ES2283129T3 - Metodo para deteccion de bacteria de legionela empleando anticuerpos especificos de antigeno purificados. - Google Patents
Metodo para deteccion de bacteria de legionela empleando anticuerpos especificos de antigeno purificados. Download PDFInfo
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Abstract
Un método de ensayo de la presencia de una bacteria Legionela o su componente antigénico de carbohidrato en un fluido, cuyo método comprende los siguientes pasos: (a) Cultivar células bacteriales de un cultivo de una especie conocida, un serogrupo de una especie, de bacteria Legionela en la forma de un gránulo de célula húmedo. (b) Suspender el gránulo de célula húmedo en un gramo por 20 ml en una solución alcalina acuosa, conteniendo dicha solución alcalina acuosa 0.1 M de hidróxido sódico acuoso, y mezclándolo durante 45 minutos, seguido de la adición de ácido fuerte para ajustar el pH al pH ácido y centrifugar. (c) Separar el sobrenadante del paso (b), ajustar su pH a la neutralidad y añadirle una preparación de enzima de proteasa de amplio espectro, (d) Digerir la enzima de proteasa de amplio espectro - mezcla sobrenandante neutralizada del paso (c) para destruir las proteínas residuales, (e) Añadir a la mezcla digerida del paso (d) de una solución acuosa ligeramente alcalina para ajustar el pH al lado alcalino, separando un antígeno de carbohidrato libre de proteína sobre una columna de exclusión de tamaño equilibrada con una solución ligeramente alcalina y reuniendo material eluído en el primer pico y ajustar su pH a la neutralidad, (f) Recuperar el antígeno carbohidrato libre de proteína de la solución acuosa neutral del paso (e) y enlazar este antígeno con una molécula espaciadora para forma un conjugado; (g) Enlazar el conjugado del paso (f) a una columna de afinidad cromatográfica, (h) Purificar anticuerpos sin tratar con la misma especie o serogrupo de una especie de bacteria de Legionela usada en el paso (a) pasándolos por la columna de afinidad cromatográfica del paso (g) habiéndose unido a la misma el conjugado de molécula separadora y antígeno de carbohidrato libre de proteína del paso (f), produciendo así anticuerpos específicos de antígeno purificados, y; (i) Usar los anticuerpos purificados del paso (h) para detectar la presencia de una pareja de enlace antigénica para estos anticuerpos en una muestra de test de fluido sospechosa de contenerlo.
Description
Método para detección de bacteria de Legionela
empleando anticuerpos específicos de antígeno purificados.
Esta invención se refiere a carbohidrato libre
de proteína, que incluye antígenos polisacáridos separados de la
bacteria Legionela, y especialmente a serogrupos y/o cepas de
Legionela neumófila, que incluye el antígeno
O-polisacárido de L. Neumófila serogrupo 1, y al
uso de estos antígenos en la purificación de afinidad de
anticuerpos polivalentes correspondientes a organismos Legionela.
Más en particular, la invención comprende la unión del carbohidrato
o antígeno polisacárido separados de una bacteria Legionela con una
columna cromatográfica activada y el uso de esta columna para
purificación de afinidad de los anticuerpos policlonales con las
mismas especies, o el mismo serogrupo de una especie, de Legionela.
La invención además comprende el uso de los anticuerpos
polivalentes purificados por afinidad producidos en ensayos
inmunoquímicos para la detección de enfermedades causadas por
Legionela tales como enfermedad de los Legionarios y fiebre de
Pontiac en pacientes humanos y para la detección de fuentes
medioambientales de agentes infecciosos de Legionela.
La enfermedad de los Legionarios, una infección
humana similar a la neumonía causada por la bacteria
gram-negativa del género Legionela, resulta
virtualmente imposible de diferenciar sobre una base clínica fiable
(que implica el análisis de los síntomas del paciente sin pruebas
de laboratorio) de la neumonía u otras infecciones similares del
pulmón. Debido a que la enfermedad puede provocar abscesos de
pulmón, infecciones en otros órganos del cuerpo o bacteriemia, y
debido también a que su tasa de mortalidad aumenta
considerablemente por retrasos en el inicio de una apropiada
terapia, existe la necesidad de crear pruebas de diagnóstico
rápidas y fiables que hasta la fecha sólo se han conseguido
parcialmente. Stout, J. E y Yu, V.L, "Legionellosis", 337, N.
Eng. J. Med. 682-687 (1997). Los esfuerzos por
desarrollar tales pruebas se han visto dificultados por el hecho de
que hay un número de especies Legionela, algunas de las cuales
parecen tener un número de distintos serogrupos.
La enfermedad de los Legionarios se reconoció
por primera vez en el verano de 1976 y en el ínterin se han
desarrollado una serie de técnicas para detectar Legionela (L)
neumófila que ahora se sabe que corresponde al 90% de los casos
(Stout y Yu, supra). En general, estas pruebas han supuesto
demasiado tiempo y han sido de incapaces de identificar más de un
serogrupo de los 15 serogrupos conocidos hasta ahora
correspondientes a la especie L. Neumófila. Sin embargo, hay que
indicar que, tal y como afirmaron Stout y Yu, supra, más del
80% de los casos detectados como enfermedad de los Legionarios se
atribuyen a L. Neumófila serogrupo 1, un hecho que provocó el
desarrollo de un rápido y fiable inmunoensayo para esa entidad de
particular importancia que ha llevado a los científicos a centrarse
en ella como una prioridad.
Los primeros esfuerzos para establecer la
identidad del agente causativo de la enfermedad de los Legionarios
dependieron en gran parte del cultivo de bacterias durante 5 o 6
días y del examen de los cultivos microscópicamente. Los esfuerzos
por acelerar el proceso de identificación llevaron a numerosas
pruebas inmunoquímicas de variación de sensibilidad y especificidad
que incluían, entre otros, el inmunoensayo disponible actualmente en
el mercado EQUATE^{TM} ("RIA"), y el inmunoensayo de enzima
Binax ("EIA"), y ambos se venden en forma de kit por el
cesionario del solicitante, Binax, Inc. Como se indica por Hackman,
B.A. et al. En "Comparison of Binax Legionella Urinary
Antigen EIA Kit with Binax RIA Urinary Antigen Kit for Detection of
Legionella pneumophila Serogroup I Antigen", 34 J. Clin.
Microbiol. 1579-1580 (1996), estos dos ensayos
resultaron ser específicos para L. Neumófila Serogrupo 1 antígeno.
La sensibilidad mostrada por EIA fue del 77%; la del RIA fue más
elevada. El artículo indica que cada uno puede llevarse a cabo en
menos de 3 horas desde el inicio hasta el final; en las propias
pruebas de Binax, cada uno precisa de al menos 2 horas y media para
llevarse a cabo. Más información sobre este ensayo EIA se puede
encontrar en Kazandjian. D. Et al., "Rapad Diagnosis of
Legionella pneumophila Serogroup I Infection with Binax
Enzyme Immunoassay Urinary Antigen Test", 35. J. Clin.
Inmunobiol. 954-956 (1997), en resúmenes de la
reunión general de la sociedad americana de microbiología, The
Society, Washington DC, US, Vol. 98, mayo 1998
(1998-05), p. 203, Moore N. et al. Que
trataba sobre "el desarrollo de un ensayo inmunocromatográfico
(ICT) para la detección de Legionela neumófila" por Binax, Inc.
El ensayo se ha desarrollad en formato de membrana de lujo lateral
(ICT) y se dirige al análisis de Legionela neumófila serogrupo 1. El
antígeno de carbohidrato de pureza 95% fue aislado y se unió con
una matriz Sefarosa 4B. Se cultivaron anticuerpos para conejos, se
purificaron para afinidad, se inmovilizaron y se conjugaron con oro
coloidal para obtener un ensayo ICT.
Quizás la ventaja más significativa del test
inmunocromatográfico (ICT) aquí descrito es su habilidad para dar
un resultado en un lapso de tiempo de 15 minutos para la presencia
o ausencia de L. Neumófila Serogrupo 1 (o su antígeno), cuyo
resultado es de elevada especificidad y sensibilidad. Esta velocidad
con la que la prueba puede ser llevada de manera fiable y segura
para producir un resultado de elevada especificidad y sensibilidad
se cree que se debe a la naturaleza fuertemente reactiva de los
anticuerpos purificados de afinidad preparados de acuerdo con la
invención. Las propiedades superiores reactivas de estos
anticuerpos, sin embargo, pueden atribuirse al uso de purificación
de afinidad de la novedad, esencialmente antígeno
O-polisacárido libre de proteína de L. Neumófila
Serogrupo 1, que es también parte de esta invención.
\newpage
También ha sido posible otra prueba ICT mediante
la separación, de acuerdo con esta invención, de un antígeno de L.
Neumófila Serogrupo 5 que no es proteínico, de naturaleza
carbohidrato y es común a múltiples serogrupos de L. Neumófila. La
presencia de tal antígeno ha sido sugerida en varias publicaciones
científicas; ver por ejemplo, Nolte, F. S. Et al.
"Electrophoretic and Serological Characterization of the
Lipopolysaccharides of Legionella pneumophila", 167 J.
Bacterial. 893-904 (1986); Barthe, C. Et
al., "Common Epitope on the Lipopolysaccharide of
Legionella pneumophila Recognized by a Monoclonal
Antibody", 26 J. Clin. Microbiol. 1016-1023
(1994). Hasta este momento, no ha habido ningún informe claro sobre
ninguna separación de tal antígeno para uso en el desarrollo de un
ensayo inmunoquímico de amplio espectro útil.
Esta invención comprende la extracción de la
bacteria Legionela, y especialmente de una bacteria de cualquiera
de los serogrupos L. Neumófila de antígeno de carbohidrato libre de
proteína, la preparación de un conjugado de este antígeno con una
proteína separadora, la unión del conjugado con una columna de
afinidad, el uso de tal columna para la purificación de anticuerpos
polivalentes correspondientes a la bacteria Legionela, tal como una
bacteria de un serogrupo de L. Neumófila y el uso de los
anticuerpos purificados en un inmunoensayo ICT para la detección de
bacteria Legionela o sus antígenos, que incluyen antígenos de L.
Neumófila serogrupos o sus correspondientes bacterias, como se
describirá con más detalle a continuación.
En particular, la invención incluye la
separación de antígeno O-polisacárido libre de
proteína de L. Neumófila Serogrupo 1, su uso en la purificación de
afinidad del anticuerpo polivalente específico al mismo
microorganismo y el uso de tal anticuerpo purificado de afinidad en
un inmunoensayo ICT de elevada especificidad y sensibilidad que se
lleva a cabo en un espacio de tiempo de 15 minutos.
En otra realización, la invención incluye la
separación de L. Neumófila Serogrupo 5 de un antígeno de
carbohidrato libre de proteína y su uso en la purificación de
afinidad del anticuerpo policlonal específico al antígeno L.
Neumófila Serogrupo 5 (es decir, un anticuerpo que se obtuvo de un
conejo inmunizado con el citado antígeno); este anticuerpo mostró
una habilidad para reaccionar de manera cruzada con antígenos L.
neumófila de serotipos 1, 2 y 4 además del antígeno de serotipo
5.
La Figura 1 y sus Figuras relacionadas 1A, 1B y
1C muestran la estructura de un dispositivo ICT típico que se
adapta de manera adecuada para llevar a cabo el ensayo específico L.
Neumófila Serogrupo 1, como se describe en los Ejemplos VII, VIII y
IX.
La Figura 2 muestra los resultados de los
análisis Western blot de extractos de salina
fosfato-tampón de L. Neumófila Serogrupos 1, 2, 4 y
5 con L. Neumófila Serogrupo 5, carbohidrato libre de proteína
anticuerpo policlonal purificado de afinidad de antígeno específico
del antígeno serogrupo 5, cuyo análisis se describe en el Ejemplo
X.
La experiencia previa en la técnica, incluyendo
la experiencia con el ensayo RIA Binax para L. Neumófila Serogrupo
1 antígeno vendido bajo la marca EQUATE y le ensayo EIA Binax para
el mismo antígeno, ha demostrado que los antígenos de la especie
Legionela, incluyendo antígenos de varios grupos L. Neumófila, se
detectan de manera más sencilla en especimenes de la orina de
pacientes infectados con un microorganismo Legionela que en
especimenes de sangre, esputo u otros fluidos. Este se debe en
parte porque los antígenos de Legionela normalmente aparecen en la
orina tras 1-3 días después de la infección de un
paciente humano mientras que su aparición a un nivel detectable en
sangre suele ocurrir más tarde, y también en parte porque los
pacientes infectados con la enfermedad de los Legionarios a menudo
no producen mucho esputo. La prueba ICT que forma parte de la
presente invención puede realizarse en sangre, esputo u otro fluido
como fluido cerebroespinal, o sobre muestras acuosas de origen
medioambiental. Se observa que la orina es generalmente el fluido
de muestra preferente para diagnóstico de pacientes humanos porque
puede obtenerse de manera no invasiva y de modo sencillo, incluso
en la consulta del médico, y no se contamina fácilmente con otros
microorganismos, como por ejemplo la microflora oral presente en el
esputo, que son inocuos pero pueden afectar los resultados
obtenidos.
Hablando en general, la prueba ICT para antígeno
L. Neumófila Serogrupo 1 que es específicamente parte de la
presente invención puede diseñarse para realizarse en cualquier
dispositivo ICT desechable conocido descrito en la técnica.
Preferentemente, la prueba se realiza empleando un dispositivo ICT
del tipo descrito en la Solicitud de Serie copendiente U.S No.
07/706,639 de Howard Chandler, o uno de sus solicitudes
continuación-en-parte, todas por
Smith-Kline Diagnostics, Inc pero exclusivamente
bajo la licencia de Binax, Inc. en una amplia área de aplicaciones
que incluye el presente campo de diagnóstico, es decir,
enfermedades del sistema respiratorio. El dispositivo se impregna
adecuadamente con los anticuerpos polivalentes purificados de
afinidad aquí descritos que son específicos a antígeno L. Neumófila
Serogrupo 1. Los resultados positivos del ensayo se muestran por la
aparición de un color tras la reacción de anticuerpos adecuadamente
etiquetados con antígeno. Las etiquetas adecuadas pueden ser
cualquiera de las conocidas en la técnica, que incluyen etiquetas
metálicas divididas de manera muy fina y otros varios materiales de
etiquetado. El oro coloidal es la etiqueta preferente.
La invención comprende que el carbohidrato libre
de proteína o antígenos pueden separarse de manera similar de cada
una de las bacterias Legionela, incluyendo bacterias de otras
especies de Legionela de otros serogrupos de L. Neumófila, y que
tales antígenos pueden utilizarse de manera similar en la
purificación de afinidad de anticuerpos polivalentes con las
correspondientes especies de Legionela o bacterias de serogrupo y
sus antígenos, y que estos anticuerpos purificados por afinidad
pueden utilizarse en ICT y en otros inmunoensayos como aquí
específicamente se describen para anticuerpos purificados por
afinidad con L. Neumófila Serogrupo 1.
Antes de preparar el dispositivo se obtienen los
anticuerpos y se efectúa su purificación de afinidad. Los
anticuerpos que pueden emplearse en esta invención son anticuerpos
polivalentes (también llamados "policlonales") convencionales
que se obtienen por el bien conocido proceso de inmunización de un
conejo, cabra u otro animal con un antígeno Legionela, es decir,
antígeno L. Neumófila de serogrupo conocido y haciendo sangrar al
animal tras el paso de un periodo apropiado para obtener suero que
contenga los anticuerpos deseados. Ver, por ejemplo, Cherry, U.B. y
McKinney, R.M., ps. 91-104 en Jones, G.L. y
Herbert, G.A (Eds). "Legionnaires" the diseasase, the
bacterium and the methodology, (Center for Disease Control,
Atlanta, 1979). En esta invención, relativa al inmunoensayo ICT
para L. neumófila serogrupo 1 aquí descrito, el conejo u otro
animal se inmuniza para el antígeno L. neumófila serogrupo 1 y los
anticuerpos polivalentes recuperados de su sangre son anticuerpos
L. neumófila serogrupo 1.
Los anticuerpos polivalentes que se emplean en
esta invención son además sometidos a purificación de afinidad en
una columna cromatográfica especialmente preparada que emplea el
carbohidrato libre de proteína incluyendo antígeno polisacárido de
la misma bacteria contra la cual los anticuerpos son reactivos como
el agente purificador para ellos.
Antes de la purificación de afinidad de los
anticuerpos, es por lo tanto necesario de acuerdo con esta
invención preparar antígeno de carbohidrato purificado libre de
proteína de un cultivo de bacteria Legionela conocida de las
especies deseadas o serogrupo de una especie.
Los siguiente ejemplos I y II explican cómo se
obtiene el antígeno de carbohidrato purificado libre de
proteína.
Ejemplo
I
Bacterias de L. neumófila serogrupo
1(cepa Philadelphia-1) se obtuvieron de
Centros para Control y Prevención de Enfermedades (Atlanta, GA) y
se cultivaron en placas de agar con extracto de
charcoal-levadura obtenidas del Norhteast Laboratory
(Waterville, ME) durante un periodo de 72 horas a 37°C. Las células
se cultivaron con salina tapón de fosfato ("PBS") a pH 7.2 que
contenía 0.2% de NaN_{3} y se recogió por centrifugación a 8000
rpm durante 25 minutos. El gránulo de célula resultante se almacenó
a -20°C hasta su uso.
Las células mojadas de este gránulo se
suspendieron en 20 ml 0.1 M NaOH por gramo de células mojadas y se
agitaron a temperatura ambiente durante 45 minutos. El pH de la
solución se ajustó a continuación con ácido acético concentrado a
3.0 y la solución se sometió a centrifugación a 8000 rpm durante 20
minutos. El sobrenadante de este paso se neutralizó con NaOH acuoso
y se dializó contra agua destilada.
El dializado resultante se concentró 10 veces en
un evaporador de vacío rotatorio y después se sometió a ultrasonido
durante 5 minutos en un baño ultrasónico.
Se añadió Proteinasa K, en una concentración de
0.2 mg por ml. del producto concentrado, para digerir las proteínas
restantes y la mezcla se incubó a 40°C durante la noche. El
siguiente paso fue la adición de más Proteinasa K, en una
concentración de 0.2 mg por ml., a la mezcla, seguido de una
incubación adicional a 40°C durante la noche. La segunda incubación
fue seguida por concentración del producto en un evaporador
rotatorio a un volumen pequeño, ajuste de su pH a
10-11 con 0.2% trietilamina y aplicación de la
mezcla tratada a una columna de Sephacryl S-200 de
Pharmacia, equilibrado con 0.02% trietilamina. El material se
extraído con disolvente en el primer pico se reunió, se ajustó con
0.1 NHCl a aproximadamente pH neutral y se dializó contra agua
destilada durante 18 horas, seguido de liofilización.
La producción de antígeno
O-polisacárido de 16.5 gramos de células mojadas de
L. neumófila serogrupo 1 cepa Philadelphia-1 fue 62
mg.
Debe observarse que en lugar de Proteinasa K,
cualquier preparación de proteasa de amplio espectro puede
emplearse. Lo que es importante es este proceso es la máxima
posible eliminación de proteína desde el antígeno dentro de los
límites razonables de viabilidad de tiempo.
Ejemplo
II
El Ejemplo I se repitió usando L. neumófila
serogrupo 5 cepa Dallas IE como la bacteria en el paso de cultivo.
11.5 gramos mojados produjeron 21 mg. de un antígeno carbohidrato.
Posteriormente, el proceso se volvió a repetir, esta vez usando L.
neumófila serogrupo 5 (cepa U8W) como la bacteria en el paso de
cultivo.
Se encuentra dentro del campo de esta invención
el paso de repetir los pasos de cultivo y extracción tal y como aquí
se describe en cualquier bacteria Legionela y especialmente en
bacterias de otros serogrupos diferentes a L. Neumófila, es decir,
cualquiera de los serogrupos 2, 3, 4 y 6-15
incluidos, para obtener un antígeno carbohidrato libre de material
proteínico.
Con el fin de enlazar el producto
O-polisacárido libre de proteína del Ejemplo I o el
carbohidrato del Ejemplo II con una columna cromatográfica para
usarlo en purificación de afinidad de anticuerpos polivalentes con
la correspondiente bacteria desde la cual el antígeno carbohidrato
se extrae, resulta necesario hacerlo más complejo con una molécula
separadora de proteína adecuadamente preparada para asegurar que
esté establemente unida al antígeno carbohidrato y a la columna u
que permanezca inerte durante el paso de purificación de afinidad.
Se eligió una albúmina de suero bovino modificado ("BSA") como
molécula separador preferente y se preparó como en el Ejemplo
III:
Ejemplo
III
Una solución acuosa 0.5 M de dihidrocloruro de
hidracina de Aldrich Chemical Co., Inc. (Milwaukee, WI) se preparó
y su pH se ajustó a 5.2 con NaOH seco. Posteriormente, la solución
se mezcló con BSA seco de Sigma Chemical Co. para una concentración
final de 25 mg. por ml. de BSA. Después de que BSA se disolviera
por completo, se añadió
N-(dimetilaminopropil)-N^{1}-etilcarbodiimida
hidrocloruro obtenido de Fluka Chemical Co. (St. Louis, MO) a la
concentración final de 25 mg. por ml. La mezcla se agitó durante la
noche a temperatura ambiente y a continuación se dializó durante un
periodo de aproximadamente cinco días contra agua destilada a 4°C,
con cambios diarios de agua.
En lugar de este BSA modificado, se contempla
que pueden usarse otras moléculas separadoras apropiadas.
La conjugación de antígeno
O-polisacárido del serogrupo 1 de L. neumófila con
la molécula espaciadora se llevó a cabo del siguiente modo:
Ejemplo
IV
Antígeno O-polisacarido libre de
proteína de L. neumófila serogrupo 1 se disolvió en agua destilada
en una concentración de 4-5 mg/ml y el pH se ajustó
a 5.0 con 1 M HCL. La solución de BSA modificada preparada como se
ha explicado en el Ejemplo III s e ajustó a pH 5.0 con 1 M HCL y
lentamente se añadió, en un radio de peso de
4-a-1 de la solución de antígeno
O-polisacarido, a ésta. Después de 5 minutos de
agitación, se añadieron aproximadamente 100-200 mcl
de agua destilada que contenía el
N-(dimetilaminopropil)-N^{1}-etilcarbodiimida
hidrocloruro referido en el Ejemplo III en un radio de peso 1:2 al
antígeno O-polisacárido/solución BSA. La mezcla
resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche.
Para separar el conjugado de antígeno
O-polisacárido con BSA modificado de cualquier
material no reactivo presente, la mezcla de reacción se sometió a
cromatografía en una columna Sefarosa CL-4B
equilibrada con un búfer de 0.1 M Nah_{2}po_{4}:0.5 M NaCl.
Todas las fracciones de cromatografía se sometieron a prueba para
actividad de antígeno usando el test comercial Bincha EIA como se
ha mencionado anteriormente. Todas las fracciones que mostraron
actividad de antígeno en las pruebas se reunieron y se usaron para
preparación de columna de afinidad como se muestra en el Ejemplo
V.
Ejemplo
V
Se preparó un gel inmunoabsorbente mediante
activación convencional de Sefarosa CL-4B con
bromuro de cianogeno. El ligando de antígeno
O-polisacárido con BSA modificado, preparado como
se ha explicado en el Ejemplo IV, se enlazó con él para usando
procesos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describió en
Hermanson, G.T, et al. en Immobilized Affinity Ligand
Techniques, 53-56 (Academia Press, Inc. 1992). A
continuación, el gel fue empaquetado en una columna y se lavó
sucesivamente con 5-10 volúmenes por volumen de gel
de PBS de pH 7.2, triple fuerza de PBS de 7.2 y 0.2 M
glicina-HCl de pH 2.5. La columna activada
resultante se usó, como se ha descrito previamente, para
purificación de afinidad de anticuerpos polivalentes con antígeno
L. neumófila serogrupo 1. Tras la extracción con disolvente, la
columna debería almacenarse en PBS u otro búfer neutral hasta su
uso.
En vez de Sefarosa activada de bromuro de
cianogeno, sferelosa y varias columnas activadas comercialmente
disponibles pueden usarse en este paso.
Ejemplo
VI
La columna activada descrita en el Ejemplo V se
usó para la cromatografía de afinidad de
conejo-anti- L. neumófila serogrupo 1 anticuerpos
polivalentes con antígeno L. neumófila serotipo 1 de acuerdo con el
método descrito por Harlow E. y Lane, D. En Antibodies: a
Laboratory Manual en 313-315 (Cold Spring Harbor
Laboratory, 1988). La elución de los anticuerpos de la columna fue
efectiva con 0.2 M glicina-HCL búfer de pH 2.5.
Eluantes alternativos como 3 M NaSCN o 0.1 M Et3N también pueden
emplearse.
Los anticuerpos purificados por afinidad se
utilizaron en un test ICT específico para L. neumófila serogrupo 1
como de describe en el siguiente ejemplo.
Ejemplo
VII
Se preparó un dispositivo de test que comprende
una carcasa articulada de cartón equipada con una ventana que
permite la vista de los resultados del test y el control de los
resultados, tal y como se muestra en la Figura 1. El dispositivo
tiene una ranura dentro de la cual se coloca un hisopo de plástico
preformado para recibir el hisopo mojado de muestra a la derecha
(con la etiqueta 1 en el dibujo). A continuación, se coloca una
sobreetiqueta mostrada en la Figura 1A sobre todo el lado derecho
del dispositivo. La sobreetiqueta está provista de dos agujeros-
uno en la parte inferior (marcado A en la Figura 1A) dentro del
cual se insertará el hisopo saturado y otro en la parte superior
(marcado B en la Figura 1A) hacia el cual es hisopo será empujado
después de la inserción del mismo en el agujero B. La posición de
la sobreetiqueta con sus agujeros A y B, y el pozo hisopo cooperan
para mantener al hisopo en la posición correcta durante el ensayo y
para provocar la expulsión del líquido absorbido desde el
hisopo.
Una tira de prueba premontada (marcada C en la
Figura 1) descrita a continuación, se inserta en la ranura
(etiquetada con el 2 en la Figura 1) y se sujeta en su lugar por un
adhesivo aplicado al fondo del mismo. Una sobreetiqueta mostrada en
la Figura 1B se coloca encima del lado de la izquierda. Se ha
provisto de un único agujero (marcado D en la Figura 1 B) que
coincide con el agujero A del lado de la derecha cuando el
dispositivo está cerrado para llevar a cabo el ensayo.
El dispositivo montado se almacena en una bolsa
sellada con desecante hasta su uso. Antes de sellar la bolsa y
almacenarla, se coloca con suavidad una cinta adhesiva el borde
externo de la mitad derecha del dispositivo.
La Figura 1C muestra la construcción de la tira
premontada. Consiste en una almohadilla conjugada de material
absorbente en el cual se han impregnado un conjunto de partículas
de oro y los anticuerpos anti-Legionela neumófila
serogrupo 1 purificados por afinidad de conejo descritos
anteriormente. En contacto con esta almohadilla se encuentra una
almohadilla de nitrocelulosa en la cual se ha establecido una línea
de captura para la muestra que reacciona con el conjugado mediante
unión de una línea de anticuerpos anti-Legionela
neumófila serogrupo 1 de conejo purificados por afinidad,
preparados como se ha descrito anteriormente. La almohadilla de
nitrocelulosa también tiene una línea de control en dirección
descendente desmontando o deshaciendo la almohadilla con
inmunoglobulina de cabra anti-conejo (IgG). Tras
las almohadilla de nitrocelulosa, la tira se acaba por una
almohadilla absorbente que sirve como una reserva para líquido.
Todas estas almohadillas están apoyadas por una tira adhesiva
cuando el dispositivo está listo para ser transportado.
La almohadilla conjugada está normalmente hecha
de poliéster no tejido o acetato de celulosa extrudido. Para
preparar esta almohadilla para el ensayo, se conjugan partículas de
oro de 50 nm. de diámetro con anticuerpos
anti-Legionela neumófila serogrupo 1 de conejo
purificados por afinidad, preparados como se ha descrito
anteriormente. Esta conjugación se hace efectiva utilizando un
método conocido como el descrito por DeMay in Polar, J. M. Y Van
Norden, S (Eds.), Inmunochemistry: Modern Methods and Application,
(Wright, Bristol, England, 1986). Las partículas de conjugado de
oro se mezclan con un agente secante consistente en teraborato de
sodio 5 mM acuoso de pH 8.0 que contiene 1.0% BSA, 0.2% Triton
X-100, 2.0% Tween 20, 6.0% sacarosa y 0.02% azida
sódica. La almohadilla se calienta lo suficiente como para retirar
todo el líquido presente y se almacena en un ambiente de baja
humedad, quedando pendiente el montaje de la tira de test. Se
eligen precisamente estas almohadillas y su tratamiento para que
las almohadillas que sujeten el conjugado seco y lo liberen sólo
cuando más tarde se humedezca por la muestra.
La almohadilla de nitrocelulosa es tratada en
primer lugar por la unión de una raya de anticuerpos
anti-Legionela neumófila serogrupo 1 de conejo
purificados por afinidad en una primera porción de la misma, usando
una solución portadora de salina de búfer fosfato. Estos
anticuerpos actúan como la línea de captura. En una secunda porción
de la almohadilla, en la parte inferior de la primera parte en el
dispositivo del test montado, se establece la línea de control
deshaciendo IgG de cabra anti-conejo en la misma
solución portadora sobre la superficie de la almohadilla. La
almohadilla de nitrocelulosa es posteriormente sometida a
desecación a 18-25°C para aumentar la absorción
permanente de las tiras de proteína de la misma.
La almohadilla absorbente usada es de un
material de celulosa comercialmente disponible bajo el nombre
Ahlstrom 39. Esta almohadilla no requiera un tratamiento
especial.
Tal y como se vende en el mercado, el
dispositivo del test que contiene la tira de test acabada está
montado. En la práctica, un número de dispositivos están
empaquetados con un número proporcional de hisopos creados a partir
de Dacron fibroso y una botella de "Reagente A" equipado con
una parte superior adaptada para enviar el Reagente A en dirección
descendente. "Reagente A" es una solución de 2.0% Tween 20,
0.05% azida sódica y 0.5% sulfato dodecil sódico en un búfer de
fosfato citrato-sodio sódico 0.05 M de pH 6.5.
Controles positivos y negativos también están incluidos en cada
kit.
El uso de los dispositivos de test finalizados
para identificar antigeno O-polisacárido de L.
Neumófila serogrupo 1 se ilustra en el siguiente ejemplo VIII:
Ejemplo
VIII
En la práctica, el hisopo facilitado con cada
dispositivo se baña en la muestra líquida, introduciendo por
completo la cabeza del hisopo. El uso del hisopo para actuar como
un filtro para sólidos no disueltos, semisólidos y coloides
presentes en muestras biológicas líquidas como orina, sangre,
linfa, etc. y también en muestras ambientales líquidas es el tema
de la Solicitud copendiente No. de Serie 09/044,677 de Norman Moore
y Vencen Sy presentada el 19 de marzo de 1998, que en breve será
asignada a Binax, Inc. El hisopo se inserta en el agujero en el
fondo del dispositivo (agujero B de la Figura 1A) y con suavidad se
presiona hacia arriba hasta que la punta del hisopo sea visible en
el agujero superior (agujero A de la Figura 1A). El Reagente A vial
se sujeta verticalmente sobre el agujero B y se añaden lentamente
dos gotas de Reagente A. La línea adhesiva es posteriormente
despegada del borde derecho del dispositivo y el dispositivo se
cierra y se sella de manera segura, presionando por lo tanto el
hisopo en la pared del hisopo contra al almohadilla de conjugado de
oro. Después de 15 minutos, el resultado puede leerse en la ventana
del dispositivo. Una muestra negativa, es decir, una que no
contenga antigeno O-polisacárido de L. Neumófila
serogrupo 1, sólo mostrará la línea de control en la mitad de la
parte superior de la ventana. Una muestra positiva que contenga el
antígeno objetivo mostrará dos líneas, la inferior es la línea del
paciente (o muestra); incluso una línea débil de muestra indica la
presencia del antígeno objetivo en la muestra. Si no aparece línea
en la ventana después de 15 minutos, o sólo una línea de muestra
aparece en la parte inferior de la ventana, el test no es válido y
hay que repetirlo.
Usando el procedimiento descrito que se acaba de
describir, los dispositivos preparados como se ha descrito en el
Ejemplo VII se probaron en el procedimiento ICT que se acaba de
describir con 300 muestras de orina de pacientes, 100 de las cuales
habían sido previamente diagnosticadas por tener infección L.
Neumófila serogrupo 1.
Estas pruebas ICT de acuerdo con la invención se
llevaron a cabo bajo circunstancias tales que los diagnósticos
previos resultaron desconocidos por el personal encargado de llevar
a cabo las pruebas ICT. En total, el 98% de las pruebas
coincidieron con los diagnósticos positivos previos. También en
total, el 98% de las muestras de orina previamente diagnosticadas
como negativas para antigeno O-polisacárido de L.
Neumófila serogrupo 1 dieron resultados de acuerdo con lo que se
comprobó mediante el proceso ICT aquí descrito, usando el
dispositivo ICT descrito en el Ejemplo VII.
Ejemplo
IX
La aplicación de esta misma prueba a muestras
ambientales sospechosas de contener L. Neumófila serogrupo 1
también se investigó del siguiente modo:
Se cultivó agua con la bacteria L. Neumófila
serogrupo 1 obtenida a partir de una fuente comercial. La mezcla se
concentró filtrándolo por medio de un filtro de 0.22 \mum. Se
aplicó un hisopo bañado en la muestra al dispositivo, éste se cerró
y el ensayo prosiguió. Se observó un resultado positivo en menos de
15 minutos.
Ejemplo
X
Con el fin de llevar a cabo el inmunoensayo
Western Blot usando un kit adquirido en Laboratorios
Bio-Rad, células de L. Neumófila serogrupo 5 se
cultivaron como en el Ejemplo II. Una suspensión de dichas células
se solubilizó con 1% de dodecilsulfato de sodio en la presencia de
10 mM mercaptoetanol a 100°C durante 5 minutos. Las células
solubilizadas fueron tratadas con proteasa K y a continuación se
sometieron a separación de proteína electroforética de acuerdo con
los procedimientos estándar proporcionados por
Bio-Rad.
El antígeno de carbohidrato de L. Neumófila
serogrupo 5 se conjugó con la molécula espaciadora descrita en el
Ejemplo III de la manera descrita en el Ejemplo IV y se aplicó a
una columna de Sefarosa activada como se ha descrito en el Ejemplo
V. Esta columna se usó a continuación para la purificación por
afinidad de anticuerpos de conejo polivalentes específicos al
antígeno de carbohidrato de L. Neumófila serogrupo 5 (que se
obtuvieron de manera convencional de suero de un conejo previamente
inyectado con la proteína que contiene L. Neumófila serogrupo 5)
usando el procedimiento del Ejemplo VI.
El análisis Western inmunoblot se llevó a cabo
usando un kit reagente de Bio-Rad de acuerdo con
las directrices del fabricante. En resumen, el extracto PBS de
células de antígenos L. Neumófila 1, 2, 4 y 5 se sometieron a
SDS-PAGE en 12% gel poliacrilamida bloqueado con 1%
BSA con PBS transferido a una membrana de nitrocelulosa. Tras este
paso, la membrana se incubó con anticuerpos purificados por
afinidad específicos al antígeno de carbohidrato de L. Neumófila
serogrupo 5. La membrana, lavada del modo recomendado por el
fabricante, e incubada con peroxidasa de rábano picante se conjugó
con anticuerpos cabra-anti-conejo
provistos por Bio-Rad. Después del lavado, la
membrana se desarrolló con un sistema de sustrato de 0.022 M
4-cloro-1 naftol y 0.0012 M
N,N-dimetil-p-fenileno-diamina
monohidrocloruro en 0.1 M búfer de citrato de sodio de pH 6.9 que
contenía 2.9 mM de peroxidasa de hidrógeno. La Figura 2 del mismo
muestra los resultados del el ensayo Western Blot comparados con
los del estándar premanchado SDS-PAGE (en Ruta 5)
para los anticuerpos purificados por afinidad de serogrupo 5 de L.
Neumófila contra extractos PBS que contenían antígenos de L.
Neumófila que indican lo siguiente:
Rutas 1 y 7 - L. Neumófila serogrupo 2 (cepa
Togus-1)
Rutas 2 y 8 - L. Neumófila serogrupo 4 (cepa Los
Angeles-1)
Rutas 3 y 6 - L. Neumófila serogrupo 1 (cepa
Philadelphia-1)
Rutas 4 y 9 - L. Neumófila serogrupo 5 (cepa
U8W).
Se debe señalar que los anticuerpos purificados
por afinidad le las rutas 1-4 se purificaron por
afinidad en una columna en la cual antígeno de carbohidrato de L.
Neumófila serogrupo 5 (cepa U8W) se unión mientras que los de las
Rutas 6-9 se purificaron por afinidad del mismo
modo sobre una columna que se había unido al antígeno de
carbohidrato de L. Neumófila serogrupo 5 (cepa Dallas IE).
La figura 2 demuestra claramente que los
anticuerpos purificados por afinidad aquí descritos de L. Neumófila
serogrupo 5 reaccionan con antígenos de L. Neumófila serogrupo 1, 2
y 4 además de con los del serogrupo 5.
Se considera o contempla un ensayo ICT como se
ha descrito anteriormente en el cual los anticuerpos purificados
por afinidad de L. Neumófila serogrupo 5 se sustituyen por
anticuerpos purificados por afinidad de L. Neumófila serogrupo
1.
Aquellos expertos en la técnica de inmunoquímica
en general, y especialmente aquellos expertos en inmunoensayos,
reconocerán que otros materiales e ingredientes y en ocasiones,
otros pasos de procedimiento, pueden fácilmente sustituir a
aquellos recomendados aquí específicamente. Una vasta colección de
literatura, tanto patentes como no patentes, describe y debate el
diseño y uso de dispositivos fiables, de un solo uso y desechables
que puedan sustituir el dispositivo ICT preferente aquí descrito y
recomendado. No se desea que la presente invención se limite con
respecto a dispositivos, materiales, ingredientes o pasos de
procedimientos sustituibles en la medida en que las siguientes
reivindicaciones podrían limitarlo.
Claims (41)
1. Un método de ensayo de la presencia de una
bacteria Legionela o su componente antigénico de carbohidrato en un
fluido, cuyo método comprende los siguientes pasos:
- (a)
- Cultivar células bacteriales de un cultivo de una especie conocida, un serogrupo de una especie, de bacteria Legionela en la forma de un gránulo de célula húmedo.
- (b)
- Suspender el gránulo de célula húmedo en un gramo por 20 ml en una solución alcalina acuosa, conteniendo dicha solución alcalina acuosa 0.1 M de hidróxido sódico acuoso, y mezclándolo durante 45 minutos, seguido de la adición de ácido fuerte para ajustar el pH al pH ácido y centrifugar.
- (c)
- Separar el sobrenadante del paso (b), ajustar su pH a la neutralidad y añadirle una preparación de enzima de proteasa de amplio espectro,
- (d)
- Digerir la enzima de proteasa de amplio espectro - mezcla sobrenandante neutralizada del paso (c) para destruir las proteínas residuales,
- (e)
- Añadir a la mezcla digerida del paso (d) de una solución acuosa ligeramente alcalina para ajustar el pH al lado alcalino, separando un antígeno de carbohidrato libre de proteína sobre una columna de exclusión de tamaño equilibrada con una solución ligeramente alcalina y reuniendo material eluído en el primer pico y ajustar su pH a la neutralidad,
- (f)
- Recuperar el antígeno carbohidrato libre de proteína de la solución acuosa neutral del paso (e) y enlazar este antígeno con una molécula espaciadora para forma un conjugado;
- (g)
- Enlazar el conjugado del paso (f) a una columna de afinidad cromatográfica,
- (h)
- Purificar anticuerpos sin tratar con la misma especie o serogrupo de una especie de bacteria de Legionela usada en el paso (a) pasándolos por la columna de afinidad cromatográfica del paso (g) habiéndose unido a la misma el conjugado de molécula separadora y antígeno de carbohidrato libre de proteína del paso (f), produciendo así anticuerpos específicos de antígeno purificados, y;
- (i)
- Usar los anticuerpos purificados del paso (h) para detectar la presencia de una pareja de enlace antigénica para estos anticuerpos en una muestra de test de fluido sospechosa de contenerlo.
2. El método de la reivindicación 1 en el cual
la bacteria es L. Neumófila serogrupo 1 y el antígeno
O-carbohidrato libre de proteína recuperado en el
paso (f) en el antígeno O-polisacárido libre de
proteína de L. Neumófila sero-
grupo 1.
grupo 1.
3. El método de la reivindicación 1 en el cual
la bacteria es L. Neumófila serogrupo 5 y el antígeno libre de
proteína recuperado en el paso (f) en el antígeno
O-carbohidrato de L. Neumófila serogrupo 5.
4. Un antígeno de carbohidrato libre de proteína
obtenido de una bacteria que es una especie, o un serogrupo de
especies de Legionela neumófila de acuerdo con el método de pasos
(a) a (e) incluidos en la reivindicación 1.
5. Un antígeno de carbohidrato libre de proteína
de acuerdo con la reivindicación 4 que es un antígeno
O-polisacárido obtenido de L. Neumófila serogrupo
1.
6. Un antígeno de carbohidrato libre de proteína
de acuerdo con la reivindicación 4 que es un antígeno
O-carbohidrato obtenido de L. Neumófila serogrupo
5.
7. Un método de acuerdo con la reivindicación 1
en el cual en el paso (b) el ácido pH ajustado es 3.0.
8. Un método de acuerdo con la reivindicación 1
en el cual en el paso (e) el pH se ajusta a un pH entre 10 y
11.
9. Un método de acuerdo con la reivindicación 1
en el cual, después del paso (e), se lleva a cabo un paso de
liofilización.
10. Un método para la purificación de
anticuerpos sin tratar con una especie, o serogrupos de especies,
de bacteria de Legionela que comprende los siguientes pasos:
- (a)
- Separar de la misma especie, o serogrupo de una especie, de bacteria de Legionela, un antígeno de carbohidrato libre de proteína usando losa pasos (a) y (f) del método incluidos en la reivindicación 1,
- (b)
- Enlazar el conjugado con una columna cromatográfica activada;
- (c)
- Someter a dichos anticuerpos sin tratar a cromatografía de afinidad sobre la columna del paso (c) para obtener anticuerpos específicos de antígeno purificados, y
- (d)
- Someter a elución los anticuerpos específicos de antígeno purificados de dicha columna.
11. Un método de acuerdo con la reivindicación
10 en el cual los anticuerpos no tratados son anticuerpos para L.
Neumófila serogrupo 1 y el antígeno de carbohidrato libre de
proteína es el antígeno O-polisacárido libre de
proteína de la reivindicación 5.
12. Un método de acuerdo a la reivindicación 10
en el cual los anticuerpos sin tratar son anticuerpos para L.
Neumófila serogrupo 5 y el antígeno de carbohidrato libre de
proteína es el antígeno de carbohidrato libre de proteína de la
reivindicación 6.
13. Los anticuerpos específicos de antígeno
purificados para L. Neumófila serogrupo 1 y su antígeno
O-polisacárido, que se producen mediante el método
de la reivindicación 11.
14. Los anticuerpos específicos de antígeno
purificados para L. Neumófila serogrupo 5 y su antígeno
O-polisacárido, que se producen mediante el método
de la reivindicación 12.
15. Los anticuerpos purificados para una
bacteria de al menos una especie, o serogrupo de especies, de L.
Neumófila obtenidos por medio del método de la reivindicación 10,
cuyos anticuerpos purificados muestran especificidad con el
antígeno de carbohidrato de la mencionada especie, o serogrupo de
especies.
16. El método de la reivindicación 1 donde la
molécula espaciadora del paso (f) es una molécula de proteína.
17. El método de la reivindicación 1 donde las
conocidas bacterias de Legionela son bacterias de uno de los
serogrupos de Legionela neumófila.
18. El método de la reivindicación 17 en el cual
las conocidas bacterias de Legionela son bacterias de uno de los
serogrupos de Legionela neumófila serogrupo 1, el antígeno obtenido
en el paso (e) es su antígeno O-polisacárido libre
de proteína y los anticuerpos purificados para bacterias L.
Neumófila serogrupo 1 obtenidos en el paso (h) se usan en el paso
(i) para comprobar la presencia o ausencia de bacterias L.
Neumófila serogrupo 1 o su antígeno
O-polisacárido.
19. El método de la reivindicación 18 donde el
fluido del paso (i) es agua.
20. El método de la reivindicación 18 donde el
fluido del paso (i) es un fluido natural de origen mamífero.
21. El método de la reivindicación 20 donde el
fluido es orina humana.
22. El método de la reivindicación 21 en el cual
el fluido se obtiene de un paciente que muestra signos clínicos de
una enfermedad del tipo neumonía.
23. El método de la reivindicación 22 en el cual
el paso (i) es un proceso inmuno-ensayo.
24. El método de la reivindicación 23 en el cual
el paso (i) es un proceso de ensayo
inmuno-cromatográfico ("ICT").
25. El método de la reivindicación 23 donde una
parte de los anticuerpos específicos al antígeno purificados del
paso (h) se conjugan con un agente etiquetador conocido para
exponer o visualizar un color visible cuando dichos anticuerpos
reaccionan con el antígeno correspondiente.
26. El método de la reivindicación 25 donde el
agente etiquetador es oro coloidal.
27. El método de la reivindicación 17 en el cual
las conocidas bacterias de Legionela son bacterias de Legionela
neumófila serogrupo 5, el antígeno obtenido en el paso (e) es su
antígeno de carbohidrato libre de proteína y los anticuerpos
purificados obtenidos en el paso (h) son capaces de detectar en
fluidos bacterias L. Neumófila de serogrupos 1, 2, 4 y 5 o sus
componentes antigénicos.
28. El método de la reivindicación 27 en el cual
los anticuerpos polivalentes purificados para L. Neumófila
serogrupo 5 se utilizan para comprobar la presencia de alguna o
todas las bacterias de L. Neumófila serogrupos 1, 2, 4 o 5 o sus
antígenos en un fluido.
29. El método de la reivindicación 28 donde el
fluido es agua.
30. El método de la reivindicación 29 en el cual
el paso (i) es un procedimiento inmuno-ensayo.
31. El método de la reivindicación 30 en el cual
el paso (i) es un proceso de ensayo
inmuno-cromatográfico ("ICT").
\newpage
32. El método de la reivindicación 31 donde una
parte de los anticuerpos específicos al antígeno purificados del
paso (h) se conjugan con un agente etiquetador conocido para
exponer o visualizar un color visible cuando dichos anticuerpos
reaccionan con el antígeno correspondiente.
33. El método de la reivindicación 32 donde el
agente etiquetador es oro coloidal.
34. Un ensayo ICT para la detección de al meno
una especie o serogrupo de especie de bacteria Legionela, o un
antigeno de carbohidrato de dicha bacteria, que comprende:
- (a)
- poner en contacto una muestra de un fluido sospechoso de contener dicha bacteria o su componente de antígeno carbohidrato con un dispositivo ICT que consta de una banda de material absorbente, cuya banda tiene
- (i)
- una zona a la que se ha unido un conjugado de
- (1)
- un agente etiquetador que visualiza un cambio visible de color tras la reacción de anticuerpos con sus respectivas parejas de enlace antigénico y
- (2)
- anticuerpos específicos de antígeno purificados para la especie Legionela, o serogrupo de una especie, que se busca detectar, habiéndose purificado dichos anticuerpos mediante el paso sobre una columna de afinidad cromatográfica a la cual se conjuga por medio de una molécula espaciadora un antígeno de carbohidrato libre de proteína de la especie Legionela, o serogrupo de una especie, que se busca detectar, cuyo antígeno de carbohidrato se obtuvo a partir de un cultivo de la misma especie de Legionela, o serogrupo de una especie tras llevar a cabo los pasos (a)a (e) del método incluidos en la reivindicación 1.
- (ii)
- una segunda zona habiendo unido a la misma los mismos anticuerpos específicos de antígeno purificados en forma no conjugada, cuya zona está equipada con una ventana para visualizar los cambios de color,
- (b)
- permitir a dicha muestra fluir de manera lateral a lo largo de dicha banda hasta la mencionada primera zona,
- (c)
- permitir a dicha muestra, junto con dicho conjugado de anticuerpos y etiqueta, fluir de manera lateral a lo largo de dicha banda de test hasta dicha segunda zona, y
- (d)
- tras 15 minutos a partir del comienzo del paso (a) observar a través de dicha ventana si una línea de color ha aparecido en dicha segunda zona, indicando de este modo la presencia en la muestra de la especie de bacteria Legionela, o serogrupo de especie, que busca detectarse o el antígeno de carbohidrato de dicha especie o serogrupo de especie.
35. El método de la reivindicación 34 donde el
fluido sospechoso de contener al menos una especie, o serogrupo de
especie, de bacteria Legionela es agua.
36. El método de la reivindicación 34 donde el
fluido sospechoso de contener al menos una especie, o serogrupo de
una especie, de bacteria Legionela es un fluido de origen
mamífero.
37. El método de la reivindicación 36 donde el
fluido natural de origen mamífero es orina humana.
38. El método de la reivindicación 37 donde el
agente etiquetador que muestra un cambio visible de color tras la
reacción de anticuerpos con sus correspondientes parejas de enlace
antigénicos es metal dividido de manera muy fina.
39. El método de la reivindicación 38 donde el
agente etiquetador es oro coloidal.
40. El método de la reivindicación 36 donde la
bacteria o antígeno del mismo a ser detectada es L. Neumófila
serogrupo 1 o su antígeno O-polisacárido y el
antígeno libre de proteína conjugado con la columna cromatográfica
usado en la purificación de anticuerpos es el antígeno 1
O-polisacárido libre de proteína del grupo L.
Neumófila de un cultivo de L. Neumófila serogrupo 1 llevando a cabo
los pasos (a) a (e) de la reivindicación 1.
41. El método de la reivindicación 36 donde los
anticuerpos específicos de antígeno purificados son anticuerpos
para L. Neumófila serogrupo 5, y el antígeno libre de proteína
conjugado con la columna cromatográfica usado en la purificación de
anticuerpos es un antígeno de carbohidrato libre de proteína de L.
Neumófila serogrupo 5 obtenido de un cultivo de L. Neumófila
serogrupo 5 llevando a cabo los pasos (a) a (e) de la reivindicación
1.
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|---|---|---|---|
| US09/139,720 US9134303B1 (en) | 1998-08-25 | 1998-08-25 | ICT immunoassay for Legionella pneumophila serogroup 1 antigen employing affinity purified antibodies thereto |
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