ES2965161T3

ES2965161T3 - Método y composiciones para el tratamiento de infección por coronavirus

Info

Publication number: ES2965161T3
Application number: ES20758085T
Authority: ES
Inventors: Robert A Newman; Otis C Addington; Richard Obiso
Original assignee: Phoenix Biotechnology Inc
Current assignee: Phoenix Biotechnology Inc
Priority date: 2020-03-31
Filing date: 2020-07-14
Publication date: 2024-04-11
Anticipated expiration: 2040-07-14
Also published as: CN114209711A; CN112689510B; CN112689510A

Abstract

Se proporciona un método para tratar una infección viral, tal como una infección viral causada por un virus de la familia Coronaviridae. Se usa una composición que tiene al menos oleandrina para tratar infecciones virales. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método y composiciones para el tratamiento de infección por coronavirus

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una composición antiviral para el tratamiento de infección por COVID-19 (SARS-CoV-2).

Antecedentes de la invención

Nerium oleander,un miembro de la especieNerium, es una planta ornamental distribuida ampliamente en Asia subtropical, el sudoeste de los Estados Unidos, y el Mediterráneo. Sus propiedades médicas y toxicológicas han sido reconocidas por mucho tiempo. Se ha propuesto para uso, por ejemplo, en el tratamiento de hemorroides, úlceras, lepra, mordidas de serpientes, cánceres, tumores, trastornos neurológicos, verrugas, y enfermedades proliferativas de células. Zibbu et al. (J. Chem. Pharm. Res. (2010), 2(6), 351-358) proporcionan una revisión breve de la actividad química y farmacológica deNerium oleander.

La extracción de componentes de plantas de la especieNeriumha sido realizada tradicionalmente utilizando agua hirviendo, agua fría, fluido supercrítico, o solvente orgánico.

ANVIRZEL™ (US 5,135,745 de Ozel) contiene la forma concentrada o la forma en polvo del extracto en agua caliente deNerium oleander.Muller et al.(Pharmazie.(1991) Sept. 46(9), 657-663) describen los resultados con respecto al análisis de un extracto en agua deNerium oleander. Ellos informan que el polisacárido presente es principalmente ácido galacturónico. Otros sacáridos incluyen ramnosa, arabinosa y galactosa. El contenido de polisacárido y la composición del azúcar individual de los polisacáridos dentro del extracto de agua caliente deNerium oleandertambién han sido informados por Newman et al.(J. Herbal Pharmacotherapy,(2001) vol 1, pp.1-16). El análisis de la composición de ANVIRZEL™, el extracto en agua caliente, fue descrito por Newman et al. (Anal. Chem. (2000), 72(15), 3547-3552). La Patente de E.U.A. No. 5,869,060 de Selvaraj et al. pertenece a los extractos de la especieNeriumy a los métodos de producción. Para preparar el extracto, se coloca material vegetal en agua y se hierve. El extracto crudo luego se separa de la materia vegetal y se esteriliza por filtración. El extracto resultante puede entonces ser liofilizado para producir un polvo. La Patente de E.U.A. No. 6,565,897 (Publicación Preconcesión en E.U.A. de la No. 20020114852 y la Solicitud Internacional de PCT No. WO 2000/016793 de Selvaraj et al.) describen un procedimiento de extracción en agua caliente para la preparación de un extracto en agua sustancialmente estéril. Ishikawa et al. (J. Nutr. Sci. Vitaminol. (2007), 53, 166-173) describe un extracto en agua caliente deNerium oleandery el fraccionamiento del mismo por cromatografía líquida utilizando mezclas de cloroformo, metanol, y agua. Ellos también informan que los extractos de las hojas deN. oleanderhan sido utilizados para tratar diabetes Tipo II. La US20060188585 publicada el 24 de agosto de 2006 de Panyosan describe un extracto en agua caliente deNerium oleander.La US 10323055 concedida el 18 de junio de 2019 a Smothers describe un método de extracción de material vegetal con aloe y agua para proporcionar un extracto que comprende aloe y glucósido cardíaco. La US20070154573 publicada el 5 de julio de 2007 de Rashan et al. describe un extracto en agua fría deNerium oleandery su uso.

Erdemoglu et al.(J. Ethnopharmacol.(2003) Nov. 89(1), 123-129) describe los resultados para la comparación de extractos de plantas acuosos y etanólicos, incluyendoNerium oleander, con base en sus actividades antinociceptivas y antiinflamatorias. Fartyal et al. (J. Sci. Innov. Res. (2014), 3(4), 426-432) describe resultados para la comparación de extractos en metanol, acuosos, y en éter de petróleo deNerium oleandercon base en su actividad antibacterial.

Los extractos en solventes orgánicos deNerium oleandertambién se describen por Adome et al. (Afr. Health Sci.(2003) Aug. 3(2), 77-86; ethanolic extract), el-Shazly et al.(J. Egypt Soc. Parasitol.(1996), Aug. 26(2), 461-473; ethanolic extract), Begum et al.(Phytochemistry(1999) Feb. 50(3), 435-438; methanolic extract), Zia et al.(J. Ethnolpharmacol.(1995) Nov. 49(1), 33-39; methanolic extract), y Vlasenko et al.(Farmatsiia.(1972) Sept.-Oct. 21(5), 46-47; alcoholic extract). Turkmen et al.(J. Planar Chroma.(2013), 26(3), 279-283) describe un extracto en etanol acuoso de hojas y tallos de Nerium oleander. La US 3833472 concedida el 3 de septiembre de 1974 de Yamauchi describe la extracción de hojas de Nerium odorum SOL (Nerium oleander Linn) con agua, solvente orgánico, o solvente orgánico acuoso, en donde las hojas son calentadas a 60°-170°C y luego extraídas, y el solvente orgánico es metanol, etanol, éter propílico o cloroformo.

Un extracto de fluido supercrítico de la especieNeriumes conocido (US 8394434, US 8187644, US 7402325) y ha demostrado eficacia en el tratamiento de trastornos neurológicos (US 8481086, US 9220778, US 9358293, US 20160243143A1, US 9877979, US 10383886) y trastornos proliferativos de células (US 8367363, US 9494589, US 9846156), y algunas infecciones virales (US 10596186, WO 2018053123A1, WO2019055119A1)

Los triterpenos son conocidos por poseer una amplia variedad de actividades terapéuticas. Algunos de los triterpenos conocidos incluyen ácido oleanólico, ácido ursólico, ácido betulínico, bardoxolona, ácido maslínico, y otros. La actividad terapéutica de los triterpenos ha sido evaluada principalmente individualmente más que como combinaciones de triterpenos.

El ácido oleanólico está en una clase de triterpenoides tipificados por compuestos tales como bardoxolona que han mostrado ser activadores potentes de la ruta de desintoxicación en fase 2 celular innata, en la que la activación del factor de transcripción Nrf2 lleva a incrementos transcripcionales en programas de genes antioxidantes en dirección 3’ que contienen el elemento de respuesta transcriptional antioxidante (ARE). La propia Bardoxolona ha sido investigada extensamente en ensayos clínicos en condiciones inflamatorias; sin embargo, un ensayo clínico de Fase 3 en enfermedad renal crónica fue terminado debido a eventos adversos que podrían haber estado relacionados con toxicidades celulares conocidas de ciertos triterpenoides incluyendo bardoxolona a concentraciones elevadas.

Las composiciones que contienen triterpenos en combinación con otros componentes terapeúticos se encuentran como extractos vegetales. Fumiko et al. (Biol. Pharm. Bull (2002), 25(11), 1485-1487) describe la evaluación de un extracto metanólico deRosmarimus officinalisL. para el tratamiento de tripanosomiasis. Addington et al. (US 8481086, US 9220778, US 9358293, US 20160243143 A1) describen un extracto en fluido supercrítico (SCF; PBI-05204) deNerium oleanderque contiene oleandrina y triterpenos para el tratamiento de condiciones neurológicas. Addington et al. (US 9011937, US 20150283191 A1) describen una fracción que contiene triterpeno (PBI-04711) del extracto en SCF deNerium oleanderque contiene oleandrina y triterpenos para el tratamiento de condiciones neurológicas. Jager et al. (Molecules (2009), 14, 2016-2031) describen varios extractos vegetales que contienen mezclas de ácido oleanólico, ácido ursólico, ácido betulínico, y otros componentes. Mishra et al. (PLoS One 2016 25;11(7):e0159430. Epub 2016 Jul 25) describen un extracto de corteza deBetula utilisque contiene una mezcla de ácido oleanólico, ácido ursólico, ácido betulínico y otros componentes. Wang et al. (Molecules (2016), 21, 139) describen un extracto deAlstonia scholarisque contiene una mezcla de ácido oleanólico, ácido ursólico, ácido betulínico y otros componentes. L. e Silva et al. (Molecules (2012), 17, 12197) describen un extracto deEriope blanchettique contiene una mezcla de ácido oleanólico, ácido ursólico, ácido betulínico y otros componentes. Rui et al. (Int. J. Mol. Sci. (2012), 13, 7648-7662) describen un extracto deEucaplyptus globulusque contiene una mezcla de ácido oleanólico, ácido ursólico, ácido betulínico y otros componentes. Ayatollahi et al. (Iran. J. Pharm. Res. (2011), 10(2), 287-294) describen un extracto deEuphorbia microsciadiaque contiene una mezcla de ácido oleanólico, ácido ursólico, ácido betulínico y otros componentes. Wu et al. (Molecules (2011), 16, 1-15) describen un extracto de la especieLigustrumque contiene una mezcla de ácido oleanólico, ácido ursólico, ácido betulínico y otros componentes. Lee et al. (Biol. Pharm. Bull (2010), 33(2), 330) describen un extracto deForsythia viridissimaque contiene una mezcla de ácido oleanólico, ácido ursólico, ácido betulínico y otros componentes.

El ácido oleanólico (O u OA), ácido ursólico (U o UA) y ácido betulínico (B o BA) son los tres componentes principales de triterpeno encontrados en PBI-05204 (PBI-23; un extracto en fluido supercrítico deNerium oleander)y pBi-04711 (una fracción que contiene triterpeno 0-4 de PBI-05204). Nosotros (dos de los presentes inventores) informamos previamente (Van Kanegan et al., en Nature Scientific Reports (mayo de 2016), 6:25626. doi: 10.1038/srep25626) acerca de la contribución de los triterpenos hacia la eficacia al comparar su actividad neuroprotectora en un ensayo de modelo de privación de glucosa y oxígeno en un corte fino de cerebro (OGD) a concentraciones similares. Encontramos que el PBI-05204 (PBI) y PBI-04711 (Fracción 0-4) proporcionan actividad neuroprotectora.

Los extractos de la especieNeriumson conocidos por contener muchas clases diferentes de compuestos: glucósidos cardíacos, gluconas, esteroides, triterpenos, polisacáridos y otros. Los compuestos específicos incluyen oleandrina; neritalósido; odorósido; ácido oleanólico; ácido ursólico; ácido betulínico; oleandrigenina; oleásida A; betulina (urs-12-ene-3p,28-diol); 28-norurs-12-en-3p-ol; urs-12-en-3p-ol; ácido 3p,3p-hidroxi-12-oleanen-28-oico; ácido 3p,20adihidroxiurs-21-en-28-oico; ácido 3p,27-dihidroxi-12-ursen-28-oico; ácido 3p,13p-dihidroxiurs-11-en-28-oico; 3p,12adihidroxioleanan-28,13p-olida; ácido 3p,27-dihidroxi-12-oleanan-28-oico; y otros componentes.

La fiebre hemorrágica viral (VHF) puede ser provocada por cinco distintas familias de virus: Arenaviridae, Bunyaviridae, Filoviridae, Flaviviridae, y Paramyxoviridae. Los Filovirus, por ejemplo, virus de Ébola (EBOV) y virus de Marburg (MARV), están entre los virus más patogénicos conocidos por el hombre y los agentes causantes de los brotes de la fiebre hemorrágica viral con tasas de fatalidad de hasta 90%. Cada virión contiene una molécula de ARN de cadena simple, de sentido negativo. Más allá del cuidado de apoyo o tratamiento sintomático, no existen fármacos comerciales terapéuticamente eficaces y no hay fármacos profilácticos disponibles para tratar infecciones por EBOV (virus de Ébola) y MARV (virus de Marburg), es decir infecciones por filovirus. Se han identificado cinco especies de virus de Ébola: Tai Forest (anteriormente Costa de Marfil), Sudán, Zaire, Reston y Bundibugyo.

El virus de ARN envuelto de cadena simple de sentido negativo ((-)-(ss)-envRNAV) incluye el virus en la familia Arenaviridae, familia Bunyaviridae (orden Bunyavirales), familia Filoviridae, familia Orthomyxoviridae, familia Paramyxoviridae, y familia Rhabdoviridae. El ARN viral negativo es complementario al ARNm y debe ser convertido a un ARN positivo por polimerasa de ARN antes de la traducción; por lo tanto, el ARN purificado de un virus en sentido negativo no es infeccioso por sí mismo, ya que necesita ser convertido a un ARN en sentido positivo para replicación. Virus e infecciones ejemplares de la familia Arenaviridae incluyen virus Lassa, meningitis ascéptica, virus Guanarito, virus Junin, virus Lujo, virus Machupo, virus Sabia y virus Whitewater Arroyo. Virus e infecciones ejemplares de la familia Bunyaviridae incluyen Hantavirus, orthonairovirus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo. Virus y infecciones ejemplares de la familia Paramyxoviridae incluyen virus de las Paperas, virus Nipah, virus Hendra, virus sincital respiratorio (RSV), virus de parainfluenza humana (HPIV), y NDV. Virus e infecciones ejemplares de la familia Orthomyxoviridae incluyen virus de influenza (A a C), Isavirus, Thogotovirus, Quaranjavirus, H1N1, H2N2, H3N2, H1N2, Influenza Española, Influenza Asiática, Influenza de Hong Kong, Influenza Rusa. Virus e infecciones ejemplares de la familia Rhabdoviridae incluyen virus de la rabia, vesiculovirus, Lyssavirus, Cytorhabdovirus.

Los Flavivirus son virus de ARN envuelto, de cadena simple, de sentido positivo ((+)-(ss)-envRNAV). Ellos se encuentran en artópodos, principalmente en garrapatas y mosquitos, y provocan morbilidad y mortalidad diseminada por todo el mundo. Algunos de los virus transmitidos por mosquitos incluyen Fiebre Amarilla, Fiebre de Dengue, Encefalitis Japonesa, Virus del Nilo del Oeste, y Virus del Zika. Algunas de las infecciones virales transmitidas por garrapata incluyen Encefalitis de origen por Garrapata, Enfermedad de la Selva de Kyasanur, Enfermedad de Alkhurma, Fiebre Hemorrágica de Omsk. Aunque no es una infección hemorrágica, el virus Powassan es un Flavivirus. Los (+)-(ss)-envRNAV incluyen la familia Coronaviridae (patógeno humano y animal), familia Flaviviridae (patógeno humano y animal), familia Togaviridae (patógeno humano y animal), y familia Arterviridae (patógeno animal).

El Coronavirus (CoV) es el nombre común para el Coronaviridae. En humanos, el CoV provoca infecciones respiratorias, que típicamente son leves pero que pueden ser letales en formas raras tales como SARS (síndrome respiratorio agudo severo)-CoV, MERS (Síndrome Respiratorio del Este Medio)-CoV, y COVID-19. El CoV tiene una nucleocápside de simetría helicoidal y los tamaños del genoma varían de cerca de 26 a cerca de 32 kilobases. Otros CoV humanos ejemplares incluyen CoV 229E, CoV NL63, CoV OC43, CoV HKU1, y CoV HKU20. La envolvente del CoV porta tres glucoproteínas: Proteína de espiga S: unión a receptor, fusión celular, antígeno principal; proteína de envolvente E: proteína asociada a envolvente, pequeña; y proteína de Membrana M: brote de transmembrana y formación de la envolvente. En unos pocos tipos de CoV, existe una cuarta glucoproteína: HE- hemaglutinina-esterasa. El genoma tiene una caperuza metilada 5' y un poli A 3' y funciona directamente como ARNm. La entrada del CoV en una célula humana ocurre vía endocitosis y fusión de membrana; y la replicación ocurre en el citoplasma de la célula. El CoV es transmitido por aerosoles de las secreciones respiratorias, por la vía fecal-oral, y por transmisión mecánica. La mayor parte del crecimiento del virus ocurre en células epiteliales. Ocasionalmente se pueden infectar el hígado, los riñones, corazón u ojos, así como otros tipos de células tales como macrófagos. En infecciones respiratorias de tipo frío, el crecimiento parece estar localizado en el epitelio del tracto respiratorio superior. La infección por Coronavirus es muy común y ocurre en todo el mundo. La incidencia de la infección es fuertemente estacional, con mayor incidencia en niños en el invierno. Las infecciones en adultos son menos comunes. Se desconocen el número de serotipos de coronavirus y el grado de variación antigénica. Parece que ocurren reinfecciones durante toda la vida, implicando múltiples serotipos (por lo menos se conocen cuatro) y/o variación antigénica, por lo tanto los prospectos para inmunización contra todos los serotipos con una sola vacuna son altamente improbables. El SARS es un tipo de neumonía viral, con síntomas que incluyen fiebre, una tos seca, dispnea (dificultad para respirar), dolor de cabeza, e hipoxemia (baja concentración de oxígeno en sangre). Los hallazgos típicos en laboratorio incluyen linfopenia (reducción en el número de linfocitos) y niveles suavemente elevados de aminotransferasa (indicando daño hepático). Puede resultar la muerte del fallo respiratorio progresivo debido al daño alveolar. El transcurso clínico típico del SARS involucra una mejora en los síntomas durante la primera semana de infección, seguido por un empeoramiento durante la segunda semana. Permanece una necesidad sustancial para tratamientos antivirales efectivos (composiciones y métodos) contra CoV humano.

La oleandrina, y un extracto deNerium oleanderhan demostrado prevenir la incorporación de la glucoproteína de envolvente gp120 de VIH-1 en partículas de virus maduro e inhibir la infectividad viral in vitro (Singh et al.,“Nerium oleanderderived cardiac glycoside oleandrina is a novel inhibitor of HIV infectivity” in Fitoterapia (2013) 84, 32-39).

La oleandrina ha demostrado actividad anti-VIH pero no ha sido evaluada contra muchos virus. Se ha informado que los triterpenos, ácido oleanólico, ácido betulínico y ácido ursólico exhiben diferentes niveles de actividad antiviral pero no han sido evaluados contra muchos virus. El ácido betulínico ha demostrado algo de actividad antiviral contra la cepa 1C de HSV-1, influenza A H7N1, ECHO 6, y HIV-1. El ácido oleanólico ha demostrado algo de actividad antiviral contra HIV-1, HEP C, y la cepa NS5B de HCV H. El ácido ursólico ha demostrado algo de actividad antiviral contra HIV-1, HEP C, la cepa NS5B de HCV H , HSV-1, HSV-2, ADV-3, ADV-8, ADV-11, HEP B, ENTV CVB1 y ENTV EV71. La actividad antiviral de oleandrina, ácido oleanólico, ácido ursólico y ácido betulínico es impredecible igual que la eficacia contra virus específicos. Existen virus contra los cuales la oleandrina, ácido oleanólico, ácido ursólico y/o ácido betulínico tienen poca o no tienen actividad antiviral, lo que significa que una persona no puede predecir apriorisi la oleandrina, ácido oleanólico, ácido ursólico y/o ácido betulínico exhibirán actividad antiviral contra géneros particulares del virus.

Barrows et al. (“A screen of FDA-approved drugs for inhibitors of Zikavirus infection” inCell Host Microbe(2016),20, 259-270) informan que la digoxina demuestra actividad antiviral contra el virus de Zika pero que las dosis son demasiado altas y probablemente tóxicas. Cheung et al. (“Antiviral activity of lanatoside C against dengue virus infection” inAntiviral Res.(2014)111, 93-99) informan que el lanatósido C demuestra actividad antiviral contra el virus del Dengue.

El virus linfotrópico T Humano tipo I (HTLV-1) es un retrovirus que pertenece a la familia Retroviridae y al género deltaretrovirus. Tiene un genoma de ARN de sentido positivo que se transcribe a la inversa en ADN y luego se integra en el ADN celular. Una vez integrado, el HTLV-1 continua existiendo solo como un provirus que se puede esparcir de célula a célula a través de una sinapsis viral. Se producen pocos, si acaso, viriones libres, y normalmente no hay virus detectables en el plasma sanguíneo aunque el virus esté presente en las secreciones genitales. El HTLV-1 infecta predominantemente los linfocitos T CD4+ y provoca leucemia de linfocitos T/linfoma en adultos (ATLL) -una malignidad hematológica rara, pero agresiva con altas tasas de resistencia a terapia y generalmente con resultados clínicos deficientes, además de muchas condiciones autoinmunes/inflamatorias, incluyendo dermatitis infecciosa, artritis reumatoide, uveítis, queratoconjuntivitis, síndrome de sicca, síndrome de Sjógren, y HAM/TSP, entre otros. El HAM/TSP se caracteriza clínicamente por paraparesia espástica progresiva crónica, incontinencia urinaria, y alteración sensorial leve. Aunque el ATLL está vinculado etiológicamente con la latencia viral, transformación oncogénica, y la expansión clonal de células infectadas con HTLV-1, las enfermedades inflamatorias, tales como mielopatía/paraparesia espástica tropical asociada a HTLV-1 (HAM/TSP), son provocadas por respuestas autoinmunes y/o inmunopatológicas para la replicación proviral y la expresión de antígenos virales. El HAM/TSP es una enfermedad neuroinflamatoria progresiva que resulta en el deterioro y desmielinación de la columna vertebral inferior. Los linfocitos T circulantes infectados con HTLV-1 invaden el sistema nervioso central (SNC) y provocan una respuesta inmunopatogénica contra el virus y posiblemente componentes del SNC. El daño neural y subsecuente degeneración pueden provocar una discapacidad grave en pacientes con HAM/TSP. La persistencia de replicación proviral y la proliferación de células infectadas con HTLV-1 en el SNC lleva a una respuesta de linfocitos T citotóxica dirigida contra antígenos virales, y que puede ser responsable de la destrucción autoinmune de tejidos nerviosos.

Incluso si los glucósidos cardíacos han demostrado exhibir algo de actividad antiviral contra unos pocos virus, los compuestos específicos exhiben niveles muy diferentes de actividad antiviral contra diferentes virus, lo que significa que algunos exhiben actividad antiviral muy deficiente y algunos exhiben una mejor actividad antiviral cuando se evalúan contra el mismo (los mismos) virus.

Permanece una necesidad de composiciones farmacéuticas mejoradas que contengan oleandrina, ácido oleanólico, ácido ursólico, ácido betulínico o cualquier combinación de los mismos que sean terapéuticamente activas contra infecciones virales específicas.

Breve descripción de la invención

La invención proporciona una composición farmacéutica para uso en el tratamiento del COVID-19 (SARS-CoV-2). Los inventores han tenido éxito en preparar composiciones antivirales que exhiben suficiente actividad antiviral para justificar su uso en el tratamiento de una infección viral de SARS-CoV-2 en humanos y animales.

En algunas realizaciones, la composición antiviral es administrada a sujetos que tienen células infectadas viralmente, en donde las células exhiben una proporción elevada de isoformas alfa-3 a alfa-1 de Na,K-ATPasa.

En algunas realizaciones, la infección viral es provocada por virus de la familia Coronaviridae.

Algunas realizaciones de la invención se dirigen a composiciones para el tratamiento de infecciones virales por el virus de la familia Coronaviridae, (+)-ss-envRNAV, or (-)-ss-envRNAV.

Algunas realizaciones de la invención se dirigen a composiciones para el tratamiento de infecciones virales por virus del género Coronavirus (CoV).

En algunas realizaciones, el (+)-ss-envRNAV es un virus seleccionado del grupo que consiste en la familia Coronaviridae.

En algunas realizaciones, el (+)-ss-envRNAV es un coronavirus que es patogénico para los humanos. En algunas realizaciones, la proteína de espiga del coronavirus se une a los receptores de ACE2 (enzima 2 convertidora de angiotensina) en tejido humano. En algunas realizaciones, el coronavirus es el SARS-CoV-2.

Un aspecto de la invención proporciona composiciones para su uso en una infección viral en un sujeto por administración crónica al sujeto de una composición antiviral. El sujeto es tratado al administrar crónicamente al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva (dosis terapéuticamente relevante) de la composición, proporcionando de este modo alivio de los síntomas asociados con la infección viral o mejora de la infección viral. La administración de la composición al sujeto puede iniciar inmediatamente después de la infección o en cualquier momento dentro de un día a 5 días después de la infección o en el momento más pronto después del diagnóstico definitivo de la infección con el virus. El virus puede ser cualquier virus descrito en la presente.

En consecuencia, la invención también proporciona composiciones para su uso en el tratamiento de una infección viral en un mamífero, donde el método comprende administrar al mamífero una o más dosis terapéuticamente efectivas de la composición antiviral. Una o más dosis se administran en una base diaria, semanalmente o mensualmente. Se puede administrar una o más dosis por día. El virus puede ser cualquier virus descrito en la presente.

La invención también proporciona composiciones para su uso en el tratamiento de una infección por coronavirus, en particular una infección de coronavirus que es patogénica a humanos, por ejemplo una infección por SARS-CoV-2, el método comprende administrar crónicamente a un sujeto, que tiene dicha infección, dosis terapéuticamente efectivas de glucósido cardíaco (composición que contiene glucósido cardíaco).

La invención también proporciona composiciones para su uso en el tratamiento de una infección por coronavirus, en particular una infección de coronavirus que es patogénica a humanos, por ejemplo una infección por SARS-CoV-2, el método comprende administrar crónicamente a un sujeto, que tiene dicha infección, dosis terapéuticamente efectivas de glucósido cardíaco (composición que contiene glucósido cardíaco), inhibiendo de este modo la replicación viral de dicho coronavirus y reduciendo la infectividad del virus progenie de dicho coronavirus.

La invención también proporciona composiciones para su uso en el tratamiento de una infección por coronavirus, en particular infección por SARS-CoV-2, al administrar repetidamente (a través de cualquiera de los modos de administración discutidos en la presente) a un sujeto, que tiene dicha infección, dosis plurales terapéuticamente efectivas de glucósido cardíaco (composición que contiene glucósido cardíaco). Una o más dosis se pueden administrar por día por uno o más días por semana y opcionalmente por una o más semanas por mes y opcionalmente por uno o más meses por año.

La invención también proporciona composiciones para su uso en el tratamiento de una infección por coronavirus en un humano, donde el método comprende administrar al sujeto 1-10 dosis de glucósido cardíaco (composición que contiene glucósido cardíaco) por día por un periodo de tratamiento de 2 días a cerca de 2 meses. Dos a ocho, dos a seis, o cuatro dosis se pueden administrar diariamente durante el periodo de tratamiento. Las dosis se pueden administrar por 2 días a cerca de 60 días, 2 días a cerca de 45 días, 2 días a cerca de 30 días, 2 días a cerca de 21 días, o 2 días a cerca de 14 días. Dicha administración puede ser a través de cualquiera de los modos de administración discutidos en la presente. Se prefiere la administración sistémica que proporciona niveles en plasma terapéuticamente efectivos de oleandrina y/o digoxina en dicho sujeto.

En algunas realizaciones, una o más dosis de oleandrina son administradas por día por varios días hasta que la infección viral se cura. En algunas realizaciones, una o más dosis de glucósido cardíaco (composición que contiene glucósido cardíaco) son administradas por día por días plurales y semanas plurales hasta la infección viral que se cura. Una o más dosis se pueden administrar en un día. Una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más dosis se pueden administrar por día.

En algunas realizaciones, la concentración de oleandrina y/o digoxina en el plasma de un sujeto infectado tratado, por ejemplo, con infección por coronavirus, es cerca de 10 pg/mL o menos, cerca de 5 pg/mL o menos, cerca de 2.5 pg/mL o menos, cerca de 2 pg/mL o menos, o cerca de 1 pg/mL o menos. En algunas realizaciones, la concentración de oleandrina y/o digoxina en el plasma de un sujeto tratado con infección por coronavirus es cerca de 0.0001 pg/mL o más, cerca de 0.0005 pg/mL o más, cerca de 0.001 pg/mL o más, cerca de 0.0015 pg/mL o más, cerca de 0.01 pg/mL o más, cerca de 0.015 pg/mL o más, cerca de 0.1 pg/mL o más, cerca de 0.15 pg/mL o más, cerca de 0.05 pg/mL o más, o cerca de 0.075 pg/mL o más. En algunas realizaciones, la concentración de oleandrina y/o digoxina en el plasma de un sujeto infectado tratado es cerca de 10 pg/mL a cerca de 0.0001 pg/mL, cerca de 5 pg/mL a cerca de 0.0005 pg/mL, cerca de 1 pg/mL a cerca de 0.001 pg/mL, cerca de 0.5 pg/mL a cerca de 0.001 pg/mL, cerca de 0.1 pg/mL a cerca de 0.001 pg/mL, cerca de 0.05 pg/mL a cerca de 0.001 pg/mL, cerca de 0.01 pg/mL a cerca de 0.001 pg/mL, cerca de 0.005 pg/mL a cerca de 0.001 pg/mL. La invención incluye todas las combinaciones y selecciones de intervalos de concentración en plasma establecidos en la presente.

La composición antiviral se puede administrar crónicamente, es decir en una base recurrente, tal como diariamente, un día sí y otro no, cada segundo día, cada tercer día, cada cuarto día, cada quinto día, cada sexto día, semanalmente, una semana sí y otra no, cada segunda semana, cada tercer semana, mensualmente, bimensualmente, semi-mensualmente, un mes sí y uno no, cada segundo mes, trimestralmente, un trimestre sí y un trimestre no, trimestralmente, estacionalmente, semi-anualmente y/o anualmente. El periodo de tratamiento una o más semanas, uno o más meses, uno o más trimestres y/o uno o más años. Una dosis eficaz de glucósido cardíaco (composición que contiene glucósido cardíaco) es administrada una o más veces en un día.

En algunas realizaciones, el sujeto es administrado con 140 pg a 315 pg por día de glucósido cardíaco. En algunas realizaciones, una dosis comprende 20 gg a 750 gg, 12 gg a 300 gg, o 12 gg a 120 gg de glucósido cardíaco. La dosis diaria de glucósido cardíaco puede variar de 20 gg a 750 gg, 0.01 gg a 100 mg, o 0.01 gg a 100 gg de glucósido cardíaco/día. La dosis diaria recomendada de oleandrina, presente en el extracto de SCF, es generalmente cerca de 0.25 a cerca de 50 gg dos veces diariamente o cerca de 0.9 a 5 gg dos veces diariamente o cerca de cada 12 horas. La dosis puede ser cerca de 0.5 a cerca de 100 gg/día, cerca de 1 a cerca de 80 gg/día, cerca de 1.5 a cerca de 60 gg/día, cerca de 1.8 a cerca de 60 gg/día, cerca de 1.8 a cerca de 40 gg/día. La dosis máxima tolerada puede ser cerca de 100 gg/día, cerca de 80 gg/día, cerca de 60 gg/día, cerca de 40 gg/día, cerca de 38.4 gg/día o cerca de 30 gg/día de extracto de oleander que contiene oleandrina y la dosis mínima efectiva puede ser cerca de 0.5 gg/día, cerca de 1 gg/día, cerca de 1.5 gg/día, cerca de 1.8 gg/día, cerca de 2 gg/día, o cerca de 5 gg/día. Las dosis adecuadas que comprenden glucósido cardíaco y triterpeno pueden ser cerca de 0.05-0.5 mg/kg/día, cerca de 0.05-0.35 mg/kg/día, cerca de 0.05 0.22 mg/kg/día, cerca de 0.05-0.4 mg/kg/día, cerca de 0.05-0.3 mg/kg/día, cerca de 0.05-0.5 gg/kg/día, cerca de 0.05 0.35 gg/kg/día, cerca de 0.05-0.22 gg/kg/día, cerca de 0.05-0.4 gg/kg/día, o cerca de 0.05-0.3 gg/kg/día. En algunas realizaciones, la dosis de oleandrina es cerca de 1 mg a cerca de 0.05 mg, cerca de 0.9 mg a cerca de 0.07 mg, cerca de 0.7 mg a cerca de 0.1 mg, cerca de 0.5 mg a cerca de 0.1 mg, cerca de 0.4 mg a cerca de 0.1 mg, cerca de 0.3 mg a cerca de 0.1 mg, cerca de 0.2 mg. La invención incluye todas las combinaciones de las dosis aquí establecidas.

En algunas realizaciones, el glucósido cardíaco es administrado en por lo menos dos fases de dosificación: una fase de carga y una fase de mantenimiento. La fase de carga se continua hasta cerca de alcanzar el nivel en plasma de estado estacionario de glucósido cardíaco. La fase de mantenimiento comienza ya sea en el inicio de la terapia o después cerca del término de la fase de carga. La titulación de la dosis puede ocurrir en la fase de carga y/o en la fase de mantenimiento.

Todos los regímenes de dosificación, programas de dosificación, y dosis descritos en la presente se contemplan como siendo adecuados; sin embargo, algunos regímenes de dosificación, programas de dosificación, y dosis pueden ser más adecuados para algún sujeto que para otros. Los puntos finales clínicos diana son utilizados para guiar dicha dosificación.

La composición se puede administrar sistémicamente. Los modos de administración sistémica incluyen parenteral, bucal, enteral, intramuscular, subdérmica, sublingual, peroral, pulmonar, u oral. La composición también puede ser administrada vía inyección o intravenosamente. La composición también puede ser administrada por dos o más vías al mismo sujeto. En algunas realizaciones, la composición es administrada por una combinación de cualquiera dos o más modos de administración seleccionados del grupo que consiste de parenteral, bucal, enteral, intramuscular, subdérmica, sublingual, peroral, pulmonar, y oral.

La invención también proporciona una forma de dosificación sublingual que comprende oleandrina y portador líquido. La invención también proporciona composiciones para su uso en el tratamiento de una infección viral, en particular infección por coronavirus, por ejemplo, como se define en la presente, que comprende administrar sublingualmente una dosis plural de una composición que contiene oleandrina (que contiene digoxina) a un sujeto que tiene dicha infección viral. Una o más dosis se pueden administrar por día por dos o más días por semana y por una o más semanas por mes, opcionalmente por uno o meses por año.

En algunas realizaciones, la composición antiviral comprende oleandrina (o digoxina o una combinación de oleandrina y digoxina) y aceite. El aceite puede comprender triglicérido de cadena media. La composición antiviral puede comprender uno, dos o más extractos que contienen oleandrina y uno o más excipientes farmacéuticos.

Si está presente en la composición antiviral, se puede incluir además un glucósido cardíaco adicional: odorósido, neritalósido, o oleandrigenina. En algunas realizaciones, la composición comprende además a) uno o más triterpenos; b) uno o más esteroides; c) uno o más derivados de triterpeno; d) uno o más derivados de esteroides; o e) una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la composición comprende glucósido cardíaco y a) dos o tres triterpenos; b) dos o tres derivados de triterpeno; c) dos o tres sales de triterpeno; o d) una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el triterpeno se selecciona del grupo que consiste de ácido oleanólico, ácido ursólico, ácido betulínico y sales o derivados de los mismos.

Algunas realizaciones de la invención incluyen esas en donde una composición farmacéutica comprende por lo menos un excipiente farmacéutico y la composición antiviral de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas. En algunas realizaciones, la composición antiviral comprende: a) por lo menos un glucósido cardíaco y por lo menos un triterpeno; b) por lo menos un glucósido cardíaco y por lo menos dos triterpenos; c) por lo menos un glucósido cardíaco y por lo menos tres triterpenos; d) por lo menos dos triterpenos y excluye glucósido cardíaco; e) por lo menos tres triterpenos y excluye glucósido cardíaco; o f) por lo menos un glucósido cardíaco, por ejemplo oleandrina, digoxina. Como se utiliza en la presente, los términos genéricos triterpeno y glucósido cardíaco también abarcan sales y derivados de los mismos, a menos que se especifique de otro modo.

El glucósido cardíaco puede estar presente en una composición farmacéutica en forma pura o como parte de un extracto que contiene uno o más glucósidos cardíacos. El triterpeno(s) puede estar presente en una composición farmacéutica en forma pura o como parte de un extracto que contiene triterpeno(s). En algunas realizaciones, el glucósido cardíaco está presente como el componente terapéutico principal, que significa el componente principalmente responsable de la actividad antiviral, en la composición farmacéutica. En algunas realizaciones, el triterpeno(s) está/están presente(s) como el(los) componente(s) terapéutico(s) principal(es), lo que significa el(los) componente(s) principalmente responsable(s) de la actividad antiviral, en la composición farmacéutica.

En algunas realizaciones, un extracto que contiene oleandrina se obtiene por extracción de material vegetal. El extracto puede comprender un extracto en agua caliente, extracto en agua fría, extracto en fluido supercrítico (SCF), extracto en líquido subcrítico, extracto en solvente orgánico, o una combinación de los mismos del material vegetal. En algunas realizaciones, el extracto ha sido (biomasa) preparado por extracción en líquido subcrítico de masa vegetal deNerium(biomasa) utilizando, como el fluido de extracción, dióxido de carbono líquido subcrítico, que comprende opcionalmente alcohol. En algunas realizaciones, la composición que contiene oleandrina comprende dos o más diferentes tipos de extractos que contienen oleandrina.

Las realizaciones de la invención incluyen aquellas en las que la biomasa que contiene oleandrina (materia vegetal) esNeriumsp.,Nerium oleander, Nerium oleanderL (Apocynaceae),Nerium odourum,adelfa blanca, adelfa rosada,Thevetiasp.,Thevetia peruviana,adelfa amarilla,Thevetia nerifolia, Agrobacterium tumefaciens,cultivo celular (masa celular) de cualquiera de dichas especies, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la biomasa comprende hojas, tallos, flores, corteza, frutos, semillas, savia, y/o brotes.

En algunas realizaciones, el extracto comprende por lo menos otro agente farmacológicamente activo, obtenido junto con ele glucósido cardíaco durante la extracción, que contribuye a la eficacia terapéutica del glucósido cardíaco cuando el extracto es administrado a un sujeto. En algunas realizaciones, la composición comprende además uno o más de otros agentes terapéuticamente efectivos no de glucósido cardíaco, es decir uno o más agentes que no son glucósidos cardíacos. En algunas realizaciones, la composición comprende además uno o más compuestos antivirales. En algunas realizaciones, la composición antiviral excluye un polisacárido farmacológicamente activo.

En algunas realizaciones, el extracto comprende uno o más glucósidos cardíacos y uno o más precursores de glucósido cardíaco (tales como cardenólidos, cardadienólidos y cardatrienólidos, todos los cuales son los constituyentes de aglicona de los glucósidos cardíacos, por ejemplo, digitoxina, acetil digitoxinas, digitoxigenina, digoxina, acetil digoxinas, digoxigenina, medigoxina, estrofantinas, cimarina, ouabaina, o estrofantidina). El extracto puede comprender además uno o más constituyentes de glucona de glucósidos cardíacos (tal como glucósido, fructósido, y/o glucurónido) como precursores de glucósido cardíaco. En consecuencia, la composición antiviral puede comprender uno o más glucósidos cardíacos y dos más precursores de glucósido cardíaco seleccionados del grupo que consiste de uno o más constituyentes de aglicona, y uno o más constituyentes de glucona. El extracto también puede comprender uno o más de otros agentes terapéuticamente efectivos no de glucósido cardíaco obtenidos de material vegetal deNeriumsp. oThevetiasp.

En algunas realizaciones, una composición que contiene oleandrina (OL), ácido oleanólico (OA), ácido ursólico (UA) y ácido betulínico (BA) es más eficaz que la oleandrina pura, cuando se comparan dosis equivalentes basadas en el contenido de oleandrina.

En algunas realizaciones, la proporción molar de contenido total de triterpeno (OA UA BA) a oleandrina varía de cerca de 15:1 a cerca de 5:1, o cerca de 12:1 a cerca de 8:1, o cerca de 100:1 a cerca de 15:1, o cerca de 100:1 a cerca de 50:1, o cerca de 100:1 a cerca de 75:1, o cerca de 100:1 a cerca de 80:1, o cerca de 100:1 a cerca de 90:1, o cerca de 10:1.

En algunas realizaciones, las proporciones molares de los triterpenos individuales a oleandrina varían como sigue: cerca de 2-8 (OA) : cerca de 2-8 (UA) : cerca de 0.1-1 (BA) : cerca de 0.5-1.5 (OL); o cerca de 3-6 (OA) : cerca de 3-6 (UA) : cerca de 0.3-8 (BA) : cerca de 0.7-1.2 (OL); o cerca de 4-5 (OA) : cerca de 4-5 (UA) : cerca de 0.4-0.7 (BA) : cerca de 0.9-1.1 (OL); o cerca de 4.6 (OA) : cerca de 4.4 (UA) : cerca de 0.6 (BA) : cerca de 1 (OL).

En algunas realizaciones, el otro agente terapéutico, tal como ese obtenido por extracción de material vegetalNeriumsp. oThevetiasp., no es un polisacárido obtenido durante la preparación del extracto, lo que significa no es un homopoligalacturonano o arabinogalaturonano ácido. En algunas realizaciones, el extracto excluye otro agente terapéutico y/o excluye un homopoligalacturonano o arabinogalaturonano ácido obtenido durante la preparación del extracto.

En algunas realizaciones, el otro agente terapéutico, tal como el obtenido por extracción de material vegetal deNeriumsp. oThevetiasp., es un polisacárido obtenido durante la preparación del extracto, por ejemplo, un homopoligalacturonano o arabinogalaturonano ácido. En algunas realizaciones, el extracto comprende otro agente terapéutico y/o comprende un homopoligalacturonano o arabinogalaturonano ácido obtenido durante la preparación del extracto de dicho material vegetal.

En algunas realizaciones, el extracto comprende oleandrina y por lo menos otro compuesto seleccionado del grupo que consiste de glusósido cardíaco, glucona, aglicona, esteroide, triterpeno, polisacárido, sacárido, alcaloide, grasa, proteína, neritalósido, odorósido, ácido oleanólico, ácido ursólico, ácido betulínico, oleandrigenina, oleásido A, betulina (urs-12-ene-3p,28-diol), 28-norurs-12-en-3p-ol, urs-12-en-3p-ol, ácido 3p,3p-hidroxi-12-oleanen-28-oico, ácido 3p,20adihidroxiurs-21-en-28-oico, ácido 3p,27-dihidroxi-12-ursen-28-oico, ácido 3p,13p-dihidroxiurs-11-en-28-oico, 3p,12adihidroxioleanan-28,13p-olida, ácido 3p,27-dihidroxi-12-oleanan-28-oico, homopoligalacturonano, arabinogalaturonano, ácido clorogénico, ácido caféico, ácido L-quínico, 4-cumaroil-CoA, ácido 3-O-cafeoilquínico, ácido 5- O-cafeoilquínico, cardenólido B-1, cardenólido B-2, oleagenina, neridiginósido, nerizósido, odorósido-H, 3-beta-O-(D-diginosil)-5-beta, Polisacárido péctico 14 beta-dihidroxi-card-20(22)-enolido compuesto de ácido galacturónico, ramnosa, arabinosa, xilosa, y galactosa, polisacárido con PM en el intervalo de 17000-120000 D, o PM cerca de 35000 D, cerca de 3000 D, cerca de 5500 D, o cerca de 12000 D, cardenólido monoglucósido, cardenólido N-1, cardenólido N-2, cardenólido N-3, cardenólido N-4, pregnano, 4,6-dieno- 3,12,20-triona, 20R-hidroxipregna-4,6-dieno-3,12-diona, 16beta,17beta-epoxi-12beta-hidroxipregna-4,6-dieno-3,20-diona, 12beta-hidroxipregna-4,6,16-trieno-3,20-diona (neridienona A), 20S,21-dihidroxipregna-4,6-dieno-3,12-diona (neridienona B), ácido neriucumárico, ácido isoneriucumárico, ácido oleanderoico, oleanderen, ácido 8alfa-metoxilabdan-18-oico, 12-urseno, kanerósido, neriumósido, 3p-0-(D-diginosil)-2a- hidroxi-8,14pepoxi-5p-carda-16:17, 20: 22- dienólido, 3p-0-(D-diginosil)-2a,14p- dihidroxi-5p- carda-16:17,20:22-dienólido, 3p,27-dihidroxi-urs-18-en-13,28-ólido, 3p,22a,28-trihidroxi-25-nor-lup-1(10),20(29)-dien-2-ona, c/s-karenin (ácido 3p-hidroxi-28-Z-p-cumaroiloxi-urs-12-en-27-oico), trans-karenin (ácido 3-p-hidroxi-28-E-p-cumaroiloxi-urs-12-en-27-oico), 3beta-hidroxi-5alfa-carda-14(15),20(22)-dienólido (beta- anhidroepidigitoxigenina), 3 beta-O-(D-digitalosil)-21-hidroxi-5beta-carda-8,14,16,20(22)-tetraenólido (neriumogenina-A-3beta-D-digitalósido), proceragenina, neridienona A, ácido 3beta,27-dihidroxi-12-ursen-28-oic, ácido 3beta,13beta-dihidroxiurs-11-en-28-oico, 3beta-hidroxiurs-12-en-28-aldehído, 28- orurs-12-en-3beta-ol, urs-12-en-3beta-ol, urs-12-ene-3beta,28-diol, ácido 3beta,27-dihidroxi-12-oleanen-28-oico, (20S, 24R)-epoxidamarano-3beta,25-diol, 20beta,28-epoxi-28alfa-metoxitaraxasteran-3beta-ol, 20beta,28-epoxitaraxaster-21-en-3beta-ol, 28-nor-urs-12-ene-3beta,17 beta-diol, 3beta-hidroxiurs-12-en-28-aldehído, alfa-neriursato, Beta-neriursato, ácido 3alfa-acetofenoxi-urs-12-en-28-oico, ácido 3beta-acetofenoxi-urs-12-en-28-oico, ácido oleanderólico, kanerodiona, ácido 3p-p-hidroxifenoxi-11a-metoxi-12a-hidroxi-20-ursen-28-oico, 28-hidroxi-20(29)-lupen-3,7-diona, kanerocina, ácido 3alfa-hidroxi-urs-18,20-dien-28-oico, D-sarmentosa, D-diginosa, neridiginósido, nerizósido, ácido isoricinoleico, gentiobiosilnerigósido, gentiobiosilbeaumontósido, gentiobiosiloleandrina, folinerina, 12p-hidroxi-5p-carda-8,14,16,20(22)-tetraenólido, 8p-hidroxi-digitoxigenina, A16-8P- hidroxi-digitoxigenina, A16-neriagenina, uvaol, aldehído ursólico, ácido 27(p-cumaroiloxi)ursólico, oleanderol, 16-anhidro-deacteil-nerigósido, ácido 9-D-hidroxi-cis-12-octadecanoico, adigósido, adinerina, alfa-amirina, beta-sitosterol, campestrol, caucho, ácido cáprico, ácido caprílico, colina, cornerina, cortenerina, deacetiloleandrina, diacetil-nerigósido, foliandrina, pseudocuramina, quercetina, quercetin-3-ramnoglucósido, quercitrina, rosaginina, rutina, ácido esteárico, estigmasterol, estrospésido, urehitoxina, y uzarigenina. Componentes adicionales que pueden estar presentes en el extracto se describen por Gupta et al. (IJPSR (2010(, 1(3), 21 -27, toda la descripción del cual se incorpora de este modo para referencia).

La oleandrina también puede ser obtenida de extractos de cultivos en suspensión derivados de callos transformados deAgrobacterium tumefaciens.Se pueden utilziar extractos en agua caliente, solvente orgánico, solvente orgánico acuoso, o fluido supercrítico de agrobacterium de acuerdo con la invención.

La oleandrina también puede ser obtenida de extractos de microcultivo deNerium oleanderin vitro, con lo cual se pueden iniciar brotes de cultivos de plántulas y/o de ápices de brotes de los cultivos deNerium oleander,por ejemplo, Laurel de flor, Flor lunaria o Alsacia, u otros cultivos. Se pueden utilizar extractos en agua caliente, solvente orgánico, solvente orgánico acuoso, o fluido supercrítico de Nerium oleander microcultivado de acuerdo con la invención.

El extracto también puede ser obtenido por extracción de masa celular (tal como está presente en el cultivo celular) de cualquiera de dichas especies de plantas.

La composición farmacéutica puede comprender además una combinación de por lo menos un material seleccionado del grupo que consiste de un co-solvente soluble en agua (miscible), un co-solvente insoluble en agua (inmiscible), un agente tensoactivo, un antioxidante, un agente quelante, y un potenciador de absorción.

El solubilizante es por lo menos un solo agente tensoactivo, pero también puede ser una combinación de materiales tal como una combinación de: a) agente tensoactivo y solvente miscible en agua; b) agente tensoactivo y solvente inmiscible en agua; c) agente tensoactivo, antioxidante; d) agente tensoactivo, antioxidante, y solvente miscible en agua; e) agente tensoactivo, antioxidante, y solvente inmiscible en agua; f) agente tensoactivo, solvente miscible en agua, y solvente inmiscible en agua; o g) agente tensoactivo, antioxidante, solvente miscible en agua, y solvente inmiscible en agua.

La composición farmacéutica opcionalmente comprende además a) por lo menos un portador líquido; b) por lo menos un agente emulsificante; c) por lo menos un agente de solubilización; d) por lo menos un agente dispersante; e) por lo menos otro excipiente; o f) una combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, el solvente miscible en agua es PEG de bajo peso molecular (menos de 6000) PEG, glicol, o alcohol. En algunas realizaciones, el agente tensoactivo es un agente tensoactivo pegilado, lo que significa un agente tensoactivo que comprende un grupo funcional poli(etilen glicol).

La invención incluye todas las combinaciones de los aspectos, realizaciones y sub-realizaciones de la invención descritas en la presente.

Breve descripción de las figuras

Las siguientes figuras forman parte de la presente descripción y describen realizaciones ejemplares de la invención reclamada. El técnico experto, a la luz de estas figuras y la descripción en la presente, será capaz de practicar la invención sin experimentación indebida.

LAS FIGURAS 1 a 2 representan diagramas que resumen la actividad antiviral de respuesta a dosis in vitro de varias composiciones contra el virus de Ébola.

LAS FIGURAS 3 a 4 representan diagramas que resumen la actividad antiviral de respuesta a dosis in vitro de varias composiciones contra el virus de Marburg.

LA FIGURA 5 representa un diagrama que resume la actividad antiviral de respuesta a dosis in vitro de oleandrina contra el virus de Zika (cepa de SIKV PRVABC59) en células Vero E6.

LA FIGURA 6 representa un diagrama que resume la actividad antiviral de respuesta a dosis in vitro de digoxina contra el virus de Zika (cepa de SIKV PRVABC59) en células Vero E6.

La Figura 7 representa un diagrama que resume la actividad antiviral de respuesta a dosis in vitro de varias composiciones (oleandrina, digoxina y PBI-05204) contra el virus de Ébola en células Vero E6.

La Figura 8 representa un diagrama que resume la actividad antiviral de respuesta a dosis in vitro de varias composiciones (oleandrina, digoxina y PBI-05204) contra el virus de Marburg en células Vero E6.

La Figura 9 representa un diagrama que resume la viabilidad celular in vitro de células Vero E6 en la presencia de varias composiciones (oleandrina, digoxina y PBI-05204).

Las Figuras 10A y 10B representan diagramas que resumen la capacidad de las composiciones (oleandrina y PBI-05204) para inhibir el virus de Ébola en células Vero E6 poco después de exposición al virus: La Figura 10A- 2 hr post infección; la Figura 10B- 24 hr post-infección.

Las Figuras 11A y 11B representan diagramas que resumen la capacidad de las composiciones (oleandrina y PBI-05204) para inhibir el virus de Marburg en células Vero E6 poco después de exposición al virus: La Figura 11 A- 2 hr post-infección; la Figura 11B- 24 hr post-infección.

Las Figuras 12A y 12B representan diagramas que resumen la capacidad de composiciones (oleandrina y PBI-05204) para inhibir el producto de progenie infecciosa por células Vero E6 viralmente infectadas que han sido expuestas a oleandrina: La Figura 12A- virus de Ébola; la Figura 12B- virus de Marburg.

Las Figuras 13A y 13B representan diagramas que resumen la actividad antiviral de la respuesta a dosis in vitro de varias composiciones (oleandrina, digoxina y PBI-05204) contra el virus de Encefalomielitis Equina Venezolana (la Figura 13A) y el virus de Encefalomielitis Equina del Oeste (la Figura 13B) en células Vero E6.

La Figura 14 representa un diagrama que resume el efecto que tiene el control de vehículo, oleandrina, o extracto deN. oleanderen la replicación de HTLV-1 o la liberación de partículas virales recientemente sintetizadas según se determina por cuantificación de HTLV-1 p19Gag (véanse los Ejemplos 19 y 20). Se muestran células sin tratar (UT) para comparación. Todos los datos son representativos de por lo menos tres experimentos independientes. Los datos representan la media de los experimentos ± desviación estándar (barras de error).

La Figura 15 representa un diagrama que resume la citotoxicidad relativa del control de Vehículo, oleandrina, y extracto deN. oleandercontra la línea de linfocitos T de linfoma HTLV-1+ SLB1. Todos los datos son representativos de por lo menos tres experimentos independientes. Los datos representan la media de los experimentos ± desviación estándar (barras de error).

Las Figuras 16A a 16F representan micrografías representativas mostrando de los resultados de la tinción con Anexina V-FITC (verde) y PI (rojo) con contraste de fase DIC en las imágenes combinadas. También se proporcionan las imágenes del canal fluorescente individual de Anexina V-FITC y PI. Escala de barra, 20 pm.

La Figura 17 representa un diagrama que resume el efecto que tiene el control de vehículo, oleandrina, o extracto deN. oleanderen la replicación de HTLV-1 o la liberación de partículas virales recientemente sintetizadas de linfocitos T de linfoma HTLV-1+ tratados con oleandrina.

La Figura 18 representa un diagrama que resume la citotoxicidad relativa de control de vehículo, oleandrina, o extracto deN. oleanderen huPBMC tratadas.

La Figura 19 representa un diagrama que resume la inhibición relativa de la transmisión de HTLV-1 en ensayos de co cultivo de huPBMC que contienen control de vehículo, oleandrina, o extracto deN. oleander.

La Figura 20 representa micrografías representativas de una línea de linfocitos T HTLV-1+ SLB1 que expresa GFP: microscopía de fluorescencia (paneles superiores) e inmunotransferencia (paneles inferiores).

La Figura 21 representa micrografías representativas de sinapsis virológicas entre huPBMC y los linfoblastos HTLV-1 SLB1/pLenti-GFP tratados con mitomicina C (células verdes).

La Figura 22 representa un diagrama de los datos promediados con desviación estándar (barras de error) de la cuantificación de las micrografías de la Figura 21.

Las Figuras 23A a 23D representan diagramas de log de la titulación viral de SARS-CoV-2 (PFU/mL) contra el tiempo (h) para células Vero E6 infectadas con el virus SARS-CoV-2 tratadas con oleandrina (barras rojas) o vehículo de control (medio de incubación) (barras negras) a las 24 horas y 48 horas después del “tratamiento” (Ejemplo 28). Las células fueron pretratadas con oleandrina antes de la infección. Después de una incubación inicial de 2 h post-infección, las células infectadas fueron lavadas para remover el virus extracelular y la oleandrina. Luego, las células infectadas recuperadas fueron tratadas como sigue. Las células infectadas fueron tratadas con oleandrina (la Figura 23A: 1 pg/mL en DMSO acuoso al 0.1% con medio de cultivo RPMI 1640 como el componente acuoso; la Figura 23C: 0.1 pg/mL en DMSO acuoso al 0.01% con RPMI 1640) o solo vehículo de control (la Figura 23B: DMSO acuoso al 0.1% con RPMI 1640; la Figura 23D: DMSO acuoso al 0.01% con RPMI 1640), y se midió la titulación viral.

La Figura 24A representa un diagrama doble del eje y de por ciento de inhibición de replicación viral (Y1, eje de la izquierda) y conteo de células Vero-E6 (Y2, eje de la derecha: una expresión de toxicidad celular potencial de oleandrina contra dichas células) contra la concentración de oleandrina (pg/mL) en el medio de cultivo a las 24 h post-infección (Ejemplo 29). La Figura 24B es para los cultivos de la Figura 24A pero tomada a las 48 h post-infección.

La Figura 25 representa un diagrama de por ciento de células Vero-E6 (titulación de células) contra la concentración de oleandrina (pg/mL) en el medio de cultivo a las 24 h después de exposición continua de las células a las concentraciones indicadas de oleandrina (Ejemplo 30).

Las Figuras 26A a 26B representan diagramas de log de titulación viral de SARS-CoV-2 (PFU/mL) contra la concentración de oleandrina en el medio de cultivo para células VERO CCL-81(células normales de riñón de ceropithecus aethiops; https://www.atcc.org/products/all/CCL-81.aspx) infectadas con el virus SARs-CoV-2 y luego tratadas con oleandrina (círculos azules) o vehículo de control (medio de incubación) (cuadros rojos) a las 24 horas (la Figura 26A) y 48 horas (la Figura 26B) después de “tratamiento” (Ejemplo 31).

Para las muestras de las Figuras 26A y 26B, las veces de reducción en la titulación viral fue determinada a las 24 horas (la Figura 26C) y 48 horas (figura 26D).

Las Figuras 27A a 27D representan diagramas de log de titulación viral de SARS-CoV-2 (PFU/mL) contra tiempo (h) para células Vero E6 infectadas con el virus de SARS-CoV-2 tratadas con oleandrina (círculos azules) o vehículo de control (medio de incubación) (cuadros rojos) a las 24 horas y 48 horas después de “tratamiento” (Ejemplo 28). Las células fueron pretratadas con oleandrina antes de la infección. Después de una incubación inicial de 2 h post-infección, las células infectadas fueron lavadas para remover el virus extracelular y la oleandrina. Luego, las células infectadas recuperadas fueron tratadas como sigue. Las células infectadas fueron tratadas con oleandrina (la Figura 27A: 0.005 pg/mL en DMSO acuoso (0.005%) con medio de cultivo RPMI 1640 como el componente acuoso; la Figura 27B: 0.01 pg/mL en DMSO acuoso (0.01%) con RPMI 1640; la Figura 27C: 0.05 pg/mL en<d>M<s>O acuoso (0.05%) con RPMI 1640; la Figura 27B: 0.1 pg/mL en Dm So acuoso (0.1%) con RPMI 1640), y se midió la titulación viral.

Las Figuras 28A y 28B representan diagramas de log de titulación viral de SARS-CoV-2 (PFU/mL) contra concentración de oleandrina en el medio de cultivo para células VERO 81 infectadas con virus de SARS-CoV-2 y luego tratadas con oleandrina (círculos azul oscuro (Exp. 2) y círculos azul claro (Exp. 3)) o vehículo de control (medio de incubación) (cuadros rojo oscuro (Exp. 2) y cuadros rojo claro (Exp. 3)) a las 24 horas (la Figura 28A) y 48 horas (la Figura 28B) después de “tratamiento”. Exp. 2 y Exp. 3 son meramente corridas por duplicado del ensayo.

Las Figuras 29A y 29B representan gráficos de barras de la titulación viral contra concentración de oleandrina en el medio de cultivo, en donde la titulación viral fue medida a las 24 h (la Figura 29A) y a las 48 h (la Figura 29B) post infección. Para algunas muestras, las células fueron tratadas, antes y después de (2 h) la infección, con oleandrina (barras azules sólidas) o solo vehículo de control de DMSO (barras rojas sólidas). Para otras muestras, las células fueron tratadas con oleandrina (barras azules discontinuas: 12 h post-infección; barras azules huecas: 24 h post infección) o solo vehículo de control de DMSO (barras rojas discontinuas: 12 h post infección; barras rojas huecas: 24 h post-infección).

Las Figuras 30A y 30B representan diagramas para la evaluación de la actividad anti-COVID-19 de la composición de combinación de extracto doble (PBI-A). Para la Figura 30B, la designación mg/ml (concentración de oleandrina) supone que el PBI-A fue suministrado como 1mg/ml de solución (concentración de oleandrina). La titulación viral (Log10 (PFU/mL)) contra factor de dilución Log10 (la Figura 30A) o contra concentración de oleandrina Log10 (la Figura 30B) fue determinada. La Figura 30A es para tratamiento de los datos del ensayo pre-infección del Ejemplo 31, y la Figura 30B es para el tratamiento del ensayo post-infección del Ejemplo 34.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona composiciones para su uso en el tratamiento de una infección viral en un sujeto por administración crónica o aguda de una o más dosis efectivas de la composición antiviral (o composición farmacéutica que comprende la composición antiviral y por lo menos un excipiente farmacéutico) al sujeto. La composición es administrada de acuerdo con un régimen de dosificación más conveniente para el sujeto, la conveniencia de la dosis y el régimen de dosificación a ser determinado clínicamente de acuerdo con las prácticas clínicas convencionales y los puntos finales del tratamiento clínico para infección viral.

Tal como se utiliza en la presente, el término “sujeto” significa animales de sangre caliente tales como mamíferos, por ejemplo, gatos, perros, ratones, cobayos, caballos, vacas bovinas, ovejas, y humanos.

Tal como se utiliza en la presente, un sujeto en riesgo de de infección viral es: a) un sujeto que vive en un área geográfica dentro de la que viven mosquitos, en particular la especie de mosquitosAedes (Aedes egypti, Aedes albopictus);b) un sujeto que vive con o cerca de una person o personas que tienen infección viral; c) un sujeto que tiene relaciones sexuales con una persona que tiene una infección viral; d) un sujeto que vive en un área geográfica dentro de la que viven garrapatas, en particular garrapatas de la especieIxodes(especieIxodes marx, Ixodes scapularis,o Ixodes cooke);e) un sujeto que vive en un área geográfica dentro de la que viven murciélagos de la fruta; f) sujetos que viven en una región tropical; g) sujetos que viven en África; h) sujetos en contacto con fluidos corporales de otros sujetos que tienen una infección viral; i) un niño; o j) un sujeto con un sistema inmune debilitado. En algunas realizaciones, el sujeto es una hembra, una hembra capaz de tener embarazo, o una hembra embarazada.

Un sujeto tratado con las composiciones para su uso de la invención exhibirá una respuesta terapéutica. Por “respuesta terapéutica” se entiende que un sujeto que sufre de la infección viral disfrutará de por lo menos uno de los siguientes beneficios clínicos como un resultado del tratamiento con un glucósido cardíaco: Reducción de la titulación viral activa en la sangre o plasma del sujeto, erradicación del virus activo de la sangre o plasma del sujeto, mejora de la infección, reducción en la ocurrencia de síntomas asociados con la infección, remisión parcial o total de la infección o aumento del tiempo para la progresión de la infección, y/o reducción en la infectividad del virus que provoca dicha infección viral. La respuesta terapéutica puede ser una respuesta terapéutica total o parcial.

Tal como se utiliza en la presente, “tiempo para la progresión” es el periodo, longitud o duración de tiempo después de que se diagnosticó la infección viral (o se trató) hasta que la infección comienza a empeorar. Es el periodo de tiempo durante el que el nivel de la infección se mantiene sin mayor progresión de la infección, y el periodo de tiempo termina cuando la infección comienza a progresar de nuevo. La progresión de una enfermedad se determina por la “clasificación” de un sujeto que sufre de la infección antes de o al inicio de la terapia. Por ejemplo, la salud del sujeto se determina antes de o al inicio de la terapia. El sujeto es luego tratado con la composición antiviral, y la titulación viral se monitorea periódicamente. En algún punto de tiempo posterior, los síntomas de la infección pueden empeorar, marcando así la progresión de la infección y el final del “tiempo para la progresión”. El periodo de tiempo durante el cual la infección no progresó o durante el cual el nivel o gravedad de la infección no empeoró es el “tiempo para la progresión”.

Un régimen de dosificación incluye una dosis terapéuticamente relevante (o dosis efectiva) de uno o más glucósidos cardíacos, y/o triterpeno(s), administrados de acuerdo con un programa de dosificación. Una dosis terapéuticamente relevante, por lo tanto, es una dosis terapéutica a la que se observa una respuesta terapéutica de la infección viral al tratamiento con la composición antiviral y a la que a un sujeto se le puede administrar la composición antiviral sin una cantidad excesiva de efectos secundarios indeseados o dañinos. Una dosis terapéuticamente relevante no es letal para un sujeto, incluso si puede provocar algunos efectos secundarios en el paciente. Es una dosis a la que el nivel del beneficio clínico para un sujeto que está siendo administrado con la composición antiviral excede el nivel de efectos secundarios dañinos experimentados por el sujeto debido a la administración de la composición antiviral o componente(s) de la misma. Una dosis terapéuticamente relevante variará de sujeto a sujeto de acuerdo con una variedad de principios farmacológicos, farmacodinámicos y farmacocinéticos establecidos. Sin embargo, una dosis terapéuticamente relevante (relativa, por ejemplo, a oleandrina) típicamente será cerca de 25 microgramos, cerca de 100 microgramos, cerca de 250 microgramos, cerca de 500 microgramos o cerca de 750 microgramos de glucósido cardíaco/día o puede estar en el intervalo de cerca de 25-750 microgramos de glucósido cardíaco por dosis, o puede no exceder cerca de 25 microgramos, cerca de 100 microgramos, cerca de 250 microgramos, cerca de 500 microgramos o cerca de 750 microgramos de glucósido cardíaco/día. Otro ejemplo de un dosis terapéuticamente relevante (relativa, por ejemplo, a triterpeno ya sea individualmente o en conjunto) típicamente estará en el intervalo de cerca de 0.1 microgramo a 100 microgramos, cerca de 0.1 mg a cerca de 500 mg, cerca de 100 a cerca de 1000 mg por kg de peso corporal, cerca de 15 a cerca de 25 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 50 a cerca de 100 mg/kg, cerca de 100 a cerca de 200 mg/kg, cerca de 200 a cerca de 500 mg/kg, cerca de 10 a cerca de 750 mg/kg, cerca de 16 a cerca de 640 mg/kg, cerca de 15 a cerca de 750 mg/kg, cerca de 15 a cerca de 700 mg/kg, o cerca de 15 a cerca de 650 mg/kg de peso corporal. Se sabe en la técnica que la cantidad real de composición antiviral requerida para proporcionar un resultado terapéutico diana en un sujeto puede variar de sujeto a sujeto de acuerdo con los principios básicos de farmacia.

El tratamiento con digoxina puede ser realizado utilizando dos o más fases de dosificación: fase de carga y fase de mantenimiento. La fase de carga puede emplear el siguiente régimen de dosificación hasta que se alcancen los niveles en plasma de estado estacionario de digoxina, y la fase de mantenimiento puede emplear el siguiente régimen de dosificación después del término de la fase de carga.

Una dosis terapéuticamente relevante se puede administrar de acuerdo con cualquier régimen de dosificación típicamente usado en el tratamiento de infección viral. Una dosis terapéuticamente relevante se puede administrar una vez, dos veces, tres veces o más diariamente. Se puede administrar un día sí y otro no, cada tercer día, cada cuarto día, cada quinto día, semisemanalmente, semanalmente, bisemanalmente, cada tres semanas, cada cuatro semanas, mensualmente, bimensualmente, semimensualmente, cada tres meses, cada cuatro meses, semianualmente, anualmente, o de acuerdo con una combinación de cualquiera de los anteriores para lograr un programa de dosificación adecuado. Por ejemplo, una dosis terapéuticamente relevante se puede administrar una o más veces diariamente (hasta 10 veces diariamente para la dosis más alta) por una o más semanas.

El Ejemplo 15 proporciona una descripción detallada de un ensayoin vitroutilizado para evaluar la eficacia de composiciones que contiene oleandrina (como único activo), Anvirzel™ (extracto en agua caliente deNerium oleander)y PBI-05204 (extracto en fluido supercrítico (SCF) deNerium oleander)para el tratamiento de infección por el virus de Ébola (Figuras 1 a 2) y virus de Marburg (Figuras 3 a 4), ambos de los cuales son Filovirus.

El extracto en agua caliente se puede administrar oralmente, sublingualmente, subcutáneamente, e intramuscularmente. Una realización está disponible bajo el nombre comercial ANVIRZEL™ (Nerium Biotechnology, Inc., San Antonio, TX; Salud Integral Medical Clinic, Tegucigalpa, Honduras; www.saludintegral.com;www.anvirzel.com) como una forma de dosificación líquida. Para la administración sublingual, un régimen de dosificación típico es 1.5 ml por día o tres dosis de 0.5 ml en un día. Para la administración por inyección, un régimen de dosificación típico es cerca de 1 a cerca de 2 ml/día, o cerca de 0.1 a cerca de 0.4 ml/m2/día por cerca de 1 semana a cerca de 6 meses o más tiempo, o cerca de 0.4 a cerca de 0.8 ml/m2/día por cerca de 1 semana a cerca de 6 meses o más tiempo, o cerca de 0.8 a cerca de 1.2 ml/m2/día por cerca de 1 semana a cerca de 6 meses o más tiempo. Una dosificación más alta se puede utilizar porqu la dosis máxima tolerada de ANVIRZEL™ es mucho más alta. El ANVIRZEL™ comprende oleandrina, oleandrigenina, polisacáridos extraídos (extracción en agua caliente) de Nerium oleander. Los frascos disponibles comercialmente comprenden cerca de 150 mg de extracto de Adelfa como un polvo liofilizado (antes de su reconstitución con agua antes de la administración) que comprende cerca de 200 a cerca de 900 gg de oleandrina, cerca de 500 a cerca de 700 gg de oleandrigenin, y polisacáridos extraídos de Nerium oleander. Dichos frascos también pueden incluir excipientes farmacéuticos tales como por lo menos un agente osmótico, por ejemplo, manitol, cloruro de sodio, por lo menos un agente regulador, por ejemplo ascorbato de sodio con ácido ascórbico, por lo menos un conservante, por ejemplo propilparabeno, metilparabeno.

Los experimentos fueron configurados al agregar las composiciones a células a 40 gg/mL, luego agregando virus e incubando por 1hr. Luego de la adición del virus a las células, la concentración final de las composiciones es 20 gg/mL. Las composiciones que contienen diferentes cantidades de oleandrina pueden ser ajustadas de acuerdo con la concentración de oleandrina que contienen y convirtiendo esa a molaridad. Las Figuras 1 a 4 representan la eficacia basada en el contenido de oleandrina de los extractos. La OL por sí misma es eficaz. PBI-05204, el extracto de SCF de Nerium oleander que comprende OL, OA, UA y BA, es sustancialmente más eficaz que OL por sí misma. Anvirzel™, el extracto en agua caliente de Nerium oleander, es más eficaz que OL por sí misma. Ambos extractos claramente exhiben eficacia en el intervalo nanomolar. El porcentaje de oleandrina en el extracto de PBI-05204 (1.74%) es mayor que en Anvirzel™ (0.459%, 4.59 gg/mg). A la dosis más alta de PBI-05204, inhibió completamente la infección de<e>B<o>V y MARV, mientras que Anvirzel™ no exhibió inhibición completa, porque a una dosis mayor de 20 gg/mL con Anvirzel™, se observó toxicidad. Los datos demuestran la actividad antiviral más alta contra el virus de Ébola y virus de Marburg para PBI-05204. La combinación de triterpenos en PBI-05204 incrementó la actividad antiviral de oleandrina.

El Ejemplo 6 proporciona una descripción detallada de un ensayoin vitroutilizado para evaluar la eficacia de los glucósidos cardíacos para el tratamiento de una infección por el virus de Zika (un flavivirus). Células Vero E6 fueron infectadas con virus de Zika (cepa de ZIKV PRVABC59) a un MOI de 0.2 en la presencia de oleandrina (Figura 5) o digoxina (Figura 6). Las células fueron incubadas con el virus y el glucósido cardíaco por 1 hr, después de lo cual el inoculado y el glucósido cardíaco no absorbido (si lo hubo) fue removido. Las células fueron sumergidas en medio fresco e incubadas por 48 hr, después de que fueron fijadas con formalina y teñidas para la infección de ZIKV. Los datos demuestran actividad antiviral contra el virus de Zika para ambos glucósidos cardíacos; sin embargo, la oleandrina exhibió mayor (casi 8 veces más grande) actividad antiviral que la digoxina.

El Ejemplo 14 proporciona una descripción detallada de un ensayo utilizado para evaluar la actividad antiviral de las composiciones de prueba contra el virus de Zika y el virus de Dengue. Los datos indican que la oleandrina demuestra eficacia contra el virus de Zika y el virus de Dengue.

La Figura 7 un diagrama que resume la actividad antiviral de respuesta a dosis in vitro de varias composiciones (oleandrina, digoxina y PBI-05204) contra el virus de Ébola (EBOV) en células Vero E6. La Figura 8 representa un diagrama que resume la actividad antiviral de respuesta a dosis in vitro de varias composiciones (oleandrina, digoxina y PBI-05204) contra el virus de Marburg (MARV) en células Vero E6. La Figura 9 representa un diagrama que resume la viabilidad celular in vitro de células Vero E6 en la presencia de varias composiciones (oleandrina, digoxina y PBI-05204). Para las Figuras 7 a 8, las células hospederas fueron expuestas a las composiciones antes de la infección con el virus. Células Vero E6 fueron infectadas con EBOV/Kik (Figura 7, MOI=1) o MARV/Ci67 (Figura 8, MOI=1) en la presencia de oleandrina, digoxina o PBI-05204, un extracto vegetal que contiene oleandrina. Después de 1hr, el inoculado y los compuestos fueron removidos y se agregó medio fresco a las células. 48hr más tarde, las células fueron fijadas e inmunoteñidas para detectar las células infectadas con EBOV o MARV. Las células infectadas fueron enumeradas utilizando un Operetta.

Para asegurar que no se observaran falsos positivos, en términos de actividad antiviral, se probó la viabilidad celular en la presencia de las composiciones. Para los datos en la Figura 9, células Vero E6 fueron tratadas con el compuesto como anteriormente. Los niveles de ATP fueron medidos por CellTiter-Glo como una medición de la viabilidad celular. Fue determinado que la oleandrina, digoxina, y PBI-05204 no redujeron la viabilidad celular, lo que significa que la actividad antiviral detallada en otras figuras en la presente no se debe a falsos positivos provocados por toxicidad celular de los compuestos individuales.

En consecuencia, la invención proporciona composiciones para su uso en el tratamiento de una infección viral en un mamífero o célula hospedante, el método comprende: administrar una composición antiviral al mamífero o célula hospedante antes de contraer dicha infección viral, con lo cual tras la infección viral de dicho mamífero o célula hospedante, la composición antiviral reduce la titulación viral y mejora, reduce o elimina la infección viral.

La composición antiviral de la invención también es útil en el tratamiento de una infección viral que ha ocurrido antes de la administración de la composición antiviral. Células Vero E6 fueron infectadas con EBOV (Figuras 10A, 10B) o MARV (Figuras 11A, 11B). A las 2hr post-infección (Figuras 10A, 11A) o 24hr post-infección (Figuras 10B, 11B), se agregó oleandrina o PBI-05204 a las células por 1 hr, luego se desechó y las células fueron regresadas al medio de cultivo.

Las Figuras 10A y 10B representan diagramas que resumen la capacidad de las composiciones (oleandrina y PBI05204) para inhibir el virus de Ébola en células Vero E6 poco después de exposición al virus: La Figura 10A- 2 hr post infección; la Figura 10B- 24 hr post-infección. Cuando la composición antiviral es administrada dentro de dos horas (o dentro de hasta 12 horas) después de la infección viral, la titulación viral de la composición antiviral proporciona tratamiento eficaz y reduce la titulación viral por EBOV. Incluso después de 24 horas, la composición viral es efectiva; sin embargo, su eficacia es menor a medida que aumenta el tiempo después de la infección viral inicial. Las mismas evaluaciones fueron realizadas en MARV. Las Figuras 11A y 11B representan diagramas que resumen la capacidad de las composiciones (oleandrina y PBI-05204) para inhibir el virus de Marburg en células Vero E6 poco después de exposición al virus: La Figura 11A- 2 hr post-infección; la Figura 11B- 24 hr post-infección. Cuando la composición antiviral es administrada dentro de dos horas (o dentro de hasta 12 horas) después de la infección viral, la titulación viral de la composición antiviral proporciona tratamiento eficaz y reduce la titulación viral por MARV. Incluso después de 24 horas, la composición viral es efectiva; sin embargo, su eficacia es menor a medida que aumenta el tiempo después de la infección viral inicial.

Dado que la actividad antiviral de la composición en la presente se reduce por una única generación de células infectadas con el virus, por ejemplo, dentro de 24 horas post-infección, nosotros evaluamos si la composición antiviral es capaz de inhibir la propagación viral, lo que significa inhibir la producción de progenie infecciosa. Células Vero E6 fueron infectadas con EBOV o MARV en la presencia de oleandrina o PBI-05204 y fueron incubadas por 48hr. Los sobrenadantes de cultivos de células infectadas fueron pasados a células Vero E6 frescas, incubadas por 1hr, luego desechados. Las células que contienen el sobrenadante pasado fueron incubadas por 48hr. Las células infectadas con EBOV (B) o MARV (C) fueron evaluadas como se describe en la presente. Las tasas de infección de control fueron 66% para EBOV y 67% para MARV. La composición antiviral de la invención inhibió la producción de progenie infecciosa.

En consecuencia, la composición antiviral de la invención: a) se puede administrar profilácticamente antes de la infección viral para inhibir la infección viral después de la exposición al virus; b) se puede administrar después de la infección viral para inhibir o reducir la replicación viral y la producción de progenie infecciosa; o c) una combinación de a) y b).

La actividad antiviral de la composición antiviral contra Togaviridae alfavirus fue evaluada utilizando el virus VEE y el virus WEE en células Vero E6. Las Figuras 13A y 13B representan diagramas que resumen la actividad antiviral de respuesta a dosis in vitro de varias composiciones (oleandrina, digoxina y PBI-05204) contra el virus de Encefalomielitis Equina Venezolana (Figura 13A) y el virus de Encefalomielitis Equina del Oeste (Figura 13B) en células Vero E6. Células Vero E6 fueron infectadas con el virus de encefalitis equina Venezolana (Figura 13A, MOI=0.01) o virus de encefalitis equina del Oeste (Figura 13B, MOI=0.1) por 18hr en la presencia o ausencia de los compuestos indicados. Las células infectadas fueron detectadas como anteriormente y enumeradas en una Operetta. Se encontró que la composición antiviral de la invención es eficaz.

En consecuencia, la invención proporciona composiciones para su uso en el tratamiento de una infección viral provocada por un virus de la familia Coronaviridae en un sujeto o célula hospedante, donde el método comprende administrar una cantidad efectiva de la composición antiviral, exponiendo de este modo el virus a la composición antiviral y tratando dicha infección viral.

Nosotros evaluamos el uso de oleandrina y el extracto descrito en la presente para el tratamiento de infección de HTLV-1 (virus tipo 1 de leucemia de linfocitos T humana; un retrovirus envuelto; género Deltaretrovirus). Para determinar si el compuesto de oleandrina purificada, o un extracto deN. oleander,podría inhibir la replicación proviral de HTLV-1 y/o la producción y liberación de partículas virales que contienen p19Gag, la línea de linfocitos T de linfoma SLB1 transformado de HTLV-1 que produce el virus fue tratada con concentraciones crecientes de oleandrina o un extracto deN. oleander,o el control de vehículo estéril (DMSO al 20% en ddH2O tratada con MilliQ) y luego incubada por 72 hrs a 37°C bajo CO2 al 10%. Las células fueron peletizadas posteriormente por centrifugación y los niveles relativos de partículas virales que contienen p19Gag extracelular liberadas en los sobrenadantes de cultivo fueron cuantificados al realizar las ELISA Anti-HTLV-1 p19Gag (Zeptometrix).

La Figura 14 representa datos para la cuantificación de HTLV-1 p19Gag expresadod por la línea de linfocitos T de linfoma HTLV-1+ SLB1 tratada oor 72 hrs con el control de vehículo (1.5 pl, 7.5 pl, o 15 pl), o concentraciones crecientes (10 pg/ml, 50 pg/ml, y 100 pg/ml) del compuesto de oleandrina o un extracto deN. oleander(Ejemplo 19 y 20). La replicación viral y la liberación de partículas extracelulares en los sobrenadantes de cultivo fueron cuantificados al realizar las ELISA Anti-HTLV-1 p19Gag (Zeptometrix). La oleandrina no inhibe significativamente la replicación de HTLV-1 o la liberación de partículas virales recientemente sintetizadas. Nosotros determinamos que ninguno del extracto ni la oleandrina solos inhibe significativamente la replicación viral o la liberación de partículas que contienen p19Gag en los sobrenadantes de los cultivos. Nosotros, así, no esperamos actividad antiviral adicional; sin embargo, nosotros descubrimos inesperadamente que las partículas virales recolectadas de las células tratadas exhibieron una reducción de infectividad en las células mononucleares sanguíneas periféricas humanas primarias (huPBMCs). A diferencia de HIV-1, las partículas de HTLV-1 extracelular son deficientemente infecciosas y la transmisión viral ocurre típicamente vía interacciones intercelulares directas a través de una sinapsis virológica.

Las composiciones para su uso según la invención proporcionan así un método de producción de partículas virales de HTLV-1 con reducción de infectividad, el método comprende tratar las partículas virales de HTLV-1 con la composición antiviral para su uso según la invención para proporcionar dichas partículas virales de HTLV-1 con reducción de infectividad.

Para asegurar que la actividad antiviral observada no fue una artimaña debido a la citotoxicidad potencial de la composición antiviral a los linfoblastos de HTLV-1+ SLB1, nosotros luego evaluamos la citotoxicidad de las diferentes diluciones del compuesto de oleandrina purificado y del extracto deN. oleanderen los cultivos de linfoblastos de HTLV-1+ SLB1 tratados (Ejemplo 21). Los linfocitos T de SLB1 fueron tratados con concentraciones crecientes (10, 50, y 100 mg/ml) de oleandrina o un extracto deN. oleanderpor 72 hrs como se describe en la presente. Como un control negativo, las células fueron también tratadas con cantidades crecientes (1.5, 7.5, y 15 ml) de la solución de vehículo que correspondió a los volúmenes utilizados en los cultivos tratados con fármaco. Se incluyeron células tratadas con ciclofosfamida (50 mM; Sigma-Aldrich) como un control positivo para apóptosis. Luego, las muestras fueron lavadas y teñidas con Anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI) y analizadas por miscoscopía de fluorescencia confocal. Los porcentajes relativos de células positivas a Anexina V-FITC y/o PI fueron cuantificadas por miscoscopía de fluorescencia y contando campos visuales por triplicado utilizando una lente de objetivo de 20x.

Los resultados (Figura 15 y Figuras 16A a 16F) indican que la concentración más baja (10 mg/ml) de oleandrina y el extracto deN. oleanderno indujo citotoxicidad/apóptosis significativa. Sin embargo, las mayores concentraciones (cerca de 50 y cerca de 100 mg/ml) del fitoextracto crudo indujo notablemente más apóptosis que el compuesto de oleandrina. Esto es coherente con el hecho de que la oleandrina representa cerca de 1.23% del extracto deN. oleander.La citotoxicidad provocada por la oleandrina no fue significativamente mayor que el control de Vehículo en las células HTLV-1+ SLB1 tratadas.

Nosotros luego investigamos si la oleandrina o un extracto deN. oleanderpodía inhibir la transmisión del virus de una línea de linfocito T de linfoma HTLV-1+ que expresa Proteína Fluorescente Verde (GFP) a las huPBMC en ensayos de co-cultivo (Ejemplo 20). Para estos estudios, linfocitos T de linfoma HTLV-1+ SLB1 fueron tratados con concentraciones crecientes de ya sea el compuesto de oleandrina o el extracto deN. oleander,o el control de vehículo por 72 hrs en placas de microtitulación de 96 pocillos, y luego los sobrenadantes que contienen el virus fueron recolectados y utilizados para infectar directamente células mononucleares de sangre periférica humana (huPBMCs) primarias cultivadas in vitro. Después de 72 hrs, los niveles relativos de partículas virales que contienen p19Gag extracelular liberadas en los sobrenadantes de cultivo, como un resultado de la infección directa, fueron cuantificados al realizar las ELISA Anti-HTLV-1 p19Gag.

La línea de linfocitos T de linfoma de HTLV-1+ SLB1 fue tratada con el control de vehículo, o concentraciones crecientes (10 mg/ml, 50 mg/ml, y 100 mg/ml) del extracto deN. oleandero compuesto de oleandrina por 72 hrs y luego se recolectaron los sobrenadantes que contienen el virus y se utilizaron para infectar directamente huPBMC primarias. El control de vehículo, extracto deN. oleander, u oleandrina fueron también incluidos en el medio de cultivo para las huPBMC. Después de 72 hrs, los sobrenadantes de cultivo fueron recolectados y las cantidades relativas de partículas virales extracelulares producidas fueron cuantificadas al realizar las ELISA Anti-HTLV-1 p19Gag.

Los datos (Figura 17) indican que incluso a la concentración más baja (10 mg/ml) tanto de oleandrina como del extracto deN. oleanderse inhibió la infectividad de las partículas virales que contienen p19Gag recientemente sintetizadas liberadas en los sobrenadantes de cultivo de las células tratadas, con respecto a una cantidad comparable del control de vehículo. Tanto la oleandrina como el extracto crudo inhibieron la formación de sinapsis virológicas y la transmisión de HTLV-1 in vitro. Las partículas virales extracelulares producidas por los linfocitos T de linfoma HTLV-1+ tratados con oleandrina exhiben reducción de infectividad en las huPBMC primarias. De manera importante, la oleandrina exhibe actividad antiviral contra el virus envuelto al reducir la incorporación de la glucoproteína de envolvente en partículas maduras, lo que represents una etapa única del ciclo de infección retroviral.

Para asegurar que la actividad antiviral observada no fue una artimaña debido a la citotoxicidad potencial de la composición antiviral para las huPBMC tratadas, nosotros también investigamos (Ejemplo 21) la citotoxicidad de la oleandrina purificada y el extracto deN. oleander, en comparación con el control negativo de vehículo, en las huPBMC tratadas. Las huPBMC de la fracción de células blancas primarias fueron aisladas y estimuladas con fitohemaglutinina (PHA) y cultivadas en la presencia de interleucina 2 humana recombinante (hIL-2). Las células luego fueron tratadas por 72 hrs con concentraciones crecientes de oleandrina o un extracto deN. oleander,o con volúmenes crecientes del Vehículo. Las muestras fueron teñidas subsecuentemente con Anexina V-FITC y PI y los porcentajes relativos de células apoptóticas (es decir positivas a Anexina V-FITC y/o PI) por campo fueron cuantificadas por microscopía de fluorescencia confocal y se contaron por triplicado.

Los efectos citotóxicos del control de vehículo, extracto deN. oleander, y el compuesto de oleandrina fueron evaluados al tratar huPBMC primarias por 72 hrs, y luego los cultivos fueron teñidos con Anexina V-FITC y PI. Los porcentajes relativos de células apoptóticas (es decir positivas a Anexina V-FITC y/o PI) fueron cuantificadas por microscopía de fluorescencia y conteos de campos visuales por triplicado utilizando una lente de objetivo de 20x. Los números totales de células fueron determinados utilizando microscopía de contraste de fase DIC. Se incluyeron células tratadas con ciclofosfamida (50 pM) como un control positivo para apóptosis. El NA indica que el número de células en esta muestra fue demasiado bajo para la evaluación precisa debido a una mayor toxicidad.

Los datos (Figura 18) indican que la oleandrina exhibió citotoxicidad moderada (por ejemplo, 35-37% a la concentración más baja) en las huPBMC en comparación con el control de vehículo. En contraste, el extracto deN. oleanderfue significativamente citotóxico e indujo altos niveles de muerte celular programada incluso a la concentración más baja. Las huPBMC fueron de algún modo más sensibles a la oleandrina purificada que los linfoblastos de HTLV-1+ SLB1; sin embargo, las huPBMC fueron drásticamente más sensibles al extracto crudo deN. oleanderque también contiene otros compuestos citotóxicos tales como los triterpenos descritos en la presente.

Nosotros también investigamos (Ejemplo 22) si la oleandrina o el extracto deN. oleanderpodría interferir con la transmisión de partículas de HTLV-1 a las huPBMC diana en experimentos de co-cultivo. Para estos estudios, la línea de linfocitos T de HTLV-1+ SLB1 T productora de virus fue tratada con mitomicina C y luego con cantidades crecientes de oleandrina, extracto deN. oleander,o el control de vehículo por ya sea 15 min o 3 hrs. Las células SLB1 fueron lavadas 2X con medio libre de suero y los números equivalentes de las huPBMC luego fueron agregados a cada pocillo, y las muestras fueron co-cultivadas por 72 hrs en medio completo a 37°C bajo CO2 al 10% en una incubadora humidificada. La transmisión intercelular relativa de HTLV-1 fue evaluada al realizar las ELISA Anti-HTLV-1 p19Gag para medir los niveles de virus extracelular liberado en los sobrenadantes de cultivo.

Las huPBMCs primarias fueron co-cultivadas con linfocitos T de linfoma HTLV-1+ SLB1 tratados con mitomicina C que fueron pre-tratados por ya sea 15 min o 3 hrs con el control de vehículo, o con concentraciones crecientes (10 pg/ml, 50 pg/ml, y 100 pg/ml) del extracto deN. oleandero compuesto de oleandrina. El control de vehículo, extracto, y compuesto también estuvieron presentes en el medio de co-cultivo. Después de 72 hrs, los sobrenadantes fueron recolectados, y las cantidades de las partículas virales extracelulares liberadas fueron cuantificadas al realizar las ELIS Anti-HTLV-1 p19Gag.

Los resultados representados en la Figura 19 demuestran que tanto la oleandrina como el extracto deN. oleanderinhibieron la transmisión de HTLV-1 en comapración con el control de vehículo; aunque, no hubo diferencias observadas entre el pretratamiento de 15 min y 3 hrs de las células HTLV-1+ SLB1

Nosotros también investigamos si la oleandrina inhibe la formación de sinapsis virológica y la transmisión de HTLV-1 en ensayos de co-cultivo (Ejemplo 22). Una línea de linfocitos T HTLV-1+ SLB1 que expresa GFP fue generada al transducir linfocitos T de linfoma SLB1 con un vector pLenti-6.2/V5-DEST-GFP con selección en blasticidina (5 pg/ml; Life Technologies) por dos semanas. Los clones positivos a GFP fueron seleccionados por microscopía de fluorescencia (Figura 20 paneles superiores) e inmunotransferencia (Figura 20 paneles inferiores) y expandidos y pasados repetidamente. L imagen de contraste de fase DIC se proporciona para comparación.

La formación de sinapsis virológicas entre las huPBMC y linfoblastos HTLV-1+ SLB1/pLenti-GFP (células verdes) tratadas con mitomicina C que habían sido pretratadas por 3 hrs con el control de vehículo o cantidades crecientes (10 pg/ml, 50 pg/ml, y 100 pg/ml) del extracto deN. oleandero compuesto de oleandrina fue visualizada por microscopía de fluorescencia (Figura 21). La transmisión del virus fue evaluada por cuantificación de los porcentajes relativos de las huPBMC infectadas (es decir positivas a HTLV-1 gp21, rojo) (negativas a GFP) en 20 campos visuales (n=20) por microscopía de fluorescencia utilizando una lente de objetivo de 20x (véanse las flechas en los paneles de control de vehículo). Los datos de microscopía de fluorescencia fueron cuantificadas (Figura 22). Los datos confirman que la composición antiviral inhibe la formación de sinápsis virológica y la transmisión de HTLV-1 en ensayos de co-cultivo.

La actividad antiviral de las composiciones en la presente fue evaluada contra infección de rhinovirus. El rhinovirus es de la familia Picornaviridae y del género Enterovirus. No está envuelto y es un virus de ss-ARN de polaridad (+). Se encontró que la oleandrina es inactiva contra el rhinovirus en las concentraciones y ensayos empleados en la presente, porque no inhibió la replicación viral.

La infección por CoV puede ser tratada in vivo como se detalla en el Ejemplo 26, en donde la composición antiviral es administrada a un sujeto como monoterapia o terapia de combinación. La eficacia de la oleandrina contra CoV fue establecidain vivode acuerdo con el Ejemplo 27. En una pequeña porción de jugo de naranja, un niño fue administrado con 0.25 ml de ANVIRZEL™ reconstituido. Luego cada 12 horas, el niño fue administrado con 0.5 ml de ANVIRZEL™ reconstituido por un periodo de cerca de 2-3 días. El infante se recuperó de infección de COVID-19.

Evidencia posterior de la eficacia de la oleandrina (composición que contiene oleandrina) contra el coronavirus, por ejemplo, SARS-CoV-2 (COVID-19), fue obtenida a través de evaluación in vitro de acuerdo con el Ejemplo 28, en donde las células Vero fueron pretratadas con oleandrina y luego infectadas con SARS-CoV-2. Después de la infección de las células, el virus extracelular y la oleandrina fueron lavadas, y las células infectadas luego fueron tratadas con oleandrina (Figura 23A: 1 gg/mL en DMSO acuoso al 0.1% v/v; Figura 23C: 0.1 gg/mL en DMSO acuoso al 0.01% v/v) o solo DMSO acuoso como vehículo de control (Figura 23B: DMSO acuoso al 0.1% v/v; Figura 23D: DMSO acuoso al 0.01% v/v). Los resultados indican que a) el pretratamiento de oleandrina provocó una reducción de 1368 veces en la carga viral a las 24-h de punto tiempo y una reducción de 369 veces a las 48-h de punto de tiempo; b) la oleandrina es eficaz sobre todo el intervalo de concentración de cerca de 0.1 a cerca de 1.0 gg/mL con la mayor dosis siendo ligeramente mejor que la menor dosis de modo que es muy probable que la oleandrina sea eficaz incluso a menores concentraciones, por ejemplo 0.01 a 0.1 gg/mL; c) la oleandrina debe ser administrada repetidadmente, ya que una sola dosis no es suficiente para detener completamente la replicación viral; y d) utilizando solo 30 min de preincubación de células Vero con oleandrina es solo ligeramente efectivo en reducir la infección viral inicial y no parece tener impacto en la infectividad de los viriones de la progenie. Los resultados también indicaron que la oleandrina a concentraciones de 0.1 y 1.0 gg/mL no es extremadamente tóxica para las células Vero. Los resultados indican además que la oleandrina inhibe la infectividad del virus de progenie por a) cerca de 1 log<10>sin tratamiento continuo del fármaco; y b) cerca de >3 log<10>con tratamientos continuos del fármaco (sin toxicidad).

Para determinar si la oleandrina inhibe directamente la replicación viral, células Vero-E6 fueron infectadas con el virus de SARS-CoV-2 y tratadas con oleandrina a varias concentraciones de acuerdo con el Ejemplo 29. Los resultados se representan en las Figuras 24A y 24B. A las 24 h de punto de tiempo (Figura 24A), en los pocillos tratados solo con oleandrina durante la fase de absorción (datos de Pretratamiento), se observó actividad antiviral con una IC<50>estimada de 0.625 gg/mL. En pocillos tratados con oleandrina por la duración del ensayo (datos de duración), la oleandrina limitó significativamente la entrada del virus y/o la replicación viral incluso en la presencia de altas cantidades de virus inoculante. A las 48-h de punto de tiempo (Figura 24B), en pocillos tratados solo con oleandrina durante la fase de absorción (datos de Pretratamiento), se observó mínima actividad antiviral hacia el final del periodo de tiempo. En pocillos tratado con oleandrina por la duración del ensayo (datos de duración), la oleandrina limitó significativamente la infección viral. Los métodos potenciales de acción incluyen inhibición de replicación viral, de ensamblaje, y/o de egreso.

Para asegurar que la actividad antiviral observada de oleandrina contra SARS-CoV-2 no se debió a toxicidad celular de la oleandrina contra las células Vero-E6, se determinó la titulación celular a las 24-h (Figura 24A) y 48-h (Figura 24B) de puntos de tiempo. A concentraciones de oleandrina de 1.0 gg/mL o mayores, apareció la toxicidad celular e interfirió potencialmente con el ensayo; sin embargo, a las concentraciones de oleandrina de 0.625 gg/mL o menor, la interferencia de la de toxicidad celular se redujo sustancialmente, confirmando de este modo la fuerte actividad antiviral de la oleandrina incluso a muy bajas concentraciones. Evidencia adicioal del grado de toxicidad de la oleandrina contra células Vero-E6 fue observada en el ensayo del Ejemplo 30 (Figura 25). A una concentración de oleandrina de 0.625 gg/mL, cerca de 80% de las células Vero permanecieron viables a las 24 h de punto de tiempo, e incluso se observó menos toxicidad a menores concentraciones. Se debe entender que la toxicidad de la oleandrina contra las células Vero-E6 no sugiere que la oleandrina es tóxica para los humanos. Esta medida de toxicidad se utiliza simplemente para determinar el impacto potencial de la muerte celular de fondo cuando se mide la actividad antiviral.

La oleandrina así posee por lo menos un mecanismo doble (ruta) para el tratamiento de una infección viral, en particular infección por coronavirus, por ejemplo, infección por SARS-CoV-2: a) inhibición directa de replicación viral; y b) reducción de infectividad del virus de progenie.

Asímismo, la oleandrina posee actividad antiviral incluso a muy bajas dosis y la oleandrina exhibe un efecto profiláctico sustancial. Esto fue demostrado de acuerdo con el Ejemplo 31, en donde células VERO CCL-81 fueron infectadas con SARS-CoV-2. Las células fueron pretratadas con oleandrina antes de la infección. Después de una incubación inicial de 2 h post-infección, las células infectadas fueron lavadas para remover el virus extracelular y la oleandrina. Luego, las células infectadas recuperadas fueron tratadas como sigue. Las células infectadas fueron tratadas con oleandrina (varias concentraciones en DMSO acuoso con medio de cultivo RPMI 1640 como el componente acuoso) o solo vehículo de control (DMSO acuoso con RPMI 164), y la titulación viral fue medida a las 24 horas (Figura 26A) y 48 horas (Figura 26B) después de “tratamiento”. En la ausencia de oleandrina, el SARS-CoV-2 alcanzó altas titulaciones (aproximadamente 6 log<10>unidades formadoras de placa (pfu)/ml) para el punto de tiempo de 24 horas y se mantuvo esa titulación en el punto de tiempo posterior: permaneció consistentemente ya sea en o debajo del límite de detección para el ensayo. Las concentraciones de oleandrina de 1 gg/mL a 0.05 gg/mL proporcionaron una reducción sustancial en la titulación viral incluso en solo 24 horas. Las dos dosis más altas redujeron la titulación viral esencialmente en o debajo del límite de detección, y no se observó toxicidad celular en cualquiera de las concentraciones probadas de oleandrina. El número de veces de reducción en la titulación viral fue calculado para estas muestras. El número de veces de reducción (Figuras 26C y 26D) en la titulación viral que varió de cerca de 1,000 veces a cerca de 40,000 veces fue observado en el punto de tiempo de 48-h y cerca de 1,000 veces a cerca de 20,000 veces en el punto de tiempo de 24 h. Incluso, la dosis de 10 ng/ml, que no tuvo un efecto significativo en comparación con su control de DMSO a las 24 horas post-infección, resultó en una reducción significativa en la titulación a las 48 horas post-infección. De manera importante, la reducción atribuíble a oleandrina aumentó para las concentraciones más altas cuando se midió a las 48 horas en comparación con las 24 horas. El aumento de la eficacia profiláctica de la oleandrina con el tiempo (24 contra 48 horas) fue reflejada en sus valores de EC<50>, calculados a 11.98ng/ml a las 24 horas post-infección y 7.07ng/ml a las 48 horas post-infección.

Las células Vero 81 descritas antes fueron sometidas a análisis de genoma para determinar si la inhibición de SARS-CoV-2 estuvo al nivel del total o de la producción de partícula infecciosa. Se extrajo ARN de los sobrenadantes de cultivo celular del estudio profiláctico, y se cuantificaron equivalentes genómicos vía qRT-PCR (Ejemplo 39). El efecto profiláctico de oleandrina, observado inicialmente vía ensayo infeccioso, fue confirmado al nivel de equivalentes del genoma. A las 24 horas post-infección, la oleandrina disminuyó significativamente los genomas de SARS-CoV-2 en el sobrenadante a las cuatro dosis más altas. El efecto profiláctico de oleandrina, observado inicialmente vía ensayo infeccioso, fue confirmado al nivel de equivalentes del genoma. A las 24 horas post-infección, la oleandrina disminuyó significativamente los genomas de SARS-CoV-2 en el sobrenadante a las cuatro dosis más altas.

Estudios adicionales fueron realizados para feterminar la respuesta a la dosis de la infección por COVID-19 para oleandrina (Figuras 27A a 27B) a las 24 h y 48 h post-infección. Se observó una respuesta a dosis, en donde el aumento de la concentración de oleandrina en el medio de cultivo proporcionó una mayor reducción de la titulación viral; sin embargo, incluso la concentración más baja probada (0.05 pg/mL) resultó en una reducción de la titulación a las 24 h y una reducción de la titulación incluso mayor a las 48 h post-infección. La dosis más alta resultó en una reducción mayor que 1,000 veces la titulación infecciosa de SARS-CoV-2, con la dosis de 0.5 pg/ml y 100 ng/ml provocando reducciones de más de 100 veces, y la dosis de 50ng/ml resultando en una reducción de 78 veces.

Las Figuras 28A y 28B representan los resultados de estudios por duplicado, cada uno realizado por triplicado, para determinar la respuesta a dosis del COVID-19 al tratamiento con concentraciones variables (0.005 a 1 pg/mL) de oleandrina en el medio de cultivo. Se observó actividad antiviral sustancial incluso 24 h y 48 h post-infección en células Vero 81 para concentraciones arriba de 0.01 pg/mL. Incluso a una muy baja concentración de 0.05 pg/mL se observó una gran reducción en la titulación viral.

Para determinar la eficacia antiviral de oleandrina post-infección, se realizó un estudio de acuerdo con el Ejemplo 34. Las células Vero 81 no fueron pretratadas con oleandrina antes de la infección. En cambio, las células fueron infectadas con el virus de COVID-19 y luego tratadas con oleandrina (a las concentraciones indicadas) a las 12 h y 24 h post-infección. La titulación viral luego fue medida a las 24 h (Figura 29A) y 48 h (Figura 29B) post-infección. Los datos demuestran que incluso con solo un único tratamiento, la oleandrina es capaz de ejercer actividad antiviral por lo menos por 12, por lo menos 24 h, o por lo menos 36 h post-infección. Es importante apreciar que este ensayo es un ensayo comprimido en el tiempo en comparación con la infección viral humana. El punto de tiempo de 24 h podría ser equivalente a cerca de 5 a 7 días post-infección en un humano, y el punto de tiempo de 48 h podría ser equivalente a cerca de 10 a 14 días post infección en un humano.

Los ensayos de los Ejemplos 31 y 34 fueron repetidos utilizando la composición de combinación de extracto doble (PBI-A, que contiene 1% en peso del extracto etanólico 1% en peso del Ejemplo 36 disuelto en DMSO (98% en peso)). La Figura 30A detalla los resultados para la evaluación de la composición de combinación de extracto doble de acuerdo con el ensayo del Ejemplo 31, y la Figura 30B detalla los resultados para la evaluación del extracto doble (1% en peso) de acuerdo con el ensayo del Ejemplo 34. Los datos de la figura 30A demuestran eficacia antiviral relativa (anti-COVID-19) de PBI-A con base en la dilución rlativa de la solución de reserva original. Los datos de la figura 30B se basan en la concentración relativa de oleandrina (mg/mL) en la solución de ensayo. La línea punteada en cada gráfico representa la concentración más baja del virus que puede ser detectada utilizando el ensayo de CFU (unidad formadora de colonia del virus).

Con base en los resultados en las Figuras 30A y 30B, la composición de combinación de extracto doble es efectiva como un agente antiviral contra COVID-19 a las concentraciones que incluyen 0.05 a 1.0 mg/ml que es el mismo intervalo que ese observado con oleandrina pura.

También es importante observar que las concentraciones de oleandrina evaluadas en los ensayos son clínicamente relevantes en términos de dosificación y concentración en plasma.

Prueba de la seguridad de la composición que contiene oleandrina fue proporcionada además por el ensayo celularin vitropara determinar la liberación de lactato deshidrogenasa después de exposición de dichas células a soluciones que contienen diferentes concentraciones de oleandrina. Se determinó que hasta las concentraciones de 1 pg/mL, no hubo toxicidad adicional sobre el vehículo de control.

La eficacia de oleandrina (composición que contiene oleandrina, extracto que contiene oleandrina) en el tratamiento de infección viral por COVID-19 fue establecida después por la administración de la forma de dosis sublingual que contiene oleandrina (Ejemplo 32 o 37) a sujetos de acuerdo con el Ejemplo 35 bajo el programa de Acceso Extendido de la FDA. Sujetos que variaron en edades de 18 a 78 y de edad avanzada fueron administrados con cuatro dosis de oleandrina de 15 pg (como la composición de extracto doble) por día espaciadas a intervalos de cerca de 6 h o tres dosis de 15 mg por día espaciadas a intervalos de cerca de 8 h. Antes del inicio del tratamiento, se observaron el estado clínico de los sujetos y/o la titulación viral. Algunos sujetos estuvieron en cuidados paliativos o cuidado de hospicio. El estado clínico y/o las titulaciones virales fueron determinada periódicamente durante el periodo de tratamiento de una a dos semanas, diez a catorce días. Los siguientes resultados fueron observados después del inicio del tratamiento.

Estudios adicionalesin vivobajo el programa de Acceso Extendido de la FDA fueron realizados en un segundo grupo de sujetos humanos que exhibían diferentes niveles de sintomatología asociada con COVID-19. Antes del inicio del tratamiento, se determinaron el estado clínico de los sujetos y/o la titulación viral para confirmar la infección por COVID-19. Algunos sujetos exhibieron sintomatología moderada a severa. Los sujetos de edades variables fueron administrados con cuatro dosis de oleandrina de 15 pg (como la composición de extracto doble) por día espaciadas a intervalos de cerca de 6 h. El estado clínico y/o las titulaciones virales fueron determinada periódicamente durante el periodo de tratamiento de una a dos semanas, diez a catorce días. Todos los sujetos se recuperaron completamente de la infección de COVID-19 dentro de cinco a doce días después del inicio del tratamiento.

La oleandrina también ha mostrado producir una fuerte respuesta antiinflamatoria, que puede ser de beneficio para prevenir las respuestas híper-inflamatorias para la infección con SARS-CoV-2.

La invención así proporciona composiciones para su uso en el tratamiento de infección viral por COVID-19 que comprende la administración de dosis plurales de glucósido cardíaco (composición que contiene glucósido cardíaco, o extracto que contiene glucósido cardíaco) a un sujeto que tiene dicha infección. Las dosis plurales pueden ser divididas como una o más dosis por día por dos o más días por semana, opcionalmente por una o más semanas por mes y además opcionalmente por uno o más meses por año. El glucósido cardíaco preferido es oleandrina.

La invención así proporciona composiciones para su uso en el tratamiento de una infección por coronavirus, en particular una infección de coronavirus que es patogénica a humanos, por ejemplo, infección por SARS-CoV-2, el método comprende administrar crónicamente a un sujeto, que tiene dicha infección, dosis terapéuticamente efectivas de glucósido cardíaco (composición que contiene glucósido cardíaco). La administración crónica puede ser lograda al administrar repetidamente una o más dosis (plurales) terapéuticamente efectivas de glucósido cardíaco (composición que contiene glucósido cardíaco). Una o más dosis se pueden administrar por día por uno o más días por semana y opcionalmente por una o más semanas por mes y opcionalmente por uno o más meses por año.

En consecuencia, la invención proporciona composiciones para su uso en el tratamiento viral de infección por CoV en un sujeto (en particular un sujeto humano) en necesidad del mismo que comprende administrar al sujeto una o más dosis de la composición antiviral que comprende a) oleandrina; o b) oleandrina y uno o más de otros compuestos extraídos de la especieNerium.La oleandrina puede estar presente como parte de un extracto de la especieNerium, dicho extracto puede ser un a) extracto en fluido supercrítico; b) extracto en agua caliente; c) extracto en solvente orgánico; d) extracto en solvente orgánico acuoso; e) extracto utilizando fluido supercrítico, opcionalmente más por lo menos un solvente orgánico (modificador de extracción); f) extracto utilizando líquido subcrítico, opcionalmente más por lo menos un solvente orgánico (modificador de extracción); o g) cualquier combinación de cualquiera dos o más de dichos extractos.

PBI-05204 (como se describe en la presente y en la US 8187644 B2 de Addington, que se emitió el 29 de mayo de 2012, US 7402325 B2 de Addington, que se emitió el 22 de julio de 2008, US 8394434 B2 de Addington et al, que se emitió el 12 de marzo de 2013, las descripciones completas de las cuales se incorporan de este modo para referencia) comprende glucósido cardíaco (oleandrina, OL) y triterpenos (ácido oleanólico (OA), ácido ursólico (UA) y ácido betulínico (BA)) como los componentes primarios farmacológicamente activos. La proporción molar de OL a triterpeno total es cerca de 1 :(10-96). La proporción molar de OA:UA:BA es cerca de 7.8:7.4:1. La combinación de OA, UA y BA en PBI-05204 aumenta la actividad antiviral de oleandrina cuando se compara en una base equimolar de OL. PBI-04711 es una fracción de PBI-05204, pero no contiene glucósido cardíaco (OL). La proporción molar de OA:UA:BA en PBI-04711 es cerca de 3:2.2:1. PBI-04711 también posee actividad antiviral. En consecuencia, una composición antiviral que comprende OL, OA, UA, y BA es más eficaz que una composición que comprende OL como el único principio activo con base en un contenido equimolar de OL. En algunas realizaciones, las proporciones molares de los triterpenos individuales a oleandrina varían como sigue: cerca de 2-8 (OA) : cerca de 2-8 (UA) : cerca de 0.1-1 (BA) : cerca de 0.5 1.5 (OL); o cerca de 3-6 (OA) : cerca de 3-6 (UA) : cerca de 0.3-8 (BA) : cerca de 0.7-1.2 (OL); o cerca de 4-5 (OA) : cerca de 4-5 (UA) : cerca de 0.4-0.7 (BA) : cerca de 0.9-1.1 (OL); o cerca de 4.6 (OA) : cerca de 4.4 (UA) : cerca de 0.6 (BA) : cerca de 1 (OL).

Las composiciones antivirales que comprenden oleandrina como el único agente antiviral están dentro del alcance de la invención. Las composiciones antivirales que comprenden digoxina como el único agente antiviral están dentro del alcance de la invención.

PBI-01011 es una composición antiviral mejorada a base de triterpeno que comprende OA, UA y BA, en donde la proporción molar de OA:UA:BA es cerca de 9-12 : hasta cerca de 2 : hasta cerca de 2, o cerca de 10 : cerca de 1 : cerca de 1, o cerca de 9-12 : cerca de 0.1-2 : cerca de 0.1-2, o cerca de 9-11 : cerca de 0.5-1.5 : cerca de 0.5-1.5, o cerca de 9.5-10.5 : cerca de 0.75-1.25 : cerca de 0.75-1.25, o cerca de 9.5-10.5 : cerca de 0.8-1.2 : cerca de 0.8-1.2, o cerca de 9.75-10.5 : cerca de 0.9-1.1 : cerca de 0.9-1.1.

En algunas realizaciones, una composición antiviral comprende por lo menos ácido oleanólico (ácido libre, sal, derivado o profármaco del mismo) y ácido ursólico (ácido libre, sal, derivado o profármaco del mismo) presente a una proporción molar de OA a UA como se describe en la presente. OA está presente en un exceso molar grande sobre UA.

En algunas realizaciones, una composición antiviral comprende por lo menos ácido oleanólico (ácido libre, sal, derivado o profármaco del mismo) y ácido betulínico (ácido libre, sal, derivado o profármaco del mismo) presente a una proporción molar de OA a BA como se describe en la presente. OA está presente en un exceso molar grande sobre BA.

En algunas realizaciones, una composición antiviral comprende por lo menos ácido oleanólico (ácido libre, sal, derivado o profármaco del mismo), ácido ursólico (ácido libre, sal, derivado o profármaco del mismo), y ácido betulínico (ácido libre, sal, derivado o profármaco del mismo) presente a una proporción molar de OA a UA a BA como se describe en la presente. OA está presente en exceso molar grande sobre ambos de UA y BA.

En algunas realizaciones, una composición antiviral a base de triterpeno excluye glucósido cardíaco.

En general, un sujeto que tiene infección por Arenaviridae, infección por Arternviridae, infección por Filoviridae, infección por Flaviviridae (género Flavivirus), género Deltaretrovirus, Coronaviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, o infección por Togaviridae es tratada como sigue. El sujeto es evaluado para determinar si dicho sujeto está infectado con dicho virus. Se indica la administración de la composición antiviral. Se administra la dosis inicial de la composición antiviral al sujeto de acuerdo con un régimen de dosificación prescrito por un periodo de tiempo (un periodo de tratamiento). Se determina periódicamente la respuesta clínica del sujeto y el nivel de respuesta terapéutica. Si el nivel de respuesta terapéutica es demasiado bajo a una dosis, luego se escala la dosis de acuerdo con un programa de escalado de dosis predeterminado hasta que se alcanza el nivel deseado de respuesta terapéutica en el sujeto. El tratamiento del sujeto con la composición antiviral se continua según sea necesario. La dosis o régimen de dosificación puede ser ajustado según sea necesario hasta que el paciente alcance el(los) punto(s) final(es) deseado(s) tal como el cese de la misma infección, la reducción en los síntomas asociados con la infección, y/o una reducción en la progresión de la infección.

Si un médico pretende tratar a un sujeto que tiene infección viral con una combinación de una composición antiviral y uno o más de otros agentes terapéuticos, y se sabe que la infección viral, que tiene el sujeto, es por lo menos parcialmente terapéuticamente sensible a tratamiento con dicho uno o más de otros agentes terapéuticos, entonces la invención del método presente comprende: administrar al sujeto en necesidad del mismo con una dosis terapéuticamente relevante de la composición antiviral y una dosis terapéuticamente relevante de dicho uno o más de otros agentes terapéuticos, en donde la composición antiviral es administrada de acuerdo con un primer régimen de dosificación y el uno o más de otros agentes terapéuticos son administrados de acuerdo con un segundo régimen de dosificación. En algunas realizaciones, el primero y segundo regímenes de dosificación son iguales. En algunas realizaciones, el primer y segundo regímenes de dosificación son diferentes.

La(s) composición(es) antiviral(s) de la invención se pueden administrar como terapia antiviral primaria, terapia antiviral adjunta, o terapia co-antiviral. Los métodos incluyen la administración separada o coadministración de la composición antiviral con por lo menos otra composición antiviral conocida, lo que significa que la composición antiviral de la invención se puede administrar antes, durante o después de la administración de una composición antiviral conocida (compuesto(s)) o de una composición para el tratamiento de síntomas asociados con la infección viral. Por ejemplo, los medicamentos utilizados para tratar inflamación, vómito, náusea, dolor de cabeza, fiebre, diarrea, náusea, urticaria, conjuntivitis, malestar general, dolor muscular, dolor de articulación, convulsión, o parálisis se puede administrar con o por separado de la composición antiviral de la invención.

El uno o más de otros agentes terapéuticos se pueden administrar a las dosis y de acuerdo con regímenes de dosificación que son reconocidos por el médico como siendo terapéuticamente efectivos o a dosis que son reconocidas por el médico como siendo sub-terapéuticamente efectivas. El beneficio clínico y/o efecto terapéutico proporcionado por la administración de una combinación de composición antiviral y uno o más de otros terapéuticos puede ser aditivo o sinérgico, tal nivel de beneficio o efecto es determinado por comparación de la administración de la combinación para la administración del o los componentes de la composición antiviral individual y uno o más de otros agentes terapéuticos. El uno o más de otros agentes terapéuticos pueden ser administrados a dosis y de acuerdo con los regímenes de dosificación sugeridos o descritos por la Administración de Alimentos y Fármacos, Organización Mundial de la Salud, Agencia Europea de Medicinas (E.M.E.A.), Administración de Bienes Terapéuticos (TGA, Australia), Organización Panamericana de la Salud (PAHO), Autoridad de Seguridad de Medicinas y Dispositivos Médicos (Medsafe, Nueva Zelanda) o los diversos Ministerios de Salud en todo el mundo.

Otros agentes terapéuticos ilustrativos que se pueden incluir en la composición antiviral de la invención para el tratamiento de infección viral incluyen agente antiretroviral, interferón alfa (IFN-a), zidovudina, lamivudina, ciclosporina A, CHOP con trióxido de arsénico, valproato de sodio, metotrexato, azatioprina, uno o más fármacos para el alivio de síntomas, fármaco ahorrador de esteroide, corticosteroide, ciclofosfamida, inmunosupresor, agente antiinflamatorios, inhibidor de Janus cinasa, tofacitinib, inhibidor de calcineurina, tacrolimus, inhibidor de mTOR, sirolimus, everolimus, inhibidor de IMDH, azatioprina, leflunomida, micofenolato, agente biológico, abatacept, adalimumab, anakinra, certolizumab, etanercept, golimumab, infliximab, ixekizumab, natalizumab, rituximab, secukinumab, tocilizumab, ustekinumab, vedolizumab, anticuerpo monoclonal, basiliximab, daclizumab, anticuerpo policlonal, análogos de nucleósido, inhibidor de transcriptasa inversa, emtricitabina, telbivudina, abacavir, adefovir, didanosina, emtricitabina, entecavir, stavudina, tenofovir, azitromicina, antibiótico tipo macrólido, inhibidor de proteasa, interferón, modificador de respuesta inmune, inhibidor de la síntesis de ARNm, síntesis de proteína, inhibidor, tiazólida, inhibidor de CYP3A4, biguanidina heterocíclica, inhibidor de receptor CCR5, y combinaciones de los mismos. Las terapias estudiadas también incluyen plasmaféresis y/o radiación. También se pueden administrar anticuerpos para virus específico a un sujeto tratado con la composición antiviral de la invención. El plasma obtenido de la sangre de sobrevivientes de una primera infección viral puede ser administrado a otros sujetos que tienen el mismo tipo de infección viral, dichos otros sujetos también son administrados con la composición antiviral de la invención. Por ejemplo, el plasma de un sobreviviente de infección de COVID-19 puede ser administrado a otro sujeto que tiene una infección de COVID-19, dicho otro sujeto también son administrados con la composición antiviral de la invención.

El Ejemplo 5 proporciona un procedimiento ejemplar para el tratamiento de una infección por el virus de Zika en un mamífero. El Ejemplo 12 proporciona un procedimiento ejemplar para el tratamiento de una infección por Filovirus (virus de Ébola, virus de Marburg) en un mamífero. El Ejemplo 13 proporciona un procedimiento ejemplar para el tratamiento de una infección por Flavivirus (Fiebre Amarilla, Fiebre de Dengue, Encefalitis Japonesa, virus del Nilo del Oeste, virus de Zika, Encefalitis de origen por Garrapata, Enfermedad del Bosque Kyasanur, Enfermedad de Alkhurma, Fiebre Hemorrágica de Omsk, infección por el virus de Powassan) en un mamífero. El Ejemplo 25 proporciona un procedimiento ejemplar para el tratamiento de una infección por el género Deltaretrovirus (HTLV-1).

El(los) compuesto(s) antiviral(es) (triterpeno(s), glucósido(s) cardíaco(s), etc.) presentes en la composición farmacéutica pueden estar presente en su forma sin modificar, forma de sal, forma de derivado o una combinación de los mismos. Como se utiliza en la presente, el término “derivado” significa: a) una sustancia química que está estructuralmente relacionada a una primera sustancia química y que teóricamente se deriva de ella; b) un compuesto que se forma de un primer compuesto similar o un compuesto que se puede imaginar que surge de otro primer compuesto, si un átomo del primer compuesto es reemplazado con otro átomo o grupo de átomos; c) un compuesto derivado u obtenido de un compuesto madre y que contiene elementos esenciales del compuesto madre; o d) un compuesto químico que se puede producir del primer compuesto de estructura similar en uno o más pasos. Por ejemplo, un derivado puede incluir una forma deuterada, forma oxidada, deshidratada, insaturada, polímero conjugado o forma glucosilada del mismo o puede incluir un éster, amida, lactona, homólogo, éter, tioéter, ciano, amino, alquilamino, sulfhidrilo, heterocíclico, anillo heterocíclico fusionado, polimerizado, pegilado, benzilidenilo, triazolilo, piperazinilo o forma deuterada del mismo.

Tal como se utiliza en la presente, el término “oleandrina” significa todas las formas de oleandrina a menos que se especifique de otro modo. La oleandrina puede estar presente en forma racémica, ópticamente pura u ópticamente enriquecida. El material vegetal deNerium oleanderse puede obtener, por ejemplo, de proveedores comerciales de plantas tal como Aldridge Nursery, Atascosa, Texas.

El extracto de fluido supercrítico (SCF) puede ser preparado como se detalla en la US 7,402,325, US 8394434, US 8187644, o Publicación Internacional de PCT No.<w>P 2007/016176 A2, cuyas descripciones completas se incorporan de este modo para referencia. La extracción puede ser realizada con dióxido de carbono supercrítico en la presencia o ausencia de un modificador (solvente orgánico) tal como etanol.

Otros extractos que contiene glucósido cardíaco, especialmente oleandrina, pueden ser preparados por varios procedimientos diferentes. Un extracto puede ser preparado de acuerdo con el procedimiento desarrollado por el Dr. Huseyin Ziya Ozel (Patente de E.U.A. No. 5,135,745) que describe un procedimiento para la preparación de un extracto en agua caliente. Se informa que el extracto acuoso contiene muchos polisacáridos con pesos moleculares que varían de 2KD a 30KD, oleandrina, oleandrigenina, odorósido y neritalósido. Se informa que los polisacáridos incluyen homopoligalacturonanos o arabinogalaturonanos ácidos. La Patente de E.U.A. No. 5,869,060 de Selvaraj et al. describe extractos en agua caliente de la especieNeriumy métodos de producción de los mismos, por ejemplo, el Ejemplo 2. El extracto resultante puede entonces ser liofilizado para producir un polvo. La Patente de E.U.A. No. 6,565,897 (Publicación Preconcesión en E.U.A. de la No. 20020114852 y la Solicitud Internacional de PCT No. WO 2000/016793 de Selvaraj et al.) describen un procedimiento de extracción en agua caliente para la preparación de un extracto sustancialmente estéril. Erdemoglu et al.(J. Ethnopharmacol.(2003) Nov. 89(1), 123-129) describe los resultados para la comparación de extractos de plantas acuosos y etanólicos, incluyendoNerium oleander, con base en sus actividades antinociceptivas y antiinflamatorias. Los extractos en solvente orgánico deNerium oleanderse describen por Adome et al.(Afr. Health Sci.(2003) Aug. 3(2), 77-86; ethanolic extract), el-Shazly et al.(J. Egypt Soc. Parasitol.(1996), Aug.

26(2), 461-473; ethanolic extract), Begum et al.(Phytochemistry(1999) Feb. 50(3), 435-438; methanolic extract), Zia et al.(J. Ethnolpharmacol.(1995) Nov. 49(1), 33-39; methanolic extract), y Vlasenko et al.(Farmatsiia.(1972) Sept.-Oct.

21(5), 46-47; alcoholic extract). La Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. Preconcesión No. 20040247660 de Singh et al. describe la preparación de una formulación liposomal estabilizada de proteína de oleandrina para uso en el tratamiento de cáncer. La Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. Preconcesión No. 20050026849 de Singh et al. describe una formulación soluble en agua de oleandrina que contiene una ciclodextrina. La Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. Preconcesión No. 20040082521 de Singh et al. describe la preparación de formulaciones de nanopartículas estabilizadas de proteína del extracto en agua caliente.

La oleandrina también se puede obtener de extractos de cultivos en suspensión derivados de callos transformados de Agrobacterium tumefaciens (Ibrahim et al., “Stimulation of oleandrin production by combined Agrobacterium tumefaciens mediated transformation and fungal elicitation in Nerium oleander cell cultures” in Enz. Microbial Techno. (2007), 41(3), 331-336, toda la descripción de la cual se incorpora de este modo para referencia). Se pueden utilizar extractos en agua caliente, solvente orgánico, solvente orgánico acuoso, o fluido supercrítico de agrobacterium de acuerdo con la invención.

La oleandrina también se puede obtener de extractos de microcultivo de Nerium oleander in vitro, con lo cual se pueden iniciar brotes de cultivos de plántulas y/o de ápices de brotes de los cultivos de Laurel de flor, Flor lunaria o Alsacia, u otros cultivos (Vila et al., “Micropropagation of Oleander (Nerium oleander L.)” in HortScience (2010), 45(1), 98-102, toda la descripción de la cual se incorpora de este modo para referencia). Se pueden utilizar extractos en agua caliente, solvente orgánico, solvente orgánico acuoso, o fluido supercrítico de Nerium oleander microcultivado de acuerdo con la invención.

Los extractos también difieren en su contenido de polisacárido y carbohidrato. El extracto en agua caliente contiene 407.3 unidades equivalentes de glucosa de carbohidrato con respecto a una curva estándar preparada con glucosa aunque el análisis del extracto en SCF CO2 encontró niveles de carbohidrato que fueron encontrados en muy bajos niveles que estuvieron debajo del límite de cuantificación. La cantidad de carbohidrato en el extracto en agua caliente deNerium oleanderfue, sin embargo, por lo menos 100 veces mayor que esa en el extracto en SCF CO2. El contenido de polisacárido del extracto de SCF puede ser 0%, <0.5%, <0.1%, <0.05%, o <0.01% en peso. En algunas realizaciones, el extracto de SCF excluye un polisacárido obtenido durante la extracción de la masa vegetal.

Las composiciones parciales del extracto en SCF CO2y extracto en agua caliente fueron determinadas por DART TOF-MS (Análisis Directo en Tiempo Real- Espectrometría de Masa en Tiempo de Vuelo) en un espectrómetro de masas JEOL AccuTOF-DART (JEOL USA, Peabody, MA, EUA).

El extracto de SCF de la especieNeriumo especieThevetiaes una mezcla de compuestos farmacológicamente activos, tales como oleandrina y triterpenos. El extracto obtenido por el procedimiento en SCF es un semisólido viscoso, sustancialmente insoluble en agua (después de que se remueve el solvente) a temperatura ambiente. El extracto de SCF comprende muchos diferentes componentes que poseen una variedad de intervalos diferentes de solubilidad en agua. El extracto de un procedimiento en fluido supercrítico contiene en peso un intervalo teórico de 0.9% a 2.5% en peso de oleandrina o 1.7% a 2.1% en peso de oleandrina o 1.7% a 2.0% en peso de oleandrina. Se han obtenido extractos en SCF que comprenden una cantidad variable de oleandrina. En una realización, el extracto de SCF comprende cerca de 2% en peso de oleandrina. El extracto de SCF contiene una concentración 3-10 veces mayor de oleandrina que el extracto en agua caliente. Esto fue confirmado por análisis tanto de HPLC así como de LC/MS/MS (espectrometría de masas en tándem).

El extracto de SCF comprende oleandrina y los triterpenos ácido oleanólico, ácido betulínico y ácido ursólico y opcionalmente otros componentes como se describe en la presente. El contenido de oleandrina y de triterpenos puede variar de lote a lote; sin embargo, no es excesivo el grado de variación. Por ejemplo, un lote de extracto en SCF (PBI-05204) fue analizado para estos cuatro componentes y se encontró que contiene las siguientes cantidades aproximadas de cada uno.

WRT significa “con respecto a”.

El contenido de los componentes individuales puede variar por ±25%, ±20%, ±15%, ±10% o ±5% con respecto a los valores indicados. En consecuencia, el contenido de oleandrina en el extracto en SCF podría estar en el intervalo de 20 mg ± 5 mg (que es ±25% de 20 mg) por mg de extracto en SCF.

La oleandrina, ácido oleanólico, ácido ursólico, ácido betulínico y derivados de los mismos también pueden ser comprados de Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com; St. Louis, MO, EUA). La digoxina está disponible comercialmente de HIKMA Pharmaceuticals International LTD (NDA N012648, elíxir, 0.05 mg/mL; tableta, 0.125 mg, 0.25 mg), VistaPharm Inc. (NDA A213000, elíxir, 0.05 mg/mL), Sandoz Inc. (NDA A040481, inyectable, 0.25 mg/mL), West-Ward Pharmaceuticals International LTD (NDA A083391, inyectable, 0.25 mg/mL), Covis Pharma BV (NDA N009330, 0.1 mg/mL, 0.25 mg/mL), Impax Laboratories (NDA A078556, tableta, 0.125 mg, 0.25 mg), Jerome Stevens Pharmaceuticals Inc. (NDA A076268, tableta, 0.125 mg, 0.25 mg), Mylan Pharmaceuticals Inc. (NDA A040282, tableta, 0.125 mg, 0.25 mg), Sun Pharmaceutical Industries Inc. (NDA A076363, tableta, 0.125 mg, 0.25 mg), Concordia Pharmaceuticals Inc. (NDA A020405, tableta, 0.0625, 0.125 mg, 0.1875 mg, 0.25 mg, 0.375 mg, 0.5 mg, LANOXIN), GlaxoSmithKline LLC (NDA 018118, cápsula, 0.05 mg, 0.1 mg, 0.15 mg, 0.2 mg, LANOXICAPS).

Como se utiliza en la presente, los triterpenos nombrados individualmente pueden ser seleccionados independientemente tras cada ocurrencia en su forma nativa (ácido libre, sin modificar), en su forma de sal, en forma de derivado, forma de profármaco, o una combinación de los mismos. Las composiciones que contienen y los métodos que emplean formas deuteradas de los triterpenos también están dentro del alcance de la invención.

Los derivados, profármacos y sales del ácido oleanólico, se describen en US 20150011627 A1 de Gribble et al. que fue publicada el 8 de enero de 2015, US 20140343108 A1 de Rong et al que fue publicada el 20 de noviembre de 2014, US 20140343064 A1 de Xu et al. que fue publicada el 20 de noviembre de 2014, US 20140179928 A1 de Anderson et al. que fue publicada el 26 de junio de 2014, US 20140100227 A1 de Bender et al. que fue publicada el 10 de abril de 2014, U<s>20140088188 A1 de Jiang et al. que fue publicada el 27 de marzo de 2014, U<s>20140088163 A1 de Jiang et al. que fue publicada el 27 de marzo de 2014, US 20140066408 A1 de Jiang et al. que fue publicada el 6 de marzo de 2014, US 20130317007 A1 de Anderson et al. que fue publicada el 28 de noviembre de 2013, US 20130303607 A1 de Gribble et al. que fue publicada el 14 de noviembre de 2013, US 20120245374 de Anderson et al. que fue publicada el 27 de septiembre de 2012, US 20120238767 A1 de Jiang et al. que fue publicada el 20 de septiembre de 2012, US 20120237629 A1 de Shode et al. que fue publicada el 20 de septiembre de 2012, US 20120214814 A1 de Anderson et al. que fue publicada el 23 de agosto de 2012, US 20120165279 A1 de Lee et al. que fue publicada el 28 de junio de 2012, US 20110294752 A1 de Arntzen et al. que fue publicada el 1 de diciembre de 2011, US 20110091398 A1 de Majeed et al. que fue publicada el 21 de abril de 2011, U<s>20100189824 A1 de Arntzen et al. que fue publicada el 29 de julio de 2010, U<s>20100048911 A1 de Jiang et al. que fue publicada el 25 de febrero de 2010, y US 20060073222 A1 de Arntzen et al. que fue publicada el 6 de abril de 2006, cuyas descripciones completas se incorporan de este modo para referencia.

Los derivados, profármacos y sales del ácido ursólico se describen en US 20150011627 A1 de Gribble et al. que fue publicada el 8 de enero de 2015, US 20130303607 A1 de Gribble et al. que fue publicada el 14 de noviembre de 2013, US 20150218206 A1 de Yoon et al. que fue publicada el 6 de agosto de 2015, US 6824811 de Fritsche et al. que se emitió el 30 de noviembre de 2004, US 7718635 de Ochiai et al. que se emitió el 8 de mayo de 2010, US 8729055 de Lin et al. que se emitió el 20 de mayo de 2014, y US 9120839 de Yoon et al. que se emitió el 1 de sepriembre de 2015, cuyas descripciones completas se incorporan de este modo para referencia.

Los derivados, profármacos y sales del ácido betulínico se describen en US 20150011627 A1 de Gribble et al. que fue publicada el 8 de enero de 2015, US 20130303607 A1 de Gribble et al. que fue publicada el 14 de noviembre de 2013, US 20120237629 A1 de Shode et al. que fue publicada el 20 de septiembre de 2012, US 20170204133 A1 de Regueiro-Ren et al. que fue publicada el 20 de julio de 2017, US 20170096446 A1 de Nitz et al. que fue publicada el 6 de abril de 2017, US 20150337004 A1 de Parthasaradhi Reddy et al. que fue publicada el 26 de noviembre de 2015, US 20150119373 A1 de Parthasaradhi Reddy et al. que fue publicada el 30 de abril de 2015, US 20140296546 A1 de Yan et al. que fue publicada el 2 de octubre de 2014, US 20140243298 A1 de Swidorski et al. que fue publicada el 28 de agosto de 2014, US 20140221328 A1 de Parthasaradhi Reddy et al. que fue publicada el 7 de agosto de 2014, US 20140066416 A1 de Leunis et al. que fue publicada el 6 de marzo de 2014, US 20130065868 A1 de Durst et al. que fue publicada el 14 de marzo de 2013, US 20130029954 A1 de Regueiro-Ren et al. que fue publicada el 31 de enero de 2013, US 20120302530 A1 de Zhang et al. que fue publicada el 29 de noviembre de 2012, US 20120214775 A1 de Power et al. que fue publicada el 23 de agosto de 2012, US 20120101149 A1 de Honda et al. que fue publicada el 26 de abril de 2012, US 20110224182 de Bullock et al. que fue publicada el 15 de septiembre de 2011, US 20110313191 A1 de Hemp et al. que fue publicada el 22 de diciembre de 2011, US 20110224159 A1 de Pichette et al. que fue publicada el 15 de septiembre de 2011, US 20110218204 de Parthasaradhi Reddy et al. que fue publicada el 8 de septiembre de 2011, US 20090203661 A1 de Safe et al. que fue publicada el 13 de agosto de 2009, US 20090131714 A1 de Krasutsky et al. que fue publicada el 21 de mayo de 2009, US 20090076290 de Krasutsky et al. que fue publicada el 19 de marzo de 2009, u S 20090068257 A1 de Leunis et al. que fue publicada el 12 de marzo de 2009, US 20080293682 de Mukherjee et al. que fue publicada el 27 de noviembre de 2008, US 20070072835 A1 de Pezzuto et al. que fue publicada el 29 de marzo de 2007, US 20060252733 A1 de Jansen et al. que fue publicada el 9 de noviembre de 2006, y US 2006025274 A1 de O’Neill et al. que fue publicada el 9 de noviembre de 2006, cuyas descripciones completas se incorporan de este modo para referencia.

La composición antiviral puede ser formulada en cualquier forma de dosificación adecuada farmacéuticamente aceptable. Las formas de dosificación parenteral, ótica, oftálmica, nasal, inhalable, bucal, sublingual, enteral, tópica, oral, peroral, e inyectable son particularmente útiles. Las formas de dosificación particulares incluyen formas de dosificación sóldias o líquidas. Formas de dosificación adecuadas ejemplares incluyen tableta, cápsula, píldora, capleta, pastilla, saché, solución, suspensión, dispersión, frasco, bolsa, botella, líquido inyectable, líquido administrablei.v.(intravenoso),i.m.(intramuscular) oi.p.(intraperitoneal) y otras de tales formas de dosificación conocidas por el técnico de experiencia ordinaria en las ciencias farmacéuticas.

Ya que la infección viral puede afectar múltiples órganos simultáneamente y provocar falla de múltiples órganos, puede ser ventajoso administrar la composición por más de una vía. Por ejemplo, se sabe que el COVID-19 afecta los pulmones, el corazón, el tracto gastrointestinal, y el cerebro. En consecuencia, la composición que contiene glucósido cardíaco puede ser administrada ventajosamente como una composición inhalable y una composición peroral, una composición sublingual y una composición peroral, una composición inhalable y una composición sublingual, una composición inhalable y una composición parenteral, una composición sublingual y una composición parenteral, una composición peroral y una composición parenteral, o otras de tales combinaciones.

Las formas de dosificación adecuadas que contienen la composición antiviral pueden ser preparadas al mezclar la composición antiviral con excipientes farmacéuticamente aceptables como se describe en la presente o como se describe en Pi et al. (“Ursolic acid nanocrystals for dissolution rate and bioavailability enhancement: influence of different particle size” in Curr. Drug Deliv. (Mar 2016), 13(8), 1358-1366), Yang et al. (“Self-microemulsifying drug delivery system for improved oral bioavailability of oleanolic acid: design and evaluation” in Int. J. Nanomed. (2013), 8(1), 2917-2926), Li et al. (Development and evaluation of optimized sucrose ester stabilized oleanolic acid nanosuspensions prepared by wet ball milling with design of experiments” in Biol. Pharm. Bull. (2014), 37(6), 926-937), Zhang et al. (“Enhancement of oral bioavailability of triterpene through lipid nanospheres: preparation, characterization, and absorption evaluation” in J. Pharm. Sci. (June 2014), 103(6), 1711-1719), Godugu et al. (“Approaches to improve the oral bioavailability and effects of novel anticancer drugs berberine and betulinic acid” in PLoS One (Mar 2014), 9(3):e89919), Zhao et al. (“Preparation and characterization of betulin nanoparticles for oral hypoglycemic drug by antisolvent precipitation” in Drug Deliv. (Sep 2014), 21(6), 467-479), Yang et al. (“Physicochemical properties and oral bioavailability of ursolic acid nanoparticles using supercritical anti-solvent (SAS) process” in Food Chem. (May 2012), 132(1), 319-325), Cao et al. (“Ethylene glycol-linked amino acid diester prodrugs of oleanolic acid for PEPT1-mediated transport: synthesis, intestinal permeability and pharmacokinetics” in Mol. Pharm. (Aug. 2012), 9(8), 2127-2135), Li et al. (“Formulation, biological and pharmacokinetic studies of sucrose ester-stabilized nanosuspensions of oleanolic acid” in Pharm. Res. (Aug 2011), 28(8), 2020-2033), Tong et al. (“Spray freeze drying with polyvinylpyrrolidone and sodium caprate for improved dissolution and oral bioavailablity of oleanolic acid, a BCS Class IV compound” in Int. J. Pharm. (Feb 2011), 404(1-2), 148-158), Xi et al. (Formulation development and bioavailability evaluation of a self-nanoemulsified drug delivery system of oleanolic acid” in AAPS PharmSciTech (2009), 10(1), 172-182), Chen et al. (“Oleanolic acid nanosuspensions: preparation, in-vitro characterization and enhanced hepatoprotective effect” in J. Pharm. Pharmacol. (Feb 2005), 57(2), 259-264), cuyas descripciones completas se incorporan de este modo para referencia.

Las formas de dosificación adecuadas también pueden elaborarse de acuerdo con US 8187644 B2 de Addington, que se emitió el 29 de mayo de 2012, US 7402325 B2 de Addington, que se emitió el 22 de julio de 2008, US 8394434 B2 de Addington et al, que se emitió el 12 de marzo de 2013, cuyas descripciones completas se incorporan de este modo para referencia. Las formas de dosificación adecuadas también pueden elaborarse como se describe en los Ejemplos 13 a 15.

Una cantidad efectiva o cantidad terapéuticamente relevante de compuesto antiviral (glucósido cardíaco, triterpeno o combinaciones de los mismos) se contempla específicamente. Por el término “cantidad efectiva”, se entiende que se contempla una cantidad farmacéuticamente efectiva. Una cantidad farmacéuticamente efectiva es la cantidad o cantidad de principio activo que es suficiente para la respuesta terapéutica requerida o deseada, o en otras palabras, la cantidad, que es suficiente para producir una respuesta biológica apreciable cuando se administra a un paciente. La respuesta biológica apreciable puede ocurrir como un resultado de la administración de una sola o de múltiples dosis de una sustancia activa. Una dosis puede comprender una o más formas de dosificación. Se entenderá que el nivel de dosis específico para cualquier paciente dependerá de una variedad de factores incluyendo la indicación que se trata, gravedad de la indicación, salud del paciente, edad, género, peso, dieta, respuesta farmacológica, la forma de dosificación específica empleada, y otros de tales factores.

La dosis deseada para administración oral es hasta 5 formas de dosificación aunque tan pocas como una y tantas como diez formas de dosificación se pueden administrar como una sola dosis. Las formas de dosificación ejemplares pueden contener 0.01-100 mg o 0.01-100 pg de la composición antiviral por forma de dosificación, para un total de 0.1 a 500 mg (1 a 10 niveles de dosis) por dosis. La dosis será administrada de acuerdo con regímenes de dosificación que pueden ser predeterminados y/o diseñados para alcanzar una respuesta terapéutica específica o beneficio clínico en un sujeto.

El glucósido cardíaco puede estar presente en una forma de dosificación en una cantidad suficiente para proporcionar a un sujeto con una dosis inicial de oleandrina de cerca de 20 a cerca de 100 pg, cerca de 12 pg a cerca de 300 pg, o cerca de 12 pg a cerca de 120 pg. Una forma de dosificación puede comprender cerca de 20 de oleandrina a cerca de 100 pg, cerca de 0.01 pg a cerca de 100 mg o cerca de 0.01 pg a cerca de 100 pg de oleandrina, extracto de oleandrina o extracto deNerium oleanderque contiene oleandrina.

El antiviral puede ser incluido en una forma de dosificación oral. Algunas realizaciones de la forma de dosificación no están revestidas entéricamente y liberan su carga de la composición antiviral dentro de un periodo de 0.5 a 1 horas o menos. Algunas realizaciones de la forma de dosificación están revestidas entéricamente y liberan su carga de la composición antiviral después del estómago, tal como del yeyuno, íleon, intestino delgado, y/o intestino grueso (colon). Las formas de dosificación revestidas entéricamente liberarán la composición antiviral en la circulación sistémica dentro de 1-10 hr después de la administración oral.

La composición antiviral puede ser incluida en una forma de dosificación de liberación rápida, liberación inmediata, liberación controlada, liberación sostenida, liberación prolongada, liberación extendida, liberación de ráfaga, liberación continua, liberación lenta, o liberación pulsada o en una forma de dosificación que exhibe dos o más de estos tipos de liberación. El perfil de liberación de la composición antiviral de la forma de dosificación puede ser un perfil de liberación de orden cero, pseudo-cero, primer orden, pseudo-primer orden o sigmoideo. El perfil de concentración en plasma para el triterpeno en un sujeto al que se administra la composición antiviral puede exhibir uno o más máximos.

Con base en datos clínicos humanos se anticipa que el 50% al 75% de una dosis administrada de oleandrina estará biodisponible oralmente, proporcionando por lo tanto cerca de 10 a cerca de 20 gg, cerca de 20 a cerca de 40 gg, cerca de 30 a cerca de 50 gg, cerca de 40 a cerca de 60 gg, cerca de 50 a cerca de 75 gg, cerca de 75 a cerca de 100 gg de oleandrina por forma de dosificación. Dado un volumen de sangre promedio en humanos adultos de 5 litros, la concentración en plasma de oleandrina anticipada estará en el intervalo de cerca de 0.05 a cerca de 2 ng/ml, cerca de 0.005 a cerca de 10 ng/mL, cerca de 0.005 a cerca de 8 ng/mL, cerca de 0.01 a cerca de 7 ng/mL, cerca de 0.02 a cerca de 7 ng/mL, cerca de 0.03 a cerca de 6 ng/mL, cerca de 0.04 a cerca de 5 ng/mL, o cerca de 0.05 a cerca de 2.5 ng/mL. La dosis diaria recomendada de oleandrina, presente en el extracto de SCF, es generalmente cerca de 0.2 gg a cerca de 4.5 gg/kg de peso corporal dos veces diariamente. La dosis de oleandrina puede ser cerca de 0.2 a cerca de 1 gg/kg de peso corporal/día, cerca de 0.5 a cerca de 1.0 gg/kg de peso corporal/día, cerca de 0.75 a cerca de 1.5 gg/kg de peso corporal/día, cerca de 1.5 a cerca de 2.52 gg/kg de peso corporal/día, cerca de 2.5 a cerca de 3.0 gg/kg de peso corporal/día, cerca de 3.0 a 4.0 gg/kg de peso corporal/día o cerca de 3.5 a 4.5 gg oleandrina/kg de peso corporal/día. La dosis máxima tolerada de oleandrina puede ser cerca de cerca de 3.5 gg/kg de peso corporal/día a cerca de 4.0 gg/kg de peso corporal/día. La dosis mínima efectiva puede ser cerca de 0.5 gg/día, cerca de 1 gg/día, cerca de 1.5 gg/día, cerca de 1.8 gg/día, cerca de 2 gg/día, o cerca de 5 gg/día.

La composición antiviral se puede administrar a dosis bajas a altas debido a la combinación de triterpenos presentes y la proporción molar a la que están presentes. Una dosis terapéuticamente efectiva para humanos es cerca de 100-1000 mg o cerca de 100-1000 gg de composición antiviral por Kg de peso corporal. Tal dosis se puede administrar hasta 10 veces en un periodo de 24 horas. Otros intervalos adecuados de dosificación se especifican a continuación.

Todos los valores son aproximados, lo que significa “alrededor de” el valor especificado.

Se debe apreciar que un compuesto en la presente debería poseer una o más funciones en una composición o formulación de la invención. Por ejemplo, un compuesto debería servir tanto como un agente tensoactivo y como un solvente miscible en agua o como tanto un agente tensoactivo y como un solvente inmiscible en agua.

Una composición líquida puede comprender uno o más portadores líquidos farmacéuticamente aceptables. El portador líquido puede ser un portador acuoso, no acuoso, polar, no polar, y/o orgánico. Los portadores líquidos incluyen, a modo de ejemplo y sin limitación, un solvente miscible en agua, un solvente inmiscible en agua, agua, regulador y mezclas de los mismos.

Tal como se utiliza en la presente, los términos “solvente soluble en agua” o “solvente miscible en agua”, cuyos términos son utilizados indistintamente, se refieren a un líquido orgánico que no forma una mezcla bifásica con agua o es suficientemente soluble en agua para proporcionar una mezcla en solvente acuoso que contiene por lo menos cinco por ciento de solvente sin separación de fases líquidas. El solvente es adecuado para administración a humanos o animales. Solventes solubles en agua ejemplares incluyen, a modo de ejemplo y sin limitación, PEG (poli(etilen glicol)), PEG 400 (poli(etilen glicol que tiene un peso molecular aproximado de cerca de 400), etanol, acetona, alcanol, alcohol, éter, propilen glicol, glicerina, triacetina, poli(propilen glicol), PVP (poli(vinil pirrolidona)), dimetilsulfóxido, N,N-dimetilformamida, formamida, N,N-dimetilacetamida, piridina, propanol, N-metilacetamida, butanol, soluphor (2-pirrolidona), pharmasolve (N-metil-2-pirrolidona).

Tal como se utiliza en la presente, los términos “solvente insoluble en agua” o “solvente inmiscible en agua”, cuyos términos son utilizados indistintamente, se refieren a un líquido orgánico que forma una mezcla bifásica con agua o proporciona una separación de fases cuando la concentración de solvente en agua excede cinco por ciento. El solvente es adecuado para administración a humanos o animales. Solventes insolubles en agua ejemplares incluyen, a modo de ejemplo y sin limitación, triglicéridos de cadena media/larga, aceite, aceite de ricino, aceite de maíz, vitamina E, derivado de vitamina E, ácido oleico, ácido graso, aceite de oliva, softisan 645 (Caprilato de Diglicerilo / Caprato / Estearato / hidroxi estearato adipato), migliol, captex (Captex 350: Tricaprilato de Glicerilo/ Caprato/ Laurato Triglicérido; Captex 355: Tricaprilato de Glicerilo/ Caprato Triglicérido; Captex 355 EP / NF: Tricaprilato de Glicerilo/ Caprato triglicérido de cadena media).

Los solventes adecuados se listan en la “International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) guidance for industryQ3C Impurities: Residual Solvents”(1997), que hace recomendaciones en cuanto a cuáles cantidades de solventes residuales se consideran seguras en los productos farmacéuticos. Solventes ejemplares se listan como solventes clase 2 o clase 3. Los solventes clase 3 incluyen, por ejemplo, ácido acético, acetona, anisol, 1-butanol, 2-butanol, acetato de butilo, éter ter-butlimetílico, cumeno, etanol, etiléter, acetato de etilo, formato de etilo, ácido fórmico, heptano, acetato de isobutilo, acetato de isopropilo, acetato de metilo, metil-1-butanol, metiletil cetona, metilisobutil cetona, 2-metil-1-propanol, pentano, 1-pentanol, 1-propanol, 2-propanol, o acetato de propilo.

Otros materiales que se pueden utilizar como solventes inmiscibles en agua en la invención incluyen: Captex 100: Propilen glicol Dicaprato; Captex 200: Propilen glicol Dicaprilato/ Dicaprato; Captex 200 P: Propilen glicol Dicaprilato/ Dicaprato;Propilen glicol Dicaprilocaprato;Captex 300: Tricaprilato de Glicerilo/ Caprato; Captex 300 EP / NF: Tricaprilato de Glicerilo/ Caprato Triglicéridos de Cadena Media; Captex 350: Tricaprilato de Glicerilo/ Caprato/ Laurato; Captex 355: Tricaprilato de Glicerilo/ Caprato; Captex 355 EP / n F: Tricaprilato de Glicerilo/ Caprato Triglicéridos de Cadena Media; Captex 500: Triacetina; Captex 500 P: Triacetina (Grado Farmacéutico); Captex 800: Propilen glicol Di (2-Etitexanoato); Captex 810 D: Tricaprilato de Glicerilo/ Caprato/ Linoleato; Captex 1000: Tricaprato de Glicerilo; Captex CA: Triglicéridos de cadena media; Captex MCT-170: Triglicéridos de cadena media; Capmul GMO: Monoleato de Glicerilo; Capmul GMO-50 EP/NF: Monoleato de Glicerilo; Capmul MCM: Mono y Diglicéridos de Cadena Media; Capmul MCM C8: Monocaprilato de Glicerilo; Capmul MCM C10: Monocaprato de Glicerilo; Capmul PG-8: Propilen glicol Monocaprilato; Capmul PG-12: Propilen glicol Monolaurato; Caprol 10G10O: Decaglicerol Decaoleato; Caprol 3GO: Triglicerol Monooleato; Caprol ET: Poliglicerol Éster de Ácidos Grasos Mixtos; Caprol MPGO: Dioleato de Hexaglicerol; Caprol PGE 860: Mono-, Dioleato de Decaglicerol.

Tal como se utiliza en la presente, un “agente tensoactivo” se refiere a un compuesto que comprende porciones hidrófilas polares o cargadas, así como como porciones hidrófobas (lipófilas) no polares; es decir un agente tensoactivo es anfifílico. El término agente tensoactivo puede referirse a uno o a una mezcla de compuestos. Un agente tensoactivo puede ser un agente de solubilización, un agente emulsificante o un agente dispersante. Un agente tensoactivo puede ser hidrófilo o hidrófobo.

El agente tensoactivo hidrófilo puede ser cualquier agente tensoactivo hidrófilo adecuado para uso en composiciones farmacéuticas. Tales agentes tensoactivos pueden ser aniónicos, catiónicos, zwitteriónico o no iónico, aunque actualmente se prefieren los agentes tensoactivos no iónicos hidrófilos. Como se discutió antes, estos agentes tensoactivos no iónicos hidrófilos tendrán generalmente valores de HLB mayores que cerca de 10. Las mezclas de agentes tensoactivos hidrófilos también están dentro del alcance de la invención.

Similarmente, el agente tensoactivo hidrófobo puede ser cualquier agente tensoactivo hidrófobo adecuado para uso en composiciones farmacéuticas. En general, los agentes tensoactivos hidrófobos adecuados tendrán un valor de HLB menor que cerca de 10. Las mezclas de agentes tensoactivos hidrófobos también están dentro del alcance de la invención.

Ejemplos de solubilizante adecuado adicional incluyen: alcoholes y polioles, tales como etanol, isopropanol, butanol, alcohol bencílico, etilen glicol, propilen glicol, butanodioles e isómeros de los mismos, glicerol, pentaeritritol, sorbitol, manitol, transcutol, dimetil isosorbida, polietilen glicol, polipropilen glicol, alcohol polivinílico, hidroxipropil metilcelulosa y otros derivados de celulosa, ciclodextrinas y derivados de ciclodextrina; éteres de polietilen glicoles que tienen un peso molecular promedio de cerca de 200 a cerca de 6000, tal como alcohol tetrahidrofurfurílico PEG éter (glicofurol, disponible comercialmente de BASF bajo el nombre comercial Tetraglicol) o metoxi PEG (Union Carbide); amidas, tales como 2-pirrolidona, 2-piperidona, caprolactama, N-alquilpirrolidona, N-hidroxialquilpirrolidona, N-alquilpiperidona, N-alqulcaprolactama, dimetilacetamida, y polivinipirrolidona; ésteres, tal como propionato de etilo, acetato de tributilo, trietilcitrato de acetilo, tributil citrato de acetilo, trietilcitrato, oleato de etilo, caprilato de etilo, butiraro de etilo, triacetina, monoacetato de propilen glicol, diacetato de propilen glicol, caprolactona e isómeros de los mismos, valerolactona e isómeros de los mismos, butirolactona e isómeros de los mismos; y otros solubilizantes conocidos en la técnica, tal como dimetil acetamida, dimetil isosorbida (Arlasolve DMI (ICI)), N-metil pirrolidonas (Pharmasolve (ISP)), monooctanoina, dietilen glicol nonoetil éter (available de Gattefosse bajo el nombre comercial Transcutol), y agua. Las mezclas de solubilizantes también están dentro del alcance de la invención.

Excepto como se indica, los compuestos mencionados en la presente están disponibles fácilmente de fuentes comerciales estándar.

Aunque no es necesario, la composición o formulación puede comprender además uno o más agentes quelantes, uno o más conservantes, uno o más antioxidantes, uno o más adsorbentes, uno o más agentes acidificantes, uno o más agentes alquilantes, uno o más agentes antiespumantes, uno o más agentes reguladores, uno o más colorantes, uno o más electrolitos, una o más sales, uno o más estabilizantes, uno o más modificadores de tonicidad, uno o más diluyentes, o una combinación de los mismos.

La composición de la invención también puede incluir aceites tales como aceites fijos, aceite de cacahuate, aceite de ajonjolí, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, y aceite de oliva; ácidos grasos tales como ácido oleico, ácido esteárico, y ácido isosteárico; y ésteres de ácido graso tal como oleato de etilo, miristrato de isopropilo, glicéridos de ácidos grasos y glicéridos de ácido graso acetilado. La composición también puede incluir alcohol tal como etanol, isopropanol, alcohol hexadecílico, glicerol y propilen glicol; glicerol cetales tal como 2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-metanol; éteres tal como poli(etilen glicol) 450; hidrocarburos de petróleo tal como aceite mineral y petrolato; agua; un agente tensoactivo farmacéuticamente adecuado, agente de suspensión o agente emulsificante; o mezclas de los mismos.

Se debe entender que los compuestos utilizados en la técnica de la formulación farmacéutica sirven generalmente una variedad de funciones o propósitos. Así, si un compuesto nombrado en la presente es mencionado solo una vez o es utilizado para definir más de un término en la presente, su propósito o función no debe considerarse como estando limitada solo a ese propósito(s) o función(es) nombrada(s).

Uno o más de los componentes de la formulación pueden estar presentes en su forma de base libre, ácido libre o sal farmacéuticamente o analíticamente aceptable. Como se utiliza en la presente, “sal farmacéuticamente o analíticamente aceptable” se refiere a un compuesto que ha sido modificado al hacerlo reaccionar con un ácido según sea necesario para formar un par unido iónicamente. Ejemplos de sales aceptables incluyen sales no tóxicas convencionales formadas, por ejemplo, de ácidos inorgánicos u orgánicos no tóxicos. Sales no tóxicas adecuadas incluyen esas derivadas de ácidos inorgánicos tales como clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, sulfónico, sulfámico, fosfórico, nítrico y otros conocidos por esos de experiencia ordinaria en la técnica. Las sales preparadas de ácidos orgánicos tales como aminoácidos, acético, propiónico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, pamóico, maléico, hidroximaléico, fenilacético, glutámico, benzoico, salicílico, sulfanílico, 2-acetoxibenzoico, fumárico, toluensulfónico, metanosulfónico, etano disulfónico, oxálico, isetiónico, y otros conocidos por esos de experiencia ordinaria en la técnica. Por el otro lado, cuando el ingrediente farmacológicamente activo posee un grupo funcional ácido, se agrega una base farmacéuticamente aceptable para formar la sal farmacéuticamente aceptable. Listas de otras sales adecuadas se encuentran anRemington's Pharmaceutical Sciences,17th. ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, p. 1418, cuya descripción relevante se incorpora de este modo para referencia.

La frase “farmacéuticamente aceptable” se emplea en la presente para referirse a esos compuestos, materiales, composiciones, y/o formas de dosificación que son, dentro del alcance del buen juicio médico, adecuados para uso en contacto con tejidos de seres humanos y animales y sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica, excesivos, o cualquier otro problema o complicación, conmensurado con una proporción razonable de beneficio/riesgo.

Una forma de dosificación puede ser formada por cualquier medio convencional conocido en la industria farmacéutica. Una forma de dosificación líquida puede prepararse al proporcionar por lo menos un portador líquido y una composición antiviral en un contenedor. Se puede incluir uno o más de otros excipientes en la forma de dosificación líquida. Una forma de dosificación sólida puede prepararse al proporcionar por lo menos un portador sólido y una composición antiviral. Se puede incluir uno o más de otros excipientes en la forma de dosificación sólida.

Una forma de dosificación puede ser envasada utilizando equipo y materiales de envasado convencional. Se puede incluir en un envase, botella, frasco, bolsa, jeringa, sobre, paquete, envase de ampolla, caja, ampolleta, u otros de tales contenedores.

La composición de la invención puede ser incluida en cualquier forma de dosificación. Las formas de dosificación particulares incluyen formas de dosificación sóldias o líquidas. Las formas de dosificación ejemplares adecuadas incluyen tableta, cápsula, píldora, capleta, pastilla, saché, y otras de tales formas de dosificación conocidas por el técnico de experiencia ordinaria en las ciencias farmacéuticas.

En vista de la descripción anterior y los ejemplos siguientes, una persona de experiencia ordinaria en la técnica será capaz de practicar la invención como se reclama sin experimentación indebida. Lo anterior se entenderá de mejor manera con referencia a los siguientes ejemplos que detallan ciertos procedimientos para la preparación de las realizaciones de la presente invención. Todas las referencias hechas a estos ejemplos son para fines de ilustración. Los siguientes ejemplos no se deben considerar exhaustivos, sino meramente ilustrativos de solo unas pocas de las muchas realizaciones contempladas por la presente invención.

Se utilizaron células Vero CCL81 para los ensayos profilácticos y terapéuticos (ATCC, Manassas, VA). Se realizaron ensayos en placas en células Vero E6, proporcionadas amablemente por Vineet Menachery (UTMB, Galveston, TX). Las células fueron mantenidas en una incubadora a 37°C con CO2 al 5%. Las células fueron propagadas utilizando un Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (Gibco, Grand Island, NY) suplementado con suero bovino fetal al 5% (FBS) (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA) y penicilina/estreptomicina al 1% (Gibco, Grand Island, NY). El medio de mantenimiento redujo el FBS a 2%, pero fue de otro modo idéntico. El SARS-CoV-2, cepa USA_WA1/2020 (Acceso de Genbank MT020880), fue proporcionado por el Centro de Referencia Mundial para Virus y Adenovirus Emergentes. Todos los estudios utilizaron una reserva de 4 pasos Vero secuenciada por NextGen de SARS-CoV-2.

Ejemplo 1

Extracción en Fluido Supercrítico de Hojas de Adelfa en Polvo

Método A. Con dióxido de carbono.

Se prepararon hojas de Adelfa en polvo al cosechar, lavar, y secar material de hojas de Adelfa, luego pasando el material de hoja de Adelfa a través de un aparato de trituración y deshidratación tales como esos descritos en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,236,132, 5,598,979, 6,517,015, y 6,715,705. El peso del material de partida utilizado fue 3.94 kg.

El material de partida fue combinado con CO2 puro a una presión de 30 MPa (300 bar, 4351 psi) y una temperatura de 50°C (122°F) en un dispositivo extractor. Se utilizó un total de 197 kg de CO2, para dar una proporción de solvente a materia prima de 50:1. La mezcla de CO2 y materia prima luego fue pasada a través de un dispositivo separador, que cambió la presión y temperatura de la mezcla y separó el extracto del dióxido de carbono.

El extracto (65 g) fue obtenido como un material viscoso amarronado, pegajoso que tiene una fragancia agradable. El color fue provocado probablemente por la clorofila y otros compuestos cromóforos residuales. Para una determinación exacta del rendimiento, los tubos y separador fueron enjuagados con acetona y la acetona fue evaporada para dar una adición de 9 g de extracto. La cantidad total de extracto fue 74 g. Con base en el peso del material de partida, el rendimiento del extracto fue 1.88%. El contenido de oleandrina en el extracto fue calculado utilizando cromatografía líquida de alta presión y espectrometría de masa para ser 560.1 mg, o un rendimiento de 0.76%.

Método B. Con mezcla de dióxido de carbono y etanol

Se prepararon hojas de Adelfa en polvo al cosechar, lavar, y secar material de hojas de Adelfa, luego pasando el material de hoja de Adelfa a través de un aparato de trituración y deshidratación tales como esos descritos en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,236,132, 5,598,979, 6,517,015, y 6,715,705. El peso del material de partida utilizado fue 3.85 kg.

El material de partida fue combinado con CO2 puro y etanol al 5% como un modificador a una presión de 28 MPa (280 bar, 4061 psi) y una temperatura de 50°C (122°F) en un dispositivo extractor. Se utilizó un total de 160 kg de CO2 y 8 kg de etanol, para dar una proporción de solvente a materia prima de 43.6 a 1. La mezcla de CO2, etanol, y materia prima luego fue pasada a través de un dispositivo separador, que cambió la presión y temperatura de la mezcla y separó el extracto del dióxido de carbono.

El extracto (207 g) fue obtenido después de la remoción de etanol como una masa viscosa, pegajosa, verde oscuro que obviamente contiene algo de clorofila. Con base en el peso del material de partida, el rendimiento del extracto fue 5.38%. El contenido de oleandrina en el extracto fue calculado utilizando cromatografía líquida de alta presión y espectrometría de masa para ser 1.89 g, o un rendimiento de 0.91%.

Ejemplo 2

Extracción en Agua Caliente de Hojas de Adelfa en Polvo.

(Ejemplo Comparativo)

La extracción en agua caliente se utiliza típicamente para extraer oleandrina y otros componentes activos de hojas de Adelfa. Ejemplos de procedimientos de extracción en agua caliente se pueden encontrar en las Patentes de E.U.A. Nos.

5,135,745 y 5,869,060.

Se realizó una extracción en agua caliente utilizando 5 g de hojas de Adelfa en polvo. Se agregaron diez volúmenes de agua hirviendo (por peso del material de partida de Adelfa) a las hojas de Adelfa en polvo y la mezcla se agitó constantemente por 6 horas. La mezcla luego fue filtrada y el residuo de hojas fue recolectado y extraído de nuevo bajo las mismas condiciones. Los filtrados fueron combinados y liofilizados. La apariencia del extracto fue marrón. El material del extracto seco pesó cerca de 1.44 g. 34.21 mg del material del extracto fue disuelto en agua y sometido a análisis de contenido de oleandrina utilizando cromatografía líquida de alta presión y espectrometría de masa. Se determinó que la cantidad de oleandrina era 3.68 mg. El rendimiento de oleandrina, con base en la cantidad de extracto, fue calculada siendo 0.26%.

Ejemplo 3

Preparación de Composiciones Farmacéuticas

Método A. Sistema de suministro de fármaco basado en Cremophor

Se proporcionaron los siguientes ingredientes en las cantidades indicadas.

Los excipientes fueron dosificados en una jarra y agitados en un agitador de Incubadora Refrigerada New Brunswick Scientific C24KC por 24 horas a 60oC para asegurar homogeneidad. Las muestras luego fueron jaladas e inspeccionadas visualmente para solubilización. Tanto los excipientes como la composición antiviral se disolvieron totalmente para todas las formulaciones después de 24 horas.

Método B. Sistema de suministro de fármaco basado en GMO/Cremophor

Se proporcionaron los siguientes ingredientes en las cantidades indicadas.

Se siguió el procedimiento del Método A.

Método C. Sistema de suministro de fármaco basado en Labrasol

Se proporcionaron los siguientes ingredientes en las cantidades indicadas.

Se siguió el procedimiento del Método A.

Método D. Sistema de formación de miscelas basado en Vitamina E-TPGSSe proporcionaron los siguientes ingredientes en las cantidades indicadas.

Se siguió el procedimiento del Método A.

Método E. Sistema de suministro de fármaco de Múltiples componentes

Se proporcionaron los siguientes ingredientes en las cantidades indicadas.

Se siguió el procedimiento del Método A.

Método F. Sistema de suministro de fármaco de Múltiples componentes

Se proporcionaron los siguientes ingredientes en las cantidades indicadas y se incluyeron en una cápsula.

Se siguió el procedimiento del Método A.

Ejemplo 4

Preparación de Cápsulas con Revestimiento Entérico

Paso I: Preparación de cápsula rellena de líquido

Se llenaron cápsulas de gelatina dura (50 piezas, tamaño 00) con una composición líquida del Ejemplo 3. Estas cápsulas fueron llenadas manualmente con 800 mg de la formulación y luego selladas a mano con una solución de etanol al 50%/ agua al 50%. Las cápsulas luego fueron selladas a mano con solución de gelatina al 22% que contiene los siguientes ingredientes en las cantidades indicadas.

La solución de gelatina se mezcló perfectamente y se dejó hinchar por 1-2 horas. Después del periodo de hinchamiento, la solución fue cubierta herméticamente y colocada en un horno a 55°C y se dejó licuar. Una vez que toda la solución de gelatina estuvo líquida, se realizó el sellado

Utilizando un pincel de artista de punta redonda 3/0, la solución de gelatina fue pintada sobre las cápsulas. Se utilizó el kit de sellado proporcionado por Shionogi. Después del sellado, las cápsulas fueron mantenidas a condiciones ambientales por 12 horas para permitir el curado del sellado.

Paso II: Revestimiento de la cápsula rellena de líquido

Se preparó una dispersión de revestimiento de los ingredientes listados en el cuadro siguiente.

Si se utilizaron las cápsulas selladas de acuerdo con el Paso I, se aplicó la dispersión a las cápsulas a un nivel de revestimiento de 20.0 mg/cm2. Se utilizaron las siguientes condiciones para revestir las cápsulas.

La boquilla del rociado se estableció de modo que tanto la boquilla como la trayectoria del rocío estuvieron bajo la trayectoria de flujo del aire de entrada.

Ejemplo 5

Tratamiento de Infección por Virus de Zika en un Sujeto

Método A. Terapia de Composición Antiviral

Un sujeto que presenta infección por virus de Zika es prescrito con la composición antiviral, y se administran dosis terapéuticamente relevantes al sujeto de acuerdo con un régimen de dosificación prescrito por un periodo de tiempo. El nivel de respuesta terapéutica del sujeto se determinó periódicamente. El nivel de respuesta terapéutica puede ser determinado por la determinación de la titulación del virus de Zika en la sangre o plasma del sujeto. Si el nivel de respuesta terapéutica es demasiado bajo a una dosis, entonces la dosis es escalada de acuerdo con un programa de escalamiento de dosis predeterminado hasta que se alcanza el nivel de respuesta terapéutica en el sujeto. El tratamiento del sujeto con la composición antiviral se continúa según sea necesario y la dosis o régimen de dosificación puede ser ajustado según sea necesario hasta que el paciente alcanza el punto final clínico deseado.

Método B. Terapia de Combinación: composición antiviral con otro agente

Se sigue el Método A, anterior, excepto que el sujeto es prescrito y administrado con uno o más de otros agentes terapéuticos para el tratamiento de infección por virus de Zika o síntomas de la misma. Luego uno o más de otros agentes terapéuticos se pueden administrar antes, después o con la composición antiviral. También se puede hacer el escalamiento de dosis (o desescalamiento) del uno o más de otros agentes terapéuticos.

Ejemplo 6

Evaluaciónin Vitrode Actividad Antiviral Contra Infección por el Virus de Zika

Método A. Compuesto Puro

Células Vero E6 (también conocidas como células Vero C1008, ATTC No. CRL-1586; https://www.atcc.org/Products/All/CRL-1586.aspx) fueron infectadas con ZIKV (cepa de virus de Zika PRVABC59; ATCC VR-1843; https://www.atcc.org/Products/All/VR-1843.aspx) a un MOI (multiplicidad de infección) de 0.2 en la presencia de glucósido cardíaco. Las células fueron incubadas con el virus y compuesto por 1 hr, después de lo cual el inoculado y compuesto fueron desechados. Las células recibieron medio fresco y se incubaron por 48hr, después de lo cual fueron fijadas con formalina y teñidas para infección por ZIKV. Se representan tasas de infección representativas para oleandrina (Figura 1) y digoxina (Figura 1) según se determina por centellograma. Se evalúan otros compuestos bajo las mismas condiciones y exhiben niveles muy variables de actividad antiviral contra el virus de Zika.

Método B. Compuesto en Forma de Extracto

Un extracto que contiene un compuesto diana que se está probando es evaluado como se detalló en el Método A, excepto que la cantidad de extracto es normalizada a la cantidad de compuesto diana en el extracto. Por ejemplo, un extracto que contiene 2% en peso de oleandrina contiene 20 qg de oleandrina por 1 mg de extracto. En consecuencia, si la cantidad destinada de oleandrina para evaluación es 20 qg, entonces podría utilizarse 1 mg de extracto en el ensayo.

Ejemplo 7

Preparación de una Tableta que Comprende Composición Antiviral

Una mezcla de tabletado inicial de Syloid 244FP al 3% y celulosa microcristalina al 97% (MCC) fue mezclada. Luego, se incorporó un lote existente de composición preparada de acuerdo con el Ejemplo 3 en la mezcla de Syloid/MCC vía granulación húmeda. Este mezcla es marcada "Mezcla de Tabletado Inicial) en el cuadro siguiente. Se agregó MCC adicional extra-granularmente para aumentar la compresibilidad. Esta adición a la Mezcla de Tabletado Inicial fue etiquetada como "Adición Extra-granular." La mezcla resultante de la adición extra-granular fue la misma composición que la "Mezcla de Tabletado Final."

A i i n Exr r n l r

Mezcla de Tabletado Final:

Abreviado

Syloid 244FP es un dióxido de silicio coloidal fabricado por Grace Davison. El dióxido de silicio coloidal se utiliza comúnmente para proporcionar muchas funciones, tal como un adsorbente, deslizante, y desintegrante de tabletas. El Syloid 244FP fue elegido por su capacidad de adsorber 3 veces su peso en aceite y por su tamaño de partícula de 5.5 micras.

Ejemplo 8

Análisis de HPLC de Soluciones que Contienen Oleandrina

Se analizaron muestras (estándar de oleandrina, extracto de SCF y extracto en agua caliente) en HPLC (Waters) utilizando las siguientes condiciones: Columna Symmetry C18 (5.0 mm, 150 x4.6 mm I.D.; Waters); Fase Móvill de MeOH:agua = 54: 46 (v/v) y caudal a 1.0 ml/min. La detección de longitud de onda fue ajustada a 217 nm. Las muestras fueron preparadas al disolver el compuesto o extracto en una cantidad fija de solvente de HPLC para alcanzar una concentración diana aproximada de oleandrina. El tiempo de retención de la oleandrina puede ser determinado mediante el uso de un estándar interno. La concentración de oleandrina puede ser determinada/ calibrada mediante el desarrollo de una curva de respuesta de señal utilizando el estándar interno.

Ejemplo 9

Preparación de la Composición Farmacéutica

Una composición farmacéutica de la invención puede ser preparada por cualquier de los siguientes métodos. El mezclado puede realizarse bajo condiciones húmedas o secas. La composición farmacéutica puede ser compactada, secada o ambas durante la preparación. La composición farmacéutica puede ser dividida en formas de dosificación.Método A.

Por lo menos un excipiente farmacéutico se mezcla con por lo menos un compuesto antiviral descrito en la presente.Método B.

Por lo menos un excipiente farmacéutico se mezcla con por lo menos dos compuestos antivirales descritos en la presente.

Método C.

Por lo menos un excipiente farmacéutico se mezcla con por lo menos un glucósido cardíaco descrito en la presente.Método D.

Por lo menos un excipiente farmacéutico se mezcla con por lo menos dos triterpenos descritos en la presente.

Método E.

Por lo menos un excipiente farmacéutico se mezcla con por lo menos un glucósido cardíaco descrito en la presente y por lo menos dos triterpenos descritos en la presente.

Método D.

Por lo menos un excipiente farmacéutico se mezcla con por lo menos tres triterpenos descritos en la presente.

Ejemplo 10

Preparación de Mezclas de Triterpenos

Las siguientes composiciones fueron elaboradas por mezclado de los triterpenos especificados en las proporciones molares aproximadas indicadas.

Para cada composición, se formaron tres diferentes soluciones respectivas, con lo cual la concentración total de triterpenos en cada solución fue aproximadamente 9 pM, 18 pM, o 36 pM.

Ejemplo 11

Preparación de Composiciones Antivirales

Las composiciones antivirales pueden ser preparadas por mezclado de los componentes individuales de triterpeno de la misma para formar una mezcla. Las mezclas de triterpeno preparadas antes que proporcionaron actividad antiviral aceptable fueron formuladas en las composiciones antivirales.

Composición antiviral con ácido oleanólico y ácido ursólico

Cantidades dconodias e ácido oleanólico y ácido ursólico fueron mezcladas de acuerdo con una proporción molar predeterminada de los componentes como se define en la presente. Los componentes fueron mezclados en forma sólida o fueron mezclados en el solvente(s), por ejemplo, metanol, etanol, cloroformo, acetona, propanol, dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), dimetilacetamida (DMAC), N-metilpirrolidona (NMP), agua o mezclas de los mismos. La mezcla resultante contuvo los componentes en las proporciones molares relativas como se describe en la presente. Para una composición antiviral farmacéuticamente aceptable, por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable fue mezclado con los agentes farmacológicamente activos. Una composición antiviral es formulada para administración a un mamífero.

Composición antiviral con ácido oleanólico y ácido betulínico

Cantidades conocidas de ácido oleanólico y ácido betulínico fueron mezcladas de acuerdo con una proporción molar predeterminada de los componentes como se definen en la presente. Los componentes fueron mezclados en forma sólida o fueron mezclados en el solvente(s), por ejemplo, metanol, etanol, cloroformo, acetona, propanol, dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), dimetilacetamida (DMAC), N-metilpirrolidona (NMP), agua o mezclas de los mismos. La mezcla resultante contuvo los componentes en las proporciones molares relativas como se describe en la presente.

Para una composición antiviral farmacéuticamente aceptable, por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable fue mezclado con los agentes farmacológicamente activos. Una composición antiviral es formulada para administración a un mamífero.

Composición antiviral con ácido oleanólico, ácido ursólico, y ácido betulínico

Cantidades conocidas de ácido oleanólico, ácido ursólico y ácido betulínico fueron mezcladas de acuerdo con una proporción molar predeterminada de los componentes como se define en la presente. Los componentes fueron mezclados en forma sólida o fueron mezclados en el solvente(s), por ejemplo metanol, etanol, cloroformo, acetona, propanol, dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), dimetilacetamida (DMAC), N-metilpirrolidona (NMP), agua o mezclas de los mismos. La mezcla resultante contuvo los componentes en las proporciones molares relativas como se describe en la presente.

Pra una composición antiviral farmacéuticamente aceptable, por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable fue mezclado con los agentes farmacológicamente activos. Una composición antiviral es formulada para administración a un mamífero.

Composición antiviral con oleadrina, ácido oleanólico, ácido ursólico, y ácido betulínico

Cantidades conocidas de oleandrina ácido oleanólico, ácido ursólico y ácido betulínico fueron mezcladas de acuerdo con una proporción molar predeterminada de los componentes como se define en la presente. Los componentes fueron mezclados en forma sólida o fueron mezclados en el solvente(s), por ejemplo metanol, etanol, cloroformo, acetona, propanol, dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), dimetilacetamida (DMAC), N-metilpirrolidona (NMP), agua o mezclas de los mismos. La mezcla resultante contuvo los componentes en las proporciones molares relativas como se describe en la presente.

Ejemplo 12

Tratamiento de Infección por Filovirus en un Sujeto

Infecciones por Filovirus ejemplares incluyen virus de Ébola y virus de Marburg.

Método A. Terapia de Composición Antiviral

Un sujeto que presenta infección por Filovirus es prescrito con la composición antiviral, y se administran dosis terapéuticamente relevantes al sujeto de acuerdo con un régimen de dosificación prescrito por un periodo de tiempo. El nivel de respuesta terapéutica del sujeto se determinó periódicamente. El nivel de respuesta terapéutica puede ser determinado por la determinación de titulación del Filovirus en la sangre o plasma del sujeto. Si el nivel de respuesta terapéutica es demasiado bajo a una dosis, entonces la dosis es escalada de acuerdo con un programa de escalamiento de dosis predeterminado hasta que se alcanza el nivel de respuesta terapéutica en el sujeto. El tratamiento del sujeto con la composición antiviral se continúa según sea necesario y la dosis o régimen de dosificación puede ser ajustado según sea necesario hasta que el paciente alcanza el punto final clínico deseado.

Método B. Terapia de Combinación: composición antiviral con otro agente

Se siguió el Método A, anterior, excepto que el sujeto se prescribe y administra con uno o más de otros agentes terapéuticos para el tratamiento de infección por Filovirus o síntomas de la misma. Luego uno o más de otros agentes terapéuticos se pueden administrar antes, después o con la composición antiviral. También se puede hacer el escalamiento de dosis (o desescalamiento) del uno o más de otros agentes terapéuticos.

Ejemplo 13

Tratamiento de Infección por Flavivirus en un Sujeto

Infecciones por Flavivirus ejemplares incluyen Fiebre Amarilla, Fiebre de Dengue, Encefalitis Japonesa, virus del Nilo del Oeste, virus de Zika, Encefalitis de origen por Garrapata, Enfermedad del Bosque Kyasanur, Enfermedad de Alkhurma, virus de Chikungunya, Fiebre Hemorrágica de Omsk, infección por virus de Powassan.

Método A. Terapia de Composición Antiviral

Un sujeto que presenta infección por Flavivirus es prescrito con la composición antiviral, y se administran dosis terapéuticamente relevantes al sujeto de acuerdo con un régimen de dosificación prescrito por un periodo de tiempo. El nivel de respuesta terapéutica del sujeto se determinó periódicamente. El nivel de respuesta terapéutica puede ser determinado por la determinación de titulación del Flavivirus en la sangre o plasma del sujeto. Si el nivel de respuesta terapéutica es demasiado bajo a una dosis, entonces la dosis es escalada de acuerdo con un programa de escalamiento de dosis predeterminado hasta que se alcanza el nivel de respuesta terapéutica en el sujeto. El tratamiento del sujeto con la composición antiviral se continúa según sea necesario y la dosis o régimen de dosificación puede ser ajustado según sea necesario hasta que el paciente alcanza el punto final clínico deseado.

Método B. Terapia de Combinación: composición antiviral con otro agente

Se siguió el Método A, anterior, excepto que el sujeto se prescribe y administra con uno o más de otros agentes terapéuticos para el tratamiento de la infección por Flavivirus o síntomas de la misma. Luego uno o más de otros agentes terapéuticos se pueden administrar antes, después o con la composición antiviral. También se puede hacer el escalamiento de dosis (o desescalamiento) del uno o más de otros agentes terapéuticos.

Ejemplo 14

Evaluación de la Actividad Antiviral Contra el Virus de Zika y Virus de Dengue

Se realizó un ensayo basado en CPE al infectar células diana en la presencia o ausencia de composiciones de prueba, a un intervalo de concentraciones. La infección de las células diana por los resultados en los efectos citopáticos y muerte celular. En este tipo de ensayo, la reducción de CPE en la presencia de la composición de prueba, y el correspondiente aumento en la viabilidad celular, se utilizan como un indicador de actividad antiviral. Para los ensayos a base de CPE, la viabilidad celular fue determinada con una lectura roja neutra. Las células viables incorporan un rojo neutro en sus lisosomas. La captación del rojo neutro se basa en la capacidad de las células vivas para mantener un pH más bajo al interior de sus lisosomas que en el citoplasma, y este proceso activo requiere ATP. Una vez dentro del lisosoma, el colorante rojo neutro se vuelve cargado y es retenido intracelularmente. Después de una incubación de 3 horas con el rojo neutro (0.033%), el colorante extracelular fue removido, las células fueron lavadas con PBS, y el rojo neutro intracelular fue solubilizado con una solución de etanol al 50% ácido acético al 1%. La cantidad de rojo neutral en solución fue cuantificada por la lectura de la absorbancia (densidad óptica) de cada pocillo a 490 nm

Se utilizaron líneas celulares adherentes para evaluar la actividad antiviral de las composiciones contra un panel de virus. Las composiciones fueron pre-incubadas con las células diana por 30 min antes de la adición del virus a las células. Las composiciones estuvieron presentes en el medio de cultivo celular por la duración del periodo de incubación de la infección. Para cada ensayo de infección, se configuró un ensayo de viabilidad en paralelo utilizando las mismas concentraciones de las composiciones (duplicados) para determinar los efectos de citotoxicidad de las composiciones en la ausencia de virus.

La actividad antiviral de las composiciones de prueba fue determinada por comparación de los niveles de infección (para el ensayo a base de inmunotinción) o viabilidad (para el ensayo a base de CPE) de células bajo las condiciones de prueba para el nivel de infección o viabilidad de las células no infectadas. Los efectos citotóxicos fueron evaluados en células no infectadas por comparación de la viabilidad en la presencia de inhibidores a la viabilidad de las células con falso tratamiento. La citotoxicidad fue determinada por un ensayo de viabilidad de XTT, que fue realizado en el mismo punto de tiempo que la lectura para el correspondiente ensayo de infección.

Las composiciones de prueba fueron disueltas en metanol al 100%. Se generaron ocho concentraciones de las composiciones (por duplicado) al realizar diluciones por 8 veces, iniciando con 50 pM como la concentración más alta probada. La concentración más alta de la prueba de la composición (50 pM) resultó en una concentración final al 0.25% de metanol (%v/v) en el medio de cultivo. Una serie de diluciones de 8 veces de vehículo de metanol fue incluida en cada placa de ensayo, con las concentraciones imitanto la concentración final de metanol en cada condición de prueba de la composición. Cuando fue posible, el EC50 y CC50 de la composición fue determinado para cada ensayo utilizando el softwareGraphPad.

La actividad antiviral fue evaluada por el grado de protección contra los efectos citopaticos inducidos por el virus (CPE). Las células fueron desafiadas con el virus en la presencia de diferentes concentraciones de control o de las composiciones. El grado de protección contra CPE fue monitoredo después de 6 días (ZIKV, virus de Zika) o 7 días (DENV, virus de Dengue) post-infección por cuantificación de la viabilidad celular en diferentes condiciones de prueba y comparando los valores con esos de las células sin tratar y las células tratadas solo con vehículo (medio de infección).

Los controles de calidad para los ensayos de neutralización fueron realizados en cada placa para determinar: i) valores de señal a fondo (S/B); ii) inhibición por los inhibidores conocidos, y iii) variación del ensayo, como medida por el coeficiente de variación (C.V.) de todos los puntos de datos. La variación total en los ensayos de infección varió de 3.4% a 9.5%, y la variación total en los ensayos de viabilidad varió de 1.4% a 3.2%, calculado como el promedio de todos los valores de C.V. La señal a fondo (S/B) para los ensayos de infección varió de 2.9 a 11.0, mientras la señal a fondo (S/B) para los ensayos de viabilidad varió de 6.5 a 29.9.

Protección del efecto citopático (CPE) inducido por DENV2 con lectura de Rojo Neutro: Para el ensayo antiviral de DENV2, se utilizó la cepa 08-10381 Montserrat. Se generaron reservas virales en células de insecto C6/36. Las células Vero (células epiteliales de riñón derivadas deCercopithecus aetiops)fueron mantenidas en MEM con FBS al 5% (MEM5). Para ambos de los ensayos de infección y de viabilidad, las células fueron sembradas a 10,000 células por pocillo en placas de fondo plano transparente de 96 pocillos y se mantuvieron en MEM5 a 37°C por 24 horas. El día de la infección, las muestras fueron diluidas 8 veces en placas de fondo U utilizando MEM con albúmina de suero bovino al 1% (BSA). Las diluciones del material de prueba fueron preparadas a 1.25X de la concentración final y se incubaron 40pl con las células diana a 37°C por 30 minutos. Después de la pre-incubación del material de prueba, se prepararon diluciones del virus de 10pl en MEM con BSA al 1% a cada pocillo (50pl de volumen final por pocillo) y las placas fueron incubadas a 37°C en una incubadora humidificada con CO2 al 5% por 3 horas. El volumen del virus utilizado en el ensayo fue determinado previamente para producir una señal en la escala lineal inhibida por Ribavirin y el compuesto A3, inhibidores conocidos de DENV2. Después de la incubación de la infección, las células fueron lavadas con PBS, luego MEM que contiene FBS al 2% FBS (MEM2) para remover el virus sin unir. Subsecuentemente, 50pl de medio que contiene diluciones de inhibidor preparadas a una concentración 1X en MEM2 fueron agregados a cada pocillo. La placa fue incubada a 37°C en la incubadora (CO2 al 5%) por 7 días. Los controles sin virus (“infectadas falsas’), células infectadas incubadas solo con medio, células infectadas incubadas solo con vehículo (metanol), y pocillos sin células (para determinar el fondo) fueron incluidas en la placa de ensayo. Los pocillos de control que contienen 50pM de Ribavirin y 0.5pM de compuesto A3 también fueron incluidos en la placa de ensayo. Después de 7 días de infección, las células fueron teñidas con rojo neutro para monitorear la viabilidad celular. Los materiales de prueba fueron evaluados en duplicados utilizando diluciones seriales de 8 veces en medio de infección. Los controles incluyeron células incubadas sin virus (“infectadas falsas”), células infectadas incubadas solo con medio, o células infectadas en la presencia de Ribavirin (0.5pM) o A3 (0.5pM). Una curva de inhibición por duplicado completa solo con vehículo de metanol fue incluida en la misma placa de ensayo.

Protección del efecto citopático (CPE) inducido por ZIKV con lectura de Rojo Neutro: Para el ensayo antiviral de ZIKV, se utilizó la cepa PLCal_zV. Las células Vero (células epiteliales de riñón derivadas deCercopithecus aetiops)fueron mantenidas en MEM con FBS al 5% (MEM5). Para ambos de los ensayos de infección y de viabilidad, las células fueron sembradas a 10,000 células por pocillo en placas de fondo plano transparente de 96 pocillos y se mantuvieron en MEM5 a 37°C por 24 horas. El día de la infección, las muestras fueron diluidas 8 veces en placas de fondo U utilizando MEM con albúmina de suero bovino al 1% (BSA). Las diluciones del material de prueba fueron preparadas a 1.25X de la concentración final y se incubaron 40pl con las células diana a 37°C por 30 minutos. Después de la pre-incubación del material de prueba, se prepararon diluciones del virus de 10pl en MEM con BSA al 1% a cada pocillo (50pl de volumen final por pocillo) y las placas fueron incubadas a 37°C en una incubadora humidificada con CO2 al 5% por 3 horas. Después de la incubación de la infección, las células fueron lavadas con PBS, luego MEM que contiene FBS al 2% FBS (MEM2) para remover el virus sin unir. Subsecuentemente, 50pl de medio que contiene diluciones de inhibidor preparadas a una concentración 1X en MEM2 fueron agregados a cada pocillo. La placa fue incubada a 37°C en la incubadora (CO2 al 5%) por 6 días. Los controles sin virus (“infectadas falsas’), células infectadas incubadas solo con medio, células infectadas incubadas solo con vehículo (metanol), y pocillos sin células (para determinar el fondo) fueron incluidas en la placa de ensayo. Después de 6 días de infección, las células fueron teñidas con rojo neutro para monitorear la viabilidad celular. Los materiales de prueba fueron evaluados en duplicados utilizando diluciones seriales de 8 veces en medio de infección. Los controles incluyeron células incubadas sin virus (“infectadas falsas”), células infectadas incubadas solo con medio, o células infectadas en la presencia de A3 (0.5pM). Una curva de inhibición por duplicado completa solo con vehículo de metanol fue incluida en la misma placa de ensayo.

Análisis de datos de viabilidad basados en CPE: para los ensayos de rojo neutro, se determinó la viabilidad celular por monitoreo de la absorbancia a 490 nm. La señal promedio obtenida en los pocillos sin células fue sustraída de todas las muestras. Luego, todos los puntos de datos fueron calculados como un porcentaje de la señal promedio observada en los 8 pocillos de células falsas (sin infectar) células en la misma placa de ensayo. Las células infectadas tratadas solo con medio redujeron la señal a un promedio de 4.2% (para HRV), 26.9% (para DENV), y 5.1% (para ZIKV) de esas observadas en las células sin infectar. La señal a fondo (S/B) para este ensayo fue 2.9 (para DENV), y 7.2 (para ZIKV), determinado como el porcentaje de viabilidad en las células “infectadas falsas” en comparación con ese de las células infectadas tratadas solo con vehículo.

Ensayo de viabilidad (XTT) para evaluar la citotoxicidad inducida por el compuesto: Las células infectadas falsas fueron incubadas con diluciones de inhibidor (o solo medio) utilizando la misma configuración experimental y concentraciones de inhibidor como se utilizó en el correspondiente ensayo de infección. La temperatura y duración de la incubación del periodo de incubación imitaron las condiciones del correspondiente ensayo de infección. La viabilidad celular fue evaluada con un método XTT. El ensayo XTT mide la actividad mitocondrial y se basa en la disociación de la sal de tetrazolio amarillo (XTT), que forma un colorante de formazán anaranjado. La reacción solo ocurre en células viables con mitocondrias activas. El colorante de formazán se cuantifica directamente utilizando un espectrofotómetro de exploración de múltiples pocillos. Los niveles de fondo obtenidos de los pocillos sin células fueron sustraídos de todos los puntos de datos. Los controles solo con vehículo de metanol (a 7 concentraciones que imitan el porcentaje final de metanol de cada pocillo de prueba de Oleandrina) fueron incluidos en la placa de ensayo de viabilidad. El grado de viabilidad fue monitoreado por la medición de la absorbancia a 490 nm.

Análisis de datos de citotoxicidad: Para los ensayos de XTT, la viabilidad celular fue determinada por monitoreo de la absorbancia a 490 nm. La señal promedio obtenida en los pocillos sin células fue sustraída de todas las muestras. Luego, todos los puntos de datos fueron calculados como un porcentaje de la señal promedio observada en los 8 pocillos de células falsas (sin infectar) células en la misma placa de ensayo. La señal a fondo (S/B) para este ensayo fue 29.9 (para IVA), 8.7 (para HRV), 6.5 (para DENV), y 6.7 (para ZIKV), determinada como el porcentaje de viabilidad en las células “infectadas falsas” en comparación con la señal observada para los pocillos sin células.

Ejemplo 15

Evaluación de actividad antiviral contra Filovirus (virus de Ébola y virus de Marburg)

Método A.

Células Vero E6 fueron infectadas con EBOV/Kik (A, MOI=1) o MARV/Ci67 (B, MOI=1) en la presencia de oleandrina, digoxina o PBI-05204, un extracto vegetal que contiene oleandrina. Después de 1hr, el inoculado y los compuestos fueron removidos y se agregó medio fresco a las células. 48hr más tarde, las células fueron fijadas e inmunoteñidas para detectar las células infectadas con EBOV o MARV. Las células infectadas fueron enumeradas utilizando un Operetta. C) Vero E6 fueron tratadas con compuesto como anteriormente. Los niveles de ATP fueron medidos por CellTiter-Glo como una medición de la viabilidad celular.

Método B.

Células Vero E6 fueron infectadas con EBOV (A,B) o MARV (C,D). A las 2hr post-infección (A,C) o 24hr post-infección (B,D), se agregó oleandrina o PBI-05204 a las células por 1 hr, luego se desechó y las células fueron regresadas al medio de cultivo. A las 48hr post-infección, las células infectadas fueron analizadas como en la Figura 1.

Método C.

Células Vero E6 fueron infectadas con EBOV o MARV en la presencia de oleandrina o PBI-05204 y fueron incubadas por 48hr. Los sobrenadantes de cultivos celulares infectados se pasaron sobre células Vero E6 frescas, se incubaron por 1hr, luego se desecharon (como se representa en A). Las células que contienen el sobrenadante pasado fueron incubadas por 48hr. Las células infectadas con EBOV (B) o MARV (C) fueron detectadas como se describió previamente. Las tasas de infección de control fueron 66% para EBOV y 67% para MARV.

Ejemplo 16

Evaluación de Actividad Antiviral Contra el Virus Togaviridae

(Alfavirus: VEEV y WEEV)

Células Vero E6 fueron infectadas con virus de la encefalitis equina Venezolana (A, MOI=0.01) o virus de la encefalitis equina del Oeste (B, MOI=0.1) por 18hr en la presencia o ausencia de los compuestos indicados. Las células infectadas fueron detectadas como se describe en la presente y enumeradas en una Operetta.

Ejemplo 17

Tratamiento de infección por Paramyxoviridae en un sujeto

Infecciones virales ejemplares por la familia Paramyxoviridae incluyen infección por el género Henipavirus, infección por el virus Nipah, o infección por el virus Hendra.

Método A. Terapia de Composición Antiviral

Un sujeto que presenta una infección por la familia de Paramyxoviridae es prescrito con la composición antiviral, y se administran las dosis terapéuticamente relevantes al sujeto de acuerdo con un régimen de dosificación prescrito por un periodo de tiempo. El nivel de respuesta terapéutica del sujeto se determinó periódicamente. El nivel de respuesta terapéutica puede ser determinado por la determinación de la titulación del virus en la sangre o plasma del sujeto. Si el nivel de respuesta terapéutica es demasiado bajo a una dosis, entonces la dosis es escalada de acuerdo con un programa de escalamiento de dosis predeterminado hasta que se alcanza el nivel de respuesta terapéutica en el sujeto. El tratamiento del sujeto con la composición antiviral se continúa según sea necesario y la dosis o régimen de dosificación puede ser ajustado según sea necesario hasta que el paciente alcanza el punto final clínico deseado.

Método B. Terapia de Combinación: composición antiviral con otro agente

Se siguió el Método A, anterior, excepto que el sujeto se prescribe y administra con uno o más de otros agentes terapéuticos para el tratamiento de la infección por la familia Paramyxoviridae o síntomas de la misma. Luego uno o más de otros agentes terapéuticos se pueden administrar antes, después o con la composición antiviral. También se puede hacer el escalamiento de dosis (o desescalamiento) del uno o más de otros agentes terapéuticos.

Ejemplo 18

Líneas celulares y Aislamiento de huPBMC primarias

La línea de linfocitos T de linfoma SLB1 transformado de HTLV-1 (HTLV-1+) productora del virus (Arnold et al., 2008; proporcionada amablemente por P. Green, The Ohio State University-Comprehensive Cancer Center) fue cultivada en una incubadora humidificada a 37°C bajo CO2 al 10% en Medio de Dulbeco Modificado por Iscove (IMDM; ATCC No. 30 2005), suplementado con suero bovino fetal inactivado térmicamente al 10% (FBS; Biowest), 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de sulfato de estreptomicina, y 20 mg/ml de sulfato de gentamicina (Life Technologies).

Células mononucleares de sangre periférica humana primarias (huPBMCs) fueron aisladas de muestras de sangre entera, proporcionadas sin identificadores por el SMU Memorial Health Center bajo un protocolo aprobado por el SMU Institutional Review Board y consistente con la Declaración de los principios de Helsinki. En resumen, 2 ml de sangre entera fueron mezclados con un volumen igual de salina regulada con fosfato (PBS), pH 7.4, en tubos cónicos de polipropileno (Corning) y luego las muestras fueron colocadas en capas suavemente sobre 3 ml de Medio de Separación de Linfocitos (MP Biomedicals). Las muestras fueron centrifugadas por 30 min a 400 xgen un rotor de bandeja oscilatoria a temp. ambiente. La fracción de células blancas de las huPBMC fue subsecuentemente aspirada, lavada 2X en medio RPMI-1640 (ATCC No. 30-2001), y peletizadas por centrifugación por 7 min a 260 x g. Las células fueron resuspendidas en medio RPMI-1640, suplementadas con FBS al 20%, 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de sulfato de estreptomicina, 20 mg/ml de sulfato de gentamicina, y 50 U/ml de interleucina 2 humana recombinante (hu-IL-2; Roche Applied Science), y estimuladas por 24 hrs con 10 ng/ml de fitohemaglutinina (PHA; Sigma-Aldrich) y se cultivaron a 37°C bajo CO2 de 10% en una incubadora humidificada. En el siguiente día, las células fueron peletizadas por centrifugación por 7 min a 260 xgy lavadas 2X con medio RPMI-1640 para remover el PHA, y luego resuspendidas y cultivadas en medio completo, suplementadas con antibióticos y 50 U/ml hu-IL-2.

Ejemplo 19

Generación de Clones de Linfocitos T HTLV-1+SLB1/pLenti-GFP que Expresan GFP

Para generar los clones de linfocitos T HTLV-1+ SLB1 que expresan GFP, se colocaron en capas 2x106 células SLB1 en cajas de cultivo de tejido de 60 mm2 t (Corning) en IMDM, suplementado con FBS inactivado térmicamente al 10% y antibióticos, y luego se transdujeron con partículas lentivirales que contiene vector de expresión de pLenti-6.2/V5-DEST-proteína fluorescente verdeque también porta un gen de resistencia a blasticidina. Después de 6 hrs, las células transducidas fueron formadas como pellas por centrifugación por 7 min a 260 xga temperatura ambiente, lavadas 2X con IMDM libre de suero, y resuspendidas en medio completo suplementado con 5 mg/ml de blasticidina (Life Technologies) y se pusieron alícuotas en placas de microtitulación de 96 pocillos (Corning). Los cultivos fueron mantenidos con selección a blasticidina por dos semanas en una incubadora humidificada a 37°C y CO2 al 10%. Los linfoblastos que expresan GFP fueron examinados por microscopía de fluorescencia, y luego colocados en placas por dilución limitante en placas de microtitulación de 96 pocillos para obtener clones de células que expresan GFP homogéneo. Los clones de linfocito T HTLV-1+ SLB1/pLenti-GFP resultantes fueron expandidos y pasados repetidamente; y la expresión de GFP fue confirmada por electoforesis de dodecil sulfato de sodio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y se inmuntransfirió utilizando un anticuerpo policlonal de conejo Anti-GFP (FL) (Santa Cruz Biotechnology).

Ejemplo 20

Cuantificación de Producción de Virus e Infectividad de Partículas por ELISA Anti-HTLV-1 p19Gag

Para determinar los efectos de oleandrina o un extracto deN. oleandertras replicación proviral de HTLV-1 y la liberación de partículas virales extracelulares recientemente sintetizadas, la línea de linfocitos T de linfoma de HTLV-1+ SLB1 fue colocada en placas a 2x104 células por pocillo en 300 ml de medio completo, suplementado con antibióticos, en placas de microtitulación de 96 pocilios e incubadas a 37°C bajo CO2 al 10%. El compuesto de oleandrina purificado y el extracto deN. oleander(Phoenix Biotechnology; véase Singh et al., 2013) fueron resuspendidos en la solución de Vehículo (20% v/v de dimetilsulfóxido, DMSO, en H2O destilada/desionizada MilliQ) a una concentración de reserva de 2 mg/ml y luego esterilizada utilizando un filtro de jeringa de bloqueo Luer 0.2 pm (Millipore). Las células HTLV-1+ SLB1 fueron tratadas con oleandrina o el extracto deN. oleandera concentraciones de 10, 50, y 100 pg/ml, o con cantidades crecientes (1.5, 7.5, y 15 pl) del control de vehículo por 72 hrs. Las placas de microtitulación de 96 pocillos luego fueron centrifugadas por 7 min a 260 xga temp ambiente utilizando un rotor de placa oscilante Eppendorf A-2-DWP para peletizar las células, y los niveles de partículas de HTLV-1 extracelular que contiene p19Gag liberado en los sobrenadantes de cultivo fueron cuantificados con respecto a un estándar de proteína p19Gag al realizar ensayos inmunoabsorbentes enlazados a enzima Anti-p19Gag colorimétricos (ELISA; Zeptometrix). Las muestras fueron analizadas con réplicas por triplicado en un lector de microplaca de multimodo Berthold Tristar LB 941 a 450 nm en modo absorbancia.

Para evaluar la infectividad de las partículas de HTLV-1 extracelular recientemente sintetizadas recolectadas de células tratadas con oleandrina, 2x104 Linfoblastos T HTLV-1+ SLB1 fueron colocados en placas en 300 pl de medio completo, suplementado con antibióticos, y los cultivos fueron tratados por 72 hrs con concentraciones crecientes (10, 50, y 100 pg/ml) de oleandrina o un extracto deN. oleander,o el control de vehículo (1.5, 7.5, y 15 pl). Luego, 50 pl de los sobrenadantes que contienen el virus fueron utilizados para infectar directamente las huPBMC colocadas en placas a una densidad de 2x104 células por pocillo en placas de microtitulación de 96 pocillos en medio completo, suplementado con antibióticos y hu-IL-2. El compuesto de oleandrina, extracto deN. oleander,o control de vehículo fueron mantenidos en medio de cultivo de las huPBMC para controlar posibles eventos de reinfección por las partículas recientemente producidas. Después de 72 hrs, los niveles relativos de viriones de HTLV-1 que contienen p19Gag extracelular liberados en los sobrenadantes de cultivo por las huPBMC infectadas fueron cuantificados a través de ELISA de Anti-HTLV-1 p19Gag.

Ejemplo 21

Medición de la Apoptosis Celular

Para evaluar la citotoxicidad relativa del compuesto de oleandrina, extracto deN. oleander, o el control de vehículo en cultivos celulares tratados, 2x104 linfocitos T de linfoma HTLV-1 SLB1 o huPBMC activadas/cultivadas fueron colocadas en placas en 300 pl de medio completo, suplementado con antibióticos, y mantenidas a 37°C bajo CO2 al 10% en una incubadora humidificada. Los cultivos fueron tratados ya sea con concentraciones crecientes (10, 50, y 100 pg/ml) de oleandrina o extracto deN. oleander,o el control de vehículo (1.5, 7.5, 15 ml) e incubadas por 72 hrs. Se incluyeron células tratadas con ciclofosfamida (50 pM; Sigma-Aldrich) como un control positivo para apóptosis. Las células luego fueron aspiradas y colocadas en placas en portaobjetos de cultivo de tejido de 8 cámaras Permanox (Nalge) que habían sido pretratadas con una solución estéril al 0.01% de poli-L-Lisina y Concanavalina A (1 mg/ml; Sigma-Aldrich). Las muestras fueron subsecuentmente teñidas utilizando un kit de detección de apóptosis por microscopía con Anexina V conjugada a isotiocianato de fluoresceína (Anexina V-FITC) y yoduro de propidio (PI; BD-Pharmingen), y los porcentajes relativos de células apoptóticas (es decir positivas a Anexina V-FITC y/o PI) por campo fueron cuantificadas por triplicado por microscopía de fluorescencia confocal utilizando una lente de objetivo de 20x. Los números totales de células por campo fueron cuantificadas por microscopía utilizando un filtro de contraste de fase DIC.

Ejemplo 22

Transmisión de HTLV-1 y Formación de Sinapsis Virológica en Ensayos de Co-cultivo

Ya que la transmisión de HTLV-1 ocurre típicamente a través de contacto directo entre una célula infectada y una célula diana sin infectar a través de una sinápsis virológica (Igakura et al., 2003; Pais-Correia et al., 2010; Gross et al., 2016; Omsland et al., 2018; Majorovits et al., 2008), nosotros probamos si la oleandrina, un extracto deN. oleander,o el control de vehículo podían influir en la formación de sinapsis virológicas y/o la transmisión de partículas de HTLV-1 infecciosas vía interacciones intercelulares in vitro. Para estos experimentos, 2x104 linfocitos T HTLV-1+ SLB1 productores de virus fueron colocados en placas en placas de microtitulación de 96 pocillos y tratadas con mitomicina C (100 pg/ml) en 300 pl de medio completo por 2 hrs a 37°C bajo CO2 al 10% (Bryja et al., 2006). El medio de cultivo luego fue removido, las células fueron lavadas 2X con IMDM libre de suero, y las células fueron tratadas por ya sea 15 min o 3 hrs con cantidades crecientes (10, 50, y 100 pg/ml) de oleandrina o extracto deN. oleander,o el control de vehículo (1.5, 7.5, y 15 pl). Alternativamente, 2x104 de los linfocitos T de HTLV-1+ SLB1/pLenti-GFP que expresan GFP fueron colocados en placas en portaobjetos de cultivo de tejido de 8 cámaras en 300 pl de medio completo y tratadas con mitomicina C, lavadas 2X con IMDM libre de suero, y luego tratadas con oleandrina, extracto deN. oleander,o el control de vehículo como se describe para los experimentos de microscopía confocal. A continuación nosotros aspiramos el medio, lavamos las células HTLV-1+ SLB1 2X con medio libre de suero, y agregamos 2x104 huPBMC a cada pocillo en 300 pl de medio RPMI-1640, suplementado con FBS al 20%, antibióticos y 50U/ml hu-IL-2, y luego co-cultivamos las células por otras 72 hrs (las células fueron co-cultivadas por 6 hrs para visualizar la formación de sinápsis virológica y la transmisión viral por microscopía confocal utilizando los linfoblastos SLB1/pLenti-GFP) a 37°C bajo CO2 al 10% en una incubadora humidificada. Como un control negativo, se cultivaron las huPBMC solas en la ausencia de células productoras de virus. La oleandrina, el extracto deN. oleander,y el Vehículo fueron mantenidos en el medio de co-cultivo. Los niveles relativos de partículas de HTLV-1 que contienen p19Gag extracelular liberadas en los sobrenadantes de co-cultivo como un resultado de la transmisión viral intercelular fueron cuantificados al realizar las ELISA Anti-HTLV-1 p19Gag. Las sinapsis virológicas formadas entre las células HTLV-1+ SLB/pLenti-GFP positivas a GFP y las huPBMC fueron visualizadas utilizando microscopía de inmunofluorescencia-confocal por tinción de muestras fijas con un anticuerpo primario Anti-HTLV-1 gp21Env y un anticuerpo secundario conjugado a rojo de rodamina. Se incluyó tinción nuclear de diclorhidrato de diamidino-2-fenil-indol (DAPI; Molecular Probes) para comparación y para visualizar las células sin infectar (es decir negativas a HTLV-1). La transmisión intercelular de HTLV-1 a las huPBMC en los ensayos de co-cultivo fue cuantificada por conteo de los porcentajes relativos de las huPBMC positivas a HTLV-1 gp21Env (y negativas a GFP) en 20 campos visuales utilizando un lente de objetivo de 20x.

Ejemplo 23

Microscopía

Las muestras teñidas con Anexina V-FITC/PI para cuantificar la apóptosis y citotoxicidad celular fueron visualizadas por microscopía de fluorescencia confocal en un instrumento Zeiss LSM800 equipado con un detector Airyscan e incubadora de CO2 en etapas, utilizando una lente de objetivo Plan-Apochromat 20x/0.8 y software de sistema Zeiss ZEN (Carl Zeiss Microscopy). La formación de sinapsis virológicas y transmisión viral (es decir determinada por cuantificación de los porcentajes relativos de las huPBMC positivas a Anti-HTLV-1 gp21Env) entre los linfoblastos h TlV-1+ SLB1/pLenti-GFP tratados con mitomicina C y las huPBMC cultivadas fue visualizada por microscopía de inmunofluorscencia confocal utilizando una lente de objetivo Plan-Apochromat 20x/0.8. Las intensidades de fluorescencia relativa de las señales de DAPI, específicas de Anti-HTLV-1 gp21Env (positivas a rojo de rodamina), y GFP fueron cuantificadas gráficamente utilizando la herramienta de análisis Zen 2.5D (Carl Zeiss Microscopy). Los clones de linfocitos T HTLV-1+ SLB1/pLenti-GFP que expresan GFP fueron examinados por microscopía de fluorescencia confocal en un microscopio invertido Nikon Eclipse TE2000-U y el sistema de formación de imagen confocal D-Eclipse, equipado con láseres de 633 nm y 543 nm He/Ne y 488 nm Ar, utilizando una lente de objetivo Plan Fluor 10x/0.30 y filtro de contraste de fase DIC (Nikon Instruments).

Ejemplo 24

Análisis Estadístico

La significancia estadística de los conjuntos de datos experimentales fue determinada utilizando pruebas t de Student no pareadas de dos colas (alfa =0.05) y valores dePcalculados utilizando la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk y el software Graphpad Prism 7.03. Los valores dePfueron definidos como: 0.1234 (ns), 0.0332 (*), 0.0021 (**), 0.0002 (***), <0.0001 (****). A menos que se indique de otro modo, las barras de error representan la SEM de por lo menos tres experimentos independientes.

Ejemplo 25

Tratamiento de Infección por Deltaretrovirus en un Sujeto

Infecciones por Deltaretrovirus ejemplares incluyen HTLV-1.

Método A. Terapia de Composición Antiviral

Un sujeto que presenta infección por HTLV-1 es prescrito con la composición antiviral, y se administran dosis terapéuticamente relevantes al sujeto de acuerdo con un régimen de dosificación prescrito por un periodo de tiempo. El nivel de respuesta terapéutica del sujeto se determinó periódicamente. El nivel de respuesta terapéutica puede ser determinado por la determinación de la titulación del virus HTLV-1 en la sangre o plasma del sujeto. Si el nivel de respuesta terapéutica es demasiado bajo a una dosis, entonces la dosis es escalada de acuerdo con un programa de escalamiento de dosis predeterminado hasta que se alcanza el nivel de respuesta terapéutica en el sujeto. El tratamiento del sujeto con la composición antiviral se continúa según sea necesario y la dosis o régimen de dosificación puede ser ajustado según sea necesario hasta que el paciente alcanza el punto final clínico deseado.

Método B. Terapia de Combinación: composición antiviral con otro agente

Se siguió el Método A, anterior, excepto que el sujeto se prescribe y administra con uno o más de otros agentes terapéuticos para el tratamiento de la infección por HTLV-1 o síntomas de la misma. Luego uno o más de otros agentes terapéuticos se pueden administrar antes, después o con la composición antiviral. También se puede hacer el escalamiento de dosis (o desescalamiento) del uno o más de otros agentes terapéuticos. Otros agentes terapéuticos ejemplares se describen en la presente.

Ejemplo 26

Tratamiento de Infección por CoV en un Sujeto

Infecciones por CoV ejemplares incluyen SARS-CoV, MERS-CoV, COVID-19 (SARS-CoV-2), CoV 229E, CoV NL63, CoV OC43, CoV HKU1, y CoV HKU20.

Método A. Terapia de Composición Antiviral

Un sujeto que presenta infección por CoV es prescrito con la composición antiviral, y se administran dosis terapéuticamente relevantes al sujeto de acuerdo con un régimen de dosificación prescrito por un periodo de tiempo. El nivel de respuesta terapéutica del sujeto se determinó periódicamente. El nivel de respuesta terapéutica puede ser determinado por la determinación de la titulación del virus de CoV en la sangre o plasma del sujeto. Si el nivel de respuesta terapéutica es demasiado bajo a una dosis, entonces la dosis es escalada de acuerdo con un programa de escalamiento de dosis predeterminado hasta que se alcanza el nivel de respuesta terapéutica en el sujeto. El tratamiento del sujeto con la composición antiviral se continúa según sea necesario y la dosis o régimen de dosificación puede ser ajustado según sea necesario hasta que el paciente alcanza el punto final clínico deseado.

Método B. Terapia de Combinación: composición antiviral con otro agente

Se siguió el Método A, anterior, excepto que el sujeto se prescribe y administra con uno o más de otros agentes terapéuticos para el tratamiento de la infección por CoV o síntomas de la misma. Luego uno o más de otros agentes terapéuticos se pueden administrar antes, después o con la composición antiviral. También se puede hacer el escalamiento de dosis (o desescalamiento) del uno o más de otros agentes terapéuticos. Otros agentes terapéuticos ejemplares se describen en la presente.

Ejemplo 27

Tratamiento de Infección por COVID-19 en un Sujeto Utilizando ANVIRZEL™

Un niño (infante) que presenta COVID-19 fue administrado con ANVIRZEL™ como sigue para tratar los síntomas asociados con COVID-19. La infección viral del sujeto estaba empeorando antes de la administración de ANVIRZEL™. El sujeto fue prescrito y administrado con ANVIRZEL™ de acuerdo con el siguiente régimen de dosificación: dosis inicial 0.25 mL de ANVIRZEL™ reconstituido, luego 0.5 mL de ANVIRZEL™ reconstituido cada doce horas por un periodo de dos a tres días. Se resolvió la infección por COVID-19 en el sujeto, y no se observó toxicidad relacionada con el fármaco. Ejemplo 28

Evaluaciónin vitrode Oleandrina Contra el Virus COVID-19

El propósito de este estudio fue determinar el impacto de la oleandrina en la infectividad de viriones de progenie.

Se preparó una solución de reserva de oleandrina en metanol (10 mg de oleandrina/mL). Se utilizó la solución de reserva para preparar medio de incubación que contiene DMSO (0.1% o 0.01% v/v en medio de cultivo acuoso RPMI 1640 y oleandrina (20 pg/mL, 10 pg/mL,1.0 pg/mL, o 0.1 pg/mL). Las soluciones de incubación son como sigue.

Células Vero sin infectar (conteo celular inicial diana 1x106) en cultivo fueron incubadas en cada uno de los medios de incubación indicados en frascos por 30 min a 37°C. Un inoculado viral de SARS-CoV-2 luego fue agregado a cada frasco para alcanzar una titulación viral inicial diana (cerca de PFU/mL 1x104). El MOI diana (multiplicidad de infección) de cerca de 0.1. Las soluciones fueron incubadas por un adicional de 2 h a 37°C para alcanzar la infección de las células Vero. Las células Vero infectadas luego fueron lavadas con vehículo de control para remover el virus extracelular y la oleandrina. Se agregaron alícuotas nuevas de cada medio de incubación a cada frasco respectivo de células Vero infectadas. Esas que recibieron oleandrina en la segunda alícuota fueron denotadas como “+ tratamiento Post-infección”, y esas que no recibieron oleandrina en la segunda alícuota fueron denotadas como “- tratamiento Post-infección” (Figuras 23A a 23D). La titulación viral para cada frasco fue determinada a cerca de las 24 h y cerca de las 48 h después de la infección.

Como un medio de determinación de la toxicidad potencial de oleandrina contra las células Vero, se prepararon cultivos paralelos, basados en los anteriores, para las células Vero sin infectar.

Los datos adquiridos incluyeron cantidad del virus producido, infectividad del virus de progenie, y la seguridad relativa (nontoxicidad) de oleandrina en las células infectadas y sin infectar.

Ejemplo 29

Evaluaciónin Vitrode Oleandrina Contra el Virus COVID-19

El propósito de este ensayo fue determinar la actividad antiviral directa de oleandrina contra SARS-CoV-2.

Se removió el medio de crecimiento de monocapas confluentes de aproximadamente 106 células Vero CCL81 en placas de 6 pocillos. La oleandrina fue diluida serialmente en medio de cultivo y se agregaron células Vero-E6 sembradas en placas de 96 pocillos. El medio de crecimiento fue reemplazado con 200pl de medio de mantenimiento que contiene ya sea 1.0 pg/ml, 0.5pg/ml, 100ng/ml, 50ng/ml, 10ng/ml, o 5ng/ml de oleandrina, o controles coincidentes solo de DMSO. Las placas fueron incubadas a 37°C por cerca de 30 minutos antes de la adición del virus.

El virus de SARS-CoV-2 fue agregado a las células tratadas con Oleandrina y a las células sin tratar a un MOI (multiplicidad de infección) de 0.4 (ensayo de entrada) o 0.02 (ensayo de replicación). La oleandrina permaneció en los pocillos durante una 1hr de incubación a 37°C.

Después de 1hr de absorción, se removió el medio de inoculación y se lavó 1 vez con PBS (salina regulada con fosfato estándar).

Se agregó medio solo (sin oleandrina) de vuelta a los pocillos tratados con oleandrina designados como “Pretratamiento” en los portaobjetos de datos. Los medios con las concentraciones indicadas de oleandrina se agregaron de vuelta a los pocillos designados como “Duración” en los portaobjetos de datos.

Las placas fueron fijadas ya sea a las 24 (ensayo de entrada) o 48 (ensayo de replicación) horas post-infección y se inmunotiñeron con anticuerpo específico del virus y anticuerpo secundario marcado fluorescentemente.

Se formaron imágenes de las células utilizando una Operetta y los datos fueron analizados utilizando algoritmos personalizados en software Harmonia para determinar el por ciento de células infectadas en cada pocillo.

Los resultados se representan en las Figuras 24A y 24B.

Ejemplo 30

Evaluaciónin Vitrode Toxicidad de Oleandrina Contra élulas Vero-E6

El propósito de este ensayo fue determinar la toxicidad potencial relativa de oleandrina contra células Vero-E6.

La oleandrina fue diluida serialmente en medio de cultivo se agregó a células Vero-E6 sembradas en placas de 96 pocillos y se incubaron a 37°C por cerca de 24 h. El conteo de células se obtuvo utilizando el ensayo CellTiter Glo. Los resultados se representan en la Figura 25.

Ejemplo 31

Evaluaciónin Vitrode Oleandrina Contra el Virus COVID-19

El propósito de este estudio fue determinar una respuesta a dosis del virus de COVID-19 hacia el tratamiento con oleandrina.

El procedimiento del Ejemplo 28 fue repetido excepto que se utilizaron menores concentraciones de oleandrina: 1 pg/mL, 0.5 pg/mL, 0.1 pg/mL, 0.05 pg/mL, 0.01 pg/mL, y 0.005 pg/mL. Además, se utilizaron células VERO CCL-81 en vez de células Vero E6.

La titulación viral fue determinada de acuerdo con el Ejemplo 28, y las veces en la reducción en la titulación viral fue calculada por comparación con las muestras de control. Los resultados se representan en las Figuras 26A-26D, 27A-27D, y 28A y 28B.

Ejemplo 32

Forma de dosificación líquida sublingual

Una forma de dosificación sublingual que comprende oleandrina fue elaborada al mezclar oleandrina o la composición que contiene oleandrina (por ejemplo que contiene extracto de oleandrina; 2 % en peso) con triglicérido de cadena media (95 % en peso) y agente saborizante (3 % en peso). El contenido de oleandrina en la forma de dosificación fue cerca de 25 pg/mL.

Ejemplo 33

Preparación de Extracto en Fluido Subcrítico deNerium Oleander

Un procedimiento mejorado para la preparación de un extracto que contiene oleandrina fue desarrollado al emplear extracción en líquido subcrítico en lugar de extracción en fluido supercrítico de biomasa deNerium oleander.

Se colocó biomasa seca y en polvo en una cámara de extracción, que luego fue sellada. Se inyectaron dióxido de carbono (cerca de 95% en peso) y alcohol (cerca de 5% en peso; metanol o etanol) en la cámara. La temperatura y presión interior de la cámara fueron tales que el medio de extracción fue mantenido en la fase líquido subcrítica, más que en la fase de fluido supercrítico, por la mayor parte o sustancialmente todo el periodo de tiempo de extracción: temperatura en el intervalo de cerca de 2°C a cerca de 16°C (cerca de 7°C a cerca de 8°C), y presión en el intervalo de cerca de 11500 KPa (115 bar) a cerca de 13500 KPa (135 bar) (cerca de 12400 KPa (124 bar)). El periodo de extracción fue cerca de 4 h a cerca de 12 h (cerca de 6 a cerca de 10 h). El entorno de extracción luego fue filtrado y se recolectó el sobrenadante. El dióxido de carbono fue ventilado del sobrenadante, y el extracto crudo resultante fue diluido en etanol (cerca de 9 partes de etanol : cerca de 1 parte de extracto) y congelado a cerca de -50°C por lo menos por 12 h. La solución fue descongelada y filtrada (filtro de 100 micras de tamaño de poro). El filtrado fue concentrado a cerca de 10% de su volumen original y luego filtrado estéril (filtro de 0.2 micras de tamaño de poro). El extracto concentrado luego fue diluido con etanol acuoso al 50% a una concentración de cerca de 1.5 mg de extracto por mL de solución.

El extracto de líquido subcrítico resultante (SbCL) comprendió oleandrina y uno o más de otros compuestos extraíbles deNerium oleander, dicho uno o más otros compuestos son como se define en la presente.

Ejemplo 34

Evaluaciónin Vitrode Oleandrina Contra el Virus COVID-19

El propósito de este estudio fue determinar el impacto de la oleandrina en la infectividad de los viriones de progenie sin pretratamiento de oleandrina (como en el Ejemplo 28).

Se repitió el procedimiento del Ejemplo 28 excepto que las células no fueron pre-tratadas con oleandrina antes de la infección. En cambio, las células infectadas fueron tratadas con oleandrina o vehículo de control a las 12 h y 24 h post infección. Así mismo, se utilizaron células VERO CCL-81 en vez de células Vero E6, y se utilizaron menores concentraciones de oleandrina: 1 pg/mL, 0.5 pg/mL, 0.1 pg/mL, y 0.05 pg/mL. Los datos se representan en las Figuras 29A y 29B.

Ejemplo 35

Evaluaciónin Vivode Oleandrina Contra el Virus de COVID-19

El propósito de este estudio fue determinar la eficacia de extracto que contiene oleandrina (OCE) en el tratamiento de sujetos ya infectados con el virus de COVID-19.

Los sujetos que representan una amplia distribución demográfica y que presentan infección por COVID-19 fueron evaluados para determinar el estado clínico antes de la administración sublingual, bucal o peroral de OCE, preparado de acuerdo con la forma de dosificación del Ejemplo 32. La composición fue administrada de manera segura al sujeto al colocar gotas de líquido en la boca del sujeto. El régimen de dosificación fue aproximadamente 0.5 mL por dosis y cuatro dosis por día (una dosis cerca de cada seis horas), que aproxima cerca de 50 pg de oleandrina por día. Alternativamente, se administró la mitad de la dosis total diaria. Todos los sujetos experimentaron una recuperación completa.

Ejemplo 36

Preparación de extracto etanólico deNerium oleander

El propósito de este fue preparar un extracto etanólico por extracción de biomasa deNerium oleandercon etanol acuoso.

Hojas secas molidas se trataron repetidamente con etanol acuoso (90% v/v de etanol; 10% v/v de agua). Los sobrenadantes etanólicos combinados fueron combinados y filtrados y luego concentrados por evaporaciónin vacuopara reducir la cantidad de etanol y agua en los mismos y proporcionar extracto etanólico crudo que comprende cerca de 25 mg de oleandrina/mL de extracto (que tiene cerca de 50% v/v de contenido de etanol).

Ejemplo 37

Preparación de una forma de dosificación que comprende una combinación de extractos deNerium oleander

El propósito de este fue preparar una forma de dosificación de acuerdo con el Ejemplo 32 excepto que una porción (1 % en peso) del extracto etanólico del Ejemplo 36 se combina con una porción (1 % en peso) del extracto de SbCL del Ejemplo 33, triglicérido de cadena media (95 % en peso), y agente saborizante (3 % en peso).

Ejemplo 38

Evaluaciónin Vivode Digoxina Contra el Virus de COVID-19

El propósito de este estudio es determinar la eficacia de la composición que contiene digoxina (DCC) en el tratamiento de sujetos ya infectados con el virus de COVID-19. Se compró una forma de dosificación que contiene digoxina disponible comercialmente.

Los sujetos que presentan infección por COVID-19 son evaluados para determinar el estado clínico antes de la administración peroral o sistémica del DCC. Las composiciones disponibles comercialmente se describen en la presente. El régimen de dosificación seguro para cada una se describe en el NDA respectivo y en los insertos del envase. La composición es administrada de manera segura a cada sujeto de acuerdo con la vía de administración destinada. Se realizó el monitoreo clínico para determinar la respuesta terapéutica y la dosis es titulada en consecuencia.

Ejemplo 39

Determinación del Genoma de la proporción de partículas infecciosas en la infección por SARS-CoV-2 tratada con oleandrina

El propósito de este estudio es determinar si la inhibición de SARS-CoV-2 por oleandrina fue al nivel total o de producción de partículas infecciosas.

Para cuantificar las copias del genoma para las muestras, 200pl de muestra se extrayeron con una proporción en volumen de 5:1 de TRIzol LS (Ambion, Carlsbad, CA), utilizando protocolos estándar de fabricación y resuspendiendo en 11 pl de agua. Los ARN extraídos fueron probados para SARS-CoV-2 por qRT-PCR siguiendo un ensayo publicado previamente (26). Brevemente, el gen N fue amplificado utilizando los siguientes cebadores y sondas: cebador delantero [5'-TAATCAGACAAGGAACTGATTA-3'] (SEQ ID NO. 1); cebador inverso [5'-CGAAGGTGTGACTTCCATG-3'] (SEQ ID NO. 2); y sonda [5'-FAM-GCAAATTGTGCAATTTGCGG-TAMRA-3'; (SEQ ID NO. 3)]. Una mezcla de reacción de 20pl fue preparada utilizando el kit One-Step iTaq Universal probes (BioRad, Hercules, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante: Una mezcla de reacción (2x: 10pL), transcriptasa inversa iScript (0.5 pL), cebadores (10pM: 1.0 pL), sonda (10pM: 0.5 pL), ARN extraído (4pL) y agua (3 pL). Se realizaron las reacciones de qRT-PCR utilizando el termociclador de Sistemas de PCR en Tiempo Real StepOnePlus™ (Applied Biosystems). Las reacciones fueron incubadas a 50°C por 5min y 95°C por 20seg seguido por 40 ciclos a 95°C por 5seg y 60°C por 30seg. Se utilizó la secuencia de ARN de control positivo (nucleótidos 26,044 - 29,883 del genoma de COViD-2019) para estimar el número de copias de ARN del gen N en las muestras bajo evaluación.

Tal como se utiliza en la presente, el término “cerca de” o “aproximadamente” significan ±10%, ±5%, ±2.5% o ±1% de un valor especificado. Como se utiliza en la presente, el término “sustancialmente” significa “a un grado grande” o “por lo menos una mayoría de” o “más de 50% de”

Lo anterior es una descripción detallada de las realizaciones particulares de la invención. Se apreciará que, aunque se han descrito realizaciones específicas de la invención en la presente para fines ilustrativos, se pueden hacer varias modificaciones sin apartarse del alcance de la invención reivindicada. En consecuencia, la invención no está limitada sino solamente por las reivindicaciones anexas. Todas las realizaciones descritas y reivindicadas en la presente pueden ser realizadas y ejecutadas sin experimentación indebida a la luz de la presente descripción.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición antiviral que comprende oleandrina para su uso en el tratamiento de infección por coronavirus COVID-19 (SARS-CoV-2), en donde una o más dosis terapéuticamente efectivas de dicha composición antiviral son administrada por día.

2. La composición antiviral para uso según la reivindicación 1, en donde el período de tratamiento es de al menos 5 días hasta uno o más meses.

3. La composición antiviral para uso según la reivindicación 1, en donde el período de tratamiento es de dos o más días por semana.

4. La composición antiviral para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la dosis total de oleandrina por día se selecciona, independientemente tras cada ocurrencia, desde 1 gg a 180 gg, 1 gg a 120 gg, 5 gg a 100 gg, 10 gg a 80 gg, 10 gg a 75 gg, 15 gg a 120 gg, 15 gg a 100 gg, 15 gg a 80 gg, 30 gg a 120 gg, 30 gg a 100 gg, 30 micro a 90 gg, 40 gg a 70 gg, 1 gg, 5 gg, 10 gg, 20 gg, 30 gg, 40 gg, 50 gg, 60 gg, 70 gg, 80 gg, 90 gg, 100 gg, 110 gg, 120 gg, 130 gg, 140 gg, 150 gg, 160 gg, 170 gg, 180 gg, 140 gg a 315 gg, 20 gg a 750 gg, 12 gg a 300 gg, 12 gg a 120 gg, 0.01 gg a 100 mg, 0.01 gg a 100 gg, 0.5 a 100 gg, 1 a 80 gg, 1.5 a 60 gg, 1.8 a 60 gg, y 1.8 a 40 gg.

5. La composición antiviral para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde una dosis comprende 0.05 0.5 mg/kg/día, 0.05-0.35 mg/kg/día, 0.05-0.22 mg/kg/día, 0.05-0.4 mg/kg/día, 0.05-0.3 mg/kg/día, 0.05-0.5 gg/kg/día, 0.05-0.35 gg/kg/día, 0.05-0.22 gg/kg/día, 0.05-0.4 gg/kg/día, o 0.05-0.3 gg/kg/día, en base a la cantidad unitaria de oleandrina por kg de peso corporal del sujeto por día.

6. La composición antiviral para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la dosis diaria de oleandrina: (a) es un máximo de 100 gg/día, 80 gg/día, 60 gg/día, 40 gg/día, 38.4 gg/día o 30 gg/día; y/o b) la dosis diaria de oleandrina es un mínimo de 0.5 gg/día, 1 gg/día, 1.5 gg/día, 1.8 gg/día, 2 gg/día, o 5 gg/día.

7. La composición antiviral para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde una dosis se administra dos veces diariamente o cada 12 horas, y la cantidad de oleandrina en dicha dosis es 0.25 a 50 gg o 0.9 a 15 gg.

8. La composición antiviral para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha una o más dosis de oleandrina por día son 2 a 10 dosis por día, 2 a 8 dosis por día, 2 a 6 dosis por día, 2 a 4 dosis por día, 2 dosis por día, 3 dosis por día, 4 dosis por día, 5 dosis por día, 6 dosis por día, 7 dosis por día, 8 dosis por día, 9 dosis por día, o 10 dosis por día.

9. La composición antiviral para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la oleandrina está presente en una composición que comprende al menos un extracto obtenido de biomasa que contiene oleandrina, preferiblemente donde dicho extracto se selecciona independientemente tras cada ocurrencia del grupo que consiste en extracto en agua caliente, extracto en disolvente, y extracto en fluido supercrítico, más preferiblemente donde dicho extracto comprende una combinación de oleandrina y uno o más compuestos extraídos de dicha biomasa, incluso más preferiblemente donde dicho uno o más compuestos comprende uno o más compuestos comprende uno o más precursores de glucósido cardíaco, uno o más constituyentes de glucona de glucósidos cardíacos, o una combinación de los mismos.

10. La composición antiviral para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde después de la administración de dicha una o más dosis, la concentración en plasma de oleandrina en dicho sujeto está en el intervalo de 0.05 a 2 ng/ml, 0.005 a 10 ng/mL, 0.005 a 8 ng/mL, 0.01 a 7 ng/mL, 0.02 a 7 ng/mL, 0.03 a 6 ng/mL, 0.04 a 5 ng/mL, o 0.05 a 2.5 ng/mL, en términos de la cantidad de oleandrina por mL de plasma.

11. La composición antiviral para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la dosificación se continúa por una o más semanas por mes, o donde la dosificación se continúa por uno o más meses por año.

12. La composición antiviral para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la administración es sistémica, parenteral, bucal, enteral, intramuscular, subdérmica, sublingual, peroral, oral, o una combinación de las mismas.

13. La composición antiviral para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicha composición antiviral es administrada inmediatamente después de la infección o en cualquier momento desde un día a 5 días después de la infección o en el momento más pronto después del diagnóstico de la infección con el virus.

14. La composición antiviral para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde dicha composición antiviral es administrada como terapia antiviral principal, terapia antiviral adjunta, o terapia co-antiviral, o en donde dicha administración comprende la administración separada o la coadministración de dicha composición con por lo menos otra composición antiviral o con por lo menos otra composición para el tratamiento de síntomas asociados con dicha infección viral.

15. La composición antiviral para uso según la reivindicación 14, en donde dicho extracto comprende oleandrina y uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en glucósido cardíaco, glucona, aglicona, esteroide, triterpeno, polisacárido, sacárido, alcaloide, grasa, proteína, neritalósido, odorósido, ácido oleanólico, ácido ursólico, ácido betulínico, oleandrigenina, oleásida A, betulina (urs-12-ene-3p,28-diol), 28-norurs-12-en-3p-ol, urs-12-en-3p-ol, ácido 3p,3p-hidroxi-

12-oleanen-28-oico, ácido 3p,20a-dihidroxiurs-21-en-28-oico, ácido 3p,27-dihidroxi-12-ursen-28-oico, ácido 3p,13pdihidroxiurs-11-en-28-oico, 3p,12a-dihidroxioleanan-28,13p-ólida, ácido 3p,27-dihidroxi-12-oleanan-28-oico, homopoligalacturonano, arabinogalaturonano, ácido clorogénico, ácido caféico, ácido L-quínico, 4-cumaroil-CoA, ácido 3-O-cafeoilquínico, ácido 5- O-cafeoilquínico, cardenólido B-1, cardenólido B-2, oleagenina, neridiginósido, nerizósido, odorósido-H, 3-beta-O-(D-diginosil)-5-beta, polisacárido péctico 14 beta-dihidroxi-card-20(22)-enólida compuesto de ácido galacturónico, ramnosa, arabinosa, xilosa, y galactosa, polisacárido con PM en el intervalo de 17000-120000 D, o PM 35000 D, 3000 D, 5500 D, o 12000 D, cardenólido monoglucósido, cardenólido N-1, cardenólido N-2, cardenólido N-3, cardenólido N-4, pregnano, 4,6-dieno- 3,12,20-triona, 20R-hidroxipregna-4,6-dieno-3,12-diona, 16beta,17beta-epoxi-12beta-hidroxipregna-4,6-dieno-3,20-diona, 12beta-hidroxipregna-4,6,16-trieno-3,20-diona (neridienona A), 20S,21-dihidroxipregna-4,6-dieno-3,12-diona (neridienona B), ácido neriucumárico, ácido isoneriucumárico, ácido oleanderoico, oleanderen, ácido 8alfa-metoxilabdan-18-oico, 12-urseno, kanerósido, neriumósido, 3p-0-(D-diginosil)-2a- hidroxi-8,14pepoxi-5p-carda-16:17, 20: 22- dienólida, 3p-0-(D-diginosil)-2a,14p- dihidroxi-5p- carda-16:17,20:22-dienólida, 3p,27-dihidroxi-urs-18-en-13,28-ólida, 3p,22a,28-trihidroxi-25-nor-lup-1(10),20(29)-dien-2-ona, c/s-karenin (ácido 3p-hidroxi-28-Z-p-cumaroiloxi-urs-12-en-27-oico), trans-karenin (ácido 3-p-hidroxi-28-E-p-cumaroiloxi-urs-12-en-27-oico), 3beta-hidroxi-5alfa-carda-14(15),20(22)-dienólida (beta-anhidroepidigitoxigenina), 3 beta-O-(D-digitalosil)-21-hidroxi-5beta-carda-8,14,16,20(22)-tetraenólida (neriumogenin-A-3beta-D-digitalósido), proceragenina, neridienona A, ácido 3beta,27-dihidroxi-12-ursen-28-oico, ácido 3beta,13beta-dihidroxiurs-11-en-28-oico, 3beta-hidroxiurs-12-en-28-aldehído, 28- orurs-12-en-3beta-ol, urs-12-en-3beta-ol, urs-12-ene-3beta,28-diol, ácido 3beta,27-dihidroxi-12-oleanen-28-oico, (20S, 24R)-epoxidamarano-3beta,25-diol, 20beta,28-epoxi-28alfa-metoxitaraxasteran-3beta-ol, 20beta,28-epoxitaraxaster-21-en-3beta-ol, 28-nor-urs-12-ene-3beta,17 beta-diol, 3beta-hidroxiurs-12-en-28-aldehído, alfa-neriursato, beta-neriursato, ácido 3alfa-acetofenoxi-urs-12-en-28-oico, ácido 3beta-acetofenoxi-urs-12-en-28-oico, ácido oleanderólico, kanerodiona, ácido 3p-p-hidroxifenoxi-11a-metoxi-12a-hidroxi-20-ursen-28-oico, 28-hidroxi-20(29)-lupen-3,7-diona, kanerocina, ácido 3alfa-hidroxi-urs-18,20-dien-28-oico, D-sarmentosa, D-diginosa, neridiginósido, nerizósido, ácido isoricinoleico, gentiobiosilnerigósido, gentiobiosilbeaumontósido, gentiobiosiloleandrina, folinerina, 12p-hidroxi-5p-carda-8,14,16,20(22)-tetraenólida, 8p-hidroxi-digitoxigenin, A16-8P- hidroxi-digitoxigenina, A16-neriagenina, uvaol, aldehído ursólico, ácido 27(p-comaroiloxi) ursólico, oleanderol, 16-anhidro-deacteil-nerigósido, ácido 9-D-hidroxi-cis-12-octadecanoico, adigósido, adinerina, alfa-amirina, beta-sitosterol, campestrol, caucho, ácido cáprico, ácido caprílico, colina, cornerina, cortenerina, desacetiloleandrina, diacetil-nerigósido, foliandrina, pseudocuramina, quercetina, quercetin-3-ramnoglucósido, quercitrina, rosaginina, rutina, ácido esteárico, estigmasterol, estrospésido, urehitoxina, y uzarigenina.