JP2002520151A - 生物学的テンプレート上の高分子電解質 - Google Patents

生物学的テンプレート上の高分子電解質

Info

Publication number
JP2002520151A
JP2002520151A JP2000559929A JP2000559929A JP2002520151A JP 2002520151 A JP2002520151 A JP 2002520151A JP 2000559929 A JP2000559929 A JP 2000559929A JP 2000559929 A JP2000559929 A JP 2000559929A JP 2002520151 A JP2002520151 A JP 2002520151A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
capsule
template
polyelectrolyte
envelope
active substance
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2000559929A
Other languages
English (en)
Other versions
JP4650976B2 (ja
Inventor
ノイ ビョルン
ボイムラー ハンス
ドナート エドウィン
モヤ セルジオ
スホルコフ グレーブ
メーヴァルト ヘルムート
カルーソ フランク
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26051986&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2002520151(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from EP98113181A external-priority patent/EP0972563A1/en
Priority claimed from DE1999107552 external-priority patent/DE19907552A1/de
Application filed by Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV filed Critical Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Publication of JP2002520151A publication Critical patent/JP2002520151A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4650976B2 publication Critical patent/JP4650976B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5089—Processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/20—After-treatment of capsule walls, e.g. hardening
    • B01J13/22—Coating

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • General Preparation And Processing Of Foods (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は高分子電解質外被を有するカプセルの製造方法ならびに該方法により得られるカプセルに関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、高分子電解質外被を有するカプセルの製造方法ならびに該方法によ
り得られるカプセルに関する。
【０００２】 マイクロカプセルは種々の実施態様で公知であり、かつ特に医薬作用物質の制
御された放出および標的に向けた輸送のため、ならびに敏感な作用物質、例えば
酵素およびタンパク質を保護するために使用される。
【０００３】 マイクロカプセルは機械的−物理的な方法により、例えば噴霧およびその後の
被覆、化学的な方法、例えば界面重合もしくは界面縮合またはポリマー相分離に
より、あるいはリポソームへの作用物質のカプセル化により製造することができ
る。しかし従来公知の方法は一連の欠点を有している。
【０００４】 ドイツ国特許出願公開第１９８１２０８３．４号は、直径＜１０μｍを有する
マイクロカプセルの製造方法を記載しており、この場合、テンプレート粒子の水
性分散液に反対に荷電した高分子電解質分子の複数の連続した層を施与する。こ
の場合、テンプレート粒子として特に部分的に架橋したメラミンホルムアルデヒ
ド粒子が記載されている。高分子電解質外被の形成後、メラミンホルムアルデヒ
ド粒子を酸性のｐＨ値の調整により、またはスルホン化により溶解させることが
できる。
【０００５】 意外なことに高分子電解質カプセルは生物細胞、生物学的または／および両親
媒性材料、例えば赤血球、細菌細胞もしくは脂質小胞の凝集体から選択されるテ
ンプレートを使用しても形成できることが判明した。カプセルに入れたテンプレ
ート粒子を引き続き可溶化もしくは分解により除去することができる。
【０００６】 従って本発明は高分子電解質外被を有するカプセルの製造方法に関し、この場
合、生物学的または／および両親媒性材料の凝集体から選択されるテンプレート
上に反対に荷電した高分子電解質分子の複数の連続する層を施与し、かつ場合に
より引き続き該テンプレートを分解する。
【０００７】 テンプレート材料として例えば細胞、例えば真核細胞、例えば哺乳類赤血球ま
たは植物細胞、単核細胞有機体、例えば酵母、細菌細胞、例えばＥ．コリ細胞、
細胞凝集体、細胞レベル下の粒子、例えば細胞器官、花粉、膜調製物または細胞
核、ウイルス粒子および生体分子の凝集体、例えばタンパク質凝集体、例えば免
疫複合体、縮合した核酸、リガンド−受容体−複合体などを使用することができ
る。本発明による方法は生きている生物細胞および有機体のカプセル化のために
もまた適切である。テンプレートとして両親媒性材料、特に膜構造、例えば小胞
、例えばリポソームもしくはミセル、ならびにその他の脂質凝集体が同様に適切
である。
【０００８】 これらのテンプレート上に反対に荷電した複数の高分子電解質層を析出させる
。このためにテンプレート粒子を有利にはまず適切な溶剤、例えば水性媒体中に
分散させる。次いで、特にテンプレート粒子が細胞またはその他の生物学的凝集
体の場合、固定化試薬を充分な濃度で添加し、少なくとも部分的にテンプレート
粒子を固定することができる。固定化試薬のための例はアルデヒド、例えばホル
ムアルデヒドまたはグルタルジアルデヒドであり、これを有利には最終濃度が０
．１〜５％（ｗ／ｗ）となるように媒体に添加する。
【０００９】 高分子電解質とは一般にポリマー鎖の成分または置換基であってもよい、イオ
ン的に解離することができる基と理解される。通常、高分子電解質中のイオン的
に解離可能なこれらの基の数は、解離した形（ポリイオンとも呼ばれる）でポリ
マーが水溶性であるような大きさである。ここでイオン性の基の濃度が水溶性に
とって充分ではないが、しかし自己集合(Selbstassemblierung)に突入するため
に充分な電荷を有するイオノマーもまた高分子電解質という概念で理解される。
有利には外被は「真の」高分子電解質を包含する。解離可能な基の種類に応じて
高分子電解質を多価酸および多塩基に分類する。
【００１０】 解離の際にプロトンの分離下で多価酸からポリアニオンが生じ、該ポリアニオ
ンは無機ポリマーであっても有機ポリマーであってもよい。多価酸のための例は
、ポリリン酸、ポリビニル硫酸、ポリビニルスルホン酸、ポリビニルホスホン酸
およびポリアクリル酸である。ポリ塩とも呼ばれる相応する塩のための例はポリ
リン酸塩、ポリ硫酸塩、ポリスルホン酸塩、ポリホスホン酸塩およびポリアクリ
ル酸塩である。
【００１１】 多塩基は例えば酸との反応により塩を形成しながらプロトンを受け取ることが
できる基を有する。鎖−もしくは側鎖の解離可能な基を有する多塩基のための例
はポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミンおよびポリビニル
ピリジンである。多塩基はプロトンの受容によりポリカチオンを形成する。
【００１２】 本発明により適切な高分子電解質はバイオポリマー、例えばアルギン酸、アラ
ビアゴム、核酸、ペクチン、タンパク質およびその他のものであっても、ならび
に化学的に修飾されたバイオポリマー、例えばカルボキシメチルセルロースおよ
びリグニンスルホネートであっても、ならびに合成ポリマー、例えばポリメタク
リル酸、ポリビニルスルホン酸、ポリビニルホスホン酸およびポリエチレンイミ
ンである。
【００１３】 直鎖状もしくは分枝鎖状の高分子電解質を使用することができる。分枝鎖状の
高分子電解質の使用は、高い度合いの壁孔隙率を有する緻密な高分子電解質の複
数膜につながる。カプセル安定性を向上するために、高分子電解質分子を個々の
層の内部または／およびその中間で、例えばアルデヒドを用いたアミノ基の架橋
により架橋させてもよい。さらに両親媒性高分子電解質、例えば部分的に高分子
電解質の特性を有している両親媒性ブロックコポリマーまたはランダムコポリマ
ーを小さい極性分子に対する透過性を減少するために使用してもよい。このよう
な両親媒性コポリマーは異なった官能価の単位、例えば一方では酸性もしくは塩
基性の単位、および他方ではブロックとして、もしくはランダムに分散してポリ
マー全体に配置されていてもよい疎水性単位、例えばスチレン、ジエンまたはシ
ロキサンなどからなる。外部の条件の相関関係としてその構造を変化するコポリ
マーを使用することによりカプセル壁をその透過性もしくはその他の特性に関し
て定義的に制御することができる。このために例えばポリ（Ｎ−イソプロピル−
アクリルアミド）−割合を有するコポリマー、例えばポリ（Ｎ−イソプロピルア
クリルアミド−アクリル酸）が考えられ、該コポリマーは水素架橋結合の平衡に
よりその水溶性を温度の相関関係として変化させ、このことは膨潤を伴う。
【００１４】 特定の条件下で分解可能な、例えば光、酸もしくは塩基に不安定な高分子電解
質を使用することにより、内包されている作用物質の放出をカプセル壁の溶解に
よって制御することができる。さらに特定の適用可能性のために導電性の高分子
電解質または光学活性基を有する高分子電解質をカプセル成分として使用するこ
とができる。
【００１５】 基本的に使用するべき高分子電解質もしくはイオノマーに関しては、使用され
る分子が充分に高い電荷を有し、または／およびその他の相互作用様式、例えば
水素架橋結合および／または疎水性の相互作用を介してその下に存在する層と結
合する限り、制限は生じない。
【００１６】 従って適切な高分子電解質は分子量の小さい高分子電解質もしくはポリイオン
であっても分子量の大きい高分子電解質、例えば生物由来の高分子電解質であっ
てもよい。
【００１７】 高分子電解質層をテンプレート上に施与するために有利にはまず水溶液中のテ
ンプレート粒子の分散液を製造する。次いでこの分散液にテンプレート粒子の表
面と同一または反対の電荷を有する高分子電解質種を添加する。場合により存在
する過剰の高分子電解質分子の分離後に、第二の層の構成のための使用される、
反対に荷電した高分子電解質種を添加する。引き続きさらに反対に荷電した高分
子電解質の層を交互に施与し、その際、同一の電荷を有するそれぞれの層に関し
て同一または異なった高分子電解質種または高分子電解質種の混合物を選択する
ことができる。層の数は基本的に任意に選択することができ、かつ例えば２〜４
０層、特に４〜２０層の高分子電解質層となる。
【００１８】 所望の数の層を施与した後で、所望の場合には、外被で覆われたテンプレート
粒子を分解することができる。分解は溶解試薬の添加により行うことができる。
この場合、生物学的材料、例えばタンパク質または／および脂質を溶解すること
ができる溶解試薬が適切である。有利には溶解試薬は除蛋白剤、例えばペルオキ
ソ化合物、例えばＨ２Ｏ２または／および次亜塩素酸化合物、例えば次亜塩素酸
ナトリウムもしくは次亜塩素酸カリウムを含有している。意外なことにテンプレ
ート粒子の分解は室温で短いインキュベーション時間、例えば１分〜１時間以内
に行われる。テンプレート粒子の分解は充分に完全である、というのも残留して
いる外被を電子顕微鏡により観察する場合でさえ粒子の残留物はもはや検出不可
能であるからである。生物学的高分子電解質を外被へ組み込む際に空の層もまた
高分子電解質外被中に存在していてもよい。
【００１９】 本発明による方法により得られるカプセルは１０ｎｍ〜５０μｍ、有利には５
０ｎｍ〜１０μｍの範囲の直径で球形から逸脱してもよい、つまり異方性の形状
で製造してもよい。壁厚は高分子電解質層の数により決定され、かつ例えば２〜
１００ｎｍの範囲、特に５〜８０ｎｍの範囲である。該カプセルはその単分散性
により優れている、つまり適切なテンプレートを選択すると、平均的な直径から
の逸脱が５０％を上回るカプセルの割合が１０％未満、および特に有利には１％
未満であるカプセル組成物が得られる。
【００２０】 該カプセルは化学的、生物学的、有機的および熱的な負荷に対して極めて安定
している。これらは凍結させるか、または凍結乾燥させ、引き続き再び適切な溶
剤中に溶解させることができる。
【００２１】 該カプセルはその内部に含有されているテンプレートのミクロ型(Mikroabdrue
cke)であり、かつテンプレートの除去後にもその形を保持するので、異方性の粒
子を製造することができ、この場合、これは生物学的構造、例えば細胞、ウイル
ス粒子もしくは生体分子凝集体のミクロ型である。
【００２２】 外被中の浸透性の修飾は、少なくとも１つの高分子電解質層中の孔の形成もし
くは変化により達成することができる。このような孔は相応する高分子電解質を
使用して自己形成することができる。さらにアニオン性または／およびカチオン
性の基または／および界面活性物質、例えば表面活性剤、または／および透過性
を修飾するための脂質およびその他の特性を有するナノ粒子を使用することがで
きる。さらに浸透性は高分子電解質の析出の際に支配的な条件の変更により修飾
することができる。従って例えば周囲媒体の高い塩濃度は高分子電解質外被の高
い透過性につながる。
【００２３】 高分子電解質外被の透過性の特に有利な修飾は、脂質層または／および両親媒
性高分子電解質を、テンプレート粒子の分解後に高分子電解質外被上に析出させ
ることにより達成することができる。この方法で小さく、かつ極性分子のための
高分子電解質外被の浸透性を著しく低下させることができる。高分子電解質外被
上に析出させることができる脂質の例は、少なくとも１つのイオン性もしくはイ
オン化可能な基を有する脂質、例えばリン脂質、例えばジパルミトイルホスファ
チジン酸または両性イオン性のリン脂質、例えばジパルミトイルホスファチジル
コリンあるいはまた脂肪酸もしくは相応する長鎖のアルキルスルホン酸である。
両性イオン性の脂質を使用する際に高分子電解質外被上に脂質の複数層を析出さ
せることができる。脂質層上に引き続き別の高分子電解質層を析出させることが
できる。
【００２４】 本方法により得られるカプセルは作用物質の封入のために使用することができ
る。これらの作用物質は無機物質であっても有機物質であってもよい。このよう
な作用物質のための例は触媒、特に酵素、医薬作用物質、ポリマー、着色剤、例
えば蛍光性化合物、センサー分子、つまり周囲の条件（温度、ｐＨ値）の変化に
対して検出可能な反応をする分子、農薬および香料である。
【００２５】 該カプセルを化学反応のためのマイクロ反応空間として、または沈殿−もしく
は結晶化テンプレートとして使用することもできる。カプセル壁の浸透性は制御
可能であるため、該壁は例えば分子量の小さい物質を通過させることができるが
、しかし高分子を充分に抑止するという事実に基づいて、化学反応の際に生じる
高分子の生成物の場合、例えば重合の際に生じるポリマーの場合に、容易な方法
で合成中に内部空間に抑止することができる。外部媒体中で同時に合成される反
応生成物を例えば遠心分離または／および濾過により後から、あるいはまたすで
に反応の間に除去することができる。
【００２６】 反応の間、反応基質の供給をカプセル壁による拡散により制御することができ
る。この場合、反応の進行に介入する新規の方法が生じる。例えば濾過により連
続的に、もしくは例えば遠心分離により外部媒体を突発的に交換することもまた
可能であるので、重合反応を基質除去により任意に停止させるかもしくはモノマ
ーを交換することができる。従って新規の方法で、定義されたコポリマーもしく
はマルチポリマーの製造を実施することが可能である。浸透により反応の進行は
モノマー供給を介して制御可能であるので、カプセル中で新規の、およびその他
の分子量分布を有する生成物、例えば高度に単分散性の生成物を製造することが
できる。カプセル内部で合成したポリマーを例えば蛍光染料を用いた滴定により
分光分析を用いて、および共焦点の顕微鏡により検出することができる。個別粒
子の光の散乱を用いて質量の増加ひいては反応速度論を追跡することができる。
【００２７】 作用物質の封入のために、または合成もしくは沈殿法のための反応空間として
異方性のカプセルを使用し、かつ場合により引き続きテンプレート外被を溶解す
る際に、粒子組成物を規定の形および形状を有する分散液として製造することが
できる。従って本発明は、高分子電解質外被中の作用物質のカプセル化により、
例えば合成および沈殿および引き続き熱的もしくは化学的な処理によるテンプレ
ートの除去により得られる異方性の粒子組成物に関する。有利にはこれらの異方
性粒子はテンプレートとして使用されるバイオ構造の形を有している。
【００２８】 さらに該カプセルを有機的な液体、例えばアルコールもしくは炭化水素、例え
ばヘキサノール、オクタノール、オクタンもしくはデカンの導入のため、または
気体のカプセル化のために使用することができる。このような水と非混和性の有
機液体で充填されたカプセルは化学反応、例えば重合反応のためにもまた使用す
ることができる。例えばモノマーをその分布平衡によりカプセルの内部空間中で
適切に富化させることができる。場合によりモノマー溶液はすでに合成の開始前
にカプセルの内部空間に封入されている。
【００２９】 しかしその大きさに基づいて高分子電解質外被中に浸透することができない作
用物質もまたカプセルに封入することができる。このために封入するべき作用物
質をテンプレート粒子に固定するか、または例えば生きている細胞の場合にはフ
ァゴサイトーシスもしくはエンドサイトーシスによりテンプレート粒子により封
入する。テンプレート粒子の分解後に作用物質を高分子電解質外被の内部へ放出
する。その際、有利には作用物質の不所望の分解が生じないようにテンプレート
粒子の分解の際の条件を選択する。
【００３０】 該カプセルは数多くの適用領域、例えばセンサー工学、表面分析化学で、エマ
ルションキャリア(Emulsionstraeger)、例えば触媒法、重合法、沈殿法もしくは
結晶化法のためのマイクロ反応空間として、製剤学および医学において、例えば
作用物質のターゲッティングのため、または超音波造影剤として、食料品科学技
術、化粧品、バイオテクノロジー、センサー工学、情報科学技術および印刷産業
（着色剤のカプセル封入）において使用することができる。さらに該カプセルを
ミクロ複合材料もしくはナノ複合材料、つまり少なくとも２つの異なった材料か
らなり、かつミクロ−もしくはナノスコープなオーダーを有している作用物質の
構成のために使用することができる。
【００３１】 本発明のもう１つの実施態様は固定化された形のテンプレート粒子を有利には
高分子電解質被覆の前に溶解試薬で処理することにより部分的に分解することで
ある。溶解プロセスを適切な時間で中断すると、部分的に溶解した構造、例えば
中心に穴の空いた環状構造が得られ、該構造を引き続き被覆することができる。
引き続き該テンプレート粒子を完全に分解した後で、リング状のカプセルが最終
生成物として得られる。これは例えば光学（マイクロ反響丸天井効果(Mikroflue
sterbogeneffekt)）におけような興味深い適用可能性を有する全く新規の位相品
質である。
【００３２】 本発明を以下の実施例および図面に基づいてさらに詳細に説明する。図面は以
下のものを示している： 図１は、ζ電位の変化（Ａ）および蛍光強度の上昇（Ｂ）を、グルタルジアル
デヒドで固定したヒト赤血球上でのポリ（スチレンスルホン酸ナトリウム塩（Ｐ
ＳＳ）およびポリ（塩酸アリルアミン）（ＰＡＨ）の析出の層の数の相関関係と
して示す。
【００３３】 図２は、１０層のＰＳＳおよびＰＡＨ層で被覆した円板状赤血球の走査型電子
顕微鏡の画像を示す。
【００３４】 図３は、未被覆（Ａ）および被覆した（Ｂ）円板状赤血球ならびに被覆した円
板状赤血球の溶解後に得られる高分子電解質外被（Ｃ）の透過型電子顕微鏡の図
を示す。
【００３５】 図４は、円板状赤血球（Ａ）およびエキノサイト（Ｂ）上に析出した高分子電
解質外被の原子力顕微鏡による画像を示す。
【００３６】 図５は、エキノサイト上に析出し、かつ１１層のＰＳＳ／ＰＡＨからなる高分
子電解質外被を共焦点顕微鏡で撮影した画像を示す。
【００３７】 図６は、６−カルボキシフルオレセインで充填した高分子電解質外被を共焦点
顕微鏡により撮影した画像を示す。
【００３８】 図７は、付加的な被覆を有していない円板状赤血球上の高分子電解質外被の電
子回転スペクトル（Ａ）またはＤＰＰＡ（Ｂ）もしくはＤＰＰＣ（Ｃ）で被覆し
た円板状赤血球上の高分子電解質外被の電子回転スペクトルを示す。
【００３９】 図８は、光学顕微鏡（Ａ）および相応する走査型電子顕微鏡の画像（Ｂ）によ
る円板状赤血球上に析出した高分子電解質外被の画像を示す。
【００４０】 図９は、高分子電解質外被の外側および内部でのラジカル重合によるポリ（ジ
アリルメチルアンモニウムクロリド）の画像を示す。
【００４１】 実施例 １．テンプレートとしてウシおよびヒトの赤血球を用いたポリマー外被の調製 新鮮なヒトもしくはウシの血液から血漿を遠心分離する。引き続き燐酸塩で緩
衝した等張食塩溶液ＰＢＳ（５．８ｍＭ燐酸塩緩衝液 ｐＨ７．４、ＫＣｌ ５
．６ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ）中で２回洗浄する。引き続き赤血球をグルタ
ルジアルデヒドを用いて２％の濃度に固定する。ここに赤血球沈殿物１ｍｌをＰ
ＢＳ１ｍｌと共に補充する。次いでこの溶液にグルタルジアルデヒド（グルタル
ジアルデヒド（２５％水溶液）１部およびＰＢＳ９部）８ｍｌを滴加する。２０
℃で６０分の作用時間の後で該溶液を遠心分離し、かつ赤血球を２回蒸留水で４
回洗浄する。引き続き固定した赤血球を、緩衝していない１５４ｍＭのＮａＣｌ
溶液で補充する。
【００４２】 次の工程として反対に荷電した２種類の高分子電解質の連続的吸着を行う。固
定された赤血球の出発電荷はマイナスであったので、有利にはまずプラスに荷電
した、５０〜６０ｋＤの分子量を有するポリ（アリルアミン）ヒドロクロリド（
ＰＡＨ）（Aldrich)を使用する。しかしまたマイナスに荷電した高分子電解質を
まず第一の層として赤血球上に析出させてもよい。赤血球の被覆のために０．５
ｇ／ｄｌ ＰＡＨおよび０．５ＭのＮａＣｌ濃度を有する溶液４ｍｌを約２．５
（ｖ／ｖ）の赤血球濃度で添加する。２０℃で１０分間の作用時間の後で、赤血
球を遠心分離し、かつ１５４ｍＭのＮａＣｌ中で２回洗浄する。引き続き第二の
層の吸着を行う。この目的のために７０ｋＤの分子量を有し、マイナスに荷電し
たポリ（スチレンスルホネート）−ナトリウム塩（ＰＳＳ）を使用する。すでに
ＰＡＨで被覆した赤血球上での第一のＰＳＳ層の施与のためにＰＳＳ０．５ｇ／
ｄｌおよび０．５ＭのＮａＣｌの濃度および約２．５％（ｖ／ｖ）の赤血球濃度
を有する溶液を作った。２０℃で１０分間の作用時間後に赤血球を遠心分離し、
かつ１５４ｍＭのＮａＣｌ溶液中で２回洗浄した。ＰＡＨ層およびＰＳＳ層の施
与は任意で数回繰り返してもよい。例えばそれぞれ５つのＰＡＨ層および５つの
ＰＳＳ層を施与することができる。
【００４３】 テンプレートの溶解のために、固定された赤血球を１．２％のＮａＯＣｌ溶液
へピペットで移した。同様に市販の除蛋白剤（Produkt、メーカー）または排水
清浄剤（例えばChlorix、メーカー）が適切である。作用時間は２０℃で約２０
分であり、かつ溶液の濁りの消失により光学的に制御可能である。残留している
ポリマー外被を引き続きＮａＣｌ溶液中で洗浄する。
【００４４】 ２．Ｅ．コリ細菌または酵母をテンプレートとして用いるポリマー外被の調製 まずＥ．コリ細胞をＰＢＳ等張溶液中で２回洗浄することにより培養液から分
離する。引き続きグルタルジアルデヒドを用いて固定を行う。このためにコリ細
菌の沈殿物をＰＢＳで２ｍｌになるまで補充する。この溶液にグルタルジアルデ
ヒド溶液８ｍｌを添加して最終濃度を２％とする。２０℃で６０分の作用時間の
後、該溶液を遠心分離し、かつ固定したＥ．コリ細胞を２回蒸留水で４回洗浄す
る。
【００４５】 引き続き、反対に荷電した２種類の高分子電解質の連続した吸着を例１に記載
したとおりに行う。
【００４６】 相応の方法で予備的な固定を行わずに酵母細胞もまた被覆した。
【００４７】 ３．高分子電解質外被上への脂質層の堆積 高分子電解質外被上に脂質層を析出させるために２つの異なった方法を使用し
た。
【００４８】 ３．１ 高分子電解質外被の懸濁液２００μｌをメタノール中で繰り返し洗浄すること
により再懸濁させた。３回目の洗浄の後、純粋なメタノールの代わりに、例えば
メタノール中ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）またはジパルミトイ
ルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）１ｍｇ／ｍｌの脂質溶液５００μｌを沈殿
物に添加する。外被をこのメタノール−脂質溶液中に再懸濁させ、かつ該懸濁液
を９０℃の温度で水浴中に保持する。蒸発させるべきメタノールを、その都度２
０μｌの分量の水の滴加により交換する。メタノール７００μｌと水との交換は
約３０分を要する。
【００４９】 蒸発終了後に外被懸濁液を水で３回洗浄し、かつ繰り返し遠心分離する。２５
０００ｒｐｍで２０分の遠心分離により脂質被覆した外被を沈殿させることがで
きる。
【００５０】 ３．２ 水中で脂質１ｍｇ／ｍｌの濃度を有するＤＰＰＡまたはＤＰＰＣ９０％とＤＰ
ＰＡ１０％との分散液を超音波処理により製造する。得られた脂質小胞の分散液
５００μｌを濃縮した外被懸濁液２００μｌに添加する。３０分後に試料を２５
０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する。上澄みを除去し、かつ水を添加する。こ
の手順を３回繰り返す。その際、脂質で被覆された外被の濃懸濁液が得られる。
【００５１】 ４．高分子電解質外被中への有機溶剤の封入 高分子電解質外被の水性懸濁液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上澄
みを除去した後でメタノールを添加する。外被を再懸濁させ、かつ４０００ｒｐ
ｍで１０分間遠心分離する。改めて上澄みを除去し、メタノールを添加し、かつ
該試料を前記と同一の条件下で遠心分離する。この手順を３回繰り返す。メタノ
ールを用いた最後の遠心分離の後で上澄みをヘキサノールと交換する。外被を再
懸濁させ、かつ５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。この手順を再度３回繰
り返す。
【００５２】 オクタノール、オクタンまたはデカンを外被に封入するために類似の手順を使
用するが、その際、出発材料としてヘキサノール溶液中に存在する外被を使用す
る。遠心分離の速度はオクタノールおよびオクタンに関しては７０００ｒｐｍ（
１０分）に高め、かつデカンに関しては７５００ｒｐｍ（１０分）に高める。
【００５３】 最後に得られた沈殿物を水中に再懸濁させる。外被は水相中に残留し、その一
方で外被同士の間の沈殿物中にまだ存在する痕跡量の溶剤は第二の有機相を形成
する。有機相および水相のために蛍光標識を使用することにより共焦点顕微鏡を
用いて外被が有機溶剤により充填されていることを示すことができる。
【００５４】 記載の手順により、水中の無極性の液体の高度に安定したエマルジョンを製造
することが可能になる。本来の外被の単分散の結果として、得られたエマルジョ
ンは同様に単分散性である。もう１つの利点は、個々の小滴の形でさえ、使用さ
れるテンプレートに依存して、制御することができることである。このことによ
り、球とは異なった表面：体積比を有するエマルジョンの製造が可能になる。
【００５５】 ５．高分子電解質外被の特徴付け 図１はゼータ電位における変化（Ａ）および蛍光強度の上昇（Ｂ）を、グルタ
ルジアルデヒドで予備処理したヒトの赤血球上へのポリ（スチレンスルホン酸ナ
トリウム塩）およびポリ（塩酸アリルアミン）を析出させる際の層の数の関数と
して示している。ζ電位を電気泳動移動度の測定（Elektrophor、Hasotec）によ
り生理食塩溶液中で測定する。蛍光強度の分布は貫流血球計算（FACScan、Becto
n Dickinson）によりＦＩＴＣ−標識したＰＡＨの使用下に３つの連続した層析
出サイクルで記録する。
【００５６】 図２にはＰＳＳおよびＰＡＨの１０の層で覆われた円板状赤血球の走査型電子
顕微鏡の画像を示す。乾燥工程は細胞の端部に沿った高分子電解質層の長軸方向
のしわの発生につながる。
【００５７】 図３は未被覆（Ａ）および被覆後（Ｂ）の円板状赤血球の透過型電子顕微鏡の
画像を示している。高分子電解質外被は明らかに認められる。細胞の可溶化の後
に得られる高分子電解質外被（Ｃ）は、２つの意想外の特性を示す。倍率はＡお
よびＢでは１：１５０００およびＣでは１：１７０００である。第一にこれらは
本来の細胞の形に類似しており、かつ第二にこれらは外被に亀裂もしくは比較的
大きな孔が認識されずに完全に空であるように見える。
【００５８】 図４には原子力顕微鏡（ＡＦＭ）により得られた２つの画像（幅１０μｍ）が
示されており、これは円板状赤血球（Ａ）およびエキノサイト（Ｂ）上に析出し
た、合計９つの層からなる高分子電解質外被を示している。楕円形の円板状赤血
球上に析出した外被はわずかなしわを示すのみである一方で、星形のエキノサイ
ト上の析出プロセスは、その上に本来のテンプレートの突出部さえも認識できる
ような良好に構造化された外被につながる。このことは図５に示された、エキノ
サイト上に析出したＰＳＳ／ＰＡＨの１１の層からなる高分子電解質外被の共焦
点顕微鏡の画像からよりいっそう明らかになる。最外層はＦＩＴＣにより標識し
たＰＡＨからなる。画像の幅は７μｍである。スキャンを２つのレベルで１μｍ
の間隔により別々に行った。スキャンＡはスライドガラス上に施与した外被上の
上部を通過して走行する。この画像上で外被の内部は、突出部の領域においてさ
えも空であることが認識される。
【００５９】 図６は共焦点顕微鏡を用いて撮影した、円板状赤血球上に析出した、ＰＳＳ／
ＰＡＨの１０の層からなる高分子電解質外被の画像を示している。外被を６−カ
ルボキシフルオレセイン（６−ＣＦ）溶液１００μＭを用いて処理した。図６Ａ
では外被内にフルオレセインが認識される。このことは６−ＣＦ分子が外被の内
部の侵入できることを示している。
【００６０】 １００ｎＭの６−ＣＦを用いた外被のインキュベーションの際に蛍光を発見す
ることはできなかった。このことは溶解試薬を用いた処理により６−ＣＦを結合
する能力のあるアミノ基がＰＡＨにより分解されるおよび／またはブロックされ
ることを示している。６−ＣＦのわずかな濃度に基づいて溶液の蛍光は背景とし
て検出できるためには少なすぎる。
【００６１】 気化による例３に記載の高分子電解質外被上へのジパルミトイルホスファチジ
ン酸（ＤＰＰＡ）または両性イオン性の脂質、例えばジパルミトイルホスファチ
ジルコリン（ＤＰＰＣ）の吸着により安定した脂質層で覆われた高分子電解質外
被が得られる。脂質層は外被への６−ＣＦの侵入を充分に阻止する（図６Ｂ）。
図６Ａおよび６Ｂ中に記載されている画像の幅は１６もしくは１５μｍである。
別の実験は脂質層が少なくとも４週間は安定しており、かつ脂質層上に別の高分
子電解質層が、その下に存在する脂質層を破壊することなく析出できることを示
している。
【００６２】 エレクトロローテーション(Elektrorotation)の技術（Arnold et al., J. Phy
s. Chem. 91 (1987), 5093; Fuhr et al., In: Electromanipulation of Cells,
U. Zimmermann und G. A. Neil, Hrgs., CRC Press, Boca Raton (1996), 259-
328; Prueger et al., Biophys. J. 72 (1997), 1414)は多層構造の誘電性の区
別を可能にする分光分析法である。この場合、ＫＨｚ範囲〜ＭＨｚ範囲で回転す
る電界を粒子懸濁液において印加する。誘導されたダイポールモーメントは、電
界の回転速度が速すぎ、誘導するべきダイポールモーメントが電界に従うことが
できない場合に、印加された電界ベクターを有する角度を形成する。結果として
該粒子は回転モーメントを得、これは再度認識可能な粒子自体の回転につながる
。電子回転のスペクトルは粒子の回転速度の測定により外側の電界の回転数の関
数として得られる。
【００６３】 図７はコントロールとしての未被覆の高分子電解質外被（Ａ）、ＤＰＰＡ被覆
した高分子電解質外被（Ｂ）およびＤＰＰＣで被覆した高分子電解質外被（Ｃ）
のための３つの典型的な電子回転スペクトルを示す。外被の外側の水相の導電率
は２．０００μＳ／ｃｍ、８０μＳ／ｃｍもしくは１００μＳ／ｃｍであった。
絶縁性の脂質層の存在はＫＨｚ範囲におけるマイナスの回転方向につながる。強
導電性の高分子電解質外被（約１０４μＳ／ｃｍ）は、コントロールにおいてＭ
Ｈｚ領域で認識可能なプラスのピークを生じる。弱導電性のＤＰＰＡ層は周波数
が高い場合にショートする。ＤＰＰＣ被覆の場合にプラスの回転が存在しないこ
とは脂質の複数層が存在していることを示唆している。この結果は、透過性を制
御するために高分子電解質の複数層を脂質で有利に被覆でき、かつ被覆した外被
はイオン性の化合物、例えば塩に関してほとんど透過性ではないことを示してい
る。
【００６４】 空の高分子電解質外被は、有機または無機材料の制御された沈殿または結晶化
のためにも使用することができる。このために円板状赤血球をテンプレートとし
た高分子電解質外被を３０ｍＭの６−ＣＦ溶液中ｐＨ７でインキュベーションす
る。引き続きｐＨ値は急速に３．５の値に変化し、その際、６−ＣＦは充分に不
溶性になる。１〜１２時間にわたるインキュベーションの後、明らかに完全に６
−ＣＦで充填され、かつ空の外被の混合物が得られる。図８Ａは高分子電解質外
被（１０層）の光学顕微鏡による撮影を、および図８Ｂは相応する走査型電子顕
微鏡による画像を示している。完全に暗い画像Ａは結晶化した６−ＣＦの顕著な
吸着に起因する。ＳＥＭ画像は、外被の内部で結晶化した６−ＣＦが本来のテン
プレートの形をとっていることを示している。画像Ａの幅は８μｍである。別の
実験ではローダミンＢをｐＨ値の上昇により沈殿させることができることが示さ
れた。作用物質の沈殿はその他の手段、例えば溶剤の交換、塩沈殿などによって
もまた誘発することができる。これらの結果は、高分子電解質外被を結晶化もし
くは沈殿法のためのテンプレートとして使用できることを示しており、これによ
り反応により生じたコロイド状の粒子の大きさおよび形の制御が可能になる。
【００６５】 図９はＰＡＨ／ＰＳＳ外被中でのジアリルジメチルアンモニウムクロリド（Ｄ
ＡＤＭＡＣ）のラジカル重合の結果を示している。このために２％のカプセル懸
濁液中の３％モノマー溶液に重合開始剤ペルオキソ二硫酸ナトリウム（３０ｍｇ
／１００ｍｌ）を添加し、かつ７０℃で９．５時間重合した。遠心分離により界
面層中で合成されるポリマーＰＤＡＤＭＡＣを分離した。１００ｍＭの６−ＣＦ
を用いた処理の後で、ＰＤＡＤＭＡＣのアミノ基への色素の結合は明らかに認識
することができる。該ポリマーはマイナスのカプセル壁に吸着されるが、しかし
カプセルの内部にもみられる。
【００６６】 ９つの層からなる高分子電解質外被（［ＰＳＳ／ＰＡＨ］４ＰＳＳ）をヒト赤
血球上に析出させ、かつテンプレート粒子を除去した。引き続き別の層ＰＡＨを
施与した。アクリル酸をポリアクリル酸へとラジカル重合するためにカプセルを
使用した。このために２％のカプセル懸濁液中の３％のモノマー溶液に開始剤ペ
ルオキソ二硫酸ナトリウム（３０ｍｇ／１００ｍｌ）を添加し、かつ７０℃で９
．５時間重合させた。遠心分離により界面層中で合成されるポリアクリル酸を除
去した。１００ｎＭのローダミンＢ（選択的にアニオン基に結合する）の添加後
にマイナスに荷電したカプセル壁に、あるいはまたカプセルの内部に吸着された
ポリアクリル酸の存在を検出することができた。アクリル酸により媒介される架
橋形成に基づいてカプセルの凝集化が行われた。アクリル酸のこの吸着は、外側
のマイナスの荷電を有するカプセルの使用により防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ζ電位（Ａ）の変化および蛍光強度（Ｂ）の上昇を示す図
【図２】 ＰＳＳおよびＰＡＨの層で被覆した円板状赤血球の走査型電子顕微鏡の画像を
示す図
【図３】 未被覆（Ａ）および被覆した（Ｂ）円板状赤血球ならびに被覆した円板状赤血
球の溶解後に得られる高分子電解質外被（Ｃ）の透過型電子顕微鏡による画像を
示す図
【図４】 円板状赤血球（Ａ）およびエキノサイト（Ｂ）上に析出した高分子電解質外被
の原子力顕微鏡による画像を示す図
【図５】 エキノサイト上に析出し、かつＰＳＳ／ＰＡＨからなる高分子電解質外被の共
焦点顕微鏡による画像を示す図
【図６】 ６−カルボキシフルオレセインで充填した高分子電解質外被の共焦点顕微鏡に
よる画像を示す図
【図７】 付加的な被覆を有していない円板状赤血球上の高分子電解質外被の電子回転ス
ペクトル（Ａ）またはＤＰＰＡ（Ｂ）もしくはＤＰＰＣ（Ｃ）で被覆した円板状
赤血球上の高分子電解質外被の電子回転スペクトルを示す図
【図８】 光学顕微鏡（Ａ）および相応する走査型電子顕微鏡の画像（Ｂ）による円板状
赤血球上に析出した高分子電解質外被を示す図
【図９】 高分子電解質外被の外側および内部でのラジカル重合によるポリ（ジアリルメ
チルアンモニウムクロリド）の画像を示す図
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年９月１日（２０００．９．１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＵＳ (71)出願人 Ｂｅｒｌｉｎ，ＢＲＤ (72)発明者 エドウィン ドナート ドイツ連邦共和国 ギーゼンホルスト ド レーツァー シュトラーセ １ (72)発明者 セルジオ モヤ ドイツ連邦共和国 ベルリン カロリンガ ープラッツ １ (72)発明者 グレーブ スホルコフ ロシア国 モスクワ ディストリクト ミ クロレイオン エービー−５−33 プシー ノ （番地なし) (72)発明者 ヘルムート メーヴァルト ドイツ連邦共和国 ビンゲン ドクトル− ゲバウアー−シュトラーセ 21 (72)発明者 フランク カルーソ ドイツ連邦共和国 ベルリン レンネベル クシュトラーセ ６ Ｆターム(参考） 4B035 LE07 LE12 LG15 LG20 LG22 LG25 LG26 LK14 LP36 4G005 AA01 AA02 AB02 AB10 BA20 BB04 BB06 DB05Z DB12Z DB14Z DB16Z DB17Z DB21Z DB22X DB25X DB27X DB30X DB30Z DC03Y DC10Y DC12W DC15W DC17W DC26Y DC29Y DC42Y DC52Y DC56Y DC62Y DD09Y DD33Y DD70Z DD80Z DE01Z DE02Z EA01 EA03 EA08

Claims (33)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 高分子電解質外被を有するカプセルの製造方法において、生
    物学的または／および両親媒性材料の凝集体から選択されるテンプレート上に反
    対に荷電した高分子電解質分子の複数の重なり合った層を施与し、かつ引き続き
    場合により該テンプレートを分解することを特徴とする、高分子電解質外被を有
    するカプセルの製造方法。
  2. 【請求項２】 細胞、細胞凝集体、細胞レベル下の粒子、ウイルス粒子およ
    び生体分子の凝集体からなる群から選択されるテンプレートを使用する、請求項
    １記載の方法。
  3. 【請求項３】 花粉をテンプレートとして使用する、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 小胞、ミセルおよび脂質凝集体からなる群から選択されるテ
    ンプレートを使用する、請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 テンプレートを固定化試薬で予備処理する、請求項１から４
    までのいずれか１項記載の方法。
  6. 【請求項６】 ホルムアルデヒドまたは／およびグルタルジアルデヒドを固
    定化試薬として使用する、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
  7. 【請求項７】 部分的に分解したテンプレートを高分子電解質分子の施与の
    ための出発材料として使用する、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法
    。
  8. 【請求項８】 テンプレートが環状構造を有する、請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 テンプレートの分解を溶解試薬の添加により行う、請求項１
    から８までのいずれか１項記載の方法。
  10. 【請求項１０】 溶解試薬がペルオキソ化合物および次亜塩素酸化合物から
    選択される除蛋白剤を含有する、請求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】 次亜塩素酸ナトリウムまたは次亜塩素酸カリウムを除蛋白
    剤として使用する、請求項１０記載の方法。
  12. 【請求項１２】 テンプレートの分解後に少なくとも１種の脂質層を高分子
    電解質外被上に析出させる、請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
  13. 【請求項１３】 少なくとも１種の別の高分子電解質層を脂質層上に析出さ
    せる、請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 作用物質をカプセル中に導入する、請求項１から１３まで
    のいずれか１項記載の方法。
  15. 【請求項１５】 作用物質を触媒、医薬作用物質、ポリマー、着色剤、セン
    サー分子、香料および農薬から選択する、請求項１から１４までのいずれか１項
    記載の方法。
  16. 【請求項１６】 有機の液体もしくは気体をカプセル中に導入する、請求項
    １から１５までのいずれか１項記載の方法。
  17. 【請求項１７】 カプセル中または／およびカプセル上で化学反応、例えば
    ポリマー合成を実施する、請求項１から１６までのいずれか１項記載の方法。
  18. 【請求項１８】 カプセル中または／およびカプセル上で沈殿または結晶化
    を実施する、請求項１から１７までのいずれか１項記載の方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１から１８までのいずれか１項記載の方法により得
    られる高分子電解質カプセル。
  20. 【請求項２０】 テンプレート粒子をその内部に含有している、請求項１９
    記載のカプセル。
  21. 【請求項２１】 検出可能なテンプレート残留物を含有していない、請求項
    １８記載のカプセル。
  22. 【請求項２２】 テンプレート粒子により規定される外形を有している、請
    求項１９から２１までのいずれか１項記載のカプセル。
  23. 【請求項２３】 異方性の形状を有している、請求項２２記載のカプセル。
  24. 【請求項２４】 環状の形状を有している、請求項２３記載のカプセル。
  25. 【請求項２５】 作用物質を含有している、請求項１９から２４までのいず
    れか１項記載のカプセル。
  26. 【請求項２６】 作用物質のカプセル化のための請求項１９から２５までの
    いずれか１項記載のカプセルの使用。
  27. 【請求項２７】 化学反応のためのミクロ反応空間として、または沈殿テン
    プレートもしくは結晶化テンプレートとしての請求項１９から２５までのいずれ
    か１項記載のカプセルの使用。
  28. 【請求項２８】 センサー工学、表面分析化学または情報科学技術における
    、請求項１９から２５までのいずれか１項記載のカプセルの使用。
  29. 【請求項２９】 製薬学および医学、食料品科学技術、バイオテクノロジー
    、化粧品および印刷産業における請求項１９から２５までのいずれか１項記載の
    カプセルの使用。
  30. 【請求項３０】 ミクロ複合材料もしくはナノ複合材料の構成のための請求
    項１９から２５までのいずれか１項記載のカプセルの使用。
  31. 【請求項３１】 エマルションキャリアとしての請求項１９から２５までの
    いずれか１項記載のカプセルの使用。
  32. 【請求項３２】 請求項２３または２４記載のカプセル中へ作用物質をカプ
    セル化し、かつ高分子電解質外被を除去することにより得られる、異方性粒子組
    成物。
  33. 【請求項３３】 分散液の形の請求項３２記載の組成物。
JP2000559929A 1998-07-15 1999-07-15 生物学的テンプレート上の高分子電解質 Expired - Fee Related JP4650976B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP98113181A EP0972563A1 (en) 1998-07-15 1998-07-15 Fabrication of multilayer-coated particles and hollow shells via electrostatic self-assembly of nanocomposite multilayers on decomposable colloidal templates
DE98113181.6 1999-02-22
DE1999107552 DE19907552A1 (de) 1999-02-22 1999-02-22 Polyelektrolythüllen auf biologischen Templaten
DE19907552.2 1999-02-22
PCT/EP1999/005063 WO2000003797A1 (de) 1998-07-15 1999-07-15 Polyelektrolythüllen auf biologischen templaten

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2002520151A true JP2002520151A (ja) 2002-07-09
JP4650976B2 JP4650976B2 (ja) 2011-03-16

Family

ID=26051986

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000559929A Expired - Fee Related JP4650976B2 (ja) 1998-07-15 1999-07-15 生物学的テンプレート上の高分子電解質

Country Status (7)

Country Link
US (1) US6699501B1 (ja)
EP (1) EP1098696B2 (ja)
JP (1) JP4650976B2 (ja)
AT (1) ATE377449T1 (ja)
DE (1) DE59914547D1 (ja)
ES (1) ES2292250T5 (ja)
WO (1) WO2000003797A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007529303A (ja) * 2004-03-19 2007-10-25 カプサルーション ナノサイエンス アクチェン ゲゼルシャフト 多孔質テンプレートを用いたｃｓ粒子およびマイクロカプセルの製造方法、ｃｓ粒子およびマイクロカプセル、およびそれらの使用
JP5245252B2 (ja) * 2004-10-18 2013-07-24 セイコーエプソン株式会社 カプセル化物及びその製造方法、並びにインク組成物

Families Citing this family (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999047252A2 (de) 1998-03-19 1999-09-23 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Herstellung von nano- und mikrokapseln durch schichtweise polyelektrolyt-selbstassemblierung
US7101575B2 (en) * 1998-03-19 2006-09-05 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Production of nanocapsules and microcapsules by layer-wise polyelectrolyte self-assembly
ATE228883T1 (de) * 1998-03-19 2002-12-15 Max Planck Gesellschaft Herstellung von mit mehrlagen gestrichenen partikeln und hohlen schalen durch elektrostatische selbstorganisierung von nanokompositmehrlagen auf zersetzbaren schablonen
DE10001172A1 (de) * 2000-01-13 2001-07-26 Max Planck Gesellschaft Templatieren von Feststoffpartikeln mit Polymermultischichten
DE10010264A1 (de) 2000-03-02 2001-09-13 Novosom Gmbh Stabilisierte Liposomen und Hüllstrukturen
JP2004507488A (ja) * 2000-08-28 2004-03-11 マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ 高分子電解質多層カプセルの制御された持続性の放出特性
DE10132669B4 (de) * 2001-07-05 2008-08-07 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Pharmakologische Zubereitung aus einem nanopartikulären mesomorphen Polyelektrolyt-Lipid-Komplex und mindestens einem Wirkstoff
US20080026068A1 (en) * 2001-08-16 2008-01-31 Baxter Healthcare S.A. Pulmonary delivery of spherical insulin microparticles
US7112361B2 (en) * 2001-10-25 2006-09-26 Massachusetts Institute Of Technology Methods of making decomposable thin films of polyelectrolytes and uses thereof
US7504364B2 (en) * 2002-03-01 2009-03-17 Receptors Llc Methods of making arrays and artificial receptors
WO2003090920A1 (en) * 2002-04-25 2003-11-06 Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wissenschaften Core-assisted formation of microcapsules
US20050037429A1 (en) * 2003-03-28 2005-02-17 Receptors Llc Artificial receptors including reversibly immobilized building blocks and methods
US20040137481A1 (en) * 2002-09-16 2004-07-15 Receptors Llc Artificial receptor building blocks, components, and kits
WO2005003326A2 (en) * 2003-03-28 2005-01-13 Receptors Llc. Artificial receptors including reversibly immobilized building blocks and methods
US20060057625A1 (en) * 2002-09-16 2006-03-16 Carlson Robert E Scaffold-based artificial receptors and methods
US7469076B2 (en) * 2003-09-03 2008-12-23 Receptors Llc Sensors employing combinatorial artificial receptors
US20050136483A1 (en) * 2003-09-03 2005-06-23 Receptors Llc Nanodevices employing combinatorial artificial receptors
US20050037381A1 (en) * 2002-09-16 2005-02-17 Receptors Llc Artificial receptors, building blocks, and methods
US7312040B2 (en) * 2002-09-20 2007-12-25 Agilent Technologies, Inc. Microcapsule biosensors and methods of using the same
US8105652B2 (en) * 2002-10-24 2012-01-31 Massachusetts Institute Of Technology Methods of making decomposable thin films of polyelectrolytes and uses thereof
US7666410B2 (en) 2002-12-20 2010-02-23 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Delivery system for functional compounds
US8409618B2 (en) 2002-12-20 2013-04-02 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Odor-reducing quinone compounds
US6780896B2 (en) 2002-12-20 2004-08-24 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Stabilized photoinitiators and applications thereof
US7767219B2 (en) 2003-01-31 2010-08-03 Boston Scientific Scimed, Inc. Localized drug delivery using drug-loaded nanocapsules
DE10361170A1 (de) * 2003-06-13 2005-01-05 Henkel Kgaa Lagerstabiles Polyelektrolytkapselsystem auf Basis von Peroxycarbonsäuren
DE10361084A1 (de) * 2003-06-13 2005-01-05 Henkel Kgaa Lagerstabile Bleichmittelzusammensetzungen auf Basis von Peroxycarbonsäuren
DE10361100A1 (de) * 2003-06-13 2005-01-05 Henkel Kgaa Lagerstabile Kapseln auf Basis von Peroxycarbonsäuren
US7364585B2 (en) * 2003-08-11 2008-04-29 Boston Scientific Scimed, Inc. Medical devices comprising drug-loaded capsules for localized drug delivery
US7550557B2 (en) * 2003-08-29 2009-06-23 Louisiana Tech University Foundation, Inc. Multilayer films, coatings, and microcapsules comprising polypeptides
US7348399B2 (en) * 2003-08-29 2008-03-25 Louisiana Tech University Foundation, Inc. Nanofabricated polypeptide multilayer films, coatings, and microcapsules
US7544770B2 (en) * 2003-08-29 2009-06-09 Louisiana Tech Foundation, Inc. Multilayer films, coatings, and microcapsules comprising polypeptides
US7678367B2 (en) 2003-10-16 2010-03-16 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Method for reducing odor using metal-modified particles
US7438875B2 (en) 2003-10-16 2008-10-21 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Method for reducing odor using metal-modified silica particles
US7754197B2 (en) 2003-10-16 2010-07-13 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Method for reducing odor using coordinated polydentate compounds
US7413550B2 (en) 2003-10-16 2008-08-19 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Visual indicating device for bad breath
US7488520B2 (en) 2003-10-16 2009-02-10 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. High surface area material blends for odor reduction, articles utilizing such blends and methods of using same
US8481017B2 (en) * 2004-02-23 2013-07-09 Florida State University Research Foundation, Inc. Thin films for controlled protein interaction
US8137728B2 (en) * 2004-03-11 2012-03-20 University Of Massachusetts Biopolymer encapsulation and stabilization of lipid systems and methods for utilization thereof
EP1586583A3 (en) * 2004-04-16 2005-11-16 Alligator Bioscience AB (publ) Compounds that block C5a complement receptor and their use in therapy
EP1593374A1 (en) * 2004-05-07 2005-11-09 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Remote control release of encapsulated material
US8728525B2 (en) * 2004-05-12 2014-05-20 Baxter International Inc. Protein microspheres retaining pharmacokinetic and pharmacodynamic properties
MX2007000784A (es) 2004-07-20 2007-04-09 Genentech Inc Inhibidores de proteina 4 tipo angiopoietina, combinaciones y su uso.
US8119153B2 (en) 2004-08-26 2012-02-21 Boston Scientific Scimed, Inc. Stents with drug eluting coatings
WO2006029234A1 (en) 2004-09-03 2006-03-16 Receptors Llc Combinatorial artificial receptors including tether building blocks
EP1789792A2 (en) * 2004-09-11 2007-05-30 Receptors LLC Combinatorial artificial receptors including peptide building blocks
AU2005309854A1 (en) * 2004-11-24 2006-06-01 Therakine Ltd. An implant for intraocular drug delivery
DE102005014083A1 (de) * 2005-03-22 2006-09-28 Universität Leipzig Kolloidale Nanokomposite aus LbL-Partikeln, Lipiden und biologischen Komponenten angewandt in Medizin, Molekularbiologie und Diagnostik
US20060260777A1 (en) * 2005-04-27 2006-11-23 Julia Rashba-Step Surface-modified microparticles and methods of forming and using the same
US20070048383A1 (en) * 2005-08-25 2007-03-01 Helmus Michael N Self-assembled endovascular structures
US20070104866A1 (en) * 2005-09-28 2007-05-10 Mcclements David J Encapsulated emulsions and methods of preparation
DE502006007414D1 (de) 2006-03-15 2010-08-26 Clariant Finance Bvi Ltd Polyelektrolyt-verkapselte Pigmente
EP1849482A1 (en) * 2006-04-25 2007-10-31 Capsulution Nanoscience AG Multimodally altered cells as a form for administering active substances and as diagnostic particles
US20070281031A1 (en) * 2006-06-01 2007-12-06 Guohan Yang Microparticles and methods for production thereof
EP2043773B1 (de) * 2006-07-13 2009-12-16 Basf Se Polyelektrolyt-modifizierte mikrokapseln
CN105168146A (zh) 2006-08-04 2015-12-23 巴克斯特国际公司 预防和/或逆转新发作自身免疫糖尿病的基于微球的组合物
EP2068845A2 (en) * 2006-10-06 2009-06-17 Baxter International Inc. Microencapsules containing surface-modified microparticles and methods of forming and using the same
US9274106B2 (en) * 2007-04-04 2016-03-01 Particle Sciences, Inc. Methods and devices for detecting binding events via zeta-potential and pharmacologically active compounds and delivery systems identified thereby
DE102007024642A1 (de) 2007-05-24 2008-11-27 Eyesense Ag Hydrogel-Implantat für Sensorik von Metaboliten am Auge
WO2008157372A2 (en) 2007-06-14 2008-12-24 Massachusetts Institute Of Technology Self assembled films for protein and drug delivery applications
WO2010021973A2 (en) * 2008-08-17 2010-02-25 Massachusetts Institute Of Technology Controlled delivery of bioactive agents from decomposable films
US20100047292A1 (en) * 2008-08-20 2010-02-25 Baxter International Inc. Methods of processing microparticles and compositions produced thereby
US8323685B2 (en) 2008-08-20 2012-12-04 Baxter International Inc. Methods of processing compositions containing microparticles
US8323615B2 (en) * 2008-08-20 2012-12-04 Baxter International Inc. Methods of processing multi-phasic dispersions
US8367427B2 (en) * 2008-08-20 2013-02-05 Baxter International Inc. Methods of processing compositions containing microparticles
EP2330184B1 (en) 2008-09-01 2020-11-25 Shinshu University Process for producing a useful substance in coryneform bacteria
FR2968993B1 (fr) * 2010-12-17 2012-12-28 Flamel Tech Sa Nanoparticules comportant au moins un actif et au moins deux polyelectrolytes
FR2968994B1 (fr) * 2010-12-17 2012-12-28 Flamel Tech Sa Procede de preparation de nanoparticules
DE102011000264B4 (de) 2011-01-21 2019-01-17 Surflay Nanotec Gmbh Mikrogasbläschen mit PVA-Wand, Herstellung und Verwendung von solchen Mikrogasbläschen
US10278927B2 (en) 2012-04-23 2019-05-07 Massachusetts Institute Of Technology Stable layer-by-layer coated particles
WO2014134029A1 (en) 2013-02-26 2014-09-04 Massachusetts Institute Of Technology Nucleic acid particles, methods and use thereof
US9463244B2 (en) 2013-03-15 2016-10-11 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for nucleic acid delivery
FR3029836B1 (fr) * 2014-12-11 2016-12-23 Saint Gobain Feuillete d'une feuille de materiau polymere epais et d'une feuille de verre mince
US10307513B2 (en) * 2015-06-12 2019-06-04 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Biomimetic hydrogel scaffolds and related methods
WO2019089567A1 (en) 2017-10-30 2019-05-09 Massachusetts Institute Of Technology Layer-by-layer nanoparticles for cytokine therapy in cancer treatment
WO2021002984A1 (en) 2019-05-30 2021-01-07 Massachusetts Institute Of Technology Peptide nucleic acid functionalized hydrogel microneedles for sampling and detection of interstitial fluid nucleic acids
GB2590721A (en) 2019-12-31 2021-07-07 Inst Jozef Stefan Controlled aggregation of cells

Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60190229A (ja) * 1984-02-13 1985-09-27 デイモン・バイオテツク・インコーポレーテツド カプセル化方法
JPS60224627A (ja) * 1984-04-23 1985-11-09 Sumitomo Bakelite Co Ltd 動物遊離細胞のカプセル化方法
JPS62213839A (ja) * 1986-03-14 1987-09-19 Hoechst Gosei Kk 均一に被覆された複合体粒子の製造方法
JPH03500721A (ja) * 1987-07-24 1991-02-21 ザ、リージェンツ、オブ、ザ、ユニバーシティ、オブ、ミシガン 半透膜内に生物学的材料のカプセル化
JPH05138009A (ja) * 1991-11-22 1993-06-01 Japan Synthetic Rubber Co Ltd 球状無機質中空粒子の製造方法
JPH05504573A (ja) * 1990-02-20 1993-07-15 デルタ、バイオテクノロジー、リミテッド 診断補助物
WO1995026714A1 (en) * 1994-04-01 1995-10-12 The Johns Hopkins University Living cells microencapsulated in a polymeric membrane
JPH08310115A (ja) * 1995-05-19 1996-11-26 Canon Inc 被記録媒体とその製造方法、及びこれを用いた画像形成方法
JPH09509612A (ja) * 1994-03-01 1997-09-30 ニユコメド・イメージング・アクシエセルカペト 画像診断用造影剤として有用な気体含有微小カプセル
JPH105577A (ja) * 1996-06-27 1998-01-13 Kiteii:Kk 芯物質含有カルシウム微粒子の製法
JP2002506719A (ja) * 1998-03-19 2002-03-05 マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ 層状の高分子電解質自己集合によるナノカプセルおよびマイクロカプセルの製造
JP2002515932A (ja) * 1997-04-18 2002-05-28 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー 多機能性ポリマー性組織コーティング
JP2003522621A (ja) * 1998-03-19 2003-07-29 マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ 分解性コロイド原型上のナノ複合多層の静電的自己集成体による多層被覆粒子及び中空シェルの製造

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4026978A1 (de) † 1990-08-25 1992-02-27 Bayer Ag Auf traegern angebrachte ein- oder mehrlagige schichtelemente und ihre herstellung
US5529914A (en) † 1990-10-15 1996-06-25 The Board Of Regents The Univeristy Of Texas System Gels for encapsulation of biological materials
DE4312970A1 (de) † 1993-04-21 1994-10-27 Juergen Dr Schrezenmeir Mikrokapsel sowie Verfahren und Vorrichtung zu ihrer Herstellung
US5700559A (en) * 1994-12-16 1997-12-23 Advanced Surface Technology Durable hydrophilic surface coatings
CZ286845B6 (cs) 1995-03-27 2000-07-12 Ústav Makromolekulární Chemie Av Čr Způsob imobilizace bílkovin a polyelektrolytů na povrchu pevných objektů
DE19519804A1 (de) † 1995-05-31 1996-12-05 Juergen Dr Schrezenmeir Bioaktive Kapsel mit veränderlicher Hülle
EP0951280B1 (en) * 1996-10-03 2004-01-14 Hermes Biosciences, Inc. Hydrophilic microparticles and methods to prepare same
DE19812083A1 (de) * 1998-03-19 1999-09-30 Max Planck Gesellschaft Herstellung von Nano- und Mikrokapseln durch schichtweise Polyelektrolyt-Selbstassemblierung

Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60190229A (ja) * 1984-02-13 1985-09-27 デイモン・バイオテツク・インコーポレーテツド カプセル化方法
JPS60224627A (ja) * 1984-04-23 1985-11-09 Sumitomo Bakelite Co Ltd 動物遊離細胞のカプセル化方法
JPS62213839A (ja) * 1986-03-14 1987-09-19 Hoechst Gosei Kk 均一に被覆された複合体粒子の製造方法
JPH03500721A (ja) * 1987-07-24 1991-02-21 ザ、リージェンツ、オブ、ザ、ユニバーシティ、オブ、ミシガン 半透膜内に生物学的材料のカプセル化
JPH05504573A (ja) * 1990-02-20 1993-07-15 デルタ、バイオテクノロジー、リミテッド 診断補助物
JPH05138009A (ja) * 1991-11-22 1993-06-01 Japan Synthetic Rubber Co Ltd 球状無機質中空粒子の製造方法
JPH09509612A (ja) * 1994-03-01 1997-09-30 ニユコメド・イメージング・アクシエセルカペト 画像診断用造影剤として有用な気体含有微小カプセル
WO1995026714A1 (en) * 1994-04-01 1995-10-12 The Johns Hopkins University Living cells microencapsulated in a polymeric membrane
JPH08310115A (ja) * 1995-05-19 1996-11-26 Canon Inc 被記録媒体とその製造方法、及びこれを用いた画像形成方法
JPH105577A (ja) * 1996-06-27 1998-01-13 Kiteii:Kk 芯物質含有カルシウム微粒子の製法
JP2002515932A (ja) * 1997-04-18 2002-05-28 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー 多機能性ポリマー性組織コーティング
JP2002506719A (ja) * 1998-03-19 2002-03-05 マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ 層状の高分子電解質自己集合によるナノカプセルおよびマイクロカプセルの製造
JP2003522621A (ja) * 1998-03-19 2003-07-29 マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ 分解性コロイド原型上のナノ複合多層の静電的自己集成体による多層被覆粒子及び中空シェルの製造

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007529303A (ja) * 2004-03-19 2007-10-25 カプサルーション ナノサイエンス アクチェン ゲゼルシャフト 多孔質テンプレートを用いたｃｓ粒子およびマイクロカプセルの製造方法、ｃｓ粒子およびマイクロカプセル、およびそれらの使用
JP5245252B2 (ja) * 2004-10-18 2013-07-24 セイコーエプソン株式会社 カプセル化物及びその製造方法、並びにインク組成物

Also Published As

Publication number Publication date
EP1098696B1 (de) 2007-11-07
ATE377449T1 (de) 2007-11-15
JP4650976B2 (ja) 2011-03-16
DE59914547D1 (de) 2007-12-20
ES2292250T3 (es) 2008-03-01
EP1098696A1 (de) 2001-05-16
US6699501B1 (en) 2004-03-02
EP1098696B2 (de) 2010-07-14
ES2292250T5 (es) 2010-09-14
WO2000003797A1 (de) 2000-01-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4650976B2 (ja) 生物学的テンプレート上の高分子電解質
US8092836B2 (en) Production of nanocapsules and microcapsules by layer-wise polyelectrolyte self-assembly
Sukhorukov et al. Microencapsulation by means of step-wise adsorption of polyelectrolytes
JP2002506719A (ja) 層状の高分子電解質自己集合によるナノカプセルおよびマイクロカプセルの製造
US6479146B1 (en) Fabrication of multilayer-coated particles and hollow shells via electrostatic self-assembly of nanocomposite multilayers on decomposable colloidal templates
US6833192B1 (en) Encapsulation of crystals via multilayer coatings
CA2420523C (en) Controlled and sustained release properties of polyelectrolyte multilayer capsules
Petrov et al. Protein—calcium carbonate coprecipitation: a tool for protein encapsulation
CA2417792C (en) Production of polyelectrolyte capsules by surface precipitation
JP2003519565A (ja) 重合体多層による固体粒子の鋳型化
Kazakov et al. Liposome-nanogel structures for future pharmaceutical applications
Ruysschaert et al. Liposome-based nanocapsules
US20080241242A1 (en) Porous Polyelectrolyte Materials
Wang et al. Construction of hollow DNA/PLL microcapsule as a dual carrier for controlled delivery of DNA and drug
Zhang et al. Salt-induced fusion of microcapsules of polyelectrolytes
Tian et al. Nuclease-responsive DNA–PEI hollow microcapsules for bio-stimuli controlled release
Kashcooli et al. Patchy layersomes formed by layer-by-layer coating of liposomes with strong biopolyelectrolytes
RU2409668C1 (ru) Способ получения иммобилизованных бислойных везикул
DE19907552A1 (de) Polyelektrolythüllen auf biologischen Templaten
Xu et al. Preparation of a gel‐coated liposome and its application in drug release
Trau New strategies for the encapsulation of biomaterials and hydrophobic low molecular weight substances
CN117860677A (zh) 基于脂质体和碳量子点的复合材料及其制备方法和应用
Ye Nanocapsules via Layer-by-Layer Self-assembly Technique
Sylvie et al. Liposil, a Promising Phospholipid/Silica Composite Material

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20060327

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20090416

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20090716

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100721

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20101020

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20101112

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20101210

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131224

Year of fee payment: 3

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees