が見えるようにウインドウを取付けたヒンジ付きの
厚紙ハウジングを備えた試験装置を、図1のように調製した。この装置は、右側
に試料で湿潤したスワブを受け取るための、予め形成されたプラスチック製スワ
ブウェルが配置された窪みを有する(図面では印1で示される)。次に図1A中に示
したオーバーラベル(overlabel)を、装置の右側面全体の上に配置した。このオ
ーバーラベルには、2個の穴が備えられている：飽和したスワブが挿入されてい
る下側の穴(図1Aの印B)、および穴Bへの挿入後にスワブが押される方向の上側の
穴(図1Aの印B)。オーバーラベルとその穴AおよびBの位置、ならびにスワブウェ
ルは共同して、アッセイ期間中スワブを適当な位置に保持し、かつスワブから収
着された(sorbed)液体の排除を促進する。
【００３６】 以下に説明したように予め集成された試験細片（test strip）(図1の印C)が、
窪み(図1の印2)に挿入され、かつその底に塗布された接着剤によりその位置に保
持される。図1Bに示されたオーバーラベルを、左側面の一番上に配置する。これ
は、アッセイ実行のために装置を閉じると、右側面の穴Aに一致する1個の穴(図1
Bの印D)を備えている。
【００３７】 前述の集成装置は、使用時まで、乾燥剤と共に密封した小袋中に保存されてい
る。小袋を密封し保存する前に、装置の右側半面の外側端に軽く接着テープをつ
けておく。
【００３８】B.予め集成された試験細片の構造および調製 図1Cは、予め集成された細片の構造を示している。これは、前述の金粒子とア
フィニティ精製されたウサギ抗-レジオネラ・ニューモフィラ血清群1抗体の複合
体が含浸されている収着媒材料の複合体パッドで構成されている。このパッドと
接触してニトロセルロースパッドがあり、その上には、該複合体と反応する試料
の捕獲線(capture line)が、前述のように調製された、アフィニティ精製された
ウサギ抗-L.ニューモフィラ血清群1抗体の細片を包埋することにより確立されて
いる。このニトロセルロースパッドはさらに、ヤギ抗-ウサギ免疫グロブリン(Ig
G)を有するパッドをストリッピング（striping）することにより確立されている
下側(downstream)の対照線も有している。ニトロセルロースパッドの次に、細片
の末端に、液体の貯蔵庫として利用される吸着パッドが続いている。この装置を
容易に運搬するために、これらのパッドは全て、接着細片により裏打ちされてい
る。
【００３９】 この複合体パッドは、通常、非織のポリエステルまたは押出成形された酢酸セ
ルロースから製造される。測定で使用するこのパッドを調製するために、直径50
nmの金粒子を、前述のように調製したアフィニティ精製されたウサギ抗-レジオ
ネラ・ニューモフィラ血清型1抗体に結合した。この複合体は、DeMay in Polak,
J.M.およびVan Norden. S. (編)、「免疫化学：現行法と適用（Immunochemistr
y: Modern Methods and Application）」(Wright, Bristol, 英国、1986年)に記
されたような公知の方法を用いて行うことができる。金複合粒子は、1.0％BSA、
0.1％Triton X-100、2.0％Tween 20、6.0％ショ糖および0.02％アジ化ナトリウ
ムを含有するpH8.0の5mMテトラホウ酸ナトリウム水溶液からなる乾燥化剤と混合
される。このパッドを、存在する液体の全てを除去するのに十分な程度に加熱し
、かつ試験細片の集成を待つ間低湿環境に保存する。これらのパッドおよびそれ
らの処理は、特にパッドが乾燥した複合体を保持し、かつ後に試料により湿らせ
られた場合にのみこれを放出するように選択される。
【００４０】 ニトロセルロースパッドは、最初にリン酸緩衝生理食塩水の担体溶液を用い、
その第一の部分のアフィニティ精製したウサギ抗L.ニューモフィラ血清型1抗体
の細片を包埋することにより処理される。これらの抗体は、捕獲線として作用す
る。集成された試験装置の第一部分の下側のパッドの第二部分においては、対照
線が、パッドの表面の同一の担体溶液中でヤギ抗-ウサギIgGをストリッピングす
ることにより確立される。その後ニトロセルロースパッドを18〜25℃で乾燥し、
それへのタンパク質の細片（strip）の永久の吸着を促進する。
【００４１】 使用される吸着パッドは、Ahlstrom 939の名称で販売されている市販のセルロ
ース材料である。このパッドは、特別な処理を必要としない。
【００４２】C. キットの調製 市販されているように、完成した試験細片を備えた試験装置が集成されている
。実際には、多くの装置は、繊維状のDacronから形成された同数のスワブおよび
試薬Aを滴下するのに適した蓋が装備された「試薬A」ボトルと共に包装されてい
る。「試薬A」は、0.05Mクエン酸ナトリウム−リン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)
中の2.0％Tween 20、0.05％アジ化ナトリウム、および0.5％ドデシル硫酸ナトリ
ウムの溶液である。陽性および陰性対照も、各キットに含まれている。
【００４３】 L.ニューモフィラ血清群1抗原を同定するための完成した試験装置の使用は、
下記実施例VIIIに詳細に説明されている：
【００４４】実施例VIII -- L.ニューモフィラ血清群1抗原のICT試験の実施 実際には、各装置に備えられたスワブを、液体試料中に、スワブヘッドが完全
に浸漬されるように浸す。尿、血液、リンパ液などの液体生体試料中、ならびに
液体環境試料中に存在する不溶性の固形、半固形、およびコロイド状物質のため
にフィルターとして作用するようなスワブの使用は、1998年3月19日に出願され
たNorman MooreおよびVincent Syの同時係属出願であり、間もなくBinax社に譲
渡されるであろう、米国特許出願第09/044,677号の主題である。スワブは、装置
の底の穴(図1Aの印B)に挿入され、かつゆっくり上側に押し上げられ、その結果
スワブの先端が上側の穴(図1Aの穴A)の中に見えるようになる。試薬Aのバイアル
を、穴Bの上に垂直に保持し、かつ試薬Aを2滴静かに加える。その後接着性裏当
てを迅速に装置の右端から剥がし、かつ装置を閉じ固く密閉し、次にスワブウェ
ル中のスワブを金複合体パッドに対して押し付ける。15分後、結果を装置のウイ
ンドウに読むことができる。陰性試料（すなわち、L.ニューモフィラ血清群1抗
原を含まない）は、ウインドウの上側半分に対照線のみを示すであろう。標的抗
原を含有する陽性試料は、2本の線を示し、そのうちの下側の線は、患者(または
試料)の線であり；かすかな試料線であったとしても、試料中の標的抗原の存在
を示している。15分後にウインドウに線が全く現れないか、またはウインドウの
下側部分に試料線のみ現れる場合は、その試験は無効であり、再試験しなければ
ならない。
【００４５】 前述の方法を用いて、実施例VIIに示されたように調製された装置を、患者300
名の尿試料について説明通りのICT法において試験したが、その中の100例につい
ては、あらかじめL.ニューモフィラ血清群1感染症と診断されていた。
【００４６】 本発明のこれらのICT試験は、個人で実施されたICT試験について、先に行われ
た診断結果がわからないような状況で行われた。全体で、ICT試験の98％は、先
に得られた陽性診断と一致していた。さらに全体で、先にL.ニューモフィラ血清
群1抗原について陰性と診断された尿試料の98％が、実施例VIIに説明したICT装
置を用い、本明細書で記載されたICT法により試験された場合に、これに一致す
る結果をもたらした。
【００４７】実施例IX -- 環境試料を試験するためのICTの使用 同じくL.ニューモフィラ血清群1を含有することが疑われる環境試料をこれと
同一の試験における適用性について下記のように調べた。
【００４８】 水を、市販の供給業者から得たL.ニューモフィラ血清群1菌と共に播種した。
この混合物を、0.22μmフィルターを通してろ過し、濃縮した。この試料に浸し
たスワブを、前述の装置に施用し、装置を閉じ、測定を進めた。陽性結果が、15
分未満で認められた。
【００４９】実施例X - L.ニューモフィラ血清群1、2、4および5の交差反応性糖質抗原の検出
のためのウェスタンブロット免疫アッセイ法 Bio-Rad Laboratories社から購入したキットを用いてウェスタンブロット免疫
アッセイ法を行うために、L.ニューモフィラ血清群5細胞を、実施例IIのように
培養した。これらの細胞の懸濁液を、10mMメルカプトエタノールの存在下で1％
ドデシル硫酸ナトリウムで、100℃で5分間溶解した。可溶化した細胞をプロテア
ーゼKで処理し、かつその後Bio-Rad社により示された標準的方法に従いタンパク
質の電気泳動による分離を行った。
【００５０】 実施例IVに記した方法で、L.ニューモフィラ血清群5由来の糖質抗原を、実施
例IIIに示されたスペーサー分子に結合し、かつ実施例Vに記載した活性化Sephar
oseカラムに流した。その後このカラムを、実施例VIの方法を用いて、L.ニュー
モフィラ血清群5の糖質抗原に対して特異的な多価ウサギ抗体(これは通常、L.ニ
ューモフィラ血清群5を含有するタンパク質を以前に注射したウサギ血清から得
られた)のアフィニティ精製に使用した。
【００５１】 ウェスタンイムノブロット分析を、Bio-Rad社の試薬キットを用い、製造業者
の指示に従い行った。簡単に述べると、L.ニューモフィラ抗原1、2、4および5の
PBS細胞抽出物に、12％ポリアクリルアミドゲルにおいてSDS-PAGEを行い、1％BS
Aを含むPBSでブロッキングし、ニトロセルロース膜にPBSに転写した。この工程
の後、膜を、L.ニューモフィラ血清群5の糖質に特異的なアフィニティ精製抗体
と共にインキュベーションした。この膜を、製造業者の推奨に従い洗浄し、かつ
Bio-Rad社から提供されたヤギ-抗-ウサギ抗体に結合した西洋ワサビペルオキシ
ダーゼと共にインキュベーションした。洗浄後、膜を、2.9mM過酸化水素を含有
する0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液(pH6.9)を溶媒とする0.022M 4-クロロ-1-ナ
フトールおよび0.0012M N,N-ジメチル-p-フェニレン-ジアミン一塩酸塩の基質シ
ステムにより染色した。図2は、以下のL.ニューモフィラ抗原を含むPBS抽出物に
対するL.ニューモフィラ血清群5のアフィニティ精製抗体についての、ウェスタ
ンブロットアッセイの結果を、予じめ染色されたSDS-PAGE標準品(レーン5)と比
較して示している： レーン1および7--L.ニューモフィラ血清群2 (トーガス(Togus)-1株) レーン2および8--L.ニューモフィラ血清群4 (ロスアンジェルス-1株) レーン3および6--L.ニューモフィラ血清群1 (フィラデルフィア-1株) レーン4および9--L.ニューモフィラ血清群5 (U8W株)。
【００５２】 レーン1-4のアフィニティ精製した抗体は、L.ニューモフィラ血清群5(U8W株)
由来の糖質抗原が付着されたカラム上でアフィニティ精製され、また、レーン6
〜9は、L.ニューモフィラ血清群5(ダラスIE株)の糖質抗原が付着しているカラム
上でも同様に精製されたことを示している。
【００５３】 図2は、本明細書において開示されたようなL.ニューモフィラ血清群5のアフィ
ニティ精製した抗体が、L.ニューモフィラ血清群5に加え、L.ニューモフィラ血
清群1、2および4の抗原と反応することを明確に示している。
【００５４】 L.ニューモフィラ血清群5由来のアフィニティ精製抗体が、L.ニューモフィラ
血清群1のアフィニティ精製抗体と置き換えられるような前述のICTアッセイ法も
考察されている。
【００５５】 概して免疫化学の分野の業者、および特に免疫アッセイの業者は、本明細書に
おいて特に推奨されたもの以外の材料および成分、ならびに時には他の方法工程
で容易に置き換えられることを認めると思われる。特許および特許以外の両方に
おける非常に多くの文献は、本明細書において説明されかつ推奨された好ましい
ICT装置と交換することができる、信頼できる一回使用の使い捨て免疫アッセイ
試験装置のデザインおよび使用について検討している。本発明は、特許請求の範
囲において限定される範囲以外に、代用可能なアッセイ装置、材料、成分または
方法工程を限定することは意図されていない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１および関連図1A、1Bおよび1Cは、実施例VII、VIIIおよびIX
に記された、L.ニューモフィラ血清群1に特異的アッセイ法の実施に適するよう
に適合された典型的ICT装置の構造を示している。
【図２】 L.ニューモフィラ血清群1、2、4および5のリン酸緩衝生理食塩水
抽出物と、L.ニューモフィラ血清群5、血清群5抗原に対し特異的な本質的にタン
パク質非含有の糖質抗原−アフィニティ精製ポリクローナル抗体とのウェスタン
ブロット分析の結果を示し、この分析は実施例Xに記されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/531 Ｇ０１Ｎ 33/531 Ａ 33/543 ５２１ 33/543 ５２１ ５４１ ５４１Ｚ 33/569 33/569 Ｆ //(Ｃ１２Ｐ 19/04 (Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＴ，ＡＵ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＮ，ＪＰ，ＫＲ，ＬＵ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＵ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＺＡ Ｆターム(参考） 4B064 AF11 AG27 CA02 CA10 CE02 CE12 DA15 4H045 AA11 AA30 CA42 DA76 EA52 EA61 GA26

Claims (58)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記の段階を含む、公知のレジオネラ種、または種の血清群
    の細菌から本質的にタンパク質非含有の糖質または多糖質抗原を得る方法： (a)望ましい大きさの試料を得るのに必要な時間において細菌を培養する段階
    、およびそこから細菌細胞を湿潤細胞ペレットの形状で回収する段階； (b)湿潤細胞ペレットを、アルカリ溶液中に懸濁する段階、および混合する段
    階； (c)pHを強酸により酸性pHに調整する段階、および遠心処理する段階； (d)段階(d)の上清を分離し、そのpHをほぼ中性に調整する段階； (e)この生成物を広域スペクトルを有するプロテアーゼ酵素で消化し、残留タ
    ンパク質を破壊する段階； (f)pHを弱アルカリ溶液でアルカリ側に調整する段階； (g)本質的にタンパク質非含有の糖質または多糖質抗原を、弱アルカリ溶液で
    平衡化したサイズ排除カラム上で分離する段階；ならびに (h)最初のピークで溶離した物質をプールする段階、およびそのpHをほぼ中性
    に調整する段階。
  2. 【請求項２】 細菌がL.ニューモフィラ血清群1であり、かつ回収された本
    質的にタンパク質非含有の抗原が、L.ニューモフィラ血清群1の本質的にタンパ
    ク質非含有のO-多糖質抗原である、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 細菌がL.ニューモフィラ血清群5であり、かつ回収された本
    質的にタンパク質非含有の抗原が、L.ニューモフィラ血清群5の糖質抗原である
    、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 請求項１記載の方法により、L.ニューモフィラの種、または
    種の血清群から得られた細菌の本質的にタンパク質非含有の糖質または多糖質抗
    原。
  5. 【請求項５】 請求項２記載の方法により得られた、L.ニューモフィラ血清
    群1の本質的にタンパク質非含有のO-多糖質抗原。
  6. 【請求項６】 請求項３記載の方法により得られた、L.ニューモフィラ血清
    群5の本質的にタンパク質非含有の抗原。
  7. 【請求項７】 段階(b)のアルカリ溶液が、0.1M水酸化ナトリウム水溶液中
    に湿潤細胞ペレットを約20ml/g含有する、請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 段階(c)において、pHが約3.0に調整される、請求項１記載の
    方法。
  9. 【請求項９】 段階(f)において、pHが約10〜約11の間に調整される、請求
    項１記載の方法。
  10. 【請求項10】 段階(h)の後に凍結乾燥段階を行う、請求項１記載の方法。
  11. 【請求項11】 下記の段階を含む、レジオネラ菌の種、または種の血清群に
    対する粗抗体の精製法： (a)レジオネラ菌の同一の種、または種の血清群から、本質的にタンパク質非
    含有の糖質または多糖質抗原を分離する段階； (b)該抗原を、2個の末端を持つスペーサー分子の一方の端に結合し、該本質的
    にタンパク質非含有の抗原とスペーサー分子との複合体を形成する段階； (c)複合体を、活性化されたクロマトグラフィーカラムに結合させる段階； (d)段階(c)の該カラム上で、該粗抗体をアフィニティクロマトグラフィーにか
    けて、精製された抗原特異的抗体を得る段階； (e)精製された抗原特異的抗体を該カラムから溶離させる段階。
  12. 【請求項12】 粗抗体が、L.ニューモフィラ血清群1抗原に対する抗体であ
    り、かつ本質的にタンパク質非含有の糖質または多糖質抗原が、請求項５記載の
    本質的にタンパク質非含有のO-多糖質抗原である、請求項６記載の方法。
  13. 【請求項13】 粗抗体が、L.ニューモフィラ血清群5抗原に対する抗体であ
    り、かつ本質的にタンパク質非含有の糖質または多糖質抗原が、請求項６記載の
    本質的にタンパク質非含有の糖質抗原である、請求項６記載の方法。
  14. 【請求項14】 請求項12記載の方法により生成された、L.ニューモフィラ血
    清群1およびその抗原に対する精製された抗原特異的抗体。
  15. 【請求項15】 請求項13記載の方法により生成された、L.ニューモフィラ血
    清群5およびその抗原に対する精製された抗原特異的抗体。
  16. 【請求項16】 レジオネラの種、または種の血清群に対する粗抗体のアフィ
    ニティ精製のためのクロマトグラフィーカラムであって、スペーサー分子と、抗
    体が反応性であるようなレジオネラの同一の種、または種の血清群の本質的にタ
    ンパク質非含有の多糖質または糖質抗原との複合体が、スペーサー分子によりそ
    れに結合している、クロマトグラフィーカラム。
  17. 【請求項17】 本質的にタンパク質非含有の多糖質または糖質抗原が、L.ニ
    ューモフィラ血清群1の本質的にタンパク質非含有のO-多糖質抗原である、請求
    項16記載のクロマトグラフィーカラム。
  18. 【請求項18】 本質的にタンパク質非含有の多糖質または糖質抗原が、L.ニ
    ューモフィラ血清群5の本質的にタンパク質非含有の糖質抗原である、請求項16
    記載のクロマトグラフィーカラム。
  19. 【請求項19】 請求項11記載の方法により得られたL.ニューモフィラの少な
    くとも1つの種、または種の血清群の細菌に対する、精製された抗原特異的抗体
    。
  20. 【請求項20】 下記の段階を含む、液体中のレジオネラ菌またはその抗原性
    成分の存在におけるアッセイ法： (a)公知のレジオネラ菌の種、または種の血清群の培養物から、本質的にタン
    パク質非含有の多糖質または糖質抗原を抽出する段階； (b)該本質的にタンパク質非含有の抗原を、スペーサー分子に結合させて、複
    合体を形成する段階； (c)段階(b)から得られた複合体を、クロマトグラフィーアフィニティカラムに
    結合させる段階； (d)該公知のレジオネラ菌に対する粗抗体を、段階(c)のクロマトグラフィーア
    フィニティカラムで精製し、精製された抗原特異的抗体を生成する段階；および (e)段階(d)において精製された抗体を使用し、液体中の対応するレジオネラ菌
    もしくはそれらの抗原が存在するか否かを検出する段階。
  21. 【請求項21】 段階(b)のスペーサー分子がタンパク質分子である、請求項2
    0記載の方法。
  22. 【請求項22】 公知のレジオネラ菌が、レジオネラ・ニューモフィラの血清
    群の1つに由来する細菌である、請求項20記載の方法。
  23. 【請求項23】 公知のレジオネラ菌が、L.ニューモフィラ血清群1の細菌で
    あり、段階(a)において得られた抗原が、その本質的にタンパク質非含有のO-多
    糖質抗原であり、かつ段階(d)から得られたL.ニューモフィラ血清群1細菌に対す
    る精製抗体が、段階(e)において液体中のL.ニューモフィラ血清群1細菌もしくは
    その抗原が存在するか否かについて測定するために使用される、請求項22記載の
    方法。
  24. 【請求項24】 段階(e)の液体が水である、請求項23記載の方法。
  25. 【請求項25】 段階(e)の液体が哺乳類を起源とする天然の液体である、請
    求項23記載の方法。
  26. 【請求項26】 液体がヒト尿である、請求項25記載の方法。
  27. 【請求項27】 液体が肺炎型疾患の臨床徴候を示している患者から得られる
    、請求項26記載の方法。
  28. 【請求項28】 段階(e)が免疫アッセイ法である、請求項27記載の方法。
  29. 【請求項29】 段階(e)がイムノクロマトグラフィー(「ICT」)アッセイ法で
    ある、請求項28記載の方法。
  30. 【請求項30】 段階(d)から得られた精製された抗原特異的抗体の一部が、
    該抗体が対応する抗原と反応する場合に可視色を呈することが公知である標識物
    質と結合している、請求項29記載の方法。
  31. 【請求項31】 標識物質が細かく粉砕された金属性の金である、請求項30記
    載の方法。
  32. 【請求項32】 公知のレジオネラ菌が、L.ニューモフィラ血清群5の細菌で
    あり、段階(a)において得られた抗原が、その本質的にタンパク質非含有の糖質
    抗原であり、かつ段階(d)から得られた精製抗体が、液体中に血清群1、2、4およ
    び5からのL.ニューモフィラ細菌またはそれらの抗原性成分を検出することが可
    能である、請求項22記載の方法。
  33. 【請求項33】 L.ニューモフィラ血清群5に対する精製された多価抗体が、
    液体中のL.ニューモフィラ血清群1、2、4および5細菌またはそれらの抗原のいず
    れかまたは全ての存在のアッセイのために使用される、請求項32記載の方法。
  34. 【請求項34】 液体が水である、請求項33記載の方法。
  35. 【請求項35】 段階(e)が免疫アッセイ法である、請求項33記載の方法。
  36. 【請求項36】 段階(e)がイムノクロマトグラフィー(「ICT」)アッセイ法で
    ある、請求項35記載の方法。
  37. 【請求項37】 段階(d)から得られた精製された抗原特異的抗体の一部が、
    該抗体が対応する抗原と反応する場合に可視色を呈することが公知である標識物
    質と結合している、請求項36記載の方法。
  38. 【請求項38】 標識物質が細かく粉砕された金属性の金である、請求項37記
    載の方法。
  39. 【請求項39】 検出物質が、公知のレジオネラ菌から得られた本質的にタン
    パク質非含有の糖質または多糖質抗原の複合体が結合されているクロマトグラフ
    ィーアフィニティカラム上において粗抗レジオネラ抗体の精製により得られた抗
    原特異的レジオネラ抗体から成り、レジオネラ菌の少なくとも1つの種もしくは
    種の血清群、または液体培地内においてその抗原の存在を検出する方法。
  40. 【請求項40】 抗原特異的レジオネラ抗体が、L.ニューモフィラ血清群に対
    する抗体であり、かつ複合体が、同一のL.ニューモフィラ血清群の細菌から得ら
    れた本質的にタンパク質非含有の糖質または多糖質抗原の複合体である、請求項
    39記載の方法。
  41. 【請求項41】 L.ニューモフィラ血清群が、血清群1である、請求項40記載
    の方法。
  42. 【請求項42】 L.ニューモフィラ血清群が、血清群5である、請求項40記載
    の方法。
  43. 【請求項43】 請求項39記載の免疫アッセイ法。
  44. 【請求項44】 請求項40記載の免疫アッセイ法。
  45. 【請求項45】 請求項41記載の免疫アッセイ法。
  46. 【請求項46】 請求項42記載の免疫アッセイ法。
  47. 【請求項47】 請求項43記載のICT法。
  48. 【請求項48】 請求項44記載のICT法。
  49. 【請求項49】 請求項45記載のICT法。
  50. 【請求項50】 請求項46記載のICT法。
  51. 【請求項51】 下記の段階を含む、レジオネラ菌の少なくとも1つの種もし
    くは種の血清群、または該細菌の抗原を検出するためのICTアッセイ法： (a)該細菌またはそれらの抗原を含有すると疑われる液体試料を、 (i)(1)抗体とそれらに対応する抗原性結合パートナーとの反応時に、可視色
    の変化を示す標識物質；および (2)検出しようとするレジオネラ種、または種の血清群に対する、精製さ
    れた抗原特異的抗体であって、検出しようとするレジオネラ種、または種の血清
    群の本質的にタンパク質非含有の糖質または多糖質抗原が結合しているクロマト
    グラフィーアフィニティカラム上を通過することにより精製されている抗体 からなる複合体が包埋されているゾーンと、 (ii)結合していない形状の同一の精製された抗原特異的抗体が結合されてお
    り、このゾーンが可視色の変化を調べるためのウインドウを備える、第二ゾーン
    とを有する、 吸湿性材料の細片（strip）を含むICT装置と接触する段階； (b)該試料を、試験細片に沿って、該第一ゾーンまで側方に流す段階； (c)該試料を、アフィニティ精製した抗体および標識物の複合体とともに、該
    試験細片に沿って、該第二ゾーンまで側方に流す段階；ならびに (d)段階(a)開始から約15分以内に、色の線が該第二ゾーンに出現したかどうか
    が該ウインドウから観察され、これにより検出しようとしているレジオネラ菌の
    種、または種の血清群における試料中の存在を示す段階。
  52. 【請求項52】 レジオネラ菌の少なくとも1つの種、または種の血清群を含
    有することが疑われる液体が水である、請求項51記載の方法。
  53. 【請求項53】 レジオネラ菌の少なくとも1つの種、または種の血清群を含
    有することが疑われる液体が、哺乳類を起源とする天然の液体である、請求項51
    記載の方法。
  54. 【請求項54】 哺乳類を起源とする天然の液体がヒト尿である、請求項51記
    載の方法。
  55. 【請求項55】 抗体とそれらに対応する抗原性結合パートナーとの反応時に
    可視色の変化を示す標識物質が、細かく粉砕された金属である、請求項54記載の
    方法。
  56. 【請求項56】 標識物質が、細かく粉砕された金である、請求項55記載の方
    法。
  57. 【請求項57】 検出されるべき細菌またはその抗原が、L.ニューモフィラ血
    清群1であり、精製された抗原特異的抗体が、L.ニューモフィラ血清群1に対する
    抗体であり、抗体の精製に使用されるクロマトグラフィーカラムに結合された本
    質的にタンパク質非含有の抗原が、L.ニューモフィラ血清群1の本質的にタンパ
    ク質非含有のO-多糖質抗原である、請求項56記載の方法。
  58. 【請求項58】 精製された抗原特異的抗体が、L.ニューモフィラ血清群5に
    対する抗体であり、かつ抗体の精製に使用されるクロマトグラフィーカラムに結
    合された本質的にタンパク質非含有の抗原が、L.ニューモフィラ血清群5の本質
    的にタンパク質非含有の糖質抗原である、請求項56記載の方法。
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