CN117860677A - 基于脂质体和碳量子点的复合材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于脂质体和碳量子点的复合材料及其制备方法和应用。本发明有效制备得到了能在PH值为5‑9的环境中体现出不同的荧光颜色的LNP@CQDs，该复合材料比单纯CQDs表现出对PH更灵敏的响应性。因此可以根据LNP@碳量子点荧光随pH的响应变化能够建立测定pH值的分析模式，用于检测创口的愈合情况。本发明的LNP@CQDs在药物传递方面显示出独特的优势，可以用于帮助伤口愈合药物的有效载体，帮助伤口愈合，并且相比单纯的LNP有更高的载药率。
Description
技术领域
本发明属于碳量子点技术领域，涉及基于脂质体和碳量子点的复合材料及其制备方法和应用，尤其涉及可用于治疗创口及检测创口PH的脂质体及碳量子点复合材料及其制备方法与应用。
背景技术
碳量子点(CQDs)作为新一代荧光纳米材料，以其优良的水溶性、易于合成、稳定的光致发光(PL)、低毒性和生物相容性好，CQDs自身的微观结构和化学成分起着关键作用，决定其光学性能的多样性，可选择的前体，多种修改方法以及灵活的合成路线赋予CQDs丰富生物医学应用，包括检测、成像(体内和体外成像)和药物传递(靶向治疗、光动力学和光热治疗，以及免疫学和基因治疗)等等。脂质体是一种小的球形纳米囊泡，其内部水腔被脂质双层包裹，一般由两亲性磷脂和稳定剂组成。通常可以利用阳离子脂质与带负电的核酸之间的静电相互作用来搭载核酸药物。可通过静电相互作用、包封等方法用来作为治疗创口药物的载体。
伤口pH的监测对于解释伤口状态至关重要，因为早期识别伤口感染或未愈合的伤口有利于在正确的时间进行治疗。通过检测创口处pH可以判断创口是在非愈合状态或感染状态下，伤口的表面pH值对于预防病情恶化至关重要，也有助于伤口护理中的治疗干预。到目前为止，已经建立了各种实现与伤口状态相关的pH监测系统，如染料固定化技术、微加工传感器、和丝网印刷pH电位传感器或伏安传感器。虽然这些基于电化学或比色性能制备的伤口pH传感器在准确性和灵敏度方面是可以接受的，但每个检测系统并不完美。例如，电化学传感器由于机械脆性、非特异性吸收污染以及需要频繁的重新校准而导致性能下降。更重要的是，这类pH传感器的便携性、兼容性和廉价性在实际应用中仍然是一个重大挑战。
脂质体和碳量子的结合可以起到很好的协同增益的效果，能够更大程度的发挥出两者的优势。一方面脂质体可以作为碳量子点的载体，将碳量子点更好的固定在脂质体的表面，防止碳量子点在溶液中的团聚与流动可以增加碳量子点和创口的接触效果，从而提高碳量子点对PH检测的灵敏性。另一方面可以利用碳量子点高比面积的特点来增加脂质体对药物的负载效率，提高药物的负载量，加快对创口的治疗效果。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种基于脂质体和碳量子点的复合材料的制备方法。
本发明还要解决的技术问题是提供了该制备方法制备得到的复合材料。
本发明最后要解决的技术问题是提供了该复合材料在作为药物载体中的应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明提供了一种基于脂质体和碳量子点的复合材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)取1,2,4-二盐酸三氨基苯和尿素在溶剂中混合，然后进行超声或搅拌，经过反应，最后经纯化冻干处理后得到碳量子点粉体；
(2)将磷脂和胆固醇溶于氯仿中，混合均匀，减压蒸发，使其在瓶壁上形成均匀的薄膜，向瓶中加入PBS溶液，搅拌水化，之后在细胞破碎仪超声，超声后的溶液通过脂质体挤出器过滤得到脂质体纳米颗粒的溶液；
(3)在搅拌下将步骤(1)得到的碳量子点粉体加入到步骤(2)的脂质体纳米颗粒的溶液中，超声搅拌，最后离心冻干得到脂质体及碳量子点复合材料；所述碳量子点粉体和脂质体纳米颗粒的重量比为0.5:1-3:1。
其中，步骤(1)中的溶剂包括水、无水乙醇或DMF中的一种或几种。
其中，步骤(1)中1,2,4-二盐酸三氨基苯、尿素的质量比为0.5:1-2:1，1,2,4-二盐酸三氨基苯和尿素占溶剂的浓度为0.5-10mg/ml。
其中，步骤(1)的超声或搅拌处理的时间为20-30分钟，所述的反应包括水热合成法或微波法，加热温度为180-250℃，时间为20分钟～1小时。
其中，步骤(2)的磷脂包括卵磷脂、大豆磷脂、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或硬脂酰胺中的一种或几种。
其中，步骤(2)的减压蒸发条件为40℃，10min。
其中，步骤(2)的超声功率为100-400W，探头超声开2S，关3S，探头直径为0.5cm，超声时间为5-30min。
其中，步骤(2)的挤出器过滤膜孔径为50-200nm。
本发明内容还包括所述的制备方法制备得到的复合材料。
本发明内容还包括所述的复合材料在作为药物载体中的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：本发明有效制备得到了能在PH值为5-9的环境中体现出不同的荧光颜色的LNP@CQDs，该复合材料比单纯CQDs表现出对PH更灵敏的响应性。因此可以根据碳量子点荧光随pH的响应变化能够建立测定pH值的分析模式，用于帮助判断检测实际场景中的创口的愈合情况。同时，本发明的LNP@CQDs在药物传递方面显示出独特的优势，可以用于帮助伤口愈合药物的有效载体，帮助伤口愈合，并且相比单纯的LNP有更高的载药率。
附图说明
图1为实施例1中LNP@CQDs的透射电镜图像。
图2为实施例1中LNP@CQDs的在PH为7，460nm激发光下的荧光光谱图。
图3为实施例1中LNP@CQDs在不同PH下太阳光下的颜色变化图。
图4为实施例1中LNP@CQDs在不同PH下的荧光光谱图。
图5为对比例1中纯CQDs的透射电镜图像。
图6为对比例1中纯CQDs在不同PH下太阳光下的颜色变化图。
图7为对比例1中纯CQDs在不同PH下的荧光光谱图。
图8为实施例1和2中LNP@CQDs和纯CQDs负载胶原酶的紫外光谱图。
图9为对比例2制备的负载胶原酶的LNP@CQDs复合材料的透射电镜图像。
图10为对比例3制备的负载胶原酶的LNP@CQDs复合材料的透射电镜图像。
具体实施方式
以下结合附图1～5对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种LNP@CQDs的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：取250mg1,2,4-二盐酸三氨基苯和250mg尿素至烧杯中，加入500mL去离子水溶解得到溶液，然后将溶液倒入反应容器中，在微波反应器中以200℃反应20分钟然后自然冷却至室温，用孔径为0.22μm的滤膜对反应产物进行过滤，去除大颗粒杂质，将合成的悬浮液对超纯水进行透析(MWCO 800Da)48h，每8h更换一次超纯水。然后将得到的产物经过真空冷冻干燥得到50mg碳量子点粉末。
步骤2：称取160mg蛋黄卵磷脂(阿拉丁公司，货号L305002)，40mg胆固醇溶于10mL的氯仿中，混合均匀，40℃减压蒸发10min，使其在瓶壁上形成均匀的薄膜。然后向茄形瓶中加入10mL含有10mg胶原酶的PBS溶液(PH7.4，购买于阿拉丁，货号P475661，下同)，37℃搅拌水化30min，之后在细胞破碎仪功率100W的条件下超声5min。超声后的溶液通过脂质体挤出器(50nm过滤膜)过滤得到负载胶原酶的脂质体纳米颗粒的溶液(过滤完之后依然是液体，浓度为1mg/ml)。
步骤3：将步骤1得到的碳量子点粉末在搅拌下加入到步骤2的脂质体纳米颗粒的溶液中，两者的质量比为1:1，碳量子点的浓度为1mg/ml。两者混合超声10min，室温下搅拌6小时，得到负载胶原酶的LNP@CQDs复合材料。且复合材料具有PH响应性，随着PH值在5-9之间变化，产生颜色变化和荧光变化。
图1中颜色较深的小圆形是脂质体纳米颗粒，小黑点是CQDs，从图中可以看到CQDs和LNP结合在一起且分布比较均匀。
对比例1
一种PH响应型碳量子点的具体制备方法为：取250mg 1,2,4-二盐酸三氨基苯和250mg尿素至烧杯中，加入500mL去离子水溶解，然后将溶液倒入反应容器中，在微波反应器中以200℃反应20分钟然后自然冷却至室温，用孔径为0.22μm的滤膜对反应产物进行过滤，去除大颗粒杂质，将合成的悬浮液对超纯水进行透析(MWCO 800Da)48h，每8h更换一次超纯水。然后将得到的产物经过真空冷冻干燥得到碳量子点粉末(TEM图5)。
比较实施例1和对比例1数据可以发现：
比较图1和图5的TEM图，单纯的碳量子点在溶液中成游离状态，单位面积内的碳量子点数量少且团聚，而LNP@CQDs因为有了LNP作为载体的固定作用，单位面积的碳量子点数量增多且分布较均匀；对比图3(LNP@CQDs)和图6(纯碳量子点)可以看出，LNP@CQDs颜色随PH变化更加明显，区分度也更高；对比图4(LNP@CQDs)和图7(碳量子点)的PL光谱图可以看出，LNP@CQDs光谱随PH变化更均匀，特别是在PH在大于6的情况下，LNP@CQDs的光谱随PH变化更明显，而单纯CQDs光谱此时变化已经非常小，这也与我们肉眼可见的颜色变化也是一致的。通过以上对比看出，LNP@CQDs比单纯CQDs颜色随PH响应灵敏性有很明显的提高。
实施例2
步骤1：称取160mg蛋黄卵磷脂，40mg胆固醇溶于10mL的氯仿中，混合均匀，40℃减压蒸发10min，使其在瓶壁上形成均匀的薄膜。然后向茄形瓶中加入10mL含有10mg胶原酶的PBS溶液(PH7.4)，37℃搅拌水化30min，之后在细胞破碎仪功率100W的条件下超声5min。超声后的溶液通过脂质体挤出器(50nm过滤膜)过滤得到负载胶原酶的脂质体纳米颗粒的溶液，将溶液离心去除上清液，将沉淀冷冻干燥得到胶原酶@LNP粉体。
步骤2：称取10mg胶原酶溶于10ml PBS溶液，向溶液中加入10mg实施例1制备的CQDs，37℃搅拌水化6小时，然后离心去除上清液，将剩余沉淀冷冻干燥得到胶原酶@CQDs粉体。
步骤3：胶原酶负载量测定：
将胶原酶@LNP@CQDs、胶原酶@LNP、胶原酶@CQDs的粉体配制成1mg/ml的溶液，测试溶液的紫外吸光度，通过对比三种溶液的吸光度来确定三种材料对胶原酶的负载率。
通过图8对比可以发现胶原酶@LNP@CQDs在280nm出的吸光度是0.45，胶原酶@LNP在280nm处的吸光度是0.16，胶原酶@CQDs在280nm处的吸光度是0.049，胶原酶@LNP@CQDs的吸光度远远超过胶原酶@LNP及胶原酶
@CQDs。
实施例4胶原酶的LNP@CQDs复合材料的应用
步骤1：按照实施例1中步骤制备好的胶原酶的LNP@CQDs复合材料；
步骤2：将制备好的复合材料配置成浓度为5mg/mL的溶液，并分散均匀；
步骤3：从步骤2中配制好的溶液中取1ml分别加入到PH为5、6、7、8和9的水溶液中，混合均匀后，观察溶液的颜色变化，并用手机相机进行拍摄。
参见图3，混合后溶液的颜色变化可以推断出原始溶液的PH值。
从该实施例4的复合材料可以通过颜色判断其对应的pH值，有望将该材料应用于创口的pH检测中从而通过颜色即可了解该创口的pH，这样可以更直观了解创口的恢复情况。
实施例5
步骤1：取125mg1,2,4-二盐酸三氨基苯和250mg尿素至烧杯中，加入750mL去离子水溶解得到溶液，然后将溶液倒入反应容器中，在微波反应器中以200℃反应20分钟然后自然冷却至室温，用孔径为0.22μm的滤膜对反应产物进行过滤，去除大颗粒杂质，将合成的悬浮液对超纯水进行透析(MWCO 800Da)48h，每8h更换一次超纯水。然后将得到的产物经过真空冷冻干燥得到30mg碳量子点粉末。
步骤2：称取160mg蛋黄卵磷脂(阿拉丁公司，货号L305002)，40mg胆固醇溶于10mL的氯仿中，混合均匀，40℃减压蒸发10min，使其在瓶壁上形成均匀的薄膜。然后向茄形瓶中加入10mL含有10mg胶原酶的PBS溶液(PH7.4，购买于阿拉丁，货号P475661，下同)，37℃搅拌水化30min，之后在细胞破碎仪功率100W的条件下超声5min。超声后的溶液通过脂质体挤出器(50nm过滤膜)过滤得到负载胶原酶的脂质体纳米颗粒的溶液(过滤完之后依然是液体，浓度为1mg/ml)。
步骤3：将步骤1得到的碳量子点粉末在搅拌下加入到步骤2的脂质体纳米颗粒的溶液中，两者的质量比为0.5:1，碳量子点的浓度为0.5mg/ml。两者混合超声10min，室温下搅拌6小时，得到负载胶原酶的LNP@CQDs复合材料，制备得到的复合材料和实施例1结果类似，CQDs和LNP结合在一起且分布比较均匀。
实施例6
步骤1：取500mg1,2,4-二盐酸三氨基苯和250mg尿素至烧杯中，加入75mL去离子水溶解得到溶液，然后将溶液倒入反应容器中，在微波反应器中以200℃反应20分钟然后自然冷却至室温，用孔径为0.22μm的滤膜对反应产物进行过滤，去除大颗粒杂质，将合成的悬浮液对超纯水进行透析(MWCO 800Da)48h，每8h更换一次超纯水。然后将得到的产物经过真空冷冻干燥得到100mg碳量子点粉末。
步骤2：称取160mg蛋黄卵磷脂(阿拉丁公司，货号L305002)，40mg胆固醇溶于10mL的氯仿中，混合均匀，40℃减压蒸发10min，使其在瓶壁上形成均匀的薄膜。然后向茄形瓶中加入10mL含有10mg胶原酶的PBS溶液(PH7.4，购买于阿拉丁，货号P475661，下同)，37℃搅拌水化30min，之后在细胞破碎仪功率100W的条件下超声5min。超声后的溶液通过脂质体挤出器(50nm过滤膜)过滤得到负载胶原酶的脂质体纳米颗粒的溶液(过滤完之后依然是液体，浓度为1mg/ml)。
步骤3：将步骤1得到的碳量子点粉末在搅拌下加入到步骤2的脂质体纳米颗粒的溶液中，两者的质量比为3:1，碳量子点的浓度为3mg/ml。两者混合超声10min，室温下搅拌6小时，得到负载胶原酶的LNP@CQDs复合材料，制备得到的复合材料和实施例1结果类似，CQDs和LNP结合在一起且分布比较均匀。
对比例2
步骤1：取250mg1,2,4-二盐酸三氨基苯和250mg尿素至烧杯中，加入500mL去离子水溶解，然后将溶液倒入反应容器中，在微波反应器中以200℃反应20分钟然后自然冷却至室温，用孔径为0.22μm的滤膜对反应产物进行过滤，去除大颗粒杂质，将合成的悬浮液对超纯水进行透析(MWCO 800Da)48h，每8h更换一次超纯水。然后将得到的产物经过真空冷冻干燥得到碳量子点粉末。
步骤2：称取50mg蛋黄卵磷脂，30mg胆固醇溶于20mL的氯仿中，混合均匀，60℃减压蒸发10min，使其在瓶壁上形成均匀的薄膜。然后向茄形瓶中加入10mL含有10mg胶原酶的PBS溶液，37℃搅拌水化30min，之后在细胞破碎仪功率600W的条件下超声5min。超声后的溶液通过脂质体挤出器(50nm过滤膜)过滤得到负载胶原酶的脂质体纳米颗粒的溶液。
步骤3：将步骤1得到的碳量子点粉末在搅拌下加入到步骤2的脂质体纳米颗粒的溶液中，两者的质量比为5:1，碳量子点的浓度为5mg/ml。两者混合超声10min，室温下搅拌6小时，得到负载胶原酶的LNP@CQDs复合材料。
从图9可以看出脂质体没有成型，且图中小黑点为团聚起来的CQDs。
对比例3：
步骤1：取50mg1,2,4-二盐酸三氨基苯和50mg尿素至烧杯中，加入500mL去离子水溶解，然后将溶液倒入反应容器中，在微波反应器中以150℃反应30分钟然后自然冷却至室温，用孔径为0.22μm的滤膜对反应产物进行过滤，去除大颗粒杂质，将合成的悬浮液对超纯水进行透析(MWCO 800Da)48h，每8h更换一次超纯水。然后将得到的产物经过真空冷冻干燥得到碳量子点粉末。
步骤2：称取50mg蛋黄卵磷脂，30mg胆固醇溶于20mL的氯仿中，混合均匀，60℃减压蒸发10min，使其在瓶壁上形成均匀的薄膜。然后向茄形瓶中加入10mL含有10mg胶原酶的PBS溶液，37℃搅拌水化30min，之后在细胞破碎仪功率600W的条件下超声5min。超声后的溶液通过脂质体挤出器(50nm过滤膜)过滤得到负载胶原酶的脂质体纳米颗粒的溶液。
步骤3：将步骤1得到的碳量子点粉末在搅拌下加入到步骤2的脂质体纳米颗粒的溶液中，两者质量比为1:0.1，碳量子点的浓度为0.1mg/ml。两者混合超声10min，室温下搅拌6小时，得到负载胶原酶的LNP@CQDs复合材料。
图10中颜色比较浅的小圆形是脂质体纳米颗粒，从图中可以看到只有LNP而没有CQDs，说明无法有效形成CQDs。
Claims (10)
1.一种基于脂质体和碳量子点的复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取1,2,4-二盐酸三氨基苯和尿素在溶剂中混合，然后进行超声或搅拌，经过反应，最后经纯化冻干处理后得到碳量子点粉体；
(2)将磷脂和胆固醇溶于氯仿中，混合均匀，减压蒸发，使其在瓶壁上形成均匀的薄膜，向瓶中加入PBS溶液，搅拌水化，之后在细胞破碎仪超声，超声后的溶液通过脂质体挤出器过滤得到脂质体纳米颗粒的溶液；
(3)在搅拌下将步骤(1)得到的碳量子点粉体加入到步骤(2)的脂质体纳米颗粒的溶液中，超声搅拌，最后离心冻干得到脂质体及碳量子点复合材料；所述碳量子点粉体和脂质体纳米颗粒的重量比为为0.5:1-3:1。
2.根据权利要求1所述的基于脂质体和碳量子点的复合材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中的溶剂包括水、无水乙醇或DMF中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的基于脂质体和碳量子点的复合材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中1,2,4-二盐酸三氨基苯、尿素和溶剂，1,2,4-二盐酸三氨基苯、尿素的质量比为0.5:1-2:1，1,2,4-二盐酸三氨基苯和尿素占溶剂的浓度为0.5-10mg/ml。
4.根据权利要求1所述的基于脂质体和碳量子点的复合材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)的超声或搅拌处理的时间为20-30分钟，所述的反应包括水热合成法或微波法，加热温度为180-250℃，时间为20分钟～1小时。
5.根据权利要求1所述的基于脂质体和碳量子点的复合材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)的磷脂包括卵磷脂、大豆磷脂、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或硬脂酰胺中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的基于脂质体和碳量子点的复合材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)的减压蒸发条件为40℃，10min。
7.根据权利要求1所述的基于脂质体和碳量子点的复合材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)的超声功率为100-400W，探头超声开2S，关3S，探头直径为0.5cm，超声时间为5-30min。
8.根据权利要求1所述的基于脂质体和碳量子点的复合材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)的挤出器过滤膜孔径为50-200nm。
9.权利要求1～8任一项所述的制备方法制备得到的复合材料。
10.权利要求9所述的复合材料在作为药物载体中的应用。
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2023
- 2023-12-21 CN CN202311769396.1A patent/CN117860677A/zh active Pending
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