CN101912622A

CN101912622A - 用于磁共振成像和血压监测的靶向微气泡探针及其制备方法

Info

Publication number: CN101912622A
Application number: CN 201010252428
Authority: CN
Inventors: 杨芳; 顾宁; 张宇; 何闻
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2010-08-11
Filing date: 2010-08-11
Publication date: 2010-12-15
Anticipated expiration: 2030-08-11
Also published as: CN101912622B

Abstract

用于磁共振成像和血压监测的靶向微气泡探针涉及一种携带超顺磁性纳米颗粒和靶向抗体的稳定包膜微气泡材料的制备及应用于磁共振成像(MRI)和心血管压力变化的磁共振监测。该靶向微气泡探针包括气体核心、壳层和壳层中的超顺磁性纳米颗粒以及膜壳表面的靶向分子，所述气体包括氮气、氩气、氧气或全氟化碳的顺磁性气体；壳层包括生物可降解的聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚乙烯醇、聚乳酸、壳聚糖或海藻酸钠；超顺磁纳米颗粒包括四氧化三铁、γ-三氧化二铁或其他铁氧体超顺磁性纳米粒子；所述的靶向分子为靶向肿瘤新生血管的RGD和NGR多肽。

Description

用于磁共振成像和血压监测的靶向微气泡探针及其制备方法

技术领域

本发明属于磁共振成像技术领域，具体涉及一种携带超顺磁性纳米颗粒和靶向抗体的稳定包膜微气泡材料的制备及应用于磁共振成像(MRI)和心血管压力变化的磁共振监测。

背景技术

磁共振成像造影剂主要通过改变病灶部位的纵向弛豫时间(T₁)或纵向磁豫率(R₁，R₁ ^*)、横向弛豫时间(T₂)或横向磁豫率(R₂，R₂ ^*)，以及氢质子密度来增强病灶部位和正常组织间的对比度而成像。其图像的对比度主要由质子密度、T₁和T₂等因素决定。尽管磁共振成像技术具有可进行轴状、冠状、矢状等全方面的图像扫描优势，但是MRI诊断模式由于缺乏更好的探针材料而被限制了进一步的应用研究，没有合适的造影剂材料，很难区分病灶组织和周围正常组织。因此，研究性能优良的MRI造影剂将有助于显著提高MRI成像技术的诊断准确度。近年来，MRI造影剂的研究主要集中在顺磁性或超顺磁性材料方面。包膜微气泡在磁场中，由于气液界面引起局部磁场的磁化率发生变化，必将引起局部磁场的扰动，从而缩短横向弛豫时间(T₂，T₂ ^*)或增加横向弛豫率(R₂，R₂ ^*)。当微气泡中包裹的气体为上述顺磁性气体或外界磁场强度更高时，微气泡能更显著地缩短横向弛豫时间。微气泡的半径、磁场强度、微气泡的浓度等因素均显著影响微气泡磁共振成像效果和横向弛豫时间。然而，一定浓度的微气泡溶液在磁场中虽然能够引起横向弛豫率的变化，但是，这种信号变化十分微弱，目前已逐渐采用各种方法和技术来进一步提高微气泡增强MRI的能力，如选择氮气、氩气、氧气、全氟化碳等顺磁性气体，或改变微气泡膜壳的磁化强度。其中最有效的方法是在微气泡膜壳中装载顺磁性氧化铁或其他磁性材料。

压力是人体内心血管系统非常重要的一个血流动力学参数，体内血压动态平衡失调会导致多种疾病的发生。尽管可以通过各种手段对血压进行监控，但是由于缺乏灵敏、无损的探测技术，目前主要还是依赖于出现相关疾病后的相关症状进行判别。微气泡材料由于包膜微气泡的壳膜具有体积伸缩弹性，能够较灵敏地通过磁共振成像时横向弛豫时间T₂信号的变化判定微气泡膜壳内外的压力变化，因此，通过人体内血管压力变化导致的微气泡体积变化，监控MRI中横向弛豫率R₂的变化即可进行准确判断。

本发明拟制备膜壳表面装载超顺磁性纳米颗粒和靶向分子的微气泡探针，利用微气泡的图像增强功能和表面修饰的分子靶标，不仅可有效应用于靶向MRI分子显影成像，显著提高MRI图像的分辨率，而且可监测人体管腔或血管内的压力微小变化，从而可对血液压力的变化情况进行精确监测，可应用于对高血压相关疾病进行早期诊断。

发明内容

技术问题：本发明的目的在于提供一种可携带超顺磁性纳米颗粒和靶向分子的微气泡探针及其制备方法，成为一种新型的MRI造影剂靶向探针进行磁共振成像，并通过监测磁共振成像T₂或R₂信号的改变对体内微弱血压变化导致的人体病理做出及早判断。具体目的包括：(1)制备同时装载气体、超顺磁性纳米颗粒以及微气泡膜壳修饰靶向抗体的微气泡靶向探针；(2)将该探针应用于体内外磁共振成像；(3)通过监测MRI成像中的T₂或R₂，将该探针应用于监测血管内压力的变化。

技术方案：包裹超顺磁性纳米颗粒的微气泡由于耦合了纳米颗粒，在磁场中具有磁性以及由于气泡膜壳本身具有粘弹伸缩特性，从而在一定外界压力条件下，由于外界压力的变化，会引起微气泡体积的大小变化，体积的变化可引起磁共振成像中的横向磁豫时间T₂或横向磁豫率R₂的变化，从而可进行磁共振成像以及通过监控磁共振成像过程中的T₂或R₂变化来判断微气泡周围环境的微小压力变化。因此，该发明制备的该种微气泡结构可被作为新型的磁共振成像造影剂和心血管内压力传感的器件在生物医学领域进行应用。

1.本发明所述微气泡探针，由气体核心、壳层和壳层中的超顺磁性纳米颗粒以及膜壳表面的靶向分子构成，所述气体由氮气、氩气、氧气、全氟化碳等顺磁性气体组成；壳层主要由生物可降解的聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚乙烯醇、聚乳酸、壳聚糖、海藻酸钠等组成；超顺磁纳米颗粒(Magnetic nanoparticles，MNPs)，主要包括四氧化三铁(Fe₃O₄)、γ-三氧化二铁(γ-Fe₂O₃)或其他铁氧体超顺磁性纳米粒子；所述的靶向分子为靶向肿瘤新生血管的RGD和NGR多肽。

上述微气泡的壳层中，聚合物和超顺磁性纳米粒子的质量比为6.5～38∶1，优选10～20∶1。

上述微气泡结构呈球状，其粒径为4～6μm，其壳层的厚度为50～200nm。

本发明所述微气泡作为磁共振成像靶向探针和压力传感器件的机理为：微气泡内部包裹的气体和膜壳表面的超顺磁性纳米颗粒赋予了该微气泡具有响应磁场进行磁共振成像的特性。同时利用微气泡膜壳的伸缩粘弹特性能在压力环境中导致微气泡内部体积的变化，若血管中或疾病部位的血压升高，则微气泡体积的伸缩变化能够在磁共振成像时的T₂参数上反映出来，通过监控磁共振成像时的T₂或R₂参数的变化可对血液的压力变化做出判断。

2.本发明所述微气泡探针的制备方法，具体工艺步骤如下：

(1)微气泡包膜材料的修饰和改性

选择表面携带羧基(-COOH)、氨基(-NH₂)等活性基团的高分子聚合物作为微气泡的包膜材料；或对所选择的其他高分子包膜材料进行表面修饰，获得上述活性基团。

(2)超顺磁性纳米粒子磁性流体的制备和表面修饰

通过改进化学共沉淀法(常温、常压、水相合成)或高温分解法制备尺寸为8-20nm可控的超顺磁性氧化铁纳米粒子，反立方尖晶石结构，具有羧基化或氨基化表面，表面功能基团含量为总铁量的2.5-5％，饱和磁化强度＞60emu/g，所得磁性液体可通过0.22微米滤膜进行过滤灭菌。

(3)耦合靶向抗体的磁性纳米颗粒的制备

利用化学偶联剂法制备免疫磁性纳米颗粒，将表面修饰后的纳米颗粒用双蒸水磁分离洗三遍后，用MES缓冲液(0.1M，pH 4.7)重悬并超声分散，然后加入适量的经过EDC/NHS活化的靶向抗体，混匀，室温下振荡2h。将混合物用MES缓冲液磁分离洗涤3次以除去游离抗体，然后将磁性纳米颗粒重悬于经过EDC/NHS活化的溶液中，室温振荡2h。同样进行磁分离洗涤除去游离分子，最后重悬于PBS(0.01M，pH 7.4)中，4℃保存。

(4)靶向磁共振成像和压力传感微器件的制备

首先以步骤(1)中的聚合物为微气泡膜材，通过超声生空化法制备聚合物微气泡悬浮液，然后向该悬浮液中加入步骤(3)耦合靶向分子抗体的磁性纳米颗粒，利用羧基与氨基的反应将靶向抗体的纳米颗粒连接到微气泡表面，制备得表面连接纳米颗粒的微气泡，获得靶向微气泡磁共振成像和压力传感微器件样品溶液。

(5)分离纯化

将靶向微气泡从收集液中分离出来并用去离子水洗涤，洗涤的次数以除去附在微气泡表面的游离纳米颗粒和抗体为限。

3.靶向微气泡磁共振成像和压力传感器件磁共振成像

将制备所得携带含靶向抗体纳米颗粒的微气泡进行磁共振成像，获得磁共振成像图像；并通过改变溶液中的压力测定微气泡磁共振成像后R₂的变化，获得溶液中压力变化与微气泡磁共振成像后R₂的相关关系。

有益效果：

(1)本发明所述微气泡探针可成为一种新型的MRI造影剂，提高MRI的图像对比度，从而提高MRI诊断的效果和准确度。

(2)本发明所述微气泡探针器件可用于心血管内血压的微量变化，通过监控MRI成像过程中R₂的变化，即可判断血压的变化，从而为高血压等疾病提供早期的监测手段。

附图说明

图1是本发明所述靶向磁共振成像微气泡探针的结构示意图。

图2是进入血液循环的微气泡平衡压力由三个方面决定：①气-液界面张力；②包裹气体的扩散Laplace张力；③血液运动压力。

图3是随着溶液中压力的变化，微气泡磁共振成像后R₂值的变化结果。

图中，1-靶向抗体、2-磁性纳米颗粒、3-气体、4-聚合物膜壳。

具体实施方式

下面通过实施实例对本发明所述磁共振成像和压力检测用靶向微气泡器件及其制备方法作进一步说明。

具体实施实例1：

(1)微气泡包膜材料的修饰和改性

将5％的聚乙烯醇(PVA)水溶液按摩尔比1∶3与高碘酸钠(NaIO₄)在pH＝4的条件下混合，在60℃恒温水浴中搅拌4小时，然后冷却至室温。在此过程中PVA两端的羟基会部分被氧化成醛基，此外PVA的单体在形成聚合物的过程中由于排列顺序不同产生的“头碰头”单位会断裂开，断裂处的羟基被氧化成醛基。然后在产物中，按照醛基与亚氯酸钠(NaClO₂)摩尔比1∶4加入亚氯酸钠，静置反应4小时，在此过程中溶液由无色变为黄绿色，pH值由4变成5.5。此时PVA聚合物中的醛基被氧化成羧基。

(2)修饰四氧化三铁纳米颗粒使其表面含有氨基

取24.3g FeCl₃·6H₂O和16.7gFeSO₄·6H₂O混合超声分散于50ml水中，加入到250ml三颈瓶中。氮气保护下，加入50ml氨水，5g油酸和3g十一烯酸，70℃下搅拌反应1小时后，升温至85℃保温30分钟。冷却至室温后，用无水乙醇和水洗涤所得样品，磁分离后，得到稳定的油溶性油酸包裹Fe₃O₄纳米粒子。使用油酸包裹的四氧化三铁纳米颗粒，用聚丙烯酸(PAA)将其包裹，使其从油溶性变成水溶性。在EDC/NHS催化条件下，该水溶性的纳米颗粒与两端含有氨基的PEG水溶液反应，即得表面携带氨基的水溶性四氧化三铁纳米颗粒溶液。

(3)耦合靶向抗体的磁性纳米颗粒的微气泡制备

利用化学偶联剂EDC/NHS制备RGD磁性纳米探针，将表面修饰后的纳米颗粒用双蒸水磁分离洗三遍后，用MES缓冲液(0.1M，pH 4.7)重悬并超声分散，然后加入适量的经过EDC/NHS活化的靶向抗体，混匀，室温下振荡2h。将混合物用MES缓冲液磁分离洗涤3次以除去游离抗体，然后将磁性纳米颗粒重悬于经过EDC/NHS活化的溶液中，室温振荡2h。同样进行磁分离洗涤除去游离分子，最后重悬于PBS(0.01M，pH 7.4)中，4℃保存，备用。

(4)靶向磁共振成像和压力传感微器件的制备

首先以步骤(1)中的聚合物为微气泡膜材，通过超声声空化法和乳液法制备微气泡悬浮液，然后向该悬浮液中加入步骤(3)耦合RGD靶向抗体的磁性纳米颗粒，利用羧基与氨基的反应将靶向抗体的纳米颗粒连接到微气泡表面，制备得表面连接纳米颗粒的微气泡溶液，获得靶向用于磁共振成像和压力传感的微气泡器件样品。

(5)分离纯化

(6)磁共振成像实验

将上述制备的样品进行磁共振T₂成像研究，测定其T₂图像，并通过改变溶液内的压力测定相应R₂的变化。

具体实施实例2：

(1)超顺磁性纳米粒子磁性流体的制备和表面修饰

用200ml的2mol/L盐酸溶液超声搅拌溶解54.05g FeCl₃·6H₂O，加入玻璃反应釜中，通氮气搅拌。再用50ml 2M的盐酸溶液超声溶解27.80g FeSO₄·7H₂O，然后与Fe3+溶液混合搅拌。蠕动泵将1.25L 12.5％的(CH₃)₄NOH水溶液90s快速加入至铁盐溶液中，室温反应1h，全程通氮气保护。将上述制备的Fe₃O₄纳米粒子溶液用2M的HCl溶液调节pH值为3，反复超声搅拌，pH值稳定后，加入玻璃反应釜中进行油浴加热搅拌(反应体系数显温度为90℃)，同时用空气泵鼓入空气进行氧化反应5h。从而制得γ-Fe₂O₃纳米粒子。反应结束后，磁分离洗涤一次。

取上述γ-Fe₂O₃于100ml无水乙醇中，并磁分离，重复3次。超声5min，搅拌下加入0.5mlAPTS，半小时后加水100微升，继续搅拌3.5小时，停止搅拌，磁分离，很快沉出，用100ml乙醇洗，重复3次，用100ml水洗，重复3次，定容至80ml，超声(用水定容)，不稳定，很快絮状沉淀。用盐酸调pH＝3.85，超声10分钟，即得稳定的表面带NH₂基团的氧化铁纳米颗粒。

(2)携带纳米颗粒的微气泡的制备

以壳聚糖为微气泡膜材，通过超声声空化法制备聚合物微气泡悬浮液，然后向该悬浮液中加入步骤(1)表面带NH₂基团的氧化铁纳米颗粒，利用羧基与氨基的反应将纳米颗粒连接到微气泡表面，最后进行磁分离洗涤除去游离纳米颗粒，从而制备得表面连接纳米颗粒的微气泡溶液。

(3)耦合靶向抗体的微气泡制备

将步骤(2)中的微气泡溶液与肿瘤新生血管靶向抗体RGD，混匀，室温下振荡2h。将混合物用MES缓冲液磁分离洗涤3次以除去游离抗体，最后重悬于PBS(0.01M，pH 7.4)溶液中，4℃保存，即得耦合靶向抗体的微气泡样品。

(4)磁共振成像实验

Claims

1.一种用于磁共振成像和血压监测的靶向微气泡探针，其特征在于该靶向微气泡探针包括气体核心、壳层和壳层中的超顺磁性纳米颗粒以及膜壳表面的靶向分子，所述气体包括氮气、氩气、氧气或全氟化碳的顺磁性气体；壳层包括生物可降解的聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚乙烯醇、聚乳酸、壳聚糖或海藻酸钠；超顺磁纳米颗粒包括四氧化三铁、γ-三氧化二铁或其他铁氧体超顺磁性纳米粒子；所述的靶向分子为靶向肿瘤新生血管的RGD和NGR多肽。

2.根据权利要求1所述的用于磁共振成像和血压监测的靶向微气泡探针，其特征在于所述微气泡探针的壳层中，聚合物和超顺磁性纳米粒子的质量比为6.5～38∶1。

3.根据权利要求1所述的用于磁共振成像和血压监测的靶向微气泡探针，其特征在于所述微气泡探针结构呈球状，其粒径为4～6μm，其壳层的厚度为50～200nm。

4.一种如权利要求1所述的用于磁共振成像和血压监测的靶向微气泡探针的制备方法，其特征在于具体工艺步骤为：

1)微气泡包膜材料的修饰和改性：选择表面携带羧基、氨基活性基团的高分子聚合物作为微气泡的包膜材料；或对所选择的其他高分子包膜材料进行表面修饰，获得上述活性基团；

2)超顺磁性纳米粒子磁性流体的制备和表面修饰：通过改进化学共沉淀法或高温分解法制备尺寸为8-20nm可控的超顺磁性氧化铁纳米粒子，反立方尖晶石结构，具有羧基化和氨基化表面，表面功能基团含量为总铁量的2.5-5％，饱和磁化强度＞60emu/g，所得磁性液体可通过0.22微米滤膜进行过滤灭菌；

3)耦合靶向抗体的磁性纳米颗粒的制备：利用化学偶联剂法制备免疫磁性纳米探针，将表面修饰后的纳米颗粒用双蒸水磁分离洗涤后，用0.1M，pH 4.7的MES缓冲液重悬并超声分散，然后加入经过EDC/NHS活化的靶向抗体，混匀，室温下振荡；将混合物用MES缓冲液磁分离洗涤以除去游离抗体，然后将磁性纳米颗粒重悬于经过EDC/NHS活化的溶液中，室温振荡；同样进行磁分离洗涤除去游离分子，最后重悬于0.01M，pH 7.4的PBS中，4℃保存；

4)靶向磁共振成像和压力传感微器件的制备：首先以步骤1)中的聚合物为微气泡膜材，通过超声生空化法制备聚合物微气泡悬浮液，然后向该悬浮液中加入步骤3)耦合靶向分子抗体的磁性纳米颗粒，利用羧基与氨基的反应将靶向抗体的纳米颗粒连接到微气泡表面，制备得表面连接纳米颗粒的微气泡，获得靶向微气泡磁共振成像和压力传感微器件样品；

5)分离纯化：将靶向微气泡从收集液中分离出来并用去离子水洗涤，洗涤的次数以除去附在微气泡表面的游离纳米颗粒和抗体为限。