ES2292250T5 - Envolventes de polielectrolitos sobre plantillas (templates) biologicas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la preparación de cápsulas con una envolvente de polielectrolitos, caracterizado porque sobre una plantilla (templat) seleccionada a partir de agregados de materiales biológicos y/o anfífilos se depositan varias capas sucesivas de moléculas de polielectrolitos cargadas de forma opuesta, preparando primero una dispersión de las partículas de la plantilla en una solución acuosa, añadiendo después a esta dispersión una especie de polielectrolito con igual carga o carga opuesta a la de la superficie de la partícula de la plantilla, añadiendo a continuación, después de la separación de las moléculas de polielectrolitos excedentes eventualmente presentes, la especie de polielectrolito cargada de forma opuesta utilizada para la construcción de la segunda capa y, después, depositando eventualmente, de forma alternativa, más capas de moléculas de polielectrolitos cargadas de forma opuesta y, eventualmente, desintegrando a continuación la plantilla.
Description
Envolventes de polielectrolitos sobre plantillas
(templates) biológicas.
La invención se refiere a procedimientos para la
preparación de cápsulas con una envolvente de polielectrolitos, así
como a las cápsulas obtenibles por el procedimiento.
Las microcápsulas son conocidas en diferentes
formas de ejecución y se utilizan especialmente para la liberación
controlada y el transporte preestablecido de principios activos
farmacéuticos, así como para la protección de principios activos
sensibles tales como, por ejemplo, enzimas y proteínas.
Las microcápsulas se pueden preparar por
procedimientos físico-mecánicos o, respectivamente,
por pulverización y subsiguiente recubrimiento, por procedimientos
químicos tales como por ejemplo polimerización o condensación de
superficies límite o por separación de fases polímeras o por
encapsulamiento de principios activos en liposomas. Sin embargo,
los procedimientos conocidos hasta el momento presentan una serie de
desventajas.
El documento WO 95/26714 se refiere al
encapsulamiento de células vivas en una membrana, en cuyo caso se
trata de un complejo que se forma por cohesión de dos capas de
polímeros. La capa interna comprende un biopolímero de sustrato y
la capa externa, un polielectrolito sintético con una carga opuesta
al biopolímero. En este modo de proceder no se forman cápsulas de
polielectrolito sobre las células, sino gotas con células
suspendidas dentro. La desventaja de este procedimiento es que el
grosor de las membranas y el tamaño de las microcápsulas sólo se
pueden controlar con dificultad.
El documento WO 99/47252 A2 se refiere a un
procedimiento para la preparación de cápsulas utilizando partículas
de plantillas (templates) tales como, por ejemplo, partículas de
melamina-formaldehído parcialmente reticuladas y
preparando una envolvente alrededor de las partículas por deposición
de electrolitos.
Los documentos WO 99/47253 y EP 0 972 563 se
refieren al recubrimiento de partículas de plantillas con capas
alternantes de nanopartículas cargadas de modo opuesto y
polielectrolitos o, respectivamente, capas alternantes de
nanopartículas cargadas de modo opuesto.
F. Caruso et al., J. Phys. Chem. B 1998,
102, 2011-2016 describen el recubrimiento de
partículas de melamina-formaldehído no
desintegrables, con capas de polielectrolitos marcadas con rodamina
B. Las multicapas se examinan por FRET.
La solicitud de patente alemana 198 12 083.4
describe un procedimiento para la preparación de microcápsulas con
un diámetro < 10 \mum, depositando sobre una dispersión acuosa
de partículas de plantillas varias capas sucesivas de moléculas de
polielectrolito cargadas de modo opuesto. Como partículas de
plantillas se describen especialmente, en este caso, partículas de
melamina-formaldehído parcialmente reticuladas.
Después de la formación de la envolvente de polielectrolitos las
partículas de melamina-formaldehído se pueden
disolver ajustando un valor de pH ácido o por sulfonación.
Sorprendentemente, se encontró que también se
podían formar cápsulas de polielectrolitos utilizando plantillas
seleccionadas a partir de células biológicas, agregados de
materiales biológicos y/o anfífilos tales como, por ejemplo,
eritrocitos, células bacterianas o vesículas lipídicas. Las
partículas de la plantilla encapsuladas se pueden separar por
subsiguiente solubilización o, respectivamente, desintegración.
Por consiguiente, la invención se refiere a un
procedimiento para la preparación de cápsulas con una envolvente de
polielectrolitos, que tienen un diámetro comprendido en el intervalo
de 10 nm a 10 \mum, según el cual sobre una plantilla
seleccionada a partir de agregados de materiales biológicos y/o
anfífilos se depositan varias capas sucesivas de moléculas de
polielectrolitos cargadas de forma opuesta preparando primero una
dispersión de las partículas de la plantilla en una solución
acuosa, añadiendo después a esta dispersión una especie de
polielectrolito con igual carga o carga opuesta a la de la
superficie de la partícula de la plantilla, añadiendo a
continuación, después de la separación de las moléculas de
polielectrolitos excedentes eventualmente presentes, la especie de
polielectrolito cargada de forma opuesta utilizada para la
construcción de la segunda capa y depositando, después,
eventualmente, de forma alternativa, otras capas de moléculas de
polielectrolitos cargadas de forma opuesta y, eventualmente,
desintegrando a continuación la plantilla.
Como materiales para plantillas se pueden
utilizar, por ejemplo, células, por ejemplo células eucariotas tales
como por ejemplo eritrocitos de mamíferos o células vegetales,
organismos unicelulares tales como, por ejemplo, levaduras, células
bacterianas tales como, por ejemplo, células de E. coli,
agregados celulares, partículas subcelulares tales como, por
ejemplo, orgánulos celulares, pólenes, preparados de membranas o
núcleos celulares, partículas víricas y agregados de biomoléculas,
por ejemplo agregados proteicos tales como, por ejemplo, complejos
inmunológicos, ácidos nucleicos condensados, complejos
ligando-receptor, etc.. El procedimiento conforme a
la invención es también adecuado para el encapsulamiento de células
biológicas y organismos vivos. Igualmente adecuados como plantillas
son los agregados de materiales anfífilos, especialmente estructuras
con membrana tales como, por ejemplo, vesículas, por ejemplo
liposomas o micelas, así como otros agregados lipídicos.
Sobre estas plantillas se depositan varias capas
de polielectrolitos cargados de forma opuesta. Para ello,
preferentemente, las partículas de la plantilla se dispersan primero
en un disolvente adecuado, por ejemplo en un medio acuoso. Después,
especialmente cuando en el caso de las partículas de la plantilla se
trate de células u otros agregados biológicos, se puede añadir un
reactivo de fijación en concentración suficiente para provocar al
menos una fijación parcial de las partículas de la plantilla.
Ejemplos de reactivos de fijación son aldehídos tales como
formaldehído o dialdehído glutárico, los cuales se añaden
preferentemente al medio en una concentración final comprendida
entre 0,1 - 5% (p/p).
Por polielectrolitos se entienden en general
polímeros con grupos iónicamente disociables, los cuales pueden ser
componentes o sustituyentes de la cadena del polímero.
Habitualmente, el número de estos grupos iónicamente disociables en
los polielectrolitos es tan elevado que los polímeros en forma
disociada (denominados también poliiones) son solubles en agua. En
este caso, bajo el término polielectrolitos se entienden también
ionómeros, en los cuales la concentración de los grupos iónicos no
es suficiente para una solubilidad en agua, pero que presentan
suficientes cargas para emprender una autoensambladura. La
envolvente comprende preferentemente "auténticos"
polielectrolitos. Según el tipo de estos grupos disociables los
polielectrolitos se clasifican en poliácidos y polibases.
A partir de los poliácidos se forman en la
disociación, bajo separación de protones, polianiones, los cuales
pueden ser tanto polímeros inorgánicos como también orgánicos.
Ejemplos de poliácidos son ácido polifosfórico, ácido
polivinilsulfúrico, ácido polivinilsulfónico, ácido
polivinilfosfónico y ácido poliacrílico. Ejemplos de las
correspondientes sales, que se denominan también polisales, son
polifosfato, polisulfato, polisulfonato, polifosfonato y
poliacrilato.
Las polibases contienen grupos que están en
situación de aceptar protones, por ejemplo por reacción con ácidos
bajo la formación de sales. Ejemplos de polibases con grupos
disociables situados en la cadena o, respectivamente en las
ramificaciones laterales son polialilamina, polietilenimina,
polivinilamina y polivinilpiridina. Las polibases por admisión de
protones forman policationes.
Polielectrolitos adecuados conforme a la
invención son tanto los biopolímeros tales como ácido algínico, goma
arábiga, ácidos nucleicos, pectinas, proteínas y otros, como los
biopolímeros modificados químicamente tales como
carboximetilcelulosa y sulfonatos de lignina, así como los polímeros
sintéticos tales como ácido polimetacrílico, ácido
polivinilsulfónico, ácido polivinilfosfónico y polietilenimina.
Se pueden emplear polielectrolitos lineales o
ramificados. La utilización de polielectrolitos ramificados conduce
a películas múltiples de polielectrolitos menos compactas, con un
mayor grado de porosidad de pared. Para aumentar la estabilidad de
las cápsulas, las moléculas del polielectrolito se pueden reticular
dentro y/o entre las diferentes capas, por ejemplo por reticulación
cruzada de grupos amino con aldehídos. Además de esto, se pueden
emplear polielectrolitos anfífilos, por ejemplo copolímeros
anfífilos de bloques o aleatorios, con carácter parcial de
polielectrolito para la reducción de la permeabilidad frente a
pequeñas moléculas polares. Tales copolímeros anfífilos se componen
de unidades de diferente funcionalidad, por ejemplo, por una parte
unidades ácidas o básicas y, por otra, unidades hidrófugas tales
como estirenos, dienos o siloxanos, etc., los cuales se pueden
disponer en forma de bloques o distribuidos estadísticamente sobre
el polímero. Por la utilización de copolímeros, que en función de
las condiciones externas modifican su estructura, se pueden
controlar de forma definida las paredes de las cápsulas en lo
referente a su permeabilidad o demás propiedades. Para ello, se
ofrecen, por ejemplo, copolímeros con una parte de
poli(N-isopropil-acrilamida),
por ejemplo poli(N-isopropilacrilamida-ácido
acrílico), los cuales a través del equilibrio de las uniones de
puentes de hidrógeno modifican su solubilidad en agua en función de
la temperatura, lo cual transcurre con una expansión
(hinchamiento).
Utilizando polielectrolitos degradables bajo
determinadas condiciones, por ejemplo polielectrolitos lábiles a la
luz, a ácidos o a bases, a través de la disolución de las paredes de
las cápsulas se puede controlar la liberación de los principios
activos incluidos en ellas. Además, para diferentes posibilidades de
aplicación, también se pueden utilizar como componentes de las
cápsulas polielectrolitos conductores o polielectrolitos con grupos
ópticamente activos.
Fundamentalmente no se producen limitaciones
algunas en referencia a los polielectrolitos o, respectivamente,
ionómeros, a utilizar, siempre que las moléculas utilizadas
presenten una carga suficientemente elevada y/o tengan la capacidad
de establecer una unión con la capa situada debajo a través de otros
tipos de interacción tales como, por ejemplo, uniones de puentes de
hidrógeno y/o interacciones hidrófugas.
Por consiguiente, polielectrolitos adecuados son
tanto los polielectrolitos o poliiones de bajo peso molecular como
también los polielectrolitos macromoleculares, por ejemplo también
los polielectrolitos de origen biológico.
Para la deposición de las capas de
polielectrolitos sobre la plantilla, preferentemente se crea primero
una dispersión de las partículas de la plantilla en una solución
acuosa. A esta dispersión se añade después una especie de
polielectrolito con igual carga o carga opuesta que la superficie de
las partículas de la plantilla. Después de la separación de las
moléculas excedentes de polielectrolito, eventualmente presentes, se
añade la especie de electrolito cargada de forma opuesta, utilizada
para la construcción de la segunda capa. A continuación, se siguen
depositando de forma alternativa las demás capas de moléculas de
polielectrolitos cargadas de forma opuesta, pudiéndose elegir para
cada capa con la misma carga las mismas o diferentes especies de
polielectrolitos o mezclas de especies de polielectrolitos. El
número de capas se puede elegir fundamentalmente de forma arbitraria
y consta, por ejemplo, de 2 a 40, especialmente de 4 a 20 capas de
polielectrolitos.
En caso que se desee, después de que se ha
depositado el número de capas deseado, se pueden desintegrar
entonces las partículas revestidas de la plantilla. La
desintegración puede tener lugar por adición de reactivos de lisis.
En este caso, son adecuados los reactivos de lisis que pueden
disolver los materiales biológicos tales como proteínas y/o
lípidos. Los reactivos de lisis contienen preferentemente un agente
de desproteinización, por ejemplo compuestos peroxo tales como
H_{2}O_{2} o/y compuestos de hipoclorito tales como hipoclorito
de sodio o potasio. Sorprendentemente, la desintegración de las
partículas de la plantilla tiene lugar durante un corto tiempo de
incubación, por ejemplo 1 minuto hasta 1 h a la temperatura
ambiente. La desintegración de las partículas de la plantilla es en
gran medida completa, puesto que incluso observando las envolventes
remanentes por microscopio electrónico ya no son detectables
residuos algunos de partículas. En el caso de la incorporación de
polielectrolitos biológicos en la envolvente se pueden crear también
capas vacías en el interior de la envolvente de
polielectrolito.
La invención se refiere además a cápsulas de
polielectrolitos, que son obtenibles mediante el procedimiento
conforme a la invención, y a las partículas de plantilla contenidas
en su interior. Las cápsulas vacías, que ya no contienen ninguna
partícula de plantilla, no son objeto de la invención.
Las cápsulas obtenibles por el procedimiento
conforme a la invención se pueden preparar con diámetros en el
intervalo de 10 nm a 10 \mum, también en las formas que se desvían
de la forma esférica, es decir en formas anisótropas. El grosor de
pared se determina por el número de capas de polielectrolito y se
puede situar, por ejemplo, en el intervalo de 2 a 100 nm,
especialmente en el intervalo de 5 a 80 nm. Las cápsulas se
caracterizan también por su monodispersidad, es decir que en el
caso de elegir plantillas adecuadas se pueden obtener composiciones
de cápsulas en las cuales la proporción de cápsulas cuya desviación
del diámetro medio es > 50%, es menor del 10% y, de modo
particularmente preferido, menor del 1%.
Las cápsulas son muy estables frente a
solicitaciones químicas, biológicas, orgánicas y térmicas.
Congeladas o liofilizadas se pueden admitir, a continuación, en
disolventes adecuados.
Puesto que las cápsulas representan microcopias
de las plantillas en ellas contenidas y aún después de la
separación de las plantillas conservan su forma, se pueden preparar
partículas anisótropas, en cuyo caso se trata de microcopias de
estructuras biológicas tales como células, partículas víricas o
agregados biomoleculares.
Se puede conseguir una modificación de las
propiedades de permeabilidad de la envolvente por medio de la
formación o modificación de poros en al menos una de las capas de
polielectrolitos. Tales poros se pueden formar por si mismo
utilizando los correspondientes polielectrolitos. Además, se pueden
emplear nanopartículas con grupos aniónicos o/y catiónicos o/y
sustancias tensioactivas tales como, por ejemplo surfactantes o/y
lípidos para la modificación de la permeabilidad y de otras
propiedades. Además de esto, la permeabilidad se puede modificar
por variación de las condiciones que reinan cuando se separa el
polielectrolito. Así, por ejemplo, una elevada concentración salina
del medio circundante conduce a una elevada permeabilidad de la
envolvente de polielectrolito.
Una modificación de la permeabilidad de las
envolventes de polielectrolitos, particularmente preferida, se
puede conseguir por deposición de capas lipídicas o/y de
polielectrolitos anfífilos sobre la envolvente del polielectrolito
después de la desintegración de las partículas de la plantilla. De
esta manera se puede reducir mucho la permeabilidad de las
envolventes de polielectrolitos para moléculas pequeñas y polares.
Ejemplos de lípidos que se pueden depositar sobre las envolventes
de polielectrolitos son los lípidos que al menos llevan un grupo
iónico o ionizable, por ejemplo fosfolípidos tales como, por
ejemplo, ácido dipalmitoilfosfatídico, o fosfolípidos iónicos
híbridos tales como, por ejemplo, dipalmitoilfosfatidilcolina o
también ácidos grasos o, respectivamente, los correspondientes
ácidos alquilsulfónicos de cadena larga. En el caso de la
utilización de lípidos iónicos híbridos se pueden depositar
multicapas lipídicas sobre la envolvente de polielectrolitos. Sobre
las capas lipídicas se pueden depositar a continuación otras capas
de polielectrolitos.
Las cápsulas creadas por medio del procedimiento
se pueden utilizar para la inclusión de principios activos. Estos
principios activos pueden ser tanto sustancias inorgánicas como
también orgánicas. Ejemplos de tales principios activos son
catalizadores, especialmente enzimas, principios activos
farmacéuticos, polímeros, colorantes tales como, por ejemplo,
compuestos fluorescentes, moléculas sensoras, es decir moléculas que
reaccionan de forma detectable frente a variaciones de las
condiciones del entorno (temperatura, valor del pH), agentes
fitoprotectores y sustancias aromáticas.
Las cápsulas se pueden utilizar también como
microespacios de reacción para reacciones químicas o como plantillas
para precipitación o cristalización. En virtud del hecho de que la
permeabilidad de las paredes de las cápsulas es controlable, de
modo que, por ejemplo, dejan pasar sustancias de bajo peso molecular
reteniendo sin embargo en gran medida las macromoléculas, se pueden
retener en el espacio interior, de forma sencilla durante la
síntesis, los productos de elevado peso molecular que se forman en
una reacción química, por ejemplo, los polímeros que se forman en
el caso de una polimerización. El producto de reacción sintetizado
al mismo tiempo en el medio exterior se puede separar
posteriormente o ya también durante la reacción, por ejemplo por
centrifugación o/y filtración.
Durante la reacción se puede controlar el aporte
del sustrato de reacción a través de la difusión por las paredes de
las cápsulas. De este modo resultan nuevas vías para intervenir en
los transcursos de las reacciones. Puesto que, por ejemplo, por
filtración es posible un intercambio continuo del medio exterior o,
por ejemplo, por centrifugación también es posible un intercambio
súbito del medio exterior, la reacción de polimerización se puede
detener arbitrariamente por separación del sustrato o,
respectivamente, se puede sustituir el monómero. Con ello, es
posible llevar a cabo la preparación de copolímeros o multipolímeros
de nuevas maneras. Puesto que por permeación se puede controlar el
transcurso de la reacción a través del aporte de los monómeros, se
pueden formar en las cápsulas productos con nuevas y diferentes
distribuciones de pesos moleculares, por ejemplo productos
altamente monodispersos. Los polímeros sintetizados en el interior
de las cápsulas se pueden detectar espectroscópicamente, por
ejemplo por titulación con colorantes fluorescentes y por
microscopía confocal. Con fotodispersión de las partículas
individuales se puede seguir el crecimiento másico y, con ello, la
cinética de la reacción.
En el caso de utilizar cápsulas anisótropas para
empaquetar principios activos o como espacios de reacción, por
ejemplo para síntesis o procesos de precipitación, y eventualmente
subsiguiente disolución de las envolventes de la plantilla, se
pueden crear composiciones de partículas en forma de dispersiones
con formas y aspectos predeterminados. Por consiguiente, la
invención se refiere también a las composiciones anisótropas de
partículas, que se pueden obtener por encapsulamiento de principios
activos en una envolvente de polielectrolitos, por ejemplo por
síntesis o precipitación y subsiguiente separación de la plantilla,
por ejemplo por tratamiento térmico o químico. Estas partículas
anisótropas poseen preferentemente la forma de las bioestructuras
utilizadas como plantilla.
Además, las cápsulas se pueden utilizar para
introducir líquidos orgánicos tales como, por ejemplo, alcoholes o
hidrocarburos, por ejemplo hexanol, octanol, octano o decano, o para
el encapsulamiento de gases. Tales cápsulas repletas con un líquido
orgánico no miscible con agua se pueden emplear también para
reacciones químicas, por ejemplo reacciones de polimerización. De
este modo, a través de su equilibrio de distribución se puede
concentrar el monómero de forma preestablecida en el espacio
interior de las cápsulas. Eventualmente, la solución de monómeros
ya se puede encapsular en el espacio interior antes del comienzo de
la síntesis.
Sin embargo, también se pueden encapsular
principios activos que, en virtud de su tamaño, no pueden atravesar
la envolvente de polielectrolitos. Para ello, el principio activo a
encapsular se inmoviliza en las partículas de la plantilla o es
encapsulado por las partículas de la plantilla, por ejemplo por
fagocitosis o endocitosis en el caso de células vivas. Después de
la desintegración de las partículas de la plantilla el principio
activo se libera en el interior de la envolvente de
polielectrolitos. En este caso, las condiciones de desintegración
de las partículas de la plantilla se eligen convenientemente de tal
modo que no se produzca ninguna descomposición no deseada del
principio
activo.
activo.
Las cápsulas se pueden emplear en numerosos
campos de aplicación, por ejemplo en el sensorial, en analítica de
superficies, como soporte para emulsiones, como microespacios de
reacción tales como, por ejemplo, procesos catalíticos, procesos de
polimerización, precipitación o catalización, en farmacia y
medicina, por ejemplo para la aplicación dirigida (targeting) de
principios activos o como agente de contraste para ultrasonidos, en
la tecnología de los productos alimentarios, cosmética,
biotecnología, tecnología sensorial, tecnología de la información e
industria de la impresión (encapsulamiento de colorantes). Además,
las cápsulas se pueden emplear para la construcción de micro- y
nano-composites, es decir materiales de trabajo que
se componen al menos de dos materiales distintos y que presentan un
ordenamiento microscópico o nanoscópico.
Todavía otro aspecto de la invención consiste en
desintegrar parcialmente las partículas de la plantilla,
preferentemente en forma fijada, antes del recubrimiento con
polielectrolitos, por tratamiento con un reactivo de lisis.
Interrumpiendo a tiempo el proceso de lisis se obtienen estructuras
parcialmente disueltas, por ejemplo estructuras toroidales con un
agujero en el centro, las cuales pueden ser recubiertas a
continuación. A continuación, después de completar la construcción
de las partículas de la plantilla, se obtienen como resultado
cápsulas de forma anular. Esta es una cualidad topológica totalmente
nueva con interesantes posibilidades de aplicación, por ejemplo en
óptica (efecto de flexión microsusurrante,
"mikroflüsterbogeneffekt", en inglés "micro whispering
bending effect").
La invención se explica con más detalle por los
siguientes ejemplos y figuras. Éstas muestran:
Figura 1 Las variaciones del potencial zeta (A)
y el incremento de la intensidad de fluorescencia (B) en función
del número de capas para la deposición de la sal de sodio del
poli(estirenosulfonato) (PSS) y del
poli(alilaminohidrocloruro) (PAH) sobre eritrocitos humanos
fijados con dialdehído glutárico.
Figura 2 una fotografía por miocroscopio
electrónico por retículos de un discocito recubierto con diez capas
de PSS y PAH.
Figura 3 imágenes por microscopio electrónico de
transmisión de un discocito sin recubrir (A) y un discocito
recubierto (B), así como de una envolvente de polielectrolito (C)
obtenida después de la disolución del discocito recubierto.
Figura 4 imágenes microscópicas por energía
atómica de envolventes de polielectrolitos depositadas sobre
discocitos (A) y equinocitos (B).
Figura 5 fotografías tomadas con un microscopio
confocal de envolventes de polielectrolitos depositadas sobre
equinocitos y constituidas por 11 capas de PSS/PAH.
Figura 6 fotografías tomadas con un microscopio
confocal de envolventes de polielectrolitos repletas con
6-carboxifluoresceína.
Figura 7 espectro de electrorotación de
envolventes de polielectrolitos sobre discocitos sin recubrimiento
adicional (A) o recubiertos con DPPA (B) o DPPC (C).
Figura 8 la imagen por un microscopio lúmico (A)
de una envolvente de polielectrolitos depositada sobre un discocito
y la correspondiente fotografía por microscopio electrónico por
retículos (B).
Figura 9 la formación de poli(cloruro de
dialilmetilamonio) por polimerización de radicales sobre la cara
externa y en el interior de envolventes de polielectrolitos.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de sangre humana o bovina reciente se
separa por centrifugación el plasma. A continuación siguen dos
lavados en una solución de sal común isotónica, tamponada con
fosfato PBS (tampón fosfato 5,8 mM, pH 7,4, KCl 5,6 mM, NaCl 150
mM). A continuación, se fijan los eritrocitos con dialdehído
glutárico en una concentración del 2%. Para ello se completa 1 ml
del sedimento de eritrocitos con 1 ml de PBS. A esta solución se
añaden después, gota a gota, 8 ml de una solución de dialdehído
glutárico (1 parte de dialdehído glutárico (solución acuosa al 25%)
y 9 partes de PBS). Después de un tiempo de acción de 60 min a 20ºC
la solución se separa por centrifugación y los eritrocitos se lavan
cuatro veces con agua bidestilada. A continuación, los eritrocitos
fijados se completan con solución no tamponada de NaCl 154 mM.
Como siguiente paso sigue la adsorción
consecutiva de dos polielectrlitos cargados opuestamente. Dado que
la carga de partida de los eritrocitos fijados es negativa,
preferentemente se utiliza primero
poli(alilamino)hidrocloruro (PAH) cargado
positivamente, con un peso molecular comprendido entre 50 y 60 kD
(Aldrich). Sin embargo, también se puede depositar sobre los
eritrocitos como primera capa un polielectrolito cargado
negativamente. Para el recubrimiento de los eritrocitos se disponen
4 ml de solución con una concentración de 0,5 g/dl de PAH y NaCl
0,5 M con una concentración de eritrocitos de aproximadamente 2,5
(v/v). Al cabo de 10 minutos de tiempo de acción a 20ºC los
eritrocitos se separan por centrifugación y se lavan dos veces con
una solución de NaCl 154 mM. A continuación, sigue la adsorción de
la segunda capa. Para este fin se utiliza sal de
poli(estirenosulfonato) de sodio (PSS) cargado
negativamente, con un peso molecular de 70 kD. Para depositar la
primera capa de PSS sobre los eritrocitos recubiertos ya con PAH se
disponen 4 ml de solución con una concentración de 0,5 g/dl de PSS
y NaCl 0,5 M y una concentración de eritrocitos de aproximadamente
2,5 (v/v). Al cabo de 10 minutos de tiempo de acción a 20ºC los
eritrocitos se separan por centrifugación y se lavan dos veces con
una solución de NaCl 154 mM. La deposición de capas de PAH y PSS se
puede repetir cuantas veces se desee. Por ejemplo, se pueden
depositar en cada caso 5 capas de PAH y 5 capas de PSS.
Para la disolución de la plantilla los
eritrocitos fijados se traspasan con pipeta a una solución de NaOCl
al 1,2%. Igualmente adecuados son los desproteinizadores habituales
(producto, fabricante) o limpiadores de desagües (por ejemplo
clorix, fabricante). El tiempo de acción es aproximadamente 20
minutos a 20ºC y se puede controlar ópticamente por la desaparición
de la turbidez de la disolución. Las envolventes de polímeros
remanentes se lavan a continuación con solución de NaCl.
\vskip1.000000\baselineskip
Primero, las células de E. coli se
separan del medio de cultivo por dos lavados en una solución
isotónica de PBS. A continuación tiene lugar la fijación con
dialdehído glutárico. Para ello, el sedimento de las
coli-bacterias se completa hasta 2 ml con PBS. A
esta solución se añaden 8 ml de una solución de dialdehído glutárico
a una concentración final del 2%. Después de un tiempo de acción de
60 min a 20ºC la solución se separa por centrifugación y las
células de E. coli fijadas se lavan cuatro veces en agua
bidestilada.
Sigue a continuación una adsorción consecutiva
de dos polielectrolitos cargados de forma opuesta tal como se
describe en el ejemplo 1.
De forma correspondiente se recubrieron también
- sin fijación previa - células de levaduras.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la deposición de capas lipídicas sobre
envolventes de polielectrolitos se utilizaros dos procedimientos
distintos.
\vskip1.000000\baselineskip
3.1
200 \mul de una suspensión de envolventes de
polielectrolitos se volvieron a suspender por repetidos lavados en
metanol. Después del tercer lavado, en lugar de metanol puro se
añaden al sedimento 500 \mul de una solución lipídica de, por
ejemplo, 1 mg/ml de ácido dipalmitoilfosfatídico (DPPA) o
dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) en metanol. Las envolventes se
vuelven a suspender en esta solución lipídica en metanol y la
suspensión se mantiene en un baño de agua a una temperatura de
90ºC. El metanol en evaporación se reemplaza por adición de agua,
gota a gota, en porciones de respectivamente 20 \mul. El
intercambio de 700 \mul de metanol por agua dura aproximadamente
30 minutos.
Finalizada la evaporación, la suspensión de
envolventes se lava tres veces con agua y se centrifuga
repetidamente. Por 20 minutos de centrifugación a 25.000 rpm se
pueden sedimentar las envolventes recubiertas con lípidos.
\vskip1.000000\baselineskip
3.2
Por tratamiento con ultrasonidos se preparan
dispersiones de DPPA o de 90% de DPPC y 10% de DPPA con una
concentración de 1 mg de lípido/ml de agua. 500 \mul de la
dispersión de vesículas lipídicas resultante se disponen sobre 200
\mul de una suspensión concentrada de envolventes. Al cabo de 30
minutos se centrifugan las muestras durante 20 minutos a 25.000
rpm. El sobrenadante se separa y se reemplaza por agua. Este proceso
se repite tres veces. Se obtiene en este caso una suspensión
concentrada de envolventes recubiertas por lípidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Una suspensión acuosa de envolventes de
polielectrolitos se centrifuga durante 5 minutos a 3.000 rpm.
Después de separar el sobrenadante se añade metanol. Las
envolventes se vuelven a suspender y durante 10 minutos se
centrifugan a 4.000 rpm. De nuevo se separa el sobrenadante, se
añade metanol y la muestra se centrifuga bajo las mismas
condiciones que antes. Este proceso se repite tres veces. Después de
la última centrifugación con metanol, el sobrenadante se reemplaza
por hexanol. Las envolventes se vuelven a suspender y se centrifugan
durante 10 minutos a 5.000 rpm. este proceso se repite nuevamente
tres veces.
Para la inclusión de octanol, octano o decano en
las envolventes se utiliza un proceso parecido, utilizándose como
material de partida las envolventes presentes en una solución de
hexanol. La velocidad de centrifugación se incrementa para el
octanol y octano a 7.000 rpm (10 min) y para el decano, a 7.500 rpm
(10 min).
Finalmente, el sedimento resultante se vuelve a
suspender en agua. Las envolventes permanecen en la fase acuosa,
mientras que las trazas de disolvente aún remanentes en el sedimento
entre las envolventes forman una segunda fase orgánica. Utilizando
marcadores de fluorescencia para la fase orgánica y la acuosa se
puede mostrar mediante microscopía confocal que las envolventes
están repletas de disolvente orgánico.
El proceso descrito posibilita la preparación de
una emulsión altamente estable de líquidos no polares en agua. Como
resultado de la monodispersidad de las envolventes originales, la
emulsión formada es igualmente monodispersa. Otra ventaja más es
que incluso la forma de las gotitas individuales - dependiente de la
plantilla utilizada - puede ser regulada. Esto posibilita la
preparación de emulsiones con relaciones de superficie : volumen que
son diferentes a las de una esfera.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 1 muestra las variaciones del
potencial zeta (A) y el incremento de la intensidad de fluorescencia
(B) como función del número de capas, en el caso de la deposición de
la sal de poli(estirenosulfonato-de sodio) y
poli(alilaminohidrocloruro) sobre eritrocitos humanos
tratados previamente con dialdehído glutárico. El potencial zeta se
determina por mediciones de mobilidad electroforéticas (Electrophor,
Hasotec) en solución salina fisiológica. Las distribuciones de la
intensidad de fluorescencia se representan por el caudal
citométrico (FACScan, Becton Dickinson) utilizando PAH marcado con
FITC en tres ciclos sucesivos de deposición de capa.
En la figura 2 se muestra la fotografía por
microscopio electrónico por retículos de un discocito recubierto
con diez capas de PSS y PAH. El proceso de secado conduce a la
aparición de pliegues longitudinales en la capa de polielectrolito
a lo largo del borde de la célula.
La figura 3 muestra fotografías por microscopio
electrónico de transmisión de discocitos sin recubrir (A) y
discocitos recubierto (B). La envolvente de polielectrolito se puede
reconocer bien. La envolvente de polielectrolito (C) obtenida
después de la disolución de la célula muestra dos propiedades
sorprendentes. Las ampliaciones son de 1:15.000 en el caso de A y
B, y de 1:17.000 en el caso de C. Primeramente, es parecida a la
forma de la célula original y, en segundo lugar parece estar
totalmente vacía, sin que se aprecien fisuras o poros mayores en la
envolvente.
En la figura 4 se representan fotografías por
microscopio (anchura 10 \mum) por energía atómica (AFM) que
muestran envolventes de polielectrolitos con un total de 9 capas
depositadas sobre un discocito (A) y un equinocito (B). Mientras
que las envolventes depositadas sobre un discocito elipsoidal tan
solo presentan unos pocos pliegues, el proceso de deposición sobre
un equinocito en forma de estrella conduce a envolventes bien
estructuradas sobre las que incluso se pueden ver los resaltes de
la plantilla original. Esto se manifiesta aun más claramente en las
fotografías confocales del microscopio mostradas en la figura 5 de
una envolvente de polielectrolito con once capas de electrolitos
PSS/PAH, depositadas sobre un equinocito. La capa más externa se
compone de PAH marcado con FITC. La anchura de las fotografías es
de 7 \mum. Las exploraciones por escáner se hicieron en 2 niveles
separados por una distancia de 1 \mum. La exploración A transcurre
por la parte superior de la envolvente depositada sobre un soporte
de vidrio. En estas imágenes se reconoce que el interior de la
envolvente, incluso en la zona de los resaltes, está vacía.
La figura 6 muestra fotografías tomadas con un
microscopio confocal de envolventes de polielectrolitos depositadas
sobre discocitos, las cuales se componen de 10 capas de PSS/PAH. Las
envolventes se trataron con una solución de
6-carboxifluoresceína 100 \muM
(6-CF). En la figura 6A se puede reconocer una
fluorescencia en el interior de las envolventes. Esto pone de
manifiesto que las moléculas de 6-CF se pueden
introducir en el interior de la envolvente.
Por incubación de las envolventes con
6-CF 100 nM no se pudo encontrar fluorescencia
alguna. Esto demuestra que por tratamiento con el reactivo de lisis
los grupos amino capaces de ligar 6-CF son
degradados o/y bloqueados por 6-CF. En virtud de la
baja concentración de 6-CF la fluorescencia de la
solución es demasiado escasa como para ser detectada como
fondo.
Por adsorción por vaporización de ácido
dipalmitoilfosfatídico (DPPA) o de lípidos híbridos, por ejemplo
dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), sobre envolventes de
polielectrolitos conforme al ejemplo 3, se obtienen envolventes de
polielectrolitos recubiertas con capas estables de lípidos. La capa
de lípido evita en gran medida la entrada de 6-CF en
la envolvente (Figura 6 B). La anchura de las imágenes
representadas en la figura 6A y 6B es 16 o, respectivamente, 15
\mum. Otros experimentos muestran que las capas de lípidos son
estables al menos durante 4 semanas y que sobre las capas de
lípidos se pueden depositar más capas de polielectrolitos sin
destrucción de la capa lipídica situada debajo.
La técnica de la electrorotación (Arnold et
al., J. Phys. Chem. 91 (1987), 5093; Fuhr et al., In:
Electromanipulation of Cells, U. Zimmermann y G.A. Neil, editor,
CRC Press, Boca Raton (1996) 259-328; Prüger et
al., Biophys. J. 72 (1997), 1414) es un método espectroscópico
que hace posible el examen de las propiedades dieléctricas de
estructuras multicapa. En este caso, a la suspensión de partículas
se aplica un campo eléctrico rotatorio en la zona de KHz hasta MHz.
El momento dipolar inducido forma un ángulo con el vector de campo
aplicado, cuando la velocidad de rotación del campo es demasiado
rápida para que le pueda seguir el momento dipolar demasiado
inducido. Como resultado, la partícula adquiere un momento de giro,
el cual, nuevamente, conduce a una rotación reconocible de la
propia partícula. Un espectro de electrorotación se obtiene por
medición de la velocidad de rotación de la partícula en función de
la frecuencia de rotación del campo eléctrico exterior.
La figura 7 muestra tres típicos espectros de
electrorotación de una envolvente de polielectrolitos sin
recubrimiento (A) como control, una envolvente de polielectrolitos
(B) recubierta con DPPA y una envolvente de polielectrolitos (C)
recubierta con DPPC. La conductividad de la fase acuosa en el
exterior de la envolvente era 2.000 \muS/cm, 80 \muS/cm o,
respectivamente, 100 \muS/cm. La presencia de una capa lipídica
aislante conduce a una dirección de rotación negativa en la zona de
KHz. La envolvente de polielectrolitos fuertemente conductiva
(aproximadamente 10^{4} \muS/cm,) crea el pico positivo en la
región MHz, reconocible en el control. La capa de DPPA débilmente
conductiva se pone en cortocircuito en el caso de elevadas
frecuencias. La ausencia de una rotación positiva en el caso del
recubrimiento con DPPC apunta a la presencia de multicapas
lipídicas. Estos resultados muestran que se pueden recubrir con
éxito multicapas de polielectrolitos con lípidos para el control de
la permeabilidad, y que las envolventes recubiertas son poco
permeables para compuestos iónicos tales como sales.
Las envolventes de polielectrolitos vacías se
pueden utilizar también para la precipitación o cristalización
controlada de materiales orgánicos o inorgánicos. Para ello,
envolventes de polielectrolitos a modo de plantillas se incuban
sobre discocitos en una solución de 6-CF 30 mM, a pH
7. A continuación, el valor del pH se modificó rápidamente a un
valor de 3,5, en el cual 6-CF es ampliamente
insoluble. Después de una incubación durante 1 a 12 h se obtuvo una
mezcla de envolventes aparentemente repletas por completo con
6-CF y envolventes vacías. La figura 8A muestra la
imagen fotomicroscópica de una envolvente de polielectrolitos (10
capas) y la figura 8B la correspondiente fotografía por microscopio
electrónico por retículos. La fotografía A totalmente oscura se
puede atribuir a la fuerte adsorción del 6-CF
cristalizado. La fotografía SEM muestra que el 6-CF
cristalizado en el interior de la envolvente adopta la forma de la
plantilla original. La anchura de la fotografía A es 8 \mum. En
otros experimentos se puso de manifiesto que se puede precipitar
rodamina B por incremento del valor del pH. La precipitación de
principios activos se puede desencadenar también por otras medidas,
por ejemplo por intercambio de disolventes, precipitación salina,
etc. Estos resultados muestran que las envolventes de
polielectrolitos pueden servir como plantillas para procesos de
cristalización o precipitación, por lo que se hace posible un
control del tamaño y de la forma de las partículas coloidales
formadas por la reacción.
La figura 9 muestra el resultado de una
polimerización por radicales de cloruro de dialildimetilamonio
(DADMAC) en envolventes de PAH/PSS. Para ello, se trató una
solución de monómero al 3% en una suspensión de cápsulas al 2% con
el iniciador de polimerización peroxodisulfato de sodio (30 mg/100
ml) y se polimerizó durante 9,5 h a 70ºC. El polímero PDADMAC
sintetizado en la fase de volumen se separó por centrifugación.
Después del tratamiento con 6-CF 100 mM se puede
reconocer claramente la unión del colorante a los grupos amino del
PDADMAC. El polímero se ha adsorbido a las paredes negativas de las
cápsulas, pero se puede encontrar también en el interior de las
cápsulas.
Envolventes de polielectrolitos constituidas por
nueve capas ([PSS/PAH]_{4}PSS) se depositaron sobre
eritrocitos humanos y se separaron las partículas de la plantilla.
A continuación, se depositó una segunda capa de PAH. Las cápsulas
se utilizaron para la polimerización por radicales de ácido acrílico
a ácido poliacrílico. Para ello, una solución de monómero al 3% en
una suspensión de cápsulas al 2% se trató con el iniciador de
polimerización peroxodisulfato de sodio (30 mg/100 ml) y se
polimerizó durante 9,5 h a 70ºC. El ácido poliacrílico sintetizado
en la fase de volumen se separó por centrifugación. Después de la
adición de rodamina B 100 nm (que se une selectivamente a grupos
aniónicos) se pudo detectar la presencia de ácido poliacrílico
adsorbido a las paredes de las cápsulas cargadas negativamente,
pero también en el interior de las cápsulas. En virtud de una
formación de puentes fomentada por ácido acrílico tuvo lugar una
floculación de las cápsulas. Esta adsorción de ácido acrílico puede
ser impedida utilizando cápsulas con una carga negativa externa.
Claims (35)
1. Procedimiento para la preparación de cápsulas
con una envolvente de polielectrolitos, que tienen un diámetro
comprendido en el intervalo de 10 nm a 10 \mum,
caracterizado porque
sobre una plantilla (template) seleccionada a
partir de agregados de materiales biológicos y/o anfífilos se
depositan varias capas sucesivas de moléculas de polielectrolitos
cargadas de forma opuesta, preparando primero una dispersión de las
partículas de la plantilla en una solución acuosa, añadiendo después
a esta dispersión una especie de polielectrolito con igual carga o
carga opuesta a la de la superficie de la partícula de la
plantilla, añadiendo a continuación, después de la separación de las
moléculas de polielectrolitos excedentes eventualmente presentes,
la especie de polielectrolito cargada de forma opuesta utilizada
para la construcción de la segunda capa y, después, depositando
eventualmente, de forma alternativa, más capas de moléculas de
polielectrolitos cargadas de forma opuesta y, eventualmente,
desintegrando a continuación la plantilla.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque
para cada capa con la misma carga se eligen
especies de polielectrolitos iguales o distintas, o mezclas de
especies de polielectrolitos.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o
2,
caracterizado porque
se depositan de dos a cuarenta capas de
polielectrolitos.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque
se depositan de cuatro a veinte capas de
polielectrolitos.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4,
caracterizado porque
se utiliza una plantilla seleccionada del grupo
constituido por células, agregados celulares, partículas
subcelulares, partículas víricas y agregados de biomoléculas.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4,
caracterizado porque
se utilizan pólenes como plantilla.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4,
caracterizado porque
se utiliza una plantilla seleccionada del grupo
constituido por vesículas, liposomas, micelas y agregados
lipídicos.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes
caracterizado porque
la plantilla se trata previamente con un
reactivo de fijación.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes
caracterizado porque
se utiliza formaldehído o/y dialdehído glutárico
como reactivo de fijación.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 - 9,
caracterizado porque
se utiliza una plantilla parcialmente
desintegrada como material de partida para la deposición de las
moléculas de polielectrolitos.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Procedimiento según la reivindicación
10,
caracterizado porque
la plantilla presenta una estructura
toroidal.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes
caracterizado porque
la desintegración de la plantilla tiene lugar
por adición de un reactivo de lisis.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Procedimiento según la reivindicación
12,
caracterizado porque
el reactivo de lisis contiene un agente de
desproteinización, seleccionado de compuestos peroxo y compuestos
de hipoclorito.
\vskip1.000000\baselineskip
14. Procedimiento según la reivindicación
13,
caracterizado porque
como agente de desproteinización se utiliza
hipoclorito de sodio o de potasio.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes
caracterizado porque
después de la desintegración de la plantilla se
deposita al menos una capa lipídica sobre la envolvente de
polielectrolitos.
\vskip1.000000\baselineskip
16. Procedimiento según la reivindicación
15,
caracterizado porque
sobre la capa lipídica se deposita al menos una
capa más de polielectrolito.
\vskip1.000000\baselineskip
17. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes
caracterizado porque
se introduce un principio activo en las
cápsulas.
\newpage
\global\parskip0.950000\baselineskip
18. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes
caracterizado porque
el principio activo se selecciona a partir de
catalizadores, principios activos farmacéuticos, polímeros,
colorantes, moléculas sensoras, sustancias aromáticas y agentes
fitosanitarios.
\vskip1.000000\baselineskip
19. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes
caracterizado porque
en las cápsulas se introducen líquidos o gases
orgánicos.
\vskip1.000000\baselineskip
20. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes
caracterizado porque
dentro o/y sobre las cápsulas se lleva a cabo
una reacción química, por ejemplo una síntesis de polímeros.
\vskip1.000000\baselineskip
21. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes
caracterizado porque
dentro o/y sobre las cápsulas se lleva a cabo
una precipitación o una cristalización.
\vskip1.000000\baselineskip
22. Cápsulas de polielectrolitos, obtenibles por
un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 - 21,
caracterizadas porque
en su interior contienen las partículas de
plantilla.
\vskip1.000000\baselineskip
23. Cápsulas según la reivindicación 22,
caracterizadas porque
presentan un grosor de pared de las capas de
polielectrolitos en el intervalo de 2 a 100 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
24. Cápsulas según la reivindicación 22 o
23,
caracterizadas porque
presentan una forma exterior prefijada por las
partículas de plantilla.
\vskip1.000000\baselineskip
25. Cápsulas según la reivindicación 24,
caracterizadas porque
presentan una forma anisótropa.
\vskip1.000000\baselineskip
26. Cápsulas según la reivindicación 25,
caracterizadas porque
presentan una forma toroidal.
\vskip1.000000\baselineskip
27. Cápsulas según las reivindicaciones 22 -
26,
caracterizadas porque
contienen un principio activo.
\global\parskip1.000000\baselineskip
28. Utilización de cápsulas según una de las
reivindicaciones 22 - 27 para el encapsulamiento de principios
activos.
29. Utilización de cápsulas según una de las
reivindicaciones 22 - 27 como microespacios de reacción para
reacciones químicas o como plantilla para precipitación o
cristalización.
30. Utilización de cápsulas según una de las
reivindicaciones 22 - 27 en el sector sensorial, en analítica de
superficies o en tecnología de la información.
31. Utilización de cápsulas según una de las
reivindicaciones 22 - 27 en farmacia y medicina, en la tecnología
alimentaria, biotecnología, cosmética e industria de la
impresión.
32. Utilización de cápsulas según una de las
reivindicaciones 22 - 27 para la construcción de micro- y
nano-composites.
33. Utilización de cápsulas según una de las
reivindicaciones 22 - 27 como soportes para emulsiones.
34. Composiciones anisótropas de partículas,
obtenibles por encapsulamiento de principios activos en cápsulas
según la reivindicación 25 o 26 y separación de la envolvente de
polielectrolito.
35. Composiciones según la reivindicación 34 en
forma de una dispersión.
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