DE102011000264B4 - Mikrogasbläschen mit PVA-Wand, Herstellung und Verwendung von solchen Mikrogasbläschen - Google Patents

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Abstract

Mikrogasbläschen mit einer Wand aus quervernetztem Polyvinylalkohol, wobei in der Wand der Mikrogasbläschen Nanopartikel eingelagert sind.

Description

  • Hintergrund
  • Gasbläschen in einer meist wässrigen Flüssigkeit, die zur höheren Haltbarkeit mit einer Wand stabilisiert sind, werden oft als Mikrobubbles bezeichnet. Häufigster Einsatzort ist bisher die Ultraschalldiagnostik, da diese Bläschen einen hervorragenden Kontrast durch Reflektion der Schallwelle liefern. Obwohl der Kontrast mit zunehmender Bläschengröße zunimmt, werden für die Diagnostik Gasbläschen mit einer Größe von allgemein 1-10 µm verwendet, da sie durch die Blutgefäße passen müssen. Zur Stabilisierung sind verschiedene Wandmaterialien entwickelt worden, wie einfache oder quervernetzte Lipide, Zucker (Carbohydrate) oder Polymere auf der Basis von n-Butylcyanacrylat (J.R Harris, F Depoix and K. Urich; Micron 26/2, 1995, 103-111; W. Schmidt, G. Roesslinga; Chemical Engineering Science 61, 2006, 4973-4981), Polyvinylalkohol [PVA] (F. Cavalieri, A. El Hamassi, E. Chiessi, G. Paradossi, Langmuir 21, 8758-8764 (2005)), Albumin oder Lysozym (F. Cavalieri, M. Ashokkumar, F. Grieser and F. Caruso Langmuir 2008, 24, 10078-10083).
  • Es gibt verschiedene kommerzielle Produkte für die Verwendung im Tier und Menschen, wie z.B. Levovist® (Luft/Galaktose/Palmitinsäure, Bayer-Schering), SonoVue® (Schwefelhexachlorid/Phospholipid, Bracco SpA), Optison® (Octafluoropropan/Albumin, Amersham) oder Cardiosphere® (Polymer/Albumin/Stickstoff, Point Biomedical). Weitere Materialien und Eigenschaften sind in der Literatur umfangreich beschrieben (V.R. Stewart, P.S. Sidhu, British Journal of Radiology, 79 (2006), 188-194).
  • Das allgemeine Problem der lipidstabilisierten Gasbläschen ist ihre kurze Lebensdauer, die mit perfluorierten Lipiden und Gasen erhöht werden kann (F. Gerber, M.P. Krafft, G. Watona and T.F. Vandammeb, New J. Chem. 30, 2006, 524-527). Dagegen besitzen Gasbläschen mit vernetzten Makromolekülen generell eine höhere Stabilität bzw. Lebensdauer. Zum Beispiel sind Gasbläschen mit vernetztem PVA als Wand über Jahre stabil. Die Verwendung derartiger PVA-Gasbläschen als Wirkstoffdarreichungssysteme (Drug Delivery Systeme) für Gase wie z.B. Stickstoffmonoxid ist in US 2010/ 0 158 813 A1 beschrieben.
  • Neuere Entwicklungen auf diesem Gebiet betreffen einerseits Modifizierungen der Gasbläschenoberfläche mit Antikörpern oder anderen Biomarkern, um ein gezieltes Anhaften an spezifischen Körperzellen/-organen wie z.B. Plaques oder Krebszellen zu erreichen (Jonathan R. Lindner, Nature Reviews Drug Discovery 3, 2004 527-533; M. Palmowski et.al. Mol Cancer Ther 7(1), 2008, 101-109). Andererseits wird versucht, die Gasbläschen mit Funktionen auszurüsten, um sie zusätzlich zum Ultraschall als Kontrastmittel für andere bildgebende Verfahren, wie Magnetresonanztomographie - MRT (Magnet Resonance Imaging - MRI) oder Positronen-Emissions-Tomographie (Positron Emission Tomography - PET) verwenden zu können. Das ist z.B. in US 5 215 680 A beschrieben, in dem Lipid-beschichtete Gasbläschen mit paramagnetischen Komplexen von Gadolinium oder Mangan gekoppelt werden, um sie gleichzeitig für Ultraschall und MRI verwenden zu können.
  • In US 5 558 856 A werden Lipid/Carbohydrat Gasbläschen für die simultane Verwendung für MRT und Ultraschall beschrieben. Die erfolgreiche Abscheidung von superparamagnetischen Eisenoxidpartikeln auf Lipid Mikrogasbläschen ist ebenfalls beschrieben (K. Soetanto et.al. Jpn. J. Appl. Phys. 39, 2000, 3230-3232; K. Soetanto, H. Watarai, Engineering in Medicine and Biology Society, Proceedings of the 25th Annual International Conference of the IEEE, Vol 2, 2003, 1226 - 1229).
  • Kürzlich wurde über eine gezielte Lieferung von magnetischen Gasbläschen aus Perfluoropropan stabilisiert mit Sojaöl berichtet, die Oligonukleotide enthalten. Nachdem die Gasbläschen von einem magnetischen Feld an die gewünschte Position gebracht wurden, konnten die Oligonukleotide mittels eines Ultraschallpulses für therapeutische Zwecke freigesetzt werden (C. Plank et.al. European Cells and Materials 10, 2005, 8). Eine Modifikation der lipidischen SonoVue® Gasbläschen mit magnetischen Nanopartikeln ist in WO 2009/156743A2 beschrieben. Ein vergleichbares Design mit magnetischen Partikeln und komplexierten aktiven Wirkstoffen aber ohne Gas im Zentrum ist in US 2006/0057211 A1 beschrieben.
  • Die CN 101912622 A beschreibt Gasbläschen, an deren Oberfläche superparamagnetische Nanopartikel immobilisiert sind.
  • Kurze Beschreibung der Erfindung
  • Vor diesem Hintergrund werden Mikrogasbläschen nach Anspruch 1 vorgeschlagen. Weiterhin wird ein Verfahren zur Herstellung von Mikrogasbläschen nach Anspruch 8 sowie die Verwendung von Mikrogasbläschen nach Anspruch 12 vorgeschlagen. Weitere Ausführungsformen, Modifikationen und Verbesserungen ergeben sich anhand der folgenden Beschreibung und der beigefügten Ansprüchen.
  • Gemäß einer Ausführungsform werden Mikrogasbläschen mit einer Wand aus quervernetztem Polyvinylalkohol (PVA) bereitgestellt, wobei in der Wand der Mikrogasbläschen Nanopartikel eingelagert sind.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Herstellung von Mikrogasbläschen mit eingelagerten Nanopartikeln vorgeschlagen. Das Verfahren umfasst das Herstellen von Mikrogasbläschen, deren Wände quervernetztes Polyvinylalkohol (PVA) aufweisen, wobei die Quervernetzung in Anwesenheit von Nanopartikeln erfolgt, die bei der Quervernetzung in die Wände eingelagert werden.
  • Gemäß einer Ausführungsform werden Mikrogasbläschen aus PVA verwendet für die Freisetzung von Nanopartikeln oder von Molekülen aus den Nanopartikeln durch externe Impulse von Ultraschall, Magnetfeldern, Lichtstrahlung; und/oder für diagnostische Anwendungen; und/oder für bildgebende Verfahren, wie Ultraschalldiagnostik, Magnetresonanzbildgebung, PET oder NIR-Bildgebung; und/oder in strömenden Flüssigkeiten, in denen eine Sedimentation unerwünscht ist; und/oder in der Mikrofluidik; und/oder für die pharmazeutische Gabe von Medikamenten auf der Basis schwer wasserlöslicher kleiner Molekülen, von komplexierter DNA und/oder RNA und/oder Proteinen.
  • Figurenliste
  • Die beiliegenden Zeichnungen veranschaulichen Ausführungsformen und dienen zusammen mit der Beschreibung der Erläuterung der Prinzipien der Erfindung. Die Elemente der Zeichnungen sind relativ zueinander und nicht notwendigerweise maßstabsgetreu. Gleiche Bezugszeichen bezeichnen entsprechend ähnliche Teile.
    • 1 zeigt die Anziehung von magnetischen Mikrogasbläschen gemäß einer Ausführungsform mittels eines Permanentmagneten, a) ohne Magnet, b) 5 s nach Annähern des Permanentmagneten.
    • 2 zeigt Mikroskopaufnahmen von Nanopartikel-modifizierten Mikrogasbläschen gemäß einer Ausführungsform.
    • 3 zeigt Fluoreszenzspektren einer Lösung von RenXrot® Nanopartikeln und Mikrogasbläschen gemäß einer Ausführungsform, in deren Wand RenXrot® eingelagert wurde.
    • 4 zeigt Mikrogasbläschen gemäß einer Ausführungsform mit Polyelektrolytkomplexen in der PVA Wand sowie nicht sedimentierte Aggregate aus PVA und Komplexen; (Bildgröße 32 µm × 32 µm, links Transmission, rechts Rhodamin-Fluoreszenz.
    • 5 zeigt Mikrogasbläschen gemäß einer Ausführungsform mit DNA-Cy5/PEI Komplexen in der PVA Wand; (links Transmission, rechts Cy5-Fluoreszenz, Cy5-Kanal, Bildgröße 63.5 µm × 63.5 µm).
    • 6 zeigt ein konfokales Mikroskopiebild von PVA-Mikrogasbläschen gemäß einer Ausführungsform mit eingelagerten PAH-Rho beschichteten, 182 nm großen Silikapartikeln (Bildgröße 32 µm × 32 µm, links Transmission, rechts Fluoreszenzbild).
    • 7 illustriert ein Verfahren zur Herstellung von Mikrogasbläschen gemäß einer Ausführungsform.
  • Ausführungsbeispiele
  • Im Sinne der vorliegenden Beschreibung werden unter Mikrogasbläschen mit Gas gefüllte kolloidale Hohlstrukturen verstanden, die eine stabilisierende Polymerwand aufweisen und geeignet sind, das Gas zu speichern. Die Mikrogasbläschen können eine Größe im Bereich von etwa 50 nm bis etwa 20 µm und insbesondere von etwa 1 µm bis etwa 5 µm haben. Die Wandstärke der Mikrogasbläschen kann in einem Bereich von etwa 20 nm bis etwa 2 µm und insbesondere von etwa 100 nm bis etwa 700 nm liegen. Unter Nanopartikeln werden im Sinne der vorliegenden Beschreibung Partikel verstanden, deren Größe im Bereich von etwa 2 nm bis etwa 600 nm und insbesondere im Bereich von etwa 5 nm bis etwa 300 nm liegt. Die Nanopartikel können massive oder poröse, auch mit weiteren Stoffen befüllte Partikel sein.
  • Gemäß einer Ausführungsform werden Mikrogasbläschen mit einer Wand aus quervernetztem Polyvinylalkohol (PVA) bereitgestellt, wobei in der Wand der Mikrogasbläschen Nanopartikel eingelagert sind. Dabei kann die Wand aus telechelischen PVA Ketten hergestellt sein. Die telechelischen PVA Ketten können durch Spaltung von PVA durch Natriumperjodat erzeugt werden. Dadurch entstehen terminale Aldehydgruppen, die nachfolgend beispielsweise im sauren Milieu mit den Hydroxylgruppen über Acetalisierung oder Aldolisierung quervernetzt werden.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird PVA aktiviert, wobei durch die Aktivierung des PVA kürzere telechelische PVA-Ketten entstehen, die mit sich selbst reagieren und dadurch eine Vernetzung herbeiführen können.
  • Gemäß einer Ausführungsform können die PVA Ketten auch mit weiteren Reaktionspartnern wie Glutardialdehyd oder Formaldehyd vernetzt werden im sauren Milieu.
  • Gemäß einer Ausführungsform kann nicht-aktiviertes PVA durch ein Vernetzungsreagenz vernetzt werden, was mit den Hydroxylgruppen reagiert. Bei dem Vernetzungsreagenz kann es sich beispielsweise um Formaldehyd oder Dialdehyde handeln.
  • Gemäß einer Ausführungsform besitzen die Nanopartikel eine kationische Oberflächenladung. Gemäß einer Ausführungsform kann die kationische Oberflächenladung durch eine Beschichtung mit mindestens einer Schicht eines kationischen Polyelektrolyten erzeugt werden. Alternativ können mehrere Schichten von Polyelektrolyten, beispielsweise mit wechselnder Polarität, aufgebracht werden.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Herstellung von Mikrogasbläschen mit eingelagerten Nanopartikeln vorgeschlagen. Das Verfahren umfasst das Herstellen von Mikrogasbläschen, deren Wände quervernetztes Polyvinylalkohol (PVA) aufweisen, wobei die Quervernetzung in Anwesenheit von kationisch geladenen Nanopartikeln erfolgt, die bei der Quervernetzung in die Wände eingelagert werden.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird die Oberfläche der Nanopartikel vor deren Einlagerung kationisiert, beispielsweise mit einer kationischen Oberflächenladung versehen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Mikrogasbläschen aus beispielsweise telechelischem Polyvinylalkohol, welche ein Gas im Inneren und funktionale Nanopartikel in der Wand enthalten. Die nichtkovalente Einbettung von Nanopartikel ermöglicht die Herstellung von magnetischen, Licht absorbierenden, fluoreszenten, photoadressierbaren oder wirkstoffhaltigen Mikrogasbläschen im Größenbereich von 500 nm bis 20 µm. Im Gegensatz zu gewöhnlichen Mikrobeads, die schnell sedimentieren, können Mikrogasbläschen in Abhängigkeit von der Nanopartikeldichte- und menge, Gasvolumen und Wandstärke in wässrigen Lösungen schwimmend oder schwebend hergestellt werden. Diese Mikrogasbläschen zeigen verschiedene Vorteile in diagnostischen Prozessen, wie in der Mikrofluidik oder in analytischen Anwendungen, in denen Sedimentationsprozesse störend und unerwünscht sind.
  • Speziell die Einlagerung von Magnetitnanopartikeln, langwellig absorbierenden Farbstoffpartikeln oder Kalziumfluoridnanopartikeln resultieren in Kontrastmitteln, die gleichzeitig in mehreren bildgebenden Verfahren wie der Ultraschalldiagnostik, der Magnetresonanz, der Positronenemissionstomographie oder der NIR Analyse eingesetzt werden können. Weiterhin ist das Einbringen von schwer wasserlöslichen Wirkstoffen in kristalliner Form oder von wasserlöslichen Wirkstoffen in schwerlöslicher, komplexierter Form möglich, die durch Ultraschall, Licht oder elektromagnetische Wechselfelder gesteuert wieder freigesetzt werden können. Insbesondere pharmazeutisch wirksame Wirkstoffe sind hier von Interesse.
  • Im Gegensatz zu den lipidischen Gasbläschen mit Wandstärken im unteren Nanometerbereich weisen die sehr stabilen PVA-Gasbläschen Wandstärken eines Hydrogels in einem Bereich von etwa 500-600 nm auf (Wassergehalt > 70%), ohne darauf beschränkt zu sein. Dieses große Wandvolumen bzw. die große Wandstärke ermöglicht den Einschluss größerer Mengen von Wirkstoffen oder anderen Kontrastmitteln ohne die hervorragenden inerten Oberflächeneigenschaften der Gasbläschen zu verändern. Im Gegensatz dazu sind die oben angeführten Modifikationen der Gasbläschen weitgehend an der Oberfläche lokalisiert, was zu unerwünschten Änderungen ihrer Eigenschaften wie Serumkompatibilität, Koagulationsstabilität und unspezifische Wechselwirkungen führt.
  • Die bisherigen Schwierigkeiten der Einführung weiterer Funktionen in die PVA-Mikrogasbläschen entstehen durch die chemische Inertheit der PVA- Mikrogasbläschen gegenüber kovalenter Kopplungen sowie ihre Instabilität gegenüber organischen Lösungsmitteln, Detergentien und dem schnellen Auswaschen (Leaching) von kleinen Molekülen aus der Hydrogelwand. Die Idee der Erfindung basiert daher auf dem nichtkovalenten Einbringen von Nanopartikeln mit den gewünschten Funktionen in die Mikrogasbläschenwand, die aufgrund ihrer Größe nicht mehr hinausdiffundieren können.
  • Mikrogasbläschen können beispielsweise aus telechelischem Polyvinylalkohol (PVA) hergestellt werden. Dabei können PVA Ketten durch partielle Oxidation beispielsweise mit Natriumperjodat an Stellen gespalten werden, an denen vicinale OH-Gruppen vorliegen. Es entstehen kürzere PVA-Ketten mit durchschnittlich 50 Monomereinheiten, die an den Enden mit reaktiven Aldehydgruppen terminiert sind. In einer nachfolgenden Reaktion der Aldehydgruppen mit den Hydroxy-Gruppen bei saurem pH-Wert bilden sich Acetale und/oder Aldole, die die PVA Ketten vernetzen. Werden während dieser Reaktion Gasbläschen an einer Gas-Wasser Grenzfläche beispielsweise durch starkes Rühren (z.B. mit einem Dispergierer wie Ultraturrax®) oder anderweitig eingebracht, scheiden sich die telechelischen PVA-Ketten an der Oberfläche der Gasbläschen ab und vernetzen miteinander. Im Ergebnis entstehen Mikrogasbläschen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von etwa 3 µm und einer Wand aus vernetztem PVA-Hydrogel von etwa 600 nm Dicke. Diese Mikrogasbläschen zeigen eine außergewöhnlich hohe Stabilität im Vergleich zu bekannten, lipidstabilisierten Mikrogasbläschen und lassen sich über Jahre lagern. Die PVA-Ketten können jedoch auch anderweitig mit Aldehygruppen funktionalisiert bzw. vernetzt werden. Da die Mikrogasbläschen aufsteigen, lassen sie sich leicht von dem Rest trennen und auch gut waschen.
  • Die Oberfläche der PVA-Mikrogasbläschen ist ungeladen und sterisch stabilisiert, so dass eine Aggregation der Mikrogasbläschen und auch eine Adsorption von geladenen Polyelektrolyten, DNA, Proteinen und Antikörpern kaum stattfinden. Daher kann beim Einbringen in den Organismus mit einem sogenannten Stealth-Effekt ähnlich wie bei pegylierten Materialien gerechnet werden. Dieses konnte bereits mit einem Phagozytose-Test bewiesen werden, wo die Mikrogasbläschen von menschlichen Phagozyten nicht als Fremdkörper erkannt und daher weniger als 1% innerhalb von 60 min aufgenommen wurden. Die Größe der Mikrogasbläschen kann im Bereich von etwa 1 bis etwa 5 µm eingestellt werden, was eine ideale Größe für die Anwendung in der Blutbahn darstellt.
  • Versuche zur Anbindung von pharmazeutischen Wirkstoff-Molekülen, Farbstoffen oder Proteinen an die Mikrogasbläschen erfordern daher üblicherweise eine kovalente Kopplungschemie, die die Oberfläche der Mikrogasbläschen so verändert, dass der Stealth-Effekt vollständig verloren geht und sie von den Phagozyten sofort erkannt und aufgenommen werden.
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht ein stabiles Einbringen von Nanopartikeln in die Mikrogasbläschenwand ohne die Oberflächeneigenschaften chemisch zu verändern.
  • Beispielsweise durch den Einsatz von Silikapartikeln, die zuvor mit einer Schicht des Polykations Polyallylamin (PAH) nach dem sogenannten Layer-by-Layer Verfahren (C. Peyratout, L. Dähne Angew. Chem. Int. Ed. 43, 2004, 3762-3783) beschichtet wurden, führt zu einem erfolgreichen Beladen der Wände der Mikrogasbläschen. Eine Untersuchung der Unterschiede zwischen fehlgeschlagenen und erfolgreichen Versuchen zeigte, dass das Zetapotential der Silika/PAH Probe bei pH 7 + 42 mV betrug, wohingegen unbehandelte Partikel Zetapotentiale kleiner als - 30 mV aufwiesen. Ohne sich darauf beschränken zu wollen wird angenommen, dass eine attraktive Wechselwirkung zwischen kationischen Nanopartikeln und dem PVA besteht.
  • Weitere kationische Nanopartikel können ebenfalls in die Mikrogasbläschenwand eingebracht werden. Dieses gelingt beispielsweise mit RenXrot® (CAN Hamburg), einem Europium gedopten Yttriumvanadat, welches sehr scharfe Emissionsbanden zeigt, mit TiO2 Nanopartikeln (Nanosolutions GmbH) bei pH 2, kationischem Magnetit und kleinen kationischen Komplexpartikeln aus Polyanionen und Polykationen, wobei die kationische Komponente im Überschuss vorhanden sein sollte.
  • Im Gegensatz dazu zeigten Versuche, bei denen Gold-, Magnetit- oder Cadmiumtelluridpartikel mit Durchmessern von 4-15 nm oder Silikapartikeln mit einem Durchmesser von 150 nm vor der Natriumperjodatoxidation oder auch danach zugegeben wurden und die Mikrogasbläschen durch eine Ultraturraxbehandlung erzeugen wurden, keine Einlagerung der Nanopartikel. Die Nanopartikel befanden sich immer vollständig in dem Überstand und nicht in der Wand der Mikrogasbläschen.
  • Insbesondere können auch Nukleinsäurekomplexe (DNA/RNA) mit Polykationen in die Wand der Mikrogasbläschen eingebettet werden. Aber auch am isoelektrischen Punkt unlösliche oder komplexierte Proteinpartikel können so eingeschlossen und auch wieder freigesetzt werden. Weiterhin können so schwerlösliche Medikament durch eine vorherige Umhüllung mit einer kationischen Schicht in die Mikrogasbläschenwand leicht eingebracht werden.
  • Derartig modifizierte Mikrogasbläschen behalten ihre inerten Eigenschaften, können jedoch durch äußere Einflüsse, wie magnetische Felder, Licht oder Ultraschall gezielt angesprochen werden. Das erlaubt ihren Einsatz als Kontrastmittel in bildgebenden Verfahren, wie der Ultraschalldiagnostik, Magnetresonanztomographie bzw. Magnetresonanzbildgebung (Magnet Resonance Imaging), Nahinfrarottomographie bzw. Nahinfrarotbildgebung (Near Infrared Imaging) (I. Erkan et.al. ACS Nano 2 (10), 2008, S. 2075-2084), Fluoreszenzbildgebung (Fluoreszenzimaging) oder der Positronenemissiontomographie z.B. mit eingeschlossenen Kalzium 18fluorid Nanopartikeln.
  • Andererseits können derartige Einflüsse auch zur verstärkten bzw. gesteuerten Freisetzung von eingeschlossenen Medikamenten dienen. So führt z.B. Ultraschall zum Zerplatzen der Wände, mit elektromagnetischen Wechselfeldern können die superparamagnetischen Mikrogasbläschen aufgeheizt werden oder mit Licht- bzw. Laserstrahlung können Mikrogasbläschen mit photoaktiven Komponenten energetisch angeregt werden, was ebenfalls zu ihrer Erwärmung und ggf. Zerstörung führt und somit eingeschlossene Medikamentpartikel komplett als Partikel oder verstärkt in molekularer Form freigesetzt werden.
  • Gemäß einer Ausführungsform werden PVA-Ketten sowie Nanopartikel bereitgestellt. Insbesondere können die PVA-Ketten durch partielle Oxidation von längerkettigem PVA mittels Perjodat-Ionen hergestellt werden. Die Nanopartikel tragen typischerweise eine kationische Oberfläche. Diese kann nativ vorhanden sein, oder durch geeignete Maßnahmen erreicht werden. Beispielsweise können die Nanopartikel mit einer oder mehreren Schichten von Polyelektrolyten beschichtet werden. Mehrere Schichten werden dabei mit abwechselnder Polarität der Polyelektrolyte aufgebracht. Diese Beschichtung ist auch als Layer-by-Layer Verfahren bekannt und beispielsweise in der WO 99/47252 A2 , US 2006/0275375 A1 , US 2006/0275374 A1 , US 2006/0275373 A1 , US 2003/0219384 A1 , US 7101575 B2 , US 6699501 B1 , US 6479146 B1 beschrieben, deren Offenbarungsinhalte bezüglich der Durchführung der Beschichtung sowie geeigneter Beschichtungsmaterialien hiermit aufgenommen werden.
  • Die Größe der verwendeten Nanopartikel kann an die Wandstärke der Mikrogasbläschen geeignet angepasst werden, um sicherzustellen, dass die Nanopartikel vollständig eingebettet werden, sofern dies gewünscht ist.
  • Derart vorbereitete Nanopartikel und PVA-Ketten werden dann gemischt. Es ist auch möglich, die PVA-Ketten in Anwesenheit der Nanopartikel zu erzeugen.
  • Anschließend werden, wie in 7 gezeigt, Gasbläschen erzeugt, beispielsweise durch starkes Rühren oder Einleiten eines gewünschten Gases. Dabei werden die PVA-Ketten geeignet quervernetzt, beispielsweise durch Einstellen des pH-Werts. Im Ergebnis entstehen Mikrogasbläschen, in deren Wände aus quervernetztem PVA die Nanopartikel eingebettet sind.
  • Ausführungsbeispiele:
  • Beispiel 1: PVA-Mikrogasbläschen mit Magnetit
  • a) Herstellung von Magnetit mit kationischer Oberflächenladung
  • 1 g FeCl2 × 4 H2O und 2,7 g FeCl3 × 6 H2O werden in 100 mL Wasser gelöst. Dazu werden unter kräftigem Rühren innerhalb von 15 min 20 ml 25%ige Ammoniaklösung getropft und dann 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die ausgefallenen Partikel werden mit einem Permanentmagneten abgetrennt und der Überstand verworfen. Sodann werden die Partikel in 10-15 Waschzyklen mit destilliertem Wasser einer Leitfähigkeit < 0,6 µS/cm ionenfrei gewaschen. Dann wird der pH Wert mit 5 M HCl auf 4,5 eingestellt, weiter mit Wasser gewaschen und mit HCl auf 4,5 nachgestellt bis die Leitfähigkeit des Überstandes kleiner 200 µS/cm bei pH 4,5 beträgt. Danach wird mit Salzsäure auf pH = 2 eingestellt und die Suspension 2 × 30s mit einer Sonotrode behandelt (Resonator UW 2200, Bandelin, Deutschland).
  • Die erhaltene Suspension wird durch ein 0,2 µm Filter filtriert. Kurz vor der Verwendung wird sie zur Abtrennung größerer Partikel oder Partikelaggregate 20 min lang bei 8000 U/min zentrifugiert und der Überstand verwendet. Die Konzentration der weitgehend monodispersen Primärmagnetitteilchen wurde durch ihre UV/Vis Absorption bei 430 nm bestimmt, wobei als Extinktionskoeffizient ε430nm = 14,2 l/g × cm ermittelt wurde. Das Zetapotential der so hergestellten Magnetitteilchen, die hier als Nanopartikel dienen, beträgt bei pH 2 zwischen +23 und +28 mV.
  • b) Herstellung der magnetischen Mikrogasbläschen
  • 2 g Polyvinylalkohol (Sigma-Aldrich) wurden in 100 ml destilliertem Wasser durch Rühren bei 80°C aufgelöst. Sodann wurden 190 mg Na-Periodate (Sigma-Aldrich) als Feststoff dazugegeben. Die Spaltungsreaktion wurde 1 h unter Rühren durchgeführt. Nach Abkühlung auf 5°C wurde der pH Wert mit HCl auf 2 eingestellt. Dann wurden 5 ml einer konzentrierten kationischen Magnetitlösung (E430nm = 17,9; c = 1,2 mg/ml) zugegeben. Die Suspension wurde für 2 h mit einem Ultraturrax T25 (IKA, Germany) mit einer groben Spitze bei andauernder Kühlung auf 5°C gerührt. Nach Erwärmung auf Raumtemperatur wurde der pH Wert mit NaOH auf 5 hochgestellt. Nach 5-stündigem Stehen wurden die oben schwimmenden magnetischen Mikrogasbläschen abgetrennt und mehrfach mit Wasser gewaschen, wobei die Mikrogasbläschen mit einem Permanentmagneten festgehalten werden konnten. 1 zeigt in Abbildung b) im Vergleich zur Abbildung a) das Trennen der Mikrogasbläschen durch einen Permanentmagneten.
  • Diese Rezeptur wurde mit der doppelten (10 mL) und vierfachen Menge (20 ml) an Magnetit wiederholt, wodurch eine höhere Menge an Magnetit je Mikrogasbläschen erhalten wurde (siehe 2a und 2b). Dieses konnte schon optisch an der dunkler werdenden Farbe der Mikrogasbläschen erkannt werden und wurde mit einer Magnetwaage quantifiziert. Bei der vierfachen Menge an Magnetit wurde jedoch einerseits eine deutlich stärkere Aggregation beobachtet und andererseits ein größerer Teil an Mikrogasbläschen, die auch bei langem Stehen in dem Wasser schwebten und aufgrund der hohen Magnetitmasse nicht mehr nach oben stiegen. Das Zetapotential bei den Proben mit geringerer Magnetitzugabe wurde wie bei den magnetitfreien Mikrogasbläschen zu 1,6 bzw. 1,4 mV gemessen. Bei der 20 mL Magnetitprobe lag es geringfügig höher bei 2,7 mV. Das beweist einen Erhalt der Oberflächeneigenschaften bzw. eine Lokalisation des Magnetits innerhalb der PVA-Wand, da bei Aufbringung des kationischen Magnetits auf eine negativ geladene LbL Oberfläche einer Vergleichsprobe ein Zetapotential von +24 mV erreicht wird.
  • Beispiel 2: Einbringen von fluoreszierenden Nanopartikeln RenXrot®
  • 2 g Polyvinylalkohol wurden in 100 ml destilliertem Wasser durch Rühren bei 80°C aufgelöst. Sodann wurden 190 mg Na-Periodate als Feststoff dazugegeben. Die Spaltungsreaktion wurde 1 h unter Rühren durchgeführt. Nach Abkühlung auf 5°C wurde der pH Wert mit HCl auf 2 eingestellt. Dann wurden 50 ml einer RenXrot® Lösung (CAN Hamburg) mit einer Konzentration von 3 g/l zugegeben.
  • Die Suspension wurde für 2 h mit einem Ultraturrax T25 (IKA, Germany) mit einer groben Spitze bei 5°C gerührt. Nach Erwärmung auf Raumtemperatur wurde der pH Wert mit NaOH auf 5 hochgestellt. Nach 5-stündigem Stehen wurden die oben schwimmenden Mikrogasbläschen abgetrennt und mehrfach mit Wasser gewaschen. Das Zetapotential der Mikrogasbläschen wurde identisch zur Ausgangsprobe mit 1,5 mV bestimmt.
  • Die Mikrogasbläschen wurden mit der Fluoreszenzspektroskopie im Vergleich zu der RenXrot® Ausgangslösung vermessen. Wie aus 3 ersichtlich ist, zeigen die Mikrogasbläschen eine hohe Fluoreszenz bei den entsprechenden Wellenlängen der Nanopartikel, was ihre Einbettung beweist.
  • Beispiel 3: Einlagerung von kationisch geladenen Polyelektrolytkomplexen
  • a. Herstellung von PEI/PSS Koazervatpartikeln
  • Es wurde ein kationisch geladener Komplex aus dem Polykation PEI (Molekulargew. 25000) und mit rhodamingelabeltem Polyanion PSS hergestellt. Zu 10 ml einer Lösung von 0,1 g/l PEI (pH 5, 50 mM Acetatpuffer) wurden langsam unter Rühren 20 ml 0,1 g/l PSS zugegeben (molares Verhältnis PEI: PSS = 2,4). Die entstehende Suspension wurde 1 h bei 80°C unter Rühren gereift. Die erhaltenen Koazervatpartikel hatten eine Größe von 186,2 nm (PDI 0,148) und ein Zetapotential von + 53 mV.
  • b. Herstellung von koazervathaltigen PVA-Mikropartikel
  • 2 g Polyvinylalkohol wurden in 80 ml destilliertem Wasser durch Rühren bei 80°C aufgelöst dazu wurden 20 mL der in Beispiel 3a hergestellten Koazervatsuspension gegeben. Sodann wurden 190 mg Na-Periodate als Feststoff dazugegeben. Die Spaltungsreaktion wurde 1 h unter Rühren durchgeführt. Nach Abkühlung auf 5°C wurde der pH Wert mit HCl auf 2 eingestellt.
  • Die Suspension wurde für 2 h mit einem Ultraturrax T25 (IKA, Germany) mit einer groben Spitze bei 5°C gerührt. Nach Erwärmung auf Raumtemperatur wurde der pH Wert mit NaOH auf 5 hochgestellt. Nach 5-stündigem Stehen wurden die oben schwimmenden Mikrogasbläschen abgetrennt und mehrfach mit Wasser gewaschen. Das Zetapotential der Mikrogasbläschen wurde identisch zur Ausgangsprobe mit 1,5 mV bestimmt. Im konfokalen Laser Scanning Mikroskopiebild der Lösung wurden neben den leuchtenden Mikrogasbläschen auch hell leuchtende Aggregate von Koazervaten gefunden (4) die jedoch bei weiteren Waschvorgängen über Sedimentation abgetrennt werden konnten.
  • Beispiel 4: Einlagerung von DNA-Komplexen
  • a. Herstellung von PEI/DNA Koazervatpartikeln
  • Es wurde ein kationisch geladener Komplex aus rhodamingelabeltem PEI und Cy5-gelabelter doppelsträngiger (ds)-DNA hergestellt. Zu 5 ml einer Lösung von 0,01 g/l PEI (Molekulargew. 25000, pH 5, 50 mM Acetatpuffer) wurden langsam unter Rühren 1 ml einer 0,12 g/L Lösung von ds-DNA (etwa 2000 bp) zugegeben. Die entstandene Suspension ergab in der Lichtstreuung eine Partikelgröße von 148 nm (PDI 0,19) und ein Zetapotential von + 43 mV.
  • b. Herstellung von DNA-haltigen PVA-Mikrogasbläschen
  • 0,5 g Polyvinylalkohol wurden in 20 ml destilliertem Wasser durch Rühren bei 80°C aufgelöst. Sodann wurden 48 mg Na-Periodate als Feststoff dazugegeben. Die Spaltungsreaktion wurde 1 h unter Rühren durchgeführt. Nach Abkühlung auf 5°C wurde der pH Wert mit HCl auf 5 eingestellt. Zu der Lösung wurden 6 mL der in 3a hergestellten DNA/PEI Komplex-Suspension zugegeben. Die Reaktionslösung wurde für 2 h mit einem Ultraturrax T25 (IKA, Germany) mit einer groben Spitze bei 5°C gerührt. Nach Erwärmung auf Raumtemperatur wurde der pH Wert mit NaOH auf 5 hochgestellt. Die erhaltenen Mikrogasbläschen wurden über Flotation abgetrennt und gewaschen. Im konfokalen Laser Scanning Mikroskopiebild der Lösung (Cy5-Kanal) zeigten die Mikrogasbläschen eine deutliche Cy5-Fluoreszenz, was die Einlagerung der Komplexe beweist (5).
  • Beispiel 5: Einlagerung kolloidaler Teilchen mit kationischer Beschichtung
  • a. Herstellung kationisch beschichteter Kolloide
  • 2 mL einer Suspension von monodispersen Silikapartikeln (5%) mit einem Durchmesser von 182 nm (CV 2%; Microparticles GmbH, Deutschland) wurden mit 10 mL einer Lösung von rhodamingelabeltem Polyallylamin (Molekulargew. = 56 000 g/mol, Labelgrad Monomereinheit zu Farbstoff = 240; c= 2g/l, pH 5,6, 50 mM Acetatpuffer, 0,2 M Salz) für 2 h nach dem typischen Layer-by-Layer- (LbL) Verfahren beschichtet (G. Decher, J. Schlenoff in „Multilayer Thin Films" Wiley 2003, ISBN 3-527-30440-1, S. 3-12). Danach wurden die Partikel abzentrifugiert und das überschüssige Polymer in 3 Waschzyklen entfernt. Nach der Beschichtung ergab sich eine Partikelgröße von 212 nm und ein Zetapotential von + 39 mV.
  • b. Herstellung von Mikrogasbläschen mit eingelagerten Silikapartikeln
  • 2 g Polyvinylalkohol wurden in 100 ml destilliertem Wasser durch Rühren bei 80°C aufgelöst. Sodann wurden 190 mg Na-Periodate als Feststoff dazugegeben. Die Spaltungsreaktion wurde 1 h unter Rühren durchgeführt. Nach Abkühlung auf 5°C wurde der pH Wert mit HCl auf 2 eingestellt. Dann wurden 10 ml der PAH-Rho beschichteten Silikapartikel (1%) zugegeben. Die Suspension wurde für 2 h mit einem Ultraturrax T25 (IKA, Germany) mit einer groben Spitze bei 5°C gerührt. Nach Erwärmung auf Raumtemperatur wurde der pH Wert mit NaOH auf 5 hochgestellt. Nach 5-stündigem Stehen wurden die oben schwimmenden Mikrogasbläschen abgetrennt und mehrfach mit Wasser gewaschen. Das Zetapotential der Mikrogasbläschen wurde auch hier fast identisch zur Ausgangsprobe mit 0,8 mV bestimmt.
  • Die deutlich rot gefärbten Mikrogasbläschen wurden im konfokalen Mikroskop untersucht. Wie aus 6 ersichtlich ist, sehen die Mikrogasbläschen unverändert aus, zeigen aber eine hohe Fluoreszenzintensität im Rhodaminkanal aufgrund der in die Wand eingebetteten Silikapartikel.
  • Da die LbL-Technologie auf allen Oberflächen anwendbar ist, lässt sich auf diese Weise die Oberfläche von beliebigen Wirkstoffpartikeln mit geringer Wasserlöslichkeit mit einer oder mehreren LbL-Schichten identisch ausstatten und somit bei ausreichend kleinem Durchmesser prinzipiell in die Mikrogasbläschenwand einlagern, ohne die inerten Oberflächeneigenschaften der Mikrogasbläschen zu verändern.
  • Wenngleich hierin spezifische Ausführungsformen dargestellt und beschrieben worden sind, liegt es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, die gezeigten Ausführungsformen geeignet zu modifizieren, ohne vom Schutzbereich der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Die nachfolgenden Ansprüche stellen einen ersten, nicht bindenden Versuch dar, die Erfindung allgemein zu definieren.

Claims (12)

  1. Mikrogasbläschen mit einer Wand aus quervernetztem Polyvinylalkohol, wobei in der Wand der Mikrogasbläschen Nanopartikel eingelagert sind.
  2. Mikrogasbläschen nach Anspruch 1, wobei die Wand aus telechelischen Polyvinylalkohol-Ketten hergestellt ist.
  3. Mikrogasbläschen nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Nanopartikel eine kationische Oberflächenladung besitzen.
  4. Mikrogasbläschen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Nanopartikel superparamagnetische Eigenschaften aufweisen und insbesondere Magnetit oder Maghemite enthalten.
  5. Mikrogasbläschen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Nanopartikel Fluoreszenzeigenschaften und/oder Licht absorbierende Eigenschaften aufweisen und insbesondere Farbstoffpartikel, Quantum Dots, Farbstoffaggregate, Titandioxid- oder Goldnanopartikel umfassen.
  6. Mikrogasbläschen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Nanopartikel amorphe oder kristalline pharmazeutisch wirksame Wirkstoffe enthalten.
  7. Mikrogasbläschen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Nanopartikel Komplexe aus zwei oder mehreren Molekülen oder Polymeren enthalten, und insbesondere Komplexe aus DNA oder RNA mit kationischen Polymeren enthalten.
  8. Verfahren zur Herstellung von Mikrogasbläschen mit eingelagerten Nanopartikeln, umfassend: - Herstellen von Mikrogasbläschen, deren Wände quervernetztes Polyvinylalkohol aufweisen, wobei die Quervernetzung in Anwesenheit von Nanopartikeln erfolgt, die bei der Quervernetzung in die Wände eingelagert werden.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, weiterhin umfassend: - Funktionalisieren von Polyvinylalkohol-Ketten mit Aldehydgruppen an ihren Enden; - Quervernetzen der Polyvinylalkohol-Ketten durch Reaktion mit sich selbst oder durch Zugabe von Vernetzern.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Polyvinylalkohol-Ketten bei saurem pH quervernetzt werden.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, weiterhin umfassend: - Kationisierung der Oberfläche der Nanopartikel vor deren Einlagerung.
  12. Verwendung von Mikrogasbläschen nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder von nach einem der Ansprüche 8 bis 11 hergestellten Mikrogasbläschen: - für die Freisetzung von Nanopartikeln oder Molekülen aus den Nanopartikeln durch externe Impulse von Ultraschall, Magnetfeldern oder Lichtstrahlung; - oder für diagnostische Anwendungen in bildgebenden Verfahren für die Ultraschalldiagnostik, Magnetresonanzbildgebung, Magnetresonanztomographie, Magnetresonanzangiographie, Positronenemissiontomographie oder NIR-Bildgebung; - oder in der Mikrofluidik strömende Flüssigkeiten, in denen eine Sedimentation unerwünscht ist; oder - oder für die pharmazeutische Gabe von Medikamenten auf der Basis von schwer wasserlöslichen kleinen Molekülen, von komplexierter DNA und/oder von RNA und/oder von Proteinen.
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