KR102464428B1 - 코로나바이러스 감염 치료를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

코로나비리대 과의 바이러스에 의해 유발되는 바이러스 감염과 같은 바이러스 감염을 치료하는 방법이 제공된다. 적어도 올레안드린을 갖는 조성물이 바이러스 감염을 치료하는데 사용된다.

Description

코로나바이러스 감염 치료를 위한 방법 및 조성물
참조에 의한 통합
37 CFR 1.52(e)(5)에 따라, 본 출원은 EFS를 통해 전자 형식으로 제출되었으며, 여기에 참조로 통합된 시퀀스 목록을 포함한다. 특허 3.5.1 및 Checker 4.4.6을 사용하여 2020 년 7 월 10 일에 생성된 PBI22PCT9_SEQ_ST25.txt, 크기 1KB라는 전자 파일에 포함된 시퀀스 정보는 전체로서 참조로 통합된다.
본 발명은 포유동물에서 아레나비리대 감염, 부니아비리대 감염, 플라비비리대 감염, 토가비리대 감염, 파라믹소비리대 감염, 레트로비리대 감염, 코로나비리대 감염, 또는 필로비리대 감염의 치료를 위한 항 바이러스 조성물 및 그 사용에 관한 것이다. 일부 실시 예는 출혈성 바이러스 감염의 치료에 관한 것이다.
네리움(Nerium) 종의 일원인 네리움 올리앤더(Nerium oleander)는 아열대 아시아, 미국 남서부 및 지중해에 널리 분포된 관상용 식물이다. 그것의 의학적 및 독성학적 특성은 오랫동안 인식되어 왔다. 예를 들어, 치질, 궤양, 나병, 뱀 물림, 암, 종양, 신경계 장애, 사마귀, 및 세포 증식성 질환의 치료에 사용하도록 제안되어 왔다. Zibbu et al.(J. Chem. Pharm. Res.(2010), 2(6), 351-358)은 네리움 올리앤더의 화학 및 약리학적 활성에 대한 간략한 검토를 제공한다.
네리움 종의 식물로부터 성분의 추출은 전통적으로 끓는 물, 냉수, 초임계 유체 또는 유기 용매를 사용하여 수행되어 왔다.
ANVIRZEL™(Ozel의 미국 특허 제 5,135,745 호)은 네리움 올리앤더의 열탕(hot-water) 추출물의 농축 형태 또는 분말 형태를 함유한다. Muller et al.(Pharmazie.(1991) Sept. 46(9), 657-663)은 네리움 올리앤더의 물 추출물 분석에 관한 결과를 개시한다. 그것들은 존재하는 다당류가 주로 갈락투론산이라고 보고한다. 다른 당류들에는 람노오스, 아라비노오스 및 갈락토스가 포함된다. 네리움 올리앤더의 열탕 추출물 내의 다당류 함량 및 다당류의 개별 당 조성은 또한 Newman et al.(J. Herbal Pharmacotherapy,(2001) vol 1, pp.1-16)에 의해 보고된 바 있다. 열수 추출물인 ANVIRZEL™의 조성 분석은 Newman et al.(Anal. Chem.(2000), 72(15), 3547-3552)에 기재되어 있다. Selvaraj et al.의 미국 특허 제 5,869,060 호는 네리움 종의 추출물 및 생산 방법에 관한 것이다. 추출물을 준비하기 위해 식물 재료를 물에 넣고 끓인다. 그 다음, 조(crude) 추출물을 식물 재료로부터 분리하고, 여과에 의해 멸균시켰다. 이어서, 생성된 추출물을 동결 건조시켜 분말을 제조할 수 있다. 미국 특허 제 6,565,897 호(Selvaraj et al.의 미국 특허전 공개 제 20020114852 호 및 PCT 국제 공개 제 WO 2000/016793 호)는 실질적으로 멸균된 물 추출물의 제조를 위한 열탕 추출 공정을 개시한다. Ishikawa et al.(J. Nutr. Sci. Vitaminol.(2007), 53, 166-173)은 클로로포름, 메탄올 및 물의 혼합물을 사용하는 액체 크로마토그래피에 의한 네리움 올리앤더의 열수 추출물 및 이의 분획을 개시한다. 그들은 또한 N. oleander 잎 추출물이 제 2 형 당뇨병 치료에 사용되었다고 보고한다. Panyosan에 의해 2006 년 8 월 24 일에 공개된 US20060188585는 네리움 올리앤더의 열수 추출물을 개시한다. Smothers에 의해 2019 년 6 월 18 일 발행된 US 10323055는 알로에와 강심 배당체를 포함하는 추출물을 제공하기 위해 알로에와 물로 식물 물질을 추출하는 방법을 개시한다. Rashan et al.에 의해 2007 년 7 월 5 일에 공개된 US20070154573은 네리움 올래앤더의 냉수 추출물 및 그 용도를 개시한다.
Erdemoglu et al.(J. Ethnopharmacol.(2003) Nov. 89(1), 123-129)는 항-통각 및 항-염증 활성에 기초하여, 네리움 올리앤더를 포함하는 식물의 수용(aqueous) 및 에탄올 추출물의 비교 결과를 개시한다. Fartyal et al.(J. Sci. Innov. Res.(2014), 3(4), 426-432)는 항균 활성을 기준으로 네리움 올리앤더의의 메탄올, 수성 및 석유 에테르 추출물을 비교한 결과를 개시한다.
네리움 올리앤더의 유기 용매 추출물은 또한 Adome et al.(Afr. Health Sci.(2003) Aug. 3(2), 77-86; 에탄올 추출물), el-Shazly et al.(J. Egypt Soc. Parasitol.(1996), Aug. 26(2), 461-473; 에탄올 추출물), Begum et al.(Phytochemistry(1999) Feb. 50(3), 435-438; 메탄올 추출물), Zia et al.(J. Ethnolpharmacol.(1995) Nov. 49(1), 33-39; 메탄올 추출물) 및 Vlasenko et al.(Farmatsiia.(1972) Sept.-Oct.21(5), 46-47; 알콜성 추출물)에 의해 개시된다. Turkmen et al.(J. Planar Chroma.(2013), 26(3), 279-283)은 Nerium oleander 잎과 줄기의 수성 에탄올 추출물을 개시한다. Yamauchi에 의해 1974 년 9 월 3 일에 발행된 US 3833472는 네리움 오도롬(Nerium odorum) SOL(Nerium oleander Linn) 잎을 물, 유기 용매 또는 수성 유기 용매로 추출하는 것을 개시하고 있으며, 여기서 잎은 60℃-170℃로 가열된 다음 추출되고, 유기 용매는 메탄올, 에탄올, 프로필 에테르 또는 클로로포름이다.
네리움 종의 초임계 유체 추출물은 공지되어 있고(US 8394434, US 8187644, US 7402325), 신경계 장애(US 8481086, US 9220778, US 9358293, US 20160243143A1, US 9877979, US 10383886) 및 세포 증식성 장애(US 8367363, US 9494589, US 9846156) 및 일부 바이러스 감염(US 10596186, WO 2018053123A1, WO2019055119A1)을 치료하는 데 효능을 나타냈다.
트리테르펜은 매우 다양한 치료 활성을 갖는 것으로 알려져있다. 공지된 트리테르펜 중 일부는 올레아놀산, 우르솔산, 베툴린산, 바독솔론, 마슬린산 등을 포함한다. 트리테르펜의 치료 활성은 트리테르펜의 조합보다는 개별적으로 주로 평가되었다.
올레아놀산은 선천적 세포 상(cellular phase) 2 해독 경로의 강력한 활성화제인 것으로 밝혀진 바독솔론과 같은 화합물로 대표되는 트리테르페노이드 부류에 있으며, 여기서 전사 인자 Nrf2의 활성화는 항산화 전사 반응 요소(ARE)를 함유하는 다운스트림 항산화 유전자의 프로그램에서 전사적 증가를 초래한다. 바독솔론 자체는 염증 질환의 임상 시험에서 광범위하게 조사되어 왔지만, 만성 신장 질환에서의 3 상 임상 시험은 상승된 농도에서 바독솔론을 포함하는 특정 트리테르페노이드의 공지된 세포 독성과 관련될 수 있는 부작용으로 인해 종결되었다.
다른 치료 성분과 함께 트리테르펜을 함유하는 조성물은 식물 추출물로서 발견된다. Fumiko et al.(Biol. Pharm. Bull(2002), 25(11), 1485-1487)은 트리파노소마증을 치료하기 위한 Rosmarimus officinalis L.의 메탄올 추출물의 평가를 개시한다. Addington et al.(US 8481086, US 9220778, US 9358293, US 20160243143 A1)은 신경 질환의 치료를 위한 올레안드린 및 트리테르펜을 함유하는 네리움 올리앤더의 초임계 유체 추출물(SCF; PBI-05204)을 개시한다. Addington et al.(US 9011937, US 20150283191 A1)은 신경 질환의 치료를 위한 올레안드린 및 트리테르펜을 함유하는 네리움 올리앤더의 SCF 추출물의 트리테르펜-함유 분획(PBI-04711)을 개시한다. Jager et al.(Molecules(2009), 14, 2016-2031)은 올레아놀산, 우르솔산, 베툴린산 및 다른 성분들의 혼합물을 함유하는 다양한 식물 추출물을 개시한다. Mishra et al.(PLoS One 2016 25; 11(7):e0159430. Epub 2016 Jul 25)는 올레아놀산, 우르솔산, 베툴린산 및 다른 성분들의 혼합물을 함유하는 Betula utilis 나무 껍질의 추출물을 개시한다. Wang et al.(Molecules(2016), 21, 139)는 올레아놀산, 우르솔산, 베툴린산 및 다른 성분들의 혼합물을 함유하는 Alstonia scholaris의 추출물을 개시한다. L. e Silva et al.(Molecules(2012), 17, 12197)는 올레아놀산, 우르솔산, 베툴린산 및 다른 성분들의 혼합물을 함유하는 Eriope blanchetti의 추출물을 개시한다. Rui et al.(Int. J. Mol. Sci.(2012), 13, 7648-7662)는 올레아놀산, 우르솔산, 베툴린산 및 다른 성분들의 혼합물을 함유하는 Eucaplyptus globulus의 추출물을 개시한다. Ayatollahi et al.(Iran. J. Pharm. Res.(2011), 10(2), 287-294)는 올레아놀산, 우르솔산, 베툴린산 및 다른 성분들의 혼합물을 함유하는 Euphorbia microsciadia의 추출물을 개시한다. Wu et al.(Molecules(2011), 16, 1-15)는 올레아놀산, 우르솔산, 베툴린산 및 다른 성분들의 혼합물을 함유하는 Ligustrum 종의 추출물을 개시한다. Lee et al.(Biol. Pharm. Bull(2010), 33(2), 330)은 올레아놀산, 우르솔산, 베툴린산 및 다른 성분들의 혼합물을 함유하는 Forsythia viridissima의 추출물을 개시한다.
올레아놀산(O 또는 OA), 우르솔산(U 또는 UA) 및 베툴린산(B 또는 BA)은 PBI-05204(PBI-23; 네리움 올리앤더의 초임계 유체 추출물) 및 PBI 04711(PBI-05204의 트리테르펜-함유 분획 0-4)에서 발견되는 3 가지 주요 트리테르펜 성분이다. 본 발명자들은 이전에(Van Kanegan et al., Nature Scientific Reports(May 2016), 6:25626. doi:10.1038/srep25626), 유사한 농도에서의 뇌 슬라이스 산소 포도당 결핍(OGD) 모델 분석에서 이들의 신경 보호 활성을 비교함으로써 효능에 대한 트리테르펜의 기여에 대해 보고하였다. 본 발명자들은 PBI 05204(PBI) 및 PBI-04711(분획 0-4)이 신경 보호 활성을 제공한다는 것을 발견했다.
네리움 종의 추출물은 많은 다른 부류의 화합물들: 강심 배당체, 당체, 스테로이드, 트리테르펜, 다당류 및 기타 화합물을 함유하는 것으로 알려져있다. 특정 화합물은 올레안드린; 네리탈로사이드; 오도로사이드; 올레아놀산; 우르솔산; 베툴린산; 올레안드리게닌; 올리아사이드 A; 베툴린(urs-12-ene-3β,28-diol); 28-norurs-12-en-3β-ol; urs-12-en-3β-ol; 3β,3β-하이드록시-12-올레아넨-28-oic acid; 3β,20α-디하이드록시우르스-21-en-28-oic acid; 3β,27-디하이드록시-12-ursen-28-oic acid; 3β,13β-디히드록시우르스-11-en-28-oic acid; 3β,12α-디하이드록시올레아난-28,13β-olide; 3β,27-디하이드록시-12-올레아난-28-oic acid; 및 다른 성분들을 포함하는 것으로 알려져있다.
바이러스성 출혈열(VHF)은 5 개의 별개의 바이러스 과: 아레나비리대, 부니아비리대, 필로비리대, 플라비비리대 및 파라믹소비리대에 의해 야기될 수 있다. 필로바이러스, 예를 들어 에볼라바이러스(EBOV)와 마르부르그바이러스(MARV)는 사람에게 알려진 가장 병원성인 바이러스이며 최대 90 %의 사망률을 가진 바이러스성 출혈열의 원인이 되는 바이러스 중 하나이다. 각각의 비리온은 단일 가닥의 네가티브-센스 RNA 분자를 포함한다. 지지적인 관리 또는 대증 요법 이외에, EBOV(에볼라바이러스) 및 MARV(마르부르그바이러스) 감염, 즉 필로바이러스 감염을 치료할 수 있는 상업적 치료 효과적인 약물과 예방 약물이 존재하지 않는다. Tai Forest(이전의 Ivory Coast), Sudan, Zaire, Reston 및 Bundibugyo의 5 종의 에볼라바이러스가 확인되었다.
네거티브-센스 단일 가닥 엔벨롭된 RNA 바이러스((-)-(ss)-envRNAV)는 아레나비리대 과, 부니아비리대 과(Bunyavirales order), 필로비리대 과, 오르토믹소비리대 과, 파라믹소비리대 과 및 랍도비리대 과의 바이러스를 포함한다. 음성 바이러스 RNA는 mRNA에 상보적이며, 번역 전에 RNA 중합 효소에 의해 양성 RNA로 전환되어야 한다. 따라서 네거티브 센스 바이러스의 정제된 RNA는 복제를 위해 포지티브 센스 RNA로 전환되어야하기 때문에 그 자체로는 감염성이 없다. 아레나비리대 과로부터의 예시적인 바이러스 및 감염은 라사(Lassa) 바이러스, 무균성 수막염, 구아나리토(Guanarito) 바이러스, 쥬닌(Junin) 바이러스, 루요(Lujo) 바이러스, 마추포(Machupo) 바이러스, 사비아(Sabia) 바이러스 및 화이트워트 아로요(Whitewater Arroyo) 바이러스를 포함한다. 부니아비리대 과로부터의 예시적인 바이러스 및 감염은 한타바이러스(Hantavirus), 크리민-콩고(Crimean-Congo) 출혈열 오르토나이로 바이러스를 포함한다. 파라믹소비리대 과의 예시적인 바이러스 및 감염은 볼거리 바이러스, 니파 바이러스, 헨드라 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV), 인간 파라인플루엔자 바이러스(HPIV) 및 NDV를 포함한다. 오르토믹소 비리대 과의 예시적인 바이러스 및 감염은 인플루엔자 바이러스(A 내지 C), 이사 바이러스, 토고토바이러스, 콰란자바이러스, H1N1, H2N2, H3N2, H1N2, 스페인 독감, 아시아 독감, 홍콩 독감, 러시아 독감을 포함한다. 랍도비리대 과로부터의 예시적인 바이러스 및 감염은 광견병 바이러스, 베시큘로 바이러스, 리사바이러스, 사이토랍도바이러스를 포함한다.
플라비바이러스는 포지티브의 단일 가닥의 인벨롭된(enveloped) RNA 바이러스((+)-(ss)-envRNAV)이다. 그것들은 주로 진드기 및 모기인 절지 동물에서 발견되며, 전 세계적으로 광범위한 질병률과 사망률을 유발한다. 모기-전염 바이러스 중 일부는 황열병, 뎅기열, 일본 뇌염, 웨스트 나일 바이러스 및 지카바이러스를 포함한다. 진드기-전염 바이러스 감염의 일부는 진드기성 뇌염, 캬사누르 삼림병, 알크후르마 질병, 옴스크 출혈열을 포함한다. 출혈성 감염은 아니지만, 포와산 바이러스는 플라비바이러스이다.(+)-(ss)-envRNAV는 코로나비리대 과(인간 및 동물 병원체), 플라비비리대 과(인간 및 동물 병원체), 토가비리대 과(인간 및 동물 병원체) 및 아터비리대(Arterviridae) 과(동물 병원체)를 포함한다.
코로나바이러스(CoV)는 코로나비리대의 일반적인 명칭이다. 인간의 경우, CoV는 일반적으로 경미하지만 SARS(심각한 급성 호흡기 증후군)-CoV, MERS(중동 호흡기 증후군)-CoV 및 COVID-19와 같은 드문 형태에서는 치명적일 수 있는 호흡기 감염을 유발한다. CoV는 나선형 대칭의 뉴클레오캡시드를 가지고 있으며, 게놈 크기는 약 26 내지 약 32 킬로베이스 범위이다. 다른 예시적인 인간 CoV는 CoV 229E, CoV NL63, CoV OC43, CoV HKU1 및 CoV HKU20을 포함한다. CoV의 엔벨롭은 3 개의 당 단백질을 운반한다: S-스파이크 단백질:수용체 바인딩, 세포 융합, 주요 항원; E-엔벨롭 단백질: 작은 엔벨롭 관련 단백질; 및 M-막 단백질:막 횡단-버딩(transmembrance-budding) 및 엔벨롭 형성물을 포함한다. 몇 가지 유형의 CoV에는 네 번째 당 단백질인 HE-헤마글루티닌-에스테라제가 있다. 게놈은 5' 메틸화 캡과 3' 폴리-A를 가지고 있으며, mRNA로 직접 기능한다. 인간 세포로의 CoV 유입은 세포 내 이입 및 막 융합을 통해 발생한다. 복제는 세포의 세포질에서 발생한다. CoV는 호흡기 분비물 에어로졸, 대변-구강 경로 및 기계적 전달에 의해 전달된다. 대부분의 바이러스 성장은 상피 세포에서 발생한다. 때때로 간, 신장, 심장 또는 눈뿐만 아니라 대식세포와 같은 다른 세포 유형이 감염될 수 있다. 감기형 호흡기 감염에서 성장은 상부 호흡기의 상피에 국한된 것으로 보인다. 코로나 바이러스 감염은 매우 흔하며 전 세계적으로 발생한다. 감염 발생률은 계절성이 강하며, 겨울철 어린이에게 가장 많이 발생한다. 성인 감염은 흔하지 않다. 코로나 바이러스 혈청 형의 수와 항원 변이의 정도는 알려져 있지 않다. 재감염은 일생 동안 발생하는 것으로 보이며, 여러 혈청 형(최소 4 개가 알려져 있음) 및/또는 항원 변이를 의미하므로, 단일 백신으로 모든 혈청 형에 대한 면역화 가능성은 매우 낮다. SARS는 바이러스성 폐렴의 일종으로 발열, 마른 기침, 호흡 곤란(숨가쁨), 두통, 저산소 혈증(낮은 혈중 산소 농도) 등의 증상이 있다. 일반적인 실험실 결과에는 림프구 감소증(림프구 수 감소)과 약간의 아미노 전이 효소 수치(간 손상을 나타냄)가 있다. 폐포 손상으로 인한 진행성 호흡 부전으로 사망할 수 있다. SARS의 전형적인 임상 과정은 감염 첫 주 동안 증상이 개선된 다음 두 번째 주에 악화된다. 인간 CoV에 대한 효과적인 항 바이러스 치료(조성물 및 방법)에 대한 상당한 필요성이 남아 있다.
올레안드린 및 네리움 올리앤더의 추출물은 HIV-1의 gp120 엔벨롭 당 단백질이 성숙한 바이러스 입자에 혼입되는 것을 방지하고, 체외 바이러스 감염을 억제하는 것을 보여줬다(Singh et al., "네리움 올리앤더 유래 강심 배당체 올레안드린은 새로운 HIV 감염 억제제이다" Fitoterapia(2013) 84, 32-39).
올레안드린은 항-HIV 활성을 나타내었지만, 많은 바이러스에 대해서는 평가되지 않았다. 트리테르펜 올레아놀산, 베툴린산 및 우르솔산은 상이한 수준의 항 바이러스 활성을 나타내는 것으로 보고되었지만, 많은 바이러스에 대해서는 평가되지 않았다. 베툴린산은 HSV-1 균주 1C, 인플루엔자 A H7N1, ECHO 6 및 HIV-1에 대해 일부 항 바이러스 활성을 나타냈다. 올레아놀산은 HIV-1, HEP C 및 HCV H 균주 NS5B에 대해 항 바이러스 활성을 나타냈다. 우르솔산은 HIV-1, HEP C, HCV H 균주 NS5B, HSV-1, HSV-2, ADV-3, ADV-8, ADV-11, HEP B, ENTV CVB1 및 ENTV EV71에 대해 항 바이러스 활성을 나타냈다. 올레안드린, 올레아놀산, 우르솔산 및 베툴린산의 항 바이러스 활성은 특정 바이러스에 대한 효능으로까지 예측할 수 없다. 올레안드린, 올레아놀산, 우르솔산 및/또는 베툴린산이 항 바이러스 활성을 거의 또는 전혀 갖지 않는 바이러스가 존재하는데, 이는 올레안드린, 올레아놀산, 우르솔산 및/또는 베툴린산이 특정 속의 바이러스에 대해 항 바이러스 활성을 나타낼지 여부를 선험적으로 예측할 수 없음을 의미한다.
Barrows et al.(Cell Host Microbe(2016), 20, 259-270의 "지카바이러스 감염 억제제에 대한 FDA 승인 약물의 스크린")은 디곡신이 지카바이러스에 대한 항 바이러스 활성을 나타내지만, 투여량이 너무 높고 독성이 있을 수 있다고 보고한다. Cheung et al.(Antiviral Res.(2014) 111, 93-99의 "뎅기 바이러스 감염에 대한 라나토사이드 C의 항 바이러스 활성")은 라나토사이드 C가 뎅기 바이러스에 대한 항 바이러스 활성을 나타냄을 보고한다.
인간 T-림포트로픽 바이러스 1 형(HTLV-1)은 레트로비리대 과 및 델타레트로바이러스 속에 속하는 레트로바이러스이다. 그것은 DNA로 역전사된 후 세포 DNA로 통합되는 포지티브-센스 RNA 게놈을 가지고 있다. 일단 통합되면, HTLV-1은 바이러스 시냅스를 통해 세포에서 세포로 퍼질 수 있는 프로바이러스로만 계속 존재한다. 유리 비리온(free virion)이 생성되는 경우는 거의 없으며, 일반적으로 바이러스가 생식기 분비물에 존재하지만 혈장에서 검출 가능한 바이러스가 없다. HTLV-1은 주로 CD4 + T-림프구를 감염시키고, 성인 T-세포 백혈병/림프종(ATLL)을 유발한다. 이는 드물지만 공격적인 혈액 악성 종양으로서, 감염성 피부염, 류마티스 관절염, 포도막염, 각 결막염, 시카 증후군, 쇼그렌 증후군, HAM/TSP 등을 포함하는 여러 자가면역/염증성 질병에 더하여 치료 저항률이 높고 일반적으로 임상 결과가 좋지 않다. HAM/TSP는 임상적으로 만성 진행성 경련 마비, 요실금 및 경미한 감각 장애를 특징으로 한다. ATLL은 바이러스 잠복기, 발암성 형질 전환 및 HTLV-1에 감염된 세포의 클론 확장과 병인적으로 연관되어 있지만, HTLV-1 관련 골수 병증/열대 경련성 대부전 마비(HAM/TSP)와 같은 염증성 질환이 자가 면역 및/또는 프로바이러스성 복제와 바이러스 항원의 발현에 대한 면역 질환성 반응에 의해 유발된다. HAM/TSP는 진행성 신경 염증성 질환으로서, 하부 척수의 악화 및 탈수초화를 초래한다. HTLV-1에 감염된 순환 T 세포는 중추 신경계(CNS)를 침범하여, 바이러스 및 아마도 CNS의 구성 요소에 대한 면역 병원성 반응을 일으킨다. 신경 손상 및 후속 변성은 HAM/TSP 환자에게 심각한 장애를 유발할 수 있다. 프로바이러스성 복제의 지속성과 CNS에서 HTLV-1에 감염된 세포의 증식은 바이러스 항원에 대해 표적화된 세포 독성 T-세포 반응을 유발하며, 이는 신경 조직의 자가 면역 파괴를 담당할 수 있다.
강심 배당체가 몇몇 바이러스에 대해 일부 항 바이러스 활성을 나타내는 것으로 입증되었지만, 특정 화합물은 상이한 바이러스에 대해 매우 상이한 수준의 항 바이러스 활성을 나타내며, 이는 동일한 바이러스에 대한 평가시, 일부는 매우 열악한 항 바이러스 활성을 나타내고, 일부는 더 우수한 항 바이러스 활성을 나타냄을 의미한다.
특정 바이러스 감염에 대해 치료적으로 활성인 올레안드린, 올레아놀산, 우르솔산, 베툴린산 또는 이들의 임의의 조합을 함유하는 개선된 약제학적 조성물에 대한 요구가 여전히 남아있다.
본 발명은 포유동물 대상체에서 바이러스 감염을 치료 및 예방하기 위한 약제학적 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 바이러스 감염, 예를 들어 포유동물 대상체에서 바이러스성 출혈열(VHF) 감염을 치료하기 위한 약제학적 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 약제학적 조성물의 투여에 의해 포유동물에서 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명자들은 인간 및 동물에서 바이러스 감염을 치료하는데 사용하기에 충분한 항 바이러스 활성을 나타내는 항 바이러스 조성물을 제조하는데 성공하였다. 본 발명자들은 특정 투약 요법을 사용하는 상응하는 치료 방법을 개발하였다. 본 발명은 또한 바이러스 감염에 걸릴 위험이 있는 대상체를 치료하는 예방적 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체가 바이러스 감염되기 전에 연장된 치료 기간에 걸쳐 반복적으로 항 바이러스 조성물의 1 회 이상의 용량을 대상체에게 만성적으로 투여하는 것을 포함한다. 이에 의해 대상체가 바이러스 감염에 걸리지 않도록 방지하고, 여기서 항 바이러스 조성물은 올레안드린을 포함한다.
일부 실시 예에서, 항 바이러스 조성물은 바이러스 감염 세포를 갖는 대상체에게 투여되고, 여기서 세포는 Na, K-ATPase의 알파-3 대 알파-1 동형의 상승된 비율을 나타낸다.
일부 실시 예에서, 바이러스 감염은 아레나비리대, 아터비리대, 부니아비리대, 필로비리대, 플라비비리대, 오르토믹소비리대, 파라믹소비리대, 랍도비리대, 레트로비리대(특히, 델타레트로비리대 속), 코로나비리대, 또는 토가비리대와 같은 바이러스 과에 의해 야기된다. 일부 실시 예에서, 바이러스 감염은 (+)-ss-envRNAV 또는 (-)-ss-envRNAV에 의해 야기된다.
본 발명의 일부 실시 예는 필로바이러스 감염, 플라비바이러스 감염, 헤니파바이러스 감염, 알파바이러스 감염 또는 토가바이러스 감염을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 치료할 수 있는 바이러스성 감염은 적어도, 에볼라바이러스, 마르부르그바이러스, 알파바이러스, 플라비바이러스, 황열병, 뎅기열, 일본 뇌염, 웨스트 나일 바이러스, 지카바이러스, 베네수엘라 말 뇌척수염(뇌염)(VEE) 바이러스, 치쿤구야 바이러스, 웨스턴 말 뇌척수염(뇌염)(WEE) 바이러스, 이스턴 말 뇌척수염(뇌염)(EEE) 바이러스, 진드기성 뇌염, 캬사누르(Kyasanur) 삼림병, 알크후르마(Alkhurma) 질병, 옴스크 출혈열, 헨드라 바이러스, 니파 바이러스 델타레트로바이러스 속, HTLV-1 바이러스 및 이들의 종을 포함한다.
본 발명의 일부 실시 예는 아레나비리대 과, 아터비리대 과, 부니아비리대 과, 필로비리대 과, 플라비비리대 과(플라비바이러스 속), 오르토믹소비리대 과, 파라믹소비리대 과, 랍도비리대, 레트로바리대 고가(델타레트로바이러스 속), 코로나비리대 과, (+)-ss-envRNAV, (-)-ss-envRNAV 또는 토가비리대 과의 바이러스로부터의 바이러스 감염을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일부 실시 예는 헤니파바이러스 속, 에볼라바이러스 속, 플라비바이러스 속, 마르부르그바이러스 속, 델타레트로바이러스 속, 코로나바이러스(CoV), 또는 알파바이러스 속의 바이러스로부터의 바이러스 감염을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
일부 실시 예에서, (+)-ss-envRNAV는 코로나비리대 과, 플라비비리대 과, 토가비리대 과 및 아르테르비리대 과로 구성된 군으로부터 선택되는 바이러스이다.
일부 실시 예에서, (+)-ss-envRNAV는 인간에게 병원성인 코로나 바이러스이다. 일부 실시 예에서, 코로나 바이러스 스파이크 단백질은 인간 조직의 ACE2(안지오텐신 전환 효소 2) 수용체에 결합한다. 일부 실시 예에서, 코로나 바이러스는 SARS-CoV, MERS-CoV, COVID-19(SARS-CoV-2), CoV 229E, CoV NL63, CoV OC43, CoV HKU1 및 CoV HKU20으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시 예에서, (+)-ss-envRNAV는 플라비 바이러스, 황열병 바이러스, 뎅기열 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 지카 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 키아사누 포레스트 질병(Kyasanur Forest Disease) 바이러스, 알쿠르마(Alkhurma) 질병 바이러스, 옴스크(Omsk) 출혈열 바이러스 및 포와산(Powassan) 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스이다.
일부 실시 예에서, (+)-ss-envRNAV는 아르보 바이러스, 동부 말 뇌척수염 바이러스(EEEV), 서부 말 뇌척수염 바이러스(WEEV), 베네수엘라 말 뇌척수염 바이러스(VEEV), 치쿤구니야(Chikungunya) 바이러스(CHIKV), 오녕인 바이러스(O'nyong'nvirus)(ONNV), 포고스타(Pogosta) 질병 바이러스, 신드비스(Sindbis) 바이러스, 로스강(Ross River) 열병 바이러스(RRV) 및 셈리키 삼림(Semliki Forest) 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 토가비리대 과 바이러스이다.
일부 실시 예에서, (-)-(ss)-envRNAV는 아레나비리대 과, 부니야비리대 과(Bunyavirales order), 필로비디래 과, 오르토믹소비리대 과, 파라믹소비리대 ㄱ과 또는 랍도비리대 과로 구성된 군에서 선택된 바이러스이다.
일부 실시 예에서, 아레나비리대 과 바이러스는 라사(Lassa) 바이러스, 무균성 수막염, 구아나리토(Guanarito) 바이러스, 쥬닌(Junin) 바이러스, 루요(Lujo) 바이러스, 마추포(Machupo) 바이러스, 사비아(Sabia) 바이러스 및 화이트워트 아로요(Whitewater Arroyo) 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시 예에서, 부니아비디래과 바이러스는 한타바이러스(Hantavirus), 크리민-콩고(Crimean-Congo) 출혈열 오르토나이로 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시 예에서, 파라믹소비리대 과 바이러스는 볼거리 바이러스, 니파 바이러스, 헨드라 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV), 인간 파라인플루엔자 바이러스(HPIV) 및 NDV로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시 예에서, 오르토믹소비리대 과 바이러스는 인플루엔자 바이러스(A 내지 C), 이사 바이러스, 토고토바이러스, 콰란자바이러스, H1N1, H2N2, H3N2, H1N2, 스페인 독감, 아시아 독감, 홍콩 독감, 러시아 독감으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시 예에서, 랍도비리대 과 바이러스는 광견병 바이러스, 베시큘로 바이러스, 리사바이러스, 사이토랍도바이러스로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 HTLV-1 관련 질병 또는 신경-염증성 질환의 치료를 위한 실시 예를 제공한다. 일부 실시 예에서, HTLV-1 관련 질환 또는 신경 염증성 질환은 골수병증/열대성 경련성 마비(HAM/TSP), 성인 T-세포 백혈병/림프종(ATLL), 자가 면역 질환, 염증 질환, 전염성 피부염, 류마티스 관절염, 포도막염, 각 결막염, 시카 증후군, 쇼그렌 증후군 및 분선충(Strongyloides stercoralis)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 처리된 세포의 배양 상청액으로 방출되는 HTLV-1 입자의 감염성을 억제하고 또한 바이러스 시냅스의 Env-의존적 형성을 억제함으로써 HTLV-1의 세포 간 전파를 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 항 바이러스성 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시 예에서, 본 발명은 (a) 특정 강심 배당체(들); b) 복수의 트리테르펜; 또는 c) 특정 강심 배당체(들)와 복수의 트리테르펜의 조합을 포함하는(필수적으로 구성되는) 항 바이러스 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면은 항 바이러스 조성물의 대상체에게 만성 투여함으로써 대상체에서 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 대상체는 조성물의 치료적 유효량(치료적으로 적절한 투여량)을 대상체에게 만성적으로 투여함으로써 바이러스 감염 또는 바이러스 감염의 개선과 관련된 증상의 완화를 제공함으로써 치료된다. 대상체에게의 조성물의 투여는 감염 직후 또는 감염 후 1 일 내지 5 일 이내에 또는 바이러스 감염의 명확한 진단 후 가장 빠른 시점에 시작될 수 있다. 바이러스는 여기에 기재된 임의의 바이러스일 수 있다.
따라서, 본 발명은 포유동물에게 하나 이상의 치료적 유효량의 항 바이러스 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 1회 이상의 투여량은 매일, 매주 또는 매월 단위로 투여된다. 하루에 1회 이상의 투여량이 투여될 수 있다. 바이러스는 여기에 기재된 임의의 바이러스일 수 있다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:
대상체가 바이러스 감염을 갖는지 여부를 결정하는 단계;
항 바이러스 조성물의 투여를 지시하는 단계;
일정 기간 동안 처방된 초기 투여 요법에 따라 대상체에 초기 투여량의 항 바이러스 조성물을 투여하는 단계;
항 바이러스 조성물에 의한 치료에 대한 대상체의 임상 반응 및/또는 치료 반응의 적절성을 주기적으로 결정하는 단계; 및
대상체의 임상 반응 및/또는 치료 반응이 적절한 경우, 원하는 임상적 종점(endpoint)에 도달할 때까지 항 바이러스 조성물로 치료를 계속하고; 또는
대상체의 임상 반응 및/또는 치료 반응이 초기 투여량 및 초기 투여 요법에서 불충분한 경우, 대상체에서 원하는 임상 반응 및/또는 치료반응이 달성될 때까지 투여량을 증량 또는 감량시키는 단계를 포함한다.
항 바이러스 조성물에 의한 대상체의 치료는 필요에 따라 계속된다. 투여량 또는 투여 요법은 예를 들어 바이러스 감염과 관련된 특정 증상의 감소 또는 완화와 같이, 환자가 원하는 임상적 종점(들)에 도달할 때까지 필요에 따라 조정될 수 있다. 임상 반응 및/또는 치료 반응의 적절성을 결정하는 것은 바이러스 감염에 익숙한 임상의에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 방법의 개별 단계는 별도의 설비 또는 동일한 설비 내에서 수행될 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 모든 실시 예에 대해 대안적인 실시 예를 제공하며, 여기서 올레안드린은 디곡신으로 대체되거나 디곡신과 조합하여 사용된다. 본 발명의 방법은 올레안드린, 디곡신, 또는 올레안드린과 디곡신의 조합을 사용할 수 있다. 따라서, 올레안드린, 디곡신, 올레안드린-함유 조성물, 디곡신-함유 조성물, 또는 올레안드린-함유 조성물 및 디곡신-함유 조성물은 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 강심 배당체는 올레안드린, 디곡신 또는 이들의 조합을 의미하는 것으로 간주될 수 있다. 강심 배당체 함유 조성물은 올레안드린, 디곡신 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 발명은 또한 코로나 바이러스 감염, 특히 인간에게 병원성인 코로나 바이러스 감염, 예를 들어, SARS-CoV-2 감염에 있어서, 코로나 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 감염을 갖는 대상체에게 치료적 유효량의 강심 배당체(강심 배당체 함유 조성물)를 만성적으로 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 코로나 바이러스 감염, 특히 인간에게 병원성인 코로나 바이러스 감염, 예를 들어, SARS-CoV-2 감염에 있어서,코로나 바이러스 감염을 치료하는 이중 경로 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 감염을 갖는 대상체에게 치료학적 유효량의 강심 배당체(강심 배당체 함유 조성물)를 만성적으로 투여하여, 상기 코로나 바이러스의 바이러스 복제를 억제하고, 상기 코로나 바이러스의 자손 바이러스의 감염성을 감소시키는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 상기 감염을 갖는 대상체에게 복수의 치료적 유효량의 강심 배당체(강심 배당체 함유 조성물)를 (본원에서 논의된 임의의 투여 방식을 통해) 반복적으로 투여함으로써, 코로나 바이러스 감염, 특히 SARS-CoV-2 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 1 회 이상의 투여량은 1 주일에 1 일 이상 매일, 선택적으로 한 달에 1 주 이상, 선택적으로 1 년에 1 개월 이상 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 인간에서 코로나 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 2 일 내지 약 2 달의 치료 기간 동안, 매일 1 내지 10 회 투여량의 강심 배당체(강심 배당체 함유 조성물)를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 치료 기간 동안, 매일 2 내지 8 회, 2 내지 6 회 또는 4 회 투여할 수 있다. 투여량은 2 일 내지 약 60 일, 2 일 내지 약 45 일, 2 일 내지 약 30 일, 2 일 내지 약 21 일, 또는 2 일 내지 약 14 일 동안 투여될 수 있다. 상기 투여는 본원에 논의 된 임의의 투여 방식을 통해 이루어질 수 있다. 상기 대상체에서 올레안드린 및/또는 디곡신의 치료학적 유효 혈장 수준을 제공하는 전신 투여가 바람직하다.
일부 실시 예에서, 바이러스 감염이 치유 될 때까지, 1 회 이상의 투여량의 올레안드린이 매일 복수일 동안 투여된다. 일부 실시 예에서, 1 회 이상의 투여량의 강심 배당체(강심 배당체 함유 조성물)는 바이러스 감염이 치료 될 때까지, 수일 및 수주 동안 매일 투여된다. 매일 하나 이상의 투여량이 투여될 수 있다. 매일 1 회, 2 회, 3 회, 4 회, 5 회, 6 회 이상 투여될 수 있다.
일부 실시 예에서, 예를 들어 코로나 바이러스 감염으로 치료된 감염 대상체의 혈장 중 올레안드린 및/또는 디곡신의 농도는, 약 10 ㎍/mL 이하, 약 5 ㎍/mL 이하, 약 2.5 ㎍/mL 이하, 약 2 ㎍/mL 이하, 또는 약 1 ㎍/mL 이하이다. 일부 실시 예에서, 코로나 바이러스 감염으로 치료된 대상체의 혈장 중 올레안드린 및/또는 디곡신의 농도는 약 0.0001 ㎍/mL 이상, 약 0.0005 ㎍/mL 이상, 약 0.001 ㎍/mL 이상, 약 0.0015 ㎍이다./mL 이상, 약 0.01 ㎍/mL 이상, 약 0.015 ㎍/mL 이상, 약 0.1 ㎍/mL 이상, 약 0.15 ㎍/mL 이상, 약 0.05 ㎍/mL 이상, 또는 약 0.075 ㎍/mL 이상이다. 일부 실시 예에서, 치료된 감염 대상체의 혈장 중 올레안드린 및/또는 디곡신의 농도는 약 10 ㎍/mL 내지 약 0.0001 ㎍/mL, 약 5 ㎍/mL 내지 약 0.0005 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL 내지 약 0.001 ㎍/mL, 약 0.5 ㎍/mL 내지 약 0.001 ㎍/mL, 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 0.001 ㎍/mL, 약 0.05 ㎍/mL 내지 약 0.001 ㎍/mL, 약 0.01 ㎍/mL 내지 약 0.001 ㎍/mL, 약 0.005 ㎍/mL 내지 약 0.001 ㎍/mL이다. 본 발명은 본원에 기재된 혈장 농도 범위의 모든 조합 및 선택을 포함한다.
항 바이러스 조성물은 만성적으로, 즉 매일, 격일로, 2일마다, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 6일마다, 매주, 격주로, 2주마다, 3주마다, 매월, 격월로, 반달마다, 격월로, 2개월마다, 분기별로, 격분기마다, 3개월마다, 계절에 따라, 반년마다 및/또는 매년 투여될 수 있다. 치료 기간은 하나 이상의 주, 하나 이상의 개월, 하나 이상의 분기 및/또는 하나 이상의 년일 수 있다. 유효량의 강심 배당체(강심 배당체-함유 조성물)는 하루에 1 회 이상 투여된다.
일부 실시 예에서, 대상체는 하루에 강심 배당체의 140 마이크로그램 내지 315 마이크로그램을 투여받는다. 일부 실시 예에서, 투여량은 20 마이크로그램 내지 750 마이크로그램, 12 마이크로그램 내지 300 마이크로그램, 또는 12 마이크로그램 내지 120 마이크로그램의 강심 배당체를 포함한다. 강심 배당체의 일일 투여량은 강심 배당체의 20 마이크로그램 내지 750 마이크로그램, 0.01 마이크로그램 내지 100 mg, 또는 0.01 마이크로그램 내지 100 마이크로그램의 범위일 수 있다. SCF 추출물에 존재하는 권장 일일 투여량의 올레안드린은 일반적으로 1 일 2 회 약 0.25 내지 약 50 마이크로그램, 또는 1 일 2 회 또는 약 12 시간마다 약 0.9 내지 5 마이크로그램이다. 투여량은 약 0.5 내지 약 100 마이크로그램/일, 약 1 내지 약 80 마이크로그램/일, 약 1.5 내지 약 60 마이크로그램/일, 약 1.8 내지 약 60 마이크로그램/일, 약 1.8 내지 약 40 마이크로그램/일일 수 있다. 최대 허용 투여량은 올레안드린을 함유하는 올리앤더 추출물의 약 100 마이크로그램/일, 약 80 마이크로그램/일, 약 60 마이크로그램/일, 약 40 마이크로그램/일, 약 38.4 마이크로그램/일 또는 약 30 마이크로그램/일일 수 있으며, 최소 유효 투여량은 약 0.5 마이크로그램/일, 약 1 마이크로그램/일, 약 1.5 마이크로그램/일, 약 1.8 마이크로그램/일, 약 2 마이크로그램/일, 또는 약 5 마이크로그램/일일 수 있다. 강심 배당체 및 트리테르펜을 포함하는 적합한 투여량은 약 0.05 0.5 mg/kg/일, 약 0.05-0.35 mg/kg/일, 약 0.05-0.22 mg/kg/일, 약 0.05-0.4 mg/kg/일, 약 0.05-0.3 mg/kg/일, 약 0.05-0.5 마이크로그램/kg/일, 약 0.05-0.35 마이크로그램/kg/일, 약 0.05-0.22 마이크로그램/kg/일, 약 0.05-0.4 마이크로그램/kg/일 또는 약 0.05-0.3 마이크로그램/kg/일일 수 있다. 일부 실시 예에서, 올레안드린의 투여량은 약 1 mg 내지 약 0.05 mg, 약 0.9 mg 내지 약 0.07 mg, 약 0.7 mg 내지 약 0.1 mg, 약 0.5 mg 내지 약 0.1 mg, 약 0.4 mg 내지 약 0.1 mg, 약 0.3 mg 내지 약 0.1 mg, 약 0.2 mg이다. 본 발명은 본원에 제시된 용량의 모든 조합을 포함한다.
일부 실시 예에서, 강심 배당체는 적어도 2 개의 투여 단계, 즉 로딩 단계 및 유지 단계로 투여된다. 로딩 단계는 강심 배당체의 정상 상태 혈장 수준이 달성 될 때까지 계속된다. 유지 단계는 치료 시작시 또는 로딩 단계 완료 후 시작된다. 투여량 적정은 로딩 단계 및/또는 유지 보수 단계에서 발생할 수 있다.
본원에 기술된 모든 투여 요법, 투여 일정 및 투여량은 적합한 것으로 고려된다; 그러나, 일부 투약 요법, 투약 일정 및 투여량은 다른 대상체보다 일부 대상체에 더 적합 할 수 있다. 표적 임상 종료점은 상기 투여량을 안내하는 데 사용된다.
바이러스 조성물은 전신 투여될 수 있다. 전신 투여 방식은 비경구, 구강(buccal), 장내, 근육내, 피하, 설하, 경구(peroral), 폐, 입 투여를 포함한다. 조성물은 또한 주사를 통해 또는 정맥 내로 투여될 수 있다. 조성물은 또한 동일한 대상체에게 2 개 이상의 경로로 투여될 수 있다. 일부 실시 예에서, 조성물은 비경구, 구강(buccal), 장내, 근육내, 피하, 설하, 경구(peroral), 폐, 입 투여로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 2 개 이상의 투여 방식의 조합에 의해 투여된다.
본 발명은 또한 올레안드린 및 액체 담체를 포함하는 설하 제형를 제공한다. 본 발명은 또한 바이러스 감염, 특히 코로나 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본원에 정의된 바와 같이, 복수 투여량의 올레안드린 함유(디곡신 함유) 조성물을 상기 바이러스 감염을 갖는 대상체에게 설하 투여하는 것을 포함한다. 1 회 이상의 투여량은 1 주일에 2 일 이상 및 1 개월에 1 주 이상, 선택적으로 1 년에 1 개월 이상 투여될 수 있다.
일부 실시 예에서, 항 바이러스 조성물은 올레안드린(또는 디곡신 또는 올레안드린과 디곡신의 조합) 및 오일을 포함한다. 오일은 중쇄 트리글리세리드를 포함 할 수 있다. 항 바이러스 조성물은 하나, 둘 또는 그 이상의 올레안드린-함유 추출물 및 하나 이상의 약제학적 부형제를 포함할 수 있다.
항 바이러스 조성물에 존재하는 경우, 추가적인 강심 배당체가 추가적으로 포함될 수 있다: 오도로사이드, 네리탈로사이드 또는 올레안드리게닌. 일부 실시 예에서, 조성물은 a) 하나 이상의 트리테르펜; b) 하나 이상의 스테로이드; c) 하나 이상의 트리테르펜 유도체; d) 하나 이상의 스테로이드 유도체; 또는 e) 이들의 조합을 더 포함한다. 일부 실시 예에서, 조성물은 강심 배당체 및 a) 2 개 또는 3 개의 트리테르펜; b) 2 개 또는 3 개의 트리테르펜 유도체; c) 2 개 또는 3 개의 트리테르펜 염; 또는 d) 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시 예에서, 트리테르펜은 올레아놀산, 우르솔산, 베툴린산 및 이의 염 또는 유도체로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 일부 실시 예는 약제학적 조성물이 적어도 하나의 약제학적 부형제 및 항 바이러스 조성물을 포함하는 것을 포함한다. 일부 실시 예에서, 항 바이러스 조성물은 a) 적어도 하나의 강심 배당체 및 적어도 하나의 트리테르펜; b) 적어도 하나의 강심 배당체 및 적어도 2 개의 트리테르펜; c) 적어도 하나의 강심 배당체 및 적어도 3 개의 트리테르펜; d) 적어도 2 개의 트리테르펜을 포함하며 강심 배당체를 배제하고; e) 적어도 3 개의 트리테르펜을 포함하며 강심 배당체를 배제하고; 또는 f) 적어도 하나의 강심 배당체, 예를 들어 올레안드린, 디곡신을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 트리테르펜 및 강심 배당체는 또한 달리 명시되지 않는 한, 이들의 염 및 유도체를 포함한다.
강심 배당체는 순수한 형태로 또는 하나 이상의 강심 배당체를 함유하는 추출물 부분으로서 약제학적 조성물에 존재할 수 있다. 트리테르펜(들)은 순수한 형태로 또는 트리테르펜(들)을 함유하는 추출물의 일부로서 약제학적 조성물에 존재할 수 있다. 일부 실시 예에서, 강심 배당체는 약제학적 조성물에서 항 바이러스 활성을 주로 담당하는 성분을 의미하는 1 차 치료 성분으로서 존재한다. 일부 실시 예에서, 트리테르펜(들)은 약제학적 조성물에서 항 바이러스 활성을 주로 담당하는 성분(들)을 의미하는 1 차 치료 성분(들)으로서 존재한다.
일부 실시 예에서, 올레안드린-함유 추출물은 식물 재료의 추출에 의해 수득된다. 추출물은 식물 재료의 열탕 추출물, 냉수 추출물, 초임계 유체(SCF) 추출물, 임계치 이하 액체 추출물, 유기 용매 추출물 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시 예에서, 추출물은 선택적으로 알코올 포함하여 추출 유체, 임계 미만 액체 이산화탄소를(바이오매스) 사용하여, 네리움(협죽도) 식물 질량의 임계 미만 액상 추출에 의해(바이오매스) 준비된다. 일부 실시 예에서, 올레안드린-함유 조성물은 둘 이상의 상이한 유형의 올레안드린-함유 추출물을 포함한다.
본 발명의 실시 예는 올레안드린-함유 바이오매스(식물 물질)가 네리움 종, 네리움 올리앤더 또는 네리움 올리앤더 L(협죽도과), 네리움 오도우럼(Nerium odourum), 화이트 올리앤더, 핑크 올리앤더, 테베티아 종(Thevetia sp.), 테베티아 페루비아나(Thevetia peruviana), 옐로 올리앤더, 테베티아 네리폴리아(Thevetia nerifolia), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 임의의 상기 종의 세포 배양(세포 덩어리), 또는 이들의 조합인 것을 포함한다. 일부 실시 예에서, 바이오매스는 잎, 줄기, 꽃, 나무 껍질, 과일, 종자, 수액 및/또는 꼬투리를 포함한다.
일부 실시 예에서, 추출물은 추출물이 대상체에게 투여될 때, 추출 동안 강심 배당체와 함께 수득되어, 강심 배당체의 치료 효능에 기여하는 적어도 하나의 다른 약리학적 활성 제제를 포함한다. 일부 실시 예에서, 조성물은 하나 이상의 다른 비-강심 배당체 치료학적 유효 작용제, 즉 강심 배당체가 아닌 하나 이상의 작용제를 추가로 포함한다. 일부 실시 예에서, 조성물은 하나 이상의 항 바이러스 화합물(들)을 추가로 포함한다. 일부 실시 예에서, 항 바이러스 조성물은 약리학적 활성 다당류를 배제한다.
일부 실시 예에서, 추출물은 하나 이상의 강심 배당체 및 하나 이상의 강심 배당체 전구체(예를 들어, 카르데놀리드, 카르다디에놀리드 및 카르다트리에놀리드)와 같은 것으로서, 이들 모두는 강심 배당체의 아글리콘 성분, 예를 들어 디기톡신, 아세틸 디기톡신, 디기톡시게닌, 디곡신, 아세틸 디곡신, 디곡시게닌, 메디곡신, 스트로판틴, 사이마린, 우아바인 또는 스트로판티딘이다. 추출물은 강심 배당체 전구체로서 강심 배당체(예컨대, 글루코사이드, 프럭토사이드 및/또는 글루쿠로나이드)의 하나 이상의 글리콘(glycone) 성분을 더 포함할 수 있다. 따라서, 항 바이러스 조성물은 하나 이상의 아글리콘 성분 및 하나 이상의 글리콘 성분으로 이루어진 군으로부터 선택된 2 이상의 강심 배당체 전구체 및 하나 이상의 강심 배당체를 포함할 수 있다. 추출물은 또한 네리움 종 또는 테베티아 종 식물 재료로부터 얻은 하나 이상의 다른 비-강심 배당체 치료 유효 제제를 포함할 수 있다.
일부 실시 예에서, 올레안드린 함량에 기초한 등가 투여량이 비교될 때, 올레안드린(OL), 올레아놀산(OA), 우르솔산(UA) 및 베툴린산(BA)을 함유하는 조성물이 순수한 올레아드린보다 더 효과적이다.
일부 실시 예에서, 총 트리테르펜 함량(OA + UA + BA) 대 올레안드린의 몰비는 약 15:1 내지 약 5:1, 또는 약 12:1 내지 약 8:1, 또는 약 100:1 내지 약 15:1, 또는 약 100:1 내지 약 50:1, 또는 약 100:1 내지 약 75:1, 또는 약 100:1 내지 약 80:1, 또는 약 100:1 내지 약 90:1, 또는 약 10:1의 범위이다.
일부 실시 예에서, 개별 트리테르펜 대 올레안드린의 몰비는 다음과 같이 범위가 설정된다: 약 2-8(OA): 약2-8(UA): 약 0.1-1(BA): 약 0.5-1.5(OL); 또는 약 3-6(OA): 약 3-6(UA): 약 0.3-8(BA): 약 0.7-1.2(OL); 또는 약 4-5(OA): 약 4-5(UA): 약 0.4-0.7(BA): 약 0.9-1.1(OL); 또는 약 4.6(OA): 약 4.4(UA): 약 0.6(BA): 약 1(OL).
일부 실시 예에서, 네리움 종 또는 테베티아 종 식물 재료의 추출에 의해 수득된 것과 같은 다른 치료제는 추출물의 제조 동안 수득된 다당류가 아니며, 이는 그것이 산성 호모폴리갈락투로난 또는 아라비노갈락투로난이 아님을 의미한다. 일부 실시 예에서, 추출물은 다른 치료제를 배제하고, 및/또는 추출물의 제조 동안 수득된 산성 호모폴리갈락투로난 또는 아라비노갈락투로난을 배제한다.
일부 실시 예에서, 다른 치료제, 예를 들어 네리움 종 또는 테베티아 종 식물 재료는 추출물을 제조하는 동안 얻은 다당류, 예를 들어 산성 호모폴리갈락투로 난 또는 아라비노갈라투로난이다. 일부 실시 예에서, 추출물은 또 다른 치료제를 포함하고/거나 상기 식물 물질로부터 추출물을 제조하는 동안 얻어진 산성 호모폴리갈락투로난 또는 아라비노갈라투로난을 포함한다.
일부 실시 예에서, 상기 추출물은 올레안드린, 및 강심 배당체, 당체, 비당체, 스테로이드, 트리테르펜, 다당류, 당류, 알칼로이드, 지방, 단백질, 네리탈로사이드, 오도로사이드, 올레아놀산, 우르솔산, 베툴린산, 올레안드리게닌, 올레아사이드 A, 베툴린(urs-12-ene-3β,28-diol), 28-norurs-12-en-3β-ol, urs-12-en-3β-ol, 3β,3β-하이드록시-12-올레아넨-28-oic acid, 3β,20α-디하이드록시우르스-21-en-28-oic acid, 3β,27-디하이드록시-12-ursen-28-oic acid, 3β,13β-디하이드록시우르스-11-en-28-oic acid, 3β,12α-디하이드록시올레아난-28,13β-olide, 3β,27-디하이드록시-12-올레아난-28-oic acid, 호모폴리갈락투로난, 아라비노갈라투로난, 클로로겐산, 카페산, L-퀸산, 4-쿠마로일-CoA, 3-O-카페오일퀸산, 5-O-카페오일퀸산, 카르데놀라이드 B-1, 카르데놀라이드 B-2, 올레아게닌, 네리디지노사이드, 네리조사이드, 오도로사이드-H, 3-베타-O-(D-디지노실)-5-베타, 17000-120000 D 범위의 MW 또는 약 35000 D, 약 3000 D, 약 5500 D 또는 약 12000 D의 MW를 갖는 갈락투론산, 람노즈, 아라비노스, 자일로스 및 갈락토스, 다당류로 구성된 14 베타-디하이드록시-card-20(22)-에놀라이드 펙틱 다당류, 카르데놀라이드 모노글리코사이드, 카르데놀라이드 N-1, 카르데놀라이드 N-2, 카르데놀라이드 N-3, 카르데놀라이드 N-4, 프레그난, 4,6-디엔-3,12,20-트리온, 20R-히드록시프레그나-4,6-디엔-3,12-디온, 16베타,17 베타-에폭시-12베타-히드록시 프레그나-4,6-디엔-3,20-디온, 12베타-히드록시프레그나-4,6,16-트리엔-3,20-디온(네리디에논 A), 20S,21-디히드록시프레그나-4,6-디엔-3,12-디온(네리디온 B), 네리우코우마릭산(neriucoumaric acid), 이소네리우코우마릭산(isoneriucoumaric acid), 올레안데로익산(oleanderoic acid), 올레안데렌(oleanderen), 8알파-메톡시랍단-18-oic acid, 12-우르센, 칸네로사이드, 네리우모사이드, 3β-O-(D-디지노실)-2α-히드록시-8,14β-에폭시-5β-카르다-16:17, 20:22-디에놀리드, 3β-O-(D-디지노실)-2α,14β-디히드록시-5β-카르다-16:17,20:22-디에놀리드, 3β,27-디히드록시-urs-18-en-13,28-olide, 3β,22α,28-트리히드록시-25-nor-lup-1(10),20(29)-dien-2-one, cis-카레닌(3β-히드록시-28-Z-p-쿠마로일옥시-urs-12-en-27-oic acid), trans-카레닌(3-β-히드록시-28-E-p-쿠마로일옥시-urs-12-en-27-oic acid), 3베타-히드록시-5알파-카르다-14(15),20(22)-디에놀리드(베타-안하이드로에피디기톡시게닌(anhydroepidigitoxigenin), 3베타-O-(D-디지털로실)-21-하이드록시-5베타-카르다-8,14,16,20(22)-테트라에놀리드(네리움모게닌-A-3베타-D-디지탈로사이드), 프로세라게닌 , 네리디엔온 A, 3베타,27-디히드록시-12-우르센-28-oic acid, 3베타,13베타-디히드록시우르스-11-en-28-oic acid, 3베타-히드록시우르스-12-en-28-알데히드, 28-orurs-12-en-3베타-ol, urs-12-en-3베타-ol, urs-12-ene-3베타,28-diol, 3베타,27-디히드록시-12-올레아넨-28-oic acid, (20S, 24R)-에폭시담마란-3베타,25-디올, 20베타,28-에폭시-28알파-메톡시타락사스테란-3베타-ol, 20베타,28-에폭시타락사스터-21-en-3베타-ol, 28-nor-urs-12-ene-3베타,17베타-디올, 3베타-히드록시우르스-12-en-28-알데히드, 알파-네리우르세이트(neriursate), 베타-네리우르세이트, 3알파-아세토페녹시-urs-12-en-28-oic acid, 3베타-아세토페녹시-urs-12-en-28-oic acid, 올레안데로익산, 칸네로디온(Kanerodione), 3β-p-히드록시페녹시-11α-메톡시-12α-히드록시-20-ursen-28-oic acid, 28-히드록시-20(29)-lupen-3,7-디온, 카네로신(kanerocin), 3알파-히드록시-urs-18,20-dien-28-oic acid, D-사르멘토스, D-디지노스, 네리디지노사이드, 네리조사이드, 이소리시노레익산(isoricinoleic acid), 젠티오비오실네리고사이드(gentiobiosylnerigoside), 젠티오비오실베오몬토사이드(gentiobiosylbeaumontoside), 젠티오비오실올레안드린(gentiobiosyloleandrin), 폴리네린(folinerin), 12β-히드록시-5β-carda-8,14,16,20(22)-테트라에놀리드(tetraenolide), 8β-히드록시-디지톡시게닌(digitoxigenin), Δ16-8β-히드록시-디지톡시게닌, Δ16-네리아게닌(neriagenin), 우바올(uvaol), 우르솔릭 알데히드(ursolic aldehyde), 27(p-쿠마로일옥시)우르솔산, 올레안데롤(oleanderol), 16-무수화-데액틸-네리고사이드, 9-D-히드록시-cis-12-옥타데카노익산, 아디고사이드, 아디네린, 알파-아미린, 베타-시토스테롤(beta-sitosterol), 캄페스트롤(campestrol), 천연고무(caoutchouc), 카프릭산, 카프릴산, 콜린, 코네린(cornerin), 코르테네린(cortenerin), 데아세틸올레안드린(deacetyloleandrin), 디아세틸-네리고사이드(diacetyl-nerigoside), 폴리안드린(foliandrin), 의사쿠라민(pseudocuramine), 퀘르세틴(quercetin), 퀘르세틴(quercetin)-3-햄노글루코사이드(rhamnoglucoside), 퀘르시트린(quercitrin), 로사기닌(rosaginin), 루틴(rutin), 스테아릭산(stearic acid), 스티그마스테롤(stigmasterol), 스트로스페사이드(strospeside), 요소히톡신(urehitoxin) 및 우자리게닌(uzarigenin)을 이루는 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함한다. 추출물에 존재할 수 있는 추가 성분은 Gupta et al.(IJPSR(2010(, 1(3), 21-27, 전체 개시 내용이 여기에 참조로 포함됨)에 개시된다.
올레안드린은 또한 아그로박테리움 투메파시엔스-형질 전환된 캘리로부터 유래된 현탁 배양물의 추출물로부터 수득될 수 있다. 열수, 유기 용매, 수성 유기 용매 또는 아그로박테리움의 초 임계 유체 추출물이 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
올레안드린은 또한 시험 관내 네리움 올리앤더 미세 배양(microculture)의 추출물로부터 얻을 수 있으며, 이에 의해 싹 배양은 네리움 올리앤더 품종, 예를 들어 예를 들어, 스플렌덴스 기간티움(Splendens Giganteum), 레반체(Revanche) 또는 알사스(Alsace) 또는 기타 품종의 묘목 및/또는 싹 정점으로부터 개시될 수 있다. 본 발명에 따라 미세 배양된 네리움 올리앤더의 열수, 유기 용매, 수성 유기 용매 또는 초 임계 유체 추출물이 사용될 수 있다.
추출물은 또한 임의의 상기 식물 종의 세포 덩어리(예를 들어, 세포 배양물에 존재함)를 추출하여 얻을 수 있다.
본 발명은 또한 대상체에서의 바이러스 감염의 치료를 위한 약제의 제조에 강심 배당체를 사용하는 것을 제공한다. 일부 실시 예에서, 이러한 약제의 제조는 본 발명의 하나 이상의 항 바이러스 화합물을 제공하는 단계; 한번 투여량의 항 바이러스 화합물(들)을 약제학적 제형에 포함시키는 단계; 및 약제학적 제형을 포장하는 단계를 포함한다. 일부 실시 예에서, 제조는 PCT 국제 출원 번호 PCT/US06/29061에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 제조는 또한 포장된 제형을 벤더(소매업체, 도매업자 및/또는 유통업체)에게 전달하는 단계; 포장된 제형을 바이러스 감염을 갖는 대상체에게 판매하거나 제공하는 단계; 약제와 함께, 제형의 사용, 투여 요법, 투여, 함량 및 독성 프로파일에 관한 지침을 제공하는 라벨 및 패키지 삽입물을 포함하는 단계와 같은 하나 이상의 추가 단계들을 포함할 수 있다. 일부 실시 예에서, 바이러스 감염의 치료는 대상체가 바이러스 감염을 갖는지를 결정하는 단계; 투여 요법에 따라 대상체에게 약제학적 제형의 투여를 지시하는 단계; 대상체에게 하나 이상의 약제학적 제형을 투여하는 단계로서, 하나 이상의 약제학적 제형은 투여 요법에 따라 투여되는 단계를 포함한다.
약제학적 조성물은 수용성(혼화성) 공-용매, 불수용성(불혼화성) 공-용매, 계면 활성제, 항산화제, 킬레이트제 및 흡수 증강제로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 물질의 조합을 추가로 포함할 수 있다.
가용화제는 적어도 단일 계면 활성제이지만, 그것은 또한 a) 계면 활성제 및 물 혼화성 용매; b) 계면 활성제 및 물 불혼화성 용매; c) 계면 활성제, 항산화제; d) 계면 활성제, 항산화제 및 물 혼화성 용매; e) 계면 활성제, 항산화제 및 물 불혼화성 용매; f) 계면 활성제, 물 혼화성 용매 및 물 불혼화성 용매; 또는 g) 계면 활성제, 항산화제, 물 혼화성 용매 및 물 불혼화성 용매의 조합과 같은 재료들의 조합일 수 있다.
약제학적 조성물은 a) 적어도 하나의 액체 담체; b) 적어도 하나의 유화제; c) 적어도 하나의 가용화제; d) 적어도 하나의 분산제; e) 적어도 하나의 다른 부형제; 또는 f) 이들의 조합을 선택적으로 더 포함한다.
일부 실시 예에서, 물 혼화성 용매는 저 분자량(6000 미만) PEG, 글리콜 또는 알코올이다. 일부 실시 예에서, 계면 활성제는 페길레이티드 계면 활성제이며, 이는 폴리(에틸렌 글리콜) 작용기를 포함하는 계면 활성제를 의미한다.
본 발명은 본 명세서에 개시된 본 발명의 예, 실시 예 및 하위 실시 예의 모든 조합을 포함한다.
다음의 도면들은 본 명세서의 설명의 일부를 형성하고 청구된 발명의 예시적인 실시 예들을 설명한다. 당업자는 이들 도면 및 본 명세서의 설명에 비추어 과도한 실험없이 본 발명을 실시할 수 있을 것이다.
도 1 내지 도 2는 에볼라바이러스에 대한 다양한 조성물의 시험관내 용량 반응 항 바이러스 활성을 요약한 차트를 도시한다.
도 3 내지 도 4는 마르부르그바이러스에 대한 다양한 조성물의 시험관내 용량 반응 항 바이러스 활성을 요약한 차트를 도시한다.
도 5는 베로(Vero) E6 세포에서 지카바이러스(SIKV 균주 PRVABC59)에 대한 올레안드린의 시험관내 용량 반응 항 바이러스 활성을 요약한 차트를 도시한다.
도 6은 베로 E6 세포에서 지카바이러스(SIKV 균주 PRVABC59)에 대한 디곡신의 시험관내 용량 반응 항 바이러스 활성을 요약한 차트를 도시한다.
도 7은 베로 E6 세포에서 에볼라바이러스에 대한 다양한 조성물(올레안드린, 디곡신 및 PBI-05204)의 시험관내 용량 반응 항 바이러스 활성을 요약한 차트를 도시한다.
도 8은 베로 E6 세포에서 마르부르그바이러스에 대한 다양한 조성물(올레안드린, 디곡신 및 PBI-05204)의 시험관내 용량 반응 항 바이러스 활성을 요약한 차트를 도시한다.
도 9는 다양한 조성물(올레안드린, 디곡신 및 PBI-05204)의 존재하에 베로 E6 세포의 시험관내 세포 생존력을 요약한 차트를 도시한다.
도 10a 및 10b는 바이러스에 노출된 직후 베로 E6 세포에서 에볼라바이러스를 억제하는 조성물(올레안드린 및 PBI-05204)의 능력을 요약한 차트를 도시한다: 도 10a는 감염 후 2 시간; 도 10b는 감염 후 24 시간.
도 11a 및 11b는 바이러스에 노출된 직후 베로 E6 세포에서 마르부르그바이러스를 억제하는 조성물(올레안드린 및 PBI-05204)의 능력을 요약한 차트를 도시한다: 도 11a는 감염 후 2 시간; 도 11b는 감염 후 24 시간.
도 12a 및 도 12b는 올레안드린에 노출된 바이러스 감염된 베로 E6 세포에 의한 감염성 자손의 산물을 억제하는 조성물(올레안드린 및 PBI-05204)의 능력을 요약한 차트를 도시한다. 12a-에볼라바이러스; 12b-마르부르그바이러스.
도 13a 및 13b는 베로 E6 세포에서 베네수엘라 말 뇌척수염 바이러스(도 13a) 및 웨스턴 말 뇌척수염 바이러스(도 13b)에 대한 다양한 조성물(올레안드린, 디곡신 및 PBI-05204)의 시험관내 용량 반응 항 바이러스 활성을 요약한 차트를 도시한다.
도 14는 HTLV-1 p19Gag의 정량화에 의해 결정된 바와 같이, 비이클 대조군, 올레안드린 도는 N. oleander의 추출물이 HTLV-1 복제 또는 새로 합성 된 바이러스 입자의 방출에 대해 갖는 효과를 요약한 도표를 나타낸다(실시 예 19 및 20 참조). 비교를 위해 처리되지 않은(UT) 세포가 도시된다. 모든 데이터는 적어도 세 번의 독립적인 실험으로 나타낸다. 데이터는 실험의 평균 ± 표준 편차(에러 바)를 나타낸다.
도 15는 HTLV-1 + SLB1 림프종 T-세포주에 대한 비히클 대조군, 올레안드린 및 N. oleander 추출물의 상대적 세포 독성을 요약한 도표를 나타낸다. 모든 데이터는 적어도 세 번의 독립적인 실험으로 나타낸다. 데이터는 실험의 평균 ± 표준 편차(에러 바)를 나타낸다.
도 16a-16f는 병합된 이미지에서 DIC 위상차를 갖는 아넥신 V-FITC(녹색) 및 PI(적색) 염색 결과의 대표적인 현미경 사진을 도시한다. 개별 아넥신 V-FITC 및 PI 형광 채널 이미지도 제공된다. 스케일 바, 20 ㎛.
도 17은 비히클 대조군, 올레안드린 또는 N. oleander 추출물이 올레안드린 처리된 HTLV-1 + 림프종 T-세포로부터 새로 합성된 바이러스 입자의 방출 및 HTLV-1 복제에 대해 갖는 효과를 요약한 도표를 나타낸다.
도 18은 처리된 huPBMC에 대한 비히클 대조군, 올레안드린 또는 N. oleander 추출물의 상대적 세포 독성을 요약 한 도표를 나타낸다.
도 19는 비히클 대조군, 올레안드린 또는 N. oleander 추출물을 함유하는 공동-배양 분석 huPBMC에서 HTLV-1 전달의 상대적 억제율을 요약한 도표를 나타낸다.
도 20은 GFP-발현 HTLV-1 + SLB1 T-세포주의 대표적인 현미경 사진:형광 현미경(상부 패널) 및 면역 블롯팅(하부 패널)을 도시한다.
도 21은 huPBMC와 미토마이신 C-처리된 HTLV-1 + SLB1/pLenti-GFP 림프 모세포(녹색 세포) 사이의 바이러스학적 시냅스의 대표적인 현미경 사진을 도시한다.
도 22는 도 21의 현미경 사진의 정량화로부터 표준 편차(에러 바)를 갖는 평균 데이터의 도표를 나타낸다.
도 23a-23d는 "치료" 후, 24시간 및 48 시간에 올레안드린(빨간색 막대) 또는 대조군 비히클(배양 배지)(검정색 막대)로 처리된 SARS-CoV-2 바이러스로 감염된 VERO E6 세포에 대한 SARS-CoV-2 바이러스 역가(PFU/mL) 대 시간(h)의 로그 도표를 나타낸다(실시 예 28). 세포는 감염 전에 올레안드린으로 전처리되었다. 감염 후 초기 2 시간 배양 후, 감염된 세포를 세척하여 세포 외 바이러스 및 올레안드린을 제거하였다. 이후, 회수된 감염 세포는 다음과 같이 치료하였다. 감염된 세포를 올레안드린으로 치료하거나(도 23a: 수성 성분으로서 RPMI 1640 배양 배지를 갖는 0.1 % 수성 DMSO 중 1㎍/mL; 도 23c: RPMI 1640을 갖는 0.01 % 수성 DMSO 중 0.1㎍/mL) 또는 그냥 대조군 비히클(도 23b: RPMI 1640을 갖는 0.1 % 수성 DMSO; 도 23d: RPMI 1640을 갖는 0.01 % 수성 DMSO)로 치료하였고, 바이러스 역가를 측정하였다.
도 24a는 감염 후 24 시간에 배양 배지에서 올레안드린의 농도(㎍/mL)에 대한 바이러스 복제 억제율(Y1, 왼쪽 축) 및 Vero-E6 세포 수(Y2, 오른쪽 축:상기 세포에 대한 올레안드린의 잠재적 세포 독성 발현)의 이중 y 축 도표를 나타낸다(실시 예 29). 도 24b는 도 24의 배양을 위한 것이지만, 감염 후 48 시간에 촬영되었다.
도 25는 표시된 농도의 올레안드린에 세포를 지속적으로 노출시킨 후, 24 시간에 배양 배지에서 올레안드린의 농도(㎍/mL)에 대한 Vero-E6 세포의 백분율(세포 역가)의 도표를 나타낸다(실시 예 30).
도 26a-26b는 SARS-CoV-2 바이러스로 감염된 다음 "치료" 후 24 시간에(도 26a) 그리고 48시간에(도 26b) 올레안드린(청색 원) 또는 대조군 비이클(배양 배지)(적색 원)으로 치료된 VERO CCL-81 세포(세로피테쿠스 아에티오프스 신장 정상 세포; https://www.atcc.org/products/all/CCL-81.aspx)에 대한 배양 배지에서 올레안드린의 농도에 대한 SARS-CoV-2 바이러스 역가(PFU/mL)의 로그 차트를 도시한다(실시 예31).
도 26a 및 26b에서, 바이러스 역가의 배수 감소(fold reduction)는 24 시간(도 26c) 및 48 시간(도 26d)에 결정되었다.
도 27a-27d는 "치료" 후 24시간 및 48시간에 올레안드린(청색 원) 또는 대조군 비히클(배양 배지)로 처리된 SARS-CoV-2 바이러스로 감염된 VERO E6 세포에 대한 SARS-CoV-2 바이러스 역가(PFU/mL) 대 시간(h)의 로그 차트를 도시한다(실시 예 28) 세포는 감염 전에 올레안드린으로 전처리되었다. 감염 후 초기 2 시간 배양 후, 감염된 세포를 세척하여 세포 외 바이러스 및 올레안드린을 제거하였다. 이후 회수된 감염 세포는 다음과 같이 처리하였다. 감염된 세포를 올레안드린으로 치료하거나(도 27a: 수성 성분으로서 RPMI 1640 배양 배지를 갖는 수성 DMSO(0.005%) 중 0.005㎍/mL; 도 27b: RPMI 1640을 갖는 수성 DMSO(0.01%) 중 0.01㎍/mL) 또는; 도 27c: RPMI 1640을 갖는 수성 DMSO(0.05%) 중 0.05㎍/mL; 도 27b: RPMI 1640을 갖는 수성 DMSO(0.1%) 중 0.1㎍/mL)로 치료하였고, 바이러스 역가를 측정하였다.
도 28a 및 28b는 "치료" 후 24시간(도 28a) 및 48시간(도 28b)에 SARS-CoV-2 바이러스로 감염된 후 올레안드린(진한 청색 원(실험 2) 및 밝은 청색 원(실험 3)) 또는 대조 비히클(배양 매체)(진한 적색 사각형(실험 2) 및 밝은 적색 사각형(실험 3))으로 처리된 VERO 81 세포에 대한 배양 배지에서 SARS-CoV-2 바이러스 역가(PFU/mL) 대 올레안드린 농도의 로그 차트를 도시한다. 실험 2 및 실험 3은 단지 분석의 중복 실행일 뿐이다.
도 29a 및 29b는 바이러스 역가 대 배양 배지에서의 올레안드린 농도의 막대 그래프를 도시하며, 여기서 바이러스 역가는 감염 후 24 시간(도 29a) 및 48 시간(도 29b)에 측정되었다. 일부 샘플의 경우, 세포 감염 전후(2 시간)에 올레안드린(청색 막대) 또는 DMSO 대조군 비히클(적색 막대)로 처리했다. 다른 샘플의 경우, 세포를 올레안드린(해시된 청색 막대: 감염 후 12 시간, 속이 빈 청색 막대: 감염 후 24 시간) 또는 DMSO 대조군 비히클(해시된 적색 막대: 감염 후 12 시간, 속이 빈 적색 막대: 24 시간)로 처리했다.
도 30a 및 30b는 이중 추출물 조합 조성물(PBI-A)의 항-COVID-19 활성의 평가를 위한 차트를 도시한다. 도 30b에서, ㎍/ml(올레안드린 농도) 지시는 PBI-A가 1mg/ml(올레안드린 농도) 용액으로 공급되었다고 가정한다. 바이러스 역가(Log10(PFU/mL)) 대 Log10 희석 인자(도 30a) 또는 바이러스 역가 대 올레안드린의 Log10 농도(도 30b)을 결정하였다. 도 30a는 실시 예 31의 감염 전 데이터 처리 분석을 위한 것이다. 30b는 실시 예 34의 감염 후 처리 분석을 위한 것이다.
본 발명은 하나 이상의 유효량의 항 바이러스 조성물(또는 항 바이러스 조성물 및 하나 이상의 약제학적 부형제를 포함하는 약제학적 조성물)을 대상체에게 만성 또는 급성적으로 투여함으로써 대상체에서 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 조성물은 대상체에 가장 적합한 투여 요법에 따라 투여되고, 투여량 및 투여 요법의 적합성은 종래의 임상 관행 및 바이러스 감염에 대한 임상 치료 종점에 따라 임상적으로 결정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 포유동물, 예를 들어 고양이, 개, 마우스, 기니피그, 말, 소, 양 및 인간과 같은 온혈 동물을 의미하는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 바이러스 감염 위험이 있는 대상체는: a) 모기, 특히 에데스(Aedes) 종(Aedes egypti, Aedes albopictus) 모기가 살고있는 지리적 영역에 거주하는 대상체; b) 바이러스 감염자들 근처 또는 그들과 함께 사는 대상체; c) 바이러스 감염을 가진 사람과 성적인 관계를 가진 대상체; d) 진드기, 특히 익소디즈(Ixodes) 종(Ixodes marx, Ixodes scapularis 또는 Ixodes cooke species) 진드기가 살고있는 지리적 영역에 거주하는 대상체; e) 과일 박쥐가 사는 지리적 지역에 살고 거주하는 대상체; f) 열대 지역에 사는 대상체; g) 아프리카에 사는 대상; h) 바이러스 감염을 갖는 다른 대상체의 체액과 접촉하는 대상체; i) 아이; 또는 j) 면역 체계가 약화된 대상체이다. 일부 실시 예에서, 대상체는 암컷, 임신할 수 있는 암컷 또는 임신한 암컷이다.
본 발명에 따라 치료된 대상체는 치료 반응을 나타낼 것이다. "치료반응"은 바이러스 감염을 앓고 있는 대상체가 강심 배당체로 치료한 결과 다음과 같은 임상적 이점 중 적어도 하나를 누리게 되는 것을 의미한다: 대상체의 혈액 또는 혈장에서의 활성 바이러스 농도 감소, 대상체의 혈액 또는 혈장으로부터의 활성 바이러스의 박멸, 감염의 개선, 감염과 관련된 증상의 발생 감소, 감염의 부분적 또는 완전한 완화 또는 감염의 진행까지의 증가된 시간 및/또는 상기 바이러스 감염을 야기하는 바이러스의 감염성의 감소. 치료 반응은 전체적 또는 부분적 치료 반응일 수 있다.
본원에 사용된 "진행까지의 시간"은 바이러스 감염이 진단(또는 치료)된 후 감염이 악화되기 시작할 때까지의 기간, 길이 또는 지속 기간이다. 더 이상의 감염 진행없이 감염 수준이 유지되는 기간이며, 감염이 다시 진행되기 시작할 때 그 기간은 종료된다. 질병의 진행은 치료 전 또는 치료 시작 시에 감염을 앓고있는 대상체를 "스테이징(staging)"함으로써 결정된다. 예를 들어, 대상체의 건강은 치료 전 또는 치료 시작 시에 결정된다. 이어서, 대상체를 항 바이러스 조성물로 치료하고, 바이러스 농도를 주기적으로 모니터링한다. 나중에 어느 시점에서, 감염 증상이 악화될 수 있으며, 따라서 감염의 진행 및 "진행까지의 시간"의 끝을 표시한다. 감염이 진행되지 않거나 또는 감염의 수준 또는 심각성이 악화되지 않은 기간이 "진행까지의 시간"이다.
투여 요법은 투여 스케줄에 따라 투여되는 하나 이상의 강심 배당체 및/또는 트리테르펜의 치료적으로 관련된 투여량(또는 유효 투여량)을 포함한다. 따라서, 치료적으로 관련된 투여량은 항 바이러스 조성물에 의한 치료에 대한 바이러스 감염의 치료 반응이 관찰되고 과량의 원치 않거나 유해한 부작용없이 항 바이러스 조성물을 대상체에게 투여할 수 있는 치료 투여량이다. 치료적으로 관련된 투여량은 환자에게 일부 부작용을 일으킬 수 있지만, 대상에게 치명적이지 않다. 항 바이러스 조성물이 투여되는 대상체에 대한 임상적 이점의 수준이 항 바이러스 조성물 또는 이들 성분(들)의 투여로 인해 대상체가 경험하는 유해한 부작용의 수준을 초과하는 투여량이다. 치료적으로 관련된 투여량은 다양하게 확립된 약리학적, 약역학적 및 약동학적 원리에 따라 대상체마다 상이할 것이다. 그러나, 치료적으로 관련된 투여량(예를 들어, 올레안드린에 대한 상대적 투여량)은 전형적으로 약 25 마이크로그램, 약 100 마이크로그램, 약 250 마이크로그램, 약 500 마이크로그램 또는 약 750 마이크로그램의 강심 배당체/일이거나, 또는 투여 당 강심 배당체의 양이 약 25-750 마이크로그램의 범위이거나, 또는 하루에 약 25 마이크로그램, 약 100 마이크로그램, 약 250 마이크로그램, 약 500 마이크로그램 또는 약 750 마이크로그램의 강심 배당체를 초과하지 않을 수 있다. 치료적으로 관련된 용량(예를 들어, 개별적으로 또는 함께 트리테르펜과 관련하여)의 또 다른 예는 체중 kg 당, 일반적으로 약 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 500 mg/kg, 약 100 내지 약 1000 mg/kg, 약 15 내지 약 25 mg/kg, 약 25 내지 약 50 mg/kg, 약 50 내지 약 100 mg/kg, 약 100 내지 약 200 mg/kg, 약 200 내지 약 500 mg/kg, 약 10 내지 약 750 mg/kg, 약 16 내지 약 640 mg/kg, 약 15 내지 약 750 mg/kg, 약 15 내지 약 700 mg/kg, 또는 약 15 내지 약 650 mg/kg 범위일 수 있다. 대상체에서 표적 치료 결과를 제공하기 위해 필요한 항 바이러스 조성물의 실제 양은 약학의 기본 원리에 따라 대상체마다 다를 수 있다는 것이 당 업계에 공지되어 있다.
디곡신 처리는 2 개 이상의 투여 단계, 즉 로딩 단계 및 유지 단계를 사용하여 수행 할 수 있다. 로딩 단계는 디곡신의 정상 상태 혈장 수준이 달성될 때까지 다음 투여 요법을 사용할 수 있으며, 유지 단계는 로딩 단계 완료 후 다음의 투여 요법을 사용할 수 있다.
Figure 112020098766406-pct00001
치료적으로 관련된 투여량은 바이러스 감염의 치료에 전형적으로 사용되는 임의의 투여 요법에 따라 투여될 수 있다. 치료적으로 관련된 투여량은 1 일 1 회, 2 회, 3 회 이상 투여될 수 있다. 격일로, 3 일마다, 4 일마다, 5 일마다, 반주마다, 주마다, 격주로, 3 주마다, 4 주마다, 매월, 격월마다, 반달마다, 3 개월마다, 4 개월마다, 반년마다, 매년, 또는 상기의 임의의 조합에 따라 적합한 투여 스케줄에 도달한다. 예를 들어, 치료적으로 관련된 투여량은 1 주일 이상 동안 매일 1 회 이상(가장 많은 투여량의 경우 1일 10회까지) 투여될 수 있다.
실시 예 15는 이들 둘 모두가 필로바이러스인 에볼라바이러스(도 1 및 도 2) 및 마르부르그바이러스(도 3 및 도 4) 감염의 치료를 위한 올레안드린(단독 활성), 안비르젤(AnvirzelTM)(네리움 올리앤더의 열수 추출) 및 PBI 05204(네리움 올리앤더의 초임계 유체(SCF) 추출물)를 함유하는 조성물의 효능을 평가하기 위해 사용되는 시험관내 분석의 상세한 설명을 제공한다.
열수 추출물은 경구, 설하, 피하 및 근육 내로 투여될 수 있다. 한 실시 예는 액체 제형로서 상표명 ANVIRZEL™(Nerium Biotechnology, Inc., San Antonio, TX; Salud Integral Medical Clinic, Tegucigalpa, Honduras; www.saludintegral.com; www.anvirzel.com)으로 입수 가능하다. 설하 투여의 경우, 일반적인 투여 요법은 하루에 1.5ml 또는 하루에 0.5ml 3 회 투여량이다. 주사 투여의 경우, 전형적인 투여 요법은 약 1 내지 약 2ml/일, 또는 약 1 주 내지 약 6 개월 이상 동안 약 0.1 내지 약 0.4ml/m2/일, 또는 약 1 주 내지 약 6 개월 이상 동안 약 0.4 내지 약 0.8ml/m2/일, 또는 약 1 주 내지 약 6 개월 이상 동안 약 0.8 내지 약 1.2ml/m2/일이다. ANVIRZEL™의 최대 허용 투여량이 훨씬 더 높기 때문에, 더 높은 투여량을 사용할 수 있다. ANVIRZEL™은 올레안드린, 올레안드리게닌, 네리움 올리앤더로부터 추출한(열수 추출) 다당류를 포함한다. 시판되는 바이알은 약 200 내지 약 900 ㎍의 올레안드린, 약 500 내지 약 700 ㎍의 올레안드리게닌 및 네리움 올리앤더로부터 추출된 다당류를 포함하는 동결 건조 분말(투여 전 물로 재구성되기 이전)로서, 약 150 mg의 올리앤더 추출물을 포함한다. 상기 바이알은 또한 하나 이상의 삼투제, 예를 들어 만니톨, 염화나트륨, 하나 이상의 완충제, 예를 들어 아스코르브산을 갖는 아스코르브산나트륨, 하나 이상의 방부제, 예를 들어 프로필파라벤, 메틸파라벤과 같은 약학적 부형제를 포함할 수 있다.
상기 조성물을 40 마이크로그램/mL의 세포에 첨가한 다음, 바이러스를 첨가하고 1 시간 동안 배양하는 것으로 실험을 설정하였다. 바이러스를 세포에 첨가할 때, 조성물의 최종 농도는 20 마이크로그램/mL이다. 상이한 양의 올레안드린을 함유하는 조성물은 이들이 함유하는 올레안드린의 농도에 따라 조정될 수 있고, 이를 몰 농도로 변환시킬 수 있다. 도 1 내지 도 4는 추출물의 올레안드린 함량에 기초한 효능을 도시한다. OL 자체는 효과적이다. OL, OA, UA 및 BA를 포함하는 네리움 올리앤더의 SCF 추출물인 PBI-05204는 OL 자체보다 실질적으로 더 효과적이다. 네리움 올리앤더의 열탕 추출물인 안비르젤TM은 OL 자체보다 효과적이다. 두개의 추출물 모두는 나노 몰 범위에서 효능을 분명히 나타낸다. PBI-05204 추출물(1.74 %)에서의 올레안드린의 백분율은 안비르젤TM(0.459 %, 4.59 마이크로그램/mg)에서 보다 높다. PBI-05204의 최고 투여량에서, 그것은 EBOV 및 MARV 감염을 완전히 억제하는 반면, 안비르젤TM은 안비르젤TM과 함께 20 마이크로그램/mL 초과의 투여량에서 독성이 관찰되기 때문에, 완전한 억제를 나타내지 않았다. 데이터는 PBI-05204에 대한 에볼라바이러스 및 마르부르그바이러스에 대한 최고의 항 바이러스 활성을 입증한다. PBI-05204에서의 트리테르펜의 조합은 올레안드린의 항 바이러스 활성을 증가시켰다.
실시 예 6은 지카바이러스(플라비바이러스) 감염의 치료를 위한 강심 배당체의 효능을 평가하기 위해 사용되는 시험관내 분석의 상세한 설명을 제공한다. 베로 E6 세포는 올레안드린(도 5) 또는 디곡신(도 6)의 존재하에서, 0.2의 MOI에서 지카바이러스(ZIKV 균주 PRVABC59)로 감염되었다. 세포를 바이러스 및 강심 배당체와 함께 1 시간 동안 배양한 후, 접종원 및 비-흡수성 강심 배당체(존재하는 경우)를 제거하였다. 세포를 신선한 배지에 담그고 48 시간 동안 배양한 후, 포르말린으로 고정하고, ZIKV 감염을 위해 염색하였다. 데이터는 강심 배당체 둘 다에 대한 지카바이러스에 대한 항 바이러스 활성을 입증하지만; 올레안드린은 디곡신보다 더 높은(거의 8 배 더 큰) 항 바이러스 활성을 나타냈다.
실시 예 14는 지카바이러스 및 뎅기 바이러스에 대한 시험 조성물의 항 바이러스 활성을 평가하기 위해 사용된 분석의 상세한 설명을 제공한다. 데이터는 올레안드린이 지카바이러스 및 뎅기 바이러스에 대한 효능을 나타낸다는 것을 나타낸다.
도 7은 베로 E6 세포에서 에볼라바이러스(EBOV)에 대한 다양한 조성물(올레안드린, 디곡신 및 PBI-05204)의 시험관내 용량 반응 항 바이러스 활성을 요약한 차트를 도시한다. 도 8은 베로 E6 세포에서 마르부르그바이러스(MARV)에 대한 다양한 조성물(올레안드린, 디곡신 및 PBI-05204)의 시험관내 용량 반응 항 바이러스 활성을 요약한 차트를 도시한다. 도 9는 다양한 조성물(올레안드린, 디곡신 및 PBI-05204)의 존재하에 베로 E6 세포의 시험관내 세포 생존력을 요약한 차트를 도시한다. 도 7 내지 도 8의 경우, 숙주 세포는 바이러스 감염 전에 조성물에 노출되었다. 베로 E6 세포는 올레안드린 함유 식물 추출물인 올레안드린, 디곡신 또는 PBI-05204의 존재 하에서, EBOV/Kik(도 7, MOI = 1) 또는 MARV/Ci67(도 8, MOI = 1)로 감염되었다. 1 시간 후, 접종원 및 화합물을 제거하고, 신선한 배지를 세포에 첨가하였다. 48 시간 후, 세포를 고정시키고 면역 염색하여 EBOV 또는 MARV로 감염된 세포를 검출하였다. 감염된 세포를 오페레타(Operetta)를 사용하여 열거하였다.
항 바이러스 활성과 관련하여 위양성(false positive)이 관찰되지 않도록 하기 위해, 조성물의 존재하에서 세포 생존력을 시험하였다. 도 9의 데이터의 경우, 베로 E6 세포는 상기와 같이 화합물로 처리되었다. ATP 수준은 세포 생존력의 측정으로서 셀티터-글로(CellTiter-Glo)에 의해 측정되었다. 올레안드린, 디곡신 및 PBI-05204는 세포 생존력을 감소시키지 않는 것으로 결정되었으며, 이는 본 명세서의 다른 도면에 상세히 기술된 항 바이러스 활성이 개별 화합물의 세포 독성에 의해 유발되는 위양성 때문이 아님을 의미한다.
따라서, 본 발명은 포유동물 또는 숙주 세포에서 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 바이러스 감염 걸림 이전에 포유동물 또는 숙주 세포에 항 바이러스 조성물을 투여하는 단계를 포함하여, 상기 포유동물 또는 숙주 세포의 바이러스 감염 시, 항 바이러스 조성물이 바이러스 농도를 감소시키고 바이러스 감염을 개선, 감소 또는 제거하게 한다.
본 발명의 항 바이러스 조성물 및 방법은 또한 항 바이러스 조성물의 투여 이전에 발생한 바이러스 감염을 치료하는데 유용하다. 베로 E6 세포를 EBOV(도 10a, 10b) 또는 MARV(도 11a, 11b)로 감염시켰다. 감염 후 2 시간(도 10a, 11a) 또는 감염 후 24 시간(도 10b, 11b)에, 올레안드린 또는 PBI-05204를 1 시간 동안 세포에 첨가한 후, 폐기하고 세포를 배양 배지로 리턴시켰다.
도 10a 및 도 10b는 바이러스에 노출된 직후, 베로 E6 세포에서 에볼라바이러스를 억제하는 조성물(올레안드린 및 PBI-05204)의 능력을 요약한 차트를 도시한다: 도 10a-감염 후 2 시간; 도 10b-감염 후 24 시간. 항 바이러스 조성물이 바이러스 감염 후 2 시간 내에(또는 최대 12 시간 이내에) 투여될 때, 바이러스 농도 항 바이러스 조성물은 효과적인 치료를 제공하고, EBOV 바이러스 농도를 감소시킨다. 24 시간 후에도 바이러스 조성물이 효과적이지만, 초기 바이러스 감염 후 시간이 지날수록 그 효능은 낮아진다. MARV에 대해서도 동일한 평가가 수행되었다. 도 11a 및 도 11b는 바이러스에 노출된 직후, 베로 E6 세포에서 마르부르그바이러스를 억제하는 조성물(올레안드린 및 PBI-05204)의 능력을 요약한 차트를 도시한다: 11a-감염 후 2 시간; 도 11b-감염 후 24 시간. 항 바이러스 조성물이 바이러스 감염 후 2 시간 내에(또는 최대 12 시간 이내에) 투여될 때, 바이러스 농도 항 바이러스 조성물은 효과적인 치료를 제공하고, MARV 바이러스 농도를 감소시킨다. 24 시간 후에도 바이러스 조성물이 효과적이지만, 초기 바이러스 감염 후 시간이 지날수록 그 효능은 낮아진다.
본원의 조성물의 항 바이러스 활성이 단일 세대의 바이러스 감염 세포에 대해, 예를 들어 감염 후 24 시간 이내에 감소됨을 고려하여, 항 바이러스 조성물이 바이러스성 증식을 억제할 수 있는지, 즉 감염성 자손의 생성을 억제할 수 있는지를 평가하였다. 베로 E6 세포를 올레안드린 또는 PBI-05204의 존재하에서 EBOV 또는 MARV로 감염시키고, 48 시간 동안 배양하였다. 감염된 세포 배양물로부터의 상청액을 새로운 베로 E6 세포에 통과시키고, 1 시간 동안 배양한 다음 폐기하였다. 통과한 상청액을 함유하는 세포를 48 시간 동안 배양하였다. EBOV(B) 또는 MARV(C)로 감염된 세포는 본원에 기술된 바와 같이 평가되었다. 대조군 감염률은 EBOV의 경우 66 %, MARV의 경우 67 %였다. 본 발명의 항 바이러스 조성물은 감염성 자손의 생성을 억제하였다.
따라서, 본 발명의 항 바이러스 조성물은: a) 바이러스에 노출된 후 바이러스 감염을 억제하기 위해, 바이러스 감염 전에 예방적으로 투여될 수 있고; b) 감염성 자손의 바이러스 복제 및 생성을 억제 또는 감소시키기 위해, 바이러스 감염 후에 투여될 수 있으며; 또는 c) a)와 b)의 조합으로 투여될 수 있다.
토가비리대 알파바이러스에 대한 항 바이러스 조성물의 항 바이러스 활성은 베로 E6 세포에서 VEE 바이러스 및 WEE 바이러스를 사용하여 평가되었다. 도 13a 및 도 13b는 베로 E6 세포에서 베네수엘라 말 뇌척수염 바이러스(도 13a) 및 웨스턴 말 뇌척수염 바이러스(도 13b)에 대한 다양한 조성물(올레안드린, 디곡신 및 PBI-05204)의 시험관내 용량 반응 항 바이러스 활성을 요약한 차트를 도시한다. 지시된 화합물의 존재 또는 부재하에서, 18 시간 동안 베로 E6 세포를 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(도 13a, MOI = 0.01) 또는 웨스턴 말 뇌염 바이러스(도 13b, MOI = 0.1)로 감염시켰다. 감염된 세포를 이전과 같이 검출하고, 오페레타에 열거하였다. 본 발명의 항 바이러스 조성물은 효과적인 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 아레나비리대 과 바이러스, 필로비리대 과 바이러스, 플라비비리대 과 바이러스(플라비바이러스 속), 레트로비리대 과 바이러스, 델타레트로바이러스 속 바이러스, 코로나비래대 과 바이러스, 파라믹소비리대 과 바이러스 또는 토가비리대 과 바이러스에 의해 유발되는 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효량의 항 바이러스 조성물을 투여하고, 그에 의해 항 바이러스 조성물에 바이러스를 노출시켜 상기 바이러스 감염을 치료하는 단계를 포함한다.
본 발명자들은 HTLV-1(인간 T-세포 백혈병 바이러스 1 형; 엔벨롭된 레트로 바이러스; 델타레트로 바이러스 속) 감염의 치료를 위하여 본원에 기재된 올레안드린 및 그 추출물의 사용을 평가했다. 정제된 올레안드린 화합물 또는 N. oleander 추출물이 HTLV-1 프로바이러스 복제 및/또는 p19Gag 함유 바이러스 입자의 생성 및 방출을 억제할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 바이러스 생성 HTLV-1-형질 전환 SLB1 림프종 T-세포주를 증가하는 농도의 올레안드린 또는 N. oleander 추출물 또는 멸균 비히클 대조군(MilliQ-처리된 ddH2O에서 20 % DMSO)으로 처리한 다음, 10 % CO2 하에서 37℃에서 72 시간 동안 배양했다. 세포는 나중에 원심 분리에 의해 펠릿 화되었고, 배양 상청액으로 방출된 세포 외 p19Gag 함유 바이러스 입자의 상대적 수준(level)이 Anti-HTLV-1 p19Gag ELISA(Zeptometrix)를 수행하여 정량화되었다.
도 14는 비히클 대조군(1.5 ㎕, 7.5 ㎕, 또는 15 ㎕) 또는 증가하는 농도( 10 ㎍/ml, 50 ㎍/ml 및 100 ㎍/ml)의 올레안드린 화합물 또는 N. oleander 추출물로 72 시간 동안 처리한 HTLV-1 + SLB1 림프종 T-세포주에 의해 발현된 HTLV-1 p19Gag의 정량화 데이터를 나타낸다(실시 예 19 및 20). 바이러스 복제 및 배양 상청액으로의 세포 외 입자 방출은 Anti-HTLV-1 p19Gag ELISA(Zeptometrix)를 수행하여 정량화되었다. 올레안드린은 HTLV-1 복제 또는 새로 합성 된 바이러스 입자의 방출을 크게 억제하지 않았다. 우리는 추출물이나 올레안드린 단독으로 바이러스 복제 또는 p19Gag 함유 입자의 배양 상청액으로의 방출을 크게 억제하지 않는다는 것을 확인했다. 따라서, 우리는 더 이상의 항 바이러스 활성을 기대하지 않았다. 그러나, 우리는 예기치 않게도, 처리된 세포로부터 수집된 바이러스 입자가 1 차 인간 말초 혈액 단핵 세포(huPBMC)에서 감소된 감염성을 나타냄을 발견했다. HIV-1과 달리, 세포 외 HTLV-1 입자는 감염성이 낮으며, 바이러스 전달은 일반적으로 바이러스 시냅스를 통한 직접적인 세포 간 상호 작용을 통해 일어난다.
따라서, 본 발명은 감소된 감염성을 갖는 HTLV-1 바이러스 입자를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 감소된 감염성을 갖는 상기 HTLV-1 바이러스 입자를 제공하기 위해, 본 발명의 항 바이러스 조성물로 HTLV-1 바이러스 입자를 처리하는 것을 포함한다.
관찰된 항 바이러스 활성이 HTLV-1 + SLB1 림프 모세포에 대한 항 바이러스 조성물의 잠재적 세포 독성으로 인한 인공 산물이 아님을 확인하기 위해, 우리는 처리된 HTLV-1 + SLB1 림프 모세포 배양물에서 정제된 올레안드린 화합물 및 N. oleander 추출물의 다양한 희석액의 세포 독성을 평가했다(실시 예 21). SLB1 T-세포를 본원에 기재된 바와 같이, 72 시간 동안 증가하는 농도(10, 50 및 100 ㎍/ml)의 올레안드린 또는 N. oleander 추출물로 처리하였다. 음성 대조군으로서, 약물 처리된 배양물에 사용된 부피에 대응하는 비히클 용액의 증가량(1.5, 7.5 및 15 ㎕)으로 세포를 처리했다. 시클로포스파미드(50 μM; Sigma-Aldrich) 처리된 세포는 세포 사멸에 대한 양성 대조군으로 포함되었다. 그런 다음, 샘플을 세척하고 Annexin V-FITC 및 프로피듐 요오드화물(PI)로 염색하고, 공초점 형광 현미경으로 분석했다. Annexin V-FITC 및/또는 PI-양성 세포의 상대적 백분율은 형광 현미경 및 20x 대물 렌즈를 사용하여 3 중 시야를 계산하여 정량화되었다.
결과(도 15 및 도 16a-16f)는 올레안드린 및 N. oleander 추출물의 최저 농도(10 ㎍/ml)가 유의한 세포 독성/세포 사멸(apoptosis)을 유도하지 않았음을 나타낸다. 그러나, 조 식물 추출물의 더 높은 농도(약 50 및 약 100 ㎍/ml)는 올레안드린 화합물보다 현저하게 더 많은 세포 사멸을 유도했다. 이것은 올레안드린이 N. oleander 추출물의 약 1.23 %를 차지한다는 사실과 일치한다. 올레안드린에 의해 야기되는 세포 독성은 처리된 HTLV-1 + SLB1 세포에서 비히클 대조군보다 유의하게 높지 않았다.
이어서, 우리는 올레안드린 또는 N. oleander 추출물이 공동 배양 분석에서 녹색 형광 단백질(GFP)-발현 HTLV-1 + 림프종 T-세포주로부터 huPBMC로의 바이러스 전파를 억제할 수 있는지 조사했다(실시 예 20). 이 연구를 위해, HTLV-1 + SLB1 림프종 T-세포를 96 웰 마이크로타이터 플레이트에서 72 시간 동안, 올레안드린 화합물 또는 N. oleander 추출물 또는 비히클 대조군의 증가하는 농도로 처리한 다음, 바이러스 함유 상청액을 수집하였고, 이를 체외에서 1 차 배양된 인간 말초 혈액 단핵 세포(huPBMC)를 직접 감염시키는 데 사용하였다. 72 시간 후, 직접 감염의 결과로서, 배양 상청액으로 방출된 세포 외 p19Gag 함유 바이러스 입자의 상대적 수준을 Anti-HTLV-1 p19Gag ELISA를 수행하여 정량화했다.
HTLV-1 + SLB1 림프종 T-세포주를 72 시간 동안 비히클 대조군으로 처리하거나, N. oleander 또는 올레안드린 화합물의 증가하는 농도(10 ㎍/ml, 50 ㎍/ml 및 100 ㎍/ml)로 처리한 다음, 바이러스 함유 상청액을 수집하여 이를 1 차 huPBMC를 직접 감염시키는 데 사용했다. 비히클 대조군, N. oleander 추출물 또는 올레안드린은 또한 huPBMC의 배양 배지에 포함되었다. 72 시간 후, 배양 상청액을 수집하고, 생성된 세포 외 바이러스 입자의 상대적인 양을 Anti-HTLV-1 p19Gag ELISA를 수행하여 정량화했다.
데이터(도 17)는 올레안드린과 N. oleander 추출물 양자 모두가 심지어 가장 낮은 농도(10 ㎍/ml)에서도, 비히클 대조군의 상응하는 양에 비해, 처리된 세포의 배양 상청액으로 방출된 새로 합성된 p19Gag 함유 바이러스 입자의 감염성을 억제했음을 나타낸다. 올레안드린과 조 추출물 모두는 바이러스 시냅스의 형성과 시험 관내 HTLV-1의 전파를 억제했다. 올레안드린 처리 HTLV-1 + 림프종 T 세포에 의해 생성된 세포 외 바이러스 입자는 1 차 huPBMC에서 감소된 감염성을 나타낸다. 중요하게도, 올레안드린은 엔벨로프 당 단백질이 성숙한 입자로 통합되는 것을 감소시킴으로써, 엔벨로프된 바이러스에 대한 항 바이러스 활성을 나타내며, 이는 레트로 바이러스 감염주기의 독특한 단계를 나타낸다.
관찰된 항 바이러스 활성이 처리된 huPBMC에 대한 항 바이러스 조성물의 잠재적 세포 독성으로 인한 인공 산물이 아님을 확인하기 위해, 처리된 huPBMC에서, 비히클 음성 대조군과 비교하여, 정제된 올레안드린 및 N. oleander 추출물의 세포 독성을 조사했다(실시 예 21). 1 차 버피-코트(buffy-coat) huPBMC를 분리하고, 식물 적혈구 응집소(phytohemagglutinin)(PHA)로 자극하고, 재조합 인간 인터루킨-2(hIL-2)의 존재하에 배양했다. 이어서, 세포를 증가하는 농도의 올레안드린 또는 N. oleander 추출물 또는 증가하는 부피의 비히클로 72 시간 동안 처리하였다. 이후에 샘플을 아넥신 V-FITC 및 PI로 염색하고, 필드 당 세포 사멸(즉, 아넥신 V-FITC 및/또는 PI-양성) 세포의 상대적 백분율을 공 초점 형광 현미경 검사 및 3 중 계수로(counting in-triplicate) 정량화했다.
비히클 대조군, N. oleander 추출물 및 올레안드린 화합물의 세포 독성 효과는 1 차 huPBMC를 72 시간 동안 처리하여 평가한 다음, 배양물을 아넥신 V-FITC 및 PI로 염색하였다. 세포 사멸(즉, 아넥신 V-FITC 및/또는 PI-양성) 세포의 상대적 백분율을 형광 현미경 검사 및 20x 대물 렌즈를 사용하여 3 중 시야를 계산하여 정량화했다. 총 세포 수는 DIC 위상차 현미경을 사용하여 결정되었다. 시클로포스파미드(50 μM) 처리된 세포는 세포 사멸에 대한 양성 대조군으로 포함되었다. NA는이 샘플의 세포 수가 더 높은 독성으로 인해 정확한 평가를 하기에는 너무 적음을 나타낸다.
데이터(도 18)는 올레안드린이 비히클 대조군과 비교하여, huPBMC에서 중간 정도의 세포 독성(예를 들어, 최저 농도에서 35-37 %)을 나타냈음을 나타낸다. 대조적으로, N. oleander 추출물은 유의하게 세포 독성이었고, 최저 농도에서도 높은 수준의 프로그램된 세포 사멸을 유도했다. huPBMC는 HTLV-1 + SLB1 림프 모세포보다 정제된 올레안드린에 다소 더 민감했다. 그러나, huPBMC는 본원에 기술된 트리테르펜과 같은 다른 세포 독성 화합물도 함유하는 조(crude) N. oleander 추출물에 훨씬 더 민감했다.
또한, 우리는 올레안드린 또는 N. oleander 추출물이 공동 배양 실험에서 huPBMC를 표적으로 하는 HTLV-1 입자의 전달을 방해할 수 있는지 여부를 조사했다(실시 예 22). 이러한 연구를 위해, 바이러스를 생산하는 HTLV-1 + SLB1 T-세포주를 미토마이신 C로 처리한 다음, 증가하는 양의 올레안드린, N. oleander 추출물 또는 비히클 대조군으로 15 분 또는 3 시간 동안 처리했다. SLB1 세포를 무-혈청 배지로 2 회 세척하고, 동등한 수의 huPBMC를 각 웰에 첨가하고, 샘플을 가습 인큐베이터에서 10 % CO2 하의 37℃에서 완전 배지에서 72 시간 동안 공동 배양하였다. HTLV-1의 상대적인 세포 간 전파는 배양 상청액으로 방출되는 세포 외 바이러스의 수준을 측정하기 위해, Anti-HTLV-1 p19Gag ELISA를 수행하여 평가되었다.
1 차 huPBMC는 미토마이신 C-처리된 HTLV-1 + SLB1 림프종 T-세포와 공동 배양되었으며, 이는 비히클 대조군, 또는 증가하는 농도(10㎍/ml, 50 ㎍/ml 및 100 ㎍/ml)의 N. oleander 추출물 또는 올레안드린 화합물로 15 분 또는 3 시간 동안 전처리되었다. 비히클 대조군, 추출물 및 화합물은 또한 공동 배양 배지에 존재했다. 72 시간 후, 상청액을 수집하고 Anti-HTLV-1 p19Gag ELISAs를 수행하여 세포 외 바이러스 입자 방출량을 정량화하였다.
도 19에 도시된 결과는 올레안드린 및 N. oleander 추출물이 비히클 대조군과 비교하여, HTLV-1의 전파를 억제했음을 입증한다; 그러나, HTLV-1 + SLB1 세포의 전처리 15 분과 3 시간 사이에는 차이가 관찰되지 않았다.
또한, 올레안드린이 공동 배양 분석에서 바이러스학적 시냅스-형성 및 HTLV-1의 전파를 억제하는지 여부를 조사했다(실시 예 22). GFP-발현 HTLV-1 + SLB1 T-세포주는 2 주간의 블라스티시딘(5 ㎍/ml; Life Technologies)에 대한 선택으로 SLB1 림프종 T-세포를 pLenti-6.2/V5-DEST-GFP 벡터로 형질 도입하여 생성되었다. GFP-양성 클론을 형광 현미경(도 20 상단 패널) 및 면역 블롯팅(도 20 하단 패널)에 의해 스크리닝하고 확장하고 반복적으로 통과시켰다. 비교를 위해 DIC 위상차 이미지가 제공된다.
비이클 대조군 또는 증가하는 양(10 ㎍/ml, 50 ㎍/ml 및 100 ㎍/ml)의 N. oleander 추출물 또는 올레안드린 화합물로 3 시간 동안 전처리된, huPBMC와 미토마이신 C-처리된 HTLV-1 + SLB1/pLenti-GFP 림프 모세포(녹색 세포) 사이의 바이러스 시냅스 형성은 형광 현미경으로 시각화되었다(도 21). 20x 대물 렌즈(비이클 대조군 패널에서 화살표 참조)를 사용하여 형광 현미경으로 20 개의 시야(n = 20)에서 감염된(즉, HTLV-1 gp21-양성, 적색) huPBMC(GFP-음성)의 상대적 백분율을 정량화하여 바이러스 전파를 평가했다. 형광 현미경 데이터를 정량화했다(도 22). 데이터는 항 바이러스 조성물이 공동 배양 분석에서 바이러스 시냅스 형성 및 HTLV-1의 전파를 억제한다는 것을 확인한다.
따라서, 본 발명은 또한 처리된 세포의 배양 상청액으로 방출되는 HTLV-1 입자의 감염성을 억제(감소)하고, 또한 바이러스학적 시냅스의 Env-의존성 형성을 억제함으로써 HTLV-1의 세포 간 전파를 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 바이러스에 감염된 세포(시험 관내 또는 생체 내)를 유효량의 항 바이러스 조성물로 처리하는 것을 포함한다.
본원의 조성물의 항 바이러스 활성을 리노바이러스(Rhinovirus) 감염에 대해 평가하였다. 리노바이러스는 피코르나비리대(Picornaviridae) 과 및 엔테로바이러스(Enterovirus) 속이다. 이것은 엔벨롭되어 있지 않고,(+) 극성의 ss-RNA 바이러스이다. 올레안드린은 그것이 바이러스 복제를 억제하지 않기 때문에, 본원에 사용된 농도 및 분석에서 리노바이러스에 대해 불활성인 것으로 밝혀졌다.
CoV 감염은 실시 예 26에 상세히 설명된 바와 같이, 생체 내에서 치료될 수 있으며, 여기서 항 바이러스 조성물은 단일 요법 또는 조합 요법으로 대상체에게 투여된다. CoV에 대한 올레안드린의 효능은 실시 예 27에 따라 생체 내에서 확립되었다. 오렌지 주스의 작은 부분에서, 0.25 ml의 재구성된 ANVIRZEL™을 어린이에게 투여했다. 그런 다음, 12 시간마다 약 2-3 일 동안, 0.5ml의 재구성된 ANVIRZEL™을 투여했다. 유아는 COVID-19 감염으로부터 회복되었다.
코로나 바이러스, 예를 들어 SARS-CoV-2(COVID-19)에 대한 올레안드린(올레안드린 함유 조성물)의 효능에 대한 추가 증거는 실시 예 28에 따라 시험 관내 평가를 통해 얻었으며, Vero 세포를 올레안드린으로 전처리 한 후, SARS-CoV-2로 감염시켰다. 세포 감염 후, 세포 외 바이러스 및 올레안드린을 세척하고, 감염된 세포를 올레안드린(도 23a: 0.1 % v/v 수성 DMSO 중 1 ㎍/mL; 도 23c: 0.01 % v/v 수성 DMSO 중 0.1 ㎍/mL) 또는 대조군 비히클로서 수성 DMSO(도 23b: 0.1 % v/v 수성 DMSO; 도 23d: 0.01 % v/v 수성 DMSO)로 처리하였다. 결과는 a) 올레안드린 전처리가 24 시간에 바이러스 부하를 1368 배 감소시켰고 48 시간에 369 배 감소시켰고; b) 올레안드린은 약 0.1 내지 약 1.0 ㎍/mL의 전체 농도 범위에 걸쳐 효과적이며, 높은 투여량이 낮은 투여량보다 약간 더 우수하며, 올레안드린은 심지어 훨씬 낮은 농도, 예를 들어 0.01 내지 0.1 ㎍/mL에서 효과적일 가능성이 매우 높고; c) 단일 투여량으로는 바이러스 복제를 완전히 중단할 수 없기 때문에, 올레안드린을 반복적으로 투여해야 하고; d) 올레안드린과 함께 Vero 세포를 30 분 전 배양하는 것은 초기 바이러스 감염을 줄이는 데 약간 효과적이며, 자손 비리온의 감염성에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 결과는 또한 0.1 및 1.0 ㎍/mL 농도의 올레안드린이 Vero 세포에 과도하게 독성이 없음을 나타낸다. 결과는 올레안드린이 a) 연속적인 약물 치료없이 약 1 log10 만큼; 그리고 b) 연속 약물 치료로 약 >3 log10(독성 없음) 만큼 자손 바이러스의 감염성을 억제함을 추가로 나타낸다.
올레안드린이 바이러스 복제를 직접적으로 억제하는지 여부를 확인하기 위해, Vero-E6 세포를 SARS-CoV-2 바이러스로 감염시키고, 실시 예 29에 따라 다양한 농도의 올레안드린으로 처리하였다. 결과가 도 24a 및 24b에 도시되어 있다. 24 시간 시점에서(도 24a), 흡수 단계 동안만 올레안드린으로 처리된 웰에서(전처리 데이터), 0.625 ㎍/mL의 추정 IC50으로 항 바이러스 활성이 관찰되었다. 분석 기간(기간 데이터) 동안 올레안드린으로 처리된 웰에서, 올레안드린은 다량의 접종 바이러스가 존재하는 경우에도 바이러스 유입 및/또는 바이러스 복제를 상당히 제한했다. 48 시간 시점에서(도 24b), 흡수 단계 동안만 올레안드린으로 처리된 웰(전처리 데이터)에서, 기간이 끝날 때까지 최소한의 항 바이러스 활성이 관찰되었다. 분석 기간(기간 데이터) 동안 올레안드린으로 처리된 웰에서, 올레안드린은 바이러스 감염을 상당히 제한했다. 잠재적인 작용 방법에는 바이러스 복제, 조립 및/또는 유출의 억제가 포함된다.
SARS-CoV-2에 대한 올레안드린의 관찰된 항 바이러스 활성이 Vero-E6 세포에 대한 올레안드린의 세포 독성으로 인한 것이 아님을 확인하기 위해, 24 시간(도 24a) 및 48 시간(도 24b) 시점에 세포 역가를 측정했다. 1.0 ㎍/mL 이상의 올레안드린 농도에서 세포 독성이 나타나고 잠재적으로 분석을 방해했다. 그러나, 올레안드린 농도 0.625㎍/mL 이하에서는 세포 독성의 간섭이 현저히 감소하여, 매우 낮은 농도에서도 올레안드린의 강력한 항 바이러스 활성을 확인할 수 있었다. Vero-E6 세포에 대한 올레안드린의 독성 정도에 대한 추가 증거는 실시 예 30의 분석에서 관찰되었다(도 25). 0.625 ㎍/mL의 올레안드린 농도에서, 약 80 %의 Vero 세포가 24 시간 시점에서 생존할 수 있었으며, 더 낮은 농도에서 더 적은 독성이 관찰되었다. Vero-E6 세포에 대한 올레안드린의 독성은 올레안드린이 인간에게 독성이 있음을 시사하지 않음을 이해해야 한다. 이러한 독성의 측정은 단순히 항 바이러스 활성을 측정할 때, 배경 세포 사멸의 잠재적 영향을 결정하는 데 사용된다.
따라서, 올레안드린은 바이러스 감염, 특히 코로나 바이러스 감염, 예를 들어 SARS-CoV-2 감염을 치료하기 위한 적어도 이중 메커니즘(경로): 즉, a) 바이러스 복제의 직접적인 억제; 및 b) 자손 바이러스의 감염성 감소를 가진다.
더욱이, 올레안드린은 매우 낮은 투여량에서도 항 바이러스 활성을 가지며, 올레안드린은 상당한 예방 효과를 나타낸다. 이것은 VERO CCL-81 세포가 SARS-CoV-2로 감염된 실시 예 31에 따라 입증되었다. 세포는 감염 전에 올레안드린으로 전처리되었다. 감염 후 초기 2 시간 배양 후, 감염된 세포를 세척하여 세포 외 바이러스 및 올레안드린을 제거하였다. 이후 회수된 감염 세포는 다음과 같이 처리하였다. 감염된 세포를 올레안드린(수성 성분으로서 RPMI 1640 배양 배지를 갖는 수성 DMSO에서의 다양한 농도) 또는 단지 대조군 비히클(RPMI 164를 갖는 수성 DMSO)으로 처리하고, "처리(treatment)" 후, 24 시간(도 26a) 및 48 시간(도 26b)에 바이러스 역가를 측정하였다. 올레안드린이 없는 경우, SARS-CoV-2는 24 시간 시점까지 높은 역가(약 6 log10 플라크 형성 단위(pfu)/ml)에 도달했으며, 이후 시점에서 역가를 유지했다: 분석을 위한 검출 한계 또는 그 아래로 일관되게 유지되었다. 1 ㎍/mL 내지 0.05 ㎍/mL의 올레안드린 농도는 단 24 시간 만에 바이러스 역가를 상당히 감소시켰다. 2 개의 더 높은 투여량은 바이러스 역가를 본질적으로 검출 한계 이하로 감소시켰으며, 시험된 올레안드린 농도 중 어느 것에서도 세포 독성이 관찰되지 않았다. 이들 샘플에 대해 바이러스 역가의 배수 감소(fold reduction)를 계산하였다. 바이러스 역가의 배수 감소(도 26c 및 26d)는 48 시간 시점에서 약 1,000 배 내지 약 40,000 배 범위였고, 24 시간 시점에서 약 1,000 배 내지 약 20,000 배 관찰되었다. 비록 감염 후 24 시간에 DMSO 대조군에 비해 유의한 효과가 없었던 10ng/ml 투여량은 감염 후 48 시간에 역가를 현저히 감소시켰다. 중요한 것은 올레안드린으로 인한 감소가 24 시간에 비해 48 시간에서 측정했을 때 최고 농도에서 증가했다는 것이다. 시간 경과에 따른 올레안드린의 증가된 예방 효능(24 시간 대 48 시간)은 그것의 EC50 값에 반영되었는데, 이는 감염 후 24 시간에 11.98ng/ml로 계산되었고, 감염 후 48 시간에 7.07ng/ml로 계산되었다.
상기 기재된 Vero 81 세포는 SARS-CoV-2의 억제가 전체 또는 감염성 입자 생성 수준에 있는지를 결정하는 게놈 분석을 받았다. 예방 연구의 세포 배양 상청액으로부터 RNA를 추출하고, qRT-PCR을 통해 게놈 등가물을 정량화하였다(실시 예 39). 처음에 감염성 분석을 통해 관찰된 올레안드린의 예방 효과는 게놈 등가물 수준에서 확인되었다. 감염 후 24 시간에, 올레안드린은 4 회 최고 투여량에서 상청액에서 SARS-CoV-2 게놈을 현저하게 감소시켰다. 처음에 감염성 분석을 통해 관찰 된 올레안드린의 예방 효과는 게놈 등가물 수준에서 확인되었다. 감염 후 24 시간에, 올레안드린은 4 회 최고 투여량에서 상청액에서 SARS-CoV-2 게놈을 현저하게 감소시켰다.
감염 후 24 시간 및 48 시간에, 올레안드린(도 27a-27b)에 대한 COVID-19 감염의 용량 반응을 결정하기 위해 추가 연구를 수행하였다. 용량 반응이 관찰되었으며, 배양 배지에서 올레안드린의 농도를 증가시키면, 바이러스 역가가 더 많이 감소했으며; 그러나 시험된 최저 농도(0.05 ㎍/mL)에서도, 24 시간에 역가가 감소하였고, 감염 후 48 시간에 역가가 훨씬 더 감소했다. 최고 용량은 감염성 SARS-CoV-2 역가를 1,000 배 이상 감소시켰으며, 0.5 ㎍/ml 및 100 ng/ml 용량은 100 배 이상의 감소를 유발하였고, 50ng/ml 용량은 78 배 감소를 유발하였다.
도 28a 및 28b는 배양 배지에서 다양한 농도(0.005 내지 1 ㎍/mL)의 올레안드린을 사용한 치료에 대한 COVID-19의 용량-반응을 결정하기 위해 각각 3 회씩 수행된 중복 연구의 결과를 도시한다. 0.01 ㎍/mL 이상의 농도에 대하여 Vero 81 세포에서 감염 후 24 시간 및 48 시간에도 상당한 항 바이러스 활성이 관찰되었다. 0.05 ㎍/mL의 매우 낮은 농도에서도 바이러스 역가의 큰 감소가 관찰되었다.
감염 후 올레안드린의 항 바이러스 효능을 결정하기 위해 실시 예 34에 따른 연구를 수행하였다. Vero 81 세포는 감염 전에 올레안드린으로 전처리되지 않았다. 대신, 세포를 COVID-19 바이러스로 감염시킨 다음, 감염 후 12 시간 및 24 시간에 올레안드린(지시된 농도에서)으로 처리했다. 이어서, 바이러스 역가를 감염 후 24 시간(도 29a) 및 48 시간(도 29b)에 측정하였다. 데이터는 단일 치료로도 올레안드린이 감염 후 최소 12 시간, 최소 24 시간 또는 최소 36 시간 동안 항 바이러스 활성을 발휘할 수 있음을 보여준다. 이러한 분석은 인간 바이러스 감염에 비해 시간 압축 분석이라는 점에 유의하는 것이 중요하다. 24 시간 시점은 인간의 감염 후 약 5 내지 7 일에 해당하고, 48 시간 시점은 인간의 감염 후 약 10 내지 14 일에 해당한다.
이중 추출물 조합 조성물(PBI-A, DMSO(98 % wt)에 용해된 실시 예 36의 에탄올 추출물 1% wt의 1% wt를 함유하는 PBI-A)을 사용하여 실시 예 31 및 34의 분석을 반복하였다. 도 30a는 실시 예 31의 분석에 따른 이중 추출물 조합 조성물의 평가 결과를 상세하게 설명한다. 도 30b는 실시 예 34의 분석에 따른 이중 추출물(1 % wt)의 평가에 대한 결과를 상세히 설명한다. 도 30a는 원래 스톡 용액의 상대적 희석에 기초한 PBI-A의 상대적 항 바이러스(항-COVID-19) 효능을 입증한다. 도 30b의 데이터는 분석 용액에서 올레안드린의 상대적 농도(㎍/mL)를 기초로 한다. 각 그래프의 점선은 CFU(바이러스 콜로니 형성 단위) 분석을 사용하여 검출할 수 있는 바이러스의 최저 농도를 나타낸다.
도 30a 및 30b의 결과에 기초하여. 이중 추출물 조합 조성물은 순수 올레안드린에서 관찰된 것과 동일한 범위인 0.05 내지 1.0 ㎍/ml의 농도에서 COVID-19에 대한 항 바이러스제로서 효과적이다.
분석에서 평가된 올레안드린의 농도가 투여량 및 혈장 농도 측면에서 임상 적으로 관련이 있음을 관찰하는 것도 중요하다.
올레안드린-함유 조성물의 안전성에 대한 증거는 상기 세포를 상이한 농도의 올레안드린을 함유하는 용액에 노출시킨 후, 락테이트 탈수소 효소의 방출을 결정하기 위한 시험 관내 세포 분석에 의해 추가로 제공되었다. 1 ㎍/mL의 농도까지, 대조군 비히클에 비해 추가적인 독성이 없는 것으로 확인되었다.
COVID-19 바이러스 감염 치료에 있어서 올레안드린(올레안드린 함유 조성물, 올레안드린 함유 추출물)의 효능은 올레안드린 함유 설하 제형(실시 예 32 또는 37)를 FDA의 확장된 접근 프로그램 하에서 실시 예 35에 따라 대상체에게 투여함으로써 추가로 확립되었다. 18 세에서 78 세 사이의 대상체들에게 약 6 시간 간격으로 매일 15 ㎍ 용량의 올레안드린(이중 추출물 조성물로서)을 4 회 투여하거나, 또는 약 8 시간 간격으로 매일 15mg 용량을 3 회 투여하였다. 치료를 시작하기 전에, 대상체의 임상 상태 및/또는 바이러스 역가를 관찰했다. 일부 대상체는 완화 치료 또는 호스피스 치료를 받았다. 임상 상태 및/또는 바이러스 역가는 1 내지 2 주, 10 내지 14 일의 치료 기간 동안 주기적으로 결정되었다. 치료 개시 후 다음과 같은 결과가 관찰되었다.
Figure 112020098766406-pct00002
FDA의 확장된 접근 프로그램하에 추가적인 생체 내 연구가 다른 수준의 COVID-19 관련 증상을 나타내는 두 번째 그룹의 인간 대상체에서 수행되었다. 치료를 시작하기 전에, 대상체의 임상 상태 및/또는 바이러스 역가를 결정하여, COVID-19 감염을 확인했다. 일부 대상체는 중등도에서 중증의 증상을 보였다. 연령대의 대상체에게 약 6 시간 간격으로 하루에 4 회 15㎍ 용량의 올레안드린(이중 추출물 조성물로서)을 투여했다. 임상 상태 및/또는 바이러스 역가는 1 내지 2 주, 10 내지 14 일의 치료 기간 동안 주기적으로 결정되었다. 모든 대상체는 치료 시작 후 5 내지 12 일 이내에 COVID-19 감염으로부터 완전히 회복되었다.
올레안드린은 또한 강력한 항 염증 반응을 생성하는 것으로 나타났으며, 이는 SARS-CoV-2 감염에 대한 과염 증 반응을 예방하는 데 도움이 될 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 감염을 앓고 있는 대상체에게 복수 투여량의 강심 배당체(강심 배당체 함유 조성물 또는 강심 배당체 함유 추출물)를 투여하는 것을 포함하는, COVID-19 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 복수 투여량은 주당 2 일 이상, 선택적으로 한 달에 1 주 이상, 추가로 선택적으로 1 년에 1 개월 이상 동안, 하루에 하나 이상의 투여량으로 나눌 수 있다. 바람직한 강심 배당체는 올레안드린이다.
따라서, 본 발명은 코로나 바이러스 감염, 특히 인간에게 병원성인 코로나 바이러스, 예를 들어 SARS-CoV-2 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 감염을 갖는 대상체에게 치료적 유효량의 강심 배당체(강심 배당체 함유 조성물)를 만성적으로 투여하는 것을 포함한다. 만성 투여는 강심 배당체(강심 배당체 함유 조성물)의 하나 이상의 (복수의) 치료 유효 용량을 반복적으로 투여함으로써 달성될 수 있다. 1 회 이상의 용량은 1 주일에 1 일 이상, 선택적으로 한 달에 1 주 이상, 선택적으로 1 년에 1 개월 이상 동안, 매일 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명은 바이러스, 필요로 하는 대상체(특히 인간 대상체)에서 바이러스, 예를 들어 CoV 감염을 치료하는 방법을 제공하고, 이는 a) 올레안드린을 포함하는 하나 이상의 용량의 항 바이러스 조성물; 또는 b) 올레안드린 및 네리움 종으로부터 추출된 하나 이상의 다른 화합물을 포함하는 하나 이상의 투여량의 항 바이러스 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 올레안드린은 네리움 종의 추출물의 일부로 존재할 수 있으며, 추출물은 a) 초 임계 유체 추출물; b) 열수 추출물; c) 유기 용매 추출물; d) 수성 유기 용매 추출물; e) 선택적으로 하나 이상의 유기 용매(추출 개질제)와 함께 초 임계 유체를 사용하는 추출물; f) 선택적으로 적어도 하나의 유기 용매(추출 개질제)와 함께 임계 미만 액체를 사용하는 추출물 또는 g) 임의의 둘 이상의 상기 추출물의 임의의 조합일 수 있다.
PBI-05204(본 명세서 및 2012 년 5 월 29 일 발행된 Addington의 US 8187644 B2에서, 2008 년 7 월 22 일 발행된 Addington의 US 7402325 B2에서, 2013 년 5 월 12 일 발행된 Addington et al의 US 8394434 B2에 기재되며, 이들 전체 개시 내용은 본원에 참조로 포함됨)은 주요 약리학적 활성 성분으로서 강심 배당체(올레안드린, OL) 및 트리테르펜(올레아놀산(OA), 우르솔산(UA) 및 베툴린산(BA))을 포함한다. 총 트리테르펜에 대한 OL의 몰비는 약 1:(10-96)이다. OA:UA:BA의 몰비는 약 7.8:7.4:1이다. PBI-05204에서 OA, UA 및 BA의 조합은 OL 등몰 기준으로 비교할 때 올레안드린의 항 바이러스 활성을 증가시킨다. PBI-04711은 PBI-05204의 일부이지만, 강심 배당체(OL)를 함유하지 않는다. PBI-04711에서 OA:UA:BA의 몰비는 약 3:2.2:1이다. PBI-04711은 또한 항 바이러스 활성을 갖는다. 따라서, OL, OA, UA 및 BA를 포함하는 항 바이러스 조성물은 OL의 등몰 함량에 기초하여 유일한 활성 성분으로서 OL을 포함하는 조성물보다 효과적이다. 일부 실시 예에서, 개별 트리테르펜 대 올레안드린의 몰비는 하기와 같이 범위 설정된다: 약 2-8(OA): 약 2-8(UA): 약 0.1-1(BA): 약 0.5-1.5(OL); 또는 약 3-6(OA): 약 3-6(UA): 약 0.3-8(BA): 약 0.7-1.2(OL); 또는 약 4-5(OA): 약 4-5(UA): 약 0.4-0.7(BA): 약 0.9-1.1(OL); 또는 약 4.6(OA): 약 4.4(UA): 약 0.6(BA): 약 1(OL).
유일한 항 바이러스제로서 올레안드린을 포함하는 항 바이러스 조성물은 본 발명의 범위 내에 있다. 유일한 항 바이러스제로서 디곡신을 포함하는 항 바이러스 조성물은 본 발명의 범위 내에 있다.
항 바이러스제로서 올레안드린 및 복수의 트리테르펜을 포함하는 항 바이러스 조성물은 본 발명의 범위 내에 있다. 일부 실시 예에서, 항 바이러스 조성물은 올레안드린, 올레아놀산(이의 유리 산, 염, 유도체 또는 프로드러그), 우르솔산(이의 유리 산, 염, 유도체 또는 프로드러그) 및 베툴린산(유리 산, 염, 유도체 또는 프로드러그)을 포함한다. 화합물의 몰비는 본원에 기재된 바와 같다.
주요 활성 성분으로서 복수의 트리테르펜을 포함하는 항 바이러스 조성물(이는 스테로이드, 강심 배당체 및 약리학적 활성 성분을 배제하는 것을 의미함)도 본 발명의 범위 내에 있다. 상기한 바와 같이, PBI 04711은 주요 활성 성분으로서 OA, UA 및 BA를 포함하고, 항 바이러스 활성을 나타낸다. 일부 실시 예에서, 트리테르펜-기반 항 바이러스 조성물은 OA, UA 및 BA를 포함하고, 이들 각각은 유리 산 형태, 염 형태, 중수소화 형태 및 유도체 형태로부터 각각의 경우 독립적으로 선택된다.
PBI-01011은 OA, UA 및 BA를 포함하는 개량된 트리테르펜-기반 항 바이러스 조성물이며, 여기서 OA:UA:BA의 몰비는 약 9-12:최대 약 2:최대 약 2, 또는 약 10:약 1: 약 1, 또는 약 9-12:약 0.1-2:약 0.1-2, 또는 약 9-11:약 0.5-1.5:약 0.5-1.5, 또는 약 9.5-10.5:약 0.75-1.25:약 0.75-1.25, 또는 약 9.5-10.5:약 0.8-1.2:약 0.8-1.2, 또는 약 9.75-10.5:약 0.9-1.1:약 0.9-1.1이다.
일부 실시 예에서, 항 바이러스 조성물은 본 명세서에 설명된 바와 같이 OA 대 UA의 몰비로 존재하는 올레아놀산(이의 유리 산, 염, 유도체 또는 프로드러그) 및 우르솔산(이의 유리 산, 염, 유도체 또는 프로드러그)을 적어도 포함한다. OA는 UA보다 많은 몰량으로 존재한다.
일부 실시 예에서, 항 바이러스 조성물은 본 명세서에 설명된 바와 같이 OA 대 BA의 몰비로 존재하는 올레아놀산(이의 유리 산, 염, 유도체 또는 프로드러그) 및 베툴린산(이의 유리 산, 염, 유도체 또는 프로드러그)을 적어도 포함한다. OA는 BA보다 많은 몰량으로 존재한다.
일부 실시 예에서, 항 바이러스 조성물은 본 명세서에 설명된 바와 같이 OA 대 UA 대 BA의 몰비로 존재하는 올레아놀산(이의 유리 산, 염, 유도체 또는 프로드러그), 우르솔산(이의 유리 산, 염, 유도체 또는 프로드러그) 및 베툴린산(이의 유리 산, 염, 유도체 또는 프로드러그)를 적어도 포함한다. OA는 UA 및 BA 모두보다 많은 몰량으로 존재한다.
일부 실시 예에서, 트리테르펜-기반 항 바이러스 조성물은 강심 배당체를 배제한다.
일반적으로, 아레나비리대 감염, 아르테르비리대 감염, 필로비리대 감염, 플라비비리대 감염(플라비바이러스 속), 델타레트로바이러스 속, 코로나비리대, 파라믹소비리대, 오르토믹소비리대, 또는 토가비리대 감염이 있는 대상체는 다음과 같이 치료된다. 대상체는 상기 대상체가 상기 바이러스에 감염되었는지를 결정하기 위해 평가된다. 항 바이러스 조성물의 투여가 지시된다. 항 바이러스 조성물의 초기 투여량은 일정 기간(치료 기간) 동안 처방된 투여 요법에 따라 대상체에게 투여된다. 대상체의 임상 반응 및 치료 반응 수준은 주기적으로 결정된다. 한번의 투여량에서 치료 반응 수준이 너무 낮으면, 대상체에서 원하는 치료 반응 수준이 달성될 때까지 미리 결정된 투여량 증량 스케쥴에 따라 투여량이 증가된다. 항 바이러스 조성물에 의한 대상체의 치료는 필요에 따라 계속된다. 투여량 또는 투여 요법은 환자가 감염 자체의 중단, 감염 관련 증상의 감소 및/또는 감염의 진행의 감소와 같은 원하는 임상 종점(들)에 도달할 때까지 필요에 따라 조정될 수 있다.
임상의가 항 바이러스 조성물 및 하나 이상의 다른 치료제의 조합으로 바이러스 감염된 대상체를 치료하려는 경우, 대상체가 갖는 바이러스 감염은 상기 하나 이상의 다른 치료제에 적어도 부분적으로 치료적으로 반응하는 것으로 알려져있다. 그 다음, 본 발명의 방법은 치료적 관련 투여량의 항 바이러스 조성물 및 치료적 관련 투여량의 상기 하나 이상의 다른 치료제를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 항 바이러스 조성물은 제 1 투여 요법에 따라 투여되고, 하나 이상의 다른 치료제는 제 2 투여 요법에 따라 투여된다. 일부 실시 예에서, 제 1 및 제 2 투약 요법은 동일하다. 일부 실시 예에서, 제 1 및 제 2 투약 요법은 상이하다.
본 발명의 항 바이러스 조성물(들)은 주요 항 바이러스 요법, 보조 항 바이러스 요법 또는 공동-항 바이러스 요법으로서 투여될 수 있다. 본 발명의 방법은 하나 이상의 다른 알려진 항 바이러스 조성물과 함께 항 바이러스 조성물을 개별적으로 또는 공동으로 투여하는 것을 포함하는데, 이는 본 발명의 항 바이러스 조성물이 공지된 항 바이러스 조성물(화합물) 또는 바이러스 감염과 관련된 증상을 치료하기 위한 조성물의 투여 전, 투여 동안 또는 투여 후에 투여될 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 염증, 구토, 구역, 두통, 열, 설사, 메스꺼움, 두드러기, 결막염, 불쾌감, 근육통, 관절통, 발작 또는 마비를 치료하는데 사용되는 약물이 본 발명의 항 바이러스 조성물과 함께 또는 별도로 투여될 수 있다. .
하나 이상의 다른 치료제는 치료학적으로 유효한 것으로 임상의가 인식하는 투여량 또는 투약 요법에 따라, 또는 서브-치료적으로 효과적인 것으로 임상의가 인식하는 투여량으로 투여될 수 있다. 항 바이러스 조성물 및 하나 이상의 다른 치료제의 조합의 투여에 의해 제공된 임상적 이점 및/또는 치료 효과는 부가적인 또는 상승적일 수 있으며, 이러한 수준의 이점 또는 효과는 조합물의 투여와 개별 항 바이러스 조성물 및 하나 이상의 다른 치료제의 투여의 비교에 의해 결정된다. 하나 이상의 다른 치료제는 미국 식품의약국(FDA), 세계 보건기구, 유럽 의약청(E.M.E.A.), 치료 상품 관리국(TGA, 호주), 범 미국 건강 기구(PAHO), 의약품 및 의료 기기 안전 기관(Medsafe, 뉴질랜드) 또는 전세계 다양한 보건부에 의해 제안되거나 기술된 투여량 및 투약 요법에 따라 투여될 수 있다.
바이러스 감염의 치료를 위해 본 발명의 항 바이러스 조성물에 포함될 수 있는 예시적인 다른 치료제는 항 레트로바이러스제, 인터페론 알파(IFN-a), 지도부딘, 라미부딘, 사이클로스포린 A, 삼산화비소가 포함된 CHOP, 소듐 발프로에이트, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 하나 이상의 증상 완화 약물, 스테로이드 절약(sparing) 약물, 코르티코스테로이드, 사이클로포스파미드, 면역억제제, 항염증제, 야누스 키나제 억제제, 토파시티닙, 칼시뉴린 억제제, 타크로리무스, mTOR 억제제, 시롤리무스, 에베로리무스, IMDH 억제제, 아자티오프린(azathioprine), 레플로노미드(leflunomide), 미코페노레이트(mycophenolate), 생물제제, 아바타셉(abatacept), 아달리무맙(adalimumab), 아나킨라(anakinra), 세르톨리주맙(certolizumab), 에타네르셉(etanercept), 골리무맙(golimumab), 인플릭시맙(infliximab), 익세케지맙(ixekizumab), 나탈리주맙(natalizumab), 리툭시맙(rituximab, 세쿠키누맙(secukinumab), 토실리주맙(tocilizumab), 우스테키누맙(ustekinumab), 베돌리주맙(vedolizumab), 단클론 항체, 바실릭시맙(basiliximab), 다클리주맙(daclizumab), 다클론 항체, 뉴클레오시드 유사체, 역전사 효소 억제제, 엠트리시타빈, 텔비부딘, 아바카비르, 아데포비르, 디다노신, 엠트리시타빈, 엔테카비르, 스타부딘, 테노포비르, 아지트로마이신, 마크로라이드-형 항생제, 프로테아제 억제제, 인터페론, 면역 반응 조절제, mRNA 합성 억제제, 단백질 합성, 억제제, 티아졸리드, CYP3A4 억제제, 헤테로시클릭 비구아니딘, CCR5 수용체 억제제 및 이들의 조합을 포함한다. 연구된 치료법에는 혈장 분리 및/또는 방사선도 포함된다. 특정 바이러스에 대한 항체는 또한 본 발명의 항 바이러스 조성물로 치료된 대상체에게 투여될 수 있다. 제 1 바이러스 감염의 생존자의 혈액으로부터 수득된 혈장은 동일한 유형의 바이러스 감염을 갖는 다른 대상체에게 투여될 수 있으며, 상기 다른 대상체는 또한 본 발명의 항 바이러스 조성물을 투여받을 수 있다. 예를 들어, COVID-19 감염 생존자로부터의 혈장은 COVID-19 감염을 앓고 있는 다른 대상체에게 투여될 수 있으며, 상기 다른 대상체는 또한 본 발명의 항 바이러스 조성물을 투여받을 수 있다.
실시 예 5는 포유동물에서 지카바이러스 감염의 치료를 위한 예시적인 절차를 제공한다. 실시 예 12는 포유동물에서 필로바이러스 감염(에볼라바이러스, 마르부르그바이러스)의 치료를 위한 예시적인 절차를 제공한다. 실시 예 13은 포유동물에서 플라비바이러스 감염(황열, 뎅기열, 일본 뇌염, 웨스트 나일 바이러스, 지카바이러스, 진드기성 뇌염, 캬사누르 삼림병, 알크후르마 질병, 옴스크 출혈열, 포와산 바이러스 감염)의 치료를 위한 예시적인 절차를 제공한다. 실시 예 25는 델타레트로바이러스 속(HTLV-1) 감염의 치료를 위한 예시적인 절차를 제공한다.
약제학적 조성물에 존재하는 항 바이러스 화합물(트리테르펜(들), 강심 배당체(들) 등)은 변형되지 않은 형태, 염 형태, 유도체 형태 또는 이들의 조합으로 존재할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "유도체"는 a) 제 1 화학 물질과 구조적으로 관련되고 이론적으로 이로부터 유래되는 화학 물질; b) 제 1 화합물의 하나의 원자가 다른 원자 또는 원자 그룹으로 대체되는 경우, 유사한 제 1 화합물 또는 다른 제 1 화합물로부터 발생하는 것으로 상상될 수 있는 화합물로 형성된 화합물; c) 모 화합물로부터 유도되고 모 화합물의 필수 원소를 함유하는 화합물; 또는 d) 하나 이상의 단계에서 유사한 구조의 제 1 화합물로부터 생성될 수 있는 화합물을 의미한다. 예를 들어, 유도체는 중수소화 형태, 산화 형태, 탈수화, 불포화, 중합체 공액 또는 글리코실화 형태를 포함하거나 에스테르, 아미드, 락톤, 상동체, 에테르, 티오에테르, 시아노, 아미노, 알킬아미노, 설프히드릴, 헤테로시클릭, 헤테로시클릭 고리-융합, 중합, 페길화, 벤질리데닐, 트리아졸릴, 피페라지닐 또는 이의 중수소화 형태를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "올레안드린"은 달리 명시되지 않는 한 모든 공지된 형태의 올레안드린을 의미하는 것으로 간주된다. 올레안드린은 라세믹, 광학적으로 순수한 또는 광학적으로 풍부한 형태로 존재할 수 있다. 네리움 올리앤더 식물 재료는 예를 들어, 텍사스 아타스코사 소재의 알드리지 너서리(Aldridge Nursery)와 같은 상업적인 식물 공급 업체로부터 얻을 수 있다.
초임계 유체(SCF) 추출물은 US 7,402,325, US 8394434, US 8187644 또는 PCT 국제 공개 번호 WP 2007/016176 A2에 상세히 기술된 바와 같이 제조될 수 있으며, 이의 전체 개시 내용은 본원에 참고로 포함된다. 에탄올과 같은 개질제(유기 용매)의 존재 또는 부재하에서, 초임계 이산화탄소로 추출을 수행할 수 있다.
강심 배당체, 특히 올레안드린을 함유하는 다른 추출물은 다양한 상이한 공정에 의해 제조될 수 있다. 열탕 추출물의 제조 절차를 기술하고 있는 Huseyin Ziya Ozel 박사(미국 특허 번호 5,135,745)에 의해 개발된 공정에 따라 추출물을 제조할 수 있다. 수성 추출물은 2KD 내지 30KD의 분자량을 갖는 몇 가지 다당류, 올레안드린 및 올레안드리게닌, 오도로사이드 및 네리탈로사이드를 함유하는 것으로 보고되어 있다. 다당류는 산성 호모폴리갈락투로난 또는 아라비노갈락투로난을 포함하는 것으로 알려져있다. Selvaraj et al의 미국 특허 제 5,869,060 호는 네리움 종의 열탕 추출물 및 그의 제조 방법, 예를 들어 실시 예 2를 개시한다. 이어서, 생성된 추출물을 동결 건조시켜 분말을 제조할 수 있다. 미국 특허 제 6,565,897 호(Selvaraj et al.의 미국 특허 공개 제 20020114852 호 및 PCT 국제 공개 제 WO 2000/016793 호)는 실질적으로 멸균된 추출물의 제조를 위한 열탕 추출 공정을 개시하고 있다. Erdemoglu et al.(J. Ethnopharmacol.(2003) Nov. 89(1), 123-129)는 항-통각 및 항-염증 활성에 기초하여 네리움 올리앤더를 포함한 식물의 수성 및 에탄올 추출물의 비교 결과를 개시하고 있다. 네리움 올리앤더의 유기 용매 추출물은 Adome et al.(Afr. Health Sci.(2003) Aug. 3(2), 77-86; 에탄올 추출물), el-Shazly et al.(J. Egypt Soc. Parasitol.(1996), Aug. 26(2), 461-473; 에탄올 추출물), Begum et al.(Phytochemistry(1999) Feb. 50(3), 435-438; 메탄올 추출물), Zia et al.(J. Ethnolpharmacol.(1995) Nov. 49(1), 33-39; 메탄올 추출물) 및 Vlasenko et al.(Farmatsiia.(1972) Sept.-Oct. 21(5), 46-47; 알콜성 추출물)에 의해 개시된다. Singh et al.의 미국 특허 출원 공개 제 20040247660 호는 암 치료에 사용하기 위한 올레안드린의 단백질 안정화 리포좀 제형의 제조를 개시한다. Singh et al.의 미국 특허 출원 공개 제 20050026849 호는 사이클로덱스트린을 함유하는 올레안드린의 수용성 제형을 개시한다. Singh et al.의 미국 특허 출원 공개 제 20040082521 호는 열탕 추출물로부터 올레안드린의 단백질 안정화 나노 입자 제형의 제조를 개시한다.
올레안드린은 또한 아그로박테리움 투메파시엔스-변형 칼리(Agrobacterium tumefaciens-transformed calli)(Ibrahim et al., "Stimulation of oleandrin production by combination Agrobacterium tumefaciens mediated transformation and fungal elicitation in Nerium oleander cell cultures"in Enz. Microbial Techno (2007), 41(3), 331-336, 전체 개시 내용이 여기에 참조로 포함됨)로부터 유도된 현탁액 배양물로부터 얻을 수 있다. 열수, 유기 용매, 수성 유기 용매, 또는 아그로박테리움의 초 임계 유체 추출물이 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
올레안드린은 또한 시험 관내 네리움 올리앤더 미량 배양의 추출물로부터 얻을 수 있으며, 이에 의해 싹 배양은 묘목 및/또는 네리움 올링앤더 품종 스플렌덴스 기간티움(Splendens Giganteum), 레반체(Revanche) 또는 알사스(Alsace), 또는 기타 품종의 싹 정점으로부터 시작될 수 있다(Vila et al ., "Micropropagation of Oleander(Nerium oleander L.)" in HortScience(2010), 45(1), 98-102, 이의 전체 내용은 여기에 참조로 포함됨). 열수, 유기 용매, 수성 유기 용매, 또는 미량 배양 네리움 올리앤더의 초 임계 유체 추출물이 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
추출물은 또한 그들의 다당류 및 탄수화물 함량에서 상이하다. 열탕 추출물은 글루코스로 제조된 표준 곡선에 비해 407.3 글루코스 당량의 탄수화물을 함유하는 한편, SCF CO2 추출물의 분석은 정량 한계 미만인 매우 낮은 수준에서 발견된 탄수화물 수준을 발견하였다. 그러나, 네리움 올리앤더의 열탕 추출물에서의 탄수화물의 양은 SCF CO2 추출물에서의 그것보다 적어도 100 배 이상 더 많았다. SCF 추출물의 다당류 함량은 0 %, <0.5 %, <0.1 %, <0.05 % 또는 <0.01 % 중량일 수 있다. 일부 실시 예에서, SCF 추출물은 식물 덩어리(mass)의 추출 동안 수득된 다당류를 배제한다.
Figure 112020098766406-pct00003
SCF CO2 추출물 및 열탕 추출물의 부분 조성은 JEOL AccuTOF-DART 질량 분석기(JEOL USA, Peabody, MA, USA)에서 DART TOF-MS(비행시간 질량 분광계 실시간 직접 분석)에 의해 결정되었다.
네리움 종 또는 테베티아(Thevetia) 종의 SCF 추출물은 약리학적 활성 화합물, 예컨대 올레안드린 및 트리테르펜의 혼합물이다. SCF 공정에 의해 수득된 추출물은 주위 온도에서 실질적으로 물-불용성인 점성 반고체(용매를 제거한 후)이다. SCF 추출물은 다양한 상이한 범위의 물 용해도를 갖는 많은 상이한 성분을 포함한다. 초임계 유체 공정으로부터의 추출물은 0.9 내지 2.5 중량 %의 올레안드린 또는 1.7 내지 2.1 중량 %의 올레안드린 또는 1.7 내지 2.0 중량 %의 올레안드린을 이론적으로 함유한다. 다양한 양의 올레안드린을 포함하는 SCF 추출물이 얻어졌다. 일 실시 예에서, SCF 추출물은 약 2 중량 %의 올레안드린을 포함한다. SCF 추출물은 열탕 추출물보다 3-10 배 더 높은 농도의 올레안드린을 함유한다. 이는 HPLC 및 LC/MS/MS(탠덤 질량 분석) 분석에 의해 확인되었다.
SCF 추출물은 올레안드린 및 트리테르펜 올레아놀산, 베툴린산 및 우르솔산 및 본원에 기재된 다른 성분을 포함한다. 올레안드린 및 트리테르펜의 함량은 배치마다 다를 수 있지만; 그 변동 정도는 과도하지 않다. 예를 들어, SCF 추출물(PBI-05204)의 배치를 이들 4 가지 성분에 대해 분석하였고, 다음과 같은 각각의 대략적인 양을 함유하는 것으로 밝혀졌다.
Figure 112020098766406-pct00004
개별 성분의 함량은 지시된 값에 비해 ± 25 %, ± 20 %, ± 15 %, ± 10 % 또는 ± 5 %만큼 변할 수 있다. 따라서, SCF 추출물에서의 올레안드린의 함량은 SCF 추출물 mg 당 20mg ± 5mg(이는 20mg의 ± 25 %임)의 범위내에 있을 것이다.
올레안드린, 올레아놀산, 우르솔산, 베툴린산 및 이들의 유도체는 또한 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich(www.sigmaaldrich.com; St. Louis, MO, USA))로부터 구매할 수 있다. 디곡신은 HIKMA Pharmaceuticals International LTD(NDA N012648, elixir, 0.05mg/mL; 정제, 0.125mg, 0.25mg), VistaPharm Inc.(NDA A213000, elixir, 0.05mg/mL), Sandoz Inc.(NDA A040481), 주사 가능, 0.25 mg/mL), West-Ward Pharmaceuticals International LTD(NDA A083391, 주사 가능, 0.25 mg/mL), Covis Pharma BV(NDA N009330, 0.1 mg/mL, 0.25 mg/mL), Impax Laboratories(NDA A078556 , 정제, 0.125 mg, 0.25 mg), Jerome Stevens Pharmaceuticals Inc.(NDA A076268, 정제, 0.125 mg, 0.25 mg), Mylan Pharmaceuticals Inc.(NDA A040282, 정제, 0.125 mg, 0.25 mg), Sun Pharmaceutical Industries Inc.(NDA A076363, 정제, 0.125 mg, 0.25 mg), Concordia Pharmaceuticals Inc.(NDA A020405, 정제, 0.0625, 0.125 mg, 0.1875 mg, 0.25 mg, 0.375 mg, 0.5 mg, LANOXIN), GlaxoSmithKline LLC(NDA 018118, 캡슐 , 0.05 mg, 0.1 mg, 0.15 mg, 0.2 mg, LANOXICAPS)로부터 상업적으로 이용가능하다.
본원에 사용된 바와 같이, 개별적으로 명명된 트리테르펜은 각각의 경우에 그들의 천연(변형되지 않은, 유리 산) 형태, 염 형태, 유도체 형태, 프로드러그 형태 또는 이들의 조합에서 독립적으로 선택될 수 있다. 중수소화 형태의 트리테르펜을 함유하는 조성물 및 방법도 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
올레아놀산 유도체, 프로드러그 및 염은 2015 년 1 월 8 일에 공개된 Gribble et al.의 US 20150011627 A1, 2014 년 11 월 20 일에 공개된 Rong et al.의 US 20140343108 A1, 2014 년 11 월 20 일에 공개된 Xu et al.의 US 20140343064 A1, 2014 년 6 월 26 일에 공개된 Anderson et al.의 US 20140179928 A1, 2014 년 4 월 10 일에 공개된 Bender et al.의 US20140100227 A1, 2014 년 3 월 27 일에 공개된 Jiang et al.의 US 20140088188 A1, 2014 년 3 월 27 일에 공개된 Jiang et al.의 US 20140088163 A1, 2014년 3월 6일에 공개된 Jiang et al.의 US 20140066408 A1, 2013 년 11 월 28 일에 공개된 Anderson et al.의 US 20130317007 A1, 2013 년 11 월 14 일에 공개된 Gribble et al.의 US20130303607 A1, 2012 년 9 월 27 일에 공개된 Anderson et al.의 US 20120245374, 2012년 9월 20일에 공개된 Jiang et al.의 US 20120238767 A1, 2012년 9월 20일에 공개된 Shode et al.의 US 20120237629 A1, 2012년 8월 23일에 공개된 Anderson et al.의 US 20120214814 A1, 2012 년 6 월 28 일에 공개된 Lee et al.의 US 20120165279 A1, 2011 년 12 월 1 일에 공개된 Arntzen et al.의 US 20110294752 A1, 2011 년 4 월 21 일에 공개된 Majeed et al.의 US 20110091398 A1, 2010 년 7 월 29 일에 공개된 Arntzen et al.의 US 20100189824 A1, 2010 년 2 월 25 일에 공개된 Jiang et al.의 US 20100048911 A1, 2006 년 4 월 6 일에 공개된 Arntzen et al.의 US 20060073222 A1에 개시되어 있고, 그 전체 내용은 여기에 참조로 포함된다.
우르솔산 유도체, 프로드러그 및 염은 2015 년 1 월 8 일에 공개된 Gribble et al.의 US 20150011627 A, 2013 년 11 월 14 일에 공개된 Gribble et al.의 US 20130303607 A1, 2015 년 8 월 6 일에 공개된 Yoon et al.의 US 20150218206 A1, 2004 년 11 월 30 일에 발행된 Fritsche et al.의 US 6824811, 2010 년 5 월 8 일에 발행된 Ochiai et al.의 US 7718635, 2014 년 5 월 20 일에 발행된 Lin et al.의 US 8729055, 및 2015 년 9 월 1 일에 발행된 Yoon et al.의 US 9120839에 개시되어 있고, 그 전체 내용은 여기에 참조로 포함된다.
베툴린산 유도체, 프로드러그 및 염은 2015 년 1 월 8 일에 공개된 Gribble et al.의 US 20150011627 A, 2013 년 11 월 14 일에 공개된 Gribble et al.의 US 20130303607, 2012 년 9 월 20 일에 공개된 Shode et al.의 US 20120237629 A1, 2017 년 7 월 20 일에 공개된 Regueiro-Ren et al.의 US 20170204133 A1, 2017 년 4 월 6 일에 공개된 Nitz et al.의 US 20170096446 A1, 2015 년 11 월 26 일에 공개된 Parthasaradhi Reddy et al의 US 20150337004 A1, 2015 년 4 월 30 일에 공개된 Parthasaradhi Reddy et al.의 US 20150119373 A1, 2014 년 10 월 2 일에 공개된 Yan et al.의 US 20140296546 A1, 2014 년 8 월 28 일에 공개된 Swidorski et al.의 US 20140243298 A1, 2014 년 8 월 7 일에 공개된 Parthasaradhi Reddy et al.의 US 20140221328 A1. 2014 년 3 월 6 일에 공개된 Leunis et al.의 US 20140066416 A1, 2013 년 3 월 14 일에 공개된 Durst et al.의 US 20130065868 A1, 2013 년 1 월 31 일에 공개된 Regueiro-Ren et al.의 US 20130029954 A1, 2012 년 11 월 29 일에 공개된 Zhang et al.의 US 20120302530 A1, 2012 년 8 월 23 일에 공개된 Power et al.의 US 20120214775 A1, 2012 년 4 월 26 일에 공개된 Honda et al.의 US 20120101149 A1, 2011 년 9 월 15 일에 공개된 Bullock et al.의 US 20110224182 A1, 2011 년 12 월 22 일에 공개된 Hemp et al.의 US 20110313191 A1, 2011 년 9 월 15 일에 공개된 Pichette et al.의 US 20110224159 A1, 2011 년 9 월 8 일에 공개된 Parthasaradhi Reddy et al.의 US 20110218204, 2009 년 8 월 13 일에 공개된 Safe et al.의 US 20090203661 A1, 2009 년 5월 21 일에 공개된 Krasutsky et al.의 US 20090131714 A1, 2009 년 3 월 19 일에 공개된 Krasutsky et al.의 US 20090076290, 2009 년 3 월 12 일에 공개된 Leunis et al.의 US 20090068257 A1, 2008 년 11 월 27 일에 공개된 Mukherjee et al.의 US 20080293682, 2007 년 3 월 29 일에 공개된 Pezzuto et al.의 US 20070072835 A1, 2006 년 11 월 9 일에 공개된 Jansen et al.의 US 20060252733, 2006 년 11 월 9 일에 공개된 O'Neill et al.의 US 2006025274 A1에 개시되어 있고, 그 전체 내용은 여기에 참조로 포함된다.
항 바이러스 조성물은 임의의 적합한 약제학적으로 허용가능한 제형으로 제제화될 수 있다. 비경구, 귀, 눈, 코, 흡입, 입(buccal), 설하, 장, 국소(topical), 입, 경구 및 주사 가능한 제형이 특히 유용하다. 특정 제형은 고체 또는 액체 제형을 포함한다. 예시적인 적합한 제형은 정제, 캡슐, 알약, 캐플릿, 트로키(troche), 샤시(sache), 용액, 현탁액, 분산액, 바이알, 백, 병, 주사액, i.v.(정맥 내), i.m.(근육 내) 또는 i.p.(복강 내) 투여 가능한 액체 및 제약 과학 분야의 당업자에게 공지된 다른 제형을 포함한다.
바이러스 감염은 여러 장기에 동시에 영향을 미치고 여러 장기 부전을 일으킬 수 있기 때문에, 하나 이상의 경로로 조성물을 투여하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, COVID-19는 폐, 심장, 위장관 및 뇌에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 따라서, 강심 배당체 함유 조성물은 흡입성 조성물 및 구강 조성물, 설하 조성물 및 구강 조성물, 흡입성 조성물 및 설하 조성물, 흡입성 조성물 및 비경구 조성물, 설하 조성물 및 비경구 조성물, 경구 조성물 및 비경구 조성물, 또는 기타 이러한 조합으로서 유리하게 투여 될 수 있다
항 바이러스 조성물을 함유하는 적합한 제형은 항 바이러스 조성물을 본원에 기재된 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합함으로써 제조될 수 있으며, 약제학적으로 허용되는 부형제는 또한 Pi et al.(Cur. Drug Deliv.(Mar 2016), 13(8), 1358-1366에서의 "용출률 및 생체 이용률 향상을 위한 우르솔산 나노 결정: 상이한 입자 크기의 영향"), Yang et al.(Int. J. Nanomed.(2013), 8(1), 2917-2926에서의 "올레아놀산의 경구 생체 이용률 향상을 위한 자가 미세 유화 약물 전달 시스템: 설계 및 평가"), Li et al.(Biol. Pharm. Bull.(2014), 37(6), 926-937에서의 "실험 설계로 습식 볼 밀링에 의해 제조된 최적화된 수크로스 에스테르 안정화 올레아놀산 나노 현탁액의 개발 및 평가"), Zhang et al.(J. Pharm. Sci.(June 2014), 103(6), 1711-1719)의 "지질 나노스피어를 통한 트리테르펜의 경구 생체 이용률 향상: 제조, 특성화 및 흡수 평가"), Godugu et al.(PLoS One(Mar 2014), 9(3):e89919에서의 "새로운 항암제 베르베린 및 베툴린산의 경구 생체 이용률 및 효과 개선 방법"), Zhao et al.(Drug Deliv.(Sep 2014), 21(6), 467-479에서의 "반 용매 침전에 의한 경구 저혈당 약물에 대한 베툴린 나노 입자의 제조 및 특성"), Yang et al.(Food Chem.(May 2012), 132(1), 319-325에서의 "초임계 반-용매(SAS) 공정을 이용한 우르솔산 나노 입자의 물리 화학적 특성 및 경구 생체 이용률"), Cao et al.(Mol. Pharm.(Aug. 2012), 9(8), 2127-2135에서의 "PEPT1-매개 수송을 위한 올레아놀산의 에틸렌 글리콜-링크된 아미노산 디에스테르 프로드러그: 합성, 장 투과성 및 약동학"), Li et al.(Parm. Res.(Aug 2011), 28(8), 2020-2033)에서의 "올레아놀산의 수크로스 에스테르-안정화 나노 현탁액의 제조, 생물학적 및 약동학적 연구"), Tong et al.(Int. J. Pharm.(Feb 2011), 404(1-2), 148-158에서의 "올레아놀산, BCS 클래스 IV 화합물의 용해 및 경구 생체 이용률 향상을 위해 폴리 비닐피롤리돈 및 소듐캡레이트에 의한 스프레이 동결 건조"), Xi et al.(AAPS PharmSciTech(2009), 10(1), 172-182에서의 "올레아놀산의 자기 나노 유화 약물 전달 시스템의 제형 개발 및 생체 이용률 평가", Chen et al.(J. Pharm. Pharmacol.(Feb 2005), 57(2), 259-264에서의 "올레아놀산 나노 현탁액: 제조, 시험관내 특성화 및 개선된 간 보호 효과")에 기재되어 있고, 이의 전체 개시 내용은 본원에 참조로 포함된다.
적합한 제형은 또한 2012 년 5 월 29 일 발행된 Addingington의 US 8187644 B2, 2008 년 7 월 22 일에 발행된 Addington의 US 7402325 B2, 2013 년 3 월 12 일 발행된 Addington et al.의 US 8394434 B2에 따라 제조될 수 있고, 이의 전체 개시 내용은 본원에 참조로 포함된다. 실시 예 13-15에 기재된 바와 같이 적합한 제형이 또한 제조될 수 있다.
유효량 또는 치료적으로 관련된 양의 항 바이러스 화합물(강심 배당체, 트리테르펜 또는 이들의 조합)이 구체적으로 고려된다. 용어 "유효량"은 약제학적 유효량이 고려되는 것으로 이해된다. 약제학적 유효량은 요구되거나 원하는 치료 반응에 충분한 활성 성분의 양, 즉, 환자에게 투여될 때 상당한 생물학적 반응을 이끌어 내기에 충분한 양이다. 상당한 생물학적 반응은 활성 물질의 단일 또는 다중 투여량을 투여한 결과 발생할 수 있다. 투여량은 하나 이상의 제형을 포함할 수 있다. 임의의 환자에 대한 특정 투여량 수준은 치료중인 징후, 징후의 중증도, 환자 건강, 연령, 성별, 체중, 식이, 약리학적 반응, 사용된 특정 제형, 그리고 다른 그러한 요인들을 포함하는 다양한 요인에 따라 달라짐을 이해할 것이다.
경구 투여를 위한 바람직한 투여량은 단일 투여량으로 1 회 내지 10 회의 제형이 투여될 수 있지만, 최대 5 개의 제형이다. 예시적인 제형은 투여 당 총 0.1 내지 500 mg(1 내지 10 투여 수준)에 대해, 제형 당 0.01 내지 100 mg 또는 0.01 내지 100 마이크로그램의 항 바이러스 조성물을 함유할 수 있다. 투여량은 대상체에서 특정 치료 반응 또는 임상적 이점을 달성하도록 미리 결정 및/또는 조정될 수 있는 투여 요법에 따라 투여될 것이다.
강심 배당체는 대상체에게 약 20 내지 약 100 마이크로그램, 약 12 마이크로그램 내지 약 300 마이크로그램, 또는 약 12 마이크로그램 내지 약 120 마이크로그램의 올레안드리인의 초기 투여량을 제공하기에 충분한 양으로 제형내에 존재할 수 있다. 제형은 올레안드린의 약 20 내지 약 100 마이크로그램, 약 0.01 마이크로그램 내지 약 100 mg 또는 약 0.01 마이크로그램 내지 약 100 마이크로그램의 올레안드린, 올레안드린 추출물 또는 올레안드린을 함유하는 네리움 올리앤더 추출물을 포함할 수 있다.
항 바이러스제는 경구 제형으로 포함될 수 있다. 제형의 일부 실시 예는 장용(enteric) 코팅되지 않고, 0.5 내지 1 시간 이하의 기간 내에 항 바이러스 조성물의 복용량을(charge) 방출한다. 제형의 일부 실시 예는 장용 코팅되고, 예를 들어 공장(jejunum), 회장(ileum), 소장 및/또는 대장(콜론)으로부터와 같이, 위의 하류로 항 바이러스 조성물의 복용량을 방출한다. 장용 코팅된 제형은 경구 투여 후 1-10 시간 내에 항 바이러스 조성물을 전신 순환계로 방출할 것이다.
항 바이러스 조성물은 급속 방출, 즉시 방출, 제어 방출, 지속 방출, 장기적 방출, 연장 방출, 파열 방출, 연속 방출, 슬로우 방출 또는 펄스 방출 제형, 또는 이러한 방출 유형들 중 2개 이상을 나타내는 제형으로 포함될 수 있다. 제형으로부터의 항 바이러스 조성물의 방출 프로파일은 0 차, 유사-0 차, 1 차, 유사-1 차 또는 S자형(sigmoidal) 방출 프로파일일 수 있다. 항 바이러스 조성물이 투여되는 대상체에서 트리테르펜에 대한 혈장 농도 프로파일은 하나 이상의 최대 값을 나타낼 수 있다.
인간 임상 데이터에 기초하여, 올레안드린의 투여량의 50 % 내지 75 %가 경구 생체 이용 가능할 것으로 예상되어, 제형 당 올레안드린의 약 10 내지 약 20 마이크로그램, 약 20 내지 약 40 마이크로그램, 약 30 내지 약 50 마이크로그램, 약 40 내지 약 60 마이크로그램, 약 50 내지 약 75 마이크로그램, 약 75 내지 약 100 마이크로그램을 제공할 것이다. 성인 인간에서 5 리터의 평균 혈액량을 감안할 때, 예상되는 올레안드린 혈장 농도는 약 0.05 내지 약 2 ng/ml, 약 0.005 내지 약 10 ng/mL, 약 0.005 내지 약 8 ng/mL, 약 0.01 내지 약 7 ng/mL, 약 0.02 내지 약 7 ng/mL, 약 0.03 내지 약 6 ng/mL, 약 0.04 내지 약 5 ng/mL, 또는 약 0.05 내지 약 2.5 ng/mL의 범위일 것이다. SCF 추출물에 존재하는 권장 일일 투여량의 올레안드린은 일반적으로 1 일 2 회, kg 체중 당 약 0.2 내지 약 4.5 마이크로그램이다. 올레안드린의 투여량은 약 0.2 내지 약 1 마이크로그램/kg 체중/일, 약 0.5 내지 약 1.0 마이크로그램/kg 체중/일, 약 0.75 내지 약 1.5 마이크로그램/kg 체중/일, 약 1.5 내지 약 2.52 마이크로그램/kg 체중/일, 약 2.5 내지 약 3.0 마이크로그램/kg 체중/일, 약 3.0 내지 4.0 마이크로그램/kg 체중/일 또는 약 3.5 내지 4.5 마이크로그램 올레안드린/kg 체중/일일 수 있다. 올레안드린의 최대 허용 투여량은 약 3.5 마이크로그램/kg 체중/일 내지 약 4.0 마이크로그램/kg 체중/일일 수 있다. 최소 유효 투여량은 약 0.5 마이크로그램/일, 약 1 마이크로그램/일, 약 1.5 마이크로그램/일, 약 1.8 마이크로그램/일, 약 2 마이크로그램/일, 또는 약 5 마이크로그램/일일 수 있다.
항 바이러스 조성물은 존재하는 트리테르펜의 조합 및 그것들이 존재하는 몰비로 인해 저투여량 내지 고투여량으로 투여될 수 있다. 인간에 대한 치료 유효 투여량은 체중 Kg 당 약 100-1000 mg 또는 100-1000 마이크로그램의 항 바이러스 조성물이다. 이러한 투여량은 24 시간 동안 최대 10 회까지 투여할 수 있다. 다른 적절한 투여 범위가 아래에 지정되어 있다.
Figure 112020098766406-pct00005
본원의 화합물은 본 발명의 조성물 또는 제형에서 하나 이상의 기능을 가질 수 있음에 유의해야 한다. 예를 들어, 화합물은 계면 활성제 및 물 혼화성 용매, 또는 계면 활성제와 물 불혼화성 용매 둘 모두로서 작용할 수 있다.
액체 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 액체 담체를 포함할 수 있다. 액체 담체는 수성, 비-수성, 극성, 비-극성 및/또는 유기 담체일 수 있다. 액체 담체는 예를 들어 비-제한적으로 물 혼화성 용매, 물 불혼화성 용매, 물, 완충제 및 이들의 혼합물을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "수용성 용매"또는 "물 혼화성 용매"는 상호 교환적으로 사용되며, 물과 2 상 혼합물을 형성하지 않거나, 또는 물에 충분히 용해되어 액상의 분리없이 5 % 이상의 용매를 함유하는 수성 용매 혼합물을 제공하는 유기 액체를 지칭한다. 용매는 인간 또는 동물에게 투여하기에 적합하다. 예시적인 수용성 용매는 비-제한적인 예로서, PEG(폴리(에틸렌 글리콜)), PEG 400(폴리(에틸렌 글리콜, 이는 약 400의 대략적인 분자량을 가짐), 에탄올, 아세톤, 알칸올, 알코올, 에테르, 프로필렌 글리콜, 글리세린, 트리아세틴, 폴리(프로필렌 글리콜), PVP(폴리(비닐 피롤리돈)), 디메틸술폭시드, N,N-디메틸포름아미드, 포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, 피리딘, 프로판올, N-메틸아세트아미드, 부탄올, 용해액( 2-피롤리돈), 파마솔브(N-메틸-2-피롤리돈)을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "물 불용성 용매"또는 "물 불혼화성 용매"는 상호 교환적으로 사용되며, 물과 2 상 혼합물을 형성하거나, 또는 물내의 용매의 농도가 5 %를 초과할 때 상 분리를 제공하는 유기 액체를 지칭한다. 용매는 인간 또는 동물에게 투여하기에 적합하다. 예시적인 물 불용성 용매는 비-제한적인 예로서, 중간 사슬/장쇄 트리글리세리드, 오일, 피마자유, 옥수수 유, 비타민 E, 비타민 E 유도체, 올레산, 지방산, 올리브 오일, 소프티잔(softisan) 645(디글리세릴 카프릴레이트/카프레이트/스테아레이트/히드록시 스테아레이트 아디페이트), 미글리올, 캡텍스(Captex 350: 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트/로레이트 트리글리세리드; Captex 355: 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트 트리글리세리드; Captex 355 EP/NF:글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트 중간 사슬 트리글리세리드)를 포함한다.
적합한 용매는 "산업용 Q3C 불순물에 대한 인간 사용(ICH) 약물 등록을 위한 기술 요구 사항의 조화에 관한 국제 회의 지침: 잔류 용매"(1997)에 열거되어 있으며, 이는 잔류 용매의 어느 정도의 양이 의약품에서 안전한 것으로 간주되는지를 권고한다. 예시적인 용매는 클래스 2 또는 클래스 3 용매로 열거된다. 클래스 3 용매는 예를 들어 아세트산, 아세톤, 아니솔, 1-부탄올, 2-부탄올, 부틸 아세테이트, tert-부틸메틸 에테르, 쿠멘, 에탄올, 에틸 에테르, 에틸 아세테이트, 에틸 포르 메이트, 포름산, 헵탄, 이소부틸 아세테이트, 이소프로필 아세테이트, 메틸 아세테이트, 메틸-1-부탄올, 메틸에틸 케톤, 메틸이소부틸 케톤, 2-메틸-1-프로판올, 펜탄, 1-펜탄 올, 1-프로판올, 2-프로판올 또는 프로필 아세테이트를 포함한다.
본 발명에서 물 불혼화성 용매로서 사용될 수 있는 다른 물질은 다음의 물질들, 즉 캡텍스 100: 프로필렌 글리콜 디카프레이트; 캡텍스 200: 프로필렌 글리콜 디카프릴레이트/디카프레이트; 캡텍스 200 P: 프로필렌 글리콜 디카프릴레이트/디카프레이트; 프로필렌 글리콜 디카프릴로카프레이트; 캡텍스 300: 글리세릴 트리 카프릴레이트/카프레이트; 캡텍스 300 EP/NF: 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트 중간 사슬 트리글리세리드; 캡텍스 350: 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트/로레이터(Laurate); 캡텍스 355: 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트; 캡텍스 355 EP/NF: 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트 중간 사슬 트리글리세리드; 캡텍스 500: 트리아세틴; 캡텍스 500 P: 트리아세틴(Pharmaceutical Grade); 캡텍스 800: 프로필렌 글리콜 디(2-에티텍사노에이트); 캡텍스 810 D: 글리세릴 트리카프릴레이트/카프레이트/리놀레에이트; 캡텍스 1000: 글리세릴 트리카프레이트; 캡텍스 CA: 중간 사슬 트리글리세리드; 캡텍스 MCT-170: 중간 사슬 트리글리세리드; 캡물(Capmul) GMO: 글리세릴 모노올레에이트; 캡물 GMO-50 EP/NF: 글리세릴 모노올레 에이트; 캡물 MCM: 중간 사슬 모노-및 디글리세리드; 캡물 MCM C8: 글리세릴 모노 카프릴레이트; 캡물 MCM C10: 글리세릴 모노카프레이트; 캡물 PG-8: 프로필렌 글리콜 모노카프릴레이트; 캡물 PG-12: 프로필렌 글리콜 모노라우레이트; 카프롤(Caprol) 10G10O: 데카글리세롤 데카올레에이트; 카프롤 3GO: 트리글리세롤 모노 올레에이트; 카프롤 ET: 혼합 지방산의 폴리글리세롤 에스테르; 카프롤 MPGO: 헥사 글리세롤 디올레에이트; 카프롤 PGE 860: 데카글리세롤 모노-, 디올레에이트를 포함한다.
본원에 사용된 "계면 활성제"는 극성 또는 하전 친수성 부분뿐만 아니라 비극성 소수성(친유성) 부분을 포함하는 화합물을 지칭한다; 즉, 계면 활성제는 양쪽 친매성이다. 계면 활성제라는 용어는 하나 이상의 화합물의 혼합물을 지칭할 수 있다. 계면 활성제는 가용화제, 유화제 또는 분산제일 수 있다. 계면 활성제는 친수성 또는 소수성일 수 있다.
친수성 계면 활성제는 약제학적 조성물에 사용하기에 적합한 임의의 친수성 계면 활성제일 수 있다. 이러한 계면 활성제는 음이온성, 양이온성, 양쪽 이온성 또는 비-이온성일 수 있지만, 비-이온성 친수성 계면 활성제가 현재 바람직하다. 상기 논의된 바와 같이, 이들 비-이온성 친수성 계면 활성제는 일반적으로 약 10보다 큰 HLB 값을 가질 것이다. 친수성 계면 활성제의 혼합물 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
유사하게, 소수성 계면 활성제는 약제학적 조성물에 사용하기에 적합한 임의의 소수성 계면 활성제일 수 있다. 일반적으로, 적합한 소수성 계면 활성제는 약 10 미만의 HLB 값을 가질 것이다. 소수성 계면 활성제의 혼합물은 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
추가의 적합한 가용화제의 예는 알코올 및 폴리올, 예컨대 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 벤질 알코올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 부탄디올 및 이의 이성질체, 글리세롤, 펜타에리트리톨, 소르비톨, 만니톨, 트랜스큐톨, 디메틸 이소 소르비드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리비닐알코올, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 및 다른 셀룰로오스 유도체, 시클로덱스트린 및 시클로덱스트린 유도체; 평균 분자량이 약 200 내지 약 6000인 폴리에틸렌 글리콜의 에테르, 예컨대 테트라하이드로푸르푸릴 알코올 PEG 에테르(글리코푸롤, 이는 BASF로부터 상표명 Tetraglycol로 시판됨) 또는 메톡시 PEG(Union Carbide); 아미드, 예컨대 2-피롤리돈, 2-피페리돈, 카프로락탐, N-알킬피롤리돈, N-하이드록시알킬피롤리돈, N-알킬피페리돈, N-알킬카프로락탐, 디메틸아세트아미드 및 폴리비닐피롤리돈; 에스테르, 예컨대 에틸 프로피오네이트, 트리부틸시트레이트, 아세틸 트리에틸시트 레이트, 아세틸 트리부틸 시트레이트, 트리에틸시트레이트, 에틸 올레에이트, 에틸 카프릴레이트, 에틸 부티레이트, 트리아세틴, 프로필렌 글리콜 모노아세테이트, 프로필렌 글리콜 디아세테이트, 카프로락톤 및 이의 이성질체, 발레로락톤 및 이의 이성질체, 부티로락톤 및 이의 이성질체; 및 당 업계에 공지된 다른 가용화제, 예컨대 디메틸 아세트아미드, 디메틸 이소소르비드(Arlasolve DMI(ICI)), N-메틸 피롤리돈(Pharmasolve(ISP)), 모노옥타노인, 디에틸렌 글리콜 노노에틸 에테르(이는 상품명 Transcutol로 Gattefosse로부터 입구 가능함), 및 물을 포함한다. 가용화제의 혼합물 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
지시된 것을 제외하고는, 본원에 언급된 화합물은 표준 상업적 공급원으로부터 쉽게 입수할 수 있다.
반드시 필요하지는 않지만, 조성물 또는 제형은 하나 이상의 킬레이트화제, 하나 이상의 보존제, 하나 이상의 항산화제, 하나 이상의 흡착제, 하나 이상의 산성화제, 하나 이상의 알칼리화제, 하나 이상의 소포제, 하나 이상의 완충제, 하나 이상의 염색제, 하나 이상의 전해질, 하나 이상의 염, 하나 이상의 안정화제, 하나 이상의 장성(tonicity) 개질제, 하나 이상의 희석제 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 고정 유, 땅콩 유, 참기름, 면실유, 옥수수 유 및 올리브유와 같은 오일; 올레산, 스테아르산 및 이소스테아르 산과 같은 지방산; 에틸 올레에이트, 이소프로필 미리스테이트, 지방산 글리세리드 및 아세틸화된 지방산 글리세리드와 같은 지방산 에스테르를 포함한다. 조성물은 또한 에탄올, 이소프로판올, 헥사데실 알코올, 글리세롤 및 프로필렌 글리콜과 같은 알코올; 2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-메탄올과 같은 글리세롤 케탈; 폴리(에틸렌 글리콜) 450과 같은 에테르; 미네랄 오일 및 바셀린과 같은 석유 탄화수소; 물; 약제학적으로 적합한 계면 활성제, 현탁제 또는 유화제; 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
제약 제형 분야에서 사용되는 화합물은 일반적으로 다양한 기능 또는 목적을 제공한다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 본 명세서에서 명명된 화합물이 한 번만 언급되거나 본 명세서에서 하나 이상의 용어를 정의하는 데 사용되는 경우, 그 목적 또는 기능은 단지 명명된 목적 또는 기능(들)으로 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다.
제형의 하나 이상의 성분은 그의 유리 염기, 유리 산 또는 약제학적으로 또는 분석학적으로 허용되는 염 형태로 존재할 수 있다. 본원에 사용된 "약제학적으로 또는 분석학적으로 허용되는 허용되는 염"은 이온 결합된 쌍을 형성하기 위해 필요에 따라 이를 산과 반응시켜 개질된 화합물을 지칭한다. 허용되는 염의 예는 예를 들어 비-독성 무기 또는 유기 산으로부터 형성된 종래의 비-독성 염을 포함한다. 적합한 비-독성 염은 무기산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 황산, 설폰산, 설 팜산, 인산, 질산 및 기타 당업자에게 공지된 것들을 포함한다. 염은 유기산, 예컨대 아미노산, 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 락트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 파모산, 말레산, 히드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 설파닐산, 2-아세톡시벤조산, 푸마르산, 톨루엔술폰산, 메탄술폰산, 에탄 디술폰산, 옥살산, 이세티온산 및 기타 당업자에게 공지된 것들로부터 제조된다. 한편, 약리학적 활성 성분이 산 작용기를 갖는 경우, 약제학적으로 허용되는 염기가 첨가되어 약제학적으로 허용되는 염을 형성한다. 다른 적합한 염의 목록은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th(ed., Mack Publishing Company, PA, Easton, 1985, p. 1418)에서 찾을 수 있는데, 그 관련 개시 내용은 본원에 참고로 포함된다.
"약제학적으로 허용되는"이라는 문구는 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제나 합병증없이 합리적인 이익/위험율에 비례하여, 인간 및 동물의 조직과의 접촉에 사용하기에 적합한 화합물, 재료, 조성물 및/또는 제형을 지칭하기 위해 사용된다.
제형은 제약 산업에 공지된 임의의 종래의 수단에 의해 제조될 수 있다. 액체 제형은 용기에 하나 이상의 액체 담체 및 항 바이러스 조성물을 제공함으로써 제조될 수 있다. 하나 이상의 다른 부형제가 액체 제형에 포함될 수 있다. 고체 제형은 하나 이상의 고체 담체 및 항 바이러스 조성물을 제공함으로써 제조될 수 있다. 하나 이상의 다른 부형제가 고형 제형에 포함될 수 있다.
제형은 종래의 포장 장비 및 재료를 사용하여 포장될 수 있다. 제형은 팩, 병, 비아, 백, 주사기, 엔벨로프, 패킷, 블리스터 팩, 박스, 앰플 또는 다른 용기에 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 임의의 제형에 포함될 수 있다. 특정 제형은 고체 또는 액체 제형을 포함한다. 예시적인 적합한 제형은 정제, 캡슐, 알약, 캐플릿, 트로 키, 샤시 및 제약 과학 분야의 당업자에게 공지된 다른 제형을 포함한다.
상기 설명 및 하기 실시 예에 비추어 볼 때, 당업자는 과도한 실험없이 청구된 바와 같은 본 발명을 실시할 수 있을 것이다. 전술한 내용은 본 발명의 실시 예의 실시를 위한 특정 절차를 상세히 설명하는 하기 실시 예를 참조하여 보다 잘 이해될 것이다. 이들 예에 대한 모든 언급은 예시의 목적을 위한 것이다. 하기 실시 예는 배타적인 것으로 간주되어서는 안되며, 본 발명에 의해 고려되는 많은 실시 예들 중 일부만을 예시할 뿐이다.
Vero CCL81 세포는 예방 및 치료 분석을 위해 사용되었다(ATCC, Manassas, VA). 플라크 분석은 Vineet Menachery(UTMB, Galveston, TX)에 의해 친절히 제공되는 Vero E6 세포에서 수행되었다. 세포는 5 % CO2가 있는 37℃ 인큐베이터에 유지되었다. 5 % 소 태아 혈청(FBS)(Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA) 및 1 % 페니실리움/스트렙토마이신(Gibco, Grand Island, NY)이 보충된 델베코의 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle medium)(Gibco, Grand Island, NY)를 사용하여 세포를 증식하였다. 유지 관리 배지는 FBS를 2 %로 감소시켰지만, 그렇지 않은 경우에는 동일하였다. SARS-CoV-2, 균주 USA_WA1/2020(Genbank accession MT020880)은 신종 바이러스 및 아르보바이러스에 대한 세계 참조 센터에서 제공되었다. 모든 연구는 SARS-CoV-2의 NextGen 염기 서열 Vero passage 4 stock을 사용하였다.
실시 예 1
분말 올리앤더(oleander, 협죽도) 잎의 초임계 유체 추출
방법 A. 이산화탄소와 함께
분말 올리앤더 잎은 올리앤더 잎 재료를 수확, 세척 및 건조시킨 후, 올리앤더 잎 재료를 예컨대 미국 특허 제 5,236,132 호, 제 5,598,979 호, 제 6,517,015 호 및 제 6,715,705 호에 기술된 것과 같은 분쇄 및 탈수 장치를 통해 통과시킴으로써 준비하였다. 사용된 출발 물질의 중량은 3.94 kg이었다.
출발 물질을 추출기 장치에서 300 bar(30 MPa, 4351 psi)의 압력 및 50 ℃(122ºF)의 온도에서 순수한 CO2와 혼합하였다. 총 197 kg의 CO2를 사용하여 용매 대 원료의 비가 50:1이 되도록 하였다. 이어서, CO2와 원료의 혼합물을 분리기 장치에 통과시켜, 혼합물의 압력과 온도를 변경하고, 추출물을 이산화탄소로부터 분리하였다.
추출물(65 g)은 향이 좋은 갈색의 끈적 끈적한 점성 물질로서 수득되었다. 엽록소 및 기타 잔류 발색 화합물로 인해 컬러가 야기되었을 수 있다. 정확한 수율 측정을 위해, 튜브 및 분리기를 아세톤으로 헹구고, 아세톤을 증발시켜 추출물의 추가 9 g을 수득하였다. 총 추출량은 74g이었다. 출발 물질의 중량을 기준으로, 추출물의 수율은 1.88 %였다. 추출물 중의 올레안드린의 함량은 고압 액체 크로마토그래피 및 질량 분석법을 사용하여, 560.1 mg, 또는 0.76 %의 수율로 계산되었다.
방법 B. 이산화탄소와 에탄올의 혼합물과 함께
분말 올리앤더 잎은 올리앤더 잎 재료를 수확, 세척 및 건조시킨 후, 올리앤더 잎 재료를 예컨대 미국 특허 제 5,236,132 호, 제 5,598,979 호, 제 6,517,015 호 및 제 6,715,705 호에 기술된 것과 같은 분쇄 및 탈수 장치를 통해 통과시킴으로써 준비하였다. 사용된 출발 물질의 중량은 3.85 kg이었다.
출발 물질을 추출기 장치에서 280 bar(28 MPa, 4061 psi)의 압력 및 50 ℃(122ºF)의 온도에서 개질제로서 순수한 CO2 및 5 % 에탄올과 혼합하였다. 총 160kg의 CO2와 8kg의 에탄올을 사용하여 용매 대 원료의 비가 43.6 대 1이 되도록 하였다. 이어서, CO2, 에탄올 및 원료의 혼합물을 분리기 장치를 통해 통과시켜, 혼합물의 압력과 온도를 변경하고, 추출물을 이산화탄소로부터 분리하였다.
추출물(207 g)은 에탄올을 제거한 후, 명백하게 약간의 엽록소를 함유하는 짙은 녹색의 끈적 끈적한 점성 덩어리로서 수득되었다. 출발 물질의 중량을 기준으로, 추출물의 수율은 5.38 %였다. 추출물 중의 올레안드린의 함량은 고압 액체 크로마토그래피 및 질량 분석법을 사용하여, 1.89 g, 또는 0.91 %의 수율로 계산되었다.
실시 예 2
분말 올리앤더 잎의 열탕(hot-water) 추출.
(비교 예)
열탕 추출은 전형적으로 올리앤더 잎으로부터 올레안드린 및 다른 활성 성분을 추출하기 위해 사용된다. 열탕 추출 공정의 예는 미국 특허 제 5,135,745 호 및 제 5,869,060 호에서 찾을 수 있다.
5 g의 분말 올리앤더 잎을 사용하여 열탕 추출을 수행하였다. 분말화된 올리앤더 잎에(올리앤더 출발 물질의 중량 기준) 10 부피의 끓는 물을 첨가하고, 혼합물을 6 시간 동안 일정하게 교반하였다. 이어서, 혼합물을 여과하고, 잎 잔류 물을 수집하고, 동일한 조건 하에서 다시 추출하였다. 여과액을 합하고 동결 건조시켰다. 추출물의 외관은 갈색이었다. 건조된 추출물 물질의 무게는 약 1.44g이었다. 추출 물질 34.21 mg을 물에 용해시키고, 고압 액체 크로마토그래피 및 질량 분석법을 사용하여 올레안드린 함량 분석을 수행하였다. 올레안드린의 양은 3.68 mg으로 측정되었다. 추출물의 양을 기준으로 한 올레안드린 수율은 0.26 % 인 것으로 계산되었다.
실시 예 3
약제학적 조성물의 제조.
방법 A. 크레모포르(Cremophor)-기반 약물 전달 시스템
하기 성분들이 지시된 양으로 제공되었다.
Figure 112020098766406-pct00006
부형제를 병에 분배하고, 뉴 브런즈윅 사이언티픽 C24KC 냉장 인큐베이터 셰이커내에서 60 ℃에서 24 시간 동안 흔들어서 균질성을 확보하였다. 이어서, 샘플을 따라서 용해화를 육안으로 검사하였다. 부형제 및 항 바이러스 조성물 둘 모두는 24 시간 후에 모든 제형에 대해 완전히 용해되었다.
방법 B. GMO/크레모포르-기반 약물 전달 시스템
하기 성분들이 지시된 양으로 제공되었다.
Figure 112020098766406-pct00007
방법 A의 절차를 따랐다.
방법 C. 라브라솔(Labrasol)-기반 약물 전달 시스템
하기 성분들이 지시된 양으로 제공되었다.
Figure 112020098766406-pct00008
방법 A의 절차를 따랐다.
방법 D. 비타민 E-TPGS 기반 미셀 형성 시스템
하기 성분들이 지시된 양으로 제공되었다.
Figure 112020098766406-pct00009
방법 A의 절차를 따랐다.
방법 E. 다-성분 약물 전달 시스템
하기 성분들이 지시된 양으로 제공되었다.
Figure 112020098766406-pct00010
방법 A의 절차를 따랐다.
방법 F. 다-성분 약물 전달 시스템
하기 성분들이 캡슐에 포함된 것으로 표시된 양으로 제공되었다.
Figure 112020098766406-pct00011
방법 A의 절차를 따랐다.
실시 예 4
장용 코팅된(enteric coated) 캡슐의 제조
단계 I:액체-충전 캡슐의 제조
경질 젤라틴 캡슐(50 카운트, 00 크기)을 실시 예 3의 액체 조성물로 충전하였다. 이들 캡슐을 800mg의 제형으로 수동으로 충전한 다음, 50 % 에탄올/50 % 수용액과 함께 손으로 밀봉하였다. 이어서, 캡슐을 하기 지시된 양으로 하기 성분을 함유하는 22 % 젤라틴 용액과 함께 손으로 밴딩하였다(banded).
Figure 112020098766406-pct00012
젤라틴 용액을 완전히 혼합하고 1-2 시간 동안 팽윤시켰다. 팽창 기간 후, 용액을 단단히 덮고 55 ℃ 오븐에 넣고 액화시켰다. 전체 젤라틴 용액이 액체가 되면 밴딩(banding)을 수행하였다
뾰족한 둥근 3/0 아티스트 브러쉬를 사용하여, 젤라틴 용액을 캡슐에 페인트하였다. 시오노기(Shionogi)에 의해 제공되는 밴딩 키트를 사용했다. 밴딩 후, 밴드를 경화시키기 위해 캡슐을 주위 조건에서 12 시간 동안 유지시켰다.
단계 II:액체-충전 캡슐의 코팅
하기 표에 열거된 성분으로부터 코팅 분산액을 제조하였다.
Figure 112020098766406-pct00013
단계 I에 따른 밴딩 캡슐을 사용하는 경우, 분산액을 20.0 mg/cm2 코팅 수준으로 캡슐에 도포하였다. 캡슐을 코팅하기 위해 하기 조건을 사용하였다.
Figure 112020098766406-pct00014
* 스프레이 노즐은 노즐과 스프레이 경로가 유입 공기의 흐름 경로하에 있도록 설정되었다.
실시 예 5
대상체에서 지카바이러스 감염의 치료
방법 A. 항 바이러스 조성물 요법
지카바이러스 감염을 나타내는 대상체는 항 바이러스 조성물로 처방되고, 치료적으로 관련 투여량은 일정 기간 동안의 소정의 투여 요법에 따라 대상체에게 투여된다. 대상체의 치료 반응 수준은 주기적으로 결정된다. 치료 반응 수준은 혈액 또는 혈장에서 대상체의 지카바이러스 적정 농도(titre)를 결정함으로써 결정될 수 있다. 한 번의 투여량에서 치료 반응 수준이 너무 낮으면, 대상체에서의 원하는 치료 반응 수준이 달성될 때까지 미리 정해진 투여량 증가 스케쥴에 따라 투여량이 증가된다. 항 바이러스 조성물을 이용한 대상체의 치료는 필요에 따라 계속되고, 환자가 원하는 임상 종점에 도달할 때까지 투여량 또는 투여 요법을 필요에 따라 조절할 수 있다.
방법 B. 병용 요법:다른 약제를 갖는 항 바이러스 조성물
지카바이러스 감염 또는 그 증상의 치료를 위해 대상체에게 하나 이상의 다른 치료제를 처방하고 투여한 것을 제외하고는 상기 방법 A를 따른다. 이어서, 하나 이상의 다른 치료제가 항 바이러스 조성물과 함께, 또는 그 투여 이전 또는 이후에 투여될 수 있다. 하나 이상의 다른 치료제의 투여량 증량(또는 감량)이 또한 수행될 수 있다.
실시 예 6
지카바이러스 감염에 대한 항 바이러스 활성의 체외 평가
방법 A. 순수한 화합물
베로 E6 세포(Vero C1008 세포로도 알려짐, ATTC No. CRL-1586; https://www.atcc.org/Products/All/CRL-1586.aspx)는 강심 배당체의 존재 하에서 0.2의 MOI(다중 감염)로 ZIKV(지카바이러스 균주 PRVABC59, ATCC VR-1843; https://www.atcc.org/Products/All/VR-1843.aspx)에 감염되었다. 세포를 바이러스 및 화합물과 함께 1 시간 동안 배양한 후, 접종원 및 화합물을 폐기하였다. 세포에 새로운 배지를 제공하고 48 시간 동안 배양한 후, 포르말린으로 고정하고 ZIKV 감염을 위해 염색되었다. 신티그라피(scintigraphy)에 의해 결정된 올레안드린(도 1a) 및 디곡신(도 1b)의 대표적인 감염률이 도시되어 있다. 다른 화합물은 동일한 조건에서 평가되며, 지카바이러스에 대해 매우 다양한 수준의 항 바이러스 활성을 나타낸다.
방법 B. 추출물 형태의 화합물
시험되는 표적 화합물을 함유하는 추출물은 추출물의 양이 추출물 중의 표적 화합물의 양으로 정규화되는 것을 제외하고는 방법 A에 상세히 기술된 바와 같이 평가된다. 예를 들어, 2 중량 %의 올레안드린을 함유하는 추출물은 1 mg의 추출물 당 20 마이크로그램의 올레안드린을 함유한다. 따라서, 평가를 위한 의도된 양의 올레안드린이 20 마이크로그램이면, 1 mg의 추출물이 분석에 사용될 것이다.
실시 예 7
항 바이러스 조성물을 포함하는 정제의 제조
3 % 실로이드(Syloid) 244FP 및 97 % 미정질 셀룰로오스(MCC)의 초기 정제 혼합물을 혼합하였다. 이어서, 실시 예 3에 따라 제조된 기존의 배치 조성물을 습식 제립법(wet granulation)을 통해 실로이드/MCC 혼합물에 혼입시켰다. 이 혼합물은 아래 표에서 "초기 정제(tabletting) 혼합물"로 표시되어 있다. 추가적인 MMC가 압축률을 높이기 위해 추가-과립으로 첨가되었다. 초기 정제 혼합물에 대한 이러한 첨가는 "추가-과립(extragranular) 첨가"로 표시되어 있다. 추가-과립 첨가로부터의 결과적인 혼합물은 "최종 정제 혼합물"과 동일한 조성이었다.
Figure 112020098766406-pct00015
Figure 112020098766406-pct00016
Figure 112020098766406-pct00017
실로이드 244FP는 그레이스 데이비슨(Grace Davison)에 의해 제조된 콜로이드 이산화 규소이다. 콜로이드 이산화 규소는 일반적으로 흡착제, 활택제(glidant) 및 정제 붕해제와 같은 여러 기능을 제공하는 데 사용된다. 실로이드 244FP는 오일에서 그 중량의 3 배를 흡착하는 능력 및 5.5 미크론 입자 크기 때문에 선택되었다.
실시 예 8
올레안드린을 함유하는 용액의 HPLC 분석
다음 조건(대칭 C18 컬럼(5.0 ㎛, 150 x 4.6 mm I.D.; 물); MeOH:물의 이동 상 = 54:46(v/v) 및 1.0 ml/분에서의 유속)을 사용하여, 샘플(올레안드린 표준 물질, SCF 추출물 및 열탕 추출물)을 HPLC(물)상에서 분석하였다.
검출 파장은 217 nm로 설정되었다. 샘플은 대략적인 목표 농도의 올레안드린을 달성하기 위하여, 화합물 또는 추출물을 고정된 양의 HPLC 용매에 용해시킴으로써 제조되었다. 올레안드린의 머무른 시간은 내부 표준을 사용하여 결정할 수 있다. 올레안드린의 농도는 내부 표준을 사용하는 신호 반응 곡선을 개발/전개함으로써(developing), 결정/보정될 수 있다.
실시 예 9
약제학적 조성물의 제조
본 발명의 약제학적 조성물은 하기 방법 중 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 습식 또는 건식 조건하에서 혼합을 수행할 수 있다. 약제학적 조성물은 제조 동안 압축, 건조 또는 둘다 될 수 있다. 약제학적 조성물은 제형으로 나누어질 수 있다.
방법 A.
적어도 하나의 약제학적 부형제가 본원에 개시된 적어도 하나의 항 바이러스 화합물과 혼합된다.
방법 B.
적어도 하나의 약제학적 부형제가 본원에 개시된 적어도 두 개의 항 바이러스 화합물과 혼합된다.
방법 C.
적어도 하나의 약제학적 부형제가 본원에 개시된 적어도 하나의 강심 배당체와 혼합된다.
방법 D.
적어도 하나의 약제학적 부형제가 본원에 개시된 적어도 두 개의 트리테르펜과 혼합된다.
방법 E.
적어도 하나의 약제학적 부형제가 본원에 개시된 적어도 하나의 강심 배당체 및 본원에 개시된 적어도 두개의 트리테르펜과 혼합된다.
방법 D.
적어도 하나의 약제학적 부형제가 본원에 개시된 적어도 세 개의 트리테르펜과 혼합된다.
실시 예 10
트리테르펜 혼합물의 제조
명시된 트리테르펜을 지시된 대략적인 몰비로 혼합하여, 하기 조성물을 제조하였다.
Figure 112020098766406-pct00018
각각의 조성물에 대해, 3 개의 상이한 각각의 용액을 제조하였고, 이에 따라 각각의 용액 중 트리테르펜의 총 농도는 대략 9 μM, 18 μM 또는 36 μM이었다.
Figure 112020098766406-pct00019
실시 예 11
항 바이러스 조성물의 제조
항 바이러스 조성물은 개별 트리테르펜 성분을 혼합하여 혼합물을 형성함으로써 제조될 수 있다. 허용 가능한 항 바이러스 활성을 제공한 상기 제조된 트리테르펜 혼합물을 항 바이러스 조성물로 제형화하였다(formulated).
올레아놀산 및 우르솔산을 갖는 항 바이러스 조성물
공지된 양의 올레아놀산 및 우르솔산을 본원에 정의된 바와 같은 성분의 미리 정해진 몰비에 따라 혼합하였다. 성분은 고체 형태로 혼합되거나 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 클로로포름, 아세톤, 프로판올, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸아세트아미드(DMAC), N-메틸피롤리돈(NMP), 물 또는 이들의 혼합물내에서 혼합되었다. 생성된 혼합물은 본원에 기재된 바와 같이 상대 몰비로 성분을 함유하였다.
약제학적으로 허용되는 항 바이러스 조성물의 경우, 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제가 약리학적 활성 제제와 혼합되었다. 항 바이러스 조성물은 포유동물에게 투여하기 위해 제형화된다.
올레아놀산 및 베툴린산을 갖는 항 바이러스 조성물
공지된 양의 올레아놀산 및 베툴린산을 본원에 정의된 바와 같은 성분의 미리 정해진 몰비에 따라 혼합하였다. 성분은 고체 형태로 혼합되거나 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 클로로포름, 아세톤, 프로판올, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸아세트아미드(DMAC), N-메틸피롤리돈(NMP), 물 또는 이들의 혼합물내에서 혼합되었다. 생성된 혼합물은 본원에 기재된 바와 같이 상대 몰비로 성분을 함유하였다.
약제학적으로 허용되는 항 바이러스 조성물의 경우, 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제가 약리학적 활성 제제와 혼합되었다. 항 바이러스 조성물은 포유동물에게 투여하기 위해 제형화된다.
올레아놀산, 우르솔산 및 베툴린산을 갖는 항 바이러스 조성물
공지된 양의 올레아놀산, 우르솔산 및 베툴린산을 본원에 정의된 바와 같은 성분의 미리 정해진 몰비에 따라 혼합하였다. 성분은 고체 형태로 혼합되거나 용매, 예를 들어 용매에서 혼합되었다. 성분은 고체 형태로 혼합되거나 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 클로로포름, 아세톤, 프로판올, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸아세트아미드(DMAC), N-메틸피롤리돈(NMP), 물 또는 이들의 혼합물내에서 혼합되었다. 생성된 혼합물은 본원에 기재된 바와 같이 상대 몰비로 성분을 함유하였다.
약제학적으로 허용되는 항 바이러스 조성물의 경우, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제가 약리학적 활성 제제와 혼합되었다. 항 바이러스 조성물은 포유동물에게 투여하기 위해 제형화된다.
올레아드린, 올레아놀산, 우르솔산 및 베툴린산을 갖는 항 바이러스 조성물
공지된 양의 올레아드린, 올레아놀산, 우르솔산 및 베툴린산을 본원에 정의된 바와 같은 성분의 미리 정해진 몰비에 따라 혼합하였다. 성분은 고체 형태로 혼합되거나 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 클로로포름, 아세톤, 프로판올, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸아세트아미드(DMAC), N-메틸피롤리돈(NMP), 물 또는 이들의 혼합물내에서 혼합되었다. 생성된 혼합물은 본원에 기재된 바와 같이 상대 몰비로 성분을 함유하였다.
약제학적으로 허용되는 항 바이러스 조성물의 경우, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제가 약리학적 활성 제제와 혼합되었다. 항 바이러스 조성물은 포유동물에게 투여하기 위해 제형화된다.
실시 예 12
대상체에서 필로바이러스 감염의 치료
예시적인 필로바이러스 감염은 에볼라바이러스 및 마르부르그바이러스를 포함한다.
방법 A. 항 바이러스 조성물 요법
필로바이러스 감염을 나타내는 대상체는 항 바이러스 조성물로 처방되고, 치료적으로 관련된 투여량은 일정 기간 동안 처방된 투여 요법에 따라 대상체에게 투여된다. 대상체의 치료 반응 수준은 주기적으로 결정된다. 치료 반응 수준은 혈액 또는 혈장에서 대상체의 필로바이러스 적정 농도를 결정함으로써 결정될 수 있다. 한 번의 투여량에서 치료 반응 수준이 너무 낮으면, 대상체에서 원하는 치료 반응 수준이 달성될 때까지 미리 정해진 투여량 증가 스케쥴에 따라 투여량이 증가된다. 항 바이러스 조성물에 의한 대상체의 치료는 필요에 따라 계속되고, 환자가 원하는 임상 종점에 도달할 때까지 투여량 또는 투여 요법을 필요에 따라 조절할 수 있다.
방법 B. 병용 요법:다른 약제를 갖는 항 바이러스 조성물
대상체가 필로바이러스 감염 또는 그 증상의 치료를 위해 하나 이상의 다른 치료제를 처방 및 투여한 것을 제외하고는 상기 방법 A를 따른다. 이어서, 하나 이상의 다른 치료제가 항 바이러스 조성물과 함께, 또는 그 투여 이전 또는 이후에 투여될 수 있다. 하나 이상의 다른 치료제의 투여량 증량(또는 감량)이 또한 수행될 수 있다.
실시 예 13
대상체에서 플라비바이러스 감염의 치료
예시적인 플라비바이러스 감염은 황열병, 뎅기열, 일본 뇌염, 웨스트 나일 바이러스, 지카바이러스, 진드기성 뇌염, 캬사누르 삼림병, 알크후르마(Alkhurma) 질병, 치쿤군야 바이러스, 옴스크 출혈열, 포와산(Powassan) 바이러스 감염을 포함한다.
방법 A. 항 바이러스 조성물 요법
플라비바이러스 감염을 나타내는 대상체는 항 바이러스 조성물로 처방되고, 치료적으로 관련된 투여량은 일정 기간 동안 처방된 투여 요법에 따라 대상체에게 투여된다. 대상의 치료 반응 수준은 주기적으로 결정된다. 치료 반응 수준은 혈액 또는 혈장에서 대상체의 플라비바이러스 적정 농도를 결정함으로써 결정될 수 있다. 한 번의 투여량에서 치료 반응 수준이 너무 낮으면, 대상체에서 원하는 치료 반응 수준이 달성될 때까지 미리 정해진 투여량 증가 스케쥴에 따라 투여량이 증가된다. 항 바이러스 조성물에 의한 대상체의 치료는 필요에 따라 계속되고, 환자가 원하는 임상 종점에 도달할 때까지 투여량 또는 투여 요법을 필요에 따라 조절할 수 있다.
방법 B. 병용 요법:다른 약제를 갖는 항 바이러스 조성물
플라비바이러스 감염 또는 그 증상의 치료를 위해 대상체에 하나 이상의 다른 치료제로 처방하고 투여한 것을 제외하고는 상기 방법 A를 따른다. 이어서, 하나 이상의 다른 치료제가 항 바이러스 조성물과 함께, 또는 그 투여 이전 또는 이후에 투여될 수 있다. 하나 이상의 다른 치료제의 투여량 증량(또는 감량)이 또한 수행될 수 있다.
실시 예 14
지카바이러스 및 뎅기 바이러스에 대한 항 바이러스 활성 평가
CPE-기반 항 바이러스 분석은 일정 농도 범위에서 시험 조성물의 존재 또는 부재하에서 표적 세포를 감염시킴으로써 수행되었다. 표적 세포의 감염은 세포 병변 효과 및 세포 사멸을 초래한다. 이러한 유형의 분석에서, 시험 조성물의 존재하에서 CPE의 감소 및 이에 상응하는 세포 생존력의 증가는 항 바이러스 활성의 지표로서 사용된다. CPE-기반 분석의 경우, 중립적 적색 판독(red readout)으로 세포 생존력을 결정하였다. 생존 세포는 그 리소좀내에 중성 적색을 포함한다. 중성 적색의 흡수는 살아있는 세포가 세포질에서 보다 리소좀 내에서 더 낮은 pH를 유지하는 능력에 의존하며, 이 활성 과정은 ATP를 필요로 한다. 리소좀 내부에 들어가면, 중성 적색 염료가 충전되어 세포 내에 유지된다. 중성 적색(0.033 %)과의 3 시간 배양 후, 세포 외 염료를 제거하고, 세포를 PBS로 세척하고, 세포 내 중성 적색을 50 % 에탄올 + 1 % 아세트산 용액으로 용해시켰다. 490 nm에서 각각의 웰(well)의 흡광도(광학 밀도)를 판독하여, 용액내 중성 적색의 양을 정량화하였다.
부착성(adherent) 세포주는 바이러스 패널에 대한 조성물의 항 바이러스 활성을 평가하기 위해 사용되었다. 바이러스를 세포에 첨가하기 전에, 조성물을 표적 세포와 함께 30 분 동안 사전 배양하였다. 조성물은 감염 배양 기간 동안, 세포 배양 배지에 존재하였다. 각각의 감염 분석에 대해, 바이러스가 없는 상태에서 조성물의 세포 독성 효과를 결정하기 위해 동일한 농도의 조성물(복제물)을 사용하여 생존력 분석을 병렬적으로 수립하였다.
시험 조성물의 항 바이러스 활성은 시험 조건 하의 세포의 감염 수준(면역 염색-기반 분석) 또는 생존력(CPE-기반 분석)을, 감염되지 않은 세포의 감염 수준 또는 생존력과 비교함으로써 결정되었다. 억제제의 존재 하의 생존력을 모의-처리된 세포의 생존력과 비교함으로써, 감염되지 않은 세포에서 세포 독성 효과를 평가하였다. 세포 독성은 XTT 생존력 분석에 의해 결정되었으며, 이는 상응하는 감염 분석을 위한 판독과 동일한 시점에서 수행되었다.
시험 조성물을 100 % 메탄올에 용해시켰다. 시험된 최고 농도로서 50 μM로 시작하여, 8-배 희석을 수행함으로써, 8 가지 농도의 조성물이(중복으로) 생성되었다. 조성물의 가장 높은 시험 농도(50 μM)는 배양 배지에서 0.25 % 최종 농도의 메탄올(v/v %)을 초래하였다. 8-배 희석 시리즈의 메탄올 비히클은 각 조성물 시험 조건에서 메탄올의 최종 농도를 반영하는 농도를 가지면서, 각각의 분석 플레이트에 포함되었다. 가능한 경우, 조성물의 EC50 및 CC50는 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어를 사용하여 각각의 분석에 대해 결정되었다.
항 바이러스 활성은 바이러스-유도된 세포 병변 효과(CPE)에 대한 보호 정도에 의해 평가되었다. 상이한 농도의 대조군 또는 조성물의 존재 하에서 세포는 바이러스로 공격 받았다. CPE에 대한 보호 정도는 감염 후 6 일(ZIKV, 지카바이러스) 또는 감염 후 7 일(DENV, 뎅기바이러스) 후에, 다른 시험 조건에서 세포 생존력을 정량화하고, 비처리된 세포와 비히클 단독으로 처리된 세포(감염 배지)의 값을 비교함으로써 모니터링하였다.
중립 분석을 위한 품질 관리가 모든 플레이트에서 수행되어: i) 신호 대 배경(S/B) 값; ii) 공지된 억제제에 의한 억제, 및 iii) 모든 데이터 포인트의 변동 계수(C.V.)에 의해 측정된 분석의 변동을 결정한다. 감염 분석의 전체 변동은 3.4 % 내지 9.5 %의 범위였으며, 생존력 분석의 전체 변동은 1.4 % 내지 3.2 %의 범위였으며, 이는 모든 C.V.값들의 평균으로 계산되었다. 감염 분석에 대한 신호 대 배경(S/B)의 범위는 2.9에서 11.0이며, 생존력 분석에 대한 신호 대 배경(S/B)의 범위는 6.5에서 29.9였다.
뉴트럴 레드 판독으로 DENV2-유도된 세포 병변 효과(CPE)의 보호: DENV2 항 바이러스 분석을 위해, 08-10381 몬세라트 균주를 사용하였다. 바이러스 스톡은 C6/36 곤충 세포에서 생성되었다. 베로 세포(Cercopithecus aethiops에서 유래한 상피 신장 세포)를 5 % FBS(MEM5)와 함께 MEM에서 유지시켰다. 감염 및 생존력 분석 모두를 위해, 세포를 96-웰 투명 평평한 바닥 플레이트에 웰당 10,000 세포로 시딩하고(seeded), MEM5에서 37 ℃에서 24 시간 동안 유지시켰다. 감염 당일, 샘플을 1 % 소 혈청 알부민(BSA)과 함께 MEM을 사용하여 U-바닥 플레이트에서 8-배 희석하였다. 시험 물질 희석 물을 최종 농도 1.25X로 제조하고, 40μl을 표적 세포와 함께 37 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. 시험 물질 사전-배양 후, 1 % BSA와 함께 MEM에서 제조된 10μl의 바이러스 희석액을 각 웰에 첨가하고(웰당 50μl 최종 부피), 플레이트를 5 % CO2를 갖는 가습 인큐베이터에서 3 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 분석에 사용된 바이러스의 부피는 리바비린 및 DENV2의 공지된 억제제인 화합물 A3에 의해 억제된, 선형 범위의 신호를 생성하도록 미리 결정되었다. 감염 배양 후, 세포를 PBS로 세척한 다음, 2 % FBS(MEM2)를 함유하는 MEM으로 세척하여, 비결합(unbound) 바이러스를 제거하였다. 이어서, MEM2에서 1X 농도로 제조된 억제제 희석액을 함유하는 50μl의 배지를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 인큐베이터(5 % CO2)에서 7 일 동안 37 ℃에서 배양하였다. 바이러스가 없는 대조군( "모의-감염된"), 배지 단독으로 배양된 감염된 세포, 비히클(메탄올) 단독으로 배양된 감염된 세포, 및 세포가 없는 웰(배경을 결정하기 위해)을 분석 플레이트에 포함시켰다. 50μM 리바비린 및 0.5μM 화합물 A3을 함유하는 대조 웰을 또한 분석 플레이트 상에 포함시켰다. 감염 7 일 후, 세포 생존률을 모니터링하기 위해 세포를 중성 적색으로 염색하였다. 감염 배지에서 일련의 8-배 희석액을 사용하여 시험 물질을 중복으로 반복해서 평가하였다. 대조군은 바이러스 없이 배양된 세포("모의-감염된"), 배지 단독으로 배양된 감염된 세포, 또는 리바비린(0.5μM) 또는 A3(0.5μM)의 존재하에 감염된 세포를 포함하였다. 메탄올 비히클만을 사용한 완전 복제 억제 곡선이 동일한 분석 플레이트 상에 포함되었다.
뉴트럴 레드 판독으로 ZIKV-유도된 세포 병변 효과(CPE)의 보호: ZIKV 항 바이러스 분석을 위해, PLCal_ZV 균주가 사용되었다. 베로 세포(Cercopithecus aethiops에서 유래한 상피 신장 세포)를 5 % FBS(MEM5)와 함께 MEM에서 유지시켰다. 감염 및 생존률 분석 모두를 위해, 세포를 96-웰 투명 평평한 바닥 플레이트에 웰당 10,000 세포로 시딩하고, MEM5에서 24 시간 동안 37 ℃로 유지시켰다. 감염 당일, 샘플을 1 % 소 혈청 알부민(BSA)과 함께 MEM을 사용하여 U-바닥 플레이트에서 8-배 희석하였다. 시험 물질 희석 물을 최종 농도 1.25X로 제조하고, 40μl를 표적 세포와 함께 37 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. 시험 물질 사전-배양 후, 1 % BSA와 함께 MEM에서 제조된 10μl의 바이러스 희석액을 각 웰에 첨가하고(웰당 50μl 최종 부피), 플레이트를 5 % CO2의 가습 인큐베이터에서 3 시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. 감염 배양 후, 세포를 PBS로 세척한 다음, 2 % FBS(MEM2)를 함유하는 MEM으로 세척하여, 비결합 바이러스를 제거하였다. 이어서, MEM2에서 1X 농도로 제조된 억제제 희석액을 함유하는 50μl의 배지를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 인큐베이터(5 % CO2)에서 6 일 동안 37 ℃에서 배양하였다. 바이러스가 없는 대조군( "모의-감염된"), 배지 단독으로 배양된 감염된 세포, 비히클(메탄올) 단독으로 배양된 감염된 세포, 및 세포가 없는 웰(배경을 결정하기 위해)을 분석 플레이트에 포함시켰다. 감염 6 일 후, 세포 생존률을 모니터링하기 위해 세포를 중성 적색으로 염색하였다. 감염 배지에서 일련의 8 배 희석액을 사용하여, 시험 물질을 2 회 반복하여 평가하였다. 대조군은 바이러스 없이 배양된 세포("모의-감염된"), 배지 단독으로 배양된 감염된 세포, 또는 A3(0.5μM)의 존재하에 감염된 세포를 포함하였다. 메탄올 비히클만을 사용한 완전 복제 억제 곡선은 동일한 분석 플레이트 상에 포함되었다.
CPE-기반 생존력 데이터의 분석: 중성 적색 분석의 경우, 490 nm에서의 흡광도를 모니터링함으로써 세포 생존력을 결정하였다. 세포가 없는 웰에서 얻은 평균 신호를 모든 샘플로부터 제하였다. 이어서, 모든 데이터 포인트는 동일한 분석 플레이트상에서 모의(감염되지 않은) 세포의 8 개 웰에서 관찰된 평균 신호의 백분율로서 계산되었다. 배지 단독으로 처리된 감염된 세포는 감염되지 않은 세포에서 관찰된 것의 평균 4.2 %(HRV의 경우), 26.9 %(DENV의 경우) 및 5.1 %(ZIKV의 경우)로 신호를 감소시켰다. 이 분석에 대한 신호 대 배경(S/B)은 2.9(DENV의 경우) 및 7.2(ZIKV의 경우)였는데, 이는 비히클만으로 처리된 감염된 세포의 생존력과 비교되는, "모의-감염된" 세포에서의 생존력 백분율로 결정되었다.
화합물-유도된 세포 독성을 평가하기 위한 생존력 분석(XTT): 모의-감염된 세포를 상응하는 감염 분석에 사용된 것과 동일한 실험 설정 및 억제제 농도를 사용하여, 억제제 희석액과 함께(또는 배지 단독으로) 배양하였다. 배양 온도 및 배양 기간은 상응하는 감염 분석의 조건을 반영하였다. 세포 생존력은 XTT 방법으로 평가되었다. XTT 분석은 미토콘드리아 활성을 측정하고, 오렌지 포마잔 염료를 형성하는 황색 테트라졸륨 염(XTT)의 분할(cleavage)에 기초한다. 반응은 활성 미토콘드리아가 있는 생존 세포에서만 일어난다. 포마잔 염료는 스캐닝 다중-웰 분광 광도계를 사용하여 직접 정량화된다. 세포가 없는 웰로부터 얻은 배경 수준을 모든 데이터 포인트로부터 제하였다.(각각의 올레아드린 시험 웰의 최종 퍼센트 메탄올을 반영하는 7개의 농도로) 메탄올 비히클만을 갖는 대조군을 생존력 분석 플레이트에 포함시켰다. 490 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 생존력 정도를 모니터링하였다.
세포 독성 데이터의 분석: XTT 분석의 경우, 490 nm에서의 흡광도를 모니터링함으로써 세포 생존력을 결정하였다. 세포가 없는 웰에서 얻은 평균 신호를 모든 샘플로부터 제하였다. 이어서, 모든 데이터 포인트를 동일한 분석 플레이트상에서 모의(감염되지 않은) 세포의 8 개 웰에서 관찰된 평균 신호의 백분율로 계산하였다. 이 분석에 대한 신호 대 배경(S/B)은 29.9(IVA의 경우), 8.7(HRV의 경우), 6.5(DENV의 경우) 및 6.7(ZIKV의 경우)이였는데, 이는 세포 없는 웰에 대해 관찰된 신호와 비교되는, "모의-감염된" 세포의 생존력 백분율로 결정되었다.
실시 예 15
필로바이러스(에볼라바이러스 및 마르부르그바이러스)에 대한 항 바이러스 활성 평가
방법 A.
베로 E6 세포는 올레안드린 함유 식물 추출물인 올레안드린, 디곡신 또는 PBI-05204의 존재하에 EBOV/Kik(A, MOI = 1) 또는 MARV/Ci67(B, MOI = 1)로 감염되었다. 1 시간 후, 접종원 및 화합물을 제거하고, 신선한 배지를 세포에 첨가하였다. 48 시간 후, 세포를 고정시키고, 면역 염색하여 EBOV 또는 MARV로 감염된 세포를 검출하였다. 감염된 세포를 오페레타(Operetta)를 사용하여 열거하였다. C) 베로 E6를 상기와 같이 화합물로 처리하였다. ATP 수준은 세포 생존력의 측정으로서 CellTiter-Glo에 의해 측정되었다.
방법 B.
베로 E6 세포를 EBOV(A, B) 또는 MARV(C, D)로 감염시켰다. 감염 후 2 시간(A, C) 또는 감염 후 24 시간(B, D)에, 올레안드린 또는 PBI-05204를 1 시간 동안 세포에 첨가한 후, 폐기하고, 세포를 배양 배지로 리턴시켰다. 감염 48 시간 후, 감염된 세포를 도 1에서와 같이 분석하였다.
방법 C.
베로 E6 세포를 올레안드린 또는 PBI-05204의 존재하에서 EBOV 또는 MARV로 감염시키고, 48 시간 동안 배양하였다. 감염된 세포 배양물로부터의 상청액(supernatant)을 새로운 베로 E6 세포에 통과시키고, 1 시간 동안 배양한 다음, 폐기하였다(A에 도시된 바와 같이). 통과된 상청액을 함유하는 세포를 48 시간 동안 배양하였다. EBOV(B) 또는 MARV(C)로 감염된 세포는 전술한 바와 같이 검출되었다. 대조군 감염률은 EBOV의 경우 66 %, MARV의 경우 67 %였다.
실시 예 16
토가비리대(토가비리대) 바이러스에 대한 항 바이러스 활성 평가
(알파바이러스: VEEV 및 WEEV)
베로 E6 세포를 지시된 화합물의 존재 또는 부재하에서, 18 시간 동안 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(A, MOI = 0.01) 또는 웨스턴 말 뇌염 바이러스(B, MOI = 0.1)로 감염시켰다. 감염된 세포를 본원에 기재된 바와 같이 검출하고 오페레타에 열거하였다.
실시 예 17
대상체에서의 파라믹소비리대 감염의 치료
예시적인 파라믹소비리대(파라믹소비리대) 과 바이러스 감염은 헤니파바이러스 속 감염, 니파 바이러스 감염, 또는 헨드라 바이러스 감염을 포함한다.
방법 A. 항 바이러스 조성물 요법
파라믹소비리대 과 감염을 나타내는 대상체는 항 바이러스 조성물로 처방되고, 치료적으로 관련된 투여량은 소정의 투여 요법에 따라 일정 기간 동안 대상체에게 투여된다. 대상체의 치료 반응 수준은 주기적으로 결정된다. 치료 반응 수준은 혈액 또는 혈장에서 대상체의 바이러스 적정 농도를 결정함으로써 결정될 수 있다. 한 번의 투여량에서 치료 반응 수준이 너무 낮으면, 대상체에서 원하는 치료 반응 수준이 달성될 때까지 미리 정해진 투여량 증가 스케쥴에 따라 투여량이 증가된다. 항 바이러스 조성물에 의한 대상체의 치료는 필요에 따라 계속되고, 환자가 원하는 임상 종점에 도달할 때까지 투여량 또는 투여 요법을 필요에 따라 조절할 수 있다.
방법 B. 병용 요법:다른 약제와의 항 바이러스 조성물
파라믹소비리대 과 감염 또는 그 증상의 치료를 위해, 대상체에 하나 이상의 다른 치료제로 처방하고 투여한 것을 제외하고는 상기 방법 A를 따른다. 이어서, 하나 이상의 다른 치료제가 항 바이러스 조성물과 함께, 또는 그 투여 이전 또는 이후에 투여될 수 있다. 하나 이상의 다른 치료제의 투여량 증량(또는 감량)이 또한 수행될 수 있다.
실시 예 18
1 차 huPBMC의 세포주 및 분리
바이러스를 생산하는 HTLV-1-형질 전환(HTLV-1+) SLB1 림프종 T-세포주(Arnold et al., 2008; P. Green, The Ohio State University-Comprehensive Cancer Center에서 친절하게 제공됨) 이스코브(Iscove)의 수정된 둘벡코 배지(Modified Dulbecco's Medium(IMDM; ATCC No. 30-2005)에서, 10 % CO2하에서 37 ℃의 가습 배양기에서 배양되었고, 10 % 열-불활성화 된 소 태아 혈청(FBS; Biowest), 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신-설페이트 및 20 ㎍/ml 젠타마이신-설페이트(Life Technologies)가 보충되었다.
1 차 인간 말초 혈액 단핵 세포(huPBMC)는 전혈 샘플에서 분리되었으며, SMU Institutional Review Board 및 Helsinki principle의 선언과 일치하는 프로토콜하에서, SMU Memorial Health Center에 의해 식별자 없이 제공되었다. 간단히 말해서, 2ml의 전혈을 폴리프로필렌 원뿔형 튜브(Corning)에서 동일한 부피의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4와 혼합한 다음, 샘플을 3ml의 림프구 분리 배지(MP Biomedicals)위에 부드럽게 쌓았다. 샘플은 실온에서 스윙하는 버킷 로터에서 400 x g로 30 분 동안 원심 분리되었다. 이어서, 버피 코트 huPBMC를 흡인하고, RPMI-1640 배지(ATCC 번호 30-2001)에서 2 회 세척하고, 260 x g에서 7 분 동안 원심 분리하여 펠릿화하였다. 세포를 20 % FBS, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토 마이신-설페이트, 20 ㎍/ml 젠타마이신-설페이트 및 50 U/ml 재조합 인간 인터루킨-2(hu-IL-2; Roche Applied Science)가 보충된 RPMI-1640 배지에서 재현탁시켰다. 10ng/ml 식물적혈구응집소(phytohemagglutinin)(PHA; Sigma-Aldrich)로 24 시간 동안 자극하고, 가습 인큐베이터에서 10 % CO2 하에서 37 ℃에서 성장시켰다. 다음날 260 xg에서 7 분 동안 원심 분리하여 세포를 펠렛화하고, RPMI-1640 배지로 2 회 세척하여 PHA를 제거한 다음, 항생제와 50 U/ml hu-IL-2를 보충한 완전 배지에서 재현탁 및 배양하였다.
실시 예 19
GFP-발현 HTLV-1 + SLB1/pLenti-GFP T-세포 클론의 생성
GFP 발현 HTLV-1 + SLB1 T-세포 클론을 생성하기 위해, 2x106 SLB1 세포를 IMDM의 60 mm2 조직 배양 접시(Corning)에 플레이팅하고, 10 % 열-불활성화된 FBS 및 항생제를 보충한 다음, 블라스티시딘 내성 유전자를 운반하는 pLenti-6.2/V5-DEST-녹색 형광 단백질 발현 벡터를 함유하는 렌티바이러스 입자로 형질 도입하였다. 6 시간 후, 형질 도입된 세포를 실온에서 260 xg에서 7 분 동안 원심 분리하여 펠릿화하고, 무-혈청 IMDM으로 2 회 세척하고, 5 ㎍/ml 블라스티시딘(Life Technologies)이 보충된 완전한 배지에 재현탁하고, 96-웰 마이크로타이터 플레이트(코닝)에 분취하였다. 배양은 37 ℃ 및 10 % CO2의 가습 인큐베이터에서 2 주 동안 블라스티시딘-선택으로 유지되었다. GFP 발현 림프 모세포를 형광 현미경으로 스크리닝한 다음, 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 제한 희석에 의해 플레이팅하여, 균질한 GFP 발현 세포 클론을 얻었다. 생성된 HTLV-1 + SLB1/pLenti-GFP T-림프구 클론을 확장하고 반복적으로 통과하고; GFP의 발현은 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE) 및 래빗 폴리클로날 항-GFP(FL) 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 사용한 면역 블롯팅으로 확인되었다.
실시 예 20
Anti-HTLV-1 p19Gag ELISA에 의한 바이러스 생산 및 입자 감염의 정량화
HTLV-1 프로바이러스 복제 및 새로 합성된 세포 외 바이러스 입자의 방출에 대한 올레안드린 또는 N. oleander 추출물의 효과를 확인하기 위해, HTLV-1 + SLB1 림프종 T-세포주를 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 항생제가 보충된 300 ㎕의 완전 배지에서 웰당 2x104 세포로 플레이팅하고, 10 % CO2 하에서 37 ℃에서 배양하였다. 정제된 올레안드린 화합물 및 N. oleander 추출물(Phoenix Biotechnology; Singh et al., 2013 참조)은 2 mg/ml의 스톡 농도로 비히클 용액(MilliQ 증류/탈이온 H2O에서 20 % v/v 디메틸 설폭사이드, DMSO)에서 재현탁되고, 루어 락 0.2㎛ 주사기 필터(Millipore)를 사용하여 멸균되었다. HTLV-1 + SLB1 세포를 10, 50 및 100 ㎍/ml 농도의 올레안드린 또는 N. oleander 추출물, 또는 증가하는 비히클 대조군의 양(1.5, 7.5 및 15 ㎕)으로 72 시간 동안 처리했다. 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 Eppendorf A-2-DWP 스윙 플레이트 로터를 사용하여 실온에서 260 xg로 7 분 동안 원심 분리하여, 세포를 펠릿화하고, 배양물 상청액으로 방출된 세포 외 p19Gag 함유 HTLV-1 입자의 수준을 비색법(colorimetric) Anti-p19Gag 효소-결합 면역 흡착 분석(ELISAs; Zeptometrix)을 수행하여 p19Gag 단백질 표준에 대해 정량화하였다. 흡광도 모드에서 450nm에서 Berthold Tristar LB 941 다중 모드 마이크로플레이트-판독기에서 3 중 복제로 샘플을 분석했다.
올레안드린 처리된 세포로부터 수집된 새로 합성된 세포 외 HTLV-1 입자의 감염성을 평가하기 위해, 2x104 HTLV-1 + SLB1 T-림프 모세포를 항생제가 보충된 300㎕의 완전 배지에 플레이팅하고, 배양액을 증가하는 농도(10, 50 및 100 ㎍/ml)의 올레안드린 또는 N. oleander 추출물 또는 비히클 대조군(1.5, 7.5 및 15 ㎕)으로 72 시간 동안 처리하였다. 그런 다음, 바이러스 함유 상청액 50㎕를 사용하여 항생제와 hu-IL-2가 보충된 완전한 배지에서 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 웰당 2x104 세포 밀도로 플레이트된 huPBMC를 직접 감염시켰다. 올레안드린 화합물, N. oleander 추출물 또는 비히클 대조군은 새로 생성된 입자에 의한 가능한 재감염 이벤트를 제어하기 위해, huPBMC 배양 배지에 유지되었다. 72 시간 후, 감염된 huPBMC에 의해 배양 상청액으로 방출된 세포 외 p19Gag 함유 HTLV-1 비리온의 상대적 수준을 Anti-HTLV-1 p19Gag ELISA를 통해 정량화하였다.
실시 예 21
세포 사멸 측정
처리된 세포 배양물에서 올레안드린 화합물, N. oleander 추출물 또는 비히클 대조군의 상대적 세포 독성을 평가하기 위해, 2x104 HTLV-1 + SLB1 림프종 T-세포 또는 활성화/배양된 huPBMC를 항생제가 보충된 300㎕의 완전 배지에 플레이트하고, 가습 배양기에서 10 % CO2 하에서 37 ℃로 유지하였다. 배양액을 증가하는 농도(10, 50 및 100 ㎍/ml)의 올레안드린 또는 N. oleander 추출물 또는 비히클 대조군(1.5, 7.5, 15ml)으로 처리하고, 72 시간 동안 배양했다. 시클로포스파미드(50 μM; Sigma-Aldrich)-처리된 세포는 세포 사멸에 대한 양성 대조군으로 포함되었다. 이후, 세포를 흡인하고 Poly-L-Lysine 및 콘카나발린(Concanavalin) A(1mg/ml; Sigma-Aldrich)의 멸균 0.01 % 용액으로 전처리한 Permanox 8-챔버 조직-배양 슬라이드(Nalge)에 플레이팅했다. 샘플은 이후에 플루오레세인 이소티오시아네이트(Annexin V-FITC) 및 프로피듐 요오드화물(PI; BD-Pharmingen)에 컨쥬게이트된 아넥신 V를 갖는 현미경 세포 사멸 검출 키트를 사용하여 염색되었고, 필드 당 세포의 세포 사멸의 상대적 백분율(즉, Annexin V-FITC 및/또는 PI-양성)은 20x 대물 렌즈를 사용하여 공 초점 형광 현미경 법에 의해 삼중으로 정량화되었다. 필드 당 총 세포 수는 DIC 위상차 필터를 사용하여 현미경으로 정량화되었다.
실시 예 22
공동 배양 분석에서 HTLV-1 전파 및 바이러스 시냅스 형성
HTLV-1의 전파는 일반적으로 바이러스 시냅스를 통해 감염된 세포와 감염되지 않은 표적 세포 사이의 직접 접촉을 통해 발생하므로(Igakura et al., 2003; Pais-Correia et al., 2010; Gross et al., 2016 ; Omsland et al., 2018; Majorovits et al., 2008), 우리는 올레안드린, N. oleander 추출물 또는 비히클 대조군이 바이러스 시냅스 형성 및/또는 시험 관내 세포 간 상호 작용을 통한 감염성 HTLV-1 입자의 전파에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 테스트했다. 이 실험을 위해 2x104 바이러스-생성 HTLV-1 + SLB1 T 세포를 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 플레이팅하고, 10% CO2 하에 37 ℃에서, 300μl의 완전 배지에서 2 시간 동안 미토마이신 C(100㎍/ml)으로 처리했다(Bryja et al., 2006). 그런 다음, 배양 배지를 제거하고, 세포를 무-혈청 IMDM으로 2 회 세척하고, 세포를 증가하는 농도(10, 50 및 100 ㎍/ml)의 올레안드린 또는 N. oleander 추출물, 또는 비이클 대조군(1.5, 7.5 및 15 ㎕)으로 15 분 또는 3 시간 동안 처리했다. 대안으로, GFP-발현 HTLV-1 + SLB1/pLenti-GFP T 세포의 2x104를 300 ㎕의 완전 배지에서 8-챔버 조직 배양 슬라이드에 플레이팅하고, 미토마이신 C로 처리하고, 무-혈청 IMDM으로 2 회 세척하고, 공 초점 현미경 실험에 대해 설명된 바와 같이, 올레안드린, N. oleander 추출물 또는 비이클 대조군으로 처리하였다. 그 다음, 배지를 흡인하고, HTLV-1 + SLB1 세포를 무-혈청 배지로 2 회 세척하고, 20 % FBS, 항생제 및 50U/ml hu-IL-2가 보충된 300㎕의 RPMI-1640 배지에서 각 웰에 2x104 huPBMC를 추가하였고, 그 다음, 10% CO2 하에 37 ℃에서 또 다른 72 시간 동안(SLB1/pLenti-GFP 림프 모세포를 사용하는 공 초점 현미경에 의해 바이러스 시냅스 형성 및 바이러스 전파를 시각화하기 위해 6 시간 동안 공동 배양하였다) 가습 배양기에서 세포를 공동 배양하였다. 음성 대조군으로, huPBMC는 바이러스-생성 세포가 없는 상태에서 단독으로 배양되었다. 올레안드린, N. oleander 추출물 및 비히클은 공동 배양 배지에서 유지되었다. Anti-HTLV-1 p19Gag ELISA를 수행하여 세포 간 바이러스 전파의 결과로 공동 배양 상청액으로 방출된 세포 외 p19Gag 함유 HTLV-1 입자의 상대적 수준을 정량화하였다. GFP 양성 HTLV-1 + SLB/pLenti-GFP 세포와 huPBMC 사이에 형성된 바이러스 시냅스는 고정된 샘플을 Anti-HTLV-1 gp21Env 1 차 항체와 로다민 적색-컨쥬게이티드 2 차 항체로 염색함으로써, 면역 형광-공 초점 현미경을 사용하여 시각화했다. 디아미디노-2-페닐-인돌, 디히드로클로라이드(DAPI; Molecular Probes) 핵 염색은 비교를 위해 그리고 감염되지 않은(즉, HTLV-1-음성) 세포를 시각화하기 위해 포함되었다. 공동 배양 분석에서 huPBMC 로의 HTLV-1의 세포 간 전파는 20x 대물 렌즈를 사용하여 20 개의 시야에서 HTLV-1 gp21Env-양성(및 GFP-음성) huPBMC의 상대적 백분율을 계산하여 정량화되었다.
실시 예 23
현미경 검사
세포의 세포 사멸 및 세포 독성을 정량화하기 위한 아넥신 V-FITC/PI-염색 샘플은 Plan-Apochromat 20x/0.8 대물 렌즈 및 Zeiss ZEN 시스템 소프트웨어(Carl Zeiss Microscopy)를 사용하며, Airyscan 검출기와 단계 CO2 인큐베이터가 장착된 Zeiss LSM800 기기에서 공 초점 형광 현미경으로 시각화되었다. 미토마이신 C-처리 된 HTLV-1 + SLB1/pLenti-GFP 림프 모세포와 배양된 huPBMC 사이의 바이러스학적 시냅스 및 바이러스 전파(즉, Anti-HTLV-1 gp21Env-양성 huPBMC의 상대적 백분율을 정량화하여 결정됨)의 형성은 Plan-Apochromat 20x/0.8 대물 렌즈를 사용한 면역 형광-공 초점 현미경에 의해 시각화되었다. DAPI, Anti-HTLV-1 gp21Env-특이적(로다민 적색-양성) 및 GFP 신호의 상대 형광 강도는 Zen 2.5D 분석 도구(Carl Zeiss Microscopy)를 사용하여 그래픽으로 정량화되었다. GFP-발현 HTLV-1 + SLB1/pLenti-GFP T 세포 클론은 Plan Fluor 10x/0.30 대물 렌즈 및 DIC 위상차 필터(Nikon Instruments)를 사용하며, 633nm 및 543nm He/Ne 및 488nm Ar 레이저가 장착된 Nikon Eclipse TE2000-U inverted 현미경 및 D-Eclipse 공 초점 이미징 시스템에서 공 초점 형광 현미경으로 스크리닝되었다.
실시 예 24
통계 분석
실험 데이터 세트의 통계적 유의성은 쌍을 이루지 않은 양측 스튜던트 t-검정(알파 = 0.05)을 사용하여 결정하였고, Shapiro-Wilk 정규성 테스트 및 Graphpad Prism 7.03 소프트웨어를 사용하여 P-값을 계산했다. P-값은 0.1234(ns), 0.0332(*), 0.0021(**), 0.0002(***), <0.0001(****)로 정의되었다. 달리 명시되지 않는 한, 에러 바는 최소 세 번의 독립적인 실험으로부터 얻은 SEM을 나타낸다.
실시 예 25
대상체에서의 델타레트로 바이러스 감염 치료
예시적인 델타레트로 바이러스 감염은 HTLV-1을 포함한다.
방법 A. 항 바이러스 조성물 요법
HTLV-1 감염을 보이는 대상체는 항 바이러스 조성물을 처방받고, 치료적으로 적절한 용량이 일정 기간 동안 처방된 투여 요법에 따라 대상체에게 투여된다. 대상체의 치료 반응 수준은 주기적으로 결정된다. 치료 반응의 수준은 혈액 또는 혈장에서 대상체의 HTLV-1 바이러스 역가를 측정하여 결정할 수 있다. 치료 반응 수준이 1 회 투여량에서 너무 낮으면, 대상체에서 원하는 치료 반응 수준이 달성될 때까지 미리 결정된 투여량 증량 일정에 따라 투여량이 증량된다. 항 바이러스성 조성물로 대상체를 치료하는 것은 필요에 따라 계속되고, 환자가 원하는 임상 종점에 도달할 때까지 필요에 따라 투여량 또는 투여 요법을 조정할 수 있다.
방법 B. 병용 요법: 항 바이러스 조성물과 다른 약제
대상체가 HTLV-1 감염 또는 이의 증상을 치료하기 위해 하나 이상의 다른 치료제를 처방 및 투여받는 것을 제외하고는 상기 방법 A를 따른다. 그 후, 하나 이상의 다른 치료제가 항 바이러스 조성물 투여 이전, 이후 또는 함께 투여될 수 있다. 하나 이상의 다른 치료제의 투여량 증량(또는 감량)도 수행할 수 있다. 예시적인 다른 치료제가 본원에 기재되어 있다.
실시 예 26
대상체의 CoV 감염 치료
예시적인 CoV 감염은 SARS-CoV, MERS-CoV, COVID-19(SARS-CoV-2), CoV 229E, CoV NL63, CoV OC43, CoV HKU1 및 CoV HKU20를 포함한다.
방법 A. 항 바이러스 조성물 요법
CoV 감염을 보이는 대상체는 항 바이러스 조성물을 처방받고, 치료적으로 적절한 용량이 일정 기간 동안 처방된 투여 요법에 따라 대상체에게 투여된다. 대상체의 치료 반응 수준은 주기적으로 결정된다. 치료 반응의 수준은 혈액 또는 혈장에서 대상체의 CoV 바이러스 역가를 측정하여 결정할 수 있다. 치료 반응 수준이 1 회 투여량에서 너무 낮으면, 대상체에서 원하는 치료 반응 수준이 달성될 때까지 미리 결정된 투여량 증량 일정에 따라 투여량이 증량된다. 항 바이러스성 조성물로 대상체를 치료하는 것은 필요에 따라 계속되고, 환자가 원하는 임상 종점에 도달할 때까지 필요에 따라 투여량 또는 투여 요법을 조정할 수 있다.
방법 B. 병용 요법:항 바이러스 조성물과 다른 약제
대상체가 CoV 감염 또는 이의 증상을 치료하기 위해 하나 이상의 다른 치료제를 처방 및 투여받는 것을 제외하고는 상기 방법 A를 따른다. 그 후, 하나 이상의 다른 치료제가 항 바이러스 조성물 투여 이전, 이후 또는 함께 투여될 수 있다. 하나 이상의 다른 치료제의 투여량 증량(또는 감량)도 수행할 수 있다. 예시적인 다른 치료제가 본원에 기재되어 있다.
실시 예 27
ANVIRZEL™을 사용하여 대상체의 COVID-19 감염 치료
COVID-19와 관련된 증상을 치료하기 위해 COVID-19에 걸린 어린이(유아)에게 다음과 같이 ANVIRZEL™을 투여했다. ANVIRZEL™을 투여하기 전에 대상체의 바이러스 감염이 악화되었다. 대상체는 다음 투여 요법에 따라 ANVIRZEL™을 처방하고 투여했다: 초기 투여량-재구성된 ANVIRZEL™ 0.25 mL, 이어서 2 내지 3 일 동안 12 시간마다 재구성된 ANVIRZEL™ 0.5 mL를 투여했다. 대상체의 COVID-19 감염은 해결되었고, 약물 관련 독성은 관찰되지 않았다.
실시 예 28
COVID-19 바이러스에 대한 올레안드린의 체외 평가
이 연구의 목적은 자손 비리온의 감염성에 대한 올레안드린의 영향을 결정하기 위한 것이었다.
메탄올 중의 올레안드린 스톡 용액(10 mg 올레안드린/mL)을 준비하였다. 스톡 용액은 DMSO(수성 배양 배지 RPMI 1640 및 올레안드린(20 ㎍/mL, 10 ㎍/mL, 1.0 ㎍/mL 또는 0.1 ㎍/mL)에서 0.1 % 또는 0.01 % v/v)를 함유하는 배양 배지를 준비하는 데 사용되었다. 배양액은 다음과 같다.
Figure 112020098766406-pct00020
배양물 중 감염되지 않은 Vero 세포(표적 초기 세포 수 1x106)를 37 ℃에서 30 분 동안 바이알에서 지시된 배양 배지 각각에서 배양하였다. SARS-CoV-2의 바이러스 접종물을 각 바이알에 첨가하여 표적 초기 바이러스 역가(약 PFU/mL 1x104)를 달성했다. 약 0.1의 표적 MOI(감염의 다중도). 용액을 37 ℃에서 추가 2 시간 동안 배양하여 Vero 세포를 감염시켰다. 감염된 Vero 세포를 대조군 비히클로 세척하여 세포 외 바이러스 및 올레안드린을 제거했다. 각 배양 배지의 새로운 분취량을 감염된 Vero 세포의 각 바이알에 첨가했다. 두 번째 분취량에서 올레안드린을 받은 것들은 "감염 후 + 처리"로 표시되었고, 두 번째 분취량에서 올레안드린을 받지 않은 것들은 "감염 후 - 처리"로 표시되었다(도 23A 내지 23D). 각 바이알에 대한 바이러스 역가는 감염 후 약 24 시간 및 약 48 시간에 결정되었다.
Vero 세포에 대한 올레안드린의 잠재적 독성을 결정하기 위한 수단으로, 상술한 내용에 기초한 아주 유사한 배양물이 감염되지 않은 Vero 세포를 위해 준비되었다.
획득된 데이터는 생성된 바이러스의 양, 자손 바이러스의 감염성, 및 감염된 세포와 감염되지 않은 세포에서의 올레안드린의 상대적 안전성(무독성)을 포함하였다.
실시 예 29
COVID-19 바이러스에 대한 올레안드린의 체외 평가
이 분석의 목적은 SARS-CoV-2에 대한 올레안드린의 직접적인 항 바이러스 활성을 결정하기 위한 것이었다.
성장 배지는 6-웰 플레이트에서 약 106 개의 Vero CCL81 세포의 합류 단층으로부터 제거되었다. 올레안드린을 배양 배지에서 연속 희석하고, 96 웰 플레이트에 시드된 Vero-E6 세포에 첨가했다. 성장 배지는 1.0㎍/ml, 0.5㎍/ml, 100ng/ml, 50ng/ml, 10ng/ml 또는 5ng/ml의 올레안드린, 또는 매칭되는 DMSO 전용 대조군을 포함하는 200μl의 유지 배지로 교체되었다. 플레이트는 바이러스를 첨가하기 전에 약 30 분 동안 37 ℃에서 배양되었다.
SARS-CoV-2 바이러스를 올레안드린 처리된 세포 및 처리되지 않은 세포에, 0.4(유입 분석) 또는 0.02(복제 분석)의 MOI(감염 다중도)로 첨가했다. 올레안드린은 37 ℃에서 1 시간 배양하는 동안 웰에 남아있었다.
1 시간 흡수 후, 접종 배지를 제거하고 PBS(표준 인산염 완충 식염수)로 1 회 세척하였다.
데이터 슬라이드에서 "전처리"로 지정된 올레안드린 처리된 웰에, 배지 단독(올레안드린 없음)을 다시 첨가했다. 표시된 농도의 올레안드린을 가진 배지를 데이터 슬라이드에서 "지속(duration)"으로 지정된 웰에 다시 추가했다.
감염 후 24(유입 분석) 또는 48(복제 분석) 시간에 플레이트를 고정시키고, 바이러스 특이적 항체 및 형광 표지된 2 차 항체로 면역 염색하였다.
Operetta를 사용하여 세포를 이미지화하고, Harmonia 소프트웨어의 맞춤형 알고리즘을 사용하여 데이터를 분석하여, 각 웰에서 감염된 세포의 백분율을 결정했다.
결과는 도 24a 및 도 24b에 도시되어 있다.
실시 예 30
Vero-E6 세포에 대한 올레안드린 독성의 체외 평가
이 분석의 목적은 Vero-E6 세포에 대한 올레안드린의 상대적 잠재적 독성을 결정하기 위한 것이었다.
올레안드린을 배양 배지에서 연속 희석하고, 96 웰 플레이트에 시드된 Vero-E6 세포에 첨가하고, 약 24 시간 동안 37 ℃에서 배양했다. CellTiter Glo 분석을 사용하여 세포 수를 얻었다.
결과는 도 25에 도시되어 있다.
실시 예 31
COVID-19 바이러스에 대한 올레안드린의 체외 평가
이 연구의 목적은 올레안드린 치료에 대한 COVID-19 바이러스의 용량 반응을 결정하기 위한 것이었다.
1㎍/mL, 0.5㎍/mL, 0.1㎍/mL, 0.05㎍/mL, 0.01㎍/mL 및 0.005㎍/mL의 낮은 농도의 올레안드린을 사용한 것을 제외하고는 실시 예 28의 절차를 반복하였다. 또한, VERO E6 세포 대신 VERO CCL-81 세포를 사용했다.
바이러스 역가는 실시 예 28에 따라 결정되었고, 바이러스 역가의 배수 감소는 대조군 샘플과 비교하여 계산되었다. 결과는 26a-26d, 27a-27d, 28a 및 28b에 도시되어 있다.
실시 예 32
설하 액체 제형
올레안드린을 포함하는 설하 제형는 올레안드린 또는 올레안드린-함유 조성물(예를 들어, 올레안드린-함유 추출물; 2 wt %)을 중쇄 트리글리세라이드(95 wt %) 및 향미제(3 wt %)와 혼합하여 제조하였다. 제형의 올레안드린 함량은 약 25 ㎍/mL였다.
실시 예 33
네리움 올리앤더의 임계 미만 유체 추출물의 제조
올레안드린 함유 추출물의 제조를 위한 개선된 공정은 네리움 올리앤더 바이오매스의 초 임계 유체 추출보다는 임계 미만 액체 추출을 사용하여 개발되었다.
건조되고 분말화된 바이오매스를 추출 챔버에 넣은 다음 밀봉했다. 이산화탄소(약 95 % wt) 및 알코올(약 5 % wt; 메탄올 또는 에탄올)이 챔버에 주입되었다. 챔버의 내부 온도 및 압력은 추출 매질이 추출 시간의 대부분 또는 실질적으로 모든 기간 동안, 온도는 약 2 ℃ 내지 약 16 ℃(약 7 ℃ 내지 약 8 ℃) 및 압력은 약 115 내지 약 135 bar(약 124 bar) 범위에서, 초 임계 유체 상이 아닌 임계 미만 액체 상으로 유지되도록 했다. 추출 기간은 약 4 시간 내지 약 12 시간(약 6 내지 약 10 시간)이었다. 추출 환경을 여과하고 상청액을 수집했다. 이산화탄소를 상청액에서 배출하고, 생성된 조 추출물을 에탄올(약 9 부 에탄올:약 1 부 추출물)로 희석하고, 약 -50 ℃에서 12 시간 이상 동안 동결시켰다. 용액을 해동하고 여과하였다(100 마이크론 기공 크기 필터). 여과액을 원래 부피의 약 10 %로 농축한 다음, 멸균 여과했다(0.2 마이크론 기공 크기 필터). 농축된 추출물을 50 % 수성 에탄올로 희석하여, 용액 mL 당 추출물 약 1.5mg의 농도로 만들었다.
생성된 임계 미만 액체(SbCL) 추출물은 올레안드린 및 네리움 올리앤더로부터 추출 가능한 하나 이상의 다른 화합물을 포함하며, 상기 하나 이상의 다른 화합물은 본원에 정의된 바와 같다.
실시 예 34
COVID-19 바이러스에 대한 올레안드린의 체외 평가
이 연구의 목적은 올레안드린 전처리없이 자손 비리 의 감염성에 대한 올레안드린의 영향을 결정하기 위한 것이었다(실시 예 28에 따름).
세포가 감염 전에 올레안드린으로 전처리되지 않은 것을 제외하고 실시 예 28의 절차를 반복하였다. 대신, 감염된 세포는 감염 후 12 시간 및 24 시간에 올레안드린 또는 대조군 비히클로 처리되었다. 더욱이, VERO E6 세포 대신 VERO CCL-81 세포를 사용했고, 더 낮은 농도의 올레안드린: 1㎍/mL, 0.5㎍/mL, 0.1㎍/mL 및 0.05㎍/mL을 사용했다. 데이터는 도 29a 및 도 29b에 도시되어 있다.
실시 예 35
COVID-19 바이러스에 대한 올레안드린의 생체 내 평가
이 연구의 목적은 이미 COVID-19 바이러스에 감염된 대상체를 치료하는 데 올레안드린 함유 추출물(OCE)의 효능을 결정하기 위한 것이었다.
광범위한 인구 통계학적 분포를 나타내고 COVID-19 감염을 나타내는 대상체를 평가하여, 실시 예 32의 제형에 따라 제조된 OCE의 설하, 협측 또는 구강 투여 전 임상 상태를 결정하였다. 조성물은 액체 방울을 대상체의 입에 떨어뜨림으로써, 대상체에게 안전하게 투여되었다. 투여 요법은 투여시 약 0.5mL 및 1일 4 회 투여(약 6 시간마다 1 회 투여)였으며, 이는 하루에 약 50㎍의 올레안드린에 해당한다. 대안적으로, 총 일일 투여량의 절반이 투여되었다. 모든 대상체는 완전한 회복을 경험했다.
실시 예 36
네리움 올리앤더의 에탄올 추출물의 제조
이것의 목적은 수성 에탄올로 네리움 올리앤더 바이오매스를 추출하여 에탄올 추출물을 제조하기 위한 것이었다.
분쇄된 건조 잎을 수성 에탄올(90 % v/v 에탄올; 10 % v/v 물)로 반복적으로 처리하였다. 조합된 에탄올 상청액을 조합하곡 여과한 다음, 진공에서 증발시켜 농축하여 그 안의 에탄올 및 물의 양을 줄이고, 추출물의 약 25mg의 올레안드린/mL을 포함하는 조 에탄올 추출물(약 50 % v/v 에탄올 함량을 가짐)을 제공하였다.
실시 예 37
네리움 올리앤더 추출물의 조합을 포함하는 제형의 제조
이것의 목적은 실시 예 36의 에탄올 추출물의 일부(1 wt %)를 실시 예 33의 SbCL 추출물의 일부(1 wt %), 중쇄 트리글리세리드(95 wt %) 및 향미제(3 wt %)와 조합한 것을 제외하고는, 실시 예 32에 따라 제형을 제조하기 위한 것이었다.
실시 예 38
COVID-19 바이러스에 대한 디곡신의 생체 내 평가
이 연구의 목적은 이미 COVID-19 바이러스에 감염된 대상체를 치료하는 데 디곡신 함유 조성물(DCC)의 효능을 결정하기 위한 것이다. 디곡신을 포함하는 시판되는 제형을 구입했다.
COVID-19 감염이 있는 대상체는 DCC의 경구 또는 전신 투여 전에 임상 상태를 결정하기 위해 평가되었다. 상업적으로 입수 가능한 조성물이 본원에 기술되어있다. 각각에 대한 안전한 투여 요법은 해당 NDA 및 패키지 삽입물에 설명되어 있다. 조성물은 의도된 투여 경로에 따라 각 대상체에게 안전하게 투여된다. 치료 반응을 결정하기 위해 임상 모니터링을 수행하고 그에 따라 투여량을 적정화하였다.
실시 예 39
올레안드린으로 처리한 SARS-CoV-2 감염에서 게놈 대 감염성 입자 비율의 결정
이 연구의 목적은 올레안드린에 의한 SARS-CoV-2의 억제가 전체 또는 감염성 입자 생성 수준인지 여부를 결정하기 위한 것이다.
샘플에 대한 게놈 카피를 정량화하기 위해, 표준 제조업체 프로토콜을 사용하고 11μl 물에 재현탁하여, TRIzol LS(Ambion, Carlsbad, CA)의 5:1 부피 비율로 200μl의 샘플을 추출했다. 추출된 RNA는 이전에 발표된 분석에 따라 qRT-PCR에 의해 SARS-CoV-2에 대해 테스트되었다(26). 간단히, N 유전자는 다음의 프라이머 및 프로브를 사용하여 증폭되었다: 포워드 프라이머 [5'-TAATCAGACAAGGAACTGATTA-3'](서열 번호 1); 리버스 프라이머 [5'-CGAAGGTGTGACTTCCATG-3'](서열 번호 2); 및 프로브 [5'-FAM-GCAAATTGTGCAATTTGCGG-TAMRA-3'](서열 번호 3). 제조업체 지침에 따라 iTaq Universal probes One-Step kit(BioRad, Hercules, CA)를 사용하여 20μl 반응 혼합물을 준비했다. 반응 혼합물(2x:10μL), iScript 역전사 효소(0.5μL), 프라이머(10μM:1.0 μL), 프로브(10μM:0.5 μL), 추출된 RNA(4μL) 및 물(3μL). qRT-PCR 반응은 Thermocycler StepOnePlus™ Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여 수행되었다. 반응물은 50 ℃에서 5 분 동안, 95 ℃에서 20 초 동안 배양한 다음, 95 ℃에서 5 초 동안 및 60 ℃에서 30 초 동안 40 사이클로 배양했다. 양성 대조군 RNA 서열(COVID-2019 게놈의 뉴클레오티드 26,044-29,883)을 사용하여 평가중인 샘플에서 N 유전자의 RNA 복제 수를 추정했다.
본원에 사용된 용어 "약" 또는 "대략"은 특정 값의 ±10 %, ±5 %, ±2.5 % 또는 ±1 %를 의미하는 것으로 간주된다. 본원에서 사용되는 용어 "실질적으로"는 "대부분" 또는 "적어도 대다수" 또는 "50 % 초과"를 의미하는 것으로 간주된다
상기 기재 내용이 본 발명의 특정 실시 예에 대한 상세한 설명이다. 본 발명의 특정 실시 예가 예시의 목적으로 여기에 설명되었지만, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서, 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구 범위에 의한 것을 제외하고는 제한되지 않는다. 본 명세서에 개시되고 청구된 모든 실시 예는 본 개시내용에 비추어 볼 때, 과도한 실험없이 제조 및 실행될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> PHOENIX BIOTECHNOLOGY, INC. <120> Method and Compositions for Treating Coronavirus Infection <130> PBI-22-PCT9 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward (5' to 3') primer sequence <400> 1 taatcagaca aggaactgat ta 22 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse (5' to 3') primer sequence <400> 2 cgaaggtgtg acttccatg 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe sequence (5'-FAM-sequence-TAMRA-3'); FAM is 6-fluorescein amidite; TAMRA is Carboxytetramethylrhodamine <400> 3 gcaaattgtg caatttgcgg 20

Claims (114)

  1. 항 바이러스 조성물로서,
    COVID-19(SARS-CoV-2) 코로나 바이러스 감염을 치료하는 데 사용하기 위한 올레안드린을 포함하고, 상기 항 바이러스 조성물의 하나 이상의 치료적 유효 투여량이 적어도 5 일 내지 1 개월 이상의 치료 기간 동안 이를 필요로 하는 대상체에게 매일 투여되는 항 바이러스 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 1 일당 올레안드린의 총 투여량은 각각의 경우에 독립적으로, 1 ㎍ 내지 180 ㎍, 1 ㎍ 내지 120 ㎍, 5 ㎍ 내지 100 ㎍, 10 ㎍ 내지 80 ㎍, 10 ㎍ 내지 75 ㎍, 15 ㎍ 내지 120 ㎍, 15 ㎍ 내지 100 ㎍, 15 ㎍ 내지 80 ㎍, 30 ㎍ 내지 120 ㎍, 30 ㎍ 내지 100 ㎍, 30 ㎍ 내지 90 ㎍, 40 ㎍ 내지 70 ㎍, 1 ㎍, 5 ㎍, 10 ㎍, 20 ㎍, 30 ㎍, 40 ㎍, 50 ㎍, 60 ㎍ , 70㎍, 80㎍, 90㎍, 100㎍, 110㎍, 120㎍, 130㎍, 140㎍, 150㎍, 160㎍, 170㎍, 180㎍, 140 ㎍ 내지 315 ㎍, 20 ㎍ 내지 750 ㎍, 12 ㎍ 내지 300 ㎍, 12 ㎍ 내지 120 ㎍, 0.01 ㎍ 내지 100 mg, 0.01 ㎍ 내지 100 ㎍, 0.5 내지 100 ㎍, 1 내지 80 ㎍, 1.5 내지 60 ㎍, 1.8 내지 60 ㎍, 및 1.8 내지 40 ㎍으로부터 선택되는 항 바이러스 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 투여량은 하루에 대상체의 체중 kg 당 올레안드린의 유닛 량을 기준으로, 0.05-0.5 mg/kg/일, 0.05-0.35 mg/kg/일, 0.05-0.22 mg/kg/일, 0.05-0.4 mg/kg/일, 0.05-0.3 mg/kg/일, 0.05-0.5 ㎍/kg/일, 0.05-0.35 ㎍/kg/일, 0.05-0.22 ㎍/kg/일, 0.05-0.4 ㎍/kg/일, 또는 0.05-0.3 ㎍/kg/일인 항 바이러스 조성물.
  4. 제1항에 있어서, a) 올레안드린의 1 일 투여량은 최대 100 ㎍/일, 80 ㎍/일, 60 ㎍/일, 40 ㎍/일, 38.4 ㎍/일 또는 30 ㎍/일; 및/또는 b) 올레안드린의 1 일 투여량은 최소 0.5 ㎍/일, 1 ㎍/일, 1.5 ㎍/일, 1.8 ㎍/일, 2 ㎍/일, 또는 5 ㎍/일인 항 바이러스 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 투여량은 1 일 2 회 또는 12 시간마다 투여되고, 상기 투여량에서 올레안드린의 양은 0.25 내지 50 ㎍ 또는 0.9 내지 15 ㎍ 인 항 바이러스 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 1 회 이상의 올레안드린의 하루당 투여량은 1 일 2 내지 10 회 투여량, 1 일 2 내지 8 회 투여량, 1 일 2 내지 6 회 투여량, 1 일 2 내지 4 회 투여량, 1 일 2 회 투여량, 1 일 3 회 투여량, 1 일 4 회 투여량, 1 일 5 회 투여량, 1 일 6 회 투여량, 1 일 7 회 투여량, 1 일 8 회 투여량, 1 일 9 회 투여량, 또는 1 일 10 회 투여량인 항 바이러스 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 올레안드린은 올레안드린-함유 바이오매스로부터 수득 된 적어도 하나의 추출물을 포함하는 조성물에 존재하는 항 바이러스 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 추출물은 열수 추출물, 용매 추출물 및 초임계 유체 추출물로 이루어진 군으로부터 각각의 경우에 독립적으로 선택되는 항 바이러스 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 1 회 이상의 투여량의 투여 후, 상기 대상체에서 올레안드린의 혈장 농도는 혈장 mL 당 올레안드린의 양으로, 0.05 내지 2ng/ml, 0.005 내지 10ng/mL, 0.005 내지 8 ng/mL, 0.01 내지 7 ng/mL, 0.02 내지 7 ng/mL, 0.03 내지 6 ng/mL, 0.04 내지 5 ng/mL, 또는 0.05 내지 2.5 ng/mL인 항 바이러스 조성물.
  10. 항 바이러스 조성물로서,
    COVID-19(SARS-CoV-2) 코로나 바이러스 감염을 치료하는데 사용하기 위한 올레안드린을 포함하고, 상기 항 바이러스 조성물의 복수의 치료적 유효 투여량이 상기 감염을 갖는 대상체에게 투여되는, 항 바이러스 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 복수의 치료적 유효 투여량은 주당 2 일 이상 동안, 매일 투여되는 1 회 이상의 투여량인 항 바이러스 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 투여는 한 달에 1 주 이상 계속되는 항 바이러스 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 투여는 1 년에 1 개월 이상 계속되는 항 바이러스 조성물.
  14. 제10항에 있어서, 올레안드린은 올레안드린-함유 바이오매스로부터 수득 된 적어도 하나의 추출물을 포함하는 조성물에 존재하는 항 바이러스 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 추출물은 열수 추출물, 용매 추출물 및 초임계 유체 추출물로 이루어진 군으로부터 각각의 경우에 독립적으로 선택되는 항 바이러스 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 상기 추출물은 올레안드린, 및 올레아놀산, 우르솔산 및 베툴린산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물의 조합을 포함하는 항 바이러스 조성물.
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  18. 제10항에 있어서, 투여는 전신, 비경구, 구강, 장내, 근육내, 피하, 설하, 경구(peroral), 입 투여 또는 이들의 조합인 항 바이러스 조성물.
  19. 제10항에 있어서, 상기 항 바이러스 조성물은 감염 직후 또는 감염 후 1 일 내지 5 일 이내 또는 바이러스 감염 진단 후 가장 빠른 시간에 투여되는 항 바이러스 조성물.
  20. 제10항에 있어서, 상기 항 바이러스 조성물은 1 차 항 바이러스 요법, 보조 항 바이러스 요법 또는 공동-항 바이러스 요법으로서 투여되거나, 상기 투여는 상기 조성물을, 적어도 하나의 다른 항 바이러스 조성물 또는 상기 바이러스 감염과 관련된 증상을 치료하기 위한 적어도 하나의 다른 조성물과 함께, 개별 투여 또는 공동 투여하는 것을 포함하는 항 바이러스 조성물.
  21. 제10항에 있어서, 1 일당 올레안드린의 총 투여량은 각각의 경우에 독립적으로, 1 ㎍ 내지 180 ㎍, 1 ㎍ 내지 120 ㎍, 5 ㎍ 내지 100 ㎍, 10 ㎍ 내지 80 ㎍, 10 ㎍ 내지 75 ㎍, 15 ㎍ 내지 120 ㎍, 15 ㎍ 내지 100 ㎍, 15 ㎍ 내지 80 ㎍, 30 ㎍ 내지 120 ㎍, 30 ㎍ 내지 100 ㎍, 30 ㎍ 내지 90 ㎍, 40 ㎍ 내지 70 ㎍, 1 ㎍, 5 ㎍, 10 ㎍, 20 ㎍, 30 ㎍, 40 ㎍, 50 ㎍, 60 ㎍ , 70㎍, 80㎍, 90㎍, 100㎍, 110㎍, 120㎍, 130㎍, 140㎍, 150㎍, 160㎍, 170㎍, 180㎍, 140 ㎍ 내지 315 ㎍, 20 ㎍ 내지 750 ㎍, 12 ㎍ 내지 300 ㎍, 12 ㎍ 내지 120 ㎍, 0.01 ㎍ 내지 100 mg, 0.01 ㎍ 내지 100 ㎍, 0.5 내지 100 ㎍, 1 내지 80 ㎍, 1.5 내지 60 ㎍, 1.8 내지 60 ㎍, 및 1.8 내지 40 ㎍으로부터 선택되는 항 바이러스 조성물.
  22. 제10항에 있어서, 투여량은 하루에 대상체의 체중 kg 당 올레안드린의 유닛 량을 기준으로, 0.05-0.5 mg/kg/일, 0.05-0.35 mg/kg/일, 0.05-0.22 mg/kg/일, 0.05-0.4 mg/kg/일, 0.05-0.3 mg/kg/일, 0.05-0.5 ㎍/kg/일, 0.05-0.35 ㎍/kg/일, 0.05-0.22 ㎍/kg/일, 0.05-0.4 ㎍/kg/일, 또는 0.05-0.3 ㎍/kg/일을 포함하는 항 바이러스 조성물.
  23. 제10항에 있어서, a) 올레안드린의 1 일 투여량은 최대 100 ㎍/일, 80 ㎍/일, 60 ㎍/일, 40 ㎍/일, 38.4 ㎍/일 또는 30 ㎍/일; 및/또는 b) 올레안드린의 1 일 투여량은 최소 0.5 ㎍/일, 1 ㎍/일, 1.5 ㎍/일, 1.8 ㎍/일, 2 ㎍/일, 또는 5 ㎍/일인 항 바이러스 조성물.
  24. 제10항에 있어서, 투여량은 1 일 2 회 또는 12 시간마다 투여되고, 상기 투여량에서 올레안드린의 양은 0.25 내지 50 ㎍ 또는 0.9 내지 15 ㎍ 인 항 바이러스 조성물.
  25. 제10항에 있어서, 1 회 이상의 올레안드린의 하루당 투여량은 1 일 2 내지 10 회 투여량, 1 일 2 내지 8 회 투여량, 1 일 2 내지 6 회 투여량, 1 일 2 내지 4 회 투여량, 1 일 2 회 투여량, 1 일 3 회 투여량, 1 일 4 회 투여량, 1 일 5 회 투여량, 1 일 6 회 투여량, 1 일 7 회 투여량, 1 일 8 회 투여량, 1 일 9 회 투여량, 또는 1 일 10 회 투여량인 항 바이러스 조성물.
  26. 제10항에 있어서, 1 회 이상의 투여량의 투여 후, 상기 대상체에서 올레안드린의 혈장 농도는 혈장 mL 당 올레안드린의 양으로, 0.05 내지 2ng/ml, 0.005 내지 10ng/mL, 0.005 내지 8 ng/mL, 0.01 내지 7 ng/mL, 0.02 내지 7 ng/mL, 0.03 내지 6 ng/mL, 0.04 내지 5 ng/mL, 또는 0.05 내지 2.5 ng/mL인 항 바이러스 조성물.
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