JP2002515430A - トリテルペン組成物及びその使用法 - Google Patents
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Abstract
Description
動物において治療目的で使用できる新しい植物性組成物を得るための方法に関係
している。
植物において確認されている1つの広範なクラスの分子はサポニンである。サポ
ニンはトリテルペン又はステロイド・アグリコンと結合した糖部分を有するグリ
コシドを含む高分子量化合物である。トリテルペン・サポニンはその生物学的特
性の故に大きな関心の対象となっている。
性、そして抗炎症性などを含む種々の植物種から採取されたトリテルペン・サポ
ニンの薬学的及び生物学的特性が研究されている(Hosterttmann ら
、1995)。サポニンは血漿脂質と結合してコレステロールとの錯体を形成し
、それによってコレステロール代謝を変えてしまうことが知られている(Oka
kenfullら、1983)。餌に入れて投与されたトリテルペンも実験動物
の血液及び組織中のコレステロールの量を減らすことが示されている(Chee
ke、1971)。サポニンは多くの民間薬や最近開発された植物薬の成分であ
ることも確認されている。
症、抗肝炎、及び抗ウイルス性作用を有していることが知られている。例えば、
いくつかのグリシルレチン酸誘導体は胃潰瘍を防いだり、治癒したりすることが
できる(Dolleら、1962)。先行技術で知られているそうした化合物は
カルベノキソロン(米国特許第3,070,623号)、3位置に置換基を有す
るグリシルレチン酸エステル誘導体(米国特許第3,070,624号)、グリシ
ルレチン酸のアミノ酸塩類(日本特許公報JA−A−44−32798)、グリシ
ルレチン酸のアミド誘導体(ベルギー特許第753773号)、及び11−デオ
キシグリシルレチン酸のアミド誘導体(英国特許第134871号)などである
。グリシルレチン酸は5−リポキシジェナーゼ活性を含むロイコトリエン生物発
生に関与する酵素を抑制することが示されており、これは報告されている抗炎症
性活性に関係していると考えられる(Inoueら、1986)。
ヒト・黒色腫成長の選択的インヒビターであることが報告されており、アポトー
シスを誘発することによる細胞毒性を示すことが示された(Pishaら、19
95)。ウリ科の漢方薬植物から採取されるトリテルペン・サポニンは抗腫瘍活
性を示す(kongら、1993)。トリテルペンのモノグリコシド類はMOL
T−4ヒト白血病細胞に対する強力て選択的な細胞毒性を示すことが知られてお
り(Kashiwadaら、1992)、そしてアヤメ科植物から採取したいく
つかのトリテルペン・グリコシドはエールリッヒ腹水癌を移植されたマウスにお
ける腫瘍の成長を阻害し、寿命を長くした(Nagamotoら、1988)。
マメ科に属する植物ドリコス・ファルカルス(Dolichos falcarus)から採取し
たサポニン調製物はイン・ビトロ及びイン・ビボの両方で肉腫37細胞に対して
有効であることが報告されている(Huangら、1982)。これもマメ科に
属する大豆サポニンも一連の腫瘍に対して有効であることが示されている(To
mas−Barbarennら、1988)。溶血性及び殺軟体動物活性を示す
オレアノール酸及びジプソジェニン・グリコシドがスワルツジア・マダガスカリ
エンシス(Swartzia madagascariensis)(マメ科)の果実のさやから単離され
ている(Borel及びHostetmann、1987)。
トロゲン陽性及びエストロゲン陰性乳癌細胞系の増殖を阻害することが示されて
いるチロシン・キナーゼインヒビターである(Akiyamaら、1987)。
植物界で豊富で穀物及び豆類の天然性食用成分であるイノシトール・ヘキサホス
フェート(フィチン酸)は結腸癌腫細胞系の最終分化を引き起こすことが示され
ている。フィチン酸はイン・ビボで実験的結腸及び乳房発癌に対して抗腫瘍活性
も示す(Yangら、1995)。いくつかのトリテルペン・アグリコンも細胞
毒性あるいは静細胞特性を有していることが示されており、例えば、植物クロス
ソプテリクス・フェブリフガ(Crossopteryx febrifuga)(アカネ科)からの幹
樹皮はng/ml範囲でCo−115ヒト結腸癌腫細胞株に対する静細胞性を有
することが示された(Tomas−Barbarenら、1988)。
確認されているが、新しい生物学的活性を有するトリテルペン化合物の識別には
なお多大な努力を払う必要がある。これらの化合物の多くが正常な哺乳動物細胞
に対して毒性を示す。さらに、これまでに識別されているトリテルペンの生物学
的活性は非常に多様性に富み、その多くはいずれのヒトあるいは哺乳動物の病状
の治療において限定的な、あるいは多様な程度の有効性を有している。確認され
ているいろいろなトリテルペンの非常な多様性と非常に関連性の高いトリテルペ
ン化合物間でも観察される生物学的活性における多様性と予測不能性の範囲の広
さは強力な治療薬であるトリテルペンを入手しようとする際に遭遇する困難さの
基本的な要因となっている。有益な生物学的活性を有する新しいトリテルペンを
識別するという困難な課題を達成することは現段階では治療的な選択可能性が限
られているヒトの一連の身体的不全を治療するためのまったく新しい方法を提供
してくれる可能性がある。
enth.)(マメ科)のさや及び根の新しい使用法に関するものである。アカシア・
ビクトリアエ(Acacia victoriae)の種子はオーストラリア原住民によって何世代
にもわたって食材の供給原料として用いられてきている(Listerら、19
96)。しかしながら、さやや根は無用なものとして捨てられていた。従って、
本発明の発明者らはこの植物のこれまでに使われなかったそれらの部分から抗癌
性及びその他の生物学的に有益な化合物の存在を実証した。例えば、ここに開示
されている新しい生物学的活性を有するサポニン化合物は悪性細胞に対して特異
的な細胞毒性を示す場合がよくある。
単離することができる新しいサポニン化合物及びそれらの混合物とその使用法を
提供する。この点で、本発明の1つの実施の形態はトリテルペン又は他の芳香性
テルペノイド組成物を含むサポニン組成物を提供する。ここで開示されたこれら
のサポニンはグリコシド基を含んでいる場合もある。
のトリテルペン部分は典型的にはアカシ酸又はオレアノール酸、あるいは他の構
造的に類似したトリテルペノイド部分である。トリテルペン又はトリテルペン・
グリコシド組成物は又ひとつ、あるいは複数のモノテルペン部分を含んでいる場
合もあり、当業者であればここで述べられているサポニン組成物がさらに他の化
学的機能性で置換可能であることは容易に理解することができるであろう。従っ
て、ここで開示されているサポニン化合物は少なくとも1つ、好ましくは2つ、
3つ、あるいはそれ以上のモノテルペン部分に接合したトリテルペン部分を含ん
でいる場合がある。複数のモノテルペン部分が存在している場合、これらの部分
はそれぞれ(i)そのトリテルペン部分に直接、(ii)トリテルペン部分に取
り付けられた糖あるいはその他のリンキング基に、又は(iii)トリテルペン
部分に直接、あるいは糖又はその他のリンキング基を介して取り付けられたモノ
テルペン部分に取り付けることができる。リンキング基としては糖、アシル、ア
ミド、アルコキシ、ケチル、アルキル、アルキレン、及び当業者には明らかなそ
の他の同様の化学的部分が含まれる。ここで開示されているトリテルペン・グリ
コシドは通常1800−2600amuの範囲、あるいは少なくとも1800、
1900、2000、2100amuから約2200、2300、2400、又
は2600amuの範囲の分子量を有している。
エの組織から単離可能、b)少なくとも1つの分子量が約1800−約2600
amuのトリテルペン・グリコシドを含む、c)Jurkat細胞に対して細胞
毒性を誘発する能力、そしてd)Jurkat細胞に対してアポトーシスを誘発
する能力で特徴付けすることが可能な1つ又は複数の単離サポニン又はトリテル
ペン・グリコシドを含む混合物の単離を可能にしてくれる。
まり、約0.12−約0.40μg/mlのIC50でJurkat細胞において
細胞毒性を誘発する能力によって特徴付けることができる。本発明の他の実施の
形態で、Jurkat細胞に対して約100−約400ng/mlの濃度で投与
するとアポトーシスが誘発される。本発明のさらに別の実施の形態において、約
2000−約250、300、350又は400ng/mlの範囲、あるいは約
300−約350又は400ng/mlの濃度でJurkat細胞に投与される
と、壊死が誘発される。
urkat細胞の形質膜の再構成によって測定される。これはフロー血球計算に
よって測定することができ、誘発されるアポトーシスは16−18%程度の範囲
である。
組織から単離可能であり、b)分子量が約1800−約2600amuの分子量
を有する少なくとも1つのトリテルペン・グリコシドを含んでおり、そしてc)
Jurkat細胞内のミトコンドリアからチトクロームcの放出を誘発する能力
を有しているかのいずれかの特性で特徴付けられる1つ又は複数の単離されたト
リテルペン・グリコシドで構成される混合物を含んでいる。
トリアエの組織から単離可能であり、b)分子量が約1800−約2600am
uの分子量を有する少なくとも1つのトリテルペン・グリコシドを含んでおり、
そしてc)Jurkat細胞内でカスパーゼ−3を活性化させる能力で特徴付け
られる1つ又は複数の単離されたトリテルペン・グリコシドで構成される混合物
を含んでおり、この場合カスパーゼ活性は約0.3−約1.6蛍光単位/分/m
gの範囲である。
グリコシドで構成される混合物は以下の特性、つまりa)アカシア・ビクトリア
エの組織から単離可能であり、b)分子量が約1800−約2600amuの分
子量を有する少なくとも1つのトリテルペン・グリコシドを含んでおり、そして
c)Jurkat細胞においてPARPの切断を起こさせる能力で特徴付けられ
る。
コシドで構成される混合物は以下の特性、つまりa)アカシア・ビクトリアエの
組織から単離可能であり、b)分子量が約1800−約2600amuの分子量
を有する少なくとも1つのトリテルペン・グリコシドを含んでおり、そして、c
)Jurkat細胞におけるPI−3キナーゼの活性を抑制する能力で特徴づけ
られる。
ルペン・グリコシドで構成される混合物は以下の特性、つまりa)アカシア・ビ
クトリアエの組織から単離可能であり、そしてb)哺乳動物の上皮細胞の前悪性
又は悪性状態の誘発、促進を抑制する能力を有している。
ルペン・グリコシドで構成される混合物は以下の特性、つまりa)アカシア・ビ
クトリアエの組織から単離可能であり、そしてb)悪性哺乳動物細胞におけるア
ポトーシスを誘発する能力を有している。
ーム、又は食べることができる材料など薬学的に受け入れ可能な溶媒に溶かした
トリテルペン・グリコシド組成物で構成される栄養薬学的組成物を提供する。本
発明の1つの実施の形態において、この栄養学的組成物は薬学的に受け入れ可能
な溶媒に溶かしたアカシア・ビクトリアエの根、さや、あるいはそれらの混合物
で構成することができる。ここで開示されている栄養学的組成物は通常、錠剤、
カプセル、あるいは軟膏などの形状を有している。
混合物で構成された組成物を調整する工程において、a)アカシア・ビクトリア
エ直物からの組織を入手するステップと、b)溶媒を用いて組織を抽出して抽出
物を提供するステップと、そしてc)その抽出物から1つ又は複数のトリテルペ
ン・グリコシドを得るステップによって構成される工程が提供される。この工程
で用いられる組織は通常、さや、根、実生、あるいはそれらの混合物で構成され
ている。抽出に用いられる溶媒は、多くの場合溶解によって問題のサポニン化合
物を抽出することができるいずれかの有機溶媒である。有益な抽出溶媒はメタノ
ール、エタノール、イソプロピル・アルコール、ジクロロメタン、クロロホルム
、酢酸エチル、グリセロル、及びそれらの混合物などである。
上記抽出後にろ過を行うことで植物バガスからその組成物を単離するステップを
含んでいてもよい。さらに別の実施の形態で、この工程はさらに抽出に先立って
有機溶媒を用いて植物残滓から脱脂するステップを含んでいる。この有機溶媒は
ヘキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、あるいはそれらの混合
物など脱脂に適した溶媒であればよい。別の実施の形態で、この分離工程はさら
に抽出後に溶媒を蒸発させるステップを含んでいる。
的に単離することでトリテルペン組成物の混合物を入手するステップを含んでい
てもよい。用いることができるクロマトグラフィー技術は液体クロマトグラフィ
ー、MPLC、又はHPLCなどである。クロマトグラフィーによる単離のため
に用いることができる溶媒は当業者には明らかであろうが、具体的な溶媒として
はメタノール、アセトニトリル、水、及びそれらの混合物である。
構成される組織培養物を調整するステップと、そしてb)溶媒を用いてそれらの
細胞からトリテルペンを抽出して、それによってその組織から少なくとも第1の
トリテルペン化合物を抽出するステップで構成される1つ又は複数の単離された
トリテルペン・グリコシドの混合物で構成される組成物を調整する工程を提供す
る。1つの側面で、その組織培養物は根毛で覆われた根の培養物を含んでいる。
本発明の別の側面で、この組織培養物はアカシア・ビクトリアエの細胞をアグロ
バクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)R−1000で感染す
ることによって調製される。本発明の関連する側面で、組織培養物は重量で約3
%から約4%のスクロースを含む媒体を含んでいる。本発明の別の側面で、組成
物を抽出するために用いられる溶媒はメタノール、エタノール、イソプロピル・
アルコール、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、水、またはそれらの
混合である。
バガスをろ過したり、液体クロマトグラフィーによってトリテルペン混合物組成
物を単離したり、及び/又は上記抽出ステップから溶媒を蒸発させるステップな
どの追加的なステップを含んでいる。
の組織を継続的に培養する方法が示される。本発明の1つの実施の形態で、細胞
培養物溶媒に溶かしたアグロバクテリウム・リゾゲネスR−1000で感染され
たアカシア・ビクトリアエの細胞で構成されたヘアリールートの組織が述べられ
ている。関連する実施の形態で、その組織培養物は約3%から約4%のスクロー
スを含んでいる。
養するステップと、そしてb)1年間あたり約1回から約4回その植物から組織
を取り出すステップで構成され、その取り出しによっても植物を殺されないよう
にする、アカシア・ビクトリアエ植物組織を継続的に採取する方法が示される。
本発明の関連する実施の形態で、その栽培システムはエアロポニックシステムで
ある。本発明の別の関連する実施の形態で、培養に用いられる組織はアカシア・
ビクトリアエ根組織である。
の開始や進行を抑制する方法であり、その方法は治療上有効な量の上に述べた栄
養薬学的組成物を哺乳動物細胞に投与するステップで構成されている。1つの実
施の形態で、この上皮細胞は皮膚細胞、結腸細胞、子宮細胞、卵巣細胞、膵臓細
胞、前立腺細胞、腎臓細胞、肺細胞、膀胱細胞、あるいは乳房細胞である。関連
する実施の形態で、その哺乳動物はヒトである。さらに別の関連する実施の形態
で、その栄養薬学的組成物を投与する形態は経口である。
おり、その方法は治療的に有効な量の上に述べた栄養薬学的組成物を投与するス
テップを含んでいる。1つの実施の形態で、その細胞は皮膚細胞、結腸細胞、子
宮細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、前立腺細胞、腎臓細胞、肺細胞、膀胱細胞、ある
いは乳房細胞である。関連する実施の形態で、その哺乳動物はヒトである。別の
関連する実施の形態で、その栄養薬学的組成物を投与する形態は経口である。さ
らに別の実施の形態で、その栄養薬学的組成物を投与する形態は局所投与である
。
物の体内で防ぐ方法を含んでおり、その方法はその哺乳動物細胞又は哺乳動物に
対して治療的に有効な量の上に述べた栄養薬学的組成物を投与するステップを含
んでいる。本発明の1つの実施の形態で、その上皮細胞は小嚢腺細胞である。本
発明の別の側面で、その上皮細胞は結腸細胞である。本発明の関連する実施の形
態で、その哺乳動物はヒトである。本発明のさらに別の実施の形態で、その栄養
薬学的組成物をイン・ビボでの使用目的に投与する形態は経口である。
おり、その方法はその哺乳動物に対して治療的に有効な量の上に述べた栄養薬学
的組成物を投与するステップで構成されている。本発明の実施の形態では、その
哺乳動物とはヒトである。
テルペン部分を含む精製トリテルペン製剤か、 あるいは、その医薬品製剤を提供し、上の構造式でR1及びR2は水素、C1−C
5アルキル、及びオリゴサッカロイドで構成されるグループから選択され、b)
R3は水素、ヒドロキシル、C1−C5アルキル、C1−C5アルキレン、C1
−C5アルキル・カルボニル、及びモノテルペン基で構成されるグループから選
択され、そしてc)上記構造式はさらにR4を含んでおり、そのR4は水素、ヒ
ドロキシル、C1−C5アルキル、C1−C5アルキレン、C1−C5アルキル
・カルボニル、糖、C1−C5アルキル・エステル、及びモノテルペンによって
構成されるグループから選択され、そしてR4はそのトリテルペン部分あるいは
モノテルペン部分に取りつけられていてもよい。本発明の関連する実施の形態で
、その糖はグルコース、フコース、ラムノース、アラビノース、キセロース、キ
ノボース、マルトース、グルクロン酸、リボース、N−アセチル、及びガラクト
ースで構成されるグループから選択される。本発明の他の関連する実施の形態で
、その化合物はさらにその糖に取り付けられたモノテルペン部分で構成されてい
る。 本発明は又、R3が以下の構造式で示される組成物も提供し、 ここで、R5は水素、ヒドロキシル、C1−C5アルキル、C1−C5アルキレ
ン、C1−C5アルキル・カルボニル、糖、C1−C5アルキル・エステル、及
びモノテルペン基で構成されるグループから選択される。
別の実施の形態においては、R1及びR2はそれぞれオリゴ糖で構成されている。
本発明のさらに別の実施の形態においては、R1及びR2はそれぞれモノサッカラ
イド、ジサッカライド、トリサッカライイド、又はテトラサッカライドで構成さ
れている。本発明の関連する実施の形態では、R1及びR2はそれぞれグルコース
、フコース、ラムノーズ、アラビノース、マルトース、グルクロン酸、リボース
、N−アセチル・グルコサミン、及びガラクトースで構成されるグループから個
別的、独立的に選択される糖類で構成されたオリゴサッカライドで構成される。
さらに本発明の諸側面において、少なくとも1つの糖はメチル化されている。
レン炭素の1つを通じてトリテルペン部分に取り付けられている。本発明の別の
実施の形態で、トリテルペン部分はアカシ酸ではなくオレアノル酸である。
で構成される組成物、 又はその医薬品製剤を示しており、ここでa)R1はN−アセチル・グルコース
アミン、フコース、及びキシロースで構成されるオリゴサッカロイドであり、b
)R2はグルコース、アラビノース、及びラムノースで構成されるオリゴサッカ
ロイドである。関連する実施の形態で、以下の分子構造を有する組成物: 又はその医薬品製剤が示される。
む組成物: あるいはその医薬品製剤の精製について述べられており、ここでa)R1はNア
セチル・グルココサミン、フコース、及びキシロースで構成されるオリゴサッカ
ロイドであり、そしてb)R2はグルコース、アラビノース、及びラムノースで
構成されるオリゴサッカロイドである。本発明の関連する側面で、以下の分子構
造を有する組成物: あるいはその医薬品生成物の精製及び特性について述べられる。
ド 又はその医薬品組成物の精製について述べており、ここでa)R1はN−アセチ
ル・グルコシアミド、グルコース、及びキシロースで構成されるオリゴサッカロ
イドであり、そしてb)R2はグルコース、アラビノース及びラムノースで構成
されるオリゴサッカロイドである。本発明の関連する側面は以下の分子構造を有
する組成物の精製及び特徴について述べている。
位を含む組成物に関連している。1つの実施の形態で、そのトリテルペン部分は
アカシ酸又はオレアノル酸である。
想定されている。1つの実施の形態で、その医薬品製剤は緩衝液、溶媒、希釈剤
、不活性担体、オイル、クリーム又は食用材料で構成される薬学的に受け入れ可
能な媒体に溶解されている。本発明のいくつかの側面で、上記医薬品製剤とはさ
らにターゲッティング剤を含むことが想定されている。本発明のいくつかの側面
で、上記ターゲッティング剤は医薬品組成物の上皮細胞への伝達を指示すること
ができる。本発明の1つの関連する実施の形態で、上記ターゲッティング剤は上
記上皮細胞に結合する抗体を含んでいる。
皮細胞を殺すことができる第2の組成物を含んでいる。
ている。従って本発明は哺乳動物におけるその哺乳動物の上皮細胞の前悪性又は
悪性状態への移行の開始又はその進行を抑制する方法が提供され、この方法は治
療的に有効な量の上に述べた医薬品組成物を投与するステップを含んでいる。本
発明の1つの実施の形態で、上記上皮細胞は皮膚細胞、結腸細胞、子宮細胞、卵
巣細胞、膵臓細胞、肺細胞、膀胱細胞、前立腺細胞、腎臓細胞、又は乳房細胞で
ある。本発明の関連する実施の形態で、上記哺乳動物はヒトである。本発明のさ
らに別の実施の形態においては、その医薬品を投与する形態は経口である。本発
明のさらに別の実施の形態で、上記医薬品を投与する形態は局所的投与である。
本発明のさらに別の実施の形態で、上記医薬品を投与する形態は腫瘍内注射であ
る。本発明のさらに別の実施の形態で、上記医薬品を投与する形態は静脈注射で
ある。本発明のさらに別の実施の形態で、上記医薬品を投与する形態はエアロゾ
ル吸入のステップを含んでいる。
想定している。1つの実施の形態で、上記他の療法とは上皮細胞をX線放射、γ
−放射、あるいはマイクロ波放射で照射するステップを含んでいる。
する方法をその範囲に想定しており、その方法は治療的に有効な量の医薬品組成
物を投与するステップを含んでいる。本発明の1つの実施の形態で、上記細胞と
は皮膚細胞、結腸細胞、子宮細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、肺細胞、膀胱細胞、前
立腺細胞、腎臓細胞、あるいは乳房細胞である。
常な増殖を防ぐ方法を提供し、その方法は治療的に有効な量の上に述べた医薬品
組成物を上記哺乳動物に投与するステップを含んでいる。1つの実施の形態で、
上記上皮細胞は陰窩細胞である。本発明のさらに別の実施の形態で、上皮細胞は
結腸細胞である。本発明の関連する実施の形態で、上記哺乳動物はヒトである。
本発明のさらに別の実施の形態で、上記医薬品を投与する形態は経口である。本
発明のさらに別の実施の形態で、上記医薬品を投与する形態は局所的投与である
。本発明のさらに別の実施の形態で、上記医薬品を投与する形態は腫瘍内注射で
ある。本発明のさらに別の実施の形態で、上記医薬品を投与する形態は静脈注射
である。本発明のさらに別の実施の形態で、医薬品を投与する形態はアエロゾル
を吸入するステップを含んでいる。本発明は又本発明による上記医薬品製剤を他
の療法と組み合わせて使用することをその範囲内に想定している。1つの実施の
形態で、上記他の療法はその上皮細胞をX線放射、UV線放射、γ線放射、ある
いはマイクロ波放射で照射するステップを含んでいる。
ここで述べるトリテルペン化合物の医薬品組成物を治療上有効な量だけその哺乳
動物に投与するステップを含んでいる。本発明の関連する1つの実施の形態で、
上記哺乳動物はヒトである。本発明のさらに別の実施の形態では、上記医薬品を
投与する形態は経口である。本発明のさらに別の実施の形態では、上記医薬品を
投与する形態は局所投与である。本発明のさらに別の実施の形態では、上記医薬
品を投与する形態はアエロゾルを吸入するステップを含んでいる。
、この方法はその哺乳動物に対して治療上有効な量の上記の医薬品組成物を投与
するステップを含んでいる。この方法は哺乳動物がヒトであっても可能である。
ビボでトリテルペン・グリコシド化合物も同様の効果を示すと考えられる。
者らは本発明による化合物の他の多数の使用法も提供している。特に、本発明に
よる化合物は、毛細管の虚弱性を低下させるための薬剤として、老衰の影響と対
応するための薬剤、皮膚コラーゲンを増大するための薬剤として、ペニス機能増
強剤として、そして認識と記憶を改善するための薬剤として使用できる溶媒、酸
化防止剤、殺真菌剤、殺魚剤あるいは殺軟体動物剤、避妊薬、脈管形成調節剤、
紫外線防止剤、去痰剤、利尿剤、抗炎症剤、コレステロール代謝調整剤、心臓血
管刺激剤、抗潰瘍剤、鎮痛剤、鎮静剤、免疫調整剤、解熱剤である。
することで先行技術における限界を克服することを課題としている。特に、本発
明者はアカシア・ビクトリアエから採取したトリテルペン化合物を識別し、精製
した。識別された化合物は正常なヒト細胞に対してほとんど、あるいはまったく
毒性がない濃度で強力な抗腫瘍活性を示す。
れたマメ類の60の植物抽出物の標的を絞ったスクリーニングによって識別され
た。最初のスクリーニングでUA−BRF−004−DELEP−F001と命
名されたアカシア・ビクトリアエから単離された1つの抽出物は種々のヒト腫瘍
細胞株に対して強力な抗腫瘍活性を示した。この抽出物は後でさらに種々のフラ
クションに精製された。二段階目の精製で、精製された抗腫瘍性化合物で構成さ
れた抽出物が識別された。この抽出物は精製されたトリテルペン・グリコシド・
サポニン類を含んでいることが確認された。それら活性を示す化合物を効率的に
単離するための手順が後に開発された。
た。この精製された抽出物は正常なヒト細胞に対してはほとんど、あるいはまっ
たく毒性が示されない濃度で、粗抽出物と比較して増強された抗腫瘍活性を示し
た。その抽出物はさらに発癌性物質にさらされたマウスにおいて化学的保護効果
を持っていることが示された。
種に対する限定的な従来の研究を含む種々の要因に基づいて選択された。アカシ
ア・ビクトリアエはオーストラリア原産であるが、園芸種として世界中に輸入さ
れ、棘つきのアカシアあるいはエレガントなアカシアとして一般的に知られてい
る。この樹木は1年に60−120cmの割合で成長し、やや遅めに枯れる落葉
性で、少なくとも−15℃の低温に対して耐えることができる。成木は10−1
5フィートまで成長し、青緑色の二羽状の葉を有している。米国南西部では、そ
の植物は通常四月から五月にかけて開花し、六月にさやが熟する。アカシア・ビ
クトリアエは防風、防風林、食物、土壌安定化、そして低地水利施設の装飾用な
ど、農業分野で多数の目的のために用いられている。オーストラリア原住民によ
って何世代ににもわたって、種々のアカシア種の種子が食材供給源として使用さ
れている(Listerら、1996)。アカシア類のうちで、アカシア・ビク
トリアエは最もありふれた、広く分布する種であり、オーストラリア全土に存在
しており、従って、最も広く消費されている種である。一般的にはワットルシー
ドと呼ばれるアカシアの種子はケーキやパンの生地として、さらにデザート類,
特にアイスクリームでの香料としての需要が高い。それらは又高品質のコーヒー
状飲料を生産するためにも使われ、アカシア種の中では,特にアカシア・ビクト
リアエ(Acasia victoriae(Benth.))が一般的には上質の香りを有するものとみ
なされている(Listerら、1996)。しかしながら、この植物のさやや
根の使用に関する記録は存在しない。
さや及び根の新しい使用法に関するものである。本発明の発明者らはこの植物の
従来使われていなかった部分から採取される新しい抗癌性及びその他の生物学的
に活性のある化合物の存在を実証した。
成分の特徴づけ及び判定である。その成分及びグリコシドの単離、構造解明、及
び分析のために高度の技術が要求されることが多いトリテルペン・サポニン製剤
の場合も同様である。純粋な化合物の生物学的なテストを行う場合は、それらの
十分な量と純度で単離することが必要である。
を示すので、その単離はかなり困難である。純粋なサポニンの単離に関連した1
つの問題はアグリコン又は糖部分の性質(モノサッカライドの性質、数、位置、
および取り付け部分のキラリティー)が微妙に違っている関連性の高い化合物の
複雑な混合物の存在である。エステル類など変化しやすい成分もその難しさの一
因である。例えば、重要な天然大豆サポニン、γ−ピロン誘導体(BOA)は室
温で水性エタノールでしか抽出できない。加熱(80℃)で抽出を行うと、エス
テル部分の分裂やソヤサポニンI(Bb)の形成につながってしまう(Kudo
uら、1992)。植物においては、サポニン類はサッカライド及びフェノール
化合物などを含む発色剤など非常に極性の高い物質を伴っており、簡単に結晶化
されず、湿度の影響を受けやすく、これらのことがそれらの結晶を得ることをさ
らに困難にしている。
である。融点が一定しておらず、分解を伴うことが多い。従って、サンプルの純
度の判定は一般的には融点、光学回転値又はその他の物理的定数だけに基づいて
行われることはない。サポニンの純度のより優れたテストはTLC又はHPLC
検査−可能であれば真正サンプルとの共クロマトグラフィーによる−検査によっ
て行うことができる。適切な試薬を散布した後のTLCプレートのスポットの発
色も存在の可能性がある個別成分のもうひとつの指標である。例えば、本発明に
よるトリテルペン・グリコシドの1つであるD1は15.2分間のHPLC保持
時間を有している。これはBeutlerらによって1997年にアーチデンド
ロン・エリプティクム(Archidendron ellipicum)から分離された、15.2分
間のHPLC保持時間を有する別の関連化合物とは異なっている。本発明による
トリテルペンのさらなる特徴づけは、保持時間におけるこの違いが少なくともキ
ラリティーとD1の二重結合の違い及びエリプトシドEの報告されている特徴に
よるものであることを示している。
ルでは、植物抽出物のここで述べられているようなトリテルペン・グリコシド化
合物への粗分画ステップを含んでいる。植物性物質から得た本発明による化合物
を全体として分離した後、問題のトリテルペン・グリコシドは、部分的又は完全
な精製(又は均一状態への精製)を行うために、ここで述べられている技術、例
えばクロマトグラフィー技術を用いてさらに精製することができる。純粋なトリ
テルペン・グリコシド組成物を調整するに特に適した分析的方法も以下に具体的
に述べられている。
、植物性物質のトリテルペン・グリコシドの基本的な精製に関連している。本発
明の1つの好ましい実施の形態においては、トリテルペン・グリコシドは豆科の
植物から生成され、より好ましくはアカシア類、そして最も好ましくはAcasia v
ictoriaeら、そしてさらに好ましくはAcasia victoriae(Benth.)から精製される
。ここで用いられる『精製されたトリテルペン・グリコシド』という用語は他の
成分から単離可能で、その組成物が天然で得られる状態と比較してある程度まで
精製可能な組成物を意味している。
去するために画分された同様の分子の集団を意味し、その組成物はその表現され
た生物学的活性を基本的に保持する。『基本的に精製された』という用語が用い
られる場合は、この用語はトリテルペン・グリコシドがその組成物の重要な部分
、例えば、その組成物中の分子の約50%、約60%、約70%、約80%、約
90%、約95%あるいはそれ以上を占めているような組成物を指す。
提供されねばならないというような一般的必要性はない。実際、いくつかの実施
の形態ではそれほど精製されていない生成物でも実用性を持つと考えられる。例
えば、本発明では乾燥したアカシア・ビクトリアエの根及びその抽出物を医薬品
として使用することが考えられている。栄養薬品とは定義上、健康に対して相乗
効果を有する異なった生物学的化合物の混合物を含んでいる。本発明による栄養
薬品とは錠剤やカプセルの形状であってよく、経口で摂取することができ、ある
いは局所的に適用できる軟膏中に抽出物を含むようにすることもできる。部分的
な精製は少数の精製ステップを組み合わせるか、あるいは同じ全体的精製方式の
ことなった形態を用いることによって行うことができる。例えば、HPLC装置
を用いて行われる陽イオン交換カラム・クロマトグラフィーが通常は低圧クロマ
トグラフィー・システムを利用した同じ技術を用いた場合より何倍も大きな精製
度を達成することが知られている。より低い程度の相対的精製度を示す方法は生
成物の全体的回収やトリテルペン化合物の生物学的活性の維持において利点を有
している。
サポニンのエステル化、変化しやすいエステル基の加水分解、そしてトランスア
ルキル化など形質変換を受けやすいので、抽出手順はできるだけ温和な条件下で
行うべきである。従って、例えば薄層クロマトグラフィーでの単離手順では細心
の注意を払ってここのステップを行うべきである。
われている一般的な手順は、メタノール、エタノール、水あるいは水性アルコー
ルによる抽出;一般的には石油エーテルを用いて、上記抽出ステップ前か抽出ス
テップ中に行われる脱脂ステップと;水にその抽出物を溶解するか、又は懸濁さ
せるステップと;その溶液又は懸濁液を振動させるかあるいは水で飽和させたn
−ブタノールで洗浄するステップと;そして、ジエチル・エーテル又はアセテー
トでサポニンを精製するステップ(オプション可能)を含んでいる。糖類など小
さな水溶性分子を除去するために透析ステップを含めることもできる(例えば、
Zhouら、1981;Massiotら、1988参照)。
って行うことができる。メタノールは又新鮮な植物性物質に対しても用いること
ができる。水は通常サポニン類に対してはより効率性の低い抽出溶媒であるが(
特に水溶性グリコシドが望ましいのでなければ)、簡単に乾燥凍結でき、より鮮
明な抽出物を提供できるという利点を有している。抽出に用いられる水の割合に
応じて、モノデスモシディック又はバイデスモシデイック・サポニン類を得るこ
とができる(Domon及びHostettmann,1984;Kawamu
raら、1988)。新鮮な野菜物質は、溶媒で均一化させると、バイデスモシ
ディックをモノデスモシディックに転化できる活性酵素(エステラーゼ)を有し
ている。乾燥した素材でも水の存在下で活性化させることができるエステラーゼ
を含んでいる場合がある。モモルッディンI(モノデスモシディック・オレアノ
ル酸サポニン)の場合、モモルディンII(対応するバイデスモシド)への転化
は水、及び30%と60%メタノール溶液で起きるが、80%及び100%メタ
ノール溶液では起きない。反対に、新鮮な根のホモジェネートはメタノール内で
酵素活性を維持した。しかしながら、その酵素は最初にその新鮮な根を4%塩酸
に浸すことによって不活性化することができ、そしてバイデスモシドが主要成分
であることが示された。従って、抽出手順の正しい選択は非常に重要な第1のス
テップである。
ど蛋白質を精製するために通常用いられる方法は非サポニン成分から水溶液中の
サポニン類を部分的に分離する上で有益であるが、サポニンが混合ミセルを形成
する傾向を有しているので、個々のサポニンを単離する上では一般的にそれほど
効率的ではない。従って、効率的な分離を行うためには、通常、混合ミセルの形
成が分離に悪影響を及ぼさないようにモノマーとしての疎水性サポニンを可溶化
する有機性溶媒あるいは溶媒/水システムの使用を必要とする。
による抽出中の22−OCH3誘導体の形成である。しかしながら、真正な22
−ヒドロキシルフロスタノール類は別の溶媒(例えば、ピリジン)による抽出、
又は沸騰した水性アセトンによるメトキシル化された構成物の処理によって入手
することができる(Konishi及びShojiら、1979)。
ゆる側面に対して非常な重要性を有している。TLCプレート(通常シリカ・ゲ
ル)は純粋なサポニン類と粗抽出物の両方を取り扱うことができ、安価で、手早
く使用することができ、そして特別な装置を必要としない。視覚化のための多数
の試薬をプレート上に散布するために用いることができる(表2)。最も一般的
な試薬の調製法は以下のとおりである。 *ヴァニリン−硫酸(ゴディン試薬)。エタノールへの1%ヴァニリン溶液を
水中で3%過塩素酸と1:1の割合で混合して、TLCプレート上に散布する。
その後、エタノールに10%硫酸溶液を溶かして110℃で加熱する。 *リーバーマン−バーチャード試薬。濃縮硫酸(1ml)を無水酢酸(20m
l)及びクロロホルム(50ml)と混合する。85−90℃で加熱するとTL
Cプレート上で必要な発色が得られる。 *塩化アンチモニー(III)。TLCプレートをクロロホルムに塩化アンチ
モニーを溶かした10%溶液で散布して、100℃に加熱する。 *アニスアルデヒド−硫酸。アニサアルデヒド(0.5ml)を氷酢酸(10
ml)、メタノール(85ml)、そして濃縮硫酸(5ml)と混合する。 この溶液をTLCプレート上に散布して、100℃に加熱する。
、トリテルペン・サポニン類によって青又は紫色の発色が得られる。アニサルア
ルデヒド−硫酸を用いた場合は、TLCプレートを加熱すると青又は青紫の発色
がつくりだされる。硫酸に硫化セリウムを溶かした溶液をTLCプレートにスプ
レーすると紫外線を照射した場合に赤紫、青、又は緑の蛍光ゾーンが得られる(
Kitagawaら、1984b)。いくつかの事例で、プレートに水をスプレ
ーしただけで、サポニンの存在を明らかにするのに十分である。別のスプレー用
試薬は、例えば、Stahl(1969)に見出される。
5:10)であるが、その他の溶媒も有益である。n−ブタノール−エタノール
−アンモニア(7:2:5)溶媒はウロン酸残滓を含んでいるグルコシド類、す
なわち、非常に極性の高い混合物に対して特に有効である。その他の広く使われ
ている溶媒としてはn−ブタノール−酢酸―水(4:1:5;上層)、又はクロ
ロホルム−メタノール−酢酸−水(60:32:12:8)などである。
−ピリジン−水(30:10:30;上相)などである。視覚化はステロイド試
薬(アニスアルデヒド−硫酸)又はアルカロイド試薬(ドラゲンドルフ試薬、硫
酸セリウム(IV))を用いて行われる。その他の溶媒及び視覚化用試薬はJo
dhavら(1981)及びBaerheim Svendsen及びVerp
oorte(1983)に述べられている。
られたスポットの密度は密度計を用いて直接測定することができる。それとは別
に、TLC分離を行い、適切なバンド(例えば、ヨード蒸気で位置を確認するこ
とができる)をプレートから剥ぎ取り、サポニンを溶出させ、そして適切な試薬
(例えば濃縮硫酸)を加えた後、紫外線吸収を測定するなどの方法で定量的判定
を行うことができる。
供してくれ、この方法はシリカ・ゲル・プレート上でのTLCを補うものである
。逆相TLCプレート(例えば、Merck RP−8又はRP−18 HPT
LCプレート)を形成する場合、ほとんど例外なしにメタノール−水及びアセト
ニトリル−水混合物が用いられる。又、DIOL HPTLCガラス裏打ちプレ
ートを使用することも可能である。逆相TLCに関する限り、これらは通常のシ
リカ・ゲルTLC−タイプ溶媒、あるいはメタノール−水及びアセトニトリル−
水溶媒と共に用いられる。
る試薬の例を以下の表2に示す。
TLCプレートからバンドを剥離する必要がない平面的な方法である(Host
ettmannら、1980)。CTLCは円形TLCプレートを通じての可動
相フローを加速するために遠心力の作用を利用する。このプレートは適切な吸着
材(厚さ:1、2又は4mm)で被覆されており、電気モーターで約800r.p
.mの速度で回転され、その間に中心部でサンプル導入が行われ、吸着材を通じ
て溶離剤が汲み出される。これらは円周部分に押出され、TlC分析のために回
収される。2mmの厚さの吸着材層上で50−500mgの分離が可能である。
:3)を用いたCTLCとカラム・クロマトグラフィーの組み合わせが開示され
ている(Hostettmannら、1980)。サポニン類はシリカ・ゲル・
プレート上でクロロホルム−メタノール−水混合物を用いることによっても得ら
れている。エレウテロコックス・センティコスス(Eleutherococcus sebbticosu
s)の根(Araliaceae)から採取した2つのプロトプリムラジェニンAグリコシ
ド類をシリカ・ゲル上でカラム・クロマトグラフィーを行い、Sedephax
LH−20上でゲルろ過した後にCTLC(クロロホルム−メタノール−水、
65:35:7)を行って精製した(Segiet−Kujawa及びKalo
ga,1991)。Passiflora quadrangularis (Passifloraceae)から採取した
シクロアルタン・グリコシド類を単離するために、溶媒系酢酸エチル−エタノー
ル−水(8:2:1又は16:3:2)を1ml/分(Orsiniら、198
7)又は1.5ml/分(Orisini及びVerotta、1985)の流
量で用いた。
することが開示されている。この機械を用いて、シリカ・ゲル・プレート上で処
理液クロロホルム−メタノール−水を使ってクロマトグラフィーを行った(7:
3:1(低相)から65:35:10(低相))を行う。この技術を用いて、全
部で1gの半精製サポニン画分に対して円形プレート上でクロマトグラフィーを
行った(Kitagawaら、1988;Taniyamaら、1988)。
た多数の古典的な溶媒系がこれまでに開示されており、例えば、Woikeら、
1970及びHiller、1985に見出すことができる。オープン・カラム
・クロマトグラフィーはしばしば粗サポニン混合物に対する第1の分画ステップ
として用いられるが、いくつかの事例では純粋な生成物をつくりだす場合もある
。一般的に、分解度はそれ程高くなく、複雑な混合物は部分的に分離されるだけ
である。他の問題は可逆吸収及び分離を行うために必要な時間の長さの故に材料
が失われることになる。
フィーは最も適用性の広い技術の1つである。2相系を用いる場合、水飽和クロ
ロホルム相が溶離剤である。従って、クロロホルム−メタノール−水の勾配(例
えば、65:35:5から65:40:10)をシリカ・ゲル上で植物組織をメ
タノール抽出する場合の最初の分離に用いることができる。さらに、例えばモノ
デスモシド性殺軟体動物性サポニンをつくるために低圧カラムでのクロマトグラ
フィーを用いることができ、一方、バイデスモシド性サポニンはアセトン−n−
プロパノール−水(35:35:5)などの溶媒系を用いたシリカ・ゲル・カラ
ム・クロマトグラフィーによって得ることができる(Borelら、1987)
。
idaceae)から分離されている。これらのうちの3つ、つまりポリガラク酸の2,
9,16−トリヒドロキシパルミチン酸グリコシドが、n−ブタノール−エタノ
ール−水(5:1:4、上相)及びクロロホルム−メタノール−水(60:29
:6)を溶離剤として用いてシリカ・ゲル60(60−230μm)上で粗サポ
ニン混合物のオープン・カラム・クロマトグラフィーを含む方式で得られた。最
終的な精製はHPLCによって行われた(Asadaら、1989)。
atum (Cucurbiaceae)からダンマレーン・グリコシド・アキチノステモシドA−
Dの分離を可能にしている。MCI(ミツビシ化学工業)ポリスチレン・ゲル・
カラムを行った後、適切なフラクションはクロロホルム−メタノール−水(7:
3:0.5,32:8:1)、クロロホルム−メタノール(9:1,1,1)、
クロロホルム−エタノール(17:3)、酢酸エチル−メタノール(4:1)、
及びクロロホルム−メタノール−酢酸エチル−水(3:3:4:1.5、低相)
などの種々の溶媒を用いてクロマトグラフィーにかけられた。この手段で、純粋
なアクチノステモシドCが得られたのに対して、アクチノステモシドA及びBは
追加的な低圧LCステップを必要として、アクチノステモシドDは70%メタノ
ールで溶離されるC−18カラム上での最終的な分離を必要とした(Iwamo
toら、1987)。
クロマトグラフィーにかけられている(Stivastava及びKulshr
eshtha、1986;1988)。
カラム・クロマトグラフィーにおいて粗RP吸着剤が用いられている。粒度が細
か過ぎず、カラムが長すぎなければ、重力供給カラムが非常に適している。RP
クロマトグラフィーは一般的には最初のシリカ・ゲル分離ステップ後に行われ、
分離される物質の対する選択性の変更を可能にしてくれる。別の可能性はDCC
Cステップの後で逆相分離が行われる(Higuchiら、1988)。
長年にわたって行われている。Sephadex LH−20は最も多く使用さ
れているが、Gシリーズのポリマーも使用されないわけではない。
発されている。例えば、Daiton HP−20(ミツビシ化学工業、東京)
は最初の精製分離ステップのために広範に用いられる非常に多孔性のポリマーで
ある。
びその他の水溶性の高い物質を溶離するために、サンプル付加後に水で洗浄され
る。その後、サポニン画分を得るためにメタノール−水勾配(あるいはメタノー
ルだけ)を用いての溶離を開始する。純粋なサポニンを単離するためには他のク
ロマトグラフィー技術が用いられる。
例えば、Thladiantha dubia (Cucurbitaceae)の塊茎からキラヤ酸のバイデスモ
シド性グリコシドの分離において、メタノール抽出物はDiaion CHP−
20Pを通過させられ、水で洗浄された。粗サポニンは40%アセトンによって
溶離された。さらに、分離においてはシリカ・ゲル・クロマトグラフィー(酢酸
エチル−メタノール−水 6:2:1)及びHPLCが行われた(Nagaoら
、1990)。
のために、Amberlite XAD−2カラム上で水抽出物はクロマトグラ
フィーにかけてメタノール溶離し、その後、二番目のXAD−2カラムで40−
70%メタノール溶離した。クロロホルム−メタノール−水(65:35:10
低相から65:40:10)によるシリカ・ゲル・カラム・クロマトグラフィー
によって活性のある主要成分が得られた(Yoshikawaら、1991)。
のLPLC装置とは違って、グラム単位のサンプルをカラム上に装填することが
でき、分離は最大40barまでの圧力で行われる。基質の粒度は通常25−4
0μmの範囲で、分離は迅速に行われ、必要な時間はオープン・カラム・クロマ
トグラフィーの場合よりかなり短い。分析的HPLCからMPLCへの分離条件
の直接的な移行が逆相基質上で可能であるので、溶媒の選択が簡単である(Ho
stettmannら、1986)。
て、生物学的テストを行うのに十分な量のCussonia spicata (Araliaceae)から
の殺軟体動物性サポニン類が得られた(Gunzingerら、1986)。実
際、この方法は幹樹皮からのブラノール抽出物からのサポニン分離のためにわず
か2つのステップ(1つはシリカ・ゲル基質上で、二番目はRP物質上で)を必
要としただけである。
p RP−8(25−40μm、46x2.6cm)を用いたMPLCと、回転
小室向流クロマトグラフィーとの組み合わせでも行うことができる(Dorsa
z及びHostettmann、1986)。別のMPLC技術では、軸方向に
圧縮された(Jobin−Yvon)カラムを用いる(Eliasら、1991
)。
示す。
ポニン類を数ミリグラム・レベルで定量するための強力な技術であり、この点で
、最終的な精製ステップとして採用されることが多い。MPLCは大型の粒子(
25−100μm)を利用するが、半予備的HPLC吸着材は5−30μmの粒
度範囲にあり、従って、より高度の分離効率を可能にしてくれる。
ドを分離するために用いられる。これはガラクトース部分がグルコース残基のC
−3又はC−4位置に取り付けられているかどうかを判断する上で必要であった
。アイソマー性サポニンの単離はアセトニトリル−水(38:62)を用いて7
μm LiChrosorb RP−8カラム(250x16min)で10m
l/分の流量で行われた。検出は206nmで、50mgの混合物から行われた
(Decosterdら、1987)。
大規模な分離が軸方向圧縮カラム、寸法100x11センチ I.Dを使って行
われている。メタノール抽出物の予備的な精製がHP−20ポリマー上で溶媒分
割及びクロマトグラフィーで実行された。予備的HPLCカラムにC−18シリ
カ・ゲル(20μm粒子サイズ)をパックして、水性アセトニトリル・ステップ
勾配を用いて210m/mlの流量で溶離させた。10gの装填で、400mg
のサイコサポニンc、1200mgのサイコサポニンa、及び1600mgのサ
イコサポニンd(Sakuma及びMotomura、1987)を得るのに十
分であった。
00x57mm)を装填したWaters Prep500システム(軸方向圧
縮カラム)上でのクロマトグラフィーを含む2ステップ手順によってPanax trif
lorius (Araliaceae)から単離された。溶離液はn−ブタノール−酢酸エチル−
水(4:1:5)の上相で、4gのチャージを投入した。アセトニトリル−水(
86:14又は80:20)を用いて炭水化物カラム(Waters、300x
7.8mm)上で2ml/分の流量で半予備的HPLCを行って最終精製を行っ
た(Lee及びMarderosian,1988)。
を行うための適切な発色団が存在しないことであるが、これは通常屈折率検出、
質量検出、及び誘導体化などの技術を用いることによって克服される。
3−210nmあたりでのUV検出を一般的に用いることができる。アセトニト
リル−水を用いたUV検出での分離もうまく行われている。アセトニトリルはU
V吸収が少ないので、低波長の場合メタノールに対して好ましい。テスト対象の
一連のサポニン類で極性の違いがあまり大きくなければ(例えば、糖鎖での非常
に小さな変化など)、絶対平等的な溶離を行うことができる。
る勾配溶離液を用いたオクチル−結合カラム上で分離するステップを含んでいる
。アセトニトリルの量は20分の時間内で30%から40%に増大されたが、U
V吸収での基本的な変化としては比較的小さかった。より極性の高いバイデシモ
シド性サポニン類は通常モノデスモシド性サポニン及びグルコシドよりずっと速
やかに溶離を行い、グルクロニドの保持量は他のグリコシドより小さい。サポニ
ン類の親油部分の選択のために非極性オクチルシリル基質を用いることができる
。この技術を用いて、極性の低いオレアノル酸の同じグリコシド類より前にヘデ
ラジェニンのグリコシドが溶離された(Domonら、1984)。
不安定なベースラインの問題を引き起こす低波長での検出は誘導体化トリテルペ
ンによるHPLC分析によって改善することができる。1つの可能性はモノデス
モデシド性サポニン類の定量的検出に関して報告されているように、サポニン内
で見出される有利カルボキシル基を機能化することである。二炭酸カリウムとク
ラウン・エーテルの存在下で4−ブロモフェナシル・ブロマイドによってオレア
ノル酸グリコシドを処理するとブロモフェナシル誘導体の組成がもたらされる。
4−ブロモシルフェナシル誘導体は254nmで強力に吸収し、検出はこの波長
で溶媒からの干渉を受けずに検出を行うことができる(Slacaninら、1
988)。この誘導体の構造は以下に示す通りである。
調整することである。この手段によって、大豆サポニンを分析し、種々の大豆の
異なった器官で、内部標準としてアントラセンを用いて定量的に判定した(Ki
tagawaら、1984a;Taniら、1985)。
プが必要である。これは、例えば、Sep−PakRC18(Guedonら、1
989)又はExtrelutR(Solloz,1985)カートリッジを用
いて行うことができる。
イオン性化合物の場合は、ピークの広がりを避けるためにはイオン形成を抑制す
るための何らかの方法が必要である。これは、リン酸、トリフルオロ酢酸などの
紫外線吸収性が低い酸を流体に加えることで行うことができる。別の可能性はイ
オン対HPLCを用い、可動フェーズにカウンター・イオンを追加する方法であ
る。このイオン性化合物のキャパシティ・ファクターはペアリング試薬でイオン
錯体を形成することによって増大させる。(上に述べたような)カルボキシル基
の誘導体化は可動相に別の物質を追加する方式の代わりに用いられる方法で、ピ
ークの分解度がかなり改善される。
合物や抽出物内の個々のサポニンの量を判定することができる点である。多くの
場合、HPLCは比色、ガス・クロマトグラフィー、及びTLC−蛍光測定技術
によるものより優れた結果を提供する。
ロロキシアパタイト・カラム、化学的に修飾された多孔性ガラス・カラム、シリ
カ・ゲル・カラム、硼素錯体のHPLCの利用を含む他の多数の方法を用いるこ
とができる。
水性が高く、単純な二元水性溶媒系と共に用いることができ、紫外線による検出
をより容易にしてくれる。また中性、及びアルカリ性媒体内で安定している。最
近、高圧(最大150kg/cm2)に対して耐性を示すヒドロキシアパタイト
の硬質球状粒子が調製され、HPLCの応用性を広げている。末端ペントース単
位だけが違っており、RP−HPLCによって分離できるサポニン類がこの技術
をつかって分解された(Kasaiら、1987b)。Panax ginseng(Araliace
ae)の分離はイソクラティックなモード(アセトニトリル−水:80:20)、
あるいはより良くは線形グラジエント(アセトニトリル−水70:30から90
:10)を用いて行われた(Kasaiら、1987b)。シリカ・ゲルの場合
に観察されるように、極性を増大させるために、つまりRP−HPLCの場合と
は反対に、グリコシドが溶離される。
による最善の結果は、例えば、アサヒ・カセイ・コウギョウからのAsahip
ak ES−502NTM、100x76/分カラムを用いて、20%(v/v)
アセトニトリル(pH8)に溶かした0.4M H3BO3を75℃で用いること
によって得られる。クロマトグラフィーによる特性はサッカライド部分でのci
s−ジオールとのホウ酸錯体の形成に依存している。分離後、ホウ酸塩はメタノ
ールによる溶離物を繰返し共蒸留することで揮発性ホウ酸メチルとして取り除く
ことが出来る。
の間である。オクタデシル多孔ガラス(MPG−ODS)は逆相HPLCのため
のパッキングとして調製されており、サポニンの迅速と効率的な分離のために用
いられている。例えば、チョウセンニンジン及びbupleurumの根を含む
混合薬剤の抽出物から分離のためにアセトニトリル−水(25.5:74.5)
混合物を用いてジンセノシド類とサイコサポニンの両方を同時に分離することが
できる(Kanazawaら、1990a)。チョウセンニンジン抽出物のHP
LC及びジンセノイドの混合物に対するMPG−ODSとシリカ・カラムとの比
較ではその保持挙動は類似しているが、MPG−ODSカラムでのキャパシティ
・ファクターは小さかった。あるジンセノイドの分解度はMPG−ODSカラム
の方が優れていた(Kanazawaら、1993)。
シリカ・ゲルHPLCは通常そうした溶離剤には有効に働かない。しかしながら
、カラム・パッキングを修正することでカラムを劣化させずに水溶性グリコシド
の分離を可能にした。この手順では最初にカラムをメタノールで洗浄し、その後
でクロロホルム−メタノール−エタノール−水(62:16:16:6)、そし
て最後に上記溶媒システムで洗浄してその後で分離のために用いられる(Kai
zuka及びTakahashi,1983)。例えば、5μmシリカ・ゲル・
カラムを含水溶離剤であるヘキサン−エタノール−水(8:2:0.5)と共に
用いることで、チョウセンニンジン・サポニン及びBupleurum falcatumから採取
したサイコサポニンの効率的な分析を行うことが出来るであろう。
ー分離ステップがアルコール性又は植物抽出物の他の極性成分を除去するために
必要とされる。
ー、DCCC、低圧液体クロマトグラフィー(LPLC)、中間圧力液体クロマ
トグラフィー(MPLC)、HPLC及び通常のオープン−カラム・クロマトグ
ラフィーなどを含むいろいろな分離技術が開示されている(Hostettma
nnら、1986,1991;Marston及びHostettmann、1
991b参照)。分離条件や溶媒系についての知識は本開示の関連する技術分野
の当業者には明らかであろう。最善の結果は通常以下に具体的に示されるような
種々の方法の組み合わせを用いる基本的な方針で得ることができる。
了すると、遊離サポニンを得るためにイオン交換樹脂による処理が必要となる場
合がある。適切な樹脂の例としては、Dowex 50Wx8(H+形態)(K
itagawaら、1988;Yoshikawaら、1991)、Amber
lite IRC 84(Okabeら、1898;Nagaoら、1990)
、及びAmberlite MB−3(Mizutaniら、1984)などが
ある。しかしながら、分解を防ぐために中性又はpHの慎重な制御が必要な場合
は、イオン交換樹脂のろ過を含むステップは避けねばならない。
ンフラクションのメチル化が行われている(Okabeら、1989;Naga
oら、1989、1990)。
来のオープン・カラム・クロマトグラフィーと比較してかなりの時間的節約を可
能にしてくれる。通常のガラス・カラムは用いられるが、溶離剤は圧縮空気又は
窒素内で吸着材を通過させられ、カラムの頂部で約2barの最大の圧力に到達
する。この吸着材の粒度は加圧下で溶媒が提供されているのである程度減少し、
従って分離度がより高くなる。
として、フラッシュ・クロマトグラフィーを用いることができる。この方法を用
いて、10mgから10gのサンプルの分離はやずか10分で達成することがで
きる。例えば、Dolichos kitimanscharicus (Leguminosae)の根から軟体動物駆
除剤及び殺菌剤ヘデラジニン、バヨジニン、及びメディカジニン・グルコシドが
この技術で単離された。メタノール抽出物(3.3g)を溶媒システム:クロロ
ホルム−メタノール−水(50:10:1)を用いて60x4カラムでシリカ・
ゲル(粒度:63−200μm)で分画化された。汚染物質を除去し、2つのサ
ポニンを多量に含むフラクションを得るためにはこれで十分であった。純粋なト
リテルペン・グリコシドがC−8支持体上でのDCCCとLPLCの組み合わせ
で得られた(Marstonら、1988a)。
る傾向が増大している。RPフラッシュ・クロマトグラフィーはオリゴサッカロ
イドなどの他の、より極性の高い成分からのサポニン類の分離を可能にしてくれ
る。
ある。LPLCは粒子サイズが40−60μmの範囲の吸着材を含んだカラムを
用いる。最大10barまでの圧力下で高い流量での操作が可能であり、カラム
はほとんどの場合ガラスでできている。市販されているいろいろなサイズの事前
にパックされたカラム(例えば、Merckからの“Lobar”範囲)が50
−500mg程度のサンプル範囲でサポニンの予備的クロマトグラフィーを行う
には最も適している。高い、そして均一のパッキング密度が良好な分離密度を保
証してくれる。さらに、吸着材の化学的特性が同様であれば、分析的HPLC条
件からLPLC分離への移行が比較的容易である(Marston及びHost
ettmann,1991b)。
ている。この場合に投入されるのは予備精製サンプルだけである。LPLCの良
い事例はSwarzia madagascariensis(マメ科)からの軟体動物駆除剤及び溶血性
オレアノル酸及びジプソジェニン・グリコシドの分離である。乾燥したグランド
・フルーツの実を水で抽出して、この抽出物をn−ブタノールと水に分けた。有
機相のオープン・カラム・クロマトグラフィー後に、溶離剤としてメタノール−
水(75:25)を用いてLobar LiChroprep C−8カラム(
40−63pro;27x2.5cm)でサポニン類を分離した(Borel及
びHostettmann、1987)。
になる。この方式はActinostemma lobata(ウリ科)の分離の際に用いられ、こ
の3つのLobar27x2.5カラムが接続された。この溶離剤はまた少量の
水も含んでいた(酢酸エチル−n−プロパノル−水20:3:0.3)(Iwa
motoら、1987)。
高いサポニン類は、特にパッキング材への可逆吸収による物質の損失がないので
、向流クロマトグラフィー分離に適している。この側面は特に粗抽出物の直接分
画に利用されている。
相を通じて可動相の小滴を継続的に通過させることによって行われる。溶質は2
つの相に継続的に分割される。可動相がこれらのチューブの頂部に入れられるか
あるいは底部に入れられるかに従って、クロマトグラフィーは『降流』あるいは
『昇流』モードのいずれかになる。DCCCによる非常に関連性の高いサポニン
類の分離及び純粋な生成物の単離さえ可能であることが示されている(Host
ettmannら、1984)。実際、液体−固体クロマトグラフィーでは不可
能であったいくつかの分離がこの技術によって可能となっている。DCCCは糖
残基上のアセテート基の置換位置が違っているだけのアイソマー性サポニン類を
分離することができた(Ishiiら、1984)。
ば、Hostettmannら、1986参照)、そして、これらのうち、クロ
ロホルム−メタノール−水(7:13:8)系は最も多くの応用例を有している
。クロロホルム−メタノール−水系は非常に極性の高いサポニン類の昇流モード
あるいは1つか2つの糖を有しているが遊離ヒドロキシル基はあまり含んでいな
いサポニン類の降流モードのいずれでも用いることができる。
ノールを用いる18のカラム(30cm x 10mm内径)を用いて、予備的
な精製のための大規模DCCC手順も開示されている(Komoriら、198
3)。いくつかの事例で、純粋なサポニンを得るために2回(あるいはそれ以上
)の分離が行われている。
る(Marstonら、1990)。CPCは静止相を保持するための重力場で
はなく、800−2000r.p.m、あるいはそれ以上の回転でつくりだされ
る遠心場に依存する。この方法の原理は溶質の回転コイルあるいはカートリッジ
に含まれる2つの混じり合わない相への非均衡分離の継続プロセスを伴う。
むことができる。これらのうちの1つである拘束向流クロマトグラフ(HSCC
C)はスプールの周りに巻き付けられた内径1.6又は2.6mmのテフロン・
チューブで構成されている。カートリッジ装置の場合は、それらのカートリッジ
は遠心ローターの円周上に配置され、その長軸は遠心力の方向と平行である。カ
ートリッジの数と体積はその装置の応用目的に応じて変更することができる。分
離が2日あるいはそれ以上かけて行われるDCCCあるいはRLCCの場合と比
較して、CPCは実質数時間で同じ結果をもたらすことができる。回転コイル又
はカートリッジに基づく装置はグラム単位までの容量を有している。多層コイル
周回装置は、例えばAbus fruticulous(マメ科)からのシクロアルタン・グリコ
シド類の予備的な精製のために用いられている(Fullasら、1990)。
Hedera helix(Araliaceae)から採取される殺軟体動物性トリテルペン・グリコシ
ドが異なった装置、Sanki LLNクロマトグラフ(6カートリッジ、総体
積125ml)で分離されている。その果実のメタノール抽出物はn−ブタノー
ルと水に分離された。ブタノール画分は溶媒系クロロホルム−メタノール−水(
7:13:8)の低層を可動相として用いて100mg量で装置に直接導入され
た。
チコシド及びマデカソシドは800r.p.mで回転する内径66m x 2.
6mmカラム(350ml容量)を備えたIto多層コイル・セパレータ−エク
ストラクタ(P.C社)の助けを借りて分離された。400mgのサンプルを溶
媒系クロロホルム−メタノール−2−ブタノール−水(7:6:3:4;可動相
は低相であった)で分解することができた。検出はオンラインTLCを用いて行
われた(Dialloら、1991)。同じ装置がSesamum alatum (Pedaliacea
e)からのトリテルペン・ジサッカライドの単離でも用いられた。可動相として溶
媒クロロホルム−メタノール−i−プロパノール−水(5:6:1:4)が選ば
れ、1回に1.25グラムが投入された(Potteratら、1992)。
ップだけで十分に満足できることはめったにない。一般的なルールとして、必要
な生成物を得るためにはいくつかの予備的な技術を連続して用いることが必要に
なる。(オープン・カラム・クロマトグラフィーなどの)古典的な技術と(HP
LC)などの最新の高解像度法との組み合わせは多くのサポニン類の分析に対し
て適していることが実証されている。
の分離のための遠心分離TLCの組み合わせ(Hamburger及びHost
ettmann,1986)。同様に、Swartzia madagascariensis(マメ科)
からの5つのトリテルペン・グリコシドの単離のためにはオープン・カラム・ク
ロマトグラフィー、LPLC、及びMPLCが必要であった(Borel及びH
ostettmann、1987)。
離のためにフラッシュ・クロマトグラフィー及びOPLCとの組み合わせで用い
られている。多層コイル装置(溶媒:クロロホルム−メタノール−水7:13:
8、低層が可動相)が最初の精製を行い、フラッシュ・クロマトグラフィートO
PLCが純粋な物質を得る上で有効であった(Fullasら、1990)。
フラッシュ・クロマトグラフィーかオープン・カラム・クロマトグラフィーのい
ずれかとの組み合わせはサポニン類の生成に十分である(Schopkeら、1
991)。
させて、このステップの後にさらに粗サポニン混合物を分画するステップを含ん
でいる。この方式はNothopanax delavayi(Araliaceae)から3β−ヒドロキシオ
レイン−12−en−28,29−ジオイ酸グリコシドの単離に用いられてた。
その葉及び幹のメタノール抽出物はヘキサンと水に分離された。その水層はDi
aion HP−20カラム上でクロマトグラフィーにかけられ、水、10%メ
タノール、50%メタノール、80%メタノール、メタノール及びクロロホルム
で溶離された。グリコシド類はシリカ・ゲル上で酢酸エチル−エタノール−水(
7:2:1)を用いてカラム・クロマトグラフィーを行うことによって得られた
(Kasaiら、1987a)。Acanthopanax senicosus(Araliaceae)からトリ
テルペン及び非トリテルペン成分を単離するためには、この手順はDiaion
HP−20ポリマー上での葉のメタノール抽出物の分画から開始された。メタ
ノールで溶離され画分はシリカ・ゲル(クロロホルム−メタノール−水30:1
0:1)のクロマトグラフィーにかけられ、その結果えられたすべての画分をL
iChroprep RP−8のクロマトグラフィーにかけた。最終的な精製は
TSK−GEL ODS−120TのHPLC(300 x 21分;メタノー
ル−水70:30;メタノールー水70:30;6ml/分;RI検出)又はヒ
ドロキシアパタイトカラムでのクロマトグラフィー(アセトニトリル−水85:
15)(Shaoら、1988)によって行われた。
(メタノール)、DCCC(クロロホルム−メタノールー水7:13:8)、及
びHPLC(C−18、メタノール−水65:35)を用いて行われる(De
Tommasiら、1991)を組み合わせたものを採用した。
は定性的判定を行うために色のついた化合物をつくりだすために用いることがで
きる。例えば、硫酸、リン酸、および過塩素酸などの強鉱酸中にアイスアルデヒ
ドやバニリンなどの芳香性アルデヒドを溶解するとアグリコンを有し、最大吸収
が510−620nmの範囲で示される発色生成物が得られる。これらの反応で
、脱水が行われ、アルデヒドとともに発色濃縮生成物をもたらす非飽和メチレン
基を形成すると考えられる。バニリン−硫酸を用いた場合、C−23ヒドロキシ
基を有するトリテルペン・サポニン類は460及び485nmの間にピークを有
している(Hiaiら、1976)。
の反応で赤、青、又は緑色の発色が得られる(Abisch及びReichst
ein、1960)。トリテルペン・サポニン類は紅色又は紫色の色を発生し、
ステロイド・サポニン類は青緑の色を発生するので、サポニン類の2つの区別が
この技術を用いて識別できる。
どの無機酸;ヒドロキシトリテルペン及びヒドロキシステロイドとの発色反応を
行う無水酢酸−酢酸試薬内に塩化アンチモニー(III)に溶かした30%溶液
;ステロイド・グリコシドの5,6−デヒドロ−誘導体(ジオスジェニン及びソ
ラソジン・グリコシド)及び5−α又は5β−H−誘導体(例えば、トマチン)
を識別するために用いることができる塩化アンチモニー(III)をニトロベン
ゼン−メタノールに溶かしたもの;及び硼酸及び濃縮硫酸の存在下でウロン酸の
存在を示すことができるカルバゾールなど他の多数の試薬をトリテルペン類の検
出に用いることができる(Bitter及びMuir、1962)。
表2に示す。
ロメタン:クロロホルム抽出によってマメ抽出物がつくられた。発明者らはアカ
シア・ビクトリアエ(マメ科)からトリテルペン・グリコシドの混合物を単離し
た。UA−BRF−004−DELEP−F001の最初の回収物を以下の手順
で処理した。(1)Wileyミルで3mmサイズの粒子にするつぶす、(2)
2リットルろ過装置につめる、(3)ジクロロメタン:メタノール(1:1)で
4時間処理してすりつぶされたバイオマスを抽出し、次に一昼夜放置してから、
結合した画分」を真空中で乾燥してUA−BRF−004−DELEP−F00
1(52g)を発生させる。F001(51.5g)を酢酸エチルで抽出したと
ころ、活性のある不溶性の物質(34.7g)が得られ、これをF004と命名
した。1.7kgのシリカ・ゲル(Merck、23−220ミクロン粒子サイ
ズ)を用いたフラッシュ・クロマトグラフィーを用いてF004(34.2)を
分画したところ、51 670mlフラクションがジクロロメタン:メタノール
(ステップ勾配:95−0%:メタノール5−100%)で溶離された。カラム
を9リットルのメタノールで洗浄して、その後メタノール:水(80:20)6
リットル、さらに同じ溶離液に1%ギ酸を加えたもの6リットルで洗浄した。T
LCに基づき、フラクション23−34及び39−40が17.2gのF023
に混合にされた。中間圧力液体クロマトグラフィー(MPLC,Buchi63
2システム)が8gのF023と共に2度、Lichproprep C−18
、15−25ミクロン・サイズ粒子をパックした4.9x4.6カラムでアセト
ニトリル:水(水にアセトニトリルを0、10、20、30、50%の割合で溶
かしたもの)のステップ勾配を用いて行い、その後、100%メタノールで洗浄
した。16gの0−20%アセトニトリルで7グラムのF027が得られたが、
これは不活性であった。残りの物質を組み合わし、重複をさけるために30−4
0%アセトニトリルを用いて反復的MPLCにかけたところ、F028−F03
6フラクションが発生した。これらの画分のほとんどは抗腫瘍活性を示したが、
F035(2.19gと最も高い収量)を選んでさらにテスト及び評価を行った
。
を用いることができ、そうした方法としては殺魚類活性テスト、重量測定、分光
光度測定、TLC、GC、HPLC、HMQC、HMBC、NOESY、COS
Y、NMR、X線結晶学的測定などがある。トリテルペン・サポニン類の古典的
な特性(表面活性、魚類毒性)に基づく判定は密度測定、誘導体の比色判定など
にとって代わられており、より最近にはGC、HPLCそして特にNMRによっ
て取り代わられている。分光光度測定法は非常に感度が高いが、その反応が限定
的ではなく、フィトステロールやフラボノイドなどトリテルペンに付随している
化合物と反応して発色生成物を形成するので粗植物抽出物内のトリテルペンの評
価に常に適している訳ではない。サポニン類に関する分析作業の大部分に共通す
る別の問題はそれらが植物素材から不完全にしか抽出されないことである。しか
しながら、トリテルペンの定量に適した多数の方法を利用することができる。
分であるモノサッカライドの組成と配列、モンサッカライド単位が相互にどのよ
うに結合しているか、グリコシド結合したモノサカッカライド単位のアノマー構
成、そしてアグリコンの炭水化物部分の位置など、解明しなければならないいく
つかの基本的な問題がある。
に解明するためにいくつかの方法を組み合わせることである。構造調査は通常は
段階的に行われるプロセスで、サポニン類を徐々に小さな画分に分割して、個々
の画分を分光光学的に分析することによって行われる。それらの画分からのデー
タを慎重に取り扱うことで、そのサポニンの組成物についてのアイデアが導かれ
る。
構造判定を支援するためには、非常に感度が高く、高解像度で、そして可能であ
れば非劣化性の方法の使用が好ましい。NMR分光学及び質量分光分析(MS)
における技術革新は複雑なサポニン類の調査のために必要な能力を提供してくれ
ている。これら、及び他の技術を通じて、構造的な判定を行うことができる。例
えば、FAB−MSは分子量と、多くの場合糖配列を明らかにしてくれ、一方、
1−D及び2−D NMR技術は糖結合の位置決定を可能にし、アグリコンの構
造的解明に寄与してくれる。そうした構造的判定及び化学的研究についてはTa
naka及びKasai(1984)によって詳細に論じられている。
で、NMR分光学はそれ以前構造的知識が得られているかどうかには関係なく、
最も完全な情報を提供してくれる(Agrawal、1992)。原則として、
他のいずれかの方法に依存しないで完全な構造を明らかにすることができる唯一
の方法である。
は迅速に行える非破壊的方法であるが、非常に大量のサンプル(mg量)を必要
とする。スペクトルの分析はグリコシド鎖のアグリコンへの取り付け位置、モノ
サッカロイドの配列、性質及び数、グリコシド間の結合の構成と形状、それらの
鎖におけるアシルグリコシド類の配列、アグリコンの性質、及び取り付けられた
エステル酸の構造についての結論を引き出すことを可能にしてくれる。
いるデータと観察データとを比較することが必要である。トリテルペン・サポニ
ンの13C−NMRスペクトルにおける典型的な化学的偏差の一部に対するガイド
としては、バヨジェニン・グリコシドについて知られている偏差を用いることが
できる(Domon及びHostettmann、1984)。さらに、オレア
ネイン(Patraら、1981;Agrawal及びJain、1992)、
ウルセイン、ルペイン(Wenkerら、1978;Sholichinnら、
1980)、ホペイン(Wenkertら、1979;Wilkinsら、19
87)及びラトステイン(Parrilliら、1979)に対する13C−NM
R信号の割り付け(対応性の解明)が行われている(Nakanishiら、19
83)。ダンマレイン・グリコシドに対する関連データも論文で要約されており
(Tanaka及びKasai,1984)、一方、サイコジェニン(Tori
ら、1976a)及びサイコサポニン(Toriら、1976b)の13C−NM
R分光学的研究も開示されている。ジンセン・サポジェニン及び関連するダンマ
レイン・トリテルペン類についても研究が行われている(Asakawaら、1
977)。アカシ酸の13C−NMR分光学的研究も開示されている(Kinji
ら、1992)。
はメチル化(又はアセチル化)された場合、糖及びアグリコン両方のα−及びβ
−炭素が特性変化を受ける。例えば、α−CH信号が下方に移行し、他方β−C
H信号は情報に移行し、一般的なγ−上方移行からのずれが生じてしまう。従っ
て、アグリコンのグリコシル化はα−炭素の下方への移行と隣接炭素原子の上方
移行(グリコシル化移行)を起こさせる(Toriら、1976b;Kasai
ら、1977)。オレアネインの場合、3β−OH基のグリコシド化はC−3を
c.8.0−11.5p.p.m.、C−2及びC−4を+0.9又は−9.0
から−1.9p.p.m下方修正させ、さらに、C−23を0.5−5.1p.
p.m.、そしてC−24を1.6p.p.m.上方移行させる。28−COO
H基のグリコシド化はカルボキシル炭素を(2.5−5.0p.p.m.)上方
に移動させ、C−17信号を(1.0−2.5p.p.m.)下方に移動させる
(Agawal及びJain、1992)。従って、13C−NMRデータをアグ
リコン及びサポニンと比較すると、糖結合の位置が明らかになる(Seoら、1
978;Tanaka、1985)。
を考慮に入れることによってグリコシド間結合の(比較的単純な構造のサポニン
での)位置が示される(Kohishiら、1978)。メチルβ−D−フコピ
ラノシドの炭素13NMRデータがSeoら(1978)によって示されており
、一方、より複雑な糖類に対する13C−NMR信号についてはGorin及びM
azurek(1975)及びDorman及びRoberts(1970)に
よって示されている。アピオースは特徴的な13C−NMR信号を示しており、こ
れらは文書化されている(Sakuma及びShoji、1982;Adino
lfiら、1987;Peznicekら、1990)。
に有益な手順となっているが、それらの13C−NMRスペクトルの完全な割付ス
ペクトルの完全な割合は稀にしか報告されていない。1H−NMRスペクトルの
分析は複雑で、時間のかかる作業である。炭水化物部分の大きな部分の陽子共鳴
は3.0−4.2p.p.m.という非常に小さなスペクトル幅でだけ出現し、
重複という問題が伴う。これらはモノサッカロイド残基における同様の化学的移
行を示す非アノマー性糖メチン及びメチレン陽子が関係している。
年代以後(Kojima及びOgura、1989)種々の方法によりオレアネ
イン、ウルセン及び骨格糖類における陽子共振について位置決定が行われている
。例えば、ソヤサポジェノールBの完全は1H及び13C−NMRスペクトル位置
決定及びC−4ヘドロキシメチル置換基の構造の解明が、13C−DEPT、13C
−APT、2−D相関分光学(COSY)(1H−13C−COSY、1H−1H
COSY)及び1H−1H ROESY(回転フレームでの2−D核オーバーハウ
ザー増強(NOE))技術との組み合わせによって行われている(Baxter
ら、1990)。このサポジェニンにおける四価炭素共振の位置決定は1H検出
異種核多重結合(HMBC)及び単結合(HMQC)分光学(Massioら、
1991b)によって行われている。ジオスゲニン及びソラソジンの1H−NM
Rスペクトルの完全な解明も行われている(Puriら、1993)。
から得られている。例えば、α−結合グルコース単位のC−1陽子の結合係数は
ほぼ3Hzで、β−結合単位は6−7Hzの結合係数を有している。アノマー性
糖陽子の結合係数のより一層の詳細は別の資料で見ることができる(Lemie
uxら、1958;Capon及びThacker、1964;Kizu及びt
omimori、1982)。
シル基の構造の判定において困難が発生した場合、酸素と結合した炭素原子の陽
子の1H−NMR信号ピークの分析は種々の貴重な情報を提供してくれる(Ko
jima及びOguma、1989)。
認、位置決定が行われているが、厳密な方法でのNMR調査の結果について解釈
するためには、NMRスペクトルを明確に対応決定する必要があり、このことは
どのピークがその構造のどの炭素及び/又は水素と関係しているのかを確定しな
めければならないことを意味している。この情報は、ほとんどの場合、一次元的
な1H及び13C NMRスペクトル・データからは得ることができないが、二次
元的な調査の助けを借りてよりうまく判定することができる。これらの研究は情
報を2つの周波数領域に適用し、そして核相互の相互作用を明らかにすることに
よってスペクトル分析を単純にしてくれる。種々のパルス・シーケンスが確定さ
れれるメカニズムが非常に複雑であるという事実にも拘わらず、二次元的なNM
Rスペクトルの解釈は通常は非常に単純なものである。化学的構造を解明するた
めに多数の異なった二次元的NMR研究が考えられている。そうした技術の事例
と本発明によるトリテルペン・サポニン類の化学的解明で使用するために本発明
者によって具体的に想定された他のNMR技術を以下、及び表3に示す。
リコン対応決定ばかりでなく、糖シーケンス詳細の解明にとっても貴重である。
HMQC及びHMQCの使用は13C−1H異種核相関分光学(HETCOR)と
類似しているが、13Cを観測する代わりに、より豊富は1Hの検出が行われてい
る。例えば、Bellis perennis(シオン科)からのベリスサポニン類の場合も、
2−D 1H検出HMQC及びHMBCスペクトラを結びつけて13C−NMRデ
ータを考慮することによって、すべての化学的移行の対応付けを行うことが可能
であった。二重及び三重結合に対応したクロス・ピークがその分子におけるほと
んどすべての可能な相関関係に対して観察されている。同様に、HMQC及びH
MBCにおけるロングレンジの1H−13C相関関係を糖部分の取り付けの配列と
位置の判定のために用いることができる(Schopkeら、1991)。
及びB)の糖配列の判定(Jansakulら、1987)及びAndrosace saxi
fragifolia(サクラソウ科)から採取されるサキシフラギフォリンAのモノサッ
カロイド配列(Walthoら、1986)の判定に用いられている。カロパナ
ックス・サポニンCのアラビノース部分のラムノシル及びグルコシル結合の位置
がペルメチル化されたサポニンの糖配列決定後にNOESYによって確認された
。ラムノシル部分のH−1とラビノシル部分のH−2との間、及びグルコシル部
分のH−1とアラビノシル部分のH−3との間にクロス・ピークが観察された(
Shaoら、1989b)。Balanites aegyptiaca(バラタ科)からのフラスタ
ノール・サポニン類の糖部分の構造が400MHz NMR装置で2−D NO
ESYによって解明されている(Kamelら、1991)。
−[{α−L−ラムノピラノシル(1→4)}{β−D−グルコピラノシド(1
→2)}−β−D−グルコプブラノスyl]−(25S)−5β−スピロスタン
−3β−olのオリゴサッカロイド部分の完全な13C及び1H対応決定をもたら
した。DEPT、HETCOR、ロングレンジHETCOR、種々の同一核技術
、NOESY及びINEPTの組み合わせが陽子スペクトルの混雑によって引き
起こされる問題を解決するために構造解明に適用されている(Pantら、19
88d)。
ポニン3−O−[β−D−キシロピラノシル(1→3)−α−L−アラビノピラ
ノシル(1→3)−α−L−アラビノピラノシル](1→4)−β−D−グルコ
ピラノシル(1→3)−α−L−ラムノピラノシル(1→2)−α−L−アラビ
ノピラノシル}−ヘタラジェニンにおける糖類の識別と配列決定は500MHz
装置を用いてNMR技術を用いるだけで可能であった。このサポニンは最初にア
セチル化され、次にDQF−COSY、NOESY及びROESYスペクトルを
分析することで、構造の対応決定が可能となった。NOEデータから得られた情
報は糖の配列を確定する上で最も有益であった(Pendersら、1989)
。
ニンが多段RCT研究に基づいてNMRで確認されている。これにはCOSY、
異種核COPY、COSYタイプH−H−Cコヒーレンス伝達及び2−D−NO
ESY研究も合わせて行われた。従って広範な劣化調査を行う必要性は回避され
、30mgの生成物を使うだけで構造判定が可能であった(Zeznicekら
、1989a;1989b)。同様の技術は別の同様な植物からの4つのグリコ
シド:ギガンテアサポニン類1−4(9又は10個の糖単位を含むバヨジニンの
バイデモシド類)の構造判定のために用いられた(Reznicekら、199
0a)。
mosa tenuiflora(マメ科)から採取されたオレアニン酸サポニンであるミモノ
シドA内のヘキササッカライドの配列と結合位置を解明する上で十分であった(
jiangら、1991)。
と糖類の配列決定を可能にした。エステル化キシローズ部分がβ形態で存在して
いること、及び1C4構成を有していることが明らかになった。用いられた技術に
はHMQC、HMBC、及びROESY(より正確には、CAMELSPIN(
固定スピンによってエミュレートされた微小分子に適した交差リラクゼーション
)などが含まれていた。ROESY研究は糖配列の判定で特に有益であった(M
assioら、1991a)。
がNT1データ及びNOESY調査から明らかにされているが(Miyamot
oら、1990)、しかしこの技術は3−5p.p.m.領域の1H−NMRス
ペクトルの複雑さによってその実用性に限界があり、多数の陽子に対するNOE
の測定を不可能にしている。しかしながら、COSY、NOESY、そして直接
及びXHCORR NMR分光学の組み合わせによって、ウミウリHolothuria f
orskaliiの完全な信号対応及び構造分析が明らかにされている(Rodrigu
esら、1991)。
るサンチャゴシドの構造判定において、COSY、TOCSY、HMQC及びR
OESY NMR分光学の技術が広範に適用され、ROESYによる調査が糖類
の正確な配列、それらの取り付け箇所及び立体化学特性を解明するために用いら
れた(Vazquezら、1992)。
溶解分光学と、両方の周波数軸が化学的移行(δ)情報を含んでいる2つの基本
的なタイプの2−D NMR分光学が存在する(Agrawal、1992)。
2−D分析の大きな利点の1つは、それがスペクトル混雑の問題を解消してくれ
ることである。高分野1H−COSYにおいては、これは2.5−4.0p.p
.m.領域で言えることであり、サッカライド陽子の対応性決定を簡単にしてく
れる。好ましい環境では、与えられた糖残基に存在するすべての陽子を識別する
ことができる。
えば、モノサッカライド単位の置換基部分を対応するヒドロキシ陽子の存在ある
いは不在によって判定することができ、クロス・ピークの数は重複ピークの数を
明らかにしてくれるので、結合定数の推定が可能になる。
NMR 1−D及び2−D分光学だけで達成されている(Massiotら、1
986;1986b)。サポニンは先ずペラセチル化され、そして場の強度が十
分であれば(>300MHz)、糖陽子共振が2つのゾーンに分割され、1つは
4.75と5.40p.p.mの間にあってCHOAcに対応付けられ、他方は
3.0と4.3p.p.mの間にあってCH2OAc、CHOR、そしてCH2O
Rに対応付けられる。アノマー性陽子はいずれの結合の場合でもこれら2つのゾ
ーンの間にあり、そしてエステル結合の場合には5.5p.p.m.より高い周
波数領域に存在している。
提供する。相当する潜在それらの分子の可動性は信号がはっきり観察される程度
であり、結合定数を正確に特定することができる。アセチル化されたアルファル
ファの根のサポニンの場合、COSY及び長距離COSY調査によってその構造
をAra−2Clg−2Ara−3ヘドラジェニン28−Glcを明らかにすること
ができた(Massioら、1986)。
(アカテツ科)の葉からのさらにアセチル化されたサポニン類の構造は上に述べ
たのと同様の技術で解明されている。対応及び糖の配列はHMQC(1J結合に
関して)及びHMBC(2J及び3J結合に関して)、そして同一核Hartma
nn−Hahn(HOHAHA)トリプル・リレーCOSY及びROESY調査
から得られた(Massioら、1990;1991b)。T. claessemssiから
のサポニンのエステル糖鎖は異常な1C4構成(すべての置換基は軸方向)でβ−
D−キシロース部分を含んでいる。600MHzで、1H−NMRスペクトルは
ペラセチル化を行わなくても、すべての1H化学移行の対応付けを行うのに十分
な程度の分解度を有していた(Schopkeら、1991)。
の対応付けのために用いられている(Chen及びSnyder、1987;1
989)。ロングレンジ1H−13C COSYもシクロアスロラゲン・サポニン
のアグリコン構造判定に用いられており(Wangら、1989b)、さらに内
部グルコースのアノマー性要素と上に述べたMedicago sativaサポニンの内部ア
ラビノースのH−2との間の4J内部糖結合の位置決定のために用いられている
(Massioら、1986)。
SPY) この技術はAlliumステロイド・サポニン類の糖陽子の対応決定(Chen及び
Snyder、1987;1989)と、Crossopteryx febrifruga(Ribiaceae)
の根からの16α−ヒドロキシプロト−バシック酸グルコシド内の化学的移行の
対応決定に適用された(Gariboldiら、1990)。同じ技術がSapind
us rarak(ムクロジ科)の実からのアセチル化ヘデラジェニン誘導体内のサッカ
ライド陽子の完全な対応決定のために用いられた(Hamburgerら、19
92)。NOE差分分光学によってグリコシド間結合が確定された(Hambu
rgerら、1992)。
はHOHAHAによる研究で完全に解明されている。これらは観察されるクロス
・ピークがフェーズ中にあり、それによって重複ピークの偶然的なゼロ化が防が
れる点を除けばCOSYによる研究と類似している(そして総相関性分光学−T
OCSYとも関係している)。炭水化物鎖を解明するために、HOHAHA研究
から抽出された隣位結合定数によって各非シンメトリー中心の相対的立体化学特
性の判定を可能にしてくれ、それによってモノサッカライドの識別を可能にして
くれる。異種核H−Cリレー法もHMBCスペクトルから判定されたサッカライ
ド部分及び糖結合における13C共振の対応決定のために用いることができる(F
rechetら、1991)。
学がSesamum alatum (Pedaliaceae)における1H−13C広範囲結合の観察のため
に用いられている。従って、C−18の位置の陽子と炭素原子C−13、C−1
7及びC−28の間の相互作用が観察された。長距離異種核13C−1H相関性と
組み合わせることで、新しいセコ−ウルセン・アグリコンの構造に関して多量の
情報が集められた(Potteraら、1992)。
2−D相関性分光学(COLOC)の1つの事例はCrossopteryx febrifuga (Ru
biaceae)の構造解明において見出されるはずである(Gariboldiら、1
990)。
びII(Nishinoら、1986)のサッカロイド陽子の対応決定と糖配列
決定のためのサポニン類の構造判定にもっぱら用いられている。アラビノースの
H−2とラムノースのアノマー性陽子との間のNOEはジジフィンにおけるRh
a2−Ara−ジサッカロイド結合を確認するのに役に立った(Yoshika
waら、1991b)。この方法は結合位置でアノマー性陽子とアグリコン陽子
との間での接続活性が観察されることが多いので広い応用性を有している。ネガ
ティブNOEはシクロアストrジェノール及びその他のサポニン類内のC−3陽
子と3−O−グリコシド残基のアノマー性陽子との間で観察されている(Wan
gら、1989b)。
、分光学的、及びIR、UV、NMR、MS、光学回転分散(ORD)、円偏光
二色法(CD)、及びX線分析などそれに関連した技術にも依存して行われる。
これらの技術のいくつか、特にNMR分光学及びMSにおけるほとんどの進歩は
サポニン類及び切断反応からのそれらの対応フラグメントの分析作業を容易にし
てくれており、従って、情報を整理して、関連する構造を判定することができる
。さらに、NMR分光学は非破壊的方法であり、NMRとMSの両方とも無傷の
サポニンについての調査を可能にしてくれる。
収集に寄与してくれる種々の分光学的な技術を組み合わせた統合的なアプローチ
が必要である。
して分子量に依存する。それは天然のグリコシド類の分子量及び糖配列情報を入
手するために用いられるFAB及び吸着/化学イオン化(D/CI)などのいわ
ゆる『ソフト』イオン化技術である(Wlofenderら、1992)。これ
らの技術は誘導化を行わずにグリコシドの分析を可能にしてくれる。いくつかの
場合、アグリコンのフラグメント化が観察されるが、この目的のためには電子イ
ンパクト質量スペクトル(EI−MS)が最も有効である。
のサンプルを含んだ粘液(基質−通常はグリセロル又は1−チオグリセロル)と
共に事前に装填された標的に照射される(Barberら、1981;1982
)。この原子ビームが基質と衝突すると、運動エネルギーが表面の分子に伝達さ
れ、その多数が液体からそのイオン源の高い真空内に飛散される。これらの分子
の多くのイオン化はこの飛散中に起こり、陽性及び陰性イオンの両方が発生され
る。いずれも装置パラメータを適切に選択することによって記録されるが、サポ
ニンに関する作業では全体として陰イオンの法が有益であることが分かっている
。
ルのイオンを照射することで、PD−MSの場合と同様の吸着イオン化が発生さ
れる(Benninghoven及びSichermann、1978)。アメ
リカ大豆の種子から得られる3つの新しいバイデスモシド、アセチル−ソヤサポ
ニンA1、A2、及び、A3の構造研究においてこの方法の有用性が実証されてい
る(Glycine max、マメ科)。かなりのフラグメント・イオン・ピークがモノサ
ッカライド単位におけるアセチル化のモード、およびこれらの単位の配列につい
ての情報を提供してくれている(Kitagawaら、1988)。
起がPD及びSIMSと類似した吸着分子イオンのパターンをつくりだすことが
分かっている。複雑なグリコシドの分析に適した技術であるレーザー脱着/フー
リエ変換質量分析法(LD/FTMS)は、FAB−MSと異なった、そして相
補的なスペクトルをつくりだす。
る上で役に立つ(Komoriら、1985)。しかしながら、FD−MSの実
験手順の複雑さと、FAB−MSがより長く継続するスペクトルをつくりだすと
いう事実とから、最近ではこのFD−MSはそれ程用いられなくなっている。F
D質量スペクトルはそれらが陽イオン化されたフラグメントの存在によって一層
複雑となり、解釈を複雑にしているという欠陥も有している。それにもかかわら
ず、FD−MSはサポニン類の構造解明に非常に大きな成功を収めている(Ho
stettmann、1980)。
導入するための効率的なインタフェースが開発されている。例えば、粗サポニン
類の定性分析がセミミクロHPLCとフリット・高速原子ボンバードメント(F
RIT−FAB)インタフェースを組み合わせることによって行われている(H
attoriら、1988)。この応用例においては、流出液が1:20の割合
で分割される(100μ/分→5μl/分)オクタデシル・シリカ・カラムでは
なく、NH2カラム(例えば、μS−Finepeak SIL NH2、Ja
sco;25cm x 1.5mm内径(I.D.))が用いられる。アセトニ
トリルとグリセロールを1%含んだ線形勾配を用いての溶離によって、通常、均
等溶離で得られるものより鮮明なピークが得られる。ネガティブFAB質量スペ
クトルが最大分子量1235までのサポニン類に関して記録されている。この手
法で、糖分子の切断に関与しているとされている偽分子[M−1]及びフラグメ
ントが観察されている(Hattoriら、1988)。
アルジェニチン(共に分子量650)に関して、FRIT−FAB LC−MS
システムも述べられている。ロサムルチン(ウルセイン・グリコシド)及びアル
ジェニチン(オレアネイン・グリコシド)は共にC−28に単一のグルコース残
基を有しており、中性ガスとしてのキセノンを用いて両方ともネガティブ及びポ
ジティブFABモードで分析された。HPLCはアセトニトリル−水(7:3、
0.5%グリセロルを含有)を溶媒として1ml/分の流量で用いることによっ
てオクタデシルシリカ・カラム上で行われた。偽分子[M+1]及び[M+1]
+イオンが観察され、いずれもネガティブFAB質量スペクトルで親アグリコン
によって発生された強いピークを伴っていた(Youngら、1988)。
た技術である動的二次イオン質量分光学(SIMS)によって、サポニン類を検
出することが可能である。従って、UV(206nm)及びSIMS検出と組み
合わせたHPLCを用いて、1つのモノ−、及び2つのバイデモシド性トリテル
ペン・グリコシドの分析が行われている(Marstonら、1991)。
は低流量(1−5μl/分)が必要とされる点である。HPLC分離の後、流出
液の分割が必要である。しかしながら、サーモスプレイ(TSP)インタフェー
ズ(Blackley及びVestal、1983)は簡単であり、1−2ml
/分の流速に対処できるという能力を有している点に特徴がある。このことは植
物成分の分析に関連する問題を解決する上で、この技術をより魅力的なものとし
ている。TSP技術の中心は分子のソフトなイオン化であり、これは化学的イオ
ン化MSと同様である。これによって非揮発性で、熱的に不安定なモノ−、ジ−
、そしてトリグリコシドの分析を可能にしてくれる。サポニンの分子量と糖鎖の
性質及び配列についての情報が提供される。TSP LC−MSがTetraleura t
etraptera(マメ科)の実のメタノール抽出における殺軟体動物性サポニン類の
分析に用いられている(Maillard及びhostettmann、199
3)。蒸発イオン化を行うための揮発性緩衝液を提供するために0.5M酢酸ア
ンモニウム(0.2ml/分)をカラム処理後に加えることで、TSP LC−
MS総イオン流(質量範囲450−1000a.m.u.)は206nmでのH
PLC−UV分析の結果と優れた対応性を示した。m/z660、676、88
0、及び822でのイオン・トレースは大型サポニンの偽分子[M+H]+イオ
ンを示す信号を発生させる。この抽出物の各サポニンに関して得られたTSP質
量スペクトルは偽分子[M+H]+イオンに対する大きなピークを示した。重要
な殺軟体動物性サポニン:アリダニンに関して糖部分のフラグメント化が確認さ
れ、そこでN−アセチルグリコシル部分のロスがアグリコンに対する[A+H]
+ピークを発生させる(Maillard及びHostettmann、199
3)。
HPLCだけではその持続時間によってピークの識別が確認できただけだったの
で、LC−MSは大きな実用性の可能性を秘めている。LC−MSは植物抽出物
内のトリテルペン・グリコシドの分析に適用できるばかりでなく、それらの抽出
物の個々のサポニン類の構造判定に対しても、MS−MSを介して、一定の有用
性をもっている。
の特徴がある。IRは1350及び875cm-1の間のいくつかの強いバンドが
スピロケタル側鎖を示すので、ステロイド・サポジェニンの特徴づけのために有
益である(Jonesら、1953)。4つのバンド、980(Aバンド)、9
20(Bバンド)、900(Cバンド)、及び860cm-1(Dバンド)はE及
びFリングの特徴として対応付けられている。25R−サポジェニンの場合、B
バンドはCバンドより強い吸収を示し、25R−シリーズで、こうした関係が逆
になっている。E及びFリング内、または位置27に酸素置換基を有しているサ
ポジェニンにおいては、これら4つのバンドがかなり変化している(Taked
a、1972)。
1610及び1390cm-1の位置で確認することができる(Numaraら、
1987)。この情報は単離手順中に、その分子中のカルボキシル基がイオン化
されているかどうかを知ることが重要な場合に有用である。
アジアチコシドの分子形状を解明するためにX線結晶学が用いられている。結晶
化はジオクサンから行われた(Mahatoら、1987)。X線回折分析もモ
リック酸3−β−D−グリコシドの構造の確認で成功を収めている(Pegel
及びRoger、1985)。
alatum (Pedaliaceae)からのアラトシドのアグリコンの構造の判定に対する有効
な情報が酸加水分解後につくられたアーチファクトの結晶性トリアセテートのX
線回折分析によって得られた(Potteratら、1992)。Dolichos kir
imandscharicus(マメ科)の塊茎から採取されるメジカジェン酸の親アグリコン
であるメジカジェン酸のX線研究でその分子がcis溶融D及びEリングを有し
ていることが明らかになった。リングCはかるく歪んだソファ上立体構造を有し
ており、リングA、B、D及びEは椅子上の立体構造を有していた(Stoec
ki−Evans、1989)。
ッカライドヘミアセチル・ヒドロキシル基がトリテルペン又はステロイド残基と
共にアセチル類を構成しているグリコシド類である。そのヘミアセチル・ヒドロ
キシルとトリテルペン又はステロイドとの間のエーテル結合はグリコシド結合と
して知られている。オリゴサッカライドのモノサッカライド成分もエーテル結合
(グリコシド間結合)で結合されている。
カライド及び非炭水化物部分(アグリコン又はジェニン)が開放される。サポニ
ンの加水分解で生じる非炭水化物はサポジェノール又はサポジェニンと呼ばれて
いる。知られているすべてのサポニンはO−グリコシド類であり、エーテル又は
エステル結合を有している。
の化学反応や方法が用いられている(例えば、Kitagawa、1981参照
)。そうした方法はトリテルペン・サポニン類の構造判定において特に有用であ
る。
置くことによって実行することができる。加水分解後に残っている水溶液をジエ
チル・エーテル、クロロホルム、又は酢酸エチルで抽出して、アグリコンを得る
。水層からの糖類の抽出はその溶液を(アルカリ又は塩基性イオン交換樹脂を用
いて)中性化し(Tschesche及びForstmann、1957;Sa
ndberg及びMichel、1962)、蒸発、乾燥状態にしてから行われ
る。これらのサポニン類はこの方法でそれらの構成物質に完全に切断されるので
、存在しているアグリコン及びモノサッカライドの数と性質を識別するための情
報が得られる。(塩基加水分解によってエステル結合を切断した後に得られる)
プロサポジェニンを酸加水分解すると、そのアグリコンにエーテル結合している
糖鎖の性質を確定することができる。水性反応媒体の代わりにアルコールやジオ
キサンを用いることもできる。
酸を用いた場合、分子の劣化や再構成の可能性は低いが、エーテル結合の切断は
それほど効率的には行われない。Dianthusサポニンからジプソゲン酸を得るため
の簡便な方法としては、例えば、ジオキサン内で1M硫酸で加水分解する方法が
用いられた(Oshimaら、1984)。水及び水−エタノール内での塩酸と
硫酸を用いた加水分解条件の比較研究は、密封した真空アンプル中でサポニンを
5%硫酸/水と共に2時間加熱した場合にサッカライド類が最もよく回収される
ことを示している(Kikuchiら、1987)。ある程度温和な加水分解で
あれば、トルフルオロ酢酸を用いて、例えば1M トリフルオロ酢酸中で3時間
還流させることで行うことがてきる。
処理することによってTLCプレート上で直接加水分解することである。酸が蒸
発されてしまうと、TLC溶媒による通常の溶離が行われ、存在しているモノサ
ッカライドを識別することができる(Karting及びWegchaider
、1971;He、1987)。こうした方法で、アガベシドBを部分的に加水
分解した後、末端キシロース及びガラクトースが確認された。溶媒クロロホルム
−メタノール−水(8:5:1)によりTLCプレートが作成され、アニリン−
ジフェニルアミン−H3PO4−メタノール(1:1:5:48)を用いて検出が
行われた(Uchiyalら、1990)。
ラックスによって塩基加水分解条件下で行われる。また、水酸化カリウムの1−
20%エタノール性又はメタノール性溶液を用いることもできるが、特にトリテ
ルペン酸のカルボキシル基のメチル化が起きてしまう可能性がある。Dowex 1などのイオン交換装置は温和な塩基性加水分解条件を提供してくれる(Bu
kharov及びKarlin、1970)。それとは別に、コリダイン内でヨ
ウ化リチウムを用いる方法もある(Kochekovら、1964)。
ることができる。例えば、0.5M水酸化カリウム内で30分間還流することで
キズタ・サポニンK11の加水分解することで、バイデスモシドのC−28の糖が
除去された。しかしながら、室温で0.1M水酸化カリウム内で20時間サポニ
ンを攪拌すると、C−28エステル・グリコシド鎖上の酢酸基が除去された(K
izuら、1985b)。
分的加水分解を含む手順が構造解明によりアクセスしやすいフラグメントを得る
ために必要となる。これは酸か、あるいは酵素を使ってでも可能である。オリゴ
サッカライド及び/又は残りのサポニン部分が単離され、特徴づけが行われる。
加水分解したところ、3つの生成物の混合物が得られた。これらの化合物はRP
−LPLCで分離され、アジトール酢酸のMS、13C−NMR及びGC−MS
によってその糖配列の判定が行われた。これらの情報をまとめることによって、
その化合物、オレアノル酸誘導体の化学構造を明らかにすることができた(Do
rsaz及びHostettmann、1986)。
分解を行うことができる。この例で、サポニンはジオキサン−0.1M塩酸(1
:3)内で6時間還流された(Ikramら、1981)。サポニン類を部分的
に加水分解するための方法はトリテルペン・グリコシドの溶液をアルコール内で
アルカリ金属(ナトリウム又はカリウム)を用いて処理し、その後微量の水を加
える方法である(Ogihawa及びNose、1986)。
につながり、従って構造判定に役立つ。この方法は、サンプルに応じて、100
℃から140℃の温度で、10−140時間、水又は水−ジオキサンと共にグリ
コシドを加熱するステップを含んでいる。例えば、トリテルペン、3,28−O
−ビスグリコシドの水熱分解は対応する3−O−グリコシドが与えられる(Ki
mら、1992)。
に効率的で温和な方法は酵素による加水分解である。すべての糖類に対して適切
なヒドロラーゼは市販されていないが、β−グルコース残基のβ−グルコシダー
ゼによる切断がまったく簡単である。特定の酵素による切断のさらなる利点は、
糖部分のアノマー性構成が自動的に示されることである。トリテルペン・グリコ
シドの加水分解での使用のために特に考えられているいくつかの酵素製剤はβ−
ガラクトシダーゼ加水分解、セルラーゼ、粗ヘスペリジナーゼ、ペクチナーゼ、
そしてナリンジナーゼなどである。
、及びエムルシン粗製剤を用いた系統的な研究は、ヘスペリナーゼ、ナリンジナ
ーゼ、及びペクチナーゼがジンセノシド類の加水分解において最も有効であった
(Kohda及びTanaka、1975)。
分割で分離して、知られているトリテルペンと対照しつつ分析することができる
。最も普通の方法はジイソプロピル・エーテル−アセトン(75:30)などの
ような溶媒を用いて行うTLCによるものである。スプレイ剤もサポニン類の分
析によく用いられるものである(表2)。
る。例えば、オレアノル酸及びウルソル酸のメチル・エステル類が30%0V−
17又はSE−30でパックされたGCによって分離されている(Fokina
,1979)。トリテルペンはソヤサポジェノールA−E及びアルファルファの
メジカジェン酸の場合と同様、N、O−ビス(トリメチルシリル)セトアミド及
びクロロトリメチルシランを用いて誘導体化を行った後、GCで判定することが
できる(Jurzysta及びJurzysta、1978)。
リル誘導体を調製して、分光計で分析する。1つの例はオレアネイン及びウルセ
イン・タイプのトリテルペンの調査への応用である。9つのシリル化されたトリ
テルペンがOV−101パッキング上でGCによって分離され、その質量スペク
トル・パターンが調べられ、12−en二重結合を有しているものが特徴的なレ
トロ−Diels−Alder反応にかけられた(Burmouf−Rados
evichら、1985)。この技術は天草から採取したトリテルペンの判定に
も用いられている(Bombardeliら、1979)。
現性と感度を提供してくれる。通常フェーズ(キノア・サポジェニンの分析、B
urnouf−Radosevich及びDelfel、1984)とRP−H
PLC(Linら、1981)を用いることができるが、RP−HPLCの欠点
は化合物が水性可動相内で沈殿してしまう傾向を示すことである。
5:25:15:20)及びn−ブタノール−酢酸エチル−i−プロパノール−
酢酸−水(35:100:60:35:30)などの有機溶媒を用いてシリカ・
ゲル・プレート上で行うことができる(Shiraiwaら、1991)。検出
は通常p−アニシジン・フタレート、ナフトレソルチン、チモル硫酸(kart
ig及びWegschaider、1971)又はトリフェニルテトラゾリウム
(Walenfelsら、1950;Kamelら、1991)によって行われ
る。又、モノサッカライドの定量分析はGCかHPLCによってでも可能である
。
ル−水(75:25)によるNH2結合カラム上での分析(Glombitza
及びKurth、1987);屈折率検出によるC−18カラム(アセトニトリ
ル−水4:1)上での分析などがあり、定量的な調査のためには、HPLCピー
クの融合が標準と比較された(Adinolfiら、1987)。さらに、溶離
剤として0.005M硫酸(0.4ml/分)を用いてのAminexイオン排
出HPX−87Hカラム(BioRad)上での分析(Adinolfiら、1
990)、及び(5%塩酸−メタノールによってサポニンをメタノール分解した
後メチル糖類のp−ブロモベンゾイル化を行うことによって形成された)糖p−
ブロモベンゾエートのHPLC及び真正誘導体との比較による分析(Kawai
ら、1988;Sakamotoら、1992)もこうした事例に含まれる。
は酢酸アルジトール誘導体のGC−MS分析が行われる。適切に誘導体化された
モノサッカライドのGC−フーリエ変換IR(FTIR)分析も別の手順として
利用できる(Chen及びSnyder、1989)。
ビノース、D−キシロース、L−ラムノース、D−キボース、D−グルクロン酸
、及びD−リボースである。
り長い半減期やその他の有益な利点をもたらすようにトリテルペン・グリコシド
を操作することによっていくつかの利点が達成されると考えられる。こうした技
術にはトリテルペン・グリコシドの混合物あるいは個々のトリテルペン分子自体
の操作又は修正、糖類の修正や除去、そしてトリテルペン化合物の免疫グロブリ
ン及びFe部分を含む種々の蛋白質又は非蛋白質成分などの不活性基質への接合
などがある。『ゆっくりした放出』において使用するための医薬品組成物と半減
期を長くすることとは必ずしも両立しない。ゆっくりした放出のための製剤は通
常長期間での一定したドラッグ・レベルをもたらすようにデザインされる。本発
明によるトリテルペン・グリコシドなどの製剤の半減期を長くすることは投与後
に高い血漿レベルをもたらし、そのレベルが長期間持続されることが意図されて
いるが、そのレベルは通常はその化合物の医薬力学に基づいて崩壊する。
本発明による化合物で措置可能ないずれの疾病に関して患者を治療する際にその
トリテルペン・グリコシドの有効性を改善するために特定の分子に結合する必要
がある。そうした分子の例示的実施の形態には向標的剤及びトリテルペン化合物
のイン・ビボでの半減期を増大する薬剤などである。これらのトリテルペン化合
物は、例えば、各領域がここで開示されている抗腫瘍活性などの生物学的活性を
重大に損なわずにその意図された機能を可能にするような方法でそうした二次的
な分子に結合することができる。
して結合することができる。『リンカー基』という用語はトリテルペン化合物又
はトリテルペン混合物を薬剤に共有結合で結合させるために用いることができ、
そのトリテルペン化合物の生物学的活性に干渉しない1つ又はそれ以上の二機能
性分子を意味している。このリンカー基は例えば本発明による化合物の抗腫瘍活
性などの生物学的活性に影響を及ぼさない限り、そのトリテルペンのいずれの部
分にでも取り付けることができる。
テルペンの活性エステルを調製して、その後その活性エステルと結合されるべき
薬剤上の親核機能基との反応を行わせることによる方法である。活性エステルは
、例えば、トリテルペンのカルボキシル基をジシクロヘキシカルボジイミド(D
CC)、1−(3−ジメチルアミノプロミル)−3−エチルカルボジイミド(E
DC)、及び1−(3−ジメチルアミノプロミル)−3−エチルカルボジイミド
・メチオダイド(EDCI)などの脱水剤の存在下でアルコールと反応させるこ
とによって調製することができる。接合体をつくるためのEDCの使用は米国特
許第4,526,714号;PCT出願公報第WO91/01750号、Amo
nら、1980に開示されており、それらの開示はここに参照することによって
その全体が本明細書に取り込まれる。トリテルペンに結合される薬剤は、その後
水溶液内で活性エステルと混合されて、接合体が提供される。
コシドの活性エステルを上に述べたように調製して、リンカー、例えば2−アミ
ノエタノール、アルキレン・ジアミン、グリシンなどのアミノ酸、又はグリシン
・テルト−ブチル・エステルなどと反応させることができる。リンカーが保護さ
れたカルボキシ基を含んでいる場合は、その保護している基を取り除いて、その
リンカーの活性エステルが(上に述べたように)調製される。この活性エステル
を次に第2の分子と反応させると接合体が与えられる。又、第2の薬剤は無水コ
ハク酸エステルによって誘導体化し、EDC又はEDCIと遊離アミノ又はその
リンカー上でヒドロキシル基を有しているトリテルペンリンカーの存在下で濃縮
することが可能である薬剤−コハク酸接合体を与える(例えば、W09/017
50参照。この開示は参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる
)。
合体を調製して、その遊離アミノ基を蛋白質抗原の遊離スルフヒドリル基と反応
するスルホサクシンイミジル 4−(N−マレイミドシクロヘキサン)−1−カ
ルボキシレートなどの異種二機能性クロス・リンカーとクロス・リンクさせるこ
とも可能である。
中間イミン接合体を形成し、次にナトリウム硼化水素又はナトリウム・シアノ硼
化水素によって還元することによってリンカーに結合させることができる。そう
したリンカーの例としては、2−アミノエタノールなどのアミノ・アルコールと
エチレンジアミン、1,2−プロピレンジアミン、1,5−ペンタジアミン、1
,6−ヘキサンジアミンなどのジアミノ化合物などがある。そのトリテルペン・
グリコシドは、次に、先ず無水コハク酸エステルを用いてこはく酸化誘導体を形
成し、次にDCC、EDC、又はEDCIでトリテルペン・グリコシド−リンカ
ー接合体で濃縮させることができる。
、それからつくられるジアルデヒドをアミノ・アルコール又は上に示したジアミ
ノ化合物で濃縮させることができる。そのリンカー上の遊離ヒドロキシル又はア
ミノ基を次にDCC、EDC、またはEDCIの存在下で抗原のこはく酸エステ
ル誘導体で濃縮することができる。先行技術で多数のタイプのリンカーが知られ
ており、トリテルペン接合体の生成にもちいることができる。具体的なリンカー
のリストを表4に示す。
似物をつくりだすことである。そうした類似物をつくりだすことで、天然の分子
より活性が高くより安定しており、変性に対して異なった感受性をもっており、
あるいは種々のたの分子の機能に影響を及ぼす可能性のある薬品をつくりだすこ
とができる。1つの方式で、本発明によるトリテルペン化合物やその断片の三次
元構造を発生させることができる。これはX線結晶学、コンピュータ・モデリン
グ、あるいは両方の方式の組み合わせで達成することができる。別の方式はトリ
テルペン分子全体で機能基をランダムに置換して、その結果が判定される機能に
どのような影響を及ぼすかを調べる方法である。
結晶構造を解明することも可能である。原理的に、この方式はその後のドラッグ
・デザインの基礎となる薬物核をつくりだす。機能性を示し、薬学的に活性な抗
体に対する抗イディオタイプ抗体を発生させることで蛋白質結晶学的手順をまっ
たく用いないことも可能である。反転画像の反転画像として、抗イディオタイプ
の結合個所は最初の抗原と類似していることが予想されるであろう。そして、抗
イディオタイプを用いて化学的、あるいは生物学的につくりだされたペプチドの
バンクからペプチドを単離したり識別することが可能であろう。選択されたペプ
チドはその薬物核としての役割を果たすであろう。抗イディオタイプは抗体をそ
の抗原として用いて、本明細書で抗体の生成に関して述べられた方法によって発
生させることが可能であろう。
腫瘍性を有する薬品を設計することができる。ここで述べた化学的単離手順と説
明によって、結晶学的な研究を行うのに十分な量の本発明によるトリテルペン化
合物を生成することができる。加えて、これらの化合物の化学的特性についての
知識は構造と機能の関連性についてコンピュータによる予測を可能にしてくれる
。
れる変化を受ける。これは一般的に(1)開始:外部物質又は刺激性トリガーが
1つ又は複数の細胞に遺伝子変化を引き起こすステップと、(2)促進:と呼ば
れる炎症を含む場合もあるさらなる遺伝子的及び代謝上の変化を伴うステップで
起きる。『促進段階』で、細胞はアポトーシスが阻止されてしまう細胞成長の段
階に代謝的に変化し始める。
対する制御の喪失で特徴付けられる。癌細胞(悪性細胞)は悪性状態の開始時の
イニシエーション及びプロモーション中の一連の代謝的変化を通じて正常な成長
制御メカニズムから逸脱してしまう。これらの変化はそれらの細胞における遺伝
子変化の結果である。これらの遺伝子的変化は(i)突然変異の活性化及び/又
はプロトオンコジンの表現の増大、(ii)突然変異の不活性化及び/又は1つ
又は複数の腫瘍抑制遺伝子の表現の低下を含んでいる場合がある。ほとんどのオ
ンコジーン及び腫瘍抑制遺伝子生成物は細胞サイクルの入り口や出口を制御し、
分化を促進し、DNA損傷を感作し、故障メカニズムを開始させ、及び/又はア
ポトーシスプログラムを規制する信号移動経路の構成要素である。ほとんどすべ
ての腫瘍は複数のオンコジン及び腫瘍抑制遺伝子における突然変異を有している
。細胞は細胞成長、分化、DNA損傷制御、そしてアポトーシスを規制する複数
の平行的なメカニズムを用いていると結論付けることができる。
出された後その癌を治療する目的でそうした治療を必要とする個人に投与するこ
とができる。癌の開始及び進行を抑止するため、癌/悪性細胞を殺すため、細胞
成長を抑制するため、アポトーシスを誘発するため、転移を抑えるため、腫瘍の
大きさを減少させるため、あるいは腫瘍細胞の悪性表現型を逆転したり減らした
りするために、本発明による方法及び組成物を用いて、ここに述べられているト
リテルペン組成物で『標的』細胞と接触することができるであろう。これは本発
明によるトリテルペン組成物を含む単一の組成物あるいは薬学製剤で腫瘍又は腫
瘍細胞に接触するか、あるいは一方が本発明によるトリテルペンを含んでおり、
他方が第二の薬剤を含んでいる複数の組成物や薬学製剤で同時に腫瘍又は腫瘍細
胞に接触することによって達成される。
房、腎臓及び前立腺腫瘍細胞などの上皮癌である。他の標的細胞は脳、肝臓、胃
、食道、頭部及び首、睾丸、子宮頚部、リンパ系、喉頭、耳下腺、胆汁腺、直腸
、子宮内膜、腎臓、膀胱、そして甲状腺などであり、鱗状細胞癌腫、小細胞癌腫
、グリオーマ、神経芽細胞腫瘍などがその治療対象である。しかしながら、この
リストは例示的な目的のためだけであって、いずれの腫瘍細胞も本発明によるト
リテルペン化合物で処理が可能であるから、限定的なものでもない。上記のタイ
プの腫瘍細胞及びその他の腫瘍細胞の治療における本発明の化合物の相対的有効
性を評価するための評価方法を以下に具体的に開示し、本発明の開示により当業
者に自明にする。
剤又は基剤を含む栄養薬組成物又は医薬品組成物として投与される。この基剤の
性質は溶解性及び/又は投与モードを含めて用いられる化合物の化学的性質に依
存する。例えば、経口投与が望ましい場合は、固体担体が選択することができ、
イン・ビボ投与の場合は、液体塩溶液担体を用いることができる。
場合に、悪い、アレルギー性又はその他の目的以外の反応をつくりださない分子
集合及び組成物を意味している。ここで用いられている『薬学的に受け入れ可能
な担体』とは溶媒、分散媒体、コーティング、抗生及び抗菌剤、等浸透圧及び吸
着遅延剤などのすべてが含まれる。薬学的活性物質のためにそうした媒体や薬剤
を使用することはこの技術分野ではよく知られている。従来の媒体や薬剤がそれ
らの活性成分と両立しない場合を除いて、医療用組成物におけるその使用が考え
られる。これらの組成物には補助的な活性成分を組み入れることもできる。
補助物で構成される多重成分システムの天然成分の製剤である。栄養薬品物化合
物は栄養薬品物化合物は医薬品植物から誘導することができる。栄養薬品組成物
を調製するために用いられる多数の植物や球根についての情報は完全に揃ってお
り、例えばGerman Commission E Monographs、
Botanical Safety Handbook、及び栄養薬品物を用い
て行われた多数の臨床実験についての情報を崩壊しているAmerican B
otanical Councilの季刊誌であるHerbalGramなどに
紹介されている。
用例、作用、禁忌、副作用、従来の薬品との相互作用、投与方法、継続時間、規
制的状態、AHPA植物安全性ランキング、及びコメントなどに関する情報が入
手可能で、対象としては、コケモモ、カスカラ、キャッツ・クロー、トウガラシ
、ツルコケモモ、デビルズ・クロー、ドング・クアイ、エノキダケ、オオマツヨ
イグサ・オイル、胡椒、ショウガ、イチョウ、アジアン・ジンセング、シベリア
ン・ジンセング、ゴールデンシール、ゴツ・コラ、ブドウの種子、緑茶、サンザ
シ、カワカワ、甘草、オオアザミ、ソウ・パルメット、聖ヨハネ草、カノコソウ
などである。
健康目的に寄与するものであったりする。本発明はアカシア・ビクトリアエから
抽出された植物薬に焦点を絞っている。本発明は、特に癌の予防と治療のための
自然なアプローチとしての、薬理学的に受け入れ可能な媒体に入れた乾燥しすり
潰されたアカシア・ビクトリアエの根及びさや、あるいはこれらの組織の抽出物
で構成される栄養薬品組成物をその範囲内に入れている。この栄養薬品組成物は
発癌の開始及び進行を阻止するため、そして悪性癌細胞でのアポトーシス誘発の
ために用いることができる。ここで開示される栄養薬品組成物は又抗炎症、抗菌
、抗ウイルス、抗突然変異、抗精子又は避妊用、心臓血管及びコレステロール代
謝規制剤などとして使用することも可能である。これらの栄養薬品組成物は緩衝
液、溶媒、希釈剤、不活性基質、オイル、クリーム、あるいは食材などに入れる
こともできる。
することもできる。結腸癌や他の内部癌の場合は経口投与が望ましい。
ム内にアカシア・ビクトリアエの根やさやの抽出物を入れた軟膏の形状であって
もよい。この形態の栄養薬品組成物は皮膚癌の開始を防ぐのに有益である。これ
らの栄養薬品製剤の使用によって、哺乳動物の上皮細胞の前悪性又は悪性状態へ
の移行の開始と進行を防ぐための、治療的に有効な量の上記栄養薬品組成物を任
意の哺乳動物の細胞に投与される方法が提供される。この方法は皮膚癌などの上
皮細部癌にとって特に有益である。
リアエから単離された組成物についても開示している。これらのトリテルペン・
グリコシド組成物の精製と特徴づけについては実施例に詳細に述べられている。
D1、G1、及びB1は完全に精製された3つの組成物であり、それらの構造的
解明もほとんど完了している(図39、図40、及び図41)。癌細胞株上でこ
れらの化合物を用いて行われたバイオアッセイは悪性細胞内での細胞成長抑止及
びアポトーシスの誘発を実証している(図43、図44A−E)。さらに、アカ
シア・ビクトリアエから単離されたこれらのサポニン類の部分的に精製された組
成物は発癌物質DMBAに露出された化学的保護効果も実証している(図8、9
、11、12及び13)。従って、これらの組成物は抗癌活性を有しており、い
くつかのメカニズムで腫瘍細胞におけるアポトーシスを誘発するように作用する
。これらの化合物の医薬品組成物は、それ自体でも、あるいは化学療法、放射線
治療、外科、遺伝子治療、及び免疫治療などの他の形態の癌治療との組み合わせ
で用いることができる強力な化学治療剤として考えられる。これらの組み合わせ
治療について以下に詳細に述べる。当業者であれば有効な投与量や組み合わせ治
療処方については分かるであろう。
静脈、筋肉内、皮下、あるいはその他の経路による注射のために調整されたトリ
テルペン組成物の非経口投与の製剤を提供する。トリテルペン組成物を含む水性
組成物の調製は本発明に関連する分野の当業者には明らかであろう。通常、そう
した組成物は液体溶液であれ懸濁液であれ注射剤として調製することができ、注
射前に液体を加えて溶液や懸濁液を調製するのに適した固体形態も調製すること
ができ、そしてそれらの製剤を乳剤化することもできる。
キシプロピルセルロースなどの界面活性剤と水中で適切に混合することもできる
。通常の状態の保存や使用時には、これらの製剤は微生物の成長を防ぐための予
防剤を含んでいる。
ル、ピーナッツ・オイル、又は水性プロピレン・グリコールなどのを含む製剤、
殺菌注射可能溶液又は分散剤のための即席製剤用の殺菌粉末などである。すべて
の例で、形態は殺菌されていることが必要であり、注射器から簡単に押出せる程
度の流動性を有していなければならない。製造及び保存状態下で安定していなけ
ればならず、そして、バクテリアや菌などの微生物の汚染作用に対して防御され
ていなければならない。
学的に受け入れ可能な塩としては、例えば塩酸や硫酸などの無機酸や、酢酸、タ
ルタル酸、マンデル酸などの有機酸と共に形成される酸添加塩(蛋白質の遊離ア
ミノ基と形成される)などを含んでいる。遊離カルボキシル基と形成される塩は
、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄など
の無機塩、そしてイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカ
インなどの有機塩から誘導される。
・グリコール、そして液体ポリエチレン・グルコールなど)、それらの適切な混
合物、そして野菜オイルなどを含む溶液や分散剤であってもよい。例えば、レシ
チンなどのコーティングを使用することで、分散剤の場合には必要な粒子サイズ
を保持することで、そして、界面活性剤を使用することで適切な流動性を保持す
ることができる。微生物の作用に阻止は例えばパラベン、クロロブタノール、フ
ェノール、ソルビン酸、チメローサルなどの種々の抗生、抗菌剤などで実現する
ことができる。多くの場合、砂糖又は塩化ナトリウムなどの等張剤を含んでいる
ことが好ましい。注射可能な組成物の長期間吸収は例えばアルミニウム・モノス
テレート及びゼラチンなど吸収を遅らせる組成物内での使用で実現できる。
共に適切な溶媒に入れて、その後でろ過滅菌を行うことで調製される。一般的に
、分散剤は、種々の滅菌された活性成分を塩基性分散剤媒体と上に列挙されたも
のからの必要な他の成分を含む殺菌媒体に組み込むことで調製される。殺菌注射
可能溶液を調製するための殺菌粉末の場合は、好ましい調整法は活性成分の粉末
とその以前の殺菌ろ過溶液からのいずれかの追加的な望ましい成分をつくりだる
真空乾及び冷凍乾燥技術である。
成物を懸濁液として調製することができ、またアエロゾルや鼻腔内で使用するた
めの組成物として調製することもできる。座薬のためには、媒体組成物として通
常の結合剤、及びポリアルキレン又はトリグリセリドなどの基質を含む。そうし
た座薬は約0.5%−約10%(重量ベース)、好ましくは約1%−約2%の範
囲で活性成分を含む混合物から形成することができる。
末などの形状で調製することができる。これらの組成物は、例えば、飲み込んだ
り、吸い込んだりする方法で投与することができる。医薬品組成物が吸引される
場合は、その組成物は好ましくはアエロゾルを含んでいる。本発明で使用するた
めの水性アエロゾルを調製するための具体的な手順は米国特許第5,049,3
88号内に見出すことができ、その開示は参照することでその全体が本明細書に
組み込まれる。乾燥アエロゾル製剤の調製は、例えば、米国特許No.5,60
7,915に述べられており、その開示も参照することで、その全体が本明細書
に組み込まれる。
ることも有用である。これらの組成物は同様にいずれかの適切な基質、補形剤、
または希釈剤などを含んでいてもよい。一定の疾病兆候に対しては他の局所投与
製剤を用いることもできる。例えば、鼻腔粘膜に刺激を与えず、細毛機能に重大
な影響を及ぼさない媒体を含む鼻腔用製剤を調製することができる。水、食塩水
、又は他の公知の物質などの希釈剤を本発明で用いることができる。鼻腔用製剤
はクロロブタノール、及び塩化ベンザルコニウムなどの保存剤を含むこともでき
る。鼻腔粘膜によるその化合物の吸収を増強するために界面活性剤を用いてもよ
い。
与される。選択して製剤は、例えば、マニトール、ラクトース、スターチ、マグ
ネシウム・ステアレート、ナトリウム・サッカリン・セルロース、炭酸マグネシ
ウムなどの種々の補形剤を用いて行うことができる。
0%から約50%の範囲の活性成分を含んでいる。好ましくは、患者の体重10
kgあたり一日10mgから約25mgの範囲の量で患者に投与される。投与の
回数は患者の状態に応じて決められる。他の有効な使用量は容量応答曲線を作成
する日常的な試験を通じて当業者であれば簡単に決めることができる。
ている使用目的に応じて、一定の範囲の最終濃度をもたらすように、殺菌水溶液
などの希釈剤や補形剤と混合された一定量のトリテルペン組成物を含んでいる。
製剤の技術はMack Publishing社の1980年出版、Remin
gton‘s Pharmaceutical Science,16版などに
示されているように一般的に知られており、その内容は参照により、本明細書に
組み入れられる。なお,内毒素汚染は安全レベル、例えば、0.5ng/mg蛋
白質に抑えられるべきである。さらに、ヒトに対して投与する場合は、その製剤
はFDAの生物学的安全基準で求められているような殺菌性、発熱性、一般的安
全性、及び純度基準を満たしていなければならない。
単に決めることができる。例えば、臨床環境に適用する前に、適切な治療用投与
量を最適化するために固体腫瘍をもっている実験動物がしばしば用いられる。こ
うしたモデルは有効な抗癌戦略を決める上で非常に有効であることが知られてい
る。
が望ましい場合がある。静脈や小動脈経由の場合は、これは点滴方式で達成され
る。局所適用の場合は、反復的な適用が用いられる。種々の投与方式のために、
長い時間にわたって限定的ではあるが一定量の治療剤を繰返し提供する遅延放出
製剤を用いることも可能であろう。内科的応用のためには、問題の領域を継続的
に薬剤が提供されることが好ましい。これはいくつかの事例では手術後にカテー
テルを用いて行うことができ、その後に治療剤が継続的に投与される。継続的適
用の期間は特定の患者の臨床状態や状況によって選択されるであろうが、時間は
約1−2時間から約2−6時間、約6−10時間、約10−24時間,約1−2
日、約1−2週間あるいはそれ以上に及ぶ。一般的に、継続的浸潤による治療剤
の投与量は単一又は複合投与の場合と同様で、注射が行われる期間に応じて調節
される。しかし、この方法(浸潤)の方が投与量は多くなると考えられる。
せ治療の両方が発明者らによって構想されている。第一の方法はこれまでに化学
的、放射線、又は生物学的治療を受けたことのない患者、あるいはこれまで治療
を受けていない患者での転移癌における使用である。患者は非経口投与、つまり
、静脈注射、皮下注射か経口投与、そして腫瘍内投与によって措置される。投与
される医薬品の量は好ましくは本発明のトリテルペン組成物を、13、16、1
9及び22mg/kg/日の値を含む、1日あたりで、患者の体重1kgあたり
10−25mgの範囲である。また、患者は本発明によるトリテルペン組成物を
本発明によるトリテルペン組成物の約3、6、9、12、15、18、21、2
8、30、40、50、60、70、80、及び90mg/kg/日を含む約1
mg−約100mg/kg/日の範囲の量で治療されることもできる。
最低量を注射する措置を8週間継続する形態で行われる。医師の選択に基づいて
、腫瘍が進行するか、あるいは反応の欠如が観察されるまで同じスケジュールで
継続される。
によって臨床的疾患から開放された患者の措置における使用である。補助的治療
は疾患の再発を防ぐために最低1年間上述の処方で投与される。
の予防における利用である。こうした患者(例えば、乳癌、結腸癌、皮膚癌など
)の腫瘍への一般的に定義された移行傾向を有する患者は経口(胃腸腫瘍)、皮
膚上で局所的に措置され、あるいは癌の予防を判定するために最低1年、あるい
はそれ以上非経口投与することによって措置される。これはコレステロール・ポ
リプなどのよく定義された腫瘍形成前病変、あるいは皮膚や乳房や肺やその他の
器官の前悪性病変を有する患者に対して適用される。
者らは臨床手順を考案した。この手順によれば、先ず、癌、例えば子宮癌、膵臓
癌、腎臓癌、前立腺癌、肺癌、または暴行癌の組織的証拠を有する患者が選択さ
れる。患者は以前に化学的、放射線照射、あるいは遺伝子治療を受けていてもよ
い。最適には、(末梢絶対顆粒球カウントが2,000/mm3、及び血小板カ
ウントが100,000/mm3で定義される)十分な骨髄機能と、(ビリルビ
ン≦1.5mg/dlで定義される)十分な肝臓機能、そして(クレアチニン<
1.5mg/ml)の十分な腎臓機能を持っている場合が最適である。
0−25mg程度を含んでいる医薬品組成物を腫瘍内注射する。4cm以上のサ
イズの腫瘍に対しては、投与量は4−10ml(好ましくは10ml)で、4c
m以下のサイズに対しては、1−3ml(好ましくは3ml)の体積が用いられ
る。約1cmあるいはそれ以上の間隔を置いて、一回の投与あたり0.1−0.
5mlの量で複数回注射するようにする。
毎に6回投与あるいはそれ以下のペース(1月、2ヶ月、または3ヶ月の6回投
与)で継続される場合もある。
される治療コースを少なくとも2回連続して治療を受けなければならない。二回
目のコースの最初の週が終了した時に、患者は外科的切開を受けることになる。
切開個所を封鎖する前に、本発明によるトリテルペン化合物を含む医薬品組成物
10mlを外科的措置個所(手術個所)に与え、少なくとも60分間は接触状態
を保つようにする。傷を塞ぎ、そこにドレイン又はカテーテルを入れる。手術後
3日目にさらに10mlの医薬品組成物をドレインを介して投与し、手術個所と
少なくとも2時間は接触しているようにする。その後吸引による取り出しが行わ
れ、そしてドレインは臨床的に適切な期間だけ置いておく。
、あるいはその周辺領域に残る微小な疾患である。さらに、身体凹部に微小腫瘍
細胞が撒かれているような類似状況もある。こうした微小な疾患の有効な措置は
治療上重要な前進をもたらすであろう。
りだす。手術時及び手術後の両方で(定期的又は継続的に)本発明による医薬品
組成物をこの身体凹部に投与する。これは基本的にその凹部の『局所的』措置で
ある。組成物の体積は、その凹部表面全体が確実に接触するのに十分な量でなけ
ればならない。
物を注入するだけである。別の実施の形態では、スポンジ、綿棒、その他の装置
を用いることが望ましい。腫瘍除去後及び最初に手術中に、これらの」いずれか
の方式を用いることもできる。さらに別の実施の形態では、カテーテルを手術個
所全体を塞ぐまえにその凹部に挿入しておく。その場合、その凹部に望ましい期
間だけ継続的に薬品を投与することができる。
いは睾丸、結腸、あるいは他の内臓器官などの中空器官凹部など自然な身体凹部
を標的として治療用組成物の『局所的』投与が行われる。この状況で、凹部内に
重大な一次腫瘍がある場合とない場合がある。この措置は凹部内の顕微鏡的レベ
ルの疾患を対象として行われるが、この凹部内に存在している可能性のあるこれ
まで取り除かれていなかった一次腫瘍や腫瘍形成前の兆候に影響を及ぼす場合も
ある。この場合も、これらの内臓器官又は凹部表目塩に『局所』適用を行うため
に種々の方法を用いることができる。例えば、咽頭内口腔凹部は溶液をすすった
りうがいしたりすることで影響を及ぼすことができる。しかしながら、咽頭及び
気管内の局所的措置は内視鏡による視覚化及び治療用組成物の局所的伝達を行う
ことが必要である。膀胱や結腸粘膜などの内臓器官の場合はカテーテルを注入物
と共に飲み込み、そしてこの場合もサイトスコープやその他の内視鏡による直接
的視覚化が必要である。胸膜及び腹膜凹部などの凹部はカテーテルを飲み込むか
、あるは外科的手法でアクセスできる。
供する。こうしたキットは一般的に、適切な容器手段内に少なくとも1つのトリ
テルペン化合物の薬学的に受け入れ可能な製剤を含んでいる。このキットは措置
を必要とするその患者の体内の特定の個所にトリテルペン化合物を向かわせる成
分を含んだものなど、他の薬学的に許容される製剤や、あるいはトリテルペン化
合物と協調して作用する1つ、又は複数の薬品を含んでいてもよい。
合物を含む単一の容器手段を有しているか、又は各の望ましい薬剤のための個別
的容器手段を備えている。このキットの成分は1つ又は複数の溶液に入れられて
おり、その溶液は水溶液で、殺菌された水溶液が特に好ましい。しかしながら、
このキットの構成物は乾燥した粉末で提供することも可能である。薬品や成分を
乾燥粉末として提供する場合、その粉末は適切な溶媒を加えて再構成することが
できる。その溶媒を別の容器手段に入れて提供することも想定される。この容器
手段は一般的には小びん、試験管、フラスコ、ボトル、注射容器、その他の容器
手段であり、その中にトリテルペン・グリコシド及び他の薬剤を入れることがで
き、好ましくは適正量を入れることができる。追加的な成分が含まれている場合
は、キットはこれらを入れることができる第二の小びんやその他の容器が含まれ
、その場合個別の指定量を投与することができる。これらのキットはまた殺菌さ
れた薬学的に許容される緩衝液や希釈剤を入れるための第二/第三の容器手段を
含んでいる場合もある。
の手段、例えば1つ又は複数の注射容器、又は対眼球滴下装置、ピペット、ある
いはその他の同様の装置を含む場合もあり、それらの容器から製剤を動物や患者
の身体の疾患領域に注入することができる。本発明によるキットは通常それらの
小びんなど及び他の構成要素を市販用にしっかり密封しておくための手段、例え
ば望ましい小びんや他の装置を入れて保持するための射出または吹き出し成型プ
ラスチック容器を含んでいる場合もある。
療法剤、放射性物質、及び治療用蛋白質あるいは遺伝子の1つ又は複数と組み合
わせて投与することが望ましい場合もある。これによって本発明による化合物だ
けで達成される全体的な抗腫瘍活性を増大することができ、あるいは複数の薬品
による腫瘍耐性を防いだり克服することも可能になる。
ン組成物をその第二の化学療法剤と組み合わせて動物の体内で結合された抗腫瘍
活性を発揮させるために有効な方法で投与すればよい。これらの薬剤は従って有
効な量だけ、そして腫瘍脈管内で結合した存在がもたらされ腫瘍環境中でそれら
の結合した作用が発揮されるのに有効な期間だけ投与される。こうした課題を達
成するために、トリテルペン組成物及び化学療法剤を単一の組成物として、ある
いは異なった投与経路を用いて2つの異なった組成物として同時にその動物に投
与することができる。
治療は行われる前と後のいずれでも、数分間から数週間の間隔をおいて行われて
もよい。第二の薬剤とトリテルペン組成物が動物に対して個別に投与される実施
の形態においては、一般的には追加的な薬剤とトリテルペン組成物とが腫瘍に対
して好適に結合された作用を発揮することができるように、各投与間であまり長
い時間が経過しないようにするであろう。そうした場合、両方の薬剤で約5分か
ら約1週間、約12−72時間、そして最も好ましくは24−48時間程度の時
間的ずれで腫瘍に接触するのが好適であろう。いくつかの状況では、それぞれの
投与の間の間隔が数日(2、3、4、5、6、又は7)から数週間(1、2、3
、4、5、6、7、あるいは8週間)の範囲に及ぶような長めの治療期間とする
方が好ましい場合もある。トリテルペン・グリコシド又は二番目の薬剤のいずれ
かを複数回投与することが望ましい場合も考えられる。腫瘍退縮を達成するため
には、両方の薬剤が投与回数には関係なく、その成長を抑制するのに有効な結合
量で投与される。
る。想定される化学療法剤を例として示すと、例えば、エトポシド(VP−16
)、アドリアミシン、5−フルオロウラシル(5−FU)、カプトテシン、アク
チノマイシンーD、ミトマイシシンC、及びシスプラチン(CDDP)などであ
る。
治療で用いられているものと同様であり、これら化学療法剤は単独、あるいは他
の化学療法剤との組み合わせで投与される。例として示せば、シスプラチン、及
びその他のDNAアルキレート化剤などを用いることができる。シスプラチンは
癌治療には広く用いられており、臨床応用で用いられる有効投与量は毎週五日間
、1回20mg/mlの使用量を全部で3コース続ける。シスプラチンは経口で
は投与されず、静脈注射、皮下注射、腫瘍内あるいは腹膜内注射の方法で提供さ
れる。
を及ぼす化合物などが含まれる。こうした化学療法剤はドキソルビシンとしても
知られているアドリアミシン、エトポシド、ベラパミル、ポドフォロトキシンな
どである。腫瘍治療のための臨床状況で広く用いられるこれらの化合物はアドリ
アミシンの場合21日の間隔をおいて25−75mg/m2の範囲で静脈注射さ
れ、エトピシドの場合は静脈注射では35−50mg/m2で、そして経口の場
合はその二倍の量で投与される。
。特に有益なのは広範なテストを受け、入手が簡単な薬剤である。そうした薬剤
として、5−フルオロウラシル(5−FU)などの薬剤は新形成組織によって優
先的に使用されるので、この薬剤は新形成腫瘍細胞に向かわせるためには特に有
益である。非常に毒性が高いが、5−FUは局所剤を含む種々の基質で用いるこ
とができ、一般的には3−15mg/kg/日の量で静脈投与される。
のそれぞれは例として示すものであって、本発明の範囲を限定することは意図し
ていない。この点で、“Remington’s Pharmaceutica
l Sciences”15版、33章、特に624−652が参考になるであ
ろう。治療を受ける個人の状態によって投与量に一定の変更がなされることは必
要である。投与を担当する人は、いずれの場合でも、個々人に応じて適切な投与
量を決めることになるであろう。さらに、ヒトに対して投与する場合は、その製
剤はFDA生物製剤局が求めている殺菌、発熱性、一般的安全性及び純度基準を
満たさなければならない。
治療、及び/又は腫瘍細胞への放射性元素の直接伝達などの方法である。他の携
帯のDNA損傷ファクターには短波又はUV放射線療法などの利用も考えられる
。これらのファクターのすべてはDNA、DNA前駆体、DNAの複製と修理、
及びクロモソームの集合と維持に幅広い範囲の損傷を起こす可能性が高い。X線
の照射量は日量50−200レントゲンで長期間(3、4週間)から一回の照射
で2000−6000レントゲンの範囲である。放射性同位元素の使用量は幅広
く、その同位元素の半減期、放射される放射線の強度やタイプ、そして腫瘍細胞
による接種量などに応じて変わる。
る1つ又は複数の分子に結合することができる。向標的は例えば腫瘍箇所などの
措置箇所での薬の全体的なレベルを増大させて、措置箇所以外の部分のその薬剤
に対する露出量を減らしてくれる。上に述べた化学療法剤の場合と同様、向標的
トリテルペン化合物を化学療法剤など第二の薬剤と組み合わせて用いることもで
きる。トリテルペンと第二の薬剤の両方をその腫瘍環境内の同じ個所、あるいは
別の個所に向かわせることができる。これは追加的な、あるいは追加的というよ
りもっと大きな相乗効果をもたらすはずである。
剤としてはトリテルペン部分を腫瘍領域に向かわせることができる、つまり、腫
瘍箇所に局所化できる向標的剤である。腫瘍領域の脈管に向かう薬剤も同様に望
ましい。トリテルペン・グリコシド化合物を標的に向かわせることはトリテルペ
ン化合物のある程度広範囲の、あるいは全身的分布に伴なって観察される可能性
がある副作用を起こさずに、あるいはそれを最低のレベルに抑えての、腫瘍領域
での有効濃度をできるだけ大きくするように考えられたものである。具体的に、
向標的剤は腫瘍細胞の構成要素、つまり腫瘍脈管の構成成分、腫瘍細胞に結合す
る、あるいは全体として関連している成分、腫瘍脈管に結合する、あるいはそれ
と全体的に関連している成分、腫瘍細胞外基質又は間質、あるいはその内部に結
合した成分、そして腫瘍脈間内に見出される細胞タイプなどにも向かわせること
ができる。
合することができる領域を有する固有抗体を用いて薬剤を向かわせることができ
る。例えば、固有腫瘍細胞を抑制したり殺したりすることは抗体−トリテルペン
接合体の標的腫瘍細胞への結合によって行われる。
的側面との関連で標的として用いることができる。多数の腫瘍関連抗原を以下に
例として示す。そうした抗原に対する抗体の調製と使用は当業者がよく知る範囲
であり、ここに具体的に開示する。例としての抗体は婦人科学的腫瘍部位(例え
ばATCCカタログ参照):OC125、OC133、OMI、Mo vl、M
o v2、3C2、4C7、ID3、DU−PAN−2、F36/22、4F7
/7A10、B72.3、DF3、2C8/2F7、Mov18、CEA 11−H
5、CA 19−9(1116NS19−9)、H17−E2、791T/36
、NDOG2、H317、4D5、3H4、7C2、6F9、2C4、7F3、
2H11、3E8、5B8、7D3、SB8、HMFG2;乳癌部位:DF3、
NCRC−11、3C6F9、MBE6、CLNH5、MAC40/43、EM
A、HMFG1 HFMG3、3.15C3、M3、M8、M24、M18、6
7−D−11、D547Sp、D75P3、H222、抗EGF、LR−3、T
AI、H59、10−3D−2、HmAB1,2、MBR1,2,3、24.1
7.1、24.17.2(3E1.2)、F36/22.M7/105、C11
、G3、H7、B6.2、B1.1、Cam17.1、SM3、SM4、C−M
ul(566)、4D5 3H4、7C2、6E9、2C4、7F3、2H11
、3E8、5B8、7D3、5B8、OC125、MO v2、DU−PAN−
2、4F7/7A10、DF3、B72.3、cccccCEA11、H17−E
2、3.14.A3、FO23C5;結腸癌部位:B72.3、(17−1A)
1083−17−1A、CO17−1A、ZCE−025、AB2、HT−29
−15、250−30.6、44X14、A7、GA73.3、791T/36
、28A32、28.19.8、X MMCO−791、DU−PAN−2、I
D3、CEA 11−H5、2C8/2F7、CA−19−9(1116NS 1
9−9);黒色腫部位:4.1、8.2 M17、96.5、118.1、13
3.2、(113.2)、L1、L10、R10(R19)、I12、K5、6−1、R2
4、5.1、225.28S、465.12S、9.2.27、F11、376
.96S、465.12S、15.75、Mel−14、Mel−12、Me3
−TB7、225.28SD、763.24TS、705F6、436910、
M148;消化器官系腫瘍:ID3、DU−PAN−2、OV−TL3、B72
.3、CEA 11−H5、3−14−A3、 C COLI、CA−19−9
(116NS 19−9)及びCA50、OC125;肺腫瘍:4D5 3H4
、7C2、6E9、2C4、7F3、2H11、3E8、5B8、7D3、SB
8、MO v2,B72.3、DU−PAN−2、CEA 11−H5、MUC 8−22、MUC2−63、MUC2−39、MUC7−39、そしてその他
の雑多な腫瘍:PAb240、PAb246、PAb1801、ERIC1、M
148、FMH25、6.1、CA1、3F8、4F8/2F7、CEA11−H
5からのものである。
学的特性より腫瘍細胞自体の特性に関係している。多数の腫瘍細胞株が知られて
おり、向標的薬剤のために用いることができる。例えば、公知の細胞株から選ん
だ細胞全体、あるいは細胞をすりつぶして均一化したものを用いて関連する腫瘍
タイプの向標的のための抗腫瘍抗体を調製することができる。同様に、そうした
細胞株は種々のイン・ビトロ・アッセイの実施の際に用いることができる。この
点に関して、経験者であれば(ATCCカタログから)公開で利用できるヒト腫
瘍細胞株を知るためにATCCカタログを参照するであろう。細胞株の例として
はJ82、RT4、ScaBER、T24、TCCSUP、5637、SK−N
−MC、SK−N−SH、SW1088、SW1783、U−87MG、U−1
18MG、U−138MG、U−373MG、Y79、BT−20、BT−47
4、MCF7、MDA−MB−134−VI、MDA−MD−157、MDA−
MB−175−VII、MDA−MB−36、SK−BR−3、C−33A、H
T−3、ME−180、MS751、SiHa、JEG−3、Caco−2、H
T−29、SK−CO−I、HuTu80、A−253、FaDu、A−498
、A−704、Caki−1、Caki−2、SK−NEP−1、SW839、
SK−HEP−1、A−427、Calu−1、Calu−3、Calu−6、
SK−LU−1、SK−MES−1、SW900、EB1、EB2、P3HR−
1、HT−144、Malme3M,RPMI−7951、SK−MEL−1、
SK−MEL−2、SK−MEL−3、SK−MEL−5、SK−MEL−24
、SK−MEL−28、SK−MEL−31、CaoV−3、CaoV−4、S
K−OV−3、SW626、Capan−1、Capan−2、DU145、A
−204、Saos−2、SK−ES−1、SK−LMS−1、SW684、S
W872、SW982、SW1353、U−2OS、Malme−3、KATO III、Cate−1B、Tera−1、Tera−2、SW579、AN3
CA、HEC−1−A、HEC−1−B、SK−UT−1B、SW954、NC
I−H69、NCI−H128、BT−483、BT−549、DU4475、
HBL−100、Hs578Bst、Hs578T、MDA−MB−330、M
DA−MB−415、MDA−MB−435S、MDA−MB−436、MDA
−MB−453、MDA−468、T−47D、Hs766T、Hs746T、
Hs695T、Hs683、Hs294T、Hs602、JAR、Hs445、
Hs700T、H4、Hs696、Hs913T、Hs729、FHs173W
e、FHs738B1、NIH、0VCAR−3、Hs67、RD−ES、Ch
aGo K−1、WERI−Rb−1、MCI−H446、NCI−H209、
NCI−H146、NCI−H441、NCI−H82、H9、NCI−H46
0、NCI−H596、NCI−H676B、NCI−H345、NCI−H8
20、MCI−H520、NCI−H661、NCI−H510A、D283M
ed、Daoy、D341Med、AML−193、及びNV4−11などであ
る。
タログを参照すれば良い。また、特定の細胞タイプが望ましい場合は、そうした
細胞を入手するための手段及び/又はその供給源はこの特別の分野の当業者には
公知であろう。科学的文献を分析すれば、標的とするのに望ましいいずれの腫瘍
細胞タイプでも容易に選択することができるであろう。
る。固体腫瘍抗原に対して向けられる非常に多数の抗体が知られている。いくつ
かの有益は抗腫瘍抗体を上に示した。しかしながら、当業者には良く知られてい
るように、上に示した抗体のうちのいくつかは適切な生化学的特性をもっていな
い場合もあり、又、治療的に有用なほど十分に腫瘍特性を示さない場合もある。
1つの例は細胞質抗原を認識するMUC8−22である。こうした抗体はモデル
・システムあるいはスクリーニング・アッセイなどの調査的な実施の形態でのみ
使われる。
胞表面上でアクセスでき、そして好ましくは、あるいは特に腫瘍細胞で表現され
る高原を認識する。こうした抗体はまた好ましくは200nM以下のKd、好ま
しくは100nM以下の高親和性を示すと同時に、心臓、腎臓、肝臓、骨髄、結
腸、乳房、前立腺、甲状腺、胆嚢、肺、副腎、筋肉、神経組織、膵臓、皮膚、あ
るいはその他の人体の生命を維持する器官又は組織など生命を支える正常な組織
との重大な反応を行わない。低活性の観点からみて本発明の目的にとって最も重
要な『生命維持』組織は心臓、腎臓、中枢及び抹消神経組織及び肝臓である。こ
こで用いられている『有意な反応』とは免疫組織学的に適切な条件下で特定の組
織に適用された場合にまったく染色効果を示さないかほとんど無視できる程度の
染色効果しか示さず、ほとんどネガティブな細胞のフィールドにほんのわずかの
ポジティブな細胞が分散されているような状態を示す。
選択性を示すものである。例えば、多くの乳癌、肺癌、及び結腸癌の表面に選択
的に見出されるTAG72及びHER−2プロト・オンコジーン蛋白質(Tho
rら、1986、Cocherら、1987、Shepardら、1991);
MOv18及びOV−TL3及び牛乳ムチン・コア蛋白質及びヒト母乳脂肪小球
に結合する蛋白質(Miottiら、1985;Burchelら、1983)
;及び高Mr黒色腫抗原(Reisfeldら、1982)などである。さらに
有益な抗体はほとんどすべての卵巣癌腫内で均等に表現されることが知られてい
る 葉酸結合蛋白質に対する抗体、鱗状細胞黒色腫や多くの神経膠腫で過剰表現され
るerb系列のオンコジーンに対する抗体、そして、進行中の臨床前又は臨床評
価の対象であることが知られている他の抗体である。
2及びSM3はこの分野で日常的に行われている標準的な前臨床テストの後に行
われる臨床的実施の形態においての使用に特に適していると考えられている。B
3(米国特許第5,242,813号,Brinkmannら、1991)はA
TCC受託番号No.HB10573を有しており、KS1/4は米国特許第4
,975,369号に述べられているようにつくりだすことが可能であり、D6
12(米国特許第5,183,756号)はATCC受託番号No.HB979
6を有している。
的な特性を示すのではなく、その腫瘍細胞そのものに関係している。従って、発
明者らは腫瘍細胞に優先的に結合するいずれの抗体でもトリテルペン向標的接合
体の向標的成分として用いることができると考えている。この優先的腫瘍細胞結
合もその腫瘍細胞に対して高い親和性を示し、そして上に定義されているように
生命を維持する正常な細胞や組織と重大な反応を行わない抗体に基づいている。
リコシドのターゲッティングで使用するための抗体を発生させるいくつかの手段
を提供する。腫瘍細胞固有抗体を発生させるためには、先ず腫瘍細胞抗原で構成
される組成物で動物を免疫化し、そして、以下に詳細に述べるようにその結果と
してできる適切な特性を有する抗体を選択する。免疫化のために用いる組成物は
精製された、あるいは部分的に精製された上に列挙された抗原のうちのいずれか
の製剤、上に列挙された抗原のうちのいずれかが増強された膜製剤などの組成物
、あるいは上に列挙した細胞タイプのいずれかを含む細胞の混合物あるいは群を
含んでいる場合もある。
は、事前に臨床的に対象とされる腫瘍が最終的に選択された抗体を表現すること
を事前に確認しておくことが必要であろう。これは例えば外科的バイオプシーな
どの腫瘍組織サンプルの抗原性テスト、あるいは抗原循環テストを行うなどの手
順を含んでいる。これはハイブリドーマの『バンク』から入手した結合親和性を
腫瘍に対する反応性に関してテストするELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ
)などの免疫スクリーニング・アッセイによって簡単に行うことができる。次に
本発明による抗体を調製するために適切な腫瘍選択性及び親和性を示す抗体を選
択する。
原が、最初の抗原がヒト細胞から得られたものに加えてマウスや霊長類などの動
物から誘導された免疫化手順からもたらされる場合もある。ヒト由来の抗原が用
いられる場合は、それらはヒトの腫瘍細胞株から得られたり、あるいは治療を必
要とする特定の患者から採取した生物学的サンプルを入手して調製することも可
能である。実際、その患者の腫瘍に『合わせてつくられる』抗体の調製方法も知
られており(Stevensonら、1990)、この発明との組み合わせで使
用することが考えられる。
。例えば、患者や特定の組織タイプの築堤の領域に対して固有性を示す抗体をつ
くりだすことができる。これらの抗体はその後本発明によるトリテルペン化合物
に接合して、それによってその抗体が向けられる組織にトリテルペン化合物を向
かわせることが可能になる。こうした抗体の具体例は腫瘍細胞に結合するもので
ある。本発明の好ましい実施の形態においては、抗体はモノクローナル抗体であ
る。モノクローナル及びポリクローナル抗体を調製し、その特徴づけを行うため
の手段はこの技術分野ではよく知られており、以下に具体的に開示される(Ho
well及びLane、1988参照)。
免疫化して、その免疫化された動物から抗血清を回収することである。幅広い動
物種が抗血清をつくるために用いることができる。通常、抗−抗血清をつくるた
けに用いられる動物はウサギ、マウス、ラット、ハムスター、豚あるいは馬など
のヒト以外の動物である。ウサギは血液量が比較的多いので、ポリクローナル抗
体をつくりだすためにはウサギが好ましい。
この分野の当業者にはよく知られているように通常の免疫化技術を用いて調製す
ることができる。特定の細胞タイプの抗原エピトープを含む組成物、あるいは本
発明による化合物を用いて、ウサギやマウスなどの1つ又は複数の実験動物を免
疫化するために用いることができ、これらの動物はその抗原に対する固有の抗体
をつくりだす。ポリクローナル抗血清は抗体発生を可能にする時間が経過した後
、単にその動物から採血し、全血から血清サンプルを調製することで入手できる
。
によるトリテルペン化合物の存在に関するスクリーニングに対して適用できる免
疫化学手順、あるいは特定の抗原に固有な抗体を用いることができる他の手順に
おいて有効に適用することができると考えられる。上に検討されているように、
本発明による抗体の使用の具体的実施の形態は腫瘍固有抗原に向けられた抗体を
調製し、それらの抗体を本発明によるトリテルペン化合物に結合させ、患者であ
るヒトをその抗原−トリテルペン接合体で措置し、それによって本発明のトリテ
ルペン化合物を本発明によるトリテルペン化合物で措置できる状況に関与してい
腫瘍細胞あるいは他の細胞に向けさせるステップを含んでいる。一般的に、種々
の抗原に対するポリクローナル及びモノクローナル両方の抗体を本発明の種々の
実施の形態で用いることができる。例えば、それらは抗体親和性カラム内でトリ
テルペン化合物を精製するために用いることができる。そうした抗体を調製し特
徴づけを行う手段はこの技術分野では良く知られており、例えば、Harlow
及びLane、1988に述べられており、その開示は参照によってその全体が
本明細書に含まれる。
合がある。従って、ペプチドやポリペプチド免疫源を基質に結合させることによ
って行うことばできるようにホストの免疫システムを発動させることが必要なこ
とがしばしばある。例示的な、そして好ましい基質はキーホール・リンペット・
ヘモシアニン(KLH)、及びウシ胎児血清アルブミン(BSA)である。オバ
ルブミン、マウス血清アルブミン、あるいはウサギ血清アルブミンなどのその他
のアルブミンは基質として用いることができる。ポリペプチドを基質蛋白質に接
合するための手段はこの技術分野でよく知られており、グルタルアルデヒド、m
−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシサクシンイミド、カルボニルイミド、
及びビス−ビアゾ化ベンジジンなどが含まれている。
ジュバンドとして知られている非固有刺激剤の使用によって増強することができ
る。好ましいアジュバンドの具体例としては、完全フロイド・アジュバンド(殺
されたMycobacterium tuberculosisを含む免疫応答の非固有刺激剤)、不完全フ
ロイド・アジュバンド、及び水酸化アルミニウム・アジュバンドなどである。
性質と免疫化に用いられる動物によって変化する。免疫源を投与するためには種
々(皮下、筋肉内、皮膚内、静脈内、及び腹膜内)の経路を用いることができる
。ポリクローナル抗体の生産は免疫化の後、種々の時点で免疫化された動物の血
液を採取することによってモニターすることができる。第二のブースターである
注射を行ってもよい。このブースト及び滴定工程は適切な滴定が行われるまで繰
り返される。望ましいレベルの免疫源性が得られたら、免疫化された動物から採
血し、血清を単離、保存し、及び/又はその動物を用いてmAbを発生させるこ
とができる。
の技術を用いて簡単に調製することができ、その開示は参照によってその全体が
本明細書に組み込まれる。通常、この技術は選択された免疫源組成物、例えば精
製された、あるいは部分的に精製された腫瘍固有抗原、ポリペプチドあるいは腫
瘍細胞で適切な動物を免疫化するステップを含んでいる。この免疫化組成物は抗
体生産細胞に刺激を与えるのに有効な方法で投与される。マウスやラットなどの
けっ歯類が好ましい動物であるが、ウサギ、ヒツジあるいはカエルの使用も可能
である。ラットの使用は一定の利点を提供してくれるが(Goding、198
6)、マウスの使用が好ましく、BALB/cマウスは最も日常的に使われてお
り、一般的に高い割合の安定した細胞融合をもたらすので、その使用が最も好ま
しい。
(B−細胞)がmAb発生手順での使用に選ばれる。これらの細胞はバイオプシ
ーを受けた脾臓、扁桃腺、あるいはリンパ節から、あるいは抹消血液サンプルか
ら得ることができる。脾臓細胞及び抹消血液細胞が好ましく、前者が好ましいの
はそれらが分裂中の細胞芽段階である抗体生産細胞の豊富な供給源であり、後者
が望ましいのは末梢血液は入手しやすいからである。多くの場合、一群の動物を
免疫化し、そして抗体力価が最も高い動物の脾臓を取り出して、その脾臓のリン
パ球をその脾臓を注射器を使って均一化することで入手する。通常、免疫化され
たマウスから得られた脾臓は約5x107から2x108個のリンパ球を含んでい
る。
免疫化された動物と同じ種のひとつと融合させられる。ハイブリドーマ生産融合
手順での使用に適した黒色腫細胞株は抗体を生産せず、高融合効率を有し、さら
にその細胞が望ましい融合細胞(ハイブリドーマ)だけの成長を支える一定の選
択的な媒体中で成長できなくさせるような酵素欠陥を有している。
いることができる。例えば、免疫化された動物がマウスである場合、P3−X6
3/Ag8、P3−X63−Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp21
0−Ag14、FO、NSO/U、MPC−11、MPC11−X45−GTG
1.7、及びS194/5XX0Bulを用いることができ、ラットの場合は、
R210.RCY3、Y3−Ag1.2.3、IR983F及び4B210を使
うことができ、U−266、GM1500−GRG2、LICR−LON−HM
y2及びUC729−6はすべて細胞融合との関連で使用すると有益である(例
えば、Goding、1986;Campell、1984;ATCCカタログ
参照)。
は通常、体細胞を骨髄腫細胞を2:1の比率で混合するステップを含んでいるが
、その比率は細胞膜の融合を促進する1つ又は複数の薬剤(化学又は電気的)の
存在下で約20:1から約1:1の範囲で変化する。Sendaiウイルスを用
いた融合方法が開示されており(Kohler及びMilstein、1975
;1976)、及びGefterら(1977)による37%(v/v)PEG
などのポリエチレン・グリコール(PEG)を用いたもの参照)。電気的に誘導
した融合方法の使用も適している(Goding、1986)。
ドをつくりだす。しかしながら、成長可能な融合細胞は選択的媒体中で培養する
ことで親の、融合していない細胞(特に通常は無限に分裂しつづける未融合骨髄
腫細胞から分化されているので、これは問題を発生させない。この選択的媒体と
は通常組織培養媒体中でヌクレオチドの新しい合成を防ぐ薬剤を含んだものであ
る。好ましい薬剤の例としてはアミノプテリン、メトトレキセート、及びアザセ
リンである。アミノプテリン及びメトトレキセートはプリン及びピリミジン両方
の新しい合成を防ぐのに対して、アザセリンはプリン合成だけを防止する。アミ
ノプテリンあるいはメトトレキセートを用いた場合は、媒体にヌクレオチド(H
AT媒体)の供給源としてのヒポキサンチン及びチミジンを追加する。アザセリ
ンを使用する場合には、媒体をヒポキサンチンで補う。
ることができる細胞だけがHAT媒体中で生き延びることができる。骨髄腫細胞
は例えばヒポキサンチン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ(HPRT)な
どのサルベージ経路中の鍵となる酵素が欠陥を含んでおり、生き延びることはで
きない。B細胞はこの経路を作動させることはできるが、培養中の寿命は限定さ
れており、通常は2週間程度で死んでしまう。従って、この選択的媒体中で生き
延びる細胞だけが骨髄腫とB細胞から形成されるハイブリッドである。
レーションが提供される。通常、ハイブリドーマの選択はその細胞をマイクロタ
イター・プレート内で単一クローン希釈で培養し、その後に望ましい反応につい
て(2、3週間後に)個々のクローン上澄液をテストすることで行われる。この
アッセイは放射免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ、細胞毒性アッセイ、プラーク
・アッセイ、点免疫結合アッセイなどとどうように非常に敏感、簡単、しかも迅
速に行うことができる。
れ、それらのクローンは無限に増殖してmAbを提供する。これらの細胞株はm
Ab生産のために2つの基本的な方法でつくりだすことができる。このハイブリ
ドーマの1つのサンプルは、最初の融合のために体細胞と骨髄腫細胞を提供する
ために用いられたタイプの組織学的に適応性のある動物内に(多くの場合は腹膜
内凹部に)注入することができる。注入を受けた動物は融合された細胞ハイブリ
ッドによってつくりだす特定のモノクローナル抗体を分泌する腫瘍を形成する。
血清や腹水液などの動物の体液を注いでmAbを高濃度で提供することができる
。個々の細胞株をイン・ビボでも培養することができ、その場合、mAbは培地
に自然に分泌され、そこから簡単に高濃度で採取することができる。いずれの方
法でつくりだされたmAbも必要があればろ過、遠心分離、及びHPLC又は親
和性クロマトグラフィーなどの種々のクロマトグラフィー的方法を用いてさらに
精製される。
ペン化合物を腫瘍箇所に向けるために用いることができる。過剰表現されるれる
受容体(例えばエストロゲン受容体、EGF受容体)、あるいは突然変異受容体
である腫瘍抗原に対しては、向標的剤として対応するリガンドを用いることも可
能であろう。
的に結合する成分が存在していてもよい。例えば、腫瘍抗原が過剰表現される受
容体である場合は、その腫瘍細胞がイン・ビボで特定のリガンドで被覆される場
合もある。従って、そのリガンドはそのリガンドに対する抗体、あるいはその受
容体自体の1つの形態で標的に向かわせることができる。これらのタイプの向標
的剤の具体的な例はTIE−1又はTIE−2リガンドに対する抗体、血小板因
子4に対する抗体、そして白血球接着結合蛋白質である。
み合わせで用いられる第二の治療剤が抗体又は成長因子に接合された医薬品、特
に内皮細胞を殺すか、あるいはその成長あるいは細胞分裂を抑制する能力を有す
る細胞に対して毒性を有するか、あるいはその他の抗細胞薬であることも想定さ
れる。本発明は全体としてここで述べられているトリテルペン化合物を含め、あ
るいはそれを補うものとして、向標的薬剤に接合させ、活性形態で標的とされた
腫瘍細胞に活性形態で提供することができるいずれかの医薬品、好ましくは抗体
の使用を想定している。抗細胞薬の例としては化学治療剤、放射性同位元素、及
び細胞毒素などである。化学治療剤の場合、本発明者らはステロイド・ホルモン
、シトシン・アラビノシド、フルオロウラノシル、メトトレキセート、又はアミ
ノプロテインなどの抗代謝剤、アントラサイクリン、ミトミシンC、ビンカ・ア
ルカロイド、デモコルシン、エトポシド、ミトラミシン、あるいはクロラムブシ
ル又はメルファランなどの抗腫瘍アルキレート剤などが特に好ましい。他の実施
の形態としてはサイトカイン、成長因子、バクテリア性内毒素、あるいはバクテ
リア性内毒素の脂質A部分などを含んでいる場合もある。いずれにせよ、こうれ
らの薬剤は、望ましい場合、本発明によるトリテルペン化合物と共に向標的薬、
好ましくは抗体に対して、公知の接合技術を用いて必要とされる標的細胞の箇所
の血液成分に対する向標的、内部化、放出、あるいは提示を可能にするような方
法でうまく結合させることができる(例えば、Ghoseら、1983及びGh
oseら、1987参照)。
揮することが示されている(例えば、Vaickusら、1991参照)。調査
された抗腫瘍薬の例としてはドキソルビシン、ダウノマイシン、メトトレキセー
ト、ビンブラスチン、その他いろいろである(Dilmanら、1988、Pi
eterszら、1988)。さらに、ネオカルジノスタチン(Kimuraら
、1983)、マルコマイシン(Manabeら、1984)、トレニモン(G
hoseら、1982)、及びα−アマニチン(Davis及びPreston
、1981)など他の薬剤の取り付けも報告されている。本発明によるトリテル
ペン化合物と適当な向標的分子との間の接合体を調整するための具体的な方法は
上に具体的に開示してある。
用分野を意図する。特に、発明者らは本発明によるトリテルペン化合物を溶媒、
抗菌剤、抗ウィルス剤、殺魚剤あるいは殺軟体動物剤、避妊薬、抗寄生虫剤、紫
外線防護剤、去痰剤、利尿剤、抗炎症剤、コレステロール代謝調整剤、心臓欠陥
刺激剤、抗潰瘍剤、鎮痛剤、鎮静剤、免疫調整剤、解熱剤、血管形成調節剤、毛
細血管の虚弱さを低下するための薬剤、加齢の影響を防ぐための薬剤、そして認
識と記憶を改善するための薬剤として使用することを意図する。
いは新血管形成とは新しい血管の成長として定義される。腫瘍及び癌は血管形成
を誘発して腫瘍は存続するために酸素と栄養のためのライフ・ラインを提供する
。新しい血管の形成は悪性癌細胞が身体の他の部分に拡散するための出口として
の役割も果たす。血管形成の抑制は従って癌患者には恩恵をもたらす。一方、血
管形成は傷の治癒などの場合には必要となる。これらの傷は外部的な傷である場
合もあれば、事故や火傷や障害や手術の結果として生じる内部器官の傷である場
合もある。従って、血管形成を促進させる薬剤は傷治療での使用に大きな可能性
を有している。
。特に、本発明の化合物及び栄養薬組成物は患者としてのヒトにおける血清コレ
ステロール・レベルを低下させるための使用が考えられる。従って、患者を経口
投与か静脈注射で本発明のトリテルペン化合物で措置することで、高コレステロ
ール及びその他の関連する心臓血管系疾患に関連した不全を減らすことができる
。
ため、そしてさらには血管を置換させて高血圧を緩和するために用いることも考
えられる。
。本発明による活性トリテルペン化合物は免疫反応において重要な役割を果たす
転写因子NF−kBの強力な抑制因子であることが示されている。この知見は発
癌における炎症反応の中心的な役割を示す証拠が増大していることを考えると特
に重要である。トリテルペン化合物による患者の措置は従って腫瘍発生及び組織
的損傷を含めて炎症に関連した幅広い不全状態を緩和してくれる可能性を有して
いる。
基性ポリペプチド及び蛋白質の放出の増大によって特徴づけられる。これは血腫
及び水腫形成を伴なっている。その後、細胞浸潤と新しい結合組織の形成が見ら
れる。本発明の化合物による治療は炎症の効した初期段階を抑制し、それによっ
て炎症状態に関連した否定的な影響を減少させることができる。
たのは、一部には乾燥した地域に自生しているからである。これらの地域に自生
している植物の代謝の1つの重要な機能は細胞を紫外線照射から守る化合物をつ
くりだすことである。発明者らは特に、本発明のトリテルペン化合物はそうした
紫外線防止剤として利用できると考えている。従って、本発明の化合物は紫外線
照射からの防護が望ましいような応用例で幅広く使用できると考えられる。例え
ば、適切な応用例は、本発明の化合物を日焼け防止剤や、ヒトの皮膚に適用する
ための他の同様のローションの成分としての使用である。
れる化学的防護効果によって示される。本発明によるトリテルペン化合物を含ん
だローションや日焼け防止剤は、従って皮膚癌に対する種々の前兆症状を有して
いる人々に対して特に適している。それらの事例としては正常な皮膚を有してい
るが皮膚癌の遺伝子的兆候を含んでいる人々が含まれる。こうした兆候としては
遺伝される突然変異、あるいは紫外線誘発損傷に対するDNAによる修理を媒介
する細胞メカニズムにおける突然変異を含んでいる。特に重要なのは遺伝子的修
理メカニズム、例えば、紫外線誘発チミン−チミン二量体の除去などを制御する
遺伝子における突然変異である。同様に、本発明による化合物は紫外線防御の増
強が望まれる他の組成物に加えることができると同時に、紫外線崩御が求められ
る生きた、あるいは生きていないいずれの対象に対してでもこれらの化合物を適
用することができる。
憶喪失の回復や認識機能の増強、(血液中の酸化性分子のレベルをモニタリング
する)酸化防止剤としての利用、あるいは高血圧や関節炎の阻止のための窒素酸
化物(NO)の増加などである。加えて、発明者らはペニス機能の強化に本発明
によるトリテルペン化合物を局所的に適用することを考えている。又、皮膚コラ
ーゲンを増大させるために本発明による化合物を局所的に投与して、それによっ
て皮膚老化を防止することを発明者らは考えている。
のさらに特徴付けるために用いることができる。これらには生物学的活性のアッ
セイと化学的特性のアッセイが含まれる。これらのアッセイの結果は化合物の特
性及びそれらのヒトやその他の哺乳動物の患者に対する適用可能性に対して重大
な示唆を提供してくれる。この点で特に実用性があると考えられるアッセイは生
物学的活性のイン・ビボ及びイン・ビトロでのスクリーニング及び免疫アッセイ
である。
間に認められる同一性は可能性のある治療薬、例えば本発明によるトリテルペン
化合物の機能を調べる優れた可能性を提供してくれる。ヒト及び他の哺乳動物の
癌について高度に示唆的なマウスでの癌モデルを用いることができる。これらの
モデルでは擬似一次及び/又は転移癌に対する腫瘍細胞の局所矯正的又は全身的
投与を用いることができる。又、悪性形質変換及び/又は腫瘍進行に関連したい
くつかの事象に関与していることが分かっている薬剤を提供することで動物内に
癌を発生させることができる。
プを含んでいる。投与は経口、鼻腔経由、頬、直腸、膣経由、あるいは局所投与
などを含む臨床及び非臨床目的の竹に用いることができるいずれの経路を通じて
でも行うことができる。又、投与は気管吸入、気管支吸入、皮膚内、皮下、静脈
内、腹膜内、あるいは筋肉内注射などによって行うことができる。全身的静脈注
射、血管やリンパ管を介しての領域的投与、そして腫瘍内投与などが特に想定さ
れる。
なった基準が関与してくる。こうした基準には、生残、腫瘍の重さ又は執拗の減
少、腫瘍進行の停止あるいは速度の低下、腫瘍の根絶、転移の抑止又は防止、活
性レベルの増強、免疫効果因子機能の改善、及び食物接種の改善などである。
デルの使用を含んでいる。多段階発癌の最も良く理解された実験モデルの1つで
あるマウス皮膚モデルは癌の発達における3つの異なった段階、開始、促進、及
び進行の段階を明らかにした。現在では、悪性状態への細胞の移行はその遺伝子
生成物が信号伝達及び/又は遺伝子発現の規制に関与するプロト−オンコジン及
び/又は腫瘍抑制遺伝子の連続的な変化が関与していることが明らかになってい
る。皮膚腫瘍の促進及び進行段階は選択的及び持続的な過形成、分化変性、そし
て最初の細胞の乳頭腫や癌腫への固有の拡大につながる遺伝子の不安定性によっ
て特徴付られている。持続的な過剰形成の誘発はホルボル・エステル、いくつか
の過酸化物、及びクリサロビンなど種々の薬剤の皮膚腫瘍促進活性とかなり関係
していることが示されている。マウス皮膚モデルにおいては、すべての知られて
いる癌腫及び腫瘍促進因子が持続的な上皮過剰形成を発生させることが示されて
いる。一般的に、この減少の前に炎症減少が観察される。
とんどの腫瘍開始薬剤は細胞のDNAに共有結合で結びつく求電子性反応物質を
発生させるか、代謝的にそれに変換される。一部の遊離基及び修正されたDNA
基は発癌の腫瘍開始及び/又は腫瘍促進段階で組み込まれた遊離基である。Ha
−ras遺伝子の活性化はマウス皮膚発癌のプロセスにおける初期に起き、恐ら
く開始事象と同等であることを強力な証拠が示唆している。例えば、7,12−
ジメチルベンズ(ザ)アントラセンによって誘発されたマウス皮膚水腫及び癌腫
内における活性化されたc−Ha−ras遺伝子の存在はコドン61でのA−T
交差の高い頻度との関係していることが示されている。その後の研究で、このタ
イプの突然変異が化学的開始因子に依存しており、促進遺伝子とは無関係である
ことが示されており、これは開始因子がc−Ha−rasに対して直接影響を及
ぼすことを示唆している。さらに、ウイルスによって活性化されたHa−ras
遺伝子(v−Ha−ras)によるマウス皮膚の感染は二段階発癌においてさえ
、開始の契機として寄与することができる。強調しておかねばならないのは、皮
膚化学発癌と皮膚腫瘍開始因子がすべてHa−rasオンコジーンで突然変異を
起こすことが示された点である。
な薬剤との混合物は基本的にはヒトを対象として使用する前にイン・ビボでテス
トしなければならない。動物におけるこうした臨床前テストはこの分野では日常
的に行われることである。こうした確認テストを行うために必要なのは問題の疾
患のこの技術分野で受け入れられている固体腫瘍を持った動物などの動物モデル
である。マウスやラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、チンパンジ
ーなどどのような動物でもそうした目的で使用することができる。癌治療との関
連では、マウスなどの小動物を用いた研究がヒトにおける臨床的有効性を示すも
のとして広く受け入れられており、そうした動物モデルは少なくとも他の実験動
物と比較して簡単に入手することができ、比較的安価であるので本発明の目的の
ためには好ましい。
たテストを実施するために必要なのは同等の措置グループを確立して、テスト化
合物を1つのグループに投与し、残りのグループで同等の動物を用いて種々の比
較的研究を併行して行う。この研究中に動物を観察して、最後にその動物を致死
させて措置の効果を分析する。
腫瘍脈管に対する具体的な影響と抗腫瘍効果全体を判定するために抗腫瘍研究を
行うことができる。そうした研究の一部として、動物の全体的な健康状態を含め
それらの影響の特性について観察を行うべきである。
細胞の少なくとも約10%がアポトーシスあるいはアポトーシスを示す量である
。好ましくは特定の箇所の少なくとも約20%、約30%、約40%、あるいは
約50%の細胞が殺されることである。最も好ましくは腫瘍箇所の細胞の100
%が殺されることである。
の比較で評価される。動物において重大な副作用やその他の望ましくない反応が
生じない限り、少なくとも約60%、約70%、約80%、約85%、約90%
、そして100%のアポトーシスを誘発することができる本発明による化合物の
用量を用いることが好ましいであろう。すべてのそうした判断、評価は当業者で
あれば簡単に行うことが可能である。例えば、助手や科学者や医師は実験動物か
ら得たそうしたデータをヒトの治療に対する適切な用量の最適化のために用いる
ことができる。病気が進行している人の場合は、ある種の副作用も許容されるで
あろう。しかし疾病の初期段階の患者の場合は副作用なしで相当の治療効果を挙
げるためにより控えめな用量で措置を行うべきである。こうした実験動物を用い
た研究で観察できる効果は好ましくは比較対象レベルを統計的にかなり上回るも
のでなければならず、また研究毎に再現可能でなければならない。
本発明による化合物の組み合わせや用量でも本発明との関連では有効であること
が理解できるであろう。例えば、活性薬剤の継続的な適用が考えられるような実
施の形態においては、10%程度の壊死しかもたらさない初回用量でも、この初
回の腫瘍細胞の減少がその後の治療の再適用に際してさらに破壊的な効果を『準
備する』ことがしばしば観察されるので、有効である。いずれにせよ、約40%
程度の腫瘍抑制が最終的に達成されなくても、措置前の患者の状態より前進を示
しているという点で、血栓や壊死がいずれの程度にせよ誘発されるということは
有益である。さらに、転移や新しい発癌の可能性を防いだり低下させたりする本
発明による化合物の用量はその措置を受ける患者にとっては治療的利点をもたら
すであろう。
が意図される薬剤の組み合わせは同時にテスト、最適化されねばならないことは
当然理解されるであろう。本発明の化合物は1つ又は複数の化学療法薬、免疫毒
素、凝固結合剤などとの組み合わせで簡単に分析することができる。こうした薬
剤の組み合わせ効果の分析は上に述べたような基準に照らして判定、評価される
。
物を識別するために、植物抽出物のスクリーニングがイン・ビトロで行われる。
腫瘍細胞を殺すこと、あるいは細胞毒性は一般的には壊死又はアポトーシスによ
って示される。壊死は外部的な信号で引き起こされる比較的一般的な経路である
。このプロセス中に、細胞膜及び細胞室の一体性が失われる。一方、アポトーシ
ス(アポトーシス)、又はプログラムされたアポトーシスは特定の遺伝子の活性
化及び非活性化によって調整される高度に組織化された形態学的事象のプロセス
である(Thompsonら、1992;Wyllie,1985)。
ルを選択された植物抽出物に系統的に露出することである。これらのアッセイを
行うのに適したアッセイ及び腫瘍細胞株は当業者には良く知られている。抗腫瘍
活性のイン・ビトロ・アッセイにおいて使用するための特に有効なヒト腫瘍細胞
株はヒト卵巣癌細胞株SKO−3、HEY、OCC1、及びOVCAR−3;J
urkat T−白血病細胞;MDA−468ヒト乳癌株;LNCaPヒト前立
腺癌細胞、ヒト黒色腫腫瘍細胞株A375−M及びHs294t;及びヒト腎臓
癌株769−P、786−0、A498である。比較対象として使用するのに適
した好ましいタイプの正常な細胞株はヒトFS又はHs27包皮腺維芽細胞であ
る。
細胞周期の停止に関与する遺伝子(p21、p27;サイクリン依存キナーゼイ
ンヒビター)及びアポトーシスに関与する遺伝子(bcl−2、bcl−x1、
及びbax)の表現と誘発のアッセイによって行うことができる。このアッセイ
を行うためには、細胞をテスト化合物で処理して細胞溶解し、蛋白質を単離して
、その後SDS−PAGEゲル上で分離して、ゲルと結合した蛋白質をニトロセ
ルロース膜上に移す。この膜を先ず一次抗体(例えば、p21、p27、bax
、bcl−2、及びbcl−x1などに対する抗体)でプローブして、次にホー
スラディッシュ・ペルキシダーゼ接合二次抗体で検出して、膜をECL検出試薬
に露出させ、その後、ELC写真フィルム上で視覚化する。蛋白質の相対的な割
合の分析を通じて、与えられたステージ、例えばG0/GIフェーズ、Sフェー
ズ、あるいはG2/Mフェーズにおける細胞の割合に関する推定を行う。
でもイン・ビトロで効率的に判定することができる。この方法においては、細胞
は培養プレートに入れられ、種々の濃度のサンプル化合物に露出させて培養し、
そして、MTT(3−(4,5−ジメチルエチアゾル−2−yl)−2,5−ジ
フェニル・テトラアゾニウム・ブロマイド;Shigma Chemical社
)又は結晶バイオレットのいずれかで染色を行う。MTTで処理したプレートに
細胞溶解緩衝液(20%硫酸ドデシル・ナトリウムを50%DMFに溶かしたも
の)を入れて、さらに培養してから570nmでODの読取りを行う。決勝バイ
オレット・プレートをSorenson緩衝液(0.1Mシュウ酸ナトリウム(
pH4.2)、50%v/vエタノール)で洗浄して染料を抽出し、そして、5
70−600nmで読取りを行う(Mujooら、1996)。相対的な吸収度
は発生した細胞毒性の尺度となる。
入手するためにアカシア・ビクトリアエ以外の植物種からの抽出物をスクリーニ
ングする際に用いることができるであろう。本発明で想定されている免疫アッセ
イは米国特許第4,367,110号(二重モノクローナル抗体サンドウィッチ
・アッセイ)及び米国特許第4,452,901号(ウェスタン・ブロット)な
どである。他のアッセイとしては、イン・ビトロとイン・ビボの療法でのラベル
されたリガンドの免疫沈降及び免疫細胞化学などである。
る。いくつかの好ましい免疫アッセイは先行技術で知られている種々のタイプの
酵素結合免疫吸着剤アッセイ(ELISA)及びラジオイムノアッセイ(RIA
)である。組織切開を用いる免疫組織化学検出も非常に有益である。
滴定プレートのウェルなど蛋白質親和性を示す選択された表面上で不導態化する
。そして、アカシア・ビクトリアエに関連する植物からの植物抽出物など、本発
明によるトリテルペン化合物を含んでいることが疑われるテスト化合物をそれら
ウェルに加える。結合し、非固有結合免疫複合体を除去するために洗浄した後、
結合した抗原の検出を行う。検出は一般的に望ましい抗原に固有で検出可能なラ
ベルに結合される別の抗体を加えることによって行われる。このタイプのELI
SAは単純な『サンドウィッチELISA』である。検出は望ましい抗原に固有
の二番目の抗体を追加し、その後、第二の抗体に対する結合親和性を有する第三
の抗体を追加することによって行われ、この第三の抗体が検出可能なラベルに結
合される。
リエーションで、望ましい抗原を含んでいることが疑われるサンプルをウェル表
面上に不導態化して、その後、調製された抗体と接触させられた。結合し、適切
に洗浄した後、結合した免疫複合体が検出される。最初の抗原固有抗体が検出可
能なラベルに結合された場合、免疫複合体を直接に検出することができる。再度
、最初の抗原固有抗体に対する結合親和性を有する第二の抗体を用いて、免疫複
合体を検出することができ、第二の抗体は検出可能なラベルに結合される。
合する競合ELISAも可能である。未知のサンプル内の反応性種の量がそのサ
ンプルを被覆されたウェルでの培養前又は培養中に知られているラベルされた種
と混合することによって判定される。サンプル中の反応性種の存在はウェルに対
して結合するのに使えるラベルされた種の量を減らすように働き、従って最終的
な信号量を減らす。
固有的に結合した種を除去するための洗浄、そして結合した免疫複合体の検出な
どいくつかの共通の特徴を有している。それらについて以下に述べる。
体に結合されてもよく、不導態化抗原又は抗体に適用された分析されるサンプル
に結合することもできる。抗原か抗体でプレートを被覆する場合、通常はそのプ
レートのウェルを抗原か抗体の溶液で、一昼夜あるいは特定の期間培養する。そ
の後プレートのウェルを洗浄して、不完全にしか吸着されていない物質を取り除
く。それらのウェルのいずれの残っている利用可能な表面もテスト抗血清に関し
て抗原的に中性の非固有蛋白質で『被覆する』。これらにはウシ胎児血清アルブ
ミン(BSA)、カゼイン、及び粉ミルク溶液などがある。被覆することで不導
態化された表面上での非固有吸着際とのブロックが可能になり、従って、抗血清
のそれら表面への非固有結合によって起きるバックグランドが減少する。
方がより一般的に行われている。従って、ウェルに対する抗原や抗体の結合、バ
ックグランドを減らすための非反応性物質による被覆、そして未結合物質を除去
するための洗浄の後に、不導態化された表面を免疫複合体(抗原/抗体)形成を
可能ならしめるのに有効な条件の下で臨床的あるいは生物学的サンプルと接触さ
せられる。そして免疫複合体の検出はラベルされた二次結合リガンド又は抗体、
あるいはラベルされた三次抗体あるいは第三の結合リガンドに接合した二次結合
リガンドか抗体を必要とする。
いうことは、それらの条件はそれらの抗原及び抗体をBSA、ウシ胎児・ガンマ
・グロブリン(BCG)及びリン酸緩衝食塩水(PBS)/Tweenで希釈す
ることを含んでいる。これらの付加された薬剤は非固有バックグランドの減少を
促進する傾向を有している。
ることも意味している。培養ステップは通常約1−2あるいは4時間、好ましく
は25℃−27℃の温度範囲で行われ、あるいは一昼夜、4℃程度の温度で行わ
れる場合もある。
た表面は非複合物質を除去するために洗浄される。この洗浄ではPBS/Twe
en、あるいは硼酸塩緩衝液が用いられることが多い。テスト・サンプルと最初
に結合された物質との間の固有の免疫複合体が形成され、その後に洗浄が行われ
たら、微量の複合体の発生でも判定することができる。
ベルと組み合わされている。好ましくは、これは適切な発色物質と共に培養され
ると発色する酵素である。従って、例えば、PBS−TweenなどのPBS含
有溶液中で室温で2時間の培養など、さらに免疫複合体形成を発展させるのに有
利な期間と条件の下で、ウレアーゼ、グルコース・オキシダーゼ、アルカリ性ホ
スファターゼ又は過酸化水素結合抗体で第1又は第2の免疫複合体を接触、培養
することになるであろう。
くために洗浄をしてから、例えば、酵素ラベルとしてのペロキシダーゼの場合は
、尿素とブロモクレゾール・パープル、あるいは2,2’−アジノ−ジ−(3−
エチル−ベンズチアゾリン−6−スルホン酸[ABTS]及びH2O2などの発色
性基質で培養することで、ラベルの量を定量する。そして定量化は、例えば、可
視スペクトル分光光度計を用いて発色の程度を測定することで行われる。あるい
は、ラベルは化学的蛍光によるものであってもよい。こうしたラベルの使用は米
国特許特許第5,238,687号及び第5,221,605号に開示されてい
る。
織や細胞、あるいは細胞抽出物への結合を評価するステップを含んでいる。これ
らは当業者が十分に把握している通常の技術範囲である。例えば、腫瘍細胞抗原
に対する抗体は新鮮凍結及び免疫組織化学(IHC)による研究のために調整さ
れたフォルマリン−固定、パラフィン埋め込み組織ブロックの両方との組み合わ
せで用いることができる。各組織ブロックは50mgの残留『微粒化』腫瘍で構
成される。これらの粒子化された標本から組織ブロックを調製するための方法は
種種の診断ファクター、例えば、乳癌などに関してこれまでに行われたIHC研
究でうまく使われており、当業者には良く知られている。
でPBS中で室温で再水和し、遠心分離によってそれら粒子をペレット化し、そ
れらを粘性埋め込み媒体(OCT)内に再懸濁し、カプセルを逆転して遠心分離
で再度ペレット化し、−70℃イソペンタン内でスナップ冷凍し、プラスチック
・カプセルを切断して冷凍された円筒形の組織を取り出し、その円筒形組織をク
リオスタット・ミクロトーン・チャック上に固定し、それそれ平均約500のほ
ぼ無傷な腫瘍細胞を含む25−50の部分に切断することによって調製する。
チューブ内で再水和し、ペレット化を行い、4時間固定化するために10%ホル
マリン内に再懸濁させ、洗浄/ペレット化し、暖かい2.5%寒天製細菌培養基
内に再懸濁し、ペレット化し、その培養基を固化するために氷冷水内で冷却し、
チューブから組織/寒天ブロックを取り除き、ブロックをパラフィン内に浸潤、
埋め込んで、そして最大50個の永続的な部分に切断するステップを含む同様の
方法でつくることができる。
及び生物学的活性を有する化合物を識別するためのスクリーニング・アッセイを
用いることができるであろう。特に、本発明の開示によって、アカシア・ビクト
リアエに密接に関連した植物、例えば真性アカシアのメンバーからの生物学的に
活性のあるトリテルペン・グリコシドに対するアッセイを用いることができるで
あろう。これらのアッセイは種々の異なったフォーマットを用い、スクリーニン
グが行われている『活性』の種類に依存する。好ましいアッセイはここでアカシ
ア・ビクトリアエからの抽出物に関して述べられているような抗腫瘍活性に関す
るスクリーニングに向けられるものを含んでいる。ここで用いられている『抗腫
瘍活性』とは、腫瘍細胞における細胞間信号伝達、成長、転移、細胞分裂、細胞
移動、柔らかい寒天コロニー形成、接触抑制、侵入、血管形成、腫瘍進行及び他
の悪性表現型、あるいはアポトーシスの誘発の抑制を示している。特に、本発明
による化合物を抗菌及び抗ウィルス剤、殺魚剤又は殺軟体動物剤、避妊剤、駆虫
剤、紫外線防止剤、去痰剤、利尿剤、抗炎症剤、コレステロール代謝調整剤、心
臓血管刺激剤、抗潰瘍剤、鎮痛剤、鎮静剤、免疫調整剤、解熱剤、血管形成調整
剤、及び抹消管のもろさを低下させるための薬剤などに使用するステップを含む
機能性アッセイの利用が考えられている。そうしたアッセイは本発明の開示に照
らせば当業者には明らかであろう。活性に関するイン・ビトロ及びイン・ビボで
の直接アッセイの場合と同様、これらのアッセイは本発明による化合物による基
質、リガンド、受容体、あるいはその他の結合パラメータへの結合の抑制という
ステップを含んでいる。
エの組織の利用可能性である。本発明者らは本発明による化合物がアカシア・ビ
クトリアエの根及び実に集中していることを示したので、これらの組織の利用可
能性が非常に重要な意味を有している。発明者らはまた若い苗木が本発明による
化合物を単離するためのもうひとつの供給源であることも示した。アカシア・ビ
クトリアエは米国南西部とオーストラリアに自生しており、従って、この植物組
織は誰でも入手できる。さらに、発明者らはアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション(ATCC),10801 University Blvd.,
Manassas,VA 20110−2209に2500のアカシア・ビクト
リアエの種子を(1988年5月7日に)デポジットしている。これらデポジッ
トされた種子にはATCCアクセッションNo.209835の番号が付されて
いる。このデポジットは微生物のデポジットに関するブカレスト条約の条件と規
定に従って行われたもので、最低30年間の期限で、デポジットされたサンプル
の最も最新の供給依頼がデポジット機関で受け取られてから最低5年間、あるい
は特許の有効期間かいずれか長い方の期間で預託が行われ、その期間中に成長し
ないことが明らかになった場合は新しいサンプルとの取り換えが行われる。
植物を成長させ、本発明によるトリテルペン化合物及び栄養薬組成物を調製する
ためにその植物から組織を単離することができるであろう。また、天然に生えて
いるアカシア・ビクトリアエのポピュレーションから組織を単離することもでき
るであろう。しかしながら、アカシア・ビクトリアエ組織の増殖のために適切な
培養技術が工夫されれば、本発明の化合物を単離するための組織の調製は簡単に
行うことができるであろう。組織調製の1つのオプションはその種の大規模培養
であろう。しかしながら、より好ましいオプションはアカシア・ビクトリアエの
組織培養と気耕成長システムの実施である。
、多数の利点がもたらされる。最初に、植物の成長速度は通常の成長技術で達成
されるものの約2倍である。次に、根は必要に応じて、その植物を損なわずに簡
単に得ることができる。根を切ると、繊維性の根がさらに横方向に成長する。従
って、根は1年に数回収穫することができる。野生のアカシア・ビクトリアエの
場合は、実の採集は1年に数週間程度の期間に限定され、その植物を傷めたり殺
したりせずに根を採取するのは難しい。
湿らされる閉鎖システムである。根は栄養液で一定間隔毎に湿らされる水密箱内
に閉じ込められている。栄養液は植物がそのライフ・サイクルを完了するのに必
要なすべての基本的な要素を含んでいる。異なった植物が最適成長を行うために
異なったレベル及び栄養組成を必要としているが、全体的単一バランス溶液は満
足すべき結果をもたらす。
織培養を行うためには、先ずアカシア・ビクトリアエの種子を抗菌石鹸で水道水
中で徹底的に洗浄し、市販の漂白剤の20%溶液で15分間処理する。純水中で
の洗浄を繰り返した後、種子を沸騰した湯で処理して発芽させ、一昼夜培養する
。翌朝、種子を再度市販の漂白剤で消毒して、殺菌した純水中で2−3回すすぐ
。汚染を除去した種子を次にMBビタミンと2%サクロース(外植培養の場合は
3%サクロースを用いる)及び0.7%寒天又は0.2%ジェライトでゲル化さ
れた培養液で補強したMS培溶液(Murashigeら、1962)MS上で
培養する。
どを含むいずれの組織タイプであってもよい。これらの外植は通常はMSだけ、
あるいはIAA、NAA、IBA、2,4−D及びBAP(それぞれ個別的又は
組み合わせで)などの調節剤で補強されたMS上で培養される。培養物は通常、
白冷蛍光燈で1000luxで16時間照射して25+2℃で保持される。その
結果作成される植物培養物を温室で1ヶ月間、栄養液の霧下で保存してから温室
、露地、あるいは気耕成長システムに移す。
記植物をアグロバクテリウム・リゾジン染色R−1000で感染させるとその植
物ゲノム内でT−DNAの一体化及び表現がもたらされ、それによって毛状の細
い根が形成される。毛状の根は急速に成長し、斜行成長を示し、ホルモンを含ま
ない培養液内で非常に分岐し、そして、高度の遺伝子的安定性を示す(Aird
ら、1988)。アカシア・ビクトリアエにおける遺伝子的形質変換及び毛状の
根の誘発と成長のための最適条件は実施例に詳細に述べる。ヘアリールート培養
は組織の大規模で急速な成長を可能にし、本発明のトリテルペン化合物の単離に
用いることができる。
とができる点である。これらの培養物は大規模に成長させることができ、トリテ
ルペン化合物を単離するための植物組織の調製のための工業的な規模の成長シス
テムに拡大できる可能性を秘めている。さらに、組織培養物から再生された植物
はかなりの変差を示す場合が多い。従って、組織培養物を用いて、本発明による
トリテルペン化合物の生産に関しては『エリート』であるクローン性細胞株又は
そうした培養物から再生された植物をつくりだすことができる。つくりだされた
植物は世代を超えて同質であり、真性繁殖エリート株をつくりだすために各繁殖
世代で選択される。
存在するので、エリート変種が常に組織培養物から発生するとは限らない。従っ
て、発明者らは、野生種のアカシア・ビクトリアエ内に見出される遺伝子的変差
はトリテルペン化合物の内発レベルを制御する遺伝子の変差を含むことを考えて
いる。従って、野生種の他のメンバーと比較して増大したレベルのトリテルペン
をつくりだすアカシア・ビクトリアエのメンバーを識別すること、そして、本発
明によるトリテルペン化合物を単離するための組織をつくり出すだめの成長シス
テムで使用するためにこれらの変種を選び出すことは可能なはずである。成長シ
ステムは、例えば、通常の栽培、エアロポニック栽培技術、組織培養、あるいは
アカシア・ビクトリアエ組織培養のための他の適した技術で構成することができ
る。さらに、これらの植物はより優れており、そして真の繁殖種である変種をつ
くりだすための繁殖手順で用いるためにこれらの植物を選択することも可能であ
ろう。
、3つ、あるいはそれ以上の部分を示している。
いては、『活性成分』あるいは『活性化合物』とは、本発明者らが確認した活性
のあるトリテルペン化合物を指している。これらの化合物は精製されており、例
えば、フラクションUA−BRF−004−DELEP−F094に示されてい
る。
長及び/又は増殖の抑止を意味している。
アポトーシスという正常な生理学的プロセスと定義される。アポトーシスのプロ
セスは自死性の細胞の一連の代謝変化に細分することができる。いくつかの規制
的又は信号伝達経路の個別的酵素ステップを評価して、アポトーシスがおきてい
るかどうか、アポトーシスのプロセスが癌細胞内で中断されるかについて示すこ
とができる。アポトーシスプログラムは(非対称性の喪失など)結晶膜における
変更、細胞質及び核の濃縮、そしてDNAのヌクレオソーム間切断などを含む形
態的特徴によって観察することができる。細胞が『自死性体』に劣化していくの
で、最終的には細胞死につながる。
めの技術は多重パラメータアポトーシス研究のための標準的な手順として開発さ
れたものである。アポトーシスの初期段階の1つの例はミトコンドリアからのシ
トクロームcの放出で、その後にカスパーゼ−3経路の活性化という事象が続く
(PharMingen SanDiego,CA)。 カスパーゼ(一連のシ
トロリック・プロテアーゼ)の誘発はアポトーシスにおいて最も一貫して観察さ
れる特徴の1つである。特に、カスパーゼ−3はこのプロセスで中心的な役割を
果たしている。カスパーゼが活性化されると、それらは標的の蛋白質を切断し、
切断される蛋白質のうちの最も重要なのはPARP(ポリ−(ADP−リボース
)ポリメラーゼで、これは核内に存在している蛋白質である)。従って、シトク
ロームcの放出の検出、カスパーゼ−3活性の検出、そしてPARP劣化の検出
を行うアッセイはアポトーシスの有効な判定となる。
剤は少なくともプログラムされたアポトーシスの細胞制御の少なくともいくつか
の側面を回復する上で治療効果を発揮する可能性があると結論づけることができ
る。
,Walkerville,MD)である。通常、ホスホチジルセリン(PS)
は血漿膜の内膜上に局所化される。しかしながら、アポトーシスの初期の段階で
は、PSの外化が起きる。アンネキシン−VはPSに結合し、フロー細胞測定で
アンネキシン−V−FITC染色内に観察することができるカルシウム結合蛋白
質である(Martinら、1995)。本発明で開示されているアカシア・ビ
クトリアエ化合物によって処理された細胞のアンネキシン−Vに結合する能力は
その細胞がアポトーシスの過程にあることをしめす指標ととられる。
混合物で処理された細胞におけるアポトーシス活性を検出するためにPI−3−
キナーゼ・アッセイを用いている。細胞膜に結合した酵素であるホスホイノシチ
ド3−キナーゼ(PI3K)はホスファチジルイノシトールのイノシトール環の
3−位置をホスホリル化することができ、従って、PI3Kが活性な細胞におけ
る新しい脂質信号発信毛色を定義する。PI3Kが活性な場合に、AKTと呼ば
れるキナーゼは細胞膜にリクルートされる。ATKは膜へのリクルートの後触媒
的に活性化されるオンコジンの生成物である。十分に活性化されたAKTは細胞
生残において重要な役割を果たしている。P13K/AKT経路は細胞がアポト
ーシスを避けるためのメカニズムを提供する。従って、悪性細胞でPI3Kを抑
制する手段はアポトーシスの細胞制御の少なくともいくつかの側面を回復するた
めの治療となる可能性がある。
遺伝子的に決定された変化と定義される。このプロセスは癌細胞におけるアポト
ーシスの制御の喪失につながる。一般的に、この事象は、1.外部的薬剤又は刺
激トリガーが1つ又は複数の細胞で遺伝子変化を引き起こす段階として定義され
る開始、そして、2.炎症を含む場合もあるさらなる遺伝子及び代謝的変化を含
む段階と定義される促進と呼ばれる複数のステップで起きる。『促進段階』中は
、細胞はアポトーシスが阻止される細胞成長段階への代謝的移行が開始される。
て細胞成長制御メカニズムから逸脱してしまう癌細胞として定義される。これら
の変化は細胞における遺伝子的変性(突然変異の活性化及び/又はプロトオンコ
ジーンの表現の増大−及び/又は突然変異の不活性化及び/又は1つ又は複数の
腫瘍抑制遺伝子の表現の減少)の結果である。ほとんどのオンコジーン及び腫瘍
抑制遺伝子生成物は細胞サイクルの入り口と出口を制御し、分化を促進し、DN
A損傷を検出し、その修理メカニズムを開始し、及び/又は細胞死プログラムを
調節する信号伝達経路の成分である。細胞は成長、分化、DNA損傷制御、そし
てアポトーシスを規制する複数の平行的メカニズムを用いている。ほとんどすべ
ての腫瘍と悪性細胞は複数のオンコジーン及び腫瘍抑制遺伝子に変異原を有して
いる。
ルを指している。これらの『抽出物』は望ましい抗腫瘍活性を有しているかどう
かについて分析することができ、そして活性成分に対応するより純粋な成分をつ
くりだすためにさらに『抽出』あるいは『分画』される。
本発明によって識別された新しい及び/又は生物学的に活性のあるサポニン化合
物を指している。トリテルペン又はトリテルペン・グリコシドは、当業者が本発
明の開示に照らして関連する種から単離することもできるし、ここに開示されて
いるトリテルペン及びトリテルペン・グリコシドの類似物を化学的に合成するこ
とができるので、必ずしもアカシア・ビクトリアエから単離されなくてもよい。
本発明による『トリテルペン』は少なくともトリテルペン単位を有しており、ト
リテルペン・グリコシドの場合は糖かサッカライドを有しているサポニン化合物
を含んでいる。これらの用語は本明細書の別の箇所の説明から明らかなようにモ
ノテルペンなどの他の部分又は化学的機能性を有していてもよい。従って、本発
明によるトリテルペンは糖単位の加水分解で形成されるアグリコンも含んでおり
、さらには他の修正された形態のトリテルペノイドも有しているので、それを修
正してもその化合物の生物学的活性を破壊することはない。
のである。実施例で開示される以下の偽実は発明者らが本発明の実施にあたりよ
く機能すると見出した技術を示すものであって、その実施の好ましい形態を構成
するものと考えることができる。しかしながら、当業者は本開示に照らして開示
されている具体的な実施の計画に多くの変更を加えることができると同時に、本
発明の概念、精神、及び範囲を逸脱せずに同様の結果を得ることができることは
理解すべきである。より具体的には、化学的及び生理学的観点の両方で関係して
いる薬剤をここで述べられている薬剤の代わりに用いることができること、ある
いは同様の結果を達成できることは明らかであろう。当業者に自明のすべてのそ
うした置き換えや修正は添付請求項に定義されているような本発明の精神、範囲
、及び概念の範囲に含まれるものである。
製 有益な生物学的活性を有する新しい化合物を確認する目的を有するデザート・
レジーム・プロジェクト(DELEP)から60個の種子を選んだ。DELEP
(アリゾナ大学、Tucson)はアリゾナ大学とBoyce Thompso
n Southwestern Arboretumとの協力を通じて開発され
た砂漠マメ科植物種の集合である。各植物種から実験的フィールド・サンプルを
集めて、3−4日間空気中で乾かして、Willeyミル(3mmスクリーン・
サイズ)で3ミリメートル・サイズの粒子にすりつぶし、ジクロロメタン(DC
M)及びメタノール(MeOH)の1:1混合物で2−3回ろ過することで抽出
した。各ろ過抽出は少なくとも5時間継続され、しばしば一昼夜続けられる場合
もあった。抽出されたバイオマスの大部分は最初の2回のろ過で回収された。バ
イオマスは空隙体積の半分に等しい体積のメタノールで洗浄し、そのメタノール
画分に含まれている粗抽出物が単離された。サンプルは通常真空内でメタノール
を除去し、その水相をRP−18粒子を通じて送り、MeOH内の活性成分を回
収し、そしてMeOHを回転蒸発させて抽出物を固体として回収することでバイ
オアッセイのために分離、調製された。この粗抽出物を次にH20、DMSO、
あるいはそれらの混合物に再懸濁された(より極性の低い化合物はDMSO化合
物内に再懸濁させ、極性の高い化合物は水か、水とDMSO混合物内に再懸濁さ
れ、アグリコンはDMSOに再懸濁させた)。
、ヒト乳癌、ヒト前立腺癌、ヒト包皮繊維芽細胞、ヒト内皮細胞、及びヒト腎臓
癌細胞などを含むヒト腫瘍及び非腫瘍細胞のパネルに対してスクリーニングした
。これらの細胞は最初96−ウェル・プレートで37℃の温度下で18−24時
間培養された。これらの細胞は次に種々の濃度の植物抽出物に露出され、37℃
の温度で培養されてから、MTT(3−(4,5−ジメチルエチアゾ−2−yl
)−2,5−ジフェニル・テトラゾリウム;Sigma Chemical社)
で4時間、又はクリスタル・バイオレット(Sigma Chemical社)
で室温下で20分間のいずれかの条件で染色された。MTTプレートは細胞溶解
緩衝液(20%ドデシル硫酸ナトリウムを50%DMFに溶かしたもの)を注が
れ、そしてさらに6時間インキュベーションしてから、570nmでのODを読
取った。クリスタル・バイオレット・プレートは洗浄され、3−4時間かけて染
料をソレンセン緩衝液(0.1M蓚酸ナトリウム(pH4.2)、50%v/v
)で抽出し、そしてプレートを570−600nmで読取った(Mujooら、
1996)。スクリーニングされた抽出物の細胞毒性は処理された媒体だけと植
物抽出物で処理された細胞との間でOD読取値を比較することで示された。細胞
毒性は比較対象を100%としての割合で計算され、比較対象に対する%=[{
(植物抽出物で処理した細胞(処理されたサンプル)のOD)/(媒体だけに露
出された細胞(未処理細胞のOD))}x100]。
、同時に、通常のヒト繊維芽細胞に対してはほとんど毒性を示さなかった。UA
−BRE−004−DELEP−F001という符号で示されるこの抽出物は豆
科植物アカシア・ビクトリアエから単離された。この抽出物はヒトの卵巣癌細胞
株を用いた実験で約12μg/ml(SKOV−3)、26μg/ml(OCV
AR−3)、及び13μg/ml(HEY)で、ヒト黒色腫細胞の場合は50μ
g/ml(A375−M)及び約38μg/ml(HS294T)で、そしてヒ
ト表皮細胞(A431)の場合は約15μg/mlで、そして乳癌細胞株MDA
−468(図1)の場合は50μg/ml以上で、それぞれIC50を示した(細
胞株の説明については実施例13参照)。同じ抽出物で処理された正常なヒト包
皮繊維芽細胞(FS)及びマウス繊維芽細胞(L929)の場合、細胞毒性は観
察されなかった。
従って、予備的な努力は選択的細胞毒性に関与している活性成分を単離するため
にこの抽出物を精製することに集中された。活性成分が増大したクロマトグラフ
ィー画分を図15に示す一般的な方式で最初の抽出物から単離した。
たように(二度の)ろ過によってアカシア・ビクトリアエから採取した538g
の植物性物質から調製された。この抽出物はその後真空中で乾燥したところ、約
52.0gの粉末が得られた。そして、51.5gの乾燥物質を1L酢酸エチル
(EtOAc)で3度処理した。約15.75gのEtOAc可溶性物質がシリ
カ・ゲル(1.5kg)上でカラム・クロマトグラフィーにかけられた。ヘキサ
ン、EtOAc、及びMeOHの極性が徐々に高くなる混合物を用いて、54の
670ml準画分が溶離された。これた54の準画分を13つの画分に分けて集
められ、UA−BRF−004−DELEP−F006からUA−BRF−00
4−DELEP−F018の符号を付した。これらの画分を上に述べた手順で抗
腫瘍活性に関してスクリーニングした。これらの画分のいずれもUA−BRF−
004−DELEP−F001で観察されるような強力な抗腫瘍活性を示さなか
った。
ロマトグラフィーにかけられた。徐々に極性が高くなるDCM、MeOH、及び
水の混合物を用いて、51の670ml準画分と全部で21Lになるさらに3つ
の準画分が溶離された。これらの準画分を8つの画分にあつめて、表6に示すよ
うにUA−BRF−004−DELEP−F019からUA−BRF−004−
DELEP−F026の符号を付した。
ネルに対して抗腫瘍活性に関してスクリーニングした。それら画分の1つである
UA−BRF−004−DELEP−F023はUA−BRF−004−DEL
EP−F001より強力な抗腫瘍活性を示した。これらの6μg/mlのUA−
BRF−004−DELEP−F023はヒト卵巣癌細胞に対して50%(OC
C1)、63%(SKOV−3)、85%(HEY)、及び48%(OVCAR
−3);ヒト前立腺癌(LNCaP)に約60%;白血病細胞(Jurkat)
に対して約92%、そして患者の腹水症から得た新鮮なヒト卵巣癌細胞に対して
約73%程度の細胞毒性をそれぞれ示した。非形質変換細胞のバイオアッセイを
行ったところ、FS細胞では10.6μg/mlのIC50を、そしてHUVEC
細胞に対しては2310.6μg/mlのIC50をそれぞれ示した(図2参照)
。
の活性成分の単離及び特徴づけを支援するために多重逆転フェーズ・モード(R
P)媒体圧力液体クロマトグラフィー(MPLC)分離によってさらに精製した
。サンプルは0、10%、20%、30%、40%ACN/水のステップで、1
0%づつ4L増やしてアセトニトリルの濃度を上昇させたガス抜きした混合物か
ら溶離した。そして、2−4L画分をMeOHを用いて溶離した。これらの画分
を繰返し上の操作を行った後回収して、表7に示すようなUA−BRF−004
−DELEP−F027からUA−BRF−004−DELEP−F036の符
号を付した。
の1つ、UA−BRF−004−DELEP−F035(画分35)は強力な抗
腫瘍活性を示すことが認められた。
ニングを行ったところ、卵巣癌細胞株HEY、SKOV−3、OVCAR−3及
びC−1(シスプラチン抵抗性OVCAR−3)に対してそれぞれ3.0、1.
2、2.0及び3.5μg/ml;膵臓癌細胞(Panc−1)に対しては2.
4μg/ml;腎臓癌細胞株769−P、786−0、及びA498に対してそ
れぞれ1.2μg/ml、3.0μg/ml、及び3.7μg/ml;Jurka
t T白血病細胞に対しては130ng/ml;そしてB白血病細胞株KG1、
REH、及びNALM−6に対しては1−3μg/mlの範囲のIC50がそれぞ
れ示された(図3、図4)。表8に示すように、粗植物抽出物を精製したところ
、生物学的活性が劇的に増大した。
s27細胞に対しては約13.3μg/mlのIC50がそれぞれ示された。ヒト
赤血球及びミエロイド・コロニー(骨髄から単離された細胞)に対する画分(F
035)の効果を調べたところ、12−18%の抑制が3.0μg/mlで示さ
れた(表9)。
ml程度までの低い濃度で画分35を用いて、バアイオアッセイを上に述べた手
順で行った。この研究で、腫瘍細胞株の拡大されたパネルに対して、画分の濃度
をいろいろに変えて用いた。スクリーニングの結果、1.56μg/mlの低い
濃度でも、画分35は多数の細胞株に対して強力な抗腫瘍性を示した(表10)
。
ELEP−F035に含まれている活性成分を含む画分を直接調製するための手
順が開発された。約9665gのアカシア・ビクトリアエから新しく回収した実
の組織を3mmスクリーンのハンマー・ミルですり潰して、80%MeOHをH 2 O(3X)に溶かしたもので抽出を行ってから、ろ過した。8200gのバガ
スは廃棄された。3回の洗浄を行ってサンプルを回収し、21.5L中のF06
8(ファースト・ウォッシュ);24L中のF069(セカンド・ウォッシュ)
、そして34.3L中のF070(サード・ウォッシュ)を識別した。F068
は1Lアリコットに分割し、それぞれのアリコットに400mlのH2Oを加え
、CHCl3(2x250ml)で洗浄してさらに精製した。結合極性フェーズ
(28.5L)についてはF078、結合有機フェーズ(回転蒸発で有機溶剤を
除去したあと42g)についてはF079と識別した。
ーカーボンドRP−C18、40μm粒子を負荷した29x460mmカラムを
用いてRP MPLCでさらに分画した。500mlの水溶液をカラム上に注ぎ
、表11に示す分画を得た。
回収して乾燥させてから、真空中で単離した。この固体を水中に再懸濁させ、抗
腫瘍効果についてテストした(一部の極性の低い画分については、DMSOを水
に加えて、アグリコンをDMSO内に再懸濁した)。その結果、F094とされ
た100%MeOH溶離剤の生物学的活性は基本的に画分UA−BRF−004
−DELEP−9F035と同じであることが示された(表12)。F093も
活性成分を含んでいた。画分F094とF035の化学的類似性がTLC及びH
PLCによって確認されたが、F094は別の成分も含んでいるように思われた
。
た活性成分を得るためにバイオアッセイした。種々の量の画分(F138−F1
47)のバイオアッセイの結果を表14に示す。
ていたが、活性成分は根からも抽出できる。この場合、根を1/2時間かけてす
りつぶし、100%MeOHで被覆する。次にこの混合物をろ過して、80%M
eOH水溶液に希釈する。大量の根を抽出する場合は、上に述べたようにろ過に
よって抽出を行うのが好ましい場合がある。これらの抽出手順に違いがある理由
は根が通常は新鮮な状態で抽出に掛けられるのに対して、実は抽出以前に乾燥さ
れるからである。
めの予備的スケールの手順 画分UA−BRF−004−DELEP−F094(F904)からの活性成
分の混合物のスケール・アップされた調製のために、修正された抽出/分離手順
が用いられた。この手順は複数回繰り返され、一貫して高度に活性のある画分が
得られた。通常、20−25gのF904あるいはその相当物が150−175
mlの50%MeOHを水に溶かしたものに溶解して、カラム((26mm x 460mm)+(70mm x 460mm)、RP−C18、40μm、1
200g、60%MeOH/H2Oで均衡化)にかけられた。これらの画分を8
Lを60%MeOH/H2O、7.5Lを70%MeOH/H2O、そして2Lを
MeOHにそれぞれ入れて溶離させ、それぞれの画分を表15に示したように表
示した。画分F035−B2は図18A−18Fに示されているようにF094
、F133−136(F093から単離されたもの)及びF138−146(F
094から単離されたもの)に含まれている活性成分の混合物を含んでいる。F
094は強さが同じ、あるいは半分のF034に代わる受け入れ可能な代替物で
あり、F035−B2はF094よりその強さが弱い。
って考案され、UA−BRF−004−DELEP−F035の分析的HPLC
特製を有する画分が得られた。その手順は以下の通りであった。追加的な予備的
HPLCを10ミクロン逆相カラムを用いて画分F035−B2上で実行して1
−2%ずつの勾配で26%から最大40%アセトニトリル水溶液までの範囲のア
セトニトリルと水の段階勾配混合物で溶離、次に100%アセトニトリル、さら
に100%メタノールで洗浄すると、F035−B2が0−20分ピーク(標準
的な6ミクロンHPLC RP−18分析法によって)を含み、最初のF035
画分には含まれていないいくつかの画分に分割される(図18A)。得られたう
ちの残りの画分にはF035の成分が1つから3つの範囲で含まれている。上の
テストで示されるように、画分F139−F147はこれらの画分と類似してお
り、いくつかの細胞株では他のものと比較して抗腫瘍活性が多少増強されている
。最初の組成物を16%−26%の範囲のアセトニトリル水溶液で修正して、そ
の後複数グラム量のUA−BRF−004−DELEP−F035の相当物を得
るためにMPLC 精製を行うことによって、画分F035に存在する活性成分
の独特の混合物を大量につくりだすことができる。
らなる改良を加えることもアセトニトリル、メタノール、及び水の3つの溶液の
混合物を用いることも可能であろう。パーセンテージ範囲はクロマトグラフィー
技術に通じているものであれば誰でも動的につくりだし、最適化することができ
る。同様に、C−8、CN、ジメチル・ジオール及びC−18などを含むRPシ
ステムの組み合わせを用いて結合相シリカを変えることができる。最終段階で、
通常相のシリカでも最終精製手順のために用いることができる。
アエのすりつぶしたさや1Kg(つまり種子さやの粉末)を上に述べたように入
手した。画分F094を分析するための方法と、F094のその後の分画につい
て以下に述べる。
用いて画分F094の解像を試みた。モニタリングは220nmでの紫外線検出
及び蒸発性光分散検出(FLSD)の両方を含んでいた。より良いピーク解像度
はトリフルオロ酢酸(TFA)を含む可動相で見られた。ここではAcacia
257と呼ばれるこの方法について以下に説明する。この方法は短い操作時間で
良好な解像度を与えてくれる。
あるいは4.6x150mm Inertsil C18 3μカラム(Met
aChem)を備えていた。検出装置は220nmに設定された。
094はそれぞれ多数のピークを有する3つのグループあるいはファミリーで構
成されている。ファミリー1(8−20分;ピークA−D)、ファミリー2(2
2−35分、ピークE−H)、及びファミリー3(36−47分、ピークI−L
)。 画分F035はこの方法でも分析され、そのクロマトグラフを図26に示す。
第2のファミリーのピークは第1ファミリー・ピークがより多いF094と比較
してF035でより多かった。
シンメトリーC8準予備カラム(7.8x300nm、7μ)(水)が用いられ
、勾配溶離剤プログラムは以下に示す通りであった。7つの準画分切片を図27
で示すように作成した。最後の画分切片(#2160−007−31)はファミ
リー2及びファミリー3両方のすべてのピークを含んでいる。これらの画分と開
始物質(F094)をバイオアッセイにかけた。 時間(分) アセトニトリル(%) 0.1%TFA水溶液% 0.0 27 73 38.0 30 70 42.1 90 10 48.0 90 10 49.0 27 73 65.0 27 73
じ準予備カラムの使用で行われた。可動相は均等な32%アセトニトリル水溶液
で0.1%TFAを含んでいた。7つの画分切片がつくられた場所を示すクロマ
トグラフィーによるトレースを図28に示す。第1の画分切片はファミリー1の
すべてのピークを含んでいる。
それぞれ示す。
ら得た。D1の酸加水分解を行うとアグリコンが生成される。
0μm)上で分画した。可動相はアセトニトリル水溶液で0.1%トリフルオロ
酢酸(TFA)を含んでおり、38分間で27%−32%の勾配で操作された。
図29に示すように、このほうでD及びG/Hピークを含む画分が分離された。
この予備的操作で得られた画分切片をバイオアッセイにかけた。D及びG/Hの
分析的アッセイを図30及び31に示されている。ここで用いられている方法は
Acacia257で、これについては上に説明した。
純度を有するGIを得て、この物質をさらにC−18順予備的カラムにかけて純
粋なG1を得た。
の勾配で流された。 時間(分) アセトニトリル(%) 0.1%TFA水溶液% 0 27 73 1 29 71 40 34 66
ラム上でさらに精製した。
は31%アセトニトリル水溶液で、0.1%TFAを含んでいた。最終的なG1
生成物は100%のクロマトグラフィー純度を有していた(図33)。
カラム(25x100mm)で分画された。可動相は61メタノール水溶液で0
.1%TFAを含んでいた。HPLC分析はD1が78%の純度であり(図34
)、別のピーク(D1.5と命名)を含んでいることを示した。0.1%TFA
を含む33%アセトニトリル水溶液100%を用いてYMC C18−Aqカラ
ム上で不純なD1をさらに分画してクロマトグラフィー純度を有するD1のサン
プル(図35)がつくりだされた。D1は40℃で水中より希釈酸溶液内の方が
より安定していることが観察された。従って、0.1%TFAはD1の精製中に
溶液内に含まれた。
1及びG1の影響を表18、19、及び20にそれぞれ示す。D1及びG1は2
つの異なったpH値でテストした。これらの結果はpH6.5でpH7.5の場
合よりやや高い活性を示した。しかしながら、細胞成長はより低いpH値で約4
0%程度抑制された。
で加水分解された。つくりだされたアグリコンをHPLCで精製した。質量スペ
クトル分析はそのアグリコンの分子量が652であることを示した。
はそれがかなりの生物学的活性を持っていることを示す。
分的に生成された抽出物F094から、D1が無色のアモルファス状の固体とし
て分離された。MALDI質量分光測定で得られたその分子量は2104amu
で、これは真の分子量2081のナトリウム・アダクトである。高解像度FAB
質量分光測定でこの分子量が確認され、さらにC98H155NO46の分子式が得られた
。こうした分子は分光測定だけでの構造判定を行うには大き過ぎ、図36に示さ
れる方式1に概略が示されているような劣化計画が実施された。図36で、D1
は(1)というラベルを付されて示されている。
の糖類の存在を示した(選択された13C NMRアサインメントについては表2
1を参照)。
(2)として示されている『D1アグリコン』がつくりだされ、質量分光測定で
分子量が652であることが示された。D1アグリコンのNMRはトリテルペン
と修正モノテルペンの存在を示したが,糖の存在は示されなかった。この物質を
サポニン化によってさらに劣化したところ(1.3N NaOHを100℃の温
度でMeOH内で30分間)、以下のものが得られた。
図36の(3)に示される構造参照。表21の13C−NMRアサインメント(3
)も参照)に関してこれまでに報告されているものと同じであり、質量分光測定
で488で測定した分子量はこの構造との一貫性を示している。
ル酸、二重結合に取り付けられた2つのメチル基、そして2つのビニル陽子を持
っていることを示し、ピレン構造であることが示唆された。図36の(4)に示
すこの構造単位構造はD1アグリコンにも存在しているが、それはD1には存在
していなかった。D1は図36の構造(5)で示されるように非環式モノテルペ
ンを含んでおり、この構造は以下に示すように酸加水分解中に環化される。
2)の構造で示されているD1アグリコンとかなりよく一致する。表21の選択
された13C−NMRアサインメント(2)参照。
化合物への転化が行われた。
を示唆するNMRを有しており、劣化の疑いを裏付けた。この構造を図36の(
5)に示す。
ン、及びいくつかのモノサッカライドを含むものと同じである。この構造を図3
6の(6)に示す。
トリメチルシリル・エーテル)及びGC/MS分析を行ったところ、最初の分子
内にアラビノース、ラムノース、フコース、キシロース、6−デオキシグルコー
ス(つまり、キノボース)、Nアセチル・グルコースアミン、そして2つのグル
コースの8つの糖残基の存在が確認された。
サポニン化 トリテルペン・モノテルペン・オリゴサッカロイドを0.3N NaOHで一
時間60℃の温度下で処理したところ、3つの化合物が形成された。
ゴサッカライドであることが示された。酸加水分解(2N塩酸、100℃で2時
間)及びモノサッカライドのトリメチル。エーテルのGC/MS分析による糖分
析を行ったところ、このオリゴサッカライドは最大グルコース2分子とアラビノ
ース及びラミノースの各1個で構成されたテトラサッカライドであることが確認
された。
質を酸加水分解(2N塩酸、100℃で2時間)したところ、この糖が6−デオ
キシ・グルコースであることが確認された。このモノテルペン・グリコシドをβ
−グルコシダーゼで処理したところ、図36の(9)に示される構造を有するモ
ノテルペンが与えられ、この分子はトランス−2−ヒドロキシメチル−6−ヒド
ロキシ−2,7−オクタジエン酸と同じNMRを有している。『ベータ』−グル
コシダーゼとのこの結合を加水分解すると、これら2つの基の間の結合がベータ
結合であることを示す。
にC−3位置にトリサッカライドを含んだアカシ酸ラクトンと同じNMRを有し
ている。この化合物の酸加水分解(2N塩酸、100℃、2時間)を行ったとこ
ろ、その構成糖類がNアセチル・グルコースアミン、フコース、およびキシロー
スであることが確認され、GC/MSでトリメチル・シリル誘導体であることが
確認された。この分子は図36の構造(10a)に示されている開かれた酸/ア
ルコールと、図36の構造(10b)に示される閉じられたラクトン形態の両方
で観察された。
D1のすべての部分が図36の構造(5)、(7)、(8)及び(10a)で示
されているフラグメントに相当した。
新しい分子が形成された。
グルコースと同じであった。この分子の構造を図36の構造(11)に示す。
、この分子の構造は図36の構造(12)に示す通りである。
グルコース(キノボース)のC−4にエステル化されていることを示す。NMR
及び加水分解の結は、このキノボースの芳香性炭素は内側のモノテルペンのC−
6水酸基に結合していることを示す。キノボースの芳香性炭素の立体化学研究は
その結合が「ベータ」結合であることを示す。
ラサッカライド内の糖類は2つのグルコース分子、そしてラムノースとアラビノ
ースがそれぞれ1分子づつで構成されていることを示す。この単位は図39に示
すようにトリテルペンのC−28カルボキシル酸に直接エステル化されている。
イオン・トラップ質量分光測定の結果はこのトリサッカライド構造は図39に示
すように中央のラムノースに結合された2つのグルコースと1つのアラビノース
を持っていることを示す。これらの糖類の相互の結合は未だ分かっていない。
ンのC−3炭素に直接結合していることを示す。これらの糖の配列の残りの部分
は、部分的加水分解(1N塩酸、50%MeOH内で60℃で1時間)によるL
C/MSで中央がフコースで、端部にキシロースがあることが分かった。これら
の糖類相互の結合は未だ分からない。
されるトリテルペン及び2つのモノテルペンを含んでいる。D1の構造はArchhi
dendron ellipticumから報告されているエリプトシドE(図24)と同様である
(Beutlerら、1997)。本発明においては、D1の特異的な回転が[
α]D=−30.0°であると判断され、これはエリプトシドEの−24.3°
という報告値とは違っている。
なったHPLC保持時間を有している(D1−15.2分、エリプトシド−12
.5分)。従って、これら2つの分子はそれらの準基の特殊な結合とか光学的あ
るいは構造的アイソマーの存在など、何らかの点で違っているはずである。
H内で+11.2°、クロロホルム内で+16°であることを観察した。エリプ
トシドEの同じフラグメントは−9.1°と報告されている。さらに、内側のモ
ノテルペンのキラル中央部分だけがS字構造を有しており、これはエリプトシド
Eで見出されるものとは反対である。D1の外側モノテルペンの特殊な回転は現
在調査中である。さらに、陽子NMRはD1内のモノテルペン二重結合がtra
nsであるのに対して、エリプトシドEではBeutlerら、1997に示さ
れているようにcisであることを示す。これら2つの特徴はD1とエリプトシ
ドEとの間に認められる第1の構造的違いをもたらしている。特定の糖類の酵素
触媒による加水分解はこれらの糖類の配置がエリプトシドE内のものと同じであ
ることを示している。
ている。
4からも単離されたが、化合物の回収率は低かった。G1はD1よりやや極性が
低い。G1の比旋光度は−26.9°であることが認められた(MeOH)。陽
子NMRはG1もD1と非常に良く似たサポニンであること、そして現在ではt
rans−2、6−ジメチル−6−ヒドロキシ−2,7−オクタジエン酸である
ことが判明している外側のモノテルペン内の酸素が1つ少ないことだけがD1と
違っていることを示している。図37、構造(14)と表21の選択された13C
−NMRアサインメント(14)参照。G1は図37、スキーム2に示されてい
るように分解された。
サポニン化生成物とモノテルペンとに完全に転化された。
チル基を保有していることを示している。これを図37、構造(15)に示す。
図36の構造(6)と類似した図37の構造(16)と同じであること、そして
それがD1で見られるように1つのアカシ酸分子と1つのモノテルペン、そして
8つのモノサッカライドを含んでいることが示された。構造(16)が構造(6
)と類似していることはD1の内側モノテルペンで見られた立体化学構造と類似
していることを示唆している。
1に存在するのと同じモノサッカライド単位、つまり、アラビノース、ラムノー
ス、フコース、キシロース、6−デオキシグルコース、N−アセチル・グルコー
スアミン及び2つのグルコース分子がつくり出された。
分子が単離された。NMR及び糖分析(2N塩酸、100℃、2時間)をそれぞ
れに対して行った。これを図37、構造(16)に示す。
でおり、図37の構造(17)に示す。
モノテルペンと6−デオキシグルコースを含み、その全体的な構造は図37、構
造(18)に示される通りである。
コース及びキシロースを含んでいた。これらのフラグメント内の糖類はD1内の
糖類の配置と同じであった。この構造は図37、構造(19)に示されている。
Neutlerら)。しかしながら、エリプトシドAは非常に異なったHPLC
保持時間を有していることが認められ(G1−29.09分、エリプトシド−2
6.04分)、このことはこれら2つの分子がそれらの準基の結合及び光学的ア
イソマーの存在の両方で異なっているに違いないことを示している。G1及びエ
リプトシドの陽子及び炭素スペクトルも化学的シフトの違いを示している。これ
らの化合物の内側及び外側のモノテルペンの非旋光度も違っている可能性のある
ことが考えられる。図37の構造(14)がG1の構造を示している。
。
的及び準予備的クロマトグラフィーを行うことで、B1が単離された。B1のN
MRはこのサポニン・ファミリー全体で認められているのと同じトリテルペン/
モノテルペン/キノボース/モノテルペン構造を示す。このNMRはさらに4つ
のデオキシ糖類と1つのNアセチル基の存在も示しており、このことはこの分子
がその糖部分でD1と違っていることを示している。表21の具体的13C−NM
Rアサインメント(21)参照。この分子は図38に示すようにデグレイドされ
た。
6−デオシグルコース)の1つの複数のコピーの存在をしさしている。加水分解
(2N塩酸、100℃、2時間)後の総分子の糖分析は9つの糖類、フコース、
アラビノース、キシロース、キノボース、グルコースアミンの各分子1個、及び
グルコース及びラムノース分子各2個が存在していることを示す。Nアセチル・
グルコースアミンの残りであるグルコースアミンは最初の分子内に存在している
。B1の構造を図38、構造(21)に示す。
の高い化合物、軽度のサポニン化生成物、及びモノテルペンへの完全な転化が行
われた。
1からのモノテルペンと同じ構造を有していることを示している。
モノサッカライドを含んでいることを示している。この構造を図38の(23)
に示す。
0℃、1時間)によって、D1及びG1の場合と同様に3つの分子が単離できた
。それぞれに関して糖分析及びNMRデータが得られた。
た。これを図38、構造(24)に示す。
でいた。これを図38、構造(25)に示す。
シ酸を含んでいた。テトラサッカライドはN−アセチル・グルコースアミン、フ
コース、グルコース、及びキシロースの各1分子で構成されている。これを図3
8、構造(26)に示す。
れた生成物をバイオアッセイした。100gのF094を100mlのH2Oに
溶解して、その後、1gのKOHを加えて、1.5時間還流させた。この溶液を
室温まで冷却して、そのpHを1N塩酸で7に調製してから、ヘキサン(2x5
0ml)で洗浄した。その後水溶液をさらに段階的な抽出にかけたところ、画分
159−162が得られた。例えば、溶液は最初n−ブタノール(2x50ml
)で抽出して真空で乾燥したところ、0.127gの有機性の可溶性固体(F1
59)が得られた。水性層を1N塩酸でpH5に酸性化させ、EtOAc(2x
50ml)で抽出したところ、0.397gのEtOAc可溶性固体(F160
)が得られ、次いでn−ブタノールで抽出したところ、有機性溶媒を除去した後
で0.338gの固体(F161)が得られた。この水性層を最終的に1N Na
OHでpH7に調製した。1.808gの固体(F162)が最終的な水性層から
得られた。
いはまったく活性を有していないことが明らかになった。F159−162を7
69−P、Panc−1、HAY、MDA−MB−453及びJurkat細胞
株に対するバイオアッセイを行った。見出された唯一の活性は、50μg/ml
でMDA−MB−453に対して1.6%の細胞毒性を示したF161と、50
μg/ml、25μg/ml、12.5μg/mlでJurkat細胞に対して
それぞれ15.50%、6.60%、そして3.80%の細胞毒性を示したF1
59に関するものだけであった。これらの結果は、生物学的活性のためにはエス
テル側鎖が必要であることを示している。本発明の化合物のエステル側鎖が抗腫
瘍活性を示し、及び/又は本発明による化合物のトリテルペン骨格と協同して、
強力な抗腫瘍性を示すものと考えられる。
った。12gのF094を400mlの2N硫酸に溶解して、75分間還流させ
たところ、その間に不溶性物質が形成された。溶液を冷却して、焼成したガラス
を通じてろ過した。残滓を水で洗浄したところ、TLC分析で判定して4.8g
のアグリコンが得られた。暗琥珀色のろ過物をKOH又はNaOHで中性化した
。白い沈殿物が形成され、回収された。この暗琥珀色にイソプロパノールを加え
たところ、第2の白い沈殿物が得られた。溶媒を真空中で取り出して、その溶媒
をMeOHに再懸濁させたところ、火炎テストで判定された硫酸塩に対応してい
る可能性のある白い沈殿物が形成された。ほとんど透明のろ過物を真空中で乾燥
し、残りをアセチル化し、HPLCで分析したところ、図17A及び図17Bに
示されるような糖類の混合物が含まれていた。この混合物は恐らく少なくとも5
つのサッカライドを含んでいる。これらの糖類は、本明細書で十分に述べている
ように、GC−MS特徴づけのためのTMS誘導体の単離、紙クロマトグラフィ
ー、HPLC分離あるいはDEPT NMRのためのベンジル誘導体の単離、又
はC13NMRによってさらに特徴づけができる。標準1−D及び2−D、紙及び
フェーズTLCによって、主な糖類はグルコース、キシロース、ラムノース、ア
ラビノースと確認され、一部さらに別の糖が含まれ、アミノ・グリコシド、特に
アセトアミド置換糖である可能性が高い。
在を示唆する複雑なHPLCスペクトルの原因である。特に、いくつかの活性成
分は2つの異なった個所(アルコール性個所及びカルボキシル酸個所)でグルコ
シル化されているように思われる。2つの個所に結合した6つの糖の組み合わせ
が分離が難しい非常に多数の関連性の高い化合物を生み出すのであろう。
2.0N硫酸(残りの作業条件は同じ)を用いて強力な還流ではないが還流点ま
で軽度に加熱して軽度の加水分解を行うと、アグリコンの同様の混合物が発生す
る。一部の成分が失われており、これはより厳しい条件では一定のアイソマー化
が起きていることを示唆している。
化メチル(1ml)及び無水K2CO3(1g)を用いて5−7時間還流させてメ
チル化させた。これによって、0.315gの不溶性物質と0.54gのF19
7と表示されたメチル・エステルがもたらされた。500mgのF197をサン
プルを1.5gのSiO2、15−26μmに予備的に吸収させた15x460
mmカラム(45gSiO2、15−25μm)でさらに分離した。これらの化
合物を7%イソプロピル・アルコール(IPA)をヘキサンに溶かしたもの79
0ml(準画分1−10)、10%IPAをヘキサンに溶かしたもの470ml
(準画分1−14)、20%IPAをヘキサンに溶かしたもの272ml(準画
分14−15)、200mlのジクロロメタン、及び100mlのDCM・Me
OH(1:1)を用いて、表22に示すようにそれぞれ溶離された。
、腎臓癌細胞(株769−P)、膵臓癌細胞(株Panc−1)、Jurkat T−白血病、及びMDA−MB−453乳癌細胞に対して、表23に示すよう
な用量で細胞毒性を示した。
でさらに分画され、100mlの2%IPA/ヘキサン、525mlの4%IP
A/ヘキサン、及び250mlの10%IPA/ヘキサンでそれぞれ表24に示
されるように溶離された。
osil C18、10μm、75%ACN/水で均衡化)でさらに分画し、8
0%ACN/水で溶離し、40ml/分の流速で検出限界の220nmで溶離し
たところ、表35に示すように30秒毎に準画分が回収された。
。C−191を古典的なアセチル化手順にかけた。特に、C−191(47mg
)を一昼夜、無水酢酸とピリジンの2:1混合物内で室温で攪拌した。水を加え
てこの反応を停止させたところ、その溶液はジエチル・エーテルと5N塩酸で分
画した。有機層を中性化するまで洗浄して、回転蒸発させ、残滓を90:10ヘ
キサン:イソプロピル・アルコールで溶離した20cm予備的プレートでPTL
C−1、20cmにかけ、その後ジクロロメタン:メタノール(98:2)で溶
離したPTLCにかけたところ、C−191酢酸(F229、後でC−194と
表示)が得られた。
F201(85mg)をさらに分画し、溶離して、2%IPA/ヘキサン(12
0ml)、4%IPA/ヘキサン(330ml)、7%IPA/ヘキサン(46
0ml)、20%IPA/ヘキサン(150ml)、DCM(50ml)、及び
DCM/MeOH(1:1)(70ml)で表26に示されるように回収された
。
られて、その腫瘍に栄養を供給する血管系ができてしまうプロセスである。血管
形成を抑制することは腫瘍に対する血液供給を限定することで腫瘍の拡大を抑制
する。この機能を画分35(UA−BRF−004−DELEP−F035)に
よって処理された細胞に対する仔ウシ毛細管内皮細胞増殖アッセイを用いて調べ
た。このアッセイは以下の様に行われた。ウシ胎児毛細管内皮細胞を入手して標
準的な手順(Folkmanら、1979)を用いて成長させた。これらの細胞
をPBSで洗浄して、0.05%トリプシン溶液内に分散させた。細胞懸濁液(
25,000細胞/ml)をDMEM+10%BCS+1%GPSで作成して、
ゲル化24ウェル培養プレート(0.5ml/ウェル)に入れて、その懸濁液を
37℃の温度で24時間培養した。培地を0.26mlのDMEM+5%BCS+
1%GPSと交換して、異なった濃度のUA−BRF−004−DELEP−F
035を用いた。20分培養した後、培地とbFGFを加えて、0.5 ml
DMEM+5%BCS+1%GPS+1ng/ml bFGFの最終体積を得た
。72時間後、細胞をトリプシン内に分散させて、Hematall(Fisc
her Scientific,Pittsburg,PA)内に再懸濁させて
、カウンターでカウントした(O’Reillyら、1997)。
相当培養することを実証した(図5)。これらの結果はこの植物抽出物の活性成
分が内皮細胞増殖の強力な抑制因子であり、これは血管形成のイン・ビボでの抑
制につながることもしばしばあることを示している。加えて、この画分は毛細管
内皮細胞に対しては影響を及ぼさず、これは正常な細胞に対する毒性の欠如を示
唆している(図6)。
ゲニン・ディソジェニン)を用いる場合にしばしば発生する一般的な問題は赤血
球細胞の細胞溶解である。単純な培養管血液アッセイを用いると、1mg/ml
のUA−BRF−004−DELEP−F035で処理した後には検出可能なレ
ベルの細胞溶解はほとんど観察されなかった。また、10−25μg/mlのデ
ィジトニンを用いた処理は培養管血液アッセイで100%の細胞溶解をもたらし
た。
NF−アルファによって誘発される転写因子NF−kBの活性化を1−2μg/
mlのUA−BRF−004−DELEP−F035及びUS−BRF−004
Pod−DELEP−F094で処理したJurkat(3x106)で調べた
。この研究は以下の様に行われた。Jurkat細胞を1−2μg/mlのF0
35またはF094で37℃の温度下で15時間予備処理した。細胞を取り出し
て、1ml RPMI内に再懸濁させて、100pMのTNF−アルファで37
℃の温度下、30分間処理された。TNF−アルファで処理した後、核抽出物を
Schreiberら(1989)によって調製した。簡単にいうと、これらの
細胞を氷冷PBSで洗浄して、0.4mlの細胞溶解緩衝液(10mM HEP
ES、pH7.9、10mM KCl、0.1mM EDTA、1mMEDTA
、0.1mM EGTA、1mM ジチオトレイオール、0.5mM PMSF
、2μg/mlのレイペプチン、2μg/mlのアプロチンそして0.5mg/
mlベンザミジン)内に再懸濁した。これらの細胞を氷の上に15分間載置し、
25μlの10%Nonidet−40を細胞に加えた。これらの管を回転混合
し、30秒間遠心分離にかけた。核ペレットを25μlの氷冷核抽出緩衝液(2
0mM HEPES、pH7.9、0.4M NaCl、1mM EDTA、1
mM EGTA、1nMジチオトレイオール、1M PMSF、2μg/mlレ
ウペプチン、2.0μg/mlのアプロチニン及び0.5mg/mlベンザアミ
ジン)内に再懸濁指せ、それらの管を氷上で断続的に攪拌しながらインキュベー
トした。核抽出物は、4℃、5分間の微小遠心分離し、上清を−70℃で保存し
た。
5mM HEPES、pH7.9、0.5mM EDTA、0.5mMジチオト
レイオール、1%Nonidet P−40、5%グリセロル、及び50mM
NaCl、37℃で20分間)の存在下で32P−ラベルNF−kBオリゴヌクレ
オチド(SEQ ID NO:1;NF−kBコンセンサス・オリゴヌクレオチ
ド;Santa Curz Biotechnology)とをインキュベート
して、電気泳動移動アッセイを行った(Nabel及びBaltimore、1
987;Collartら、1990;Hassanainら、1993)。形
成されたDNA−蛋白質複合体は50mMトリス、200mMグリシン、及び1
mM EDTAを含む緩衝液を用いて5%未変性ポリアクリルアミド上で遊離オ
リゴヌクレオチドから分離した。ゲルを10%酢酸で固定して、バンドを−70
℃の温度で強化スクリーンを用いてオートジオグラフィで視覚化した。
ベルは基本的に低いことを示す(図20、レーン1及び2)。1μg/mlのF
035またはF094で細胞を予備処理して、その後TNFで活性化すると(図
20、レーン4及び8)、NF−kB活性化の抑制効果は認められなかった。細
胞を2μg/mlのUA−BRF−004−DELEP−F035あるいはUA
−BRF−004Pod−DELEP−F094(図20、レーン6及び10)
で処理すると、TNF活性化NF−KBの著しい活性化が観察された。この研究
の結果は、F035とF094の両方が強力な抗炎症性応答を誘発できることを
示している。活性トリテルペン化合物を強力な抗炎症性化合物として示すだけで
なく、これらの結果は炎症が癌発生において重要な役割を演じていることを示す
証拠の増大に寄与している点においても特に重要である(Siewekeら、1
990;Prehen,1997;Schuhら、1990)。
めに、ホスファチジルリノシオール 3−キナーゼ(PI3−キナーゼ)活性、
及びAKT(蛋白質キナーゼB、セリン−トレオニン・キナーゼ)活性、PI3
−キナーゼの下流エフェクターに対する影響を調べた。PI3−キナーゼは受容
体及び非受容体チロシン・キナーゼと結合して成長因子信号伝達に影響を及ぼす
酵素である。菌代謝物質であるワートマニンと、植物バイオフラボノイド・ケル
セチンに構造的に類似したLY294002の2つの公知のPI3−キナーゼが
存在する。
餓させて、異なった濃度(細胞株に応じて1−8μg/ml)のF035をいろ
いろな時間(2−16時間)、37℃の温度で露出された。種々の時点後に、細
胞を回収して、PBSで2000rpmで10分間洗浄した。これらの細胞を1
%NP−40細胞溶解緩衝液内で4℃で30分間細胞溶解して、15,000r
pmで4℃の温度下で5分間遠心分離を行って細胞溶解物を分離した。PI3−
キナーゼの免疫沈降を行うために、5μlのウサギ抗p−85抗体(チロシン・
キナーゼ受容体蛋白質;Upstate Biotechnology社)を1
mlの細胞溶解液で4℃の温度下で90分間培養した。そして、免疫複合体をさ
らに90分間、4℃の温度下で100μlの20%蛋白質A−セファロース・ビ
ーズ上で単離した。免疫沈降物をa)PBS、100mM Na3VO4、1%ト
リトン−X100;b)100mMトリス、pH7.6、0.5LiCl、10
0mM Na3VO4;c)100mMトリス、pH7.6、100mM NaC
l、1mM EDTA、100mM Na3VO4;そしてd)20mM Hep
es pH7.5、50mM NaCl、5mM EDTA、30mM NaP
Pi、200mM Na3VO4、1mM PMSF、0.3%トリトンX−10
0を用いて連続的に洗浄した。その後、免疫沈降物を30μlのキナーゼ反応緩
衝液(33mMトリス、pH7.6、125mM NaCl、15mM MgC
l2、200アデノシン、20mM ATP、30μCi[g−32P]ATP
)内で再懸濁させた。ホスファチジル・イノシトール(PI;50μl)を窒素
ガス下で乾燥して、20mM HEPES、pH7.5を用いて2mg/mlの
割合で再懸濁させて、氷上で10分間サポニン化させた。10μlのPI懸濁液
と10μlのガンマ−ATPを加えることでPI3−キナーゼ反応が開始された
。この反応は室温で10分間進行させ、その後、100μlのIN塩酸を加えて
反応を終了させた。クロロホルム:メタノール:NH4OH:H2O(60:47
:2:11.3)の薄層クロマトグラフィによってシリカ・ゲル上で分解した。
放射性物質でラベルした燐酸ホスファチジルリノシトールをオートラジオグラフ
ィーで視覚化して、抑制をストーム・システムで定量した(Okadaら、19
94;Vlahasら、1994)。それらの結果(図21)は、F035(4
μg/ml)での処理から2及び6時間後に、PI3−キナーゼ活性の抑制があ
った。同様に、細胞を2μg/mlのF035に15時間露出すると、Jurk
at細胞におけるワートマニン(菌代謝物質でPI3−キナーゼの公知の抑制剤
として知られている)の場合と同様、95%の抑制が観察された。
影響について調べた。サポニンBとしても知られているAKTはウイルス性オン
コジンv−AKTの細胞類似物であり、多数の成長因子によって活性化され、ワ
ートマニンに対して影響を受けやすいPI3−キナーゼ活性化において一定の役
割を果たしている。AKTは卵巣癌腫の12.1%及び乳癌の2.8%で増幅さ
れることが示されているセリン−トレオリン蛋白質キナーゼをコード表現する。
AKTは抗アポトーシス性分子であるBadのホスホリル化を通じて抗アポトー
シス経路に関与している。AKTに変性が認められる卵巣癌蛋白質はその前兆が
弱いようである(Bellacosaら、1995)。AKTは部分的にはp7
086キナーゼによって積極的にアポトーシスを阻止することが示されている(
Kennedyら、1997)。p70S6キナーゼは細胞成長及びG1細胞サ
イクルの進行に必要なミトゲン活性化セリン・トレオニン蛋白質キナーゼ(Ch
ou及びBlenis,1996)である。p70S6キナーゼの活性は触媒及
び偽基質領域内での複数のホスホリル化過程によって制御されている(Chea
thamら、1995;Wengら、1995)。
urkat細胞(5x106)を血清を枯渇させた状態において、F035に対
して37℃でワートマニンと共に15時間及び2時間露出させた。これらの細胞
をcd3XL(cd3架橋)で誘導するか、37℃で10分間未誘導状態におい
て、AKT細胞溶解緩衝液内で細胞溶解して、蛋白質を8%SDS−PAGEゲ
ル上で分離して、リン特異性AKT(Ser473;New England
Biolabs)と総AKT抗体を用いてウェスタ−ンECLで分析した。p7
0S6キナーゼに対するF035の影響に関するアッセイもほぼ同様に実行でき
るが、ただし、p70S6キナーゼ(ser411、thr421/ser42
4)リン酸化を分析するためのPhosphoplus p70S6キナーゼ抗
体キット(New England Biolabs)が使用される。AKT分
析の結果(図22)の結果はcd3架橋が多少ホスホAKTを誘発する。1及び
2μg/mlのF035による細胞の後処理で、AKTリン酸化(活性AKT)
の著しい抑制が行われ、これは1μMのワートマニンで2時間処理した場合とよ
く類似していた。しかしながら、総AKTの表現には変化はなかった。AKTリ
ン酸化の同様の抑制も卵巣癌OVCAR−3及びC−2(HEY変種)を用い、
さらに2−4μg/mlのF094で処理したJurkat細胞を使って実証さ
れた。これらの知見はF035がJurkat細胞及び卵巣癌細胞でホスホリル
化を抑制することを示している。PI3−キナーゼ/AKT信号経路が抗アポト
ーシス信号を伝達することが示されていることを考えれば、これは重要なことで
ある(Kennedyら、1997)。これらの結果は、F035とF094が
PI3−K信号経路の抑制を介して腫瘍細胞のアポトーシスを媒介していること
を示唆している。
セイ 成長抑止のメカニズムと植物抽出物の活性成分の細胞毒性についてさらに調べ
るために、約1x106のOVCAR−3腫瘍細胞を60mm3皿に入れて、種々
の濃度のUA−BRF−004−DELEP−F035で処理し、37℃の温度
下で18−24時間インキュベートした。細胞を収穫して、PBSで2度洗浄し
て、1x106個/mlの濃度で再懸濁させた。パラホルムアルデヒド(最終濃
度1%)をゆっくり回転させている細胞に滴下して加えた。これらの細胞を氷上
で15分間インキュベーションしてからPBSで再度洗浄し、ペレットを70%
氷冷エタノールで再懸濁させて、−20℃で一昼夜インキュベーションした。最
後に、エタノールを再度PBSで洗浄して、細胞をお。1%RNaseと共に1
0μg/mlのヨウ化プロピジウム(Sigma Chemical Co.)
内で再懸濁させた。これらの細胞を再度室温で30分間インキュベーションして
から、4℃の場所に移して、18時間後に流動細胞測定器で分析した(Pala
lvicini、1987)。それらの結果は、UA−BRF−004−DEL
EP−F035で処理する前に、48%の細胞がG0/G1期であり、36%の
細胞がS期であり、そして7%の細胞がG2/M期であることを示した。しかし
ながら、F035によるOVCAR−3を処理して48時間後に、58%弱の細
胞がG1であり、わずか27%がS期で、このことはG1の細胞が8%上昇し、
細胞サイクルのS期の細胞が10%弱減少したことを意味している(図19A、
B)。これらの結果はOVACAR−3ヒト卵巣癌細胞の一定のG1での停止が
起きていることを示している。
53及びMDA−MB−453乳癌細胞を種々の濃度のF035に露出させて、
上に述べたような細胞サイクル分析で72時間後に分析した。その結果は、Su
bG0ピーク(表27)の出現で、F035がMDA−MB−435のアポトー
シスを誘発することを示している。加えて、細胞サイクル調整は細胞サイクルの
S及びG2/Mフェーズにおける細胞の割合の減少によっても観察される。
ら72時間後のG1期での10%弱の増加とS期細胞の4−10%の減少によっ
てF035がG1細胞サイクルを停止させることを示している(表28)。これ
らの結果はこの植物抽出物によって誘発される細胞サイクル停止及び腫瘍細胞の
アポトーシスを示している。
LEP−F035(50−100ng/ml)で37度の温度下で18時間処理
した。これらの細胞をPBSで1度洗浄して、5μlのアネクシン−V−FIT
C接合体を含む結合緩衝液(10mM HEPES/NaOH、140mM N
aCl、2mM CaCl2)内に再懸濁させた。これらの細胞を洗浄して10
μlの20μg/mlヨウ化プロピジウム(Shigma Chemical社
)を含む結合緩衝液内に再懸濁させ、蛍光活性化細胞ソーター(HACS)分析
で分析した(Martinら、1995)。
すことができることを示している。この知見はさらに処理された細胞のアネキシ
ン−Vに結合する能力、それらの細胞はアポトーシスを起こしていたという知見
(表29)によって裏付けられた。通常、ホスホチジルセリン(PS)は血漿膜
の内側膜上に局所化される。しかしながら、アポトーシスの初期の段階に、PS
の外化が起きる。アネクシン−VはPSに結合するカルシウム結合蛋白質で、流
動化学によってアネクシンV−FTTC染色で観察することができる(Mart
inら、1995)。
おける多段回皮膚発癌モデルで調べられた。これらの動物は皮膚をアセトン、発
癌性物質DMBA(7,12−ジメチルベンズ[a]アントラセン)、DMBA
+UA−BRF−004−DELEP−F035、及びDMBA+画分60(ネ
ガティブ・コントロール)で塗布し、植物抽出物を低用量(マウス1匹あたり1
00μgのUA−BRF−004−DELEP−F035または画分60)から
高用量(マウス1匹あたり500μgのUA−BRF−004−DELEP−F
035または画分60)を週に2回、4週間投与した。UA−BRF−004−
DELEP−F035または比較対象はDMBAを適用する5分前にマウスの皮
膚に用いた。これらの動物で乳頭腫が発生するかどうか観察し、その後致死させ
て、皮膚を組織学的に分析した(図9A−図9F)。分析の結果を図10A、図
10B、図11A、図11B、図12及び図13に要約して示す。
ス当たり8個の乳頭腫を有していたが、DMBAとUA−BRF−004−DE
LEP−F035で処理したものは1匹のマウスで乳頭腫の発生する割合が0.
66で、DMBAと画分60で処理したものではその割合が6.9であった。こ
れらの結果はUA−BRF−004−DELEP−F035が腫瘍に対してかな
りの防御効果を有していること、そして画分60の場合はその保護効果が基本的
にないことを示している。
EP−F035は発癌性物質によって誘発された腫瘍に対して化学的に保護効果
を発揮することを示している。マウスの皮膚における発癌の開始段階は直接作用
性発癌性物質(すなわち、DMBA)によって行われ、この段階は基本的に非可
逆性である。発癌の抑制は8週間後にDMBAによる乳頭腫の形成における減少
によって判定された。処理された皮膚の分子分析はUA−BRF−004−DE
LEP−F035がrasオンコジ¥ンを突然変異させるDMBAの能力を防ぐ
ことを実証している(以下の実施例14、15、16参照)。
が用いられた。この手順は以下の様に行われた。約5gの葉っぱや小枝をはさみ
で小片に切断し、あるいは根のサンプルをナイフで切断して小さな切片をつくっ
た。この植物性物質を小さなブレンダー内で処理して、約25mlの80%メタ
ノール(v/v)と混合して、最低2時間放置し、そのうちの1時間毎に振動さ
せた。不溶性物質を10,000gで遠心分離して取り出した。この抽出物を用
いて、RPプレート(アルミニウムTLCシート、RP−C18 F254s)及
びアセトニトリル(v/v)を用いて薄層クロマトグラフィーを行った。TLC
プレートを0.1%バニリン(4−ヒドロキシ−3−メトキシベンズアルデヒド
)/H2SO4スプレイに露出させ、70℃で15−30分間焼成すると、活性の
あるトリテルペノイド化合物が褐色がかった赤色の斑点で可視化された(Rf=
0.2−0.3)。
抽出を行った。秋になってさらに採集したものには活性は認められなかった。そ
の後、アカシア・ビクトリアエ植物の種々の部分の活性トリテルペン化合物の相
対的存在及び不存在を判定するために系統的な研究が行われた。この植物の化学
的特性を観察した後、この植物の地上より上の部分の活性成分のほとんどすべて
はさや、根、及び実生の部分に集中しており、枝や樹皮、葉、種子にはまったく
、あるいはほとんど含まれていないと判断された。従って、有効な回収時期はさ
やの形成から裂開までの3週間程度である。この植物の根が同じ活性物質をつく
りだすことも分かったが糖と活性成分の比率は一定ではない。後者の特性は、正
常な植物の成長を維持しつつ活発な根の形成も可能にするエアロポニックがアカ
シア・ビクトリアエには適していることを示唆している。
tion(ATCC,Rockville、MD)から以下のヒトの癌細胞株を
入手した。SK−OV−3及びOVCAR−3(卵巣癌)、Jurkat(T−
細胞白血病)、U−937(組織球白血病)、MDA−MB−468、MDA−
MB−453、MDA−MB−435、SK−BP−3、MCF−7、MDA−
MB−231、BT−20(乳癌)、LNCaP、PC−3、DU145(前立
腺癌)、769−P、786O、A498(腎臓癌)、及びPANC−1(膵臓
癌)を入手した。HEY及びDov−13(卵巣癌)株はM.D.Anders
on Cancer Centerから入手した。以下の非形質変換ヒト細胞株
MCF−10A及び10F(乳房上皮)はM.D.Anderson Canc
er Centerから入手した。Hs27(ヒト包皮繊維芽細胞)及びL29
2(マウス繊維芽細胞細胞)はATCCから入手した。SK−OV−3、MDA
−MB−468、Hs 27、L292は最小必須培地で成長させた。OVCA
R−3、Jurkat、U−937、LNCaP、DU−145、PC−3、H
EY、Dov−13、PANG−1、MCF−10A、MCF−10F、及び残
りの乳癌細胞株はRPMI1640内で成長させ、F−12培地は769−P、
786−O、A498を成長させるために用いた。用いられたすべての培地は1
0%ウシ胎児血清、200mMグルタミン及び0.05%ジェンタミシンで補強
した。
1CAA→CTA突然変異の増幅 この手順はNelsonら(1992)から流用された。3MSP61mut
と命名された逆プライマーはHa−rasのコドン61で中央のヌクレオチド(
下線を付した部分)がCAA→CTAに変わっている3’末端エンド・ヌクレオ
チド(A)塩基対が以下に述べるような条件化で突然変異されたDNAを増幅す
るように設計された。このアッセイはTaqポリメラーゼが3’エンドヌクレア
ーゼ活性を欠いており、従ってアニール化されたプライマーの3’末端での不整
合を修復できないという事実に基づいている。このアッセイの条件は十分に野生
型配列にアニーリングされず延長が起きない逆プライマーに依存している。同じ
フォワード・プライマーを用いて、1つの反応は逆不整合プライマー(3MP 61mut)によって行われ、別の反応は逆野生型プライマー(3M61wt)
を用いて行われる。この手順はCAA→CTAの変化を検出するだけであるが、
これらの突然変異はコドン61での突然変異では最も一般的なものである。Xb
a I REPサイト(T/CTACA)がこのトランスバージョンでつくりだ
される。これらの突然変異はXba Iを有する増幅DNAの制限あるいは32P
エンド付標5MSP61プライマーを用いての直接DNA配列決定によって確認
することができる。不整合生成物を含むこれらの反応はその後精製及び配列決定
のために2%低融点アガロース上で行うことができる。用いられたプライマー、
5MSP61、3MSP61mut、及び3MSP61wtをそれぞれSEQ
ID No.2、SEQ ID No.3、及びSEQ ID No.4として
以下に示す。
T TGC AGG AC−3’(SEQ ID No:2) 3SMP61mut(20−mer) 5’−CAT GGC ACT ATA CTC TTC TA−3’(SEQ ID No:3) 3MSP61wt(20−mer) 5’−CAT GGC ACT ATA
CTC TTC TT−3’(SEQ ID No:4)
3つの不整合を有しており、フラグメント・サイズは110bpである。テンプ
レートDNA及び増幅剤は以下の通りであった。 DNA(ポジティブ・コントロール)OR 1.0μg
DNA(ネガティブ・コントロール、すなわち野生型)OR 1.0μg
DNA(サンプル、すなわちパラフィン・ブロック)OR 5.0μl
DNAなし(すなわち、H2O) 5.0μl
Rxn緩衝液(10X)(10X=500mM KCl、 5.0μl
100mM Tris、pH8.3、15mM MgCl2) dNTP混合物@500μM(最終濃度=20μM) 2.0μl
[32P]dCTP、3000Ci/mmol、5uCi、 0.50μl
1.7pmol、0.034μM 5’プライマー(10pmol/μl)、 0.75μl
7.5(最終濃度:0.15μM) 3’プライマー(10pmol/μl)、 0.75μl
7.5pmol(最終濃度:0.15μM) Taqポリメラーゼ(5U/μl、3.0U) 0.60μl
H2O−50.0μl 50.0μl
鉱物油 2滴
の通りであった。 プレヒート・サーモサイクラー:95℃まで ファイル512−21 95℃ 1分30秒 1サイクル ファイル512−22 95℃ 60秒 57℃ 60秒 72℃ 60秒 30サイクル ファイル512−10 浸潤4℃
ガティブ・コントロール(H2O)の比較対象を用いて行われた。プラスミドp
Hras61mutからのMUT DNAをポジティブ・コントロール・サンプ
ルとして用いた。プラスミドpHras61はSencarマウス腫瘍からのク
ローンされたエクソン2Ha−ras DNAを含んでいる。このクローンされ
た突然変異はDNA配列決定で確認された。マウスHa−rasのコドン61(
エクソン2内にある)のCA→CTAトランスバージョンという突然変異はコド
ン61内niHa−ras突然変異を含んでいる腫瘍腺黒色腫からのDNAのサ
ンプルである(図14参照)。
異アッセイ このアッセイはコドン12の3つのbp上に広がっているMnI Iサイト及
びコドン13の最初の塩基対(ラット及びマウスHa−rasコーディング配列
におけるGGA GGC、ヌクレオチド34−37)の自然断裂に基づいている
。MnIに関する認識サイトはN7GGAGである。これら4つの位置のいずれ
かにおける突然変異はMnIがこの領域を含むPCRTMフラグメントを切断でき
なくなる状況をもたらす。そのアッセイの血管はMnI Iによる不完全消化の
発生である。こうした現象は消化に対して抵抗性のある数%の野生型DNAと低
レベルの真の突然変異との間の区別を困難にしている。こうした現象は供給源D
NAが野生タイプ及び突然変異体DNAの混合物を含んでいる場合、及びアッセ
イで感作性を増大させるためのフラグメント・ラベリングのために32Pを用いた
場合などに観察される。このアッセイのために用いられたPCRTMプライマー・
セットをSEQ ID No:5及びSEQ ID No:6として以下に示す
。H−ras12増幅生成物のサイズは214bpである。 プライマー#3(5’):5’−CCTTGGCTAAGTGTGCTTCT
CATTGG−3’(SEQ IDNo.5) プライマー#6(3’):5’−ACAGCCCACCTCTGGCAGGT
AGG−3’(SEQ ID No.6)
る。 Rxn緩衝液(10X) 1.0μl (10X=500mM KCl、100mM Tris,pH8.3、15
mM MgCl2 dNTP混合物@0.5mM 1.0μl
5’プライマー 6pmol
3’プライマー 6pmol
32P−dTNP(3000Ci/mMol) 0.5μl
Taqポリメラーゼ(5U/μl、0.65U) 0.13μl
H2O 10.0μl以下
DNA(ポジティブ・コントロール) >200.0ng
DNA(ネガティブ・コントロール、つまり野生種) >200.0ng
DNA(サンプル、つまりパラフィン・ブロック) 5.0μl
DNAなし(すなわち、H2O) 5.0μl
鉱油 2滴
通りである。 プレヒート・サーモサイクラー:94℃まで ファイル512−87 94℃ 2分 1サイクル ファイル512−88 94℃ 30秒 68℃ 30秒 72℃ 1分 8サイクル ファイル512−89 94℃ 30秒 60℃ 30秒 72℃ 1分 32サイクル ファイル512−10 浸潤4℃
たり5匹の組織から得たDNAをPCRTM分析によってc−Ha−rasのコド
ン12と13、及びコドン6での突然変異について分析した。発明者らはこの分
析のために最後の投与から4日目の標本を用いたが、それは2日目のDNAの位
置が劣化して、従ってHa−ras分析に適さなくなる可能性があるからである
。コドン12と13には、野生タイプの配列でコドン12の3つのヌクレオチド
と コドン13の最初のヌクレオチドとの間にまたがるMn1 I制限箇所が存在し
ている。これらの塩基のいずれに突然変異が起きても、Mn1 I サイトの喪
失という事態につながる。発明者らはPerkin Elmerサイクラーを用
いてゲノムDNAからのc−Ha−ras遺伝子のエクソン1(コドン12及び
13を含む)を増幅した。この反応はフェノール−CHCl3で抽出され、DN
Aをエタノールで沈殿させた。DNAは酵素緩衝液内に再懸濁させ、そしてPC
RTM生成物はMn1Iで制限され、その消化物を8%非変性ポリアクリルアミド
・ゲル上で電気泳動にかけた。Mn1 I制限サイトのロスは観察されず、その
結論はテストされた物質のコドン12及び13で突然変異は起きないということ
である。Ha−ras分析のためのDNAは最後の投与から2日後に回収された
サンプルから8μで切り取られたパラフィン埋め込み部分から得られた。各パラ
フィン・ブロックから得た32の部分をミクロファージ・チューブに入れて、キ
シレン及びエタノールで脱パラフィン化され、遠心分離にかけ、5%チェレック
ス内にプロテアーゼKと共に再懸濁された。
1992(上記、実施例15)を参照した。同じフォーワード・プライマーを用
いて、1つの反応は逆不整合プライマー(3MSP61mut)を用いて行われ
、もう1つの反応は逆野生タイプ・プライマー(3MSP61wt)を用いて行
われた。この手順はコドン61ポイント突然変異において最も一般的なCAA→
CTA倒錯突然変異だけを検出する。Xba IRFLPサイト(T/CTAG
A)がこの倒錯でつくりだされる。この不整合生成物を含んでいる反応は後で精
製、配列決定を行うために2%低融点アガロース上で行われた。切断された部分
(野生種DNA)対非切断(突然変異したDNA)の量的比較が臭化エチジウム
染色強度の定量あるいは32Pラベリングによって行われた。プラスミドpHra
s61mutからのDNAはポジティブ・コントロール・サンプルとして用いら
れている。プラスミド突然変異pHras61はSencarマウス腫瘍からの
クローン化されたエクソン2Ha−ras DNAを含んでいる。クローン化さ
れた突然変異はDNA配列決定によって確認された。突然変異はマウスHa−r
as遺伝子のコドン61(エクソン2内に配置されている)におけるCAA→C
TA倒錯である。反応条件は実施例15に述べた通りである。
35の影響 生後6週間の雄ラット(Fisherら、3444)をCharles Ri
ver(Raleigh,NC)から入手した。ラットにはDyets Inc
.(Bethlehem,PA)から購入したAIN−76Aを適当に与えた。
この餌は20%カセイン、0.3%DL−メチオニン、15%コーン・スターチ
、50%スクロース、5%コーン・オイル、3.5%AIN−塩混合物、1%A
IN−76ビタミン混合物、及び0.2%コリン二酒石酸塩で構成されていた。
ラットで異常な陰窩を誘発させるアゾキシメタン(AOM)はSigma Ch
emical Company(St.Louis,MO)から購入した。動物
は3日間ラット用餌で飼育し、隔離して、その後生後7週間になるまでAIN−
76Aを与えた。これらの動物を無作為で3つの措置グループ(1グループ10
匹)に分けた。グループ1の動物をAIN−76Aの餌だけで飼育し、グループ
2はAIN−76Aに加えて5mg/kgのF035を与え、グループ3の動物
にはAIN−76Aと10mg/KgのF035を与えた(表30)。
kg体重)。1週間後に2回目のAOM注射が行われた。研究全期間を通じて、
動物の体重測定が毎週行われた。動物に対しては4週間給餌が行われた。31日
後、CO2で窒息、致死させた。結腸を摘出して、冷たいPBSでフラッシング
して、縦方向中央軸に沿って切断し、ろ過紙上において、70%アルコール内で
少なくとも24時間固定した。結腸をメチオニン・ブルー(PBS内に0.25
%)で約1分間染色した。解剖用顕微鏡で倍率20xにして異常な陰窩核をカウ
ントした。異常な陰窩はそれらの大きさが増大していること、細胞の内腔表面か
ら基底表面までの距離の増大、そして拡大された陰窩周辺ゾーンなどによってそ
の周囲の正常な陰窩とは区別された。すべての標本はコード化され、2名のスコ
アラーによってブラインドでカウントされた。基本的な意味を有する特徴につい
ては、一方向ANOVAを用いてグループ間の違いをチェックすることで判定し
た。違いが認められた場合、ボンフェンローニf−テストを用いて比較対象グル
ープに対するF035の両方の用量を何回もテストした。これら結腸のカウント
は2名のスコアラーによって行われ、彼らがカウントしている実験グループにつ
いては何の知識の与えられなかった。これらの2名のスコアラーのカウント結果
にはかなりの一致度が認められた。
総腫瘍をかなり減少させ、この投与量は体重1kgあたり1mgのF035を毎
日摂取しているのと同等である(表31、表33)。同じ用量で一重項及び二重
項カテゴリーでの異常陰窩の数も大幅に減少させた(表32、表34)。餌1k
gあたり5mgというF035の低用量(体重1kgあたるF035を500m
gづつ毎日摂取するのにほぼ相当)でも一重項及び二重項カテゴリーでの異常小
嚢腺核の数を減少させたが、その減少の程度は比較対象値とそれ程違ったもので
はなかった(表32、表34)。この実験の全期間を通じて、実験グループと比
較対象グループの間で体重増大に差は認められなかった(表35、表36、表3
7)。
がるので、生物学的活性に対する糖の重要性が確かめられる。表38に示すよう
に、UA−BRF−004Pod−DELEP−F164(エステルが結合され
たUA−BRF−004Pod−DELEP−F094からの糖の加水分析によ
って発生された)及びUA−BRF−004Pod−DELEP−F245( UA−BRF−004Pod−DELEP−F094の加水分解生成物のメチル
・エステル混合物)は一連の腫瘍細胞株に対する抗腫瘍活性の著しい低下を示す
。同様に、UA−BRF−004Pod−DELEP−C094(アグリコン1
の精製されたアセテート)はトリテルペン・グリコシド画分35のデータと比較
して一連の腫瘍細胞株に対する抗腫瘍活性のかなりの低下を示す。従って、ここ
で開示されているトリテルペン・グリコシドから糖単位を加水分解した後、生物
学的活性の著しい喪失が起きる。
あるトリテルペン・グリコシドの影響を分析することである。ほの研究の長期的
な目的はヒトを含む哺乳動物の餌に加えられたトリテルペン化合物が血清コレス
テロールを減らすことを実証することである。この研究のために選択された高脂
血症ハムスター・モデルはけっ歯類モデルで、これはラット・モデルとは対称的
に、コレステロール含量に対応してLDL受容体とヒト血漿脂質蛋白質変化の両
方を高度の類似性で再現する(Spadyら、1993)。
るいはその他の基本的成分と変えないで精製したハムスター用餌内に入れた。2
つの濃度のトリテルペン・グリコシドで補ったのは用量−応答関係をはっきりさ
せるためである。動物らはNRC勧告(Reevesら、1993)に基づいて
調製された精製され、1%コレステロールを加えた、あるいは加えないハムスタ
ー用の餌であるDytesをいつでも自由に食べられるような状態とした。コレ
ステロースを含んでいる方の精製ハムスター用餌Dytesは以下に示すような
トリテルペン・グリコシドで修飾した。餌をペレット化した場合及び比較対象の
餌を用い、ただしカルシウム、リン、あるいは他のいずれの栄養分も基本的に変
えない実験も行われた(Bethlehem、PA)。動物達の食物摂取と周毎
の体重変化を観察した。用いられた動物は生後4週間、異系交配で生まれた雄で
、ウイルスを含まないGolden Syriannハムスター(Charle
s River Laboratories、Wilmington、MA)で
あった。動物らをStatviewプログラムで乱数発生装置を用いて体重別に
混ぜ合わせ、1ケージあたり3匹を入れて、1日12時間光を照射し、22℃+
1.0℃の温度下に保持した。
に、1グループあたり12匹の動物を午前9−11時の間にランダムで致死させ
た。肝臓及び腎臓を取り出して、その重さを測り、処理し、−70℃の温度で今
後の研究のために保存した。動物達を致死させた時点で、肝臓及び腎臓を取り出
す前に心臓に穴をあけて血液を取り出し、脂質特性について分析した。血液血清
脂質特性を処理グループと比較対象グループの間で比較した。2つの比較対象グ
ループ(グループ1及び2)と2つの措置グループ(グループ3と4)が存在し
た。すべてのグループは2週間隔離期間中NRCハムスター用の餌を与えた。グ
ループ1は実験の終了時まで同じNRCの餌の提供が続けられた。グループ2−
4はNRC製餌に1%コレステロールをさらに2週間与えたところ、高コレステ
ロール症状を示した。グループ2は研究の終了時までその給餌を続け、グループ
3及び4に対しては同じ餌にトリテルペン・グリコシド(F035又はF094
)で補強して与えた。措置グループのテスト概要を表29に示す。
餌を与えたグループで0(比較対象グループのみ)、4及び8週間後に、1グル
ープあたる12匹の動物をランダムで選択し、午前9−11時に致死させた。ハ
ムスターの肝臓及び腎臓を取り出し、体重を測定し、異常がないかどうか調べた
。異常を示す各器官の一部を組織分析にかけた。具体的には、パラフィン固定の
ために凍結し、その部分をヘマトサイクリン及びエオシンで染色した。肝臓と腎
臓を外科的に取り出す前に心臓に穴を開けて致死させて血液を取り出した。血清
をつくり、脂質特性分析のために−20℃の温度で保持した。ハムスターは致死
させる前に一昼夜絶食させた。データを以下の表40に示す。
emical Laboratories,Burlington,NCで総コ
レステロール、トリグリセリド、HDL−コレステロール、及びLDL−コレス
テロールについて調べた。マッキントッシュ・ソフトウエアを装備したパワー・
マッキントッシュ9600コンピュータでこれらのデータの解析を行い、偏差、
p値、及び直線回帰について調べた(Armitage、1971)。特に、各
餌/薬品グループのデータ分析をNewman−Keul平均分離を用いて偏差
を分析することによって行った(Steel及びTorrie、1980)。
膚モデルでのUVB−誘発発癌の予防に重点が置かれる。この研究の長期的な目
的はこのマウス皮膚モデルにおいて、トリテルペン・グリコシドがUVB誘発病
変を阻止することを実証することである。マウス実験モデルを用いたのはこのモ
デルがヒトの場合と非常に良く似ているからである。この研究で、発明者らはU
VBで照射されたSKH−1無毛マウスの皮膚に本発明による活性トリテルペン
化合物を局所的に適用した場合にUVBで引き起こされる皮膚病変を防ぐことを
実証することである。
の用量でUVB照射した。マウスを2つの異なった量のF035(1用量あたり
2mg及び4mg)及びネガティブ・コントロール(F060又はアセトンだけ
)で予備処理した。統計的に有意な結果を得るためには1グループ最低10匹の
動物が必要であると考えられる。各テスト化合物を週3回、最大6−10週間に
わたり照射前に10分間局所投与した。これらの化合物の予防効果を評価するた
めにこれらのテストは短期間行われた。UVB照射だけでは目に見えるような腫
瘍は発生せず、特定の時間的枠組み内で皮膚の病変が認められるだけと考えられ
る。軽度の紅斑(皮膚が多少赤みを帯びる現象)が観察される場合もあるが、そ
れは照射の翌日には消えてしまう。
、IL−1400Aラジオメータ/フォトメータを有し、及びSEL240/U
VB−1/TD検出装置を備えたIL−1403UVBフォトセラピー・ラジオ
メータが取り付けられていた。中央部分にはいくつかの部屋があり、そのそれぞ
れにマウスが1匹づつ入れられている。それらの各部屋内部に穴が設けられ、マ
ウスに照射が行われている間適切な換気が行われるようになっている。これらの
部屋は各マウスがUVB光に均等に露出されるように、照射中循環モードで回転
される。UVBランプがONの間は閉めることができるドアが設けられており、
従ってUVBは装置内に閉じ込められる。UVB露出の量はUVBラジオメータ
で測定される。マウスは部屋の中に10−15分以上とどまるべきではない。
効果を確認することであった。UVBは細胞DNAによって直接吸収されて、大
きな遺伝子で突然変異を起こし、それが最終的に癌につながるような病変をつく
りだす。これらの病変の早期検出と各病変の予防は化学的防御効果を意味する可
能性がある(Bertonら、1997;Chatterjeeら、1996;
Younら、1997;Shiraziら、1996;Babaら、1996;
Takemaら、1996)。
ープ内での皮膚肥厚化及び皮膚炎症における偏差の比較検討、及び同じ年齢、及
び同じ成長段階の動物における皮膚の厚みや炎症における動物個体差の比較検討
に十分である。肥厚化と炎症はこの調査で測定される重要なパラメータである。
残りの皮膚は修飾DNA塩基(8−OH−dG)及びオンコジーン発現(Ha−
rasオンコジーン)など他の生物学的指標の測定のために保存される。
にアクセスできるようにされる。動物は食物摂取及び体重増加について毎週測定
される。用いられた動物は生後7週間目で、異系交配で生まれた雌で、ウイルス
に汚染されていないSKH−1無毛マウスである(Charles River
Laboratories、Wilmington、MA)。動物を乱数発生装
置を用いてStatviewプログラムで体重毎にランダム化し、1ケージあた
り5匹を入れて、1日12時間室内照射し、22℃+1.0℃の温度下に保持さ
れる。
ッキントッシュG3上で、偏差、p値、及び線形退縮に関して行われた(Arm
itage、1971)。特に、各薬品グループの皮膚の厚み分析は偏差分析で
行われた(Armitage、1971)。
性のあるトリテルペン類の影響 アポトーシスは胚形成の段階と組織ホメオスタシス中に起きるプログラムされ
た細胞死という通常の生理学的なプロセスである。アポトーシスのプロセスはア
ポトーシス段階の細胞の一連の代謝的変化に分割することができる。1つの細胞
あるいは1つの細胞群でアポトーシスが起きていること、あるいは細胞死のプロ
セスが癌細胞内で中断されたことを実証するためにいくつかの規制あるいは信号
伝達経路の個々の酵素ステップについてのアッセイを行うことができる。アポト
ーシス・プログラムは(非対称性の喪失など)血漿膜における変化、細胞液や核
の濃縮、及びDNAのヌクレオソーム間切断などの形態学的特徴によっても観察
することができる。細胞が『アポトーシス体』に劣化していくと、最終的に細胞
死に至る。
めの技術は多重パラメータ・アポトーシス研究のための標準的手順として開発さ
れている。アポトーシスの初期段階の一例はミトコンドリアからのシトクローム
cの放出と、それに続くカスパーゼ−経路の活性化である(PharMinge
n、Sandiego,CA)。カスパーゼ(一連のサイトソリックプロテアー
ゼ)の誘発はアポトーシスにおいて最も一貫して観察される特徴である。特に、
カスパーゼ−3はそのプロセスで中心的な役割を果たす。カスパーゼが活性化さ
れると、それらは標的の蛋白質を切断し、これらのうちで最も重要なのはPAR
P(核にある蛋白質)である。従って、シトクロームcの放出を検出し、カスパ
ーゼ−3活性を検出し、PARP劣化を検出するアッセイはアポトーシスの有効
な判定方法である。
ログラムされた細胞死の細胞制御の一部の側面を復活させるための治療としての
可能性をもっていると結論付けることができる。
aker、Walkerville、MD)。通常、ホスホチジルセリン(PS
)は形質膜の内膜上に配置されている。しかしながら、アポトーシスの初期段階
に、PSの外化が起きる。アネクシン−VはPSに結合し、フロー血球計測でア
ネクシン−V−FITC染色で観察することができる(Martinら、199
5)。本発明で開示されているアカシア・ビクトリアエ化合物で処理された細胞
のアネクシン−Vと結合する能力は細胞がアポトーシスを起こしつつあることを
示唆する指標として受け取られる。
で処理された細胞におけるアポトーシス活性を検出するためにPI−3キナーゼ
・アッセイが用いられている。細胞膜に結合した酵素であるホスホイノシチド3
−キナーゼ(PI3K)はホスファチジルイノシトールのイノシトール環の3−
位置をホスホリル化することができ、従って、PI3Kが活性であるこれらの細
胞で新しい脂質信号伝達経路を形成する。PI3Kが活性である時、AKTと呼
ばれるキナーゼが細胞膜に呼び集められる。AKTは膜への集合後に触媒的に活
性化されるオンコジーンの生成物である。十分に活性化されたAKTは細胞の生
残りにおいて決定的に重要な役割を果たしている。PI3K/AKT経路は細胞
がアポトーシスを回避するメカニズムを提供する。従って、悪性細胞でPI3K
を抑止する手段はアポトーシスの細胞制御の少なくとも一定部分を復活させるた
めの治療効果を示す効果を持つ可能性がある。
によって行われた。要約的に言うと、1x106個の細胞を60mm3ディッシュ
に入れて、37℃の温度で種々の濃度のF035に露出させた。細胞をPBSで
洗浄して、1x106細胞/mlの濃度で再懸濁させた。最初に細胞を1%パラ
ホルムアルデヒドで、そして次に氷冷70%エタノールで固定した。そして細胞
を0.1%PNAse(Sigma)を含むヨウ化プロピジウム(10μg/m
l;SigmaChemical Co.,St.Louis、MO)で室温で
30分間染色して、Beckton Dickinson FAC SCANで
分析した。
テストされた。Jurkat細胞(1x106)を種々の濃度のトリテルペン・
グリコシド(F035)と純粋な抽出物D1及びD2(0.5−2.0μg・m
l)の混合物で室温で18時間処理した。PBS内で細胞を洗浄した後、それら
を5μlのアネクシンV−FITC接合体(BioWhitaker,Walk
erville、MD)を含んでいる結合緩衝液(10mM HEPES・Na
OH、140mM NaCl、2mM CaCl2)に再懸濁させ、暗中で10
分間インキュベーションした。細胞を次にヨウ化プロピジウム(20μg/ml
)で染色して、フロー細胞計測で測定した(Martinら、1995)。
はワートマニンで0.5時間、いずれも37℃の温度下で処理した。PI−3キ
ナーゼ活性を上に述べたように判定した(Whitmanら、1985;Roy
al及びPark、1995)。5μlのウサギ抗p85抗血清を用いて4℃で
90分間、1mgの細胞性蛋白質からPI3−キナーゼを免疫沈降させた。免疫
複合体を4℃で90分間20%蛋白質A−セファロース・ビーズ上で回収した。
次に免疫沈澱物を30μlのキナーゼ反応物緩衝液(33mMトリス、pH7.
6、125mM NaCl、15mM MgCl2、200mMのアデノシン、
20mM ATP、40μCi[g−32P]アデノシン・トリホスフェートA
TP)内に再懸濁させた。PI3−キナーゼ反応は10μlのPI懸濁液と10
μlのガンマ−ATPの添加で開始され、室温で30分間、反応を継続させた。
1N塩酸を加えて反応を停止させた。その反応混合物からクロロホルム:メタノ
ール(1:1)混合物で脂質を抽出して、シリカ・ゲルG60プレート上でクロ
ロホルム:メタノール;NH4OH:H2O(60:47:2:11.3)で薄層
クロマトグラフィーを行って分解した。放射性物質でラベルしたリン酸ホスファ
チジルイノシトール(PI)をオートラジオグラフィで視覚化して、Storm
860システム(Molecular Dynamics)を用いて定量した。
0.5%FBSを含んでいる培地で培養されたJurkat細胞をF035と純
粋な抽出物D1及びG1(2.0μg/ml)で37℃の温度下で15時間処理
した。これらの細胞をAKT細胞溶解緩衝液(20mMトリス塩酸、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1%トリトンX−100、
2.5mM ナトリウム・ピロホスフェート、1mM8−リン酸グリセロル、1
mM Na3VO4、1mlロイペプチン、1mM PMSF、pH7.5)内で
溶解した。細胞蛋白質(40μl)を8%SDS−ポリアクリルアミド・ゲルで
分解して、ニトロセルロース膜上に電気的に移動させた。膜を最初リン酸特異的
AKT(Ser473)あるいはAKT抗体でプローブして、次にホースラディ
ッシュ・ペロキシダーゼに接合されたヤギ抗ウサギ抗体でプローブした。蛋白質
は化学蛍光(ECL、Amersham、Arlington Heights
、IL)で検出された。
Inc。)誘発NF−kBに対する影響を調べるために、先に述べたようにEM
SAを行った。Jurkat細胞(1x106/ml)を種々の濃度の粗及び生
成抽出物を用いて37℃の温度で15時間処理した。次にそれらの細胞を100
pMのTNFに37℃の温度で15分間露出させた。核抽出物をヒト免疫不全ウ
ィルスLTR、 5‘−TTGTTACAAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCC
AGGGAGGCTGG−3’(配列識別番号:No.9) からの16fmol32P末端ラベル45mer二重鎖NF−kBオリゴヌクレオ
チドと共に、2μg ポリ(dI−dC)の存在下で37℃の温度下で15分間
インキュベートした。DNA蛋白質複合体を7.5%未変性ポリアクリルアミド
・ゲル内で分離した。乾燥したゲルからの放射性バンドをImageQuant
ソフトウエアを用いてPhosphoImager(Molecular Dy
namics、Sunnyvale、CA)によって視覚化、及び、定量した。
MA(100nM)で37℃で72時間培養することによってマクロファージに
分化した。分化された細胞をF035(2μg/ml)で15時間処理して、そ
の後LPS(10μg/ml)で4時間処理して、iNOSを誘発した。Jur
kat細胞は、0.5x106/ml細胞をPHA(10μg/ml)及びPM
A(10ml)で24時間37℃の温度でインベートすることで誘導した。細胞
溶解物をRIPAバッファー(PBS中に1%NP−40、0.5%Naデオキ
シコレート、0.1%SDSを溶解したもの)で冷凍、反復を繰り返して調製し
た。細胞性蛋白質(200μg)を7.5%SDS−ポリアクリルアミド・ゲル
で分離して、ニトロセルロース上に電気的に移動させ、抗iNOS抗体、続いて
ホースラディッシュ・ペロキシダーゼに接合されたヤギ抗ウサギ抗体をプローブ
とした。蛋白質バンドは化学蛍光で検出された(ECL、Amersham、A
rlington Heights、IL)。
(F035)の混合物の影響を上に述べた方法で調べた。図42に示されるよう
に、Jurkat(T細胞白血病)はF035に対して、IC50が0.2μg/
mlであり非常に影響されやすかった。同様に、F035は卵巣癌に対して1.
7−2.8、腎臓癌に対して2.0−3.3、膵臓癌に対して1.2−6.5、
そして一部の乳癌細胞に対して0.72−4.0mlの抑制濃度で多数の癌細胞
の成長を抑制した。しかしながら、残りの乳癌細胞株はF035の細胞毒性の細
胞毒性効果に対して抵抗性を示した。図42の最後の4つのバーは非形質変換(
ヒト及びマウス繊維芽細胞及び固定化乳房表皮)細胞で、F035は癌細胞に対
して特に細胞毒性を有していることを示している。
る細胞毒性についてテストした。図43は、D1が3つの細胞株(769−P、
MDA−MB−453、及びMDA−MB−231)において、F035と同等
のIC50を有している。C−2(HEY変異)及びJurkat細胞では、D1
はF035と同様に強力であった。しかしながら、G1はF035よりかなり細
胞毒性が強く、D1がテストされたすべての細胞のうちで最も毒性が強かったが
、おそらくそれはG1が抽出物D1より極性が低いからであろう(図43参照)
。
誘発 細胞サイクルに対するF035の影響を調査するために、種々の濃度のF03
5でMDA−MB−453及びMDA−MB−435を処理した。表42はG1
における細胞数の増大(7−10%)及びそれと併行したS期における細胞の%
の低下(6−10%)を示しており、これはMDA−MD−453細胞における
G1停止を示唆している。加えて、F035による処理から72時間後に、MD
A−MB435(別の乳癌細胞株)の16%が細胞サイクルのSubG0期にあ
るように思われ(表42参照)、このことは細胞はアポトーシス中であることを
示唆している。この観察はTUNELアッセイによるアポトーシスの研究でさら
に裏付けられた。
で37℃の温度下で、72時間処理した。上に述べた方法でヨウ化プロピジウム
染色した後、細胞周期分析を行った。
、発明者らはF035、D1及びG1で処理したJurkat細胞を用いてアネ
クシンV−FTV結合アッセイを行った。表43は1mlのF035、D1及び
G1(15−17%)で処理した細胞に対する結合を示し、それによって細胞死
に至るアポトーシス経路を示している。
路を調べた。抗p85抗体(アダプタ蛋白質)プローブとその後で行った脂質キ
ナーゼ活性の免疫沈降の結果はF035がJurkat細胞におけるPI3−キ
ナーゼの活性を抑制することを示す。図45AはF035で2時間処理した場合
に、PI3−キナーゼ活性が50−70%抑制されることを示している。6時間
処理した場合にはPI3−キナーゼ活性の92−95%の抑制が観察され、その
傾向は処理後15時間継続した。よく知られているPI3−キナーゼ活性の抑制
因子であるワートマニン[1μM、処理後30分]はJurkat細胞で同様の
酵素活性抑止を示した(図45A)。
抑止する 発明者らはF035と精製抽出物の血清トレオニン・キナーゼ及びP13−キ
ナーゼ信号伝達経路の下流作用因子であるAKTに対する影響について調べた。
P13−キナーゼ活性の急速な抑制とは対照的に、AKTホスホリル化の抑制は
処理から15時間後まで起きなかった。F035(2ml)でJurkat細胞
を15時間処理するとAKTホスホリル化の低下が認められた。しかしながら、
この処理は図45Bにも示されているように総AKT蛋白質のレベルの低下にも
つながった。発明者らは純粋なトリテルペン・グリコシドによるAKT活性の抑
制も確認した。純粋なトリテルペン・グリコシドD1及びG1(2μg/ml)
もAKTホスホリル化及び総AKT蛋白質表現を抑制した。LY294002及
びワートマニン(公知のPI3−キナーゼ抑制因子)によるJurkat細胞の
処理はAKTホスホリル化の抑制を示した。
に関与していることが示されている転写ファクターNF−kBに対するF035
、D1及びG1の影響の評価を行った。図46Aに示す結果は、Jurkat細
胞で、F035がNF−kBのTNF−依存活性を用量に依存した状態で抑止し
た。未処理の細胞及びF035で処理された細胞だけがNF−kBの活性化を示
さなかった。発明者らは、純粋な抽出物D1及びG1を用いてこれらの結果を確
認した。2mlのG1及びG1で細胞を前処理するとNF−kBレベルがそれぞ
れ54%to87%低下した(図46B)。D1又はG1だけで処理した細胞は
NF−kBの活性化を示さなかった。最近、PI3−キナーゼがNF−kBを規
制することが示されたように、ワートマニンによる細胞の前処理はTNF誘発N
F−kBのほとんど完全な抑止をもたらした。
誘発に対するF035の影響について調査した。マクロファージに分化されたU
−937細胞においては、発明者らはLPSに応答してiNOSを誘発した(図
46C)。F035(1μg/ml)でこれらの細胞を前処理すると、iNOS
の誘発が阻止された。ワートマニンもこれらの細胞LPS誘発iNOSに対する
同様の効果を示した。
を調べた。iNOSを上に述べた方法でPHA及びPMAを用いて誘発させた。
これらの結果はF035によるJurkat細胞の前処理がいNOSの誘発を阻止
したことを示している。
(PARP)の蛋白質分解によって切断した。Jurkat細胞(2x106/
ml)を異なった時間F035(2μg/ml)及びD1(2μg/ml)で処
理した。細胞溶解物を20mM HEPES、250mM NaCl、2mM
EDTA、0.1%NP−40、2μg/mlのレウペプチン、0.5μg/m
lのベンズアミド、1mM DTT及び1mM PMSFを含む緩衝液内で調製
した。細胞蛋白質(60μg/ml)は7.5%SDSポリアクリルアミド・ゲ
ル上で分離して、ニトロセルロース膜上に電気的に移動させた。この膜を最初に
モノクローナル抗RARP抗(Pharingen)で、次にホースラディッシ
ュ・ペロキシダーゼ(HRPO)に接合された抗マウス抗体でプローブした。蛋
白質バンドは化学蛍光(ELC、Amrshamm)によって検出された。11
6−kDa PARPの85−kDa及び41−kDaペプチド生成物への切断
の程度がアポトーシスの尺度として用いられた(Tewariら、1995)。
した(Enariら、1995)。要約的に言うと、Jurkat細胞(1x1
06/ml)をF035、D1及びG1で時間を変えて処理した。300μlの
抽出緩衝液(12.5mMトリス、pH7.0、1mM DTT、0.125m
M EDTA、5%グリセロル、1μM PMSF、1μg/mlレウペプチン
、1μg/mlペプスタチン、及び1μg/mlアプトチニン)内で冷凍、解凍
を繰り返すことで調製した。細胞溶解物を氷冷緩衝液(50mMトリス、pH7
.0、0.5mM EDTA、4mM DTT及び20%グリセロル)と1:2
の割合で希釈して、20μMのカスパーゼ3基質(アセチル−Asp−Glu−
Val−Asp−アミノメチルクマリン)で37℃で培養した。カスパーゼ−3
活性を蛍光性アミノメチルクマリンの生成で観察したが、これはFluoros
can II(Labsystems、Helsinki、Finland)を
用いて励起355nM、放出460nMで測定された。
をウェスタン・ブロッティングで検出した。Jurkat細胞(10x106)
をサクロース緩衝液(0.25Mサクロース、30mMトリス、pH7.7、1
mM EDTA)内で洗浄した。細胞ペレットに1μM PMSF、1μg/m
lレウペプシン、1μg/mlペプスタチン、及び1μg/mlアプロチニン)
を含む20μMサクロース緩衝液を加えた。細胞を0.3mlKontesダウ
ンサー内でBペストル(Kontes Glass社)を用いて1に120回ダ
ウンシングすることで破壊した。細胞蛋白質(60μg)を15%SDS−ポリ
アクリルアミド・ゲル上で分解して、ニトロセルロース膜上に電気的に移動させ
た。膜を最初はモノクローナル抗シトクロームC抗体(Pharmingen)
で、次にホース・ラディッシュ・ペロキシダーゼ(HRPO)に接合された抗マ
ウスでプローブシタ。蛋白質バンドを化学蛍光(ECL、Amershamm)
で検出した。
を誘発する。図47に示す結果は、4時間で、F035とD1の両方ともRAR
Pの切断を誘発し始め、6−8時間でほぼ完全な切断が起きる。このことはカス
パーゼの役割を示唆しており、それによってF035及びD1に誘発される細胞
死に関与するメカニズムであるアポトーシスについても示唆している。
、発明者らはF035で処理した細胞に対するz−vad fmk及びカスパー
ゼ抑制因子の影響を調べた。100μMのz−vad fmkで37℃の温度で
1時間Jurkat細胞を前処理するとPARPのF035誘導切断が完全に逆
転された(図48)。
割を強く示唆している。発明者らは次に、このプロテアーゼが時間に依存した形
態でカスパーゼ−3のPARPのすぐ上流に配置されるので、F035、F09
4、D1及びG1で処理した細胞におけるカスパーゼ−3の活性化についてッ調
べた(図49)。活性化はすべての場合に処理の4時間後に起こり、6−8時間
後にピークに達し、その後弱まる。
の活性化の原因であるように思われる。これがF035誘発アポトーシスで実際
にそうであるかどうかを調べるために、発明者らはF035で処理した細胞の細
胞核抽出物におけるシトクロームCのレベルを調べた。発明者らはこれらの細胞
のミトコンドリアから時間に依存した形態でのシトクロームCの放出が起きるこ
とを見出した(図35)。発明者らはシトクロームCの放出がF035による処
理から4時間後に起き、これはカスパーゼ−3の活性化及びPARPの切断が始
まる時間と一致していることを認識した。それがカスパーゼ−3活性化に先立つ
のかどうかを調べるためには、それより早い時点で調べてみる必要がある。
濃縮されるという知見に照らして、化合物を単離するのに適した組織を繁殖させ
る方法の開発が望まれた。この目標を達成するためエアロポニック栽培システム
が、アカシア・ビクトリアエ根を育てるために考案された。エアロポニック栽培
システムとは閉じたシステムであり、植物の根が大気中に懸架され、完全な養素
液を噴霧するシステムである。大きさ3/4インチの合板シートを互いにネジ止
めして、グラスファイバー・シートで内張をして8x4x3.5フィートの防水
性の箱を作成した。箱の上部を、全面的に貫通した12個の円形孔のある2枚(
2x8フィート)のスチロフォーム・シートで覆ったが、今後の作業に半透明で
共押出し成型の白黒ポリエチレンで被覆したPCV被覆育成箱の設計も考えられ
ている。プログラムにより、4.5分毎に12秒間繰り返し根に噴霧した。
ジェット中空円錐状のポリプロピレン噴射ノズルを備えた、3/4インチのPV
C管から構成されたクローズド・システムである。720リットルの養素液の槽
がその室の底部に配置され、外部のポンプを使用して下から植物の根に噴霧した
。使用したポンプは/Little Giant 4−MD3250RPM,1
/12hpである。
マーセットによって制御された。温度は、電気式の屋内/屋外、最小/最大値に
対するTaylor温度計を用いて監視し、手作業で記録した。水中で機能でき
る加熱器として二個のVisi−therm300Wを使用して、冬期数ヶ月間
養素液を加熱したので周辺の大気を加熱することなく、アリゾナ州Tucson
で、暑さや寒さを避けた戸外の日陰ハウスで、植物の活発な成長の維持に十分で
あった。
。植物が違うと適切に成長させるために異なる濃度と組成が求められるが、単一
の植物を成長させる場合は、均等な溶液で満足する結果が得られる。この溶液の
成分は以下の表44に示す通りである。
ト50%で構成され、土壌を含まない混合体に蒔種した。実生には1日に2回水
をやり、オズマコートを1日1回肥料として与えた。実生の長さが通常成長3ヶ
月ないし4ヶ月に達成される15−20cmの長さになると、その根球を徹底的
に洗浄して、微量な泥炭コケおよびバーミキュライトを全て除去した。次に根を
スチロフォーム・ボードの孔を通し、苗木の先端は温室構造体から降ろす糸で上
部から支えるようにした。7.0cmの発泡管状体で実生の頂部の周りを包み、
葉およびその周辺の領域を噴霧液が当たらない様にした。次に、その箱の約30
cmを養素液で満たして、ポンプの電源をいれた。
て、糸より上に成長する苗木を摘み取ること、および水位が10cm以下になっ
た場合だけ養素液を補充することで維持がなされた。実生が温室中で成長してい
る場合、養素液の温度制御は必要ではない。しかしながら、エアロポニック箱が
周辺の環境状態の影響を受ける場合、その植物が冬期数ヶ月間休眠状態にならな
いように肥液の温度を70°Fまで上げるのが望ましい。
接洗浄し、塊状根を噴射器の数インチ上にあるハサミで切断する。余分な水は、
紙タオルでかるくたたいて乾燥し除去した後、試料を計量する。つぎに塊状根を
ハサミで3−4インチの部分に切断して、上記の化学抽出にかける。別に、根を
継続的に収穫するために、ポンプの電源を切り、根を成長している塊状根から摘
み取る。次にこれらの根を記載のように3インチ−4インチの部分に切断して抽
出する。収穫しない根には損傷のないように注意を要する。
、植物の成長速度は従来に成長技術で達成される成長速度の約2倍ある。第2に
、植物を損傷させることなく必要に応じて容易に根を収穫ができる。さらに根を
上に述べたように切断することで、ひげ根が横方向に成長し、広がっていく。従
って、根を1年に数回収穫できる。最後に、最初に花が咲くまでに戸外での植物
では3−4年かかるのに対して、エアロポニック式で栽培された植物は1年で開
花した。
で成長する植物から種子を採取した。種子を無処理の生水内で抗菌性石鹸で徹底
的に洗浄し(Vionex Viro Research Internati
ona/l Inc. USA Durango Co/lorado)、その
後、市販の漂白剤を20%(v/v)に希釈したもので15分間で処理した。脱
イオン水で繰り返し洗浄した後、種子を沸騰水で処理し(100個の種子に対し
て200m/l)、一昼夜放置、冷却する。次に、市販の漂白剤を20%(v/
v)に希釈したもので20分間で処理し、滅菌した脱イオン水で2−3回洗浄し
、MS培地(MurashigeおよびSkoog,1962)及び1/2強度
のMS培地で培養した。その培地はMSビタミン、2%(w/v)スクロースで
補強され、0.7%寒天または0.2%ゲルライトのいずれかでゲル化した。本
研究において、濃硫酸で種子を殺し、無菌水で洗浄し、培地で培養した。全ての
媒体を121℃、15分間オートクレーブにかけた。培養体を、低温白色蛍光管
で発生する1000/luxの照明で、16時間照明することにより、25+2
℃の温度に維持した。各研究は、同様のサンプルをそれぞれ18個づつ用意して
行われた。
地だけ、及び0.1mg/lオーキシン(IAA、NAAまたはIBA)とBA
P(0.1,0.3、0.5,1.0及び1.3mg/l)を個別にあるいは組
み合わせたものを付加したMS培地で培養した。シュートを根づかせるためにI
AA(0.1mg/l),IBA(0.1および0.6mg/l)及びNAA(
0.1および0.2mg/l)を用いてテストを行った。土壌に移すために植物
を培養管から取り出して、その根を無処理の生水で洗浄し、根に付いた肥料を除
去し、砂主体の土壌を満たした鉢に移した。3週間その植物をマジェンダ箱で覆
い、湿気を維持し、噴霧を継続し、照明を低くした状態を保持した。3週間後マ
ジェンダ箱をとり除き、植物を噴霧状態から照明を強くした温室に移した。
や根の断片からカルス組織を誘導した。外植体を2,4−D(1mg/l),N
AA(0.5&1mg/l),チジアゾロン(0.2mg/l),ジカンバ(0
.2&2mg/l),BAP(0.3mg/l),およびKN(0.5および0
.3mg/l)を個々に、あるいは組み合わせたものを添加したMS培地内で培
養した。
以内で完全な実生苗が得られた。熱水処理をしないで培養した種子は発芽しなか
った。寒天(0.7%)と比較してゲルライト(0.2%)を含む固形培地で高
い割合で種子が発芽した。ゲライトで固形化した半分の強度のMS培地で、最大
発芽率88.7%であることを指摘している。種々の培地との発芽状態のおおよ
その関係を表45で示す。
水準で休止状態になるので、イン・ビボでの発芽率が低い(Kau/l及びGa
nguly,1965;Grice及びWestoby,1987)。休止状態
を克服するために種子の外皮を先鋭な器具で傷つけるか、酸による処理にかける
か、または沸騰水で処理をするかのいずれかで処理して、一昼夜、水中でそのま
ま冷却しておく必要がある。発明者らは、沸騰水処理を行い、その後0.2%の
ゲルライトでゲル化した1/2MS培地で種子を培養することによって、発芽率
が88.7%まで増大できることを発見した。/Larsenら(1964)に
よれば、イン・ビボで沸騰水処理した場合に、アカシア・ビクトリアエの発芽率
が36%も増大した。前処理をしなかった場合の発芽率は19.4%であった(
Kaul及びGanguly,1965)。さらに、幼根の出現には12日間か
かり、完全な苗木の回収は79日後であった。本発明による方法によれば、発芽
率が(88.7%)に増大し、移植可能な実生を3−4週間で得ることができる
。
長さ約1.0cm)をMS培地だけとBAおよびIAAを組み合わせたBAで補
強したMS培地のいずれかで培養した。MSだけの培地では、シュートの活力が
乏しく、根の成長も乏しい(1−3根/培養体)。BA(1.3mg/L)を含
む培地の場合、シュートチップは複数のシュートを作りだす(平均3.94シュ
ート/培養体)。複数のシュートのうち1つ又は2つのシュートが細長くなり、
4週間後に8.6cmの高さになった。BAとIAAの組み合わせで補強した培
地は複数のシュートの誘導にも好ましいものである。応答に関する概要を表46
示す。
。BA(1mg/L)+IAA(0.2mg/L)の組み合わせはシュートの育
成には良好であることが分かった。カルスは、BA−IAAの組み合わせの場合
、すべての切断端部で観察された。Kaurら(1998)によるAcacia catec
huに関する報告によれば、BA−NAAの組み合わせ及びより高い水準のNAA
(1−2mg/L)の使用は、新芽の蕾みの誘発に関して格別の利点をもたらさ
なかった。LAAはシュートの芽の形成促進には効果を及ぼさなかったが、その
代りカルスは、外植の基部でつくられた。
A,NAAまたはIBAを含む培地に移植した。反応の概要を表47に示す。テ
ストした処理体うち、1/2MS+NAA(0.2mg/L)が根付きに適して
いることが分かった。シュートは4週間後に高さが9−11cmになった。Acac
ia catechu(Kaurら、1998)において、根とシュートの結合点でカルス
の形成が間歇的であり、彼らは、スクロースの濃度を3%から1.5%に減少さ
せたものを用いてカルス形成を調節したことを報告している。同様の結果が、F
eronia limonia(Purohit及びTak,1992)および
Acacia auriculiformis(Dasら、1993)でも報告されている。本研究で
は、3%のスクロースでわすかなカルス形成が観察され、2%のスクロースで最
小であった。根付いたシュートを温室に移植した。移植の後の生存率は100%
であった。苗木を3週間霧状態下で順応させ、その後温室の通常の状態で苗木を
成長させた。
断片を、0.1mg//L IAA、NAAまたはIBAで補強したMS培地で
培養した。外植あたり1つまたは2つの葉腋シュートしか発生しなかった。これ
らのシュートの成長はゆっくりしていた。一方、節外植は、その後の研究には使
用されなかった。
した発芽実生から切り出した胚軸の断片から誘発された。2,4−D(1mg/
L)、チジアズロン(0.2mg/L)、ジカンバ(0.2mg/L)に発生し
たカルスは、緑色で、引き締った固いものである。発生したカルス量は、テスト
でもちいられたほとんどの濃度で中程度であった(表51)。多量のカルス発生
が2,4−D84mg/L)+IAA(1mg/L)+NAA(1mg/L)補
強MS培地で観察された。
(1mg/L)の場合だけ、およびKN(0.5mg/L)と組み合わせ2、4
−Dで補強されたされたMS培地で培養したところ、カルスから発生した2−3
の根を持つ薄黄色の柔らかいカルスの発生した。カルス形成はすべての培養体で
観察された。BA(0.3mg/L)+IAA(0.2mg/L)を添加した培
地に根の断片から、白みがかった、柔らかく、もろく、そして豊富なカルスが形
成することが観察された。IAAおよびNAAをそれぞれ1mg/Lと組み合わ
せた2,4−D(4mg/L)を添加した培地に培養された根の断片に、淡い黄
色みがかった豊富なカルスの形成が観察された。同様なタイプのカルスの形成は
、チジオズロン(0.2mg/L)+ジカンバ((2mg/L)およびIAA(
0.1mg/L)を使用した場合にも観察されている。根の断片はジカンバ(2
mg/L)+IAA(0.1mg/L)を含む培地で培養され、淡い緑色の締ま
った、固いカルスが形成された。カルスから苗木を再生する試みは成功しなかっ
た。カルスの誘発に対する外植のタイプ間の偏差は、アルビイジア レベック(
Lakshmana RaoおよびDe、1987)およびロニセラ ジャポニ
カ(Georgesら、1993)などいくつかの木性種で報告されている。発
明者らの研究において、同一の培地で発生した胚軸由来のカルスと根由来のカル
スとの間に違いがあることも分かった。BA−IAAの組み合わせ培地の胚軸か
ら発生したカルスは淡く緑がかった色で、固く、締まっているが、根の断片から
のものは、白みがかった、柔らかく、もろいものであり、いくつつかタイプを組
み合わせたカルスからの分化した根の発生も観察された。ダルベルジア・ラチフ
ォリア(Dalbergia latifolia)においてはカルスは、締ま
った、固く、暗緑色になり、シュートの芽の分化が観察された(Pradhan
ら、1998)。発明者らの研究においても同様のタイプのカルスの発生が指摘
されたが、こうしたカルスは再生できなかった。この研究で発明者らは、アカシ
ア・ビクトリアエが、イン・ビトロでシュートチップから増殖できることを確認
した。この技術はいろいろなタイプの実生集団の中から選ばれた個体の微小繁殖
及び将来の研究のため選ばれた株の保存のために有益である。
誘導 アカシア・ビクトリアエの植物材料をアグロバクテリュウム・リゾゲネス(Ag
robacterium rhizogenes)で感染させると、植物ゲノムヘのT−DNAの組み込
みと発現が起こり、ヘアリールート表現形発生の要因となる(Grantら、1
991)。ヘアリールート培養の成長は非常に速く、ホルモンを含まない培地で
は根が斜行的に成長することが示され、非常に良く分枝する。ヘアリールートは
また遺伝的に高い安定性を示した(Airdら、1988)。多くの双子葉植物
は、アグロバクテリュウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)に感染し
易く、植物は、多くの種でヘアリールート培養から再生されてきた(Chris
tey,1997)。
ルートの遺伝子の形質転換および誘導が発明者らによって達成された。遺伝子の
宿主植物ゲノムに遺伝子を形質転換する土壌細菌アグロバクテリュウム・リゾゲ
ネス(Agrobacterium rhizogenes)の天然の能力によって感染部分に根が形成さ
れることを用いて、ヘアリールート培養体を製造する。ヘアリールートは成長が
極めて速く、根の違った位置での分枝性が高いことを特徴とし、イン・ビトロの
ホルモンを含まない培地で連続的に成長させることができる。
リュウム・リゾゲネス・プラスミドpRiA4が挿入されたアグロバクテリュウ
ム・ツメファシエンスの遺伝子工学処理株、ATCC番号43056)を使用し
て、アカシア・ビクトリアエのヘアリールートの誘導を実証した。ヘアリールー
トに含まれる化合物の生成はHPLCで確認された。ヘアリールートの誘導は、
以下のように実施された。先ず最初に、アカシア・ビクトリアエの種子は、アリ
ゾナ州Tucsonの地域で成長した植物から収集したものである。その種子に
沸騰水を注ぎ、冷却水で一昼夜浸漬し、その表面を市販の漂白剤を15%に希釈
したもので30分間滅菌した。滅菌水で繰り返し洗浄した後、種子を250ml
の円錐形フラスコに、50mlの媒地にMSビタミンおよび2%のスクロースを
加えた液状MS媒体で培養した(Murasige及びSkoog、1962)
。培養体は25℃±2℃の暗い成長室のらせん状シェーカーに保持された。培養
4日後、発芽した実生から胚芽軸を切り取り、アグロ感染させるために使用した
。
erium rhizogenes)菌株R1000をYENB培地で一昼夜成
長させた。YENB培地にはイースト抽出物7.5g/Lおよび栄養ブロス(D
ifco Laboratories,Detroit,MI)8g/Lを加え
て調製した。外植の胚芽軸を、細菌の入った溶液に浸されていた微細なステンレ
ス針を用いて感染させた。感染後、微量の細菌懸濁液(MS媒体で1:20)を
外植の表面に滴下した。その後、共培養のために、外植をMS培地、および、ア
セトシリンゲン(100μM)(3,5ヂメトオキシー4ヒドロオキシーアセト
フェノン、Aldrich Chem.Co.Milwaukee、WI)を含
むMS培地に移した。共培養は暗状態下で3日間実施した。共培養から3日後、
MS+セフォタクシン(Cefotaxime)(500mg/l,Agri−
Bio,North Maiami,F1)培地に移して、外植体に対する細菌
の過剰増殖を制御した。3−4週間経過した胚芽軸より発生する若葉よりほとん
ど感染部位から発根が開始することが示された。4週間後、根と共に外植をMS
のみの培地に移し、暗所で継続して培養し、ヘアリルートを発生させた。なお、
ヘアリールートの発生はさらに8週間経過後である。従って、ヘアリールート発
生のためには、いくつかの継体培養によるMS培地経路がある。一組のプライマ
ーを使用してPCRTMでrol B遺伝子部位を増幅することによって、ヘアリ
ールートの異種遺伝子融合的性質が確認された。使用されたプライマーは次の通
りである。 1) 5′GAGGGGATCCGATTTGCTTTTG3´[SEQ ID NO.7] 2) 5 CTGATCAGGCCCCGAGAGTC3′[SEQ ID N
O.8] PCRTM反応混合物50μ/lは、プライマー(それぞれ最終濃度が1μM)、
Taqポリメラーゼ(1.0U)各dNTP 125μM、1X PCRTM反応
緩衝液、1.5mM MgCl2、単離したDNA300ngを含んでいた。用
いられたPCRTMの条件は、92℃5分間の変性開始、続いて92℃50秒の変
性、55℃1分間のアニーリング、及び、72℃1分半の伸長の35サイクル、
並びに、72℃7分間の最終伸長であった。645bp断片が増幅された。
S半固体培地で成長中のヘアリールートを切り取り、異なる容量のフラスコ(1
25、250、500及び1000m/l)でMS液状培地をそれぞれ20、5
0、100および400m/lにした培地で培養した。ヘアリールートの成長は
、以下の塩基性媒体、つまりMS、Nitsch及びNitsch(N and
N)(1969)、SchenkおよびHilderbrandt(SH)(
1972)と、Woody Plant Medium(WPM)(Loydお
よびMcCown、1981)を用いてもテストした。種々の炭素源の毛根成長
に対する効果をテストするために、MS培地にスクロース、グルコース、フルク
トース、およびマンノースそれぞれ2%(w/v)を加えた。ジベレリン酸(0
.1、0.5および1mg/l)のヘアリールート成長への効果を、オートクレ
ーブ処理後、MS培地にろ過滅菌溶液を加えてテストした。
的に形質転換されたヘアリールートのクローンは、アセトシリンゴン(100μ
M)の存在下でR1000菌株で感染した胚芽軸から形成された。アセトシリン
ゴンなしでアグロバクテリュウム・リゾゲネス(A. rhizogenes)で共培養した
胚芽軸はヘアリールートを発生しない。アセトシリンゴンの存在下で3日間共培
養するのがヘアリールート誘発には最適であることがわかった。アセトシリンゴ
ンの促進効果は、Salvia militiorrhiza(Hu及びAlfermann,199
3)でも報告されている。この結果は、アグロバクテリュウムvir遺伝子活性
因子としてアセトシリンゴンが形質転換頻度を増大させることを示した。同様に
本研究でも、ヘアリールート誘発にはアセトシリンゴンが必要であることが確認
された。
のrol B遺伝子を増幅させることで確認された。診断用の645bpの断片
はテストする4つのヘアリールートクローンで増幅させた。
々の塩基性媒体のうちで、MS培地はヘアリールート成長に最適であることが分
かった(表56)。125m/lのフラスコ内で、4週間後に268倍に成長し
た。WPN及びNとN培地の場合、それぞれの成長率はそれぞれ254倍および
196倍であった。B5およびSH培地はヘアリールート成長には好ましいもの
ではなかった。ヘアリールートはこれら二つの培地でゆっくりと褐色に変色しは
じめた。本研究で、ヘアリールートは、容量の違うフラスコ(125、250、
500および1000ml)でMS培地それぞれ20、50,100および40
0m/l内で成長させた。成長速度の概要を表55に示す。最初に、ヘアリール
ートの成長が非常に速い撒種材料を用いて150m/lと125m/lのフラス
コ内で4週間経過させると、25.77倍の成長率が達成された。フラスコの容
量の増大につれて根の成長がわずかに減少した。
けやすい(WysokinsukaおよびChmiel,1997)。アカシア
・ビクトリアエに関して、5種の違った塩基性媒体(MS、N and N、S
H、WPM、および、B5)を用いてヘアリールート成長に対する効果をテスト
した。成長にはMS培地が最もよいことが分かった。Sakaiら(1998)
は種々の養分を含んだ培地におけるColeus foskohliiのヘアリールートの成長を
比較して、WPMは毛根成長に最適であることを確認した。
と比較してスクロースがヘアリールート成長に好適であることが確認された。最
大の成長度(24.52倍の増大)はスクロース含有培地にあることが分かった
。グルコース含有培地は、成長をわずかに抑止し、マンノースは、成長を完全に
抑止する(表57)。Catharanthus roseusの場合、培地内で炭素源としてフラ
クトースの使用することにより、カサランチンの生産を二倍に速めることができ
る。しかしながら、フラクトースを使用することで、スクロースと比較して、成
長が約40%減少することを報告している刊行物もある(Jungら、1992
)。
WysokinskaおよびChmiel,1997)、ヘアリールートを継続
的に成長させるために、外因性成長調節要素を添加する必要がない。しかしなが
ら、外在性ホルモンは成長を刺激するという報告がある。発明者らは、ヘアリー
ルートの成長に関しジベレリン酸(0.1、0.5、および1.0mg/l)の
効果をテストした。ヘアリールートの成長は、GA3含有培地と比較すると、G
A3を含有しない培地が最適である(15.77倍増大)。GA3の濃度の違いは
成長の有意差をもたらさなかった(表58)。アルテミシア(Artemisia)にお
いて、GA3は一般的に生物量の蓄積を促進しないが、GA3を含有しない培地で
の培養成長と比較して、より速く静止期に容易に達成できる(Smithら、1
997)。GA3に対するブラシカ・カンジタ(Brassica candida)のヘアリー
ルート反応はテストされたクローンへの依存性が非常に強いことをRhodes
ら(1994)は発見した。しかしながら、彼らの観察によれば、一般的にGA 3 は成長に良好な影響を及ぼし、成長形態の変化に伴うアルカロイドの蓄積が減
少する。Ohkawaら(1989)の報告によると、GA3の濃度が10ng
/l及び1mg/lで、Datura innoxiaのヘアリールートの成長を促進し、伸長
をたかめ、側面の分枝を増大する。Zobel(1989)は、GA3が根の成
長のためCO2と同様の作用効果を有していることを示唆した。アカシア・ビク
トリアエの毛根に対して、GA3は、成長促進効果は示さず、種々の遺伝子型が
異なる反応を示す。
個々に精製した化合物を含む本発明のトリテルペン・グロコシド組成物は、単離
可能な植物組織を均質に培養するための適切な手段を提供する。
成長は2%スクロースを含むMS培地で得られた。ヘアリールートの成長に関し
、フラスコ容量の相違およびジベレリン酸の影響を試験した。ヘアリールートは
、125m/lの円錐形フラスコに20mlの培養液で旋回振動器を用い、MS
液状培地でも成長させた。4週間で84倍も成長したことは注目に値する。F0
35と同定されるものに相当するとトリテルペン・サポニンが生成させることが
、標準的で真正な試料を用いてHPLC分析で確認された。
して過剰な実験を要することなく作成、実行することができる。本発明の組成物
および方法は好ましい実施の形態として述べられたものであるが、本発明の概念
、精神および範囲を逸脱することなく、ここに述べた組成物および方法に対して
、あるいはその方法における1つ、あるいは一連のステップに対して修正を加え
ることができることは当業者には明らかであろう。より詳細には、種々の化学的
及び物理的構成要素を上に述べたものに代えて使用することが可能であり、同じ
または同様の結果が達成できることはあきらかであろう。こうした同様の置換や
修正のすべては、本請求の範囲に記載の本発明の精神、措置、概念の範囲内にあ
ることは当業者には明白であろう。
を提供する程度に、本明細書に組み込まれる。
number of species transformed by Agrobacterium rhizogenes, " Plant Cell
Tissue Organ Cult., 15:47-57; 1988. Akiyama et al., J.Biol. Chem., 262:5592-5595. 1987. Allen et al.. "Leguminosae, A source book of characteristics uses and nodulation," The University of Wisconsin Press, Madison Wisconsin 1981.
Armitage, In: Statistical Methods in Medical Research, Wiley and Sons,
New York, NY, p 205, 1971. Amon, R.,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:6769-6772 1980. Baba, Hanada, Hashimoto, "The study of ultraviolet B-induced apoptosis
in cultured mouse keratinocytes and in mouse skin," J Dermatol. Sci., 12
: 18-23, 1996. Baxter, Price Fenwick, "Sapogenin structurc analysis of the 13C- and 1H-NMR spectra of soyasapogenol b," J, Nat. Prod., 53 :298-302, 1990. Bellacosa,Feo,Godwin Bell, Cheng, et al., Int. J. Cancer, 64:280-285, 1995. Berton, Mitchell, Fischer, Locniskar, "Epidermal proliferation but not
the quantity of DNA photodamage i s correlated with UV-induced mouse skin carcinogenesis," Invest. Dermatol., 109:340-347, 1997. Beutler, Kashman, Pannell, Cardellina, Alexander, Balaschak, Prather, Shoemaker, Boyd, Bioorganic and Medicinal Chemistry, 5:1509-1517, (1997)
. Boil and von Philipshorn,"NMR studies and the absolute configuration of
Solanum alkaloids (spiroaminoketalalkaloids), Acta Chem. Scand,, 19:1365
-1370, 1965. Brinkmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88(19):8616-8620, 1991 .
Burchell et al., J. Immunol., 131(1):508-513, 1983, Campbell, in Monoclonal Antibody Technology, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Vol. 13, Burden and Von Knippenberg,
Eds, pp. 75-83, Amsterdam, Elseview, 1984. Capaldi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 76:425, 1977. Capon and Thacker, "The nuclear magnetic resonance spectra of some aldofuranosides and acyclic aldose acetals," Proc. Chem Soc Lond., 369,
1964, Chatterjee, Agarwal, Muhtar, "Ultraviolet B radiation-induced DNA lesions in mouse epidermis," Biochem. Biophys. Res. Commun., 229:590-595
, 1996. Cheatham et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , 92: 11696-11700, 1995. Cheeke. Can. J. Animal Sci., 51:621 -632, 1971. Chen and Snyder, "Diosgenin-bearing, molluscicidal saponins from Allium
vineale; an NMR approach for the structural assignment of oligosaccharide units," J. Org. Chem., 54:3679-3689, 1989, Chen and Snyder, "Molluscicidal saponions form Allium vineale," Tetrahedron Lett., 28:5603-5606, 1987. Cho, Widholm, Tanaka, Nakanishi Murooka,"Agrobacterium rhizogenes- mediated transformation and regeneration of the legume Astragalus sinicus (Chinese milk vetch)," Plant Science, 138:53-65;1998. Chou and Bienis, Cel1, 85:573-583, 1996. Christey, "Transgenic crop plants using Agrobacterium rhizogenes- mediated transformation," Doran, P.M.. (ed.) Hairy roots: Culture and ap
plications, Harwood, Amsterdam, 99-111,1997. Colcher et al,, Cancer Res., 47:1185 and 4218,1987. Coliart, Baeuerle, Vassalli, Mol. Cell. Biol., 1O:1498-1506, 1990. Creelman et al., Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 89:4938-4941 , 1992. Davis & Preston Analytical Biochemistry, 116(2):402-407,1981 . Davis, Sinensky, Junker, Pharmac. Ther., 43:221-36, 1989. Defago, Ber.Schweiz. Bot.Ges., 87:79-132, 1977. Dillman et al., Antibody Immunocon. Radiopharm., 1:65-77, 1988. Doll,R.el al., Lancet l:793, 1962. Enari. Hug, Nagata, Nature, 375:78-81,1995. Folkman, Haudenschild, Zetter, Proc. Natl. Acad. Sci., 76:5217-5221,1979
.Franceschi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:6745-6749, 1991. Frechet, Christ, du Sorbier, Fischer, Vuilhorgne, "Four triterpenoid saponins from dried roots of Gypsophila species," Phytochemistry, 30:927
-931 ,1991. Gamborg, Miller, Ojima, "Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells,"Exp. Cell Res.,50:151-158; 1968. Gariboldi, Verotta, Gabetta, "Saponins from Crossopteryx febrifuga, Phytochemistry, 29:2629-2635, 1990. Gefter et al., Somatic Cell Genet., 3:231-236, 1977. Ghose et al., CRC Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,
3:262-359, 1987. Ghose,et al.,Meth. Enzymology, 93:280-333, 1983. Goding,1986, In: Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2d ed., Academic Press,Orlando,Fla., pp. 60-61, and 71-74, 1986. Grant, Dommisse, Christey, Conner, "Gene transfer to plants using Agrobacterium," In: Murray, D.R., (ed.) Advanced methods in plant breeding and biotechnology, CAB International, Wallingford, 1991:50-73.
Gundalch et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 89:2389-2393,1992. Hamburger, Slacanin, Hostettmann, Dyatmiko,Sutarjadi,"Acetylated saponins with molluscicidal activity from Sapindus rarak: unambiguous structure determination by proton nuclear magnetic resonance and quantitative analysis," Phytochem. Anal., 3:231-237, 1992. Hansen, Nielsen,Berg, J.Immunological Methods,119:203-210, 1989. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Harwood, Chandler,Pellarin, Bangerter, Wilkins, Long, Cosgrove, Malinow,
Marzetta, Pettini, Savoy, Mayne, "Pharmacologic consequences of cholesterol absorption inhibition: alteration in cholesterol metabolism
and reduction in plasma cholesterol concentration induced by the synthetic saponin β-tigogenin cellobioside (CP-88,818; tiqueside), J,
Lipid. Res. 34:377-395, 1993. Hassanain, Dai, Gupta, Anal. Biochem., 213:162-167. 1993. Hostettmann et al.,"Chemistry and pharmacology of natural products,"In
Saponins, Cambridge University Press,pp.1-548,1995. Hu, Alfermann,"Diterpenoid production in hairy root cultures of Salvia
miltiorrhiza," Phytochemistry, 32(3):699-703; 1993. Huang et al., Zhongueo Yaoii Xuebao, Chemical abstract No.98100885, 3: 286-288, 1982. Ikeda, Fujiwara. Kinjo, Nohara. Ida, Shoji, Shingu, Isobe,Kajimoto, Bull
. Chem. Soc. Jpn., 68:3483-3490 (1995). Inoue, H., et al.,Cnem.Pharm Bull.6) 2:897-901,1986 Jansakul,Baumann, Kenne, Samuelsson, "Ardisiacrispin A and B,two utero-contracting saponins from Ardisia crispa," Planta Medica, 53:405-
409, 1987. Jiang, Massiot,Lavaud,et al.,"Triterpenoid glycosides fromthe bark of Mimosa tenuiflora,Phytochemistry,30:2357-2360, 1991. Jung, Kwak, Kim, Lee, Choi, Lin, "Improvement of the catharanthine productivity in hairy root cultures of Catharanthus roseus by using monosaccharides as a carbon source," Biotech. Lett., 14:695-700; 1992.
Kamel, Ohtani, Kurokawa,et al., "Studies on Balanites aegyptiaca fruits,
an antidiabetic Egyptian folk medicine," Cnem,Pharm,Bull., 39:1229-1233
, 1991. Kasiwada et al., J. Org. Chem., 57:6946-6953, 1992. Kelly and Tsai, "Effect of pectin,gum arabic and agar on cholesterol absorption, synthesis and turnover in rats," J.Nutr., 108:630-639,1978.
Kennedy, Wagner, Conzen, Jordan, Bellacosa, Tsichlis, Nissam, Genes and
Dev., 11:701-713,1997. Kimura et al., Immunogenetics, 11:373-381,1983. Kinjo, Araki, Fukui, Higuchi, Ikeda, Nohara, Ida. Takemoto, Miyakoshi,
Shoji, Chem. Pharm. Bull. 40(12):3269-3273 ( 1992). Kizu and Tomimori, "Studies on the constituents of Clematis species. V.
On the saponins of the root of Clematis chinensis OSBECK," Chem. Pharm.
Bull., 30:3340-3346, 1982. Kohler and Milstein, Eur.J.Immunol., 6:511-519, 1976. Kohler and Milstein. Nature, 256:495-497, 1975. Kojima and Ogura. "Configurational studies on, hydroxy groups at C-2, 3
and 23 or 24 of oleanene and ursene-type triterpenes by NMR spectroscopy," Phytochemistry, 28:1703-17lO, 1989. Kong et al., Phytochemistry, 33:427-430, 1993. Konoshima and Sawada, Chem. Pharm. Bull., 30:2747-2760, 1 982. Kutney, "Nuclear magnetic resonance (N.M.R.) study in the steroidal sapogenin series. Stereochemistry of the spiro ketal system," Steroids,
2:225-235, 1963. Lemieux, Kullnig, Bernstein, Schneider, "Configurational effects on the
proton magnetic resonance spectra of six-membered ring compounds,"J,Am.
Chem. Soc., 80:6098-6105, 1958. Lister, P.R.,P. Holford, T, Haigh, and D.A. Morrison. Acacia in Australia: Ethnobotany and potential food crop. p. 228-236. In: J. Janick(ed.), Progress in new crops. ASHS Press, Alexandria, VA, 1996. Lloyd, McCown, "Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia by use of shoot tip culture," Comb. Proc. Intl.
Plant Prop. Soc., 30:421-427; 1981. Mackness, Durrington, Converse, Skinner (Eds.), In: Lipoprotein Analysis
: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, p l, 1992. Mahato, Pal, Nandy,Tetrahedron, 48:6717-6728 (1992). Manabe et al., J. Lab, Clin. Med., 104(3):445-454, 1984. Martin et al., J. Exp. Med., 182:1545-1556,1995. Martin, Reueelingsperger, McGahon, Rader,van Schie, Laface, Green, J.Exp
.Med., 182:1545-1556, 1995. Massiot, Lavaud, Besson, Le Men-Olivier, van Binst, "Saponins from aerial parts of alfalfa (Medicago sativa)," J. Agric. Food Chem., 39:78-
82,1991b. Massiot, Lavaud, Delaude, van Binst, Miller, Fales, "Saponins from Tridesmostemon claessenssi," Phytochemistry, 29:3291-3298, 1990. Massiot, Lavaud, Guillaume, Le Men-Olivier, van Binst, "Identification
and sequencing of sugars in saponins using 2D 1H NMR spectroscopy," J.
Chem. Soc.,Chem.Commun., 1485-1487,1986. Massiot, Lavaud. Le Men-Olivier, van Binst, Miller, Fales, "Structural
elucidation of alfalfa root saponins by mass spectrometry and nuclear magnetic resonance analysis " J.Chem. Soc., Perkin Trans., 1:3071-3079,
1988. Massiot,Lavaud, Nuzillard, "Revision des structures des chrysantellines
par resonance magnetique nucleaire," Bul1. Soc. Chim. Fr., 127: 100-l07,
1991a. Miotti et al., Cancer Res., 65:826, 1985, Miyamoto, Togawa, Higuchi, Komori, Sasaki, "Six newly identified biologically active triterpenoid glycoside sulphates from the sea cucumber," Cucumaria echinata. Annalen, 453-60, 1990. Monk,"Variegation in epigenetic inheritance", TIG,6:110-1 14, 1990. Mujoo, Maneval, Anderson, Gutterman. Oncogene, 12:1617-1623,1996. Murashige Skoog, "A revised medium for rapid growth and bioassay of tobacco tissue culture," Physiol.Plant.,15:473-482;1962. Murashige T and Skoog, F. "A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures," Physiologia Plantarum 15:473-
497,1962. Nabel and Baltimore, Nature 326:711-713, 1987. Nagamoto et al., Planta Medica., 54:305-307, 1988. Nagao,Hachiyama, Oka, Yamauchi, "Studies on the constituents of Aster tataricus L. f. II Structures of aster saponins isolated from the root,"
Chem. Pharm. Bull., 37:1977-1983, 1989. Nelson,Futscher, Kinsella, Wymer, Bowden, "Detection of mutant Ha-ras genes in chemically initiated mouse skin epidermis before the development of benign tumors," Proc. Natl. Acad. Sci. USA,(14):6398-6402
, 1992. Nishino. Manabe, Enoki, Nagata, Tsushida, Hamaya, "The structure of the
tetrasaccharide unit of camellidins, saponins, possessing antifungal activity," J. Chem. Soc., Chem. Commun., 720-723, 1986. Nitsch, Nitsch, "Haploid plants from pollen grains," Science, 163:85-87,
1969. O'Reilly, Boehm, Shing, Fnkai, Vasios, Lane, Flynn, Birkhead, Olsen, Folkman, Cell, 88:277-285, 1997. Oakenfull et al., Atherosclerosis, 48:301 (1983). Ohkawa,Kamada,Sudo,Harada,"Effects of gibberellic acid on hairy root growth in Datura innoxia,"J.Plant Physiol., 134:633-636;1989. Okabe, Nagao, Hachiyama, Yamauchi, "Studies on the constituents of Luffa operculata COGN. II. lsolation and structure elucidation of saponins in the herb," Chem. Pharm. Bull., 37:895-900, 1989. Okada. Koyama. Takahashi, Okuyama. Shibata, Planta Med. 40:185-192, (1980). Okada, Sakuma, Fukui, Hazeki, Ui, J. Bio, Chem, 269:3563-3567, 1994. Pallavicini, In: Techniques in Cell Cycle Analysis, Gray and Parzynkiewicz (Eds.), Hurnana Press Inc.,Clifton, NJ, pp. 139, 1987. Pant, Panwar, Negi, Rawat, Morris, Thompson, "Structure elucidation of a
spirostanol glycoside from Asparagus officinalis fruits by concerted use of two-dimensional NMR techniques," Mag. Reson. Chem., , 26:911-918,
1988. Penders, Delaude, Pepermans, van Binst, "Identification and sequencing
of sugars in an acetylated saponin of Blighia welwitschii by N.M.R. spectroscopy," Carbohyd. Res., 190:109-120, 1989. Pietenpol et al., Cancer Res., 55:1206-121O, 1995. Pieterez et al., Antibody Immunoconj. Radiopharm., 1:79-103,35,1988. Pisha et al., Nature Medicine, 1:1046-1051,1995. Polyak et al., Genes Dev., 8:9-22, 1994. Potterat, Hostettmann, Stoeckli-Evans, Saadou, "Saponins with an unusual
secoursene skeleton from Sesamum alatum THONN, Helv. Chim. Acta, 75:833
-841,1992. Prehn, "Regeneration versus neoplastic growth," Carcinogenesis, 18(8): 1439-1444, 1997. Puri, Wong, Puri, "Solasodine and diosgenin: 1H and 13C assignments by
two-dimensional NMR spectroscopy," Mag. Res.Chem., 31:278-282. 1993. Reeves, Nielson, Fahey, Am. Inst. Nutr., 1939,1993. Reisfeld et al., Melanoma Antigens and Antibodies, p.317,1982. Reznicek, Jurenitsch, Kubelka, Michl, Korhammer, Haslinger, "Isolierung
und Struktur der vier Hauptsaponine aus Solidago gigantea var. serotina,
" Annalen, 989-994, 1990. Reznicek, Jurenitsch, Michl, Haslinger, "The first structurally confirmed saponin from Solidago gigantea: structure elucidation by modern NMR techniques," Tetrahedron Lett., 30:4097-4100. 1989b, Reznicek, Jurenitsch, Robien Kubelka, " Saponins in Cyclamen species: configuration of cyclamiretin C and structure of isocyclamin," Phytochemistry, 28:825-828, 1989a. Rhodes, et al., "Influence of exogenous hormones on the growth and secondary metabolite formation in transformed root cultures," Plant Cell
Tissue Organ Culture,38:143-151;1994. Rodriguez, Castro, Riguera, "Holothurinosides: new anti-tumour non sulphated triterpenoid glycosides from the sea cucumber Holothruia forskalii," Tetrahedron, 47:4753-4762,1991. Royal I and Park M, J. Biol.Chem. 270:27780-27787, 1995. Sasaki, Udagawa, Ishimaru, Hayashi, Alfermann, Nakanishi, Shimomura, "High forskolin production in hairy roots of Coleus forskohlii,"Plant Cell Reports 17:457-459, 1998, Sashida, Kawashima, Mimaki, "Novel polyhydroxylated steroidal saponins
from Allium giganteum," Chem. Pharm. Bull., 39:698-703. 1991. Schenk, Hilderbrandt, "Medium and techniques for induction and growth of
monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures," Can. J. Bot.,
50:199-204; 1972. Schopke, Wray, Rzazewska, Hiller, "Bellissaponins BA1 and BA2, acylated
saponins from Bellis perennis," Phytochemistry, 30:627-631,1991. Schreiber, Matthias, Muller, Schaffner, Nucleic Acids Res., 17:6419, 1989. Schuh et al., "Obligatory wounding requirement for tumorigenesis in v-jun transgenic mice," Nature, 346:756-760, 1990. Shao, Kasai, Xu, Tanaka, "Saponins from roots of Kalopanax septemlobus.
(THUNB.) KOIDZ., Ciqiu: structures of kalopanaxsaponins C, D, E and F, "
Chem. Pharm. Bull., 37:311-314,1989. Shayesteh, Lu, Kuo, Baldocchi, Godfrey, Collins, Pinkel, Powell, Mills,
Grey, Nat. Gent., 21:99-l02,1999. Shepard et al., J. Clin. Immunol., 11:117-127,1991. Shirazi, Liu, Trott, "Exposure to ultraviolet B radiation increases the
tolerance of mouse skin to daily X-radiation," Rad. Res., 145:768-775, 1996. Sieweke et al., "Mediation of wound-related rous sarcoma virus tumorigenesis by TGF-β," Science, 248:1656-1660, 1990. Smith, Weathers, Cheetham, "Effects of gibberellic acid on hairy root cultures of Artemisia annua: growth and artemisinin production," In Vitro Cell Dev. Biol., 33:75-79; 1997. Spady, Wollett, Dietschy, Annu. Rev. Nutr., 13:355, 1993. Steel and Torrie, In: Principals and Procedures of Statistics, 2nd Ed.,
McGraw-Hill, New York, p 383, 1980. Stevenson et al., Chem. Immunol., 48: 126-166, 1990. Takema, Fujimura, Ohsu, Imokawa, "Unusual wrinkle formation after temporary skin fixation followed by UVB irradiation in hairless mouse skin," Exp. Dermatol., 5:145-149,1996. Tewari, Quan, Rourke, Zeng, Beidler, Salvesan, Dixit, "Yama/CPP32 beta,
a mammalian homolog of CED-3, is a CrmA-inhibitable protease that cleaves the death substrate poly(ADP-ribose)polymerase," Cell, 81:801, 1995. Thompson et al., Cancer Epidemiol.Biomarker Prevent., 1:597-602,1992. Thor et al, Cancer Res., 46:3118,1986. Tomas-Barbaren et al., Planta Medica., 54:266-267 (1988). Tori and Aono, Ann. Rept. Shionogi Res. Lab., 14:136,1964. Vaickus et al., Cancer Invest., 9:195-209,1991. Vazquez, Quinoa, Riguera, San Martin, Darias, "Santiagoside,the first asterosaponin from an Antarctic starfish (Neosmilaster georgianus)," Tetrahedron, 48:6739-6746,1992. Vlahos and Matter, FEBS Lett., 309:242-248, 1992. Vlahos, Matter, Hui, Brown, J.Bio.Chem., 269:5241-5248,1994. Waltho, Williams, Mahato, Pal, Barna, "Structure elucidation of two triterpenoid tetrasaccharides from Androsace saxifragifolia," J. Chem.
Soc., Perkin 1:1527-1531,1986. Wang, He, Ling, Li, "Chemical study of Astragalus plant. II. Structures
of asernestioside A and B, isolated from Astragalus ernestii COMB. Huaxue Xuebao, 47:583-587, Chem. Abstr., 1989. Weng et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92:5744-5748, 1995. White, Genes Dev., 1O:1-15,1996. Whitman M, Kaplan D.R,. Schatthausen B, Cantley L.C. and Roberts, T.M.
Nature, 315:239-242, 1985. Willker and Leibfritz, "Complete assignment and conformational studies
of tomatine and tomatidine,"Mag. Res. Chem.,30:645-650, 1992. Wyllie, Anticancer Res., 5:131-136,1985. Wysokinska, Chmiel, "Transformed root cultures for biotechnology," Acta
Biotechnol.,17:131-159;1997. Yang et al., Anticancer Res., 15:2479-2488,1995. Yoshikawa, Shimono, Arihara, "Antisweet substances, jujubasaponins I-III
from Zizyphus jujuba,. Revised structure of zizphin," Tetrahedron Lett.
, 32:7059-7062, 1991. Yoshikawa, Suzaki, Tanaka, Arihara, Nigam, .J, Nat. Prod.,60:1269-1274 (1997). Youn, Park, Chung, Lee, Photodermatol Photoimmunol. Photomed., 13:109- 114, 1997. Yukimune et al., Nature Biotech., 14:1129-1132,1996. Zobel,"Study-state control and investigation of root system morphology,"
In: Torrey J.G., Winship,L.J.(eds.) Applications of continuous and steady-state methods to root biology, Kluwer, Amsterdam, 165-182, 1989.
ためにここに含まれるものである。本発明はここに示されている具体的な実施の
形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の1つ又は複数の図面を参照する
ことでよりよく理解できるであろう。
。図1は粗豆科植物抽出物で処理した卵巣(SK−OV−3、HEY、OVCA
R−3)、乳房(MDA−468)、黒色腫(A375−M、Hs−294t)
、及びヒト表皮様(A43)細胞株によって示された成長抑止を示す図である。
ELEP−F023(フラクション23)の影響。図2は卵巣(SK−OV−3
、HEY、OVCAR−3)、T−細胞白血病(Jurkat)、前立腺(LN
CaP)、新鮮なヒト卵巣腫瘍細胞(FTC)、ヒト組織芽(FS)及び内皮(
HUVEC)saibouに対するフラクション23によって示される細胞毒性
を示している。わずか15−17%の細胞毒性しか形質変換されなかった細胞で
は示されなかったのに対して、腫瘍細胞では50−90%の細胞毒性を示す図で
ある。
EP−F035”又は“F035”)の影響。図3はフラクション35で処理し
たヒト卵巣(HEY、OVCAR−3、C−1、SK−OV−3)、膵臓(PA
NC−1)及び腎臓(769−P、786−O、A498)細胞株によって示さ
れた細胞毒性を示している。これらの細胞株のIC50は1−6μg/mlの範囲
であることを示す図である。
C50、130ng/mlでJurkat(T−細胞白血病)細胞に対して、さら
に1−3μg/mlの範囲でのREH、KG−1及びNALM−6(B−細胞白
血病)細胞に対するIC50で強力な細胞毒性を発揮したことを示す図である。
がbFGFによる刺激があってもなくても内皮細胞の増殖に対する強力な抑制因
子であることを示す図である。
胞の移動に対する効果がないことを示しており、これは細胞毒性の欠如を示唆す
る図である。
A培地上で成長させられた幹カルス;レーン2:BA−IAA培地上で成長させ
られた根カルス;レーン3:胚軸カルス;レーン4:半固体状培地上でメチル・
ジャスモネート(100μM)で処理された苗;レーン5:半固体状培地で成長
する比較対象の苗;レーン6:標準的なF023;レーン7:BA培地上で成長
させられた新芽;レーン8:50μMメチル・ジャスモネートで処理された苗;
レーン9:100μMメチル・ジャスモネートで処理した苗;レーン10:20
0μMメチル・ジャスモネートで処理された苗;レーン11:比較対象の苗;レ
ーン12:標準FO23を示す図である。
種を示す。両方とも8週間にわたって100nmolのDMBAの投与を繰り返
すことによって処理されたもの。15週目に両方とも多数の乳頭腫を有していた
が、SENCARとC57B1マウスの交雑種の場合、乳頭腫の数も少なく、そ
のサイズも小さかった。C57B1系統は癌腫発生に対しては抵抗性が高く、腫
瘍を形成しないことを示す図である。
035によって処理されたマウスの表皮部分を示す。FIG.9A:アセトン処
理、4週間目。図9B:アセトン処理、8週間目。図9C:DMBA処理、4週
間目。図9D:DMBA処理、8週間目。図9E:DMBA+UA−BRF−0
04−DELEP−F035処理、4週間目。図9F:DMBA+UA−BRF−
004−DELEP−F035処理、八週間目を示す図である。
週間目。図10A:低濃度のUA−BRF−004−DELEP−F035(0.
1mg/0.2ml)による処理後の酸化防止効果を示す。図10B:高濃度の
UA−BRF−004−DELEP−F035(0.3mg/0.2ml)によ
る処理後の酸化防止効果を示す図である。
目の表皮の厚さを示す。図11A:低濃度のUA−BRF−004−DELEP
−F035(0.1mg/ml)による処理後の表皮の厚みに対する影響を示す
。図11B:高濃度のUA−BRF−004−DELEP−F035(0.3m
g/0.2ml)による処理後の表皮の厚みに対する影響を示す図である。
UA−BRF−004−DELEP−F035でのDMBAによる処理後4週間
目の表皮の厚みの増加割合を示す図である。
UA−BRF−004−DELEP−F035でのDMBAによる処理後8週間
目の乳頭腫の減少の割合を示す図である。
グラムを示す図である。
精製、単離するために用いられた最初の基本方針を示す図である。
改良された全体的方式を示す図である。
−DELEP−F094”又はF094)で見られた加水分解された活性成分か
ら単離されたアセチル化糖類のHPLCスペクトルを示す。図17B:F094
で見られた加水分解された活性成分から単離されたアセチル化糖類のHPLCス
ペクトルを示す図である。
のHPLCスペクトルを示す。図18B:UA−BRF−004Pod−DEL
EP−F094のHPLCスペクトルを示す。図18C:F140のHPLCス
ペクトルを示す。図18D:F142のHPLCスペクトルを示す。図18E:
F144のHPLCスペクトルを示す。図18F:F145のHPLCスペクト
ルを示す図である。
析。図はフラクション35による処理後の細胞サイクルのG1フェーズでの細胞
の数の8%弱の増大とSフェーズでの細胞の10%弱の減少を示し、これはG1
アレストを示している。図19A:未処理OVCAR−3腫瘍細胞での細胞サイ
クル分析。図19B:フラクション35によって処理されたOVCAR−3腫瘍
細胞の細胞サイクル分析を示す図である。
d−DELEP−F094への細胞の露出によるTNF活性化NF−kBの著し
い抑制を示すEMSA。処理は以下の通り行われた。レーン1:未処理;レーン
2:TNF(100pM);レーン3:UA−BRF−004−DELEP−F
035(1μg/ml);レーン4:TNF+F035(1μg/ml);レー
ン5:F035(2μg/ml);レーン6:TNF+F035(2μg/ml
);レーン7:F094(1μg/ml);レーン8:TNF+F094(1μ
g/ml);レーン9:F094(2μg/ml);レーン10:TNF+F0
94(2μg/ml)を示す図である。
−キナーゼの抑制を示す脂質キナーゼ・アッセイを示す図である。
れたSDS−PAGEゲル。1及び2μg/mlのUA−BRF−004−DE
LEP−F035による処理後の細胞はAKTホスホリル化(活性AKT)の著し
い抑制を示し、これは1μMのウォルトマニンによる2時間の処理の場合と同様
であることを示す図である。
分からのPCRTM増幅を示す。(レーン左から右へ、1:Kbラッダー、2:ポ
ジティブ・コントロール(R1000系統からのプラスミドDNA)、3:ネガテ
ィブ・コントロール(形質変換されていない根から採取したDNA)、4−7:
4つの独立に形質変換された根のクローン。ポジティブ・コントロール及び形質
変換された根における645bPフラグメントの増幅に注目される図である。
図である。
の影響。F035は実施例で述べられた手順で細胞毒性を評価した。F035の
活性を図に示す癌及び正常な細胞株のパネル上で調べた。IC50は癌細胞株に対
しては0.2−5.8μg/mlの範囲であった。正常で不死化された細胞株で
は有意な細胞毒性は観察されなかった(IC50:15μg/ml)ことを示す図
である。
の特徴。精製された抽出物の以下のヒト癌細胞株に対する活性を調べた。Jur
kat(T−細胞白血病)、C−2ヘイ変種(卵巣)、769−P(腎臓)、M
DA−MB−231、MDA−MB−453(乳房)。それらの結果を平均+S
EMとして示す図である。
の混合物のアポトーシスに対する影響。アポトーシスは、細胞をアンネキシンV
−FTTCで染色し、DNA内容物については沃化プロピジウム(PI)で染色
し、フロー・シトメトリーを用いて分析を行うアネキシンV結合アッセイを用い
て測定した。細胞は0.5−1.0μg/mlの抽出物を用いて16時間培養し
た。16時間処理した後、3つの群の細胞が観察された。死滅したか、あるいは
アポトーシスの後期段階(アンネキシンV−FTTC及びPIポジティブ)の細
胞、アポトーシス進行中の細胞(アネキシンV−FITCポジティブ及びPIポ
ジティブ)、そして分裂可能でアポトーシスが進行していない細胞(アンネキシ
ンV−FTTC及びPIポジティブ;下左側)を示す図である。
トール(PI)をホスホリル化する能力を細胞溶解物から採取したp85蛋白質
免疫沈澱物に関して測定した。Jurkat細胞を用いてp85免疫沈澱物に対
して行ったイン・ビトロ・キナーゼ・アッセイのオートラジオグラムが薄層クロ
マトグラフィー上で分離して示されている。図45B:粗及び純粋なトリテルペ
ン・グリコシドによるSer−473及びThr−308上でのAKTホスホリ
ル化の抑制。Jurkat細胞を粗(F035)及び精製したD1とG1の抽出
物で37℃の温度下で16時間培養した。この細胞溶解物を9%SDS−PAG
E上で溶解し、抗Ser−473、Thr−308、及び総AKT抗体をプロー
ブとして用いてのウェスタン・ブロットECL分析を示す図である。
導。Jurkat細胞を異なった濃度のF035(1−4μg/ml;図46A
)及び2μg/mlの純粋な抽出物(D1及びG1;図46B)に16時間露出
させて、100pMのTNFを用いてNF−kBを37℃の温度下で15分間活
性化させた。DNA−プローブ錯体を7.5%の天然ポリアクリルアミド・ゲル
上で分離し、放射活性バンドを視覚化し、ホスホイメージャーで定量した。方法
の箇所で述べるように、U−937(図46C)及びJurkat(図46D)
でNOSが誘導された。細胞蛋白質をSDS−PAGEで溶解して、抗iNOS
抗体を用いたウェスタン・ブロットECLで分析したを示す図である。
示す図である。
kの影響を示す図である。
響を示す図である。
影響を示す図である。
Claims (119)
- 【請求項1】 次の各特性で特徴付けられる1つ又は複数の単離されたトリテルペン・グリコ
シドを含む混合物。 a)アカシア・ビクトリアエ(Acacia victoriae)の組織から単離可能、 b)分子量が約1800〜2600の範囲のトリテンペン・グリコシドをすく
なくとも1つ含む、 c)Jurkat細胞に対して細胞毒性を誘発する能力、そして、 d)Jurkat細胞に対してアポトーシスを誘発する能力。 - 【請求項2】 IC50が約0.12〜0.4μg/mlのJurkat細胞に対して細胞毒性
を誘発する請求項1記載の混合物。 - 【請求項3】 Jurkat細胞に対して約100〜400ng/mlの濃度で投与された場
合にアポトーシスが誘発される請求項1記載の混合物。 - 【請求項4】 Jurkat細胞に対して約200〜400ng/mlの濃度で投与された場
合にアポトーシスが誘発される請求項3記載の混合物。 - 【請求項5】 アポトーシスがアンネキシン結合のよるJurkat細胞の形質膜の再形成に
よって測定される請求項1記載の混合物。 - 【請求項6】 次の各特性で特徴付けられる1つ又は複数の単離されたトリテルペン・グリコ
シドを含む混合物。 a)アカシア・ビクトリアエ(Acacia victoriae)の組織から単離可能、 b)分子量が約1800〜2600の範囲のトリテンペン・グリコシドをすく
なくとも1つ含む、そして c)Jurkat細胞のミトコンドリアからシトクロームcの放出を誘発する
能力。 - 【請求項7】 次の各特性で特徴付けられる1つ又は複数の単離されたトリテルペン・グリコ
シドを含む混合物。 a)アカシア・ビクトリアエ(Acacia victoriae)の組織から単離可能、 b)分子量が約1800〜2600の範囲のトリテンペン・グリコシドをすく
なくとも1つ含む、そして c)Jurkat細胞でカスパーゼ3を活性化させる能力。 - 【請求項8】 カスパーゼの活性が約0.3〜1.6蛍光単位/分/mgの範囲である請求項
7記載の混合物。 - 【請求項9】 次の各特性で特徴付けられる1つ又は複数の単離されたトリテルペン・グリコ
シドを含む混合物。 a)アカシア・ビクトリアエ(Acacia victoriae)の組織から単離可能、 b)分子量が約1800〜2600の範囲のトリテンペン・グリコシドをすく
なくとも1つ含む、そして c)Jurkat細胞でRAPRの切断を引き起こす能力。 - 【請求項10】 次の各特性で特徴付けられる1つ又は複数の単離されたトリテルペン・グリコ
シドを含む混合物。 a)アカシア・ビクトリアエ(Acacia victoriae)の組織から単離可能、 b)分子量が約1800〜2600amuの範囲のトリテンペン・グリコシド
をすくなくとも1つ含む、そして、 c)Jurkat細胞でPI−3キナーゼ活性の阻害する能力。 - 【請求項11】 次の各特性で特徴付けられる1つ又は複数の単離されたトリテルペン・グリコ
シドを含む混合物。 a)アカシア・ビクトリアエ(Acacia victoriae)の組織から単離可能、そし
て、 b)哺乳動物の上皮細胞の前悪性又は悪性状態への移行の開始、及び促進を阻
害する能力。 - 【請求項12】 次の各特性で特徴付けられる1つ又は複数の単離されたトリテルペン・グリコ
シドを含む混合物。 a)アカシア・ビクトリアエ(Acacia victoriae)の組織から単離可能、そし
て、 b)悪性の哺乳動物細胞内でアポトーシスを引き起こす能力。 - 【請求項13】 薬学的に受け入れ可能な媒体内での請求項1〜12のいずれか1項に記載の組
成物を含んでいる栄養薬組成物。 - 【請求項14】 薬学的に受け入れ可能な媒体が緩衝液、溶媒、希釈液、不活性担体、油、クリ
ーム、又は食用材料である請求項13記載の栄養薬組成物。 - 【請求項15】 薬学的に受け入れ可能な媒体に溶かした乾燥し、すりつぶしたアカシア・ビク
トリアエ(Acacia victoriae)の根を含む栄養薬組成物。 - 【請求項16】 薬学的に受け入れ可能な媒体が緩衝液、溶媒、希釈液、不活性担体、油、クリ
ーム、又は食用材料である請求項15記載の栄養薬組成物。 - 【請求項17】 栄養薬組成物が錠剤であることを特徴とする請求項16記載の栄養薬組成物。
- 【請求項18】 前記栄養薬組成物がカプセルであることを特徴とする請求項16記載の栄養薬
組成物。 - 【請求項19】 前記栄養薬組成物が軟膏であることを特徴とする請求項16記載の栄養薬組成
物。 - 【請求項20】 薬学的に受け入れ可能な媒体に乾燥し、すりつぶしたアカシア・ビクトリア(
Acacia victoriae)のさやを含む栄養薬組成物。 - 【請求項21】 薬学的に受け入れ可能な媒体が緩衝液、溶媒、希釈液、不活性担体、油、クリ
ーム、又は食用材料である請求項20記載の栄養薬組成物。 - 【請求項22】 栄養薬組成物が錠剤であることを特徴とする請求項21記載の栄養薬組成物。
- 【請求項23】 栄養薬組成物がカプセルであることを特徴とする請求項21記載の栄養薬組成
物。 - 【請求項24】 栄養薬組成物が軟膏であることを特徴とする請求項21の栄養薬組成物。
- 【請求項25】 次の各工程を含む1つ又は複数のトリテルペン・グリコシドの混合物を含む組
成物を調製する方法。 a)アカシア・ビクトリアエ(Acacia victoriae)植物から組織を得る工程、 b)前記組織を溶媒で抽出する工程と、 c)1つ又は複数のトリテルペン・グリコシドを入手する工程。 - 【請求項26】 組織がさやであることを特徴とする請求項25記載の方法。
- 【請求項27】 組織が根であることを特徴とする請求項25記載の方法。
- 【請求項28】 上記組織が実生であることを特徴とする請求項25記載の方法。
- 【請求項29】 溶媒がメタノール、エタノール、イソプロピル・アルコール、ジクロロメタン
、クロロホルム、酢酸エチル、水、グリセロール、又はそれらの混合物である請
求項25記載の方法。 - 【請求項30】 抽出後に植物バガスからろ過により組成物を単離する工程をさらに含む請求項
25記載の方法。 - 【請求項31】 抽出前に有機溶媒で脱脂する工程をさらに含む請求項25記載の方法。
- 【請求項32】 有機溶媒がヘキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル又はそれら
の混合物である請求項31の方法。 - 【請求項33】 トリテルペン・グリコシドを入手する工程がトリテルペン・グリコシドを少な
くとも1回クロマトグラフィーで単離する工程を含んでいる請求項25記載の方
法。 - 【請求項34】 トリテルペン・グリコシドがメタノール、アセトニトリル、水、あるいはそれ
らの混合物による溶出によって単離される請求項33記載の方法。 - 【請求項35】 組成物が液体クロマトグラフィーを用いて単離される請求項33記載の方法。
- 【請求項36】 抽出後に溶媒を蒸発させる工程をさらに含む請求項25記載の方法。
- 【請求項37】 次の各工程を含む1つ又は複数のトリテルペン・グリコシドの混合物を含む組
成物を調製する方法。 a)アカシア・ビクトリアエ(Acacia victoriae)植物の細胞を含む組織培養
を調製する工程、及び、 b)前記培養から溶媒を用いてトリテルペン・グリコシド組成物を抽出して、
それによって少なくとも第1のトリテルペン・グリコシド化合物を抽出する工程
。 - 【請求項38】 組織培養がヘアリールートの培養であることを特徴とする請求項37記載の方
法。 - 【請求項39】 組織培養がアカシア・ビクトリアエ(Acacia victoriae)にアグロバクテリウ
ム・リゾジネス(Agrobacterium rhizogenes)R−1000を感染させることで
調製される請求項38記載の方法。 - 【請求項40】 組織培養が重量で約3%〜約4%のスクロースを含んでいる請求項38記載の
方法。 - 【請求項41】 溶媒がメタノール、エタノール、イソプロピル・アルコール、ジクロロメタン
、クロロホルム、酢酸エチル、水、あるいはそれらの混合物である請求項38記
載の方法。 - 【請求項42】 抽出後にトリテルペン・グリコシド組成物から植物バガスをろ過する工程をさ
らに含んでいる請求項38記載の方法。 - 【請求項43】 抽出後、液体クロマトグラフィーによってトリテルペン・グリコシド組成物を
単離する工程をさらに含んでいる請求項38記載の方法。 - 【請求項44】 抽出後に溶媒を蒸発させる工程を含んでいる請求項38記載の方法。
- 【請求項45】 請求項25〜44のいずれか1項に記載の方法で調製されるトリテルペン・グ
リコシド。 - 【請求項46】 組織培養培地内でアグロバクテリウム・リゾジネス(Agrobacterium rhizogen
es)R−1000によって感染されたアカシア・ビクトリアエ(Acacia victori
ae)の細胞を含むヘアリールートの組織培養。 - 【請求項47】 組織培養培地が重量で約3〜4%スクロースを含んでいる請求項46記載の組
織培養。 - 【請求項48】 次の各工程を含むアカシア・ビクトリアエ(Acacia victoriae)植物組織を継
続的に収穫する方法。 a)水耕栽培システムでアカシア・ビクトリアエ(Acacia victoriae)植物を
成長させる工程と、 b)年に約1回から約4回前記植物から前記組織を収穫する工程であって、そ
の収穫によってはその植物を殺さない工程。 - 【請求項49】 栽培システムがエアロポニック・システムである請求項48記載の方法。
- 【請求項50】 組織が根の組織である請求項49記載の方法。
- 【請求項51】 哺乳動物において哺乳動物の上皮細胞の前悪性又は悪性状態への移行の開始、
進行を抑制する方法において、前記哺乳動物に治療上有効な量の請求項13の栄
養薬組成物を投与するステップを含む方法。 - 【請求項52】 上皮細胞が皮膚細胞、結腸細胞、子宮細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、前立腺細胞
、腎臓細胞、肺細胞、膀胱細胞、又は乳房細胞である請求項51記載の方法。 - 【請求項53】 哺乳動物がヒトである請求項51記載の方法。
- 【請求項54】 投与は経口で行われる請求項51記載の方法。
- 【請求項55】 投与が局所投与で行われる請求項51記載の方法。
- 【請求項56】 哺乳動物において悪性の哺乳動物細胞でのアポトーシスを誘発する方法におい
て、前記哺乳動物に治療上有効な量の請求項13記載の栄養薬組成物組成物を投
与するステップを含む方法。 - 【請求項57】 細胞が皮膚細胞、結腸細胞、子宮細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、前立腺細胞、腎
臓細胞、肺細胞、膀胱細胞、又は乳房細胞である請求項56記載の方法。 - 【請求項58】 哺乳動物がヒトである請求項56記載の方法。
- 【請求項59】 投与が経口で行われる請求項56記載の方法。
- 【請求項60】 投与が局所投与で行われる請求項56記載の方法。
- 【請求項61】 哺乳動物上皮細胞の異常な増殖を防ぐ方法において、前記哺乳動物に対して治
療的に有効な量の請求項13記載の栄養薬組成物を投与するステップを含む方法
。 - 【請求項62】 上皮細胞が陰窩細胞である請求項61記載の方法。
- 【請求項63】 上皮細胞が結腸細胞である請求項61記載の方法。
- 【請求項64】 哺乳動物がヒトである請求項61記載の方法。
- 【請求項65】 投与が経口で行われる請求項61記載の方法。
- 【請求項66】 哺乳動物の炎症を治療する方法において、前記哺乳動物に治療的に有効な量の
請求項13記載の栄養薬組成物を投与するステップを含む方法。 - 【請求項67】 前記哺乳動物がヒトである請求項66記載の方法。
- 【請求項68】 以下の分子構造式を有するモノテルペン部分に取り付けられたトリテルペン部
分を含む組成物、又はその医薬品製剤において、 a)R1及びR2が水素、C1−C5アルキル、及びオリゴ糖で構成されるグル
ープから選択され、 b)R3が水素、ヒドロキシル、C1−C5アルキル、C1−C5アルキレン
、C1−C5アルキル・カルボニル、糖、及びモノテルペン基によって構成され
るグループから選択され、そして c)上記式がさらにR4を含んでおり、R4が水素、ヒドロキシル、C1−C
5アルキル、C1−C5アルキレン、C1−C5アルキル・カルボニル、糖、C
1−C5アルキル・エステル、及びモノテルペン基で構成されるグループから選
択され、R4をトリテルペン部分又はモノテルペン部分に取り付けることができ
る組成物。 - 【請求項69】 R3が糖である請求項68記載の組成物。
- 【請求項70】 上記糖がグルコース、フコース、ラムノース、アラビノース、キシロース、マ
ルトース、グルクロン酸、リボース、N−アセチル・グルコサミン、及びガラク
トースで構成されるグループから選択される請求項69記載の組成物。 - 【請求項71】 さらに、上記糖に取り付けられたモノテルペン部分を含んでいる請求項70記
載の組成物。 - 【請求項72】 R3が以下の構造式を有している請求項71記載の組成物において、 R5が水素、ヒドロキシル、C1−C5アルキル、C1−C5アルキル、C1−
C5アルキル・カルボニル、糖、C1−C5アルキル・エステル、及びモノテル
ペン基で構成されるグループから選択される組成物。 - 【請求項73】 R5が水素、または、ヒドロキシルである請求項72記載の組成物。
- 【請求項74】 R1及びR2がそれぞれオリゴ糖を含んでいる請求項68記載の組成物。
- 【請求項75】 R1及びR2がそれぞれモノサッカライド、ジサッカライド、トリサッカライ ド、又はテトラサッカライドを含む請求項74記載の組成物。
- 【請求項76】 R1及びR2がそれぞれグルコース、フコース、ラムノース、アラビノース、キ
シロース、キノボース、マルトース、グルクロン酸、リボース、N−アセチル・
グルコサミン、及びガラクトースで構成されるグループから個別的、独立的に選
択された糖類を含むオリゴ糖によって構成される請求項75記載の組成物。 - 【請求項77】 少なくとも1つの糖がメチル化されている請求項76記載の組成物。
- 【請求項78】 R4が上記トリテルペン部分に取り付けられたメチレン炭素の1つを通じてト
リテルペン部分に取り付けられている請求項68記載の組成物。 - 【請求項79】 上記トリテルペンがアカシ酸の代わりにオレアノル酸である請求項68記載の
組成物。 - 【請求項80】 分子構造式が以下の通りのトリテルペン・グリコシド: あるいはその医薬品製剤において、 a)R1はN−アセチル・グルコサミン、フコース、及びキシロースを含むオ
リゴ糖であり、 b)R2はグルコース、アラビノース、及びラムノースを含むオリゴ糖である
トリテルペン・グリコシド又はその医薬品製剤。 - 【請求項81】 分子構造式が、 である請求項記載の80の組成物、あるいはその医薬品組成物。
- 【請求項82】 分子構造式が、 であるトリテルペン・グリコシドを含む組成物において、 a)R1はN−アセチル・グルコサミン、フコース、及びキシロースを含むオ
リゴ糖であり、 b)R2はグリコース、アラビノース、及びラムノースを含むオリゴ糖である
組成物、又はその医薬品製剤。 - 【請求項83】 分子構造式が、 である請求項記載の82の組成物、又はその医薬品製剤。
- 【請求項84】 分子構造式が、 であるトリテルペン・グリコシドを含む組成物、又はその医薬品組成物において
、 a)R1がN−アセチル・グルコサミン、グルコース、フコース及びキシロー
スを含むオリゴ糖であり、 b)R2がグルコース、アラビノース、及びラムノースを含むオリゴ糖である
トリテルペン・グリコシド組成物、又はその医薬品製剤。 - 【請求項85】 分子構造式が、 の通りである請求項記載の84の組成物。
- 【請求項86】 トリテルペン部分、オリゴ糖、及び3つのモノテルペン単位を含む組成物。
- 【請求項87】 上記トリテルペン部分がアカシ酸又はオレアノール酸である請求項86記載の
組成物。 - 【請求項88】 請求項68〜87のいずれか1項に記載の組成物を薬理学的に受け入れ可能な
媒体に入れた医薬品組成物。 - 【請求項89】 薬理学的に受け入れ可能な媒体が緩衝液、溶媒、希釈剤、不活性担体、オイル
、クリーム、または食用素材である請求項88記載の医薬品組成物。 - 【請求項90】 医薬品組成物がさらにターゲッティング剤を含む請求項88記載の医薬品組成
物。 - 【請求項91】 ターゲッティング剤が上皮細胞対して医薬品組成物の伝達をもたらす請求項8
8記載の医薬品組成物。 - 【請求項92】 ターゲッティング剤が上皮細胞に結合する抗体を含む請求項91記載の医薬品
組成物。 - 【請求項93】 医薬品組成物が上皮細胞を殺すことができる少なくとも第二の組成物を含んで
いる請求項88記載の医薬品組成物。 - 【請求項94】 治療的に有効な量の請求項88記載の医薬品を哺乳動物に投与するステップを
含む、哺乳動物における哺乳動物上皮細胞の前悪性状態、あるいは悪性状態への
移行開始及び促進を阻害する方法。 - 【請求項95】 上皮細胞が皮膚細胞、結腸細胞、子宮細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、肺細胞、膀
胱細胞、前立腺細胞、腎臓細胞、及び乳房細胞である請求項94記載の方法。 - 【請求項96】 哺乳動物がヒトである請求項94記載の方法。
- 【請求項97】 投与が経口で行われる請求項94記載の方法。
- 【請求項98】 投与が局所的に行われる請求項94記載の方法。
- 【請求項99】 投与が腫瘍内注射で行われる請求項94記載の方法。
- 【請求項100】 投与が静脈注射で行われる請求項94記載の方法。
- 【請求項101】 投与がエアロゾルの吸入で行われる請求項94記載の方法。
- 【請求項102】 さらに前記上皮細胞を照射するステップを含んでいる請求項94記載の方法。
- 【請求項103】 上皮細胞がX線、紫外線、γ線、あるいはマイクロ波で照射される請求項10
2記載の方法。 - 【請求項104】 哺乳動物に治療的に有効な量の請求項88記載の医薬品組成物を投与するステ
ップを含んでいる悪性哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘発する方法。 - 【請求項105】 細胞が皮膚細胞、結腸細胞、子宮細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、肺細胞、膀胱細
胞、前立腺細胞、腎臓細胞、及び乳房細胞である請求項104記載の方法。 - 【請求項106】 哺乳動物に治療的に有効な量の請求項88記載の医薬品組成物を投与するステ
ップを含む哺乳動物上皮細胞の異常な増殖を防ぐための方法。 - 【請求項107】 細胞が陰窩細胞である請求項106記載の方法。
- 【請求項108】 上皮細胞が結腸細胞である請求項106記載の方法。
- 【請求項109】 哺乳動物がヒトである請求項106記載の方法。
- 【請求項110】 投与が経口で行われる請求項106記載の方法。
- 【請求項111】 投与が静脈注射で行われる請求項106記載の方法。
- 【請求項112】 投与が腫瘍内に対して行われる請求項106記載の方法。
- 【請求項113】 上皮細胞を照射するステップをさらに含む請求項106記載の方法。
- 【請求項114】 哺乳動物に対して治療的に有効な量の請求項88記載の医薬品組成物を投与す
るテップを含む哺乳動物の炎症を治療するための方法。 - 【請求項115】 哺乳動物がヒトである請求項114記載の方法。
- 【請求項116】 投与が経口で行われる請求項114記載の方法。
- 【請求項117】 投与が局所的に行われる請求項114記載の方法。
- 【請求項118】 哺乳動物に治療的に有効な量の請求項88記載の医薬品組成物を投与するステ
ップを含む哺乳動物における血管形成を規制する方法。 - 【請求項119】 哺乳動物がヒトである請求項118記載の方法。
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JP2000549243A Expired - Fee Related JP4860039B2 (ja) | 1998-05-19 | 1999-05-19 | トリテルペン組成物及びその使用法 |
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Cited By (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007508317A (ja) * | 2003-10-09 | 2007-04-05 | パシフィック アロー リミテッド | Xanthocerassorbifolia抽出物を含む組成物、該抽出物から単離された化合物、それらを調製する方法、およびそれらの使用 |
US8334269B2 (en) | 2003-09-04 | 2012-12-18 | Pacific Arrow Limited | Composition comprising Xanthoceras sorbifolia extracts, compounds isolated from same, methods for preparing same and uses thereof |
US8586719B2 (en) | 2005-04-27 | 2013-11-19 | Pacific Arrow Limited | Triterpenes for modulating gene expression and cell membrane, and as antiprotozoal agents |
US8614197B2 (en) | 2003-10-09 | 2013-12-24 | Pacific Arrow Limited | Anti-tumor compounds with angeloyl groups |
US8735558B2 (en) | 2005-02-14 | 2014-05-27 | Pacific Arrow Limited | Blocking the migration or metastasis of cancer cells by affecting adhesion proteins and the uses of new compounds thereof |
US8785405B2 (en) | 2010-07-16 | 2014-07-22 | Pacific Arrow Limited | Compounds for treating cancer and other diseases |
US8841265B2 (en) | 2003-10-09 | 2014-09-23 | Pacific Arrow Limited | Composition comprising triterpene saponins and compounds with angeloyl functional group, methods for preparing same and uses thereof |
US8859012B2 (en) | 2001-08-31 | 2014-10-14 | Pacific Arrow Limited | Composition comprising Xanthoceras sorbifolia extracts, compounds isolated from same, methods for preparing same and uses thereof |
US9382285B2 (en) | 2004-09-07 | 2016-07-05 | Pacific Arrow Limited | Methods and compounds for modulating the secretion or expression of adhesion proteins or angiopoietins of cells |
US9434677B2 (en) | 2009-07-16 | 2016-09-06 | Pacific Arrow Limited | Natural and synthetic compounds for treating cancer and other diseases |
US9499577B2 (en) | 2009-07-16 | 2016-11-22 | Pacific Arrow Limited | Natural and synthetic compounds for treating cancer and other diseases |
Families Citing this family (114)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4860039B2 (ja) | 1998-05-19 | 2012-01-25 | リサーチ ディベロップメント ファンデーション | トリテルペン組成物及びその使用法 |
EP2204186B1 (en) | 1999-02-17 | 2016-04-06 | CSL Limited | Immunogenic complexes and methods relating thereto |
MXPA01012390A (es) * | 1999-06-02 | 2003-10-14 | Oxford Natural Products Plc | Combinacion de glucosamina con extractos herbarios de tripterygium, ligustrum y erycibe. |
US7056491B2 (en) * | 2000-11-08 | 2006-06-06 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Monoterpenes and sesquiterpenes as chemotherapeutic and radiation sensitizers and immunomodulators |
CA2427774C (en) | 2000-11-09 | 2013-01-15 | The Hospital For Sick Children | Inhibitors of thromboxane formation and action |
US20060148732A1 (en) * | 2000-11-17 | 2006-07-06 | Gutterman Jordan U | Inhibition of NF-kappaB by triterpene compositions |
JP2002322076A (ja) * | 2001-02-26 | 2002-11-08 | Oji Paper Co Ltd | トリプシン阻害剤 |
US6777004B1 (en) * | 2001-03-30 | 2004-08-17 | Council Of Scientific & Industrial Research | Composition containing novel compound corniculatonin having antifungi properties and a process for preparing the same |
US7736677B2 (en) | 2001-06-20 | 2010-06-15 | Metaproteomics, Llc | Xanthohumol and tetrahydro-isoalpha acid based protein kinase modulation cancer treatment |
KR100464063B1 (ko) * | 2001-11-21 | 2005-01-06 | 한국생명공학연구원 | 세포사멸 유도작용을 갖는 트리테르펜 화합물 |
BR0107262B1 (pt) * | 2001-12-17 | 2014-04-22 | Da Fonseca Clovis Orlando Pereira | Composição farmacêutica inalatória |
EP1467755A1 (en) | 2001-12-21 | 2004-10-20 | Antigenics Inc. | Compositions comprising immunoreactive reagents and saponins, and methods of use thereof |
TWI241916B (en) * | 2001-12-28 | 2005-10-21 | Jian-Shin Yang | Method for producing nanometer of natural materials |
AU2003229202A1 (en) | 2002-05-28 | 2003-12-12 | The Hospital For Sick Children | Compositions comprising hepoxilin analogs and their use in the treatment of cancer |
WO2004019961A1 (en) * | 2002-08-30 | 2004-03-11 | Biopharmacopae Design International Inc. | Plant extracts for treatment of angiogenesis and metastasis |
US20090264377A1 (en) * | 2002-12-27 | 2009-10-22 | Linda Saxe Einbond | Anti-neoplastic compositions comprising extracts of black cohosh |
US7407675B2 (en) * | 2002-12-27 | 2008-08-05 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Anti-neoplastic compositions comprising extracts of black cohosh |
US20090186837A1 (en) | 2002-12-27 | 2009-07-23 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Anti-neoplastic compositions comprising extracts of black cohosh |
CA2517162A1 (en) * | 2003-02-28 | 2004-09-10 | Japan Science And Technology Agency | Method of separating sugar from compound having glycoside bond, sugar separation system, sugar separation agent kit, standardized sample for sugar separation and assessment system |
US20050095209A1 (en) * | 2003-10-31 | 2005-05-05 | Be! Products, Inc. | Nail Application Containing Gotu Kola |
US7388126B2 (en) * | 2003-12-19 | 2008-06-17 | Monsanto Technology Llc | Use of nitric oxide modulators in Agrobacterium-mediated plant transformation |
JP4488852B2 (ja) * | 2004-09-17 | 2010-06-23 | 味の素ゼネラルフーヅ株式会社 | 体内脂肪低減作用を有する組成物 |
WO2006034345A2 (en) * | 2004-09-20 | 2006-03-30 | Research Development Foundation | Avicin-coated stents |
US7727401B2 (en) * | 2004-11-09 | 2010-06-01 | Air Products And Chemicals, Inc. | Selective purification of mono-terpenes for removal of oxygen containing species |
EP1819356A4 (en) * | 2004-11-18 | 2010-07-07 | Biopharmacopae Design Internat | PLANT EXTRACTS AND THEIR USES IN DERMATOLOGY |
CA2595749A1 (en) * | 2005-01-27 | 2006-08-03 | Research Development Foundation | Combination therapy with triterpenoid compounds and proteasome inhibitors |
EP1866071A4 (en) * | 2005-03-03 | 2013-04-24 | Univ Indiana Res & Tech Corp | PERMETHYLATION OF OLIGOSACCHARIDES |
US7311050B2 (en) * | 2005-04-19 | 2007-12-25 | Kamterter Ii, L.L.C. | Systems for the control and use of fluids and particles |
US7536962B2 (en) * | 2005-04-19 | 2009-05-26 | Kamterter Ii, L.L.C. | Systems for the control and use of fluids and particles |
US8308075B2 (en) | 2005-04-19 | 2012-11-13 | Kamterter Products, Llc | Systems for the control and use of fluids and particles |
EP1894012A2 (en) * | 2005-05-18 | 2008-03-05 | Novartis AG | Methods for diagnosis and treatment of proliferative disorders mediated by cd40 signaling |
DK1889065T3 (da) * | 2005-05-18 | 2013-09-02 | Xoma Technology Ltd | Metoder til diagnostisering og behandling af sygdomme med en autoimmun- og/eller inflammationskomponent |
WO2007011985A1 (en) * | 2005-07-18 | 2007-01-25 | Duke University | Compositions for the reversible thioesterification of signaling proteins and methods of using same |
US7927787B2 (en) | 2006-06-28 | 2011-04-19 | The Invention Science Fund I, Llc | Methods and systems for analysis of nutraceutical associated components |
US7974856B2 (en) | 2005-11-30 | 2011-07-05 | The Invention Science Fund I, Llc | Computational systems and methods related to nutraceuticals |
US8297028B2 (en) | 2006-06-14 | 2012-10-30 | The Invention Science Fund I, Llc | Individualized pharmaceutical selection and packaging |
US8340944B2 (en) | 2005-11-30 | 2012-12-25 | The Invention Science Fund I, Llc | Computational and/or control systems and methods related to nutraceutical agent selection and dosing |
US10296720B2 (en) | 2005-11-30 | 2019-05-21 | Gearbox Llc | Computational systems and methods related to nutraceuticals |
US8000981B2 (en) | 2005-11-30 | 2011-08-16 | The Invention Science Fund I, Llc | Methods and systems related to receiving nutraceutical associated information |
US7827042B2 (en) | 2005-11-30 | 2010-11-02 | The Invention Science Fund I, Inc | Methods and systems related to transmission of nutraceutical associated information |
US8068991B2 (en) | 2005-11-30 | 2011-11-29 | The Invention Science Fund I, Llc | Systems and methods for transmitting pathogen related information and responding |
WO2007086100A1 (ja) * | 2006-01-24 | 2007-08-02 | Ajinomoto General Foods, Inc. | 血圧の降下作用及び/または上昇抑制作用を有する組成物およびこれを含有する飲食物 |
WO2007101202A1 (en) * | 2006-02-27 | 2007-09-07 | Research Development Foundation | Cell-targeted ikb and methods for the use thereof |
WO2007118335A1 (en) | 2006-04-19 | 2007-10-25 | Evolva S.A. | Hepoxilin analog enantiomers |
US20070264298A1 (en) * | 2006-05-10 | 2007-11-15 | Stephen W. Lee | Harvestwinner |
JP4771882B2 (ja) * | 2006-07-21 | 2011-09-14 | 味の素ゼネラルフーヅ株式会社 | 糖尿病または糖尿病性合併症の治療、予防、または改善作用を有する組成物およびこれを含有する飲料 |
CN101511369B (zh) * | 2006-08-03 | 2012-06-06 | 肿瘤学研究国际有限公司 | 用于抑制血管发生的方法及组合物 |
MX2009001163A (es) | 2006-08-03 | 2009-03-31 | Oncology Res Int Ltd | Metodos y composiciones para promover la actividad de terapias anticancer. |
WO2008045955A2 (en) * | 2006-10-10 | 2008-04-17 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Inhibiting cyclin d polypeptides |
US20090105203A1 (en) * | 2006-10-16 | 2009-04-23 | Myriad Genetics, Incorporated | Compounds for treating viral infections |
DE102006061517A1 (de) * | 2006-12-18 | 2008-06-19 | Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum | Angioinhibin |
WO2008094873A1 (en) * | 2007-01-29 | 2008-08-07 | Ligums John E | Therapeutic bph composition |
US20090274722A1 (en) * | 2007-01-29 | 2009-11-05 | Ligums John E | Therapeutic Composition for the Treatment of BPH and ED |
KR101163215B1 (ko) | 2007-05-26 | 2012-07-06 | 한국생명공학연구원 | 헐떡이풀 추출물 또는 이로부터 분리된 트리테르펜화합물을 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 치료용조성물 |
US20090068325A1 (en) * | 2007-09-10 | 2009-03-12 | Gil Depicciotto | Method of treatment of fresh produce |
US7795311B2 (en) * | 2007-10-15 | 2010-09-14 | Pittsburg State University | Methods and compositions for the management of soil-borne fungal diseases |
CN101167787B (zh) * | 2007-10-17 | 2011-06-22 | 江南大学 | 抑制血管生成的合欢属植物提取物的组合物及其制备和应用 |
US20110117008A1 (en) * | 2007-11-26 | 2011-05-19 | Research Development Foundation | Use of avicins to deliver therapeutic and diagnostic agents |
WO2009126926A2 (en) * | 2008-04-11 | 2009-10-15 | Bionovo, Inc. | Anticancer methods employing extracts of gleditsia sinensis lam |
WO2011034591A1 (en) * | 2009-09-17 | 2011-03-24 | New York University | Methods of blocking ultraviolet radiation and promoting skin growth using terpenes and terpenoids |
WO2011080579A2 (en) * | 2009-12-30 | 2011-07-07 | Himalaya Global Holdings Limited | A herbal composition for inflammatory disorders |
US8698496B2 (en) * | 2010-09-20 | 2014-04-15 | The General Hospital Corporation | Method for two-dimensional correlation magnetic resonance spectroscopy |
PL2624702T3 (pl) | 2010-10-06 | 2016-09-30 | Kompozycje przeciwko tworzeniu biofilmów oraz sposoby ich zastosowania | |
EP2529633B1 (de) * | 2011-06-01 | 2014-08-06 | Symrise AG | Oral konsumierbare Zubereitungen umfassend bestimmte süß schmeckende Triterpene und Triterpenglycoside |
US10226435B2 (en) | 2011-06-07 | 2019-03-12 | New York University | Compositions and methods for restoring the stratum corneum and treating dermatological diseases |
US11123364B2 (en) | 2011-06-21 | 2021-09-21 | Bvw Holding Ag | Medical device comprising boswellic acid |
US20130269537A1 (en) | 2012-04-16 | 2013-10-17 | Eugenio Minvielle | Conditioning system for nutritional substances |
WO2013126730A1 (en) | 2012-02-24 | 2013-08-29 | Research Development Foundation | Derivatives of avicin d and methods of making and using thereof |
US20130269538A1 (en) | 2012-04-16 | 2013-10-17 | Eugenio Minvielle | Transformation system for nutritional substances |
US8490862B1 (en) | 2012-04-16 | 2013-07-23 | Eugenio Minvielle | Transformation system for nutritional substances |
US10219531B2 (en) | 2012-04-16 | 2019-03-05 | Iceberg Luxembourg S.A.R.L. | Preservation system for nutritional substances |
US9541536B2 (en) | 2012-04-16 | 2017-01-10 | Eugenio Minvielle | Preservation system for nutritional substances |
US9564064B2 (en) | 2012-04-16 | 2017-02-07 | Eugenio Minvielle | Conditioner with weight sensors for nutritional substances |
US9702858B1 (en) | 2012-04-16 | 2017-07-11 | Iceberg Luxembourg S.A.R.L. | Dynamic recipe control |
US9528972B2 (en) | 2012-04-16 | 2016-12-27 | Eugenio Minvielle | Dynamic recipe control |
US9429920B2 (en) | 2012-04-16 | 2016-08-30 | Eugenio Minvielle | Instructions for conditioning nutritional substances |
US9080997B2 (en) | 2012-04-16 | 2015-07-14 | Eugenio Minvielle | Local storage and conditioning systems for nutritional substances |
US9016193B2 (en) | 2012-04-16 | 2015-04-28 | Eugenio Minvielle | Logistic transport system for nutritional substances |
US20140069838A1 (en) | 2012-04-16 | 2014-03-13 | Eugenio Minvielle | Nutritional Substance Label System For Adaptive Conditioning |
US9171061B2 (en) | 2012-04-16 | 2015-10-27 | Eugenio Minvielle | Local storage and conditioning systems for nutritional substances |
US9121840B2 (en) | 2012-04-16 | 2015-09-01 | Eugenio Minvielle | Logistic transport system for nutritional substances |
US9436170B2 (en) | 2012-04-16 | 2016-09-06 | Eugenio Minvielle | Appliances with weight sensors for nutritional substances |
US9460633B2 (en) | 2012-04-16 | 2016-10-04 | Eugenio Minvielle | Conditioner with sensors for nutritional substances |
US8550365B1 (en) | 2012-04-16 | 2013-10-08 | Eugenio Minvielle | System for managing the nutritional content for nutritional substances |
US8851365B2 (en) * | 2012-04-16 | 2014-10-07 | Eugenio Minvielle | Adaptive storage and conditioning systems for nutritional substances |
US9414623B2 (en) | 2012-04-16 | 2016-08-16 | Eugenio Minvielle | Transformation and dynamic identification system for nutritional substances |
US8733631B2 (en) | 2012-04-16 | 2014-05-27 | Eugenio Minvielle | Local storage and conditioning systems for nutritional substances |
US9069340B2 (en) | 2012-04-16 | 2015-06-30 | Eugenio Minvielle | Multi-conditioner control for conditioning nutritional substances |
US9072317B2 (en) | 2012-04-16 | 2015-07-07 | Eugenio Minvielle | Transformation system for nutritional substances |
WO2014100700A1 (en) | 2012-12-20 | 2014-06-26 | Research Development Foundation | Cytoprotective derivatives of avicin d and methods of making and using thereof |
CN104147088A (zh) * | 2013-05-15 | 2014-11-19 | 伽蓝(集团)股份有限公司 | 金合欢提取物在抗衰老中的应用 |
CN104147089A (zh) * | 2013-05-15 | 2014-11-19 | 伽蓝(集团)股份有限公司 | 金合欢提取物、制取方法及其用途 |
TWI492751B (zh) * | 2013-06-04 | 2015-07-21 | Univ Kaohsiung Medical | 柴胡皂苷製備之醫藥組合物、其用途及其製備方法 |
US10790062B2 (en) | 2013-10-08 | 2020-09-29 | Eugenio Minvielle | System for tracking and optimizing health indices |
KR101523434B1 (ko) * | 2013-10-14 | 2015-05-27 | 동의대학교 산학협력단 | 줄베르나디아 글로비플로라 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물 |
KR101514145B1 (ko) * | 2013-10-14 | 2015-04-21 | 동의대학교 산학협력단 | 마카에리움 쿠스피다툼 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물 |
RU2562592C2 (ru) * | 2013-10-23 | 2015-09-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Дальневосточный государственный технический рыбохозяйственный университет" | Способ получения масляного экстракта из голотурий, обладающего биологически активными свойствами (варианты) |
RU2562595C2 (ru) * | 2013-10-23 | 2015-09-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Дальневосточный государственный технический рыбохозяйственный университет" | Способ получения продукта, обладающего биологически активными свойствами, из голотурий |
RU2562581C1 (ru) * | 2014-01-29 | 2015-09-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Дальневосточный государственный технический рыбохозяйственный университет" | Способ получения биологически активного средства из голотурий, обладающего общеукрепляющими и иммуномодулирующими свойствами |
CN105358220A (zh) * | 2014-06-03 | 2016-02-24 | 高雄医学大学 | 柴胡皂苷制备的药物组合物、其用途及其制备方法 |
USD762081S1 (en) | 2014-07-29 | 2016-07-26 | Eugenio Minvielle | Device for food preservation and preparation |
CN105467059B (zh) * | 2015-12-30 | 2017-10-24 | 云南理想药业有限公司 | 一种治疗血尿的中药组合物的质量检测方法 |
JP7201659B2 (ja) | 2017-07-26 | 2023-01-10 | ツェーエルエル ヒェーミシェス・ラボラトーリウム・ドクター・クルト・リヒター・ゲーエムベーハー | 局所用ハーブ組成物 |
EP3434256A1 (en) | 2017-07-26 | 2019-01-30 | CLR-Chemisches Laboratorium Dr. Kurt Richter GmbH | Topical herbal compositions |
EP3681508A4 (en) | 2017-09-14 | 2021-05-19 | Phoenix Biotechnology, Inc. | METHOD AND COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF VIRAL INFECTION |
EP3681477A4 (en) | 2017-09-14 | 2021-06-09 | Phoenix Biotechnology, Inc. | IMPROVED METHOD AND COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF CONDITIONS, DISEASES OR DISORDERS SENSITIVE TO TRITERPENES |
CN110680818A (zh) * | 2018-07-06 | 2020-01-14 | 云南民族大学 | 丝石竹酸在制备镇痛药物中的应用 |
CN110089326A (zh) * | 2019-03-08 | 2019-08-06 | 贵州民族大学 | 一种辅助剂及利用其提高马尾松抗病性能的方法 |
KR102464428B1 (ko) | 2020-03-31 | 2022-11-04 | 피닉스 바이오테크놀러지 인코포레이티드. | 코로나바이러스 감염 치료를 위한 방법 및 조성물 |
EP4295854A3 (en) | 2020-03-31 | 2024-04-03 | Phoenix Biotechnology, Inc. | Method and compositions for treating coronavirus infection |
RU2745401C1 (ru) * | 2020-07-13 | 2021-03-24 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр "Институт биологии южных морей имени А.О. Ковалевского РАН" (ФИЦ ИнБЮМ) | Способ индукции секреции биологически активных соединений у рапаны rapana venosa val. |
CN111875662B (zh) * | 2020-08-19 | 2022-08-16 | 中国人民解放军空军军医大学 | 一种美花铁线莲茎化学提取物的提取方法和应用 |
CN112245416A (zh) * | 2020-11-17 | 2021-01-22 | 广西馨海药业科技有限公司 | Pinnatifolone A在制备具有镇静、催眠作用药物中的应用及药物组合物 |
CN115843692B (zh) * | 2022-12-29 | 2023-09-29 | 浙江省农业科学院 | 一种大花葱组织培养方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH07165598A (ja) * | 1993-12-16 | 1995-06-27 | Mitsui Norin Kk | タンパク質合成阻害剤 |
Family Cites Families (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3070623A (en) | 1957-07-16 | 1962-12-25 | Biorex Laboratories Ltd | Pharmacological compounds |
US3070624A (en) | 1960-03-04 | 1962-12-25 | Biorex Laboratories Ltd | Glycyrrhetinic acid dialkylaminoalkyl esters |
GB1255098A (en) | 1969-07-28 | 1971-11-24 | Biorex Laboratories Ltd | Derivatives of glycyrrhetinic acid |
US3814766A (en) | 1971-11-03 | 1974-06-04 | Pfizer | 11-deoxoglycyrrhetinic acid piperazides useful as antiulcer agents |
US4196265A (en) | 1977-06-15 | 1980-04-01 | The Wistar Institute | Method of producing antibodies |
US4452901A (en) | 1980-03-20 | 1984-06-05 | Ciba-Geigy Corporation | Electrophoretically transferring electropherograms to nitrocellulose sheets for immuno-assays |
US4376110A (en) | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
US4526714A (en) | 1982-12-13 | 1985-07-02 | Cordis Europa N.V. | Conjugates of anticoagulant and protein |
US5310687A (en) | 1984-10-31 | 1994-05-10 | Igen, Inc. | Luminescent metal chelate labels and means for detection |
US5221605A (en) | 1984-10-31 | 1993-06-22 | Igen, Inc. | Luminescent metal chelate labels and means for detection |
US5238808A (en) | 1984-10-31 | 1993-08-24 | Igen, Inc. | Luminescent metal chelate labels and means for detection |
US5049388A (en) | 1986-11-06 | 1991-09-17 | Research Development Foundation | Small particle aerosol liposome and liposome-drug combinations for medical use |
US4975369A (en) | 1988-04-21 | 1990-12-04 | Eli Lilly And Company | Recombinant and chimeric KS1/4 antibodies directed against a human adenocarcinoma antigen |
US5183756A (en) | 1988-08-19 | 1993-02-02 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Monoclonal antibody (D612) having selective reactivity for gastrointestinal caricinomas and method for employing the same |
JPH04507244A (ja) | 1989-07-27 | 1992-12-17 | ユニバックス・バイオロジクス・インコーポレイテッド | リピドa類似体/免疫原性担体コンジュゲートおよびそのワクチンとしての使用 |
US5242813A (en) | 1990-10-12 | 1993-09-07 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Mouse monoclonal antibodies specific for normal primate tissue, malignant human cultural cell lines human tumors |
JPH0673084A (ja) * | 1992-08-27 | 1994-03-15 | Shiratori Seiyaku Kk | グリコシド及びこれを含有する抗肝炎剤 |
DE69332105T2 (de) | 1992-09-29 | 2003-03-06 | Inhale Therapeutic Systems San | Pulmonale abgabe von aktiven fragmenten des parathormons |
CA2194761C (en) | 1994-07-15 | 2006-12-19 | Arthur M. Krieg | Immunomodulatory oligonucleotides |
US6207646B1 (en) | 1994-07-15 | 2001-03-27 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
KR0164266B1 (ko) | 1996-02-22 | 1999-01-15 | 오오니시 쿠니히로 | 인삼사포닌 장내세균 대사물 및 이를 유효성분으로하는 제암제제 |
WO1998037919A1 (en) | 1997-02-28 | 1998-09-03 | University Of Iowa Research Foundation | USE OF NUCLEIC ACIDS CONTAINING UNMETHYLATED CpG DINUCLEOTIDE IN THE TREATMENT OF LPS-ASSOCIATED DISORDERS |
ATE441432T1 (de) | 1997-03-10 | 2009-09-15 | Ottawa Hospital Res Inst | Verwendung von nicht-methyliertem cpg dinukleotid in kombination mit aluminium als adjuvantien |
EP1003531B1 (en) | 1997-05-20 | 2007-08-22 | Ottawa Health Research Institute | Processes for preparing nucleic acid constructs |
JP4860039B2 (ja) | 1998-05-19 | 2012-01-25 | リサーチ ディベロップメント ファンデーション | トリテルペン組成物及びその使用法 |
-
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2000
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2001
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2002
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-
2005
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-
2010
- 2010-01-15 US US12/688,651 patent/US7985435B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-06-14 US US13/160,144 patent/US8324177B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH07165598A (ja) * | 1993-12-16 | 1995-06-27 | Mitsui Norin Kk | タンパク質合成阻害剤 |
Cited By (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8859012B2 (en) | 2001-08-31 | 2014-10-14 | Pacific Arrow Limited | Composition comprising Xanthoceras sorbifolia extracts, compounds isolated from same, methods for preparing same and uses thereof |
US8334269B2 (en) | 2003-09-04 | 2012-12-18 | Pacific Arrow Limited | Composition comprising Xanthoceras sorbifolia extracts, compounds isolated from same, methods for preparing same and uses thereof |
JP2007508317A (ja) * | 2003-10-09 | 2007-04-05 | パシフィック アロー リミテッド | Xanthocerassorbifolia抽出物を含む組成物、該抽出物から単離された化合物、それらを調製する方法、およびそれらの使用 |
US8614197B2 (en) | 2003-10-09 | 2013-12-24 | Pacific Arrow Limited | Anti-tumor compounds with angeloyl groups |
US8841265B2 (en) | 2003-10-09 | 2014-09-23 | Pacific Arrow Limited | Composition comprising triterpene saponins and compounds with angeloyl functional group, methods for preparing same and uses thereof |
US9382285B2 (en) | 2004-09-07 | 2016-07-05 | Pacific Arrow Limited | Methods and compounds for modulating the secretion or expression of adhesion proteins or angiopoietins of cells |
US8735558B2 (en) | 2005-02-14 | 2014-05-27 | Pacific Arrow Limited | Blocking the migration or metastasis of cancer cells by affecting adhesion proteins and the uses of new compounds thereof |
US8586719B2 (en) | 2005-04-27 | 2013-11-19 | Pacific Arrow Limited | Triterpenes for modulating gene expression and cell membrane, and as antiprotozoal agents |
US9434677B2 (en) | 2009-07-16 | 2016-09-06 | Pacific Arrow Limited | Natural and synthetic compounds for treating cancer and other diseases |
US9499577B2 (en) | 2009-07-16 | 2016-11-22 | Pacific Arrow Limited | Natural and synthetic compounds for treating cancer and other diseases |
US8785405B2 (en) | 2010-07-16 | 2014-07-22 | Pacific Arrow Limited | Compounds for treating cancer and other diseases |
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