CN112689510B - 用于治疗冠状病毒感染的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

提供一种例如由冠状病毒科病毒引起的病毒感染等病毒感染的治疗方法。将至少具有夹竹桃苷的组合物用于治疗病毒感染。

Description

用于治疗冠状病毒感染的方法和组合物
通过引用并入
依照37 CFR 1.52(e)(5)，本申请包含序列表，其已经通过EFS以电子格式提交，在此通过引用并入。使用Patent-in 3.5.1和Checker 4.4.6、创建于2020年7月10日的命名为PBI22PCT9_SEQ_ST25.txt、大小1KB的电子文件中包含的序列信息通过引用其整体并入本文。
技术领域
本发明涉及抗病毒组合物以及其用于治疗哺乳动物中沙粒病毒科(Arenaviridae)感染、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)感染、黄病毒科(Flaviviridae)感染、披膜病毒科(Togaviridae)感染、副粘病毒科(Paramyxoviridae)感染、逆转录病毒科(Retroviridae)感染、冠状病毒科(Coronaviridae)感染、或丝状病毒科(Filoviridae)感染的用途。一些实施方案涉及出血性病毒感染的治疗。
背景技术
作为夹竹桃属物种(Nerium species)的成员的欧洲夹竹桃(Nerium oleander)，是一种广泛分布于亚洲亚热带、美国西南部、和地中海的观赏性植物。它的医学和毒物学特性早已被认识到。已提议其用于例如痔疮、溃疡、麻风病、蛇咬伤、癌症、肿瘤、神经学病症、疣、和细胞增殖性疾病等的治疗。Zibbu等人(J.Chem.Pharm.Res.(2010),2(6),351-358)提供夹竹桃的化学和药理活性的概述。
传统上使用沸水、冷水、超临界流体、或有机溶剂来进行来自夹竹桃属物种的植物的组分的提取。
ANVIRZELTM(Ozel的US 5,135,745)含有夹竹桃的热水提取物的浓缩形式或粉末形式。Muller等人(Pharmazie.(1991)九月，46(9),657-663)公开了关于夹竹桃的水提取物的分析的结果。他们报道，存在的多糖主要是半乳糖醛酸。其他糖类包括鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖。Newman等人(J.Herbal Pharmacotherapy,(2001)vol 1,pp.1-16)也已报道了夹竹桃的热水提取物中的多糖含量和多糖的单种糖组成。Newman等人(Anal.Chem.(2000),72(15),3547-3552)描述了热水提取物ANVIRZELTM的组成分析。Selvaraj等人的美国专利号5,869,060涉及夹竹桃属物种的提取物和生产方法。为了制备提取物，将植物材料置于水中并煮沸。然后从植物物质分离粗提取物并通过过滤灭菌。然后将所得提取物冻干来生产粉末。美国专利号6,565,897(Selvaraj等人的美国授权前公开号(U.S.Pregrant PublicationNo.)20020114852和PCT国际公开号WO 2000/016793)公开了用于制备基本上无菌的水提取物的热水提取方法。Ishikawa等人(J.Nutr.Sci.Vitaminol.(2007),53,166-173)公开了通过使用氯仿、甲醇和水的混合物的液相色谱法的夹竹桃的热水提取物或其级分。他们还报告，夹竹桃的叶的提取物已被用于治疗II型糖尿病。Panyosan的2006年8月24日公开的US20060188585公开了夹竹桃的热水提取物。Smothers的2019年6月18日授权的US10323055公开了一种用芦荟和水提取植物材料以提供含有芦荟和强心苷的提取物的方法。Rashan等人的2007年7月5日公开的US20070154573公开了夹竹桃的冷水提取物及其用途。
Erdemoglu等人(J.Ethnopharmacol.(2003)十一月，89(1),123-129)公开了基于它们的镇痛和抗炎活性，包括夹竹桃在内的植物的水和乙醇提取物的比较的结果。Fartyal等人(J.Sci.Innov.Res.(2014),3(4),426-432)公开了基于抗菌活性的夹竹桃的甲醇、水、和石油醚提取物的比较结果。
Adome等人(Afr.Health Sci.(2003)八月，3(2),77-86；乙醇提取物)、el-Shazly等人(J.Egypt Soc.Parasitol.(1996),八月，26(2),461-473；乙醇提取物)、Begum等人(Phytochemistry(1999)二月，50(3),435-438；甲醇提取物)、Zia等人(J.Ethnolpharmacol.(1995)十一月，49(1),33-39；甲醇提取物)、和Vlasenko等人(Farmatsiia.(1972)九月-十月，21(5),46-47；醇提取物)也公开了夹竹桃的有机溶剂提取物。Turkmen等人(J.Planar Chroma.(2013),26(3),279-283)公开了夹竹桃叶和茎的水性乙醇提取物。Yamauchi的1974年9月3日授权的US 3833472公开了用水、有机溶剂、或水性有机溶剂提取红花夹竹桃SOL(欧洲夹竹桃)叶子，其中将叶子加热至60°-170℃然后提取，有机溶剂是甲醇、乙醇、丙醚或氯仿。
夹竹桃属物种的超临界流体提取物是已知的(US 8394434,US 8187644,US7402325)并且已在治疗神经学病症(US 8481086,US 9220778,US 9358293,US20160243143A1,US 9877979,US 10383886)和细胞增殖性病症(US 8367363,US 9494589,US 9846156)和一些病毒感染(US 10596186,WO 2018053123A1,WO2019055119A1)中显示功效。
已知三萜具有各种治疗活性。一些已知的三萜包括齐墩果酸(oleanolic acid)、熊果酸(ursolic acid)、桦木酸(betulinic acid)、巴多索隆、山楂酸、和其他。主要单个地评价三萜的治疗活性而不是作为三萜的组合。
齐墩果酸属于以例如巴多索隆等化合物为代表的三萜化合物的一类，其已显示是先天性细胞2期排毒途径的有效激活剂，其中转录因子Nrf2的激活导致含有抗氧化剂转录应答元件(ARE)的下游抗氧化剂基因的程序中的转录增加。巴多索隆自身已在炎症条件下的临床试验中被广泛研究；然而，慢性肾脏疾病中的3期临床试验，由于可能与以提高的浓度包括巴多索隆的某些三萜化合物的已知细胞毒性有关的不良事件而被终止。
作为植物提取物，发现了组合含有三萜与其他治疗组分的组合物。Fumiko等人(Biol.Pharm.Bull(2002),25(11),1485-1487)公开了迷迭香(Rosmarimus officinalisL.)的甲醇提取物用于治疗锥虫病的评价。Addington等人(US 8481086,US 9220778,US9358293,US 20160243143 A1)公开了用于神经学病况的治疗的、含有夹竹桃苷和三萜的夹竹桃的超临界流体提取物(SCF；PBI-05204)。Addington等人(US 9011937,US 20150283191A1)公开了用于神经学病症的治疗的、含有夹竹桃苷和三萜的夹竹桃的SCF提取物的含三萜的馏分(PBI-04711)。
Figure BDA0002816516430000031
等人(Molecules(2009),14,2016-2031)公开了含有齐墩果酸、熊果酸、桦木酸和其他组分的混合物的各种植物提取物。Mishra等人(PLoS One 2016 25；11(7):e0159430.Epub 2016年7月25日)公开了含有齐墩果酸、熊果酸、桦木酸和其他组分的混合物的糙皮桦(Betula utilis)树皮的提取物。Wang等人(Molecules(2016),21,139)公开了含有齐墩果酸、熊果酸、桦木酸和其他组分的混合物的糖胶树(Alstoniascholaris)的提取物。L.e Silva等人(Molecules(2012),17,12197)公开了含有齐墩果酸、熊果酸、桦木酸和其他组分的混合物的Eriope blanchetti的提取物。Rui等人(Int.J.Mol.Sci.(2012),13,7648-7662)公开了含有齐墩果酸、熊果酸、桦木酸和其他组分的混合物的蓝桉(Eucaplyptus globulus)的提取物。Ayatollahi等人(Iran.J.Pharm.Res.(2011),10(2),287-294)公开了含有齐墩果酸、熊果酸、桦木酸和其他组分的混合物的Euphorbia microsciadia的提取物。Wu等人(Molecules(2011),16,1-15)公开了含有齐墩果酸、熊果酸、桦木酸和其他组分的混合物的女贞属物种(Ligustrum species)的提取物。Lee等人(Biol.Pharm.Bull(2010),33(2),330)公开了含有齐墩果酸、熊果酸、桦木酸和其他组分的混合物的金钟花(Forsythia viridissima)的提取物。
齐墩果酸(O或OA)、熊果酸(U或UA)和桦木酸(B或BA)是在PBI-05204(PBI-23；夹竹桃的超临界流体提取物)和PBI-04711(PBI-05204的含三萜级分0-4)中发现的三种主要的三萜组分。通过比较三萜在相似浓度下在脑片糖氧剥夺(OGD)模型试验中的神经保护活性，我们(发明人中的两名)先前报道了(Van Kanegan等人,在Nature Scientific Reports(2016年5月),6:25626.doi:10.1038/srep25626中)三萜对功效的贡献。我们发现PBI-05204(PBI)和PBI-04711(级分0-4)提供神经保护活性。
已知夹竹桃属物种的提取物含有许多不同种类的化合物：强心苷、糖基、类固醇、三萜、多糖及其他。具体化合物包括夹竹桃苷；夹竹桃它罗苷；奥多诺甙；齐墩果酸；熊果酸；桦木酸；夹竹桃甙元；夹竹桃苷A；桦木醇(乌索-12-烯-3β,28-二醇)(urs-12-ene-3β,28-diol)；28-去甲乌索-12-烯-3β-醇(28-norurs-12-en-3β-ol)；乌索-12-烯-3β-醇；3β,3β-羟基-12-齐墩果烯-28-酸(3β,3β-hydroxy-12-oleanen-28-oic acid)；3β,20α-二羟基乌索-21-烯-28-酸(3β,20α-dihydroxyurs-21-en-28-oic acid)；3β,27-二羟基-12-乌索烯-28-酸(3β,27-dihydroxy-12-ursen-28-oic acid)；3β,13β-二羟基乌索-11-烯-28-酸(3β,13β-dihydroxyurs-11-en-28-oic acid)；3β,12α-二羟基齐墩果烷-28,13β-内酯(3β,12α-dihydroxyoleanan-28,13β-olide)；3β,27-二羟基-12-齐墩果-28-酸(3β,27-dihydroxy-12-oleanan-28-oic acid)；和其他组分。
病毒性出血热(VHF)可由5种不同的病毒科导致：沙粒病毒科、布尼亚病毒科、丝状病毒科、黄病毒科、和副粘病毒科。例如埃博拉病毒(EBOV)和马尔堡病毒(MARV)等丝状病毒是已知对人类最致病性病毒并且是死亡率高达90％的病毒性出血热爆发的病原体。各病毒体含有一个分子的单链负义RNA。除了支持性护理或对症治疗外，没有可用于治疗EBOV(埃博拉病毒)和MARV(马尔堡病毒)感染(即丝状病毒感染)的市售治疗有效药和预防药。已识别埃博拉病毒的5个种：塔伊森林型(
Figure BDA0002816516430000051
Forest)(原名为象牙海岸型，Ivory Coast)、苏丹型(Sudan)、扎伊尔型(Zaire)、雷斯顿型(Reston)和本迪布焦型(Bundibugyo)。
负义单链包膜RNA病毒((-)-(ss)-envRNAV)包括沙粒病毒科、布尼亚病毒科(布尼亚病毒目)、丝状病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、和弹状病毒科中的病毒。负义病毒RNA与mRNA互补，并且在翻译前必须通过RNA聚合酶转化为正义RNA；因此，负义病毒的纯化RNA本身不是传染性的，因为需要将其转换为正义RNA来复制。来自沙粒病毒科的示例性病毒和感染包括拉沙病毒、无菌性脑膜炎、瓜纳瑞托病毒(Guanarito virus)、胡宁病毒(Juninvirus)、卢约病毒(Lujo virus)、马秋波病毒(Machupo virus)、萨比亚病毒(Sabia virus)和白水河病毒(Whitewater Arroyo virus)。来自布尼亚病毒科的示例性病毒和感染包括汉坦病毒、克里米亚-刚果出血热正内罗病毒。副粘病毒科的示例性病毒和感染包括腮腺炎病毒、尼帕病毒(Nipah virus)、亨德拉病毒(Hendra virus)、呼吸道合胞病毒(RSV)、人副流感病毒(HPIV)、和NDV。来自正粘病毒科的示例性病毒和感染包括流感病毒(A至C)、鲑传贫病毒(Isavirus)、托高土病毒(Thogotovirus)、夸兰扎病毒(Quaranjavirus)、H1N1、H2N2、H3N2、H1N2、西班牙流感、亚洲流感、香港流感、俄罗斯流感。弹状病毒科的示例性病毒和感染包括狂犬病病毒、水疱病毒、丽沙病毒属、胞内水稻黄矮炮弹病毒。
黄病毒是正义、单链、包膜的RNA病毒((+)-(ss)-envRNAV)。它们被发现于节肢动物中，主要为蜱和蚊子，并且在全世界引起广泛的发病率和死亡率。一些蚊子-传播的病毒包括黄热病、登革热、日本脑炎、西尼罗病毒、和寨卡病毒。一些蜱-传播的病毒感染包括蜱媒脑炎、科萨努尔森林病、Alkhurma症、鄂木斯克出血热。尽管不是出血性感染，但波瓦生病毒(Powassan virus)是黄病毒。(+)-(ss)-envRNAV包括冠状病毒科(人和动物病原体)、黄病毒科(人和动物病原体)、披膜病毒科(人和动物病原体)、和动脉炎病毒科(Arterviridaefamily)(动物病原体)。
冠状病毒(CoV)是冠状病毒科的通用名称。在人类中，CoV引起呼吸道感染，其通常是温和的，但可在诸如SARS(严重急性呼吸系统综合征)-CoV、MERS(中东呼吸系统综合征)-CoV、和COVID-19等稀有形式中是致命的。CoV具有螺旋对称的核衣壳，并且基因组大小范围为约26至约32千碱基。其他示例性人CoV包括CoV 229E、CoV NL63、CoV OC43、CoV HKU1、和CoV HKU20。CoV的包膜携带三种糖蛋白：S-刺突蛋白：受体结合、细胞融合、主要抗原；E包膜蛋白：小、包膜相关蛋白；和M膜蛋白：跨膜-萌芽和包膜形成。在少数CoV类型中，存在第四种糖蛋白：HE-血凝素酯酶。基因组具有5'甲基化帽和3'poly-A，并作为mRNA直接发挥功能。CoV通过细胞内吞和膜融合进入人细胞；并在细胞的细胞质中进行复制。CoV通过呼吸系统分泌物的气溶胶、通过粪口途径、和通过机械传播来传播。大多数病毒在上皮细胞生长。偶尔可感染肝、肾、心脏或眼睛、以及其他细胞类型诸如巨噬细胞。在感冒型呼吸道感染中，生长似乎局限于上呼吸道上皮。冠状病毒感染非常普遍并在世界范围内发生。感染率为强季节性的，儿童在冬季的感染率最高。成人感染较少见。冠状病毒血清型的数目以及抗原变异程度是未知的。一生中可能出现再次感染，暗示存在多种血清型(已知至少四种)和/或抗原变异，因此，用单一疫苗针对所有血清型进行免疫的可能性极低。SARS是一种病毒肺炎，症状包括发热、干咳、呼吸困难(呼吸急促)、头痛、和低氧血症(低血氧浓度)。典型的实验室结果包括淋巴细胞减少症(淋巴细胞数量减少)和氨基转移酶水平轻度升高(表明肝损伤)。由肺泡损伤引起的进行性呼吸衰竭可以导致死亡。SARS的典型临床进程包括在感染的第一周症状改善，然后在第二周恶化。仍然大量需要针对人CoV有效的抗病毒治疗(组合物和方法)。
夹竹桃苷、和欧洲夹竹桃的提取物已显示防止HIV-1的gp120包膜糖蛋白混入成熟病毒颗粒并在体外抑制病毒感染性(Singh等人,“Nerium oleander derived cardiacglycoside oleandrin is a novel inhibitor of HIV infectivity”in Fitoterapia(2013)84,32-39)。
夹竹桃苷已显示抗-HIV活性，但未针对许多病毒进行评价。三萜齐墩果酸、桦木酸和熊果酸已报道表现不同水平的抗病毒活性，但未针对许多病毒进行评价。桦木酸已显示针对HSV-1 1C株、甲型流感H7N1、ECHO 6、和HIV-1的一些抗病毒活性。齐墩果酸已显示针对HIV-1、HEP C、和HCV H株NS5B的一些抗病毒活性。熊果酸已显示针对HIV-1、HEP C、HCV H株NS5B、HSV-1、HSV-2、ADV-3、ADV-8、ADV-11、HEP B、ENTV CVB1和ENTV EV71的一些抗病毒活性。就针对特定病毒的功效而言，夹竹桃苷、齐墩果酸、熊果酸和桦木酸的抗病毒活性是不可预测的。存在夹竹桃苷、齐墩果酸、熊果酸和/或桦木酸对其几乎没有抗病毒活性的病毒，意味着无法先验地预测夹竹桃苷、齐墩果酸、熊果酸和/或桦木酸是否会对特定病毒属表现抗病毒活性。
Barrows等人(“A screen of FDA-approved drugs for inhibitors ofZikavirus infection”in Cell Host Microbe(2016),20,259–270)报道了地高辛针对寨卡病毒显示抗病毒活性，但剂量太高且可能有毒。Cheung等人(“Antiviral activity oflanatoside C against dengue virus infection”in Antiviral Res.(2014)111,93–99)报道了毛花苷C对登革热病毒显示抗病毒活性。
人嗜T淋巴细胞病毒1型(HTLV-1)是一种逆转录病毒，属于逆转录病毒科和δ逆转录病毒属。它具有正义RNA基因组，可被反转录为DNA，然后整合至细胞DNA中。一旦整合，HTLV-1仅以可以通过病毒突触在细胞之间传播的前病毒形式继续存在。如果有的话，很少产生游离病毒体，尽管病毒存在于生殖器分泌物中，但血浆中通常没有可检测到的病毒。HTLV-1主要感染CD4+T淋巴细胞，并导致成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)–一种罕见但具侵袭性的血液系统恶性肿瘤，除某些自身免疫/炎性病况外，还具有高治疗抗性率和通常差的临床结果，包括传染性皮炎、类风湿性关节炎、葡萄膜炎、角膜结膜炎、干燥综合征、修格连氏症候群(
Figure BDA0002816516430000081
syndrome)、和HAM/TSP等。HAM/TSP的临床特征是慢性进行性痉挛性轻瘫、尿失禁和轻度感觉障碍。尽管ATLL在病因上与病毒潜伏期、致癌性转化和HTLV-1感染细胞的克隆扩增有关，但例如HTLV-1相关的脊髓病/热带痉挛性轻瘫(HAM/TSP)等炎性疾病是由自身免疫引起的和/或对前病毒复制和病毒抗原表达的免疫病理学响应引起的。HAM/TSP是一种进行性神经炎性疾病，其导致下部脊髓的退化和脱髓鞘。HTLV-1感染的循环T细胞侵袭中枢神经系统(CNS)，并引起针对病毒和可能的CNS成分的免疫病原学响应。神经损伤和随后的变性可导致HAM/TSP患者严重残疾。前病毒复制的持久性和HTLV-1感染的细胞在CNS中的增殖导致针对病毒抗原的细胞毒性T细胞响应，这可能是神经组织自身免疫破坏的原因。
尽管已证明强心苷针对少数病毒表现一些抗病毒活性，特定化合物针对不同病毒表现非常不同水平的抗病毒活性，意味着当针对相同病毒(一种或多种)进行评价时，一些表现非常差的抗病毒活性，一些表现较好的抗病毒活性。
仍需要改进针对特定病毒感染具有治疗活性的，含有夹竹桃苷、齐墩果酸、熊果酸、桦木酸或其任何组合的药物组合物。
发明内容
本发明提供了用于治疗和/或预防哺乳类受试者中的病毒感染的药物组合物和方法。本发明还提供了用于治疗哺乳类受试者中的例如病毒性出血热(VHF)感染等病毒感染的药物组合物和方法。本发明还提供了通过施用所述药物组合物治疗哺乳动物中病毒感染的方法。本发明人已成功制备抗病毒组合物，其表现足够的抗病毒活性来证明其在治疗人类和动物中病毒感染的用途。本发明人已开发采用特定给药方案的相应治疗方法。本发明还提供了处置具有染上病毒感染的风险的受试者的预防方法，该方法包括在受试者染上病毒感染之前，在延长的处置期间内以重复方式向受试者长期施用一个或多个剂量的抗病毒组合物，从而防止受试者染上病毒感染；其中所述抗病毒组合物包含夹竹桃苷。
在一些实施方案中，抗病毒组合物施用于具有病毒感染细胞的受试者，其中细胞显示Na,K-ATP酶的α-3对α-1亚型的升高的比例。
在一些实施方案中，病毒感染由任何以下病毒科导致：沙粒病毒科、动脉炎病毒、布尼亚病毒科、丝状病毒科、黄病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、弹状病毒科、逆转录病毒科(特别是δ逆转录病毒属)、冠状病毒科、或披膜病毒科。在一些实施方案中，病毒感染是由(+)-ss-envRNAV或(-)-ss-envRNAV引起的。
本发明的一些实施方案涉及治疗丝状病毒感染、黄病毒感染、亨尼病毒感染、甲病毒感染、或披膜病毒感染的组合物和方法。可以治疗的病毒感染至少包括埃博拉病毒、马尔堡病毒、甲病毒、黄病毒、黄热病、登革热、日本脑炎、西尼罗病毒、寨卡病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎(脑炎)(VEE)病毒、基孔肯雅病毒、西部马脊髓炎(脑炎)(WEE)病毒、东部马脑脊髓炎(脑炎)(EEE)病毒、蜱媒脑炎、科萨努尔森林病、Alkhurma症、鄂木斯克出血热、亨德拉病毒、尼帕病毒、δ逆转录病毒属、HTLV-1病毒、及其种。
本发明的一些实施方案涉及用于治疗来自以下病毒的病毒感染的组合物和方法：沙粒病毒科、动脉炎病毒科、布尼亚病毒科、丝状病毒科、黄病毒科(黄病毒属)、正粘病毒科、副粘病毒科、弹状病毒科、逆转录病毒科(δ逆转录病毒属)、冠状病毒科、(+)-ss-envRNAV、(-)-ss-envRNAV、或披膜病毒科。
本发明的一些实施方案涉及用于治疗来自亨尼病毒属、埃博拉病毒属、黄病毒属、马尔堡病毒属、δ逆转录病毒属、冠状病毒属(CoV)、或甲病毒属的病毒的病毒感染的组合物和方法。
在一些实施方案中，(+)-ss-envRNAV是选自由以下组成的组的病毒：冠状病毒科、黄病毒科、披膜病毒科、和动脉炎病毒科。
在一些实施方案中，(+)-ss-envRNAV是对人有致病性的冠状病毒。在一些实施方案中，冠状病毒刺突蛋白结合至人组织中的ACE2(血管紧张素转化酶2)受体。在一些实施方案中，冠状病毒选自由以下组成的组：SARS-CoV、MERS-CoV、COVID-19(SARS-CoV-2)、CoV229E、CoV NL63、CoV OC43、CoV HKU1、和CoV HKU20。
在一些实施方案中，(+)-ss-envRNAV是选自由以下组成的组的病毒：黄病毒、黄热病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、西尼罗病毒、寨卡病毒、蜱媒脑炎病毒、科萨努尔森林病病毒、Alkhurma症病毒、鄂木斯克出血热病毒、和波瓦生病毒。
在一些实施方案中，(+)-ss-envRNAV是选自由以下组成的组的披膜病毒科病毒：虫媒病毒(arborvirus)、东部马脑脊髓炎病毒(EEEV)、西部马脑脊髓炎病毒(WEEV)、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(VEEV)、基孔肯雅病毒(CHIKV)、阿尼昂尼昂病毒(ONNV)、Pogosta病病毒、辛德毕斯病毒、罗斯河热病毒(RRV)和塞姆利基森林病毒。
在一些实施方案中，(-)-ss-envRNAV是选自由以下组成的组的病毒：沙粒病毒科、布尼亚病毒科(布尼亚病毒目)、丝状病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、或弹状病毒科。
在一些实施方案中，沙粒病毒科病毒选自由以下组成的组：拉沙病毒、无菌性脑膜炎、瓜纳瑞托病毒、胡宁病毒、卢约病毒、马秋波病毒、萨比亚病毒和白水河病毒。
在一些实施方案中，布尼亚病毒科病毒选自由以下组成的组：汉坦病毒、克里米亚-刚果出血热正内罗病毒。
在一些实施方案中，副粘病毒科病毒选自由以下组成的组：腮腺炎病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒(HPIV)、和新城疫病毒(NDV)。
在一些实施方案中，正粘病毒科病毒选自由以下组成的组：流感病毒(A至C)、鲑传贫病毒、托高土病毒、夸兰扎病毒、H1N1病毒、H2N2病毒、H3N2病毒、H1N2病毒、西班牙流感病毒、亚洲流感病毒、香港流感病毒、和俄罗斯流感病毒。
在一些实施方案中，弹状病毒科病毒选自由以下组成的组：狂犬病病毒、水疱病毒、丽沙病毒属、和胞内水稻黄矮炮弹病毒属。
本发明还提供了用于HTLV-1相关病况或神经炎性疾病的治疗的实施方案。在一些实施方案中，HTLV-1相关病况或神经炎性疾病选自由以下组成的组：脊髓病/热带痉挛性轻瘫(HAM/TSP)、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、自身免疫性疾病、炎性疾病、感染性皮炎、类风湿性关节炎、葡萄膜炎、角膜结膜炎、干燥综合征、修格连氏症候群、和粪类圆线虫。
本发明还提供抑制释放至处理的细胞的培养上清液中的HTLV-1颗粒的感染性以及通过抑制病毒突触的Env依赖性形成来降低HTLV-1的细胞间传播的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的抗病毒组合物。
在一些实施方案中，本发明提供了含有以下(实质上由以下组成)的抗病毒组合物：a)特定强心苷(一种或多种)；b)多种三萜；或c)特定强心苷(一种或多种)和多种三萜的组合。
本发明的一方面提供了通过向受试者长期施用抗病毒组合物来治疗受试者中病毒感染的方法。通过向受试者长期施用治疗有效量(治疗相关剂量)的组合物来治疗受试者，从而提供与病毒感染相关的症状的减轻或病毒感染的改善。可在感染后立即开始、或在感染后1天至5天内的任何时间开始、或在病毒感染的明确诊断后的最早时间开始向受试者施用组合物。病毒可以是本文所述的任何病毒
因此，本发明还提供了治疗哺乳动物中病毒感染的方法，所述方法包括向哺乳动物施用一个或多个治疗有效剂量的抗病毒组合物。一个或多个剂量基于每天、每周或每月施用。每天可施用一个或多个剂量。病毒可以是本文所述的任何病毒。
本发明还提供了在有需要的受试者中治疗病毒感染的方法，所述方法包括：
确定受试者是否具有病毒感染；
指示抗病毒组合物的施用；
根据规定的初始给药方案向受试者施用初始剂量的抗病毒组合物一段时间；
定期确定受试者对于用抗病毒组合物治疗的临床反应和/或治疗反应的适当性；和
如果受试者的临床反应和/或治疗反应是适当的，则按需继续用抗病毒组合物治疗直至达到期望的临床终点；或
如果受试者在初始剂量和初始给药方案下的临床反应和/或治疗反应是不适当的，则递增或递减剂量直至在受试者中达到期望的临床反应和/或治疗反应。
按需继续对受试者进行用抗病毒组合物治疗。可按需调整剂量或给药方案直至患者达到期望的临床终点(一个或多个)，例如减少或缓和与病毒感染相关的特定症状。可通过熟悉病毒感染的临床医生来进行临床反应和/或治疗反应的适当性的确定。
本发明的方法的各个步骤可在分开的设施或同一设施内进行。
本发明为本文所述的所有实施方案提供代替的实施方案，其中用地高辛代替夹竹桃苷，或将夹竹桃苷与地高辛组合使用。本发明的方法可采用夹竹桃苷、地高辛、或夹竹桃苷与地高辛的组合。因此，夹竹桃苷、地高辛、含有夹竹桃苷的组合物、含有地高辛的组合物、或含有夹竹桃苷和地高辛的组合物可用于本发明的方法。强心苷可以被认为是夹竹桃苷、地高辛或其组合。含有强心苷的组合物包含夹竹桃苷、地高辛或其组合。
本发明还提供了治疗冠状病毒感染，特别是对人有致病性的冠状病毒的感(例如SARS-CoV-2感染的方法，所述方法包括向患有所述感染的受试者长期施用治疗有效剂量的强心苷(含有强心苷的组合物)。
本发明还提供了治疗冠状病毒感染，特别是对人有致病性的冠状病毒的感染例如SARS-CoV-2感染的双途径方法，所述方法包括向患有所述感染的受试者长期施用治疗有效剂量的强心苷(含有强心苷的组合物)，从而抑制所述冠状病毒的病毒复制并降低所述冠状病毒的后代病毒的感染性。
本发明还提供了治疗冠状病毒感染，特别是SARS-CoV-2感染的方法，所述方法通过向患有所述感染的受试者重复施用(通过任何本文所讨论的施用方式)多个治疗有效剂量的强心苷(含有强心苷的组合物)。可在每周的一天或多天和任选地每月一周或多周和任选地每年一个月或多个月内，每天施用一个或多个剂量。
本发明还提供了治疗人冠状病毒感染的方法，该方法包括在2天至约2个月的治疗期内每天向受试者施用1-10个剂量的强心苷(含有强心苷的组合物)。在治疗期内，每天可以施用2至8、2至6、或4个剂量。剂量可以施用2天至约60天、2天至约45天、2天至约30天、2天至约21天、或2天至约14天。所述施用可以通过本文讨论的任何施用方式进行。优选在所述受试者中提供治疗有效的血浆水平的夹竹桃苷和/或地高辛的全身施用。
在一些实施方案中，每天施用一个或多个剂量的夹竹桃苷，施用多天直到治愈病毒感染。在一些实施方案中，每天施用一个或多个剂量的强心苷(含有强心苷的组合物)，施用多天和多周直到治愈病毒感染。在一天内可以施用一个或多个剂量。每天可以施用一个、二个、三个、四个、五个、六个或更多剂量。
在一些实施方案中，在治疗患有例如冠状病毒感染的感染受试者的血浆中，夹竹桃苷和/或地高辛的浓度为约10μg/mL以下、约5μg/mL以下、约2.5μg/mL以下、约2μg/mL以下、或约1μg/mL以下。在一些实施方案中，在治疗的患有冠状病毒感染的受试者的血浆中，夹竹桃苷和/或地高辛的浓度为约0.0001μg/mL以上、约0.0005μg/mL以上、约0.001μg/mL以上、约0.0015μg/mL以上、约0.01μg/mL以上、约0.015μg/mL以上、约0.1μg/mL以上、约0.15μg/mL以上、约0.05μg/mL以上、或约0.075μg/mL以上。在一些实施方案中，在治疗的感染受试者的血浆中，夹竹桃苷和/或地高辛的浓度为约10μg/mL至约0.0001μg/mL、约5μg/mL至约0.0005μg/mL、约1μg/mL至约0.001μg/mL、约0.5μg/mL至约0.001μg/mL、约0.1μg/mL至约0.001μg/mL、约0.05μg/mL至约0.001μg/mL、约0.01μg/mL至约0.001μg/mL、约0.005μg/mL至约0.001μg/mL。本发明包括本文所记载的血浆浓度范围的所有组合和选择。
抗病毒组合物可长期，即以重复方式，例如每天、每隔一天、每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周、每隔一周、每两周、每三周、每月、每两个月(bimonthly)、每半个月、每隔一个月、每隔两个月、每季度、每隔一个季度、每三个月、季节性地、每半年和/或每年施用。治疗期为一周或多周、一个月或多个月、一季度或多个季度和/或一年或多年。一天内一次或多次施用有效剂量的强心苷(含有强心苷的组合物)。
在一些实施方案中，向受试者施用强心苷140μg至315μg每天。在一些实施方案中，剂量包括20μg至750μg、12μg至300μg、或12μg至120μg的强心苷。强心苷的日剂量可为20μg至750μg、0.01μg至100mg、或0.01μg至100μg的强心苷/天。SCF提取物中存在的夹竹桃苷的推荐日剂量通常为约0.25至约50μg每日两次、或约0.9至5μg每天两次或约每12小时。剂量可为约0.5至约100μg/天、约1至约80μg/天、约1.5至约60μg/天、约1.8至约60μg/天、约1.8至约40μg/天。最大耐受剂量可为约100μg/天、约80μg/天、约60μg/天、约40μg/天、约38.4μg/天或约30μg/天的含有夹竹桃苷的夹竹桃提取物，最小有效剂量可为约0.5μg/天、约1μg/天、约1.5μg/天、约1.8μg/天、约2μg/天、或约5μg/天。含有强心苷和三萜的合适剂量可为约0.05-0.5mg/kg/天、约0.05-0.35mg/kg/天、约0.05-0.22mg/kg/天、约0.05-0.4mg/kg/天、约0.05-0.3mg/kg/天、约0.05-0.5μg/kg/天、约0.05-0.35μg/kg/天、约0.05-0.22μg/kg/天、约0.05-0.4μg/kg/天、或约0.05-0.3μg/kg/天。在一些实施方案中，夹竹桃苷的剂量为约1mg至约0.05mg、约0.9mg至约0.07mg、约0.7mg至约0.1mg、约0.5mg至约0.1mg、约0.4mg至约0.1mg、约0.3mg至约0.1mg、约0.2mg。本发明包括本文所记载的剂量的所有组合。
在一些实施方案中，强心苷以至少两个给药阶段施用：加载阶段和维持阶段。持续进行加载阶段直到约达到强心苷的稳态血浆水平。维持阶段始于治疗开始或加载阶段大约完成之后。剂量滴定可以发生在加载阶段和/或维持阶段。
本文所述的所有给药方案、给药计划、和剂量均被认为是合适的；但是，某些给药方案、给药计划和剂量可对某些受试者比对其他受试者更适合。目标临床终点用于指导所述给药。
所述抗病毒组合物可全身施用。全身施用的方式包括肠胃外、颊部、肠内、肌内、皮下、舌下、经口、肺、或口服。所述组合物也可通过注射或静脉内施用。组合物也可以通过两种或更多种途径施用于同一受试者。在一些实施方案中，通过选自由以下组成的组的任何两种或更多种施用方式的组合来施用组合物：肠胃外，颊部、肠内、肌内、皮下、舌下、经口、肺、和口服。
本发明还提供了舌下剂型，其包含夹竹桃苷和液体载体。本发明还提供了治疗病毒感染，特别是冠状病毒感染(例如本文所定义)的方法，所述方法包括向患有所述病毒感染的受试者舌下施用多个剂量的含有夹竹桃苷(含有地高辛)的组合物。在每周两天或更多天和在每个月一周或多周内、任选地在每年一个月或多个月内，每天可施用一个或多个剂量。
在一些实施方案中，抗病毒组合物包含夹竹桃苷(或地高辛或夹竹桃苷和地高辛的组合)和油。该油可包含中链甘油三酯。抗病毒组合物可以包含一种、两种或更多种含有夹竹桃苷的提取物和一种或多种药物赋形剂。
如果存在于抗病毒组合物中，另外的强心苷可进一步包括：奥多诺甙、夹竹桃它罗苷、或夹竹桃甙元。在一些实施方案中，组合物进一步包括：a)一种或多种三萜；b)一种或多种类固醇；c)一种或多种三萜衍生物；d)一种或多种类固醇衍生物；或e)其组合。在一些实施方案中，组合物包括强心苷和a)两种或三种三萜；b)两种或三种三萜衍生物；c)两种或三种三萜盐；或d)其组合。在一些实施方案中，三萜选自由齐墩果酸、熊果酸、桦木酸及其盐或衍生物组成的组。
本发明的一些实施方案包括其中药物组合物包含至少一种药物赋形剂和抗病毒组合物的那些。在一些实施方案中，抗病毒组合物包括：a)至少一种强心苷和至少一种三萜；b)至少一种强心苷和至少两种三萜；c)至少一种强心苷和至少三种三萜；d)至少两种三萜且不包括强心苷；e)至少三种三萜且不包括强心苷；或f)至少一种强心苷，例如夹竹桃苷、地高辛。如本文所用，除非另外指出，通用术语三萜和强心苷也包含其盐和衍生物。
强心苷可在药物组合物中以纯的形式存在或作为含有一种或多种强心苷的提取物的一部分存在。三萜(一种或多种)可在药物组合物中以纯的形式存在或作为含有三萜(一种或多种)的提取物的一部分存在。在一些实施方案中，强心苷在药物组合物中作为主要治疗组分存在，意味着是主要负责抗病毒活性的组分。在一些实施方案中，三萜(一种或多种)在药物组合物中作为主要治疗组分(一种或多种)存在，意味着是主要负责抗病毒活性的组分(一种或多种)。
在一些实施方案中，通过植物材料的提取来获得含有夹竹桃苷的提取物。提取物可包含植物材料的热水提取物、冷水提取物、超临界流体(SCF)提取物、亚临界流体提取物、有机溶剂提取物、或其组合。在一些实施方案中，已经通过夹竹桃属植物块(生物质)的使用亚临界流体二氧化碳、任选地包含醇作为提取流体的亚临界流体提取制备提取物(生物质)。在一些实施方案中，含有夹竹桃苷的组合物包含两种或更多种不同类型的含有夹竹桃苷的提取物。
本发明的实施方案包括其中含有夹竹桃苷的生物质(植物材料)为夹竹桃属物种(Nerium sp.)，欧洲夹竹桃(Nerium oleander,Nerium oleander L)(夹竹桃科)、红花夹竹桃(Nerium odourum)、白夹竹桃、粉夹竹桃，黄花夹竹桃属物种(Thevetia sp.)，黄花夹竹桃(Thevetia peruviana)、黄夹竹桃、黄花夹竹桃(Thevetia nerifolia)，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，任何所述种的细胞培养物(细胞团)，或其组合。在一些实施方案中，生物质包括叶、茎、花、树皮、果实、种子、汁液、和/或荚。
在一些实施方案中，提取物包含在提取期间与强心苷一同获得的至少一种其他药学活性剂，当将提取物施用于受试者时，其有助于强心苷的治疗功效。在一些实施方案中，组合物进一步包含一种或多种其他非强心苷治疗有效剂，即一种或多种不为强心苷的药剂。在一些实施方案中，组合物进一步包含一种或多种抗病毒化合物。在一些实施方案中，抗病毒组合物不包含药学活性多糖。
在一些实施方案中，提取物包含一种或多种强心苷和一种或多种强心苷前体(例如强心甾、强心二内戊酯(cardadienolides)和强心三内戊酯(cardatrienolides)，其全部为强心苷的糖苷配基(aglycone)成分，例如，洋地黄毒甙、乙酰洋地黄毒甙、毛地黄毒苷配基、地高辛、乙酰基地高辛、地高辛配基、甲地高辛、毒毛花甙、磁麻苷、哇巴因、或毒毛旋花子甙元)。提取物可进一步包含强心苷的一种或多种糖基(glycone)成分(例如葡萄糖苷、果糖苷、和/或葡糖苷酸)作为强心苷前体。因此，抗病毒组合物可包含一种或多种强心苷和选自由一种或多种糖苷配基成分和一种或多种糖基成分组成的组的两种以上的强心苷前体。提取物也可包含一种或多种获得自夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的植物材料的其他非强心糖苷治疗有效剂。
在一些实施方案中，当比较基于夹竹桃苷含量的当量剂量时，含有夹竹桃苷(OL)、齐墩果酸(OA)、熊果酸(UA)和桦木酸(BA)的组合物比纯夹竹桃苷更有效。
在一些实施方案中，总三萜含量(OA+UA+BA)与夹竹桃苷的摩尔比的范围为约15:1至约5:1、或约12:1至约8:1、或约100:1至约15:1、或约100:1至约50:1、或约100:1至约75:1、或约100:1至约80:1、或约100:1至约90:1、或约10:1。
在一些实施方案中，单种三萜与夹竹桃苷的摩尔比的范围如下：约2-8(OA):约2-8(UA):约0.1-1(BA):约0.5-1.5(OL)；或约3-6(OA):约3-6(UA):约0.3-8(BA):约0.7-1.2(OL)；或约4-5(OA):约4-5(UA):约0.4-0.7(BA):约0.9-1.1(OL)；或约4.6(OA):约4.4(UA):约0.6(BA):约1(OL)。
在一些实施方案中，其他治疗剂，例如通过夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的植物材料的提取来获得的治疗剂，不是提取物制备期间得到的多糖，意味着其不是酸性均聚半乳糖醛酸(homopolygalacturonan)或阿拉伯半乳糖醛酸(arabinogalaturonan)。在一些实施方案中，提取物不包括其它治疗剂和/或不包括提取物制备期间得到的均聚半乳糖醛酸或阿拉伯半乳糖醛酸。
在一些实施方案中，其他治疗剂，例如通过夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的植物材料的提取来获得的治疗剂是在提取物制备过程中获得的多糖，例如酸性均聚半乳糖醛酸或阿拉伯半乳糖醛酸。在一些实施方案中，提取物包含另一种治疗剂和/或包含在从所述植物材料制备提取物期间获得的酸性均聚半乳糖醛酸或阿拉伯半乳糖醛酸。
在一些实施方案中，提取物包含夹竹桃苷和至少一种其他选择由以下组成的组的化合物：强心苷、糖基、糖苷配基、类固醇、三萜、多糖、糖类、生物碱、脂肪、蛋白质、夹竹桃它罗苷、奥多诺甙、齐墩果酸、熊果酸、桦木酸、夹竹桃甙元、夹竹桃苷A、桦木醇(乌索-12-烯-3β,28-二醇)、28-去甲乌索-12-烯-3β-醇、乌索-12-烯-3β-醇、3β,3β-羟基-12-齐墩果烯-28-酸、3β,20α-二羟基乌索-21-烯-28-酸、3β,27-二羟基-12-乌索烯-28-酸、3β,13β-二羟基乌索-11-烯-28-酸、3β,12α-二羟基齐墩果烷-28,13β-内酯、3β,27-二羟基-12-齐墩果-28-酸、均聚半乳糖醛酸、阿拉伯半乳糖醛酸、绿原酸，咖啡酸、L-奎宁酸、4-香豆酰辅酶A、3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、强心苷B-1、强心苷B-2、欧夹竹桃甙元(oleagenin)、神经节苷脂(neridiginoside)、橙花苷(nerizoside)、奥多诺甙-H、由半乳糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、和半乳糖组成的3-β-O-(D-地芰糖基)-5-β,14β-二羟基-强心甾-20(22)-烯内酯果胶多糖、MW在17000-120000D的范围内或MW约为35000D、约3000D、约5500D、或约12000D的多糖、强心苷单糖苷(cardenolide monoglycoside)、强心苷N-1、强心苷N-2、强心苷N-3、强心苷N-4、孕烷、4,6-二烯-3,12,20-三酮、20R-羟基孕甾-4,6-二烯-3,12-二酮、16β,17β-环氧-12β-羟基孕甾-4,6-二烯-3,20-二酮、12β-羟基孕甾-4,6,16-三烯-3,20-二酮(欧奕二烯酮A)、20S,21-二羟基孕甾-4,6-二烯-3,12-二酮(欧奕二烯酮B)、夹竹桃香豆酸(neriucoumaric acid)、异夹竹桃香豆酸(isoneriucoumaric acid)、夹竹桃酸(oleanderoic acid)、夹竹桃烯(oleanderen)、8α-甲氧基半日花-18-酸、12-乌索烯、甘露糖苷(kaneroside)、neriumoside、3β-O-(D-地芰糖基)-2α-羟基-8,14β-环氧基-5β-强心甾-16:17,20:22-二烯内酯、3β-O-(D-地芰糖基)-2α,14β-二羟基-5β-强心甾-16:17,20:22-二烯内酯、3β,27-二羟基-乌索-18-烯-13,28-内酯、3β,22α,28-三羟基-25-去甲-羽扇-1(10),20(29)-二烯-2-酮、顺-卡瑞宁(karenin)(3β-羟基-28-Z-对香豆酰氧基-乌索-12-烯-27-酸)、反-卡瑞宁(3-β-羟基-28-E-对香豆酰氧基-乌索-12-烯-27-酸)、3β-羟基-5α-强心甾-14(15),20(22)-二烯内酯(β-脱水乌沙甙元)、3β-O-(D-洋地黄糖基)-21-羟基-5β-强心甾-8,14,16,20(22)-四烯内酯(夹竹桃甙元-A-3β-D-洋地黄苷(neriumogenin-A-3β-D-digitaloside))、牛角瓜甙元(proceragenin)、欧奕二烯酮A、3β,27-二羟基-12-乌索烯-28-酸、3β,13β-二羟基乌索-11-烯-28-酸、3β-羟基乌索-12-烯-28-醛、28-甲基乌索-12-烯-3β-醇、乌索-12-烯-3β-醇、乌索-12-烯-3β,28-二醇、3β,27-二羟基-12-齐墩果烯-28-酸、(20S,24R)-环氧达玛烷-3β,25-二醇、20β,28-环氧基-28α-甲氧基蒲公英甾-3β-醇、20β,28-环氧基蒲公英甾-21-烯-3β-醇、28-去甲-乌索-12-烯-3β,17β-二醇、3β-羟基乌索-12-烯-28-醛、α-neriursate、β-neriursate、3α-乙酰苯氧基-乌索-12-烯-28-酸、夹竹桃酸、卡那地酮(kanerodione)、3β-对羟基苯氧基-11α-甲氧基-12α-羟基-20-乌索烯-28-酸、28-羟基-20(29)-羽扇烯-3,7-二酮、kanerocin、3α-羟基-乌索-18,20-二烯-28-酸、D-沙门糖、D-地芰糖、神经节苷脂、橙花苷、异蓖麻油酸、龙胆甾苷(龙胆二糖基神经节苷)、龙胆二糖基清明花苷(gentiobiosylbeaumontoside)、龙胆二糖基夹竹桃苷(gentiobiosyloleandrin)、欧夹竹桃甙丙(folinerin)、12β-羟基-5β-carda-8,14,16,20(22)-四烯内酯、8β-羟基-洋地黄毒苷元、Δ16-8β-羟基-洋地黄毒苷元、Δ16-苦参素(neriagenin)、乌发醇、熊果醛、27(对香豆酰氧)熊果酸、夹竹桃醇、16-脱水-去乙酰基-神经节苷、9-D-羟基-顺-12-十八酸、阿迪果甙(adigoside)、欧夹竹桃苷乙、α-香树精、β-谷甾醇、菜油甾醇、橡胶(caoutchouc)、癸酸、辛酸、胆碱、cornerin、cortenerin、去乙酰欧夹竹桃苷丙、二乙酰基-神经节苷、欧夹竹桃甙丙、漂筏苔胺(pseudocuramine)、槲皮素、槲皮素-3-鼠李葡糖苷、槲皮甙、rosaginin、芦丁、硬脂酸、豆甾醇、洋地黄次甙、urehitoxin、和乌沙甙元。提取物中存在的另外的成分由Gupta等人(IJPSR(2010(,1(3),21-27,其全部公开内容通过引用并入本文)公开。
夹竹桃苷也可以从源自根癌农杆菌转化的愈伤组织的悬浮培养物的提取物中获得。根据本发明可以使用农杆菌的热水、有机溶剂、水性有机溶剂、或超临界流体提取物。
夹竹桃苷也可以获得自夹竹桃体外微培养物的提取物，由此可以从例如Splendens Giganteum、Revanche或Alsace或其他品种等夹竹桃品种的幼苗和/或茎尖开始茎段培养。根据本发明，可以使用微培养的夹竹桃的热水、有机溶剂、水性有机溶剂、或超临界流体提取物。
提取物还可以通过任何所述植物的种的细胞团(例如存在于细胞培养物中)的提取来获得。
本发明还提供了强心苷在制备用于治疗受试者中病毒感染的药物的中的用途。在一些实施方案中，这样的药物的制备包括：提供一种或多种本发明的抗病毒化合物；包含一个剂量的药物剂型中的抗病毒化合物(一种或多种)；和包装药物剂型。在一些实施方案中，可如PCT国际申请号PCT/US06/29061中所述进行制备。制备还可包括一个或多个附加步骤，例如：将包装的剂型递送至供应商(零售商、批发商和/或经销商)；向患有病毒感染的受试者销售或另外提供包装的剂型；包括药物标签和包装说明书，其提供关于剂型的使用、给药方案、施用、含量和毒理学概况的说明。在一些实施方案中，病毒感染的治疗包括：确定受试者患有病毒感染；根据给药方案指示对受试者的药物剂型的施用；向受试者施用一个或多个药物剂型，其中根据给药方案施用所述一个或多个药物剂型。
药物组合物可进一步包括选自由水溶性(混溶性)共溶剂、水不溶性(不混溶性)共溶剂、表面活性剂、抗氧化剂、螯合剂、和吸收促进剂组成的组的至少一种材料的组合。
增溶剂至少是单一表面活性剂，但其也可以是材料的组合，例如以下的组合：a)表面活性剂和水混溶性溶剂；b)表面活性剂和水不混溶性溶剂；c)表面活性剂、抗氧化剂；d)表面活性剂、抗氧化剂、和水混溶性溶剂；e)表面活性剂、抗氧化剂、和水不混溶性溶剂；f)表面活性剂、水混溶性溶剂、和水不混溶性溶剂；或g)表面活性剂、抗氧化剂、水混溶性溶剂、和水不混溶性溶剂。
药物组合物任选地进一步包括：a)至少一种液体载体；b)至少一种乳化剂；c)至少一种增溶剂；d)至少一种分散剂；e)至少一种其他赋形剂；或f)其组合。
在一些实施方案中，水混溶性溶剂是低分子量(小于6000)PEG、乙二醇、或乙醇。在一些实施方案中，表面活性剂是聚乙二醇化表面活性剂，意味着表面活性剂含有聚(乙二醇)官能团。
本发明包括本文公开的本发明的方面、实施方案和子实施方案的所有组合。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分并且描述了要求保护的发明的示例性实施方案。根据这些附图和本文的描述，本领域技术人员可在无过度实验的情况下实施本发明。
图1-2为描述总结各种组合物针对埃博拉病毒的体外剂量反应抗病毒活性的图表。
图3-4为描述总结各种组合物针对马尔堡病毒的体外剂量反应抗病毒活性的图表。
图5为描述总结夹竹桃苷针对Vero E6细胞中寨卡病毒(SIKV PRVABC59株)的体外剂量反应抗病毒活性的图表。
图6为描述总结地高辛针对Vero E6细胞中寨卡病毒(SIKV PRVABC59株)的体外剂量反应抗病毒活性的图表。
图7为描述总结各种组合物(夹竹桃苷、地高辛和PBI-05204)针对Vero E6细胞中埃博拉病毒的体外剂量反应抗病毒活性的图表。
图8为描述总结各种组合物(夹竹桃苷、地高辛和PBI-05204)针对Vero E6细胞中马尔堡病毒的体外剂量反应抗病毒活性的图表。
图9为描述总结在存在各种组合物(夹竹桃苷、地高辛和PBI-05204)的情况下，Vero E6细胞的体外细胞存活率的图表。
图10A和10B为描述总结在暴露于病毒后不久，组合物(夹竹桃苷和PBI-05204)抑制Vero E6细胞中埃博拉病毒的能力的图表：图10A–感染后2小时；图10B–感染后24小时。
图11A和11B为描述总结在暴露于病毒后不久，组合物(夹竹桃苷和PBI-05204)抑制Vero E6细胞中马尔堡病毒的能力的图表：图11A–感染后2小时；图11B–感染后24小时。
图12A和12B为描述总结组合物(夹竹桃苷和PBI-05204)通过已暴露于夹竹桃苷的病毒感染的Vero E6细胞来抑制感染性后代产物的能力的图表：图12A–埃博拉病毒；图12B–马尔堡病毒。
图13A和13B为描述总结各种组合物(夹竹桃苷、地高辛和PBI-05204)针对Vero E6细胞中委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(图13A)和西部马脑脊髓炎病毒(图13B)的体外剂量反应抗病毒活性的图表。
图14为描述总结通过HTLV-1p19Gag的定量来确定的媒介物对照(vehiclecontrol)、夹竹桃苷、或欧洲夹竹桃的提取物对HTLV-1复制或新合成的病毒颗粒的释放的作用(参见实施例19和20)的图表。显示未处理(UT)细胞用于比较。所有的数据代表至少三个独立实验。数据代表实验的平均值±标准偏差(误差线)。
图15为描述总结媒介物对照、夹竹桃苷、和欧洲夹竹桃提取物对HTLV-1+SLB1淋巴瘤T细胞系的相对细胞毒性的图表。所有的数据代表至少三个独立的实验。数据代表实验的平均值±标准偏差(误差线)。
图16A-16F为描述在合并的图像中通过DIC相衬显示的膜联蛋白V-FITC(绿色)和PI(红色)-染色结果的代表性显微图。还提供单独的膜联蛋白V-FITC和PI荧光通道图像。比例条，20μm。
图17为描述总结媒介物对照、夹竹桃苷、或欧洲夹竹桃的提取物对来自夹竹桃苷处理的HTLV-1+淋巴瘤T细胞的HTLV-1复制或新合成的病毒颗粒的释放的作用的图表。
图18为描述总结媒介物对照、夹竹桃苷、或欧洲夹竹桃的提取物对处理的huPBMC的相对细胞毒性的图表。
图19为描述总结在含有huPBMC的媒介物对照、夹竹桃苷、或欧洲夹竹桃的提取物的huPBMC共培养试验中HTLV-1传播的相对抑制的图表。
图20为描述GFP-表达HTLV-1+SLB1 T细胞系的代表性显微图：荧光显微法(上图)和免疫印迹法(下图)。
图21为描述huPBMC和丝裂霉素C处理的HTLV-1+SLB1/pLenti-GFP淋巴母细胞(绿色细胞)之间的病毒突触的代表性显微图像。
图22为描述来自图21的显微图像定量的具有标准误差(误差线)的平均数据的图表。
图23A-23D为描述“处理”后24小时和48小时，对于用SARS-CoV-2病毒感染、并用夹竹桃苷(红色条)或对照媒介物(孵育培养基)(黑色条)处理的VERO E6细胞的SARS-CoV-2病毒滴度(PFU/mL)的对数相对于时间(h)的图表(实施例28)。在感染之前用夹竹桃苷预处理细胞。在感染后起始的2h孵育后，洗涤感染的细胞以除去细胞外的病毒和夹竹桃苷。然后，按以下处理回收的感染的细胞。用夹竹桃苷处理感染的细胞(图23A：在作为水性组分的具有RPMI1640培养基的0.1％DMSO水溶液中为1μg/mL；图23C：在具有RPMI 1640的0.01％DMSO水溶液中为0.1μg/mL)或仅对照媒介物(图23B：具有RPMI 1640的0.1％DMSO水溶液；图23D：具有RPMI 1640的0.01％DMSO水溶液)，并测定病毒滴度。
图24A为描述在感染后24h在培养基中的病毒复制(Y1，左轴)和Vero-E6细胞计数(Y2，右轴：夹竹桃苷针对所述细胞的潜在细胞毒性的表达)相对于夹竹桃苷浓度(μg/mL)的抑制百分比的双y轴图(实施例29)。图24B是用于图24A的培养物，但在感染后48小时所得。
图25为描述在细胞持续暴露于指示浓度的夹竹桃苷后24h在培养基中的Vero-E6细胞(细胞滴度)相对于夹竹桃苷的浓度(μg/mL)的百分比的图表(实施例30)。
图26A-26B为描述“处理”后24小时(图26A)和48小时(图26B)，对于用SARs-CoV-2病毒感染、然后用夹竹桃苷(蓝色圆圈)或对照媒介物(孵育培养基)(红色正方形)进行处理的VERO CCL-81细胞(嗜盐拟青猴肾正常细胞；https://www.atcc.org/products/all/CCL- 81.aspx)，在培养基中的SARS-CoV-2病毒滴度(PFU/mL)的对数相对于夹竹桃苷的浓度的图表(实施例31)。
对于图26A和26B的样品，在24小时(图26C)和48小时(图26D)测定病毒滴度的倍数降低。
图27A-27D为描述“处理”后24小时和48小时，对于用SARS-CoV-2病毒感染、并用夹竹桃苷(蓝色圆圈)或对照媒介物(孵育培养基)(红色正方形))处理的VERO E6细胞，SARS-CoV-2病毒滴度(PFU/mL)的对数相对于时间(h)的图表(实施例28)。在感染之前用夹竹桃苷预处理细胞。在感染后起始的2h孵育后，洗涤感染的细胞以除去细胞外的病毒和夹竹桃苷。然后，按以下处理回收的感染的细胞。用夹竹桃苷处理感染的细胞(图27A：在以RPMI 1640培养基为水溶液成分的DMSO(0.005％)水溶液中为0.005μg/mL；图27B：在具有RPMI 1640的DMSO(0.01％)水溶液中为0.01μg/mL)；图27C：在具有RPMI 1640的DMSO(0.05％)水溶液中为0.05μg/mL；图27D：在具有RPMI 1640的DMSO(0.1％)水溶液中为0.1μg/mL)，并测定病毒滴度。
图28A和28B为描述“处理”后24小时(图28A)和48小时(图28B)的，在对于用SARS-CoV-2病毒感染、然后用夹竹桃苷(深蓝色圆圈(实施例2)和浅蓝色圆圈(实施例3))或对照媒介物(孵育培养基)(深红色正方形(实施例2)和浅红色正方形(实施例3))处理的VERO 81细胞，在培养基中的SARS-CoV-2病毒滴度(PFU/mL)的对数相对于夹竹桃苷的浓度的图表。实施例2和实施例3仅仅是该测定的重复进行。
图29A和29B为描述培养基中的病毒滴度相对于夹竹桃苷浓度的条形图，其中在感染后24小时(图29A)和48小时(图29B)测定病毒滴度。对于某些样品，在感染前后(2小时)，用夹竹桃苷(蓝色实心条)或仅DMSO对照媒介物(红色实心条)处理细胞。对于其他样品，用夹竹桃苷(蓝色虚线条：感染后12h；空心蓝色条：感染后24h)或仅DMSO对照媒介物(红色虚线条：感染后12小时；空心红色条：感染后24小时)处理细胞。
图30A和30B为描述用于评价双重提取物组合组合物(PBI-A)的抗COVID-19活性的图表。对于图30B，μg/ml(夹竹桃苷浓度)的命名假定PBI-A以1mg/ml(夹竹桃苷浓度)溶液提供。确定病毒滴度(Log10(PFU/mL))相对于Log10稀释因子(图30A)或相对于夹竹桃苷的Log10浓度(图30B)。图30A针对实施例31的感染前测定的数据处理，图30B针对实施例34的感染后测定的处理。
具体实施方式
本发明提供了通过向受试者长期施用或急性施用一种或多种有效剂量的抗病毒组合物(或包含抗病毒组合物和至少一种药物赋形剂的药物组合物)来治疗受试者中病毒感染的方法。根据最适合受试者的给药方案施用组合物，根据常规临床实践和病毒感染的临床治疗终点临床确定剂量和给药方案的适合性。
如本文所用，术语“受试者”意指温血动物如哺乳动物，例如，猫、狗、小鼠、豚鼠、马、牛、绵羊、和人类。
如本文所用，具有病毒感染的风险的受试者为：a)居住在特别是伊蚊属物种(Aedes species)(埃及伊蚊(Aedes egypti)、白纹伊蚊(Aedes albopictus))等蚊子生活的地理区域中的受试者；b)与具有病毒感染的个人或人群居住在一起或附近的受试者；c)与具有病毒感染的人存在性关系的受试者；d)居住在特别是硬蜱属(Ixodes species)(种：马科斯硬蜱(Ixodes marx)、肩突硬蜱(Ixodes scapularis)、或考克硬蜱(Ixodes cooke))等蜱生活的地理区域的受试者；e)居住在果蝠生活的地理区域的受试者；f)居住在热带地区的受试者；g)居住在非洲的受试者；h)接触具有病毒感染的其他受试者的体液的受试者；i)儿童；或j)免疫系统低下的受试者。在一些实施方案中，受试者为女性、能够怀孕的女性、或怀孕的女性。
根据本发明治疗的受试者将表现治疗反应。“治疗反应”是指作为用强心苷治疗的结果，遭受病毒感染的受试者将享受以下临床受益的至少一种：受试者血液或血浆中的活病毒滴度的降低、受试者血液或血浆中的活病毒的根除、感染的改善、与感染相关的症状的发生的减少、感染的部分或全部缓解或感染进展时间增加、和/或引起所述病毒感染的病毒的感染性的降低。治疗反应可以是全部或部分治疗反应。
如本文所用，“进展时间”是确诊(或治疗)病毒感染后直至感染开始恶化的时段、长度或持续时间。这是期间维持感染水平而无进一步的感染进展的时间段，并且该时间段在感染再次开始进展时结束。通过在治疗开始之前或开始时，将遭受感染的受试者“分阶段”来确定疾病的进展。例如，在治疗开始之前或开始时确定受试者的健康。然后用抗病毒组合物治疗受试者，并定期地监测病毒滴度。在稍后的时间点，感染的症状可能恶化，由此标记感染的进展和“进展时间”的结束。期间感染不进展或期间感染的水平或严重程度没有恶化的时间段为“进展时间”。
给药方案包括根据给药计划施用的治疗相关剂量(或有效剂量)的一种或多种强心苷、和/或三萜(一种或多种)。因此，治疗相关剂量是其中观察到病毒感染对抗病毒组合物治疗的治疗反应、并且可向受试者施用抗病毒组合物而没有过量的不需要的或有害的副作用的治疗剂量。治疗相关剂量对于受试者是非致死的，尽管其在患者中可能导致一些副作用。其是其中对于施用抗病毒组合物的受试者的临床受益水平超过由于抗病毒组合物或其组分(一种或多种)的施用而导致受试者经历的有害副作用水平的剂量。根据各种确立的药理学、药效学和药代动力学原理，治疗相关剂量在不同受试者中变化。然而，治疗相关剂量(例如相对于夹竹桃苷)通常为约25μg、约100μg、约250μg、约500μg或约750μg的强心苷/天，或者其可在每剂量约25-750μg强心苷的范围中，或者可不超过约25μg、约100μg、约250μg、约500μg或约750μg的强心苷/天。另一个治疗相关剂量(例如相对三萜是单独或共同的)的实例通常为约0.1μg至100μg、约0.1mg至约500mg、约100至约1000mg每kg体重，约15至约25mg/kg、约25至约50mg/kg、约50至约100mg/kg、约100至约200mg/kg、约200至约500mg/kg、约10至约750mg/kg、约16至约640mg/kg、约15至约750mg/kg、约15至约700mg/kg、或约15至约650mg/kg体重的范围。根据药剂学的基础原理，本领域中已知在受试者中提供目标治疗结果所需的抗病毒组合物的实际量可在不同受试者中变化。
可以使用两个或更多个给药阶段进行地高辛治疗：加载阶段和维持阶段。加载阶段可采用以下给药方案直到达到地高辛的稳态血浆水平，在加载阶段完成之后，维持阶段可采用以下给药方案。
Figure BDA0002816516430000271
可根据通常用于病毒感染治疗的任何给药方案来施用治疗相关剂量。治疗相关剂量可每天一次、两次、三次或更多次施用。其可以每隔一天、每三天、每四天、每五天、每半周、每周、每两周、每三周、每四周、每月、每两个月(bimonthly)、每半月、每三个月、每四个月、每半年、每年，或根据上述的任何组合来施用以达到合适的给药计划。例如，治疗相关剂量可以在一周或多周内每天一次或多次施用(最多每天10次以达到最高剂量)。
实施例15提供了体外试验的详细描述，所述试验用于评价含有夹竹桃苷(作为唯一活性的)、AnvirzelTM(夹竹桃的热水提取物)和PBI-05204(夹竹桃的超临界流体(SCF)提取物)的组合物对埃博拉病毒(图1-2)和马尔堡病毒(图3-4)感染的治疗的功效，埃博拉病毒和马尔堡病毒都为丝状病毒。
热水提取物可以口服、舌下、皮下、和肌内施用。一个实施方案可以以商品名ANVIRZELTM(Nerium Biotechnology,Inc.,San Antonio,TX；Salud Integral MedicalClinic,Tegucigalpa,Honduras；www.saludintegral.com；www.anvirzel.com)作为液体剂型获得。对于舌下施用，典型的给药方案为1.5mL每天或一天中三次0.5mL的剂量。对于注射施用，典型的给药方案为约1至约2mL/天、或约0.1至约0.4ml/m2/天，施用约1周至约6个月或更长，或约0.4至约0.8ml/m2/天，施用约1周至约6个月或更长，或约0.8至约1.2ml/m2/天，施用约1周至约6个月或更长。可以使用较高剂量，因为ANVIRZELTM的最大耐受剂量要更高。ANVIRZELTM包含从夹竹桃中提取(热水提取)的夹竹桃苷、夹竹桃甙元、多糖。市售小瓶含有约150mg的夹竹桃提取物作为冻干粉末(施用前用水复溶之前)，其含有从夹竹桃中提取的约200至约900μg的夹竹桃苷、约500至约700μg的夹竹桃甙元、和多糖。所述小瓶还可包括药学赋形剂例如至少一种渗透剂，例如甘露醇、氯化钠，至少一种缓冲剂，例如抗坏血酸钠与抗坏血酸，至少一种防腐剂，例如对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸甲酯。
通过将组合物以40μg/mL添加至细胞，然后添加病毒并孵育1小时来设置实验。将病毒添加至细胞时，组合物的最终浓度为20μg/mL。根据其含有的夹竹桃苷的浓度，可调节含有不同量的夹竹桃苷的组成，并转换为摩尔浓度。图1-4描述了基于提取物的夹竹桃苷含量的功效。OL自身就是有效的。作为含有OL、OA、UA和BA的夹竹桃的SCF提取物的PBI-05204实质上比OL自身更有效。作为夹竹桃的热水提取物的AnvirzelTM比OL自身更有效。两种提取物在纳摩尔范围中清楚地表现功效。PBI-05204提取物中的夹竹桃苷的百分比(1.74％)比Anvirzel中的百分比(0.459％，4.59μg/mg)更高。在PBI-05204的最高剂量下，其完全抑制EBOV和MARV感染，然而AnvirzelTM不表现完全抑制，因为在高于20μg/mL剂量的AnvirzelTM下，观察到毒性。数据说明PBI-05204具有针对埃博拉病毒和马尔堡病毒的最高抗病毒活性。PBI-05204中的三萜的组合增加了夹竹桃苷的抗病毒活性。
实施例6提供了体外试验的详细描述，所述试验用于评价强心苷治疗寨卡病毒(一种黄病毒)感染的功效。在存在夹竹桃苷(图5)或地高辛(图6)的情况下，以0.2的MOI用寨卡病毒(ZIKV PRVABC59株)感染Vero E6细胞。用病毒和强心苷孵育细胞1小时，然后除去接种物和未吸收的强心苷(如果存在)。在新鲜培养基中浸渍细胞并且孵育48小时，然后用福尔马林固定细胞并且对ZIKV感染染色。数据说明两种强心苷具有针对寨卡病毒的抗病毒活性；然而，夹竹桃苷表现比地高辛更高(几乎大8倍)的抗病毒活性。
实施例14提供了用于评价试验组合物针对寨卡病毒和登革热病毒的抗病毒活性的实验的详细描述。数据说明夹竹桃苷显示针对寨卡病毒和登革热病毒的功效。
图7为总结各种组合物(夹竹桃苷、地高辛和PBI-05204)针对Vero E6细胞中埃博拉病毒(EBOV)的体外剂量反应抗病毒活性的图表。图8为描述总结各种组合物(夹竹桃苷、地高辛和PBI-05204)针对Vero E6细胞中马尔堡病毒(MARV)的体外剂量反应抗病毒活性的图表。图9为描述总结在存在各种组合物(夹竹桃苷、地高辛和PBI-05204)的情况下，VeroE6细胞的体外细胞存活率的图表。对于图7-8，将宿主细胞在用病毒感染之前暴露于组合物。在存在夹竹桃苷、地高辛或PBI-05204(一种含夹竹桃苷的植物提取物)的情况下，用EBOV/Kik(图7，MOI＝1)或MARV/Ci67(图8，MOI＝1)感染Vero E6细胞。1小时后，除去接种物和化合物并向细胞添加新鲜培养基。48小时后，固定细胞并免疫染色来检测感染EBOV或MARV的细胞。使用Operetta计数感染的细胞。
为了确保在抗病毒活性方面没有观察到假阳性，检测在存在组合物的情况下的细胞存活率。对于图9中的数据，用上述化合物处理Vero E6细胞。通过CellTiter-Glo测定ATP水平作为细胞存活率的测定。已确定夹竹桃苷、地高辛、和PBI-05204不降低细胞存活率，意味着在本文其他附图中详述的抗病毒活性不是由于单一化合物的细胞毒性导致的假阳性所引起的。
因此，本发明提供了治疗哺乳动物或宿主细胞中病毒感染的方法，所述方法包括：在染上所述病毒感染之前，向哺乳动物或宿主细胞施用抗病毒组合物，从而在所述哺乳动物或宿主细胞被病毒感染时，抗病毒组合物降低病毒滴度并且改善、降低或消除病毒感染。
本发明的抗病毒组合物和方法在治疗在施用抗病毒组合物前发生的病毒感染也是有用的。用EBOV(图10A、10B)或MARV(图11A、11B)感染Vero E6细胞。在感染后2小时(图10A、11A)或感染后24小时(图10B、11B)，向细胞添加夹竹桃苷或PBI-05204 1小时，然后丢弃，并且将细胞返回至培养基。
图10A和10B为描述总结在暴露于病毒后不久，组合物(夹竹桃苷和PBI-05204)抑制Vero E6细胞中埃博拉病毒的能力的图表：图10A–感染后2小时；图10B–感染后24小时。当在病毒感染后2小时内(或在长达12小时内)施用抗病毒组合物时，病毒滴度抗病毒组合物提供有效的治疗并且降低EBOV病毒滴度。即使在24小时后，病毒组合物也是有效的；然而，其功效随着初始病毒感染后时间的增加而降低。对MARV进行相同的评价。图11A和11B为描述总结在暴露于病毒后不久，组合物(夹竹桃苷和PBI-05204)抑制Vero E6细胞中马尔堡病毒的能力的图表：图11A–感染后2小时；图11B–感染后24小时。当在病毒感染后2小时内(或在长达12小时内)施用抗病毒组合物时，病毒滴度抗病毒组合物提供有效治疗并降低MARV病毒滴度。即使在24小时后，病毒组合物也是有效的；然而，其功效随着初始病毒感染后时间的增加而降低。
考虑到本文组合物的抗病毒活性对于病毒感染细胞的单代为降低的，例如在感染后24小时内，我们评价了抗病毒组合物是否能够抑制病毒繁殖，意味着是否抑制感染性后代的产生。在存在夹竹桃苷或PBI-05204的情况下，用EBOV或MARV感染Vero E6细胞，并且孵育48小时。将来自感染的细胞培养物的上清液传递至新鲜Vero E6细胞，孵育1小时，然后丢弃。孵育含有传递的上清液的细胞48小时。如本文所述，评价用EBOV(B)或MARV(C)感染的细胞。EBOV的对照感染率为66％，MARV的对照感染率为67％。本发明的抗病毒组合物抑制感染性后代的产生。
因此，本发明的抗病毒组合物：a)可在病毒感染前预防性地施用以在暴露于病毒后抑制病毒感染；b)可在病毒感染后施用以抑制或降低病毒复制以及感染性后代的产生；或c)a)和b)的组合。
使用Vero E6细胞中的VEE病毒和WEE病毒来评价抗病毒组合物针对披膜病毒科甲病毒属的抗病毒活性。图13A和13B为描述总结各种组合物(夹竹桃苷、地高辛和PBI-05204)针对Vero E6细胞中委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(图13A)和西部马脑脊髓炎病毒(图13B)的体外剂量反应抗病毒活性的图表。在存在或不存在指示化合物的情况下，用委内瑞拉马脑炎病毒(图13A，MOI＝0.01)或西部马脑炎病毒(图13B，MOI＝0.1)感染Vero E6细胞18小时。如前所述检测感染的细胞并在Operetta上计数。已发现本发明的抗病毒组合物是有效的。
因此，本发明提供了治疗受试者或宿主细胞中由以下导致的病毒感染的方法：沙粒病毒科病毒、丝状病毒科病毒、黄病毒科病毒(黄病毒属)、逆转录病毒科病毒、δ逆转录病毒属病毒、冠状病毒科病毒、副粘病毒科病毒、或披膜病毒科病毒，所述方法包括施用有效量的抗病毒组合物，从而将病毒暴露于抗病毒组合物并治疗所述病毒感染。
我们评价了本文所述的夹竹桃苷和提取物用于HTLV-1(人T细胞白血病病毒1型；包膜逆转录病毒；δ逆转录病毒属)感染的的治疗的用途。为了确定纯化的夹竹桃苷化合物或欧洲夹竹桃的提取物是否可以抑制HTLV-1前病毒复制和/或含有p19Ga的病毒颗粒的产生和释放，用浓度增加的夹竹桃苷或欧洲夹竹桃提取物、或无菌媒介物对照(MilliQ处理的ddH2O中的20％DMSO)处理产生病毒的HTLV-1转化的SLB1淋巴瘤T细胞系，然后在37℃、10％CO2下孵育72小时。随后通过离心沉淀细胞，通过进行抗-HTLV-1p19Gag ELISA(Zeptometrix)定量释放至培养物上清液中的细胞外含有p19Gag的病毒颗粒的相对水平。
图14为描述用媒介物对照(1.5μL、7.5μL、或15μL)、或浓度增加(10μg/mL、50μg/mL、和100μg/mL)的夹竹桃苷化合物或欧洲夹竹桃的提取物(实施例19和20)处理72小时的HTLV-1+SLB1淋巴瘤T细胞系所表达的HTLV-1p19Gag量化的数据。通过进行抗-HTLV-1p19GagELISA(Zeptometrix)来量化病毒复制和释放至培养物上清液中的细胞外颗粒。夹竹桃苷不显著抑制HTLV-1复制或新合成的病毒颗粒的释放。我们确定，仅提取物或夹竹桃苷都不会显著抑制病毒复制或含有p19Gag的颗粒释放至培养物的上清液。因此，我们预期无进一步的抗病毒活性；然而，我们出乎意料地发现，从处理过的细胞中收集的病毒颗粒对原代人外周血单核细胞(huPBMC)表现降低的感染性。与HIV-1不同，细胞外HTLV-1颗粒的感染较差，病毒传播通常是通过跨病毒突触的直接细胞间相互作用而发生的。
本发明因此提供一种产生具有降低感染性的HTLV-1病毒颗粒的方法，所述方法包括用本发明的抗病毒组合物处理HTLV-1病毒颗粒，以提供具有降低感染性的HTLV-1病毒颗粒。
为了确保所观察的抗病毒活性不是由于抗病毒组合物对HTLV-1+SLB1淋巴母细胞的潜在细胞毒性所引起的人工产物，我们评价了在处理的HTLV-1+SLB1淋巴母细胞培养物中不同稀释的纯化的夹竹桃苷化合物和欧洲夹竹桃提取物的细胞毒性(实施例21)。如本文所述，用浓度增加(10、50、和100μg/ml)的夹竹桃苷或欧洲夹竹桃提取物处理SLB1 T细胞72小时。作为阴性对照，也用增加量(1.5、7.5、和15μl)的与药物处理的培养物中所用的体积对应的媒介物溶液处理细胞。环磷酰胺(50μM；Sigma-Aldrich)处理的细胞作为凋亡的阳性对照包括在内。然后，洗涤样品并用Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)染色，并通过共焦荧光显微镜进行分析。AnnexinV-FITC和/或PI阳性细胞的相对百分比通过荧光显微镜进行定量，并使用20倍物镜计数三次重复视野。
结果(图15和图16A-16F)说明最低浓度(10μg/ml)的夹竹桃苷和欧洲夹竹桃提取物不诱导显著的细胞毒性/凋亡。然而，较高浓度(约50和约100μg/ml)的粗植物提取物比夹竹桃苷化合物要诱导明显更多的凋亡。这与夹竹桃苷代表约1.23％的欧洲夹竹桃提取物的事实相一致。由夹竹桃苷引起的细胞毒性不显著较高于处理的TLV-1+SLB1细胞中的媒介物对照。
然后，我们在共培养试验中研究夹竹桃苷或欧洲夹竹桃提取物是否可以抑制从表达绿色荧光蛋白(GFP)的HTLV-1+淋巴瘤T细胞系至huPBMC的病毒传播(实施例20)。对于这些研究，在96孔微量滴定板中用浓度增加的夹竹桃苷化合物或欧洲夹竹桃提取物、或媒介物对照处理HTLV-1+SLB1淋巴瘤T细胞72小时，然后收集含有病毒的上清液并直接用于感染原代培养的体外人外周血单核细胞(huPBMC)。72小时后，通过进行抗-HTLV-1p19Gag ELISA定量作为直接感染结果的释放至培养物上清液中的细胞外含有p19Gag的病毒颗粒的相对水平。
用媒介物对照、或增加浓度(10μg/ml、50μg/ml、和100μg/ml)的欧洲夹竹桃提取物或夹竹桃苷化合物处理HTLV-1+SLB1淋巴瘤T细胞系72小时，然后收集含有病毒的上清液，并直接用于感染原代huPBMC。媒介物对照、欧洲夹竹桃提取物、或夹竹桃苷也包含在huPBMC的培养基内。72小时后，收集培养物上清液并通过进行抗-HTLV-1p19Gag ELISA定量产生的细胞外病毒颗粒的相对量。
数据(图17)表明相对于媒介物对照相当的量，即使最低浓度(10μg/ml)的夹竹桃苷和欧洲夹竹桃提取物二者抑制释放至处理的细胞的培养物上清液中的新合成的含有p19Gag的病毒颗粒的感染性。夹竹桃苷和粗提物二者都抑制病毒突触的形成和HTLV-1体外的传播。由夹竹桃苷处理的HTLV-1+淋巴瘤T细胞产生的细胞外病毒颗粒对原代huPBMC表现降低的感染性。重要的是，夹竹桃苷通过减少包膜糖蛋白掺入成熟颗粒中而表现出针对包膜病毒的抗病毒活性，这代表了逆转录病毒感染周期的独特阶段。
为了确保观察到的抗病毒活性不是由于抗病毒组合物对处理的huPBMC的潜在细胞毒性而引起的人工产物，我们还研究了(实施例21)，与媒介物阴性对照相比，处理的huPBMC中的纯化的夹竹桃苷和欧洲夹竹桃提取物的细胞毒性。分离原代血沉棕黄层huPBMC，并用植物血凝素(PHA)刺激，并在重组人白介素-2(hIL-2)存在下进行培养。然后用浓度增加的夹竹桃苷或欧洲夹竹桃提取物、或用体积增加的媒介物处理细胞72小时。随后将样品用Annexin V-FITC和PI染色样品，并通过共焦荧光显微镜重复三次计数，对每视野的凋亡(即Annexin V-FITC和/或PI阳性)细胞的相对百分比进行定量。
通过处理原代huPBMC 72小时，评价媒介物对照、欧洲夹竹桃提取物、和夹竹桃苷化合物的细胞毒性作用，然后用AnnexinV-FITC和PI对培养物进行染色。通过荧光显微镜并使用20x物镜计数重复三次的视野，对凋亡(即AnnexinV-FITC和/或PI阳性)细胞的相对百分比进行定量。使用DIC相衬显微镜确定细胞总数。环磷酰胺(50μM)处理的细胞作为凋亡的阳性对照包括在内。NA表示此样品中的细胞数太低，由于毒性较高，无法进行准确评价。
数据(图18)表明与媒介物对照相比，夹竹桃苷在huPBMC中显示中度细胞毒性(例如，在最低浓度下为35-37％)。相反，欧洲夹竹桃提取物具有显著的细胞毒性并且即使在最低浓度下也能诱导高水平的程序化细胞死亡。与HTLV-1+SLB1淋巴母细胞相比，huPBMC对纯化的夹竹桃苷稍微更敏感。然而，huPBMC对粗欧洲夹竹桃提取物更加敏感，该提取物还含有其他细胞毒性化合物，例如本文所述的三萜。
我们也研究了(实施例22)在共培养实验中夹竹桃苷或欧洲夹竹桃提取物是否能够干预HTLV-1颗粒向靶huPBMC的传播。对于这些研究，用丝裂霉素C、然后用增加量的夹竹桃苷、欧洲夹竹桃提取物、或媒介物对照处理产生病毒的HTLV-1+SLB1 T细胞系15分钟或3小时。用无血清培养基洗涤SLB1细胞2次，然后向每个孔中加入等量的huPBMC，并将样品在加湿培养箱中于37℃、10％CO2下在完全培养基中共培养72小时。通过进行抗-HTLV-1p19GagELISA测定释放至培养物上清液中的细胞外病毒水平，评价HTLV-1的相对细胞间传播。
将原代huPBMC与丝裂霉素C处理的HTLV-1+SLB1淋巴瘤T细胞共培养，用媒介物对照、或浓度增加(10μg/mL、50μg/mL、和100μg/mL)的欧洲夹竹桃提取物或夹竹桃苷化合物预处理HTLV-1+SLB1淋巴瘤T细胞15分钟或3小时。媒介物对照、提取物、和化合物也存在于共培养介质中。72小时后，收集上清液，通过进行抗-HTLV-1p19Gag ELISA定量释放的细胞外病毒颗粒的量。
图19中描述的结果说明与媒介物对照相比，夹竹桃苷和欧洲夹竹桃提取物均抑制HTLV-1的传播；然而，HTLV-1+SLB1细胞的15分钟和3小时预处理之间没有观察到差异。
我们还研究了在共培养试验中夹竹桃苷是否抑制病毒突触的形成和HTLV-1的传播(实施例22)。通过用pLenti-6.2/V5-DEST-GFP载体转导SLB1淋巴瘤T细胞并在杀稻瘟菌素(5μg/mL；Life Technologies)上进行选择两周而产生表达GFP的HTLV-1+SLB1 T细胞系。通过荧光显微镜(图20上图)和免疫印迹(图20下图)筛选GFP阳性克隆，并扩增和重复传代。提供DIC相衬图像以进行比较。
通过荧光显微镜可视化huPBMC和丝裂霉素C处理的HTLV-1+SLB1/pLenti-GFP淋巴母细胞(绿色细胞)之间的病毒突触形成，所述HTLV-1+SLB1/pLenti-GFP淋巴母细胞已用媒介物对照或增加量(10μg/mL、50μg/mL、和100μg/mL)的欧洲夹竹桃提取物或夹竹桃苷化合物预处理3小时(图21)。通过使用20倍物镜的荧光显微镜在20个视野(n＝20)中定量感染的(即，HTLV-1gp21-正，红色)的huPBMC(GFP-负)的相对百分比来评价病毒传播(参见媒介物对照图中的箭头)。定量荧光显微镜数据(图22)。数据确认，抗病毒组合物抑制共培养试验中的病毒突触形成以及HTLV-1的传播。
因此，本发明还提供了一种抑制(降低)释放至处理的细胞的培养物上清液的HTLV-1颗粒的感染性以及通过抑制病毒突触的Env依赖性形成来降低HTLV-1的细胞间传播的方法，所述方法包括用有效量的抗病毒组合物处理病毒感染的细胞(体外或体内)。
针对鼻病毒(rhinovirus)感染评价了本文所述组合物的抗病毒活性。鼻病毒属于微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae family)和肠病毒属(Enterovirus genus)。其是无包膜的并且是(+)极性的ss-RNA病毒。在本文采用的浓度和试验中，已发现夹竹桃苷针对鼻病毒是无活性的，因为其并不抑制病毒复制。
如实施例26中所详述，CoV感染可在体内治疗，其中抗病毒组合物作为单一疗法或组合疗法施用于受试者。根据实施例27体内确立夹竹桃苷针对CoV的功效。在一小部分的橙汁中，对儿童施用0.25ml的重组ANVIRZELTM。然后每12小时，对儿童施用0.5ml的重组ANVIRZELTM约2-3天的时间。婴儿从COVID-19感染中恢复过来。
根据实施例28，通过体外评价获得夹竹桃苷(含有夹竹桃苷的组合物)针对冠状病毒例如SARS-CoV-2(COVID-19)的功效的进一步证明，其中用夹竹桃苷预处理Vero细胞，然后用SARS-CoV-2感染。细胞感染之后，涤除细胞外病毒和夹竹桃苷,然后用夹竹桃苷处理感染的细胞(图23A：0.1％v/v水性DMSO中为1μg/mL；图23C：0.01％v/v水性DMSO中为0.1μg/mL)或仅水性DMSO作为对照媒介物(图23B：0.1％v/v水性DMSO；图23D：0.01％v/v水性DMSO)。结果表明a)夹竹桃苷预处理在24小时引起病毒载量1368倍的降低，在48小时时间点引起369倍的降低；b)夹竹桃苷在约0.1至约1.0μg/mL的整个浓度范围是有效的，其中高剂量比低剂量略好，所以夹竹桃苷很可能在甚至更低的浓度，例如0.01至0.1μg/mL是有效的；c)夹竹桃苷应当重复施用，因为单剂量并不足以完全停止病毒复制；和d)使用仅用夹竹桃苷30分钟预孵育Vero细胞仅对减少初始病毒感染略有效，似乎不会影响后代病毒体的感染性。结果还表明浓度为0.1和1.0μg/mL的夹竹桃苷对Vero细胞没有过度毒性。结果进一步表明夹竹桃苷通过以下抑制后代病毒的感染性：a)约1log10无持续药物治疗；和b)约>3log10持续药物治疗(无毒性)。
为了确定夹竹桃苷是否直接抑制病毒复制，根据实施例29用SARS-CoV-2病毒感染Vero-E6细胞，并用不同浓度的夹竹桃苷处理。结果描述于图24A和24B中。在24h时间点(图24A)，在仅用夹竹桃苷处理的孔中，仅在吸收阶段(预处理数据)，观察到抗病毒活性，近似的IC50为0.625μg/mL。在用夹竹桃苷处理的孔中，对于试验持续时间(持续时间数据)，即使在存在大量接种病毒的情况下，夹竹桃苷显著限制病毒进入和/或病毒复制。在48h时间点(图24B)，在用夹竹桃苷处理的孔中仅在吸收阶段期间(预处理数据)，在时间段的结束观察到最低的抗病毒活性。在用夹竹桃苷处理的孔中对于试验持续时间(持续时间数据)，夹竹桃苷显著抑制病毒感染。可能的作用方法包括抑制病毒复制、组装、和/或流出。
为了确保观察到的夹竹桃苷针对SARS-CoV-2的抗病毒活性不是由于夹竹桃苷针对Vero-E6细胞的细胞外毒性引起的，在24-h(图24A)和48-h(图24B)时间点确定细胞滴度。在夹竹桃苷的浓度为1.0μg/mL以上时，细胞毒性出现并潜在干扰测定；然而，在夹竹桃苷的浓度为0.625μg/mL以下时，显著降低了细胞毒性的干扰，从而确认即使在非常低的浓度下的夹竹桃苷的强的抗病毒活性。在实施例30的测定中观察到夹竹桃苷针对Vero-E6细胞的毒性程度的额外证据(图25)。在夹竹桃苷的浓度为0.625μg/mL时，在24h时间点，约80％的Vero细胞保持活力，在较低的浓度下观察到的毒性甚至更低。应理解，夹竹桃苷针对Vero-E6细胞的毒性并不表明夹竹桃苷对人有毒。在测定抗病毒活性时，这种毒性测定仅用于确定背景细胞死亡的潜在影响。
因此，夹竹桃苷具有用于治疗病毒感染、特别是冠状病毒感染、例如SARS-CoV-2感染的至少双重机制(途径)：a)直接抑制病毒复制；和b)降低后代病毒的感染性。
此外，即使在非常地的剂量下夹竹桃苷也具有抗病毒活性，并且夹竹桃苷表现出实质性的预防作用。根据实施例31对此进行说明，其中用SARS-CoV-2感染VERO CCL-81细胞。在感染之前用夹竹桃苷预处理细胞。感染后最初2小时孵育后，洗涤感染的细胞来除去细胞外病毒和夹竹桃苷。然后，如下处理回收的感染的细胞。用夹竹桃苷(在作为水溶液组分的具有RPMI 1640培养基的DMSO水溶液的各种浓度)或仅对照媒介物(具有RPMI164的DMSO水溶液)处理感染的细胞，并在“处理”后24小时(图26A)和48小时(图26B)测定病毒滴度。在无夹竹桃苷的情况下，SARS-CoV-2在24-小时时间点达到高(约6log10噬菌斑形成单位(pfu)/mL)滴度，并在随后的时间点维持那个滴度：它始终保持在或低于测定的检测限制。浓度为1μg/mL至0.05μg/mL的夹竹桃苷即使在刚好24小时，也提供大大降低的病毒滴度。两种较高剂量将病毒滴度基本降至或低于检测限制，并且在任何检测的夹竹桃苷浓度下未观察到细胞毒性。对这些样品计算病毒滴度的倍数降低。在48-h时间点观察到病毒滴度的倍数降低(图26C和26D)的范围为约1,000-倍至约40,000-倍，在24h时间点观察到约1,000-倍至约20,000-倍。尽管10ng/mL剂量在感染后24小时与其DMSO对照相比没有显著的作用，但其在感染后48小时导致滴度显著降低。重要的是，与24小时相比，在48小时测定时，由于夹竹桃苷引起的降低增加到最高浓度。夹竹桃苷的预防效力随时间(24小时与48小时)的增加反映在其EC50值中，感染后24小时计算为11.98ng/ml，感染后48小时计算为7.07ng/ml。
对上述Vero 81细胞进行基因组分析确定SARS-CoV-2的抑制是否在全部或感染性颗粒产生的水平。从预防性研究的细胞培养物上清液中提取RNA，并通过qRT-PCR定量基因组等效物(实施例39)。在基因组等效物的水平上确认最初通过感染性测定观察到的夹竹桃苷的预防性作用。在感染后24小时，夹竹桃苷在四个最高剂量中显著降低上清液中的SARS-CoV-2基因组。在基因组等效物的水平上确认最初通过感染性测定观察到的夹竹桃苷的预防性作用。在感染后24小时，夹竹桃苷在四个最高剂量中显著降低上清液中的SARS-CoV-2基因组。
进行另外的研究以确定在感染后24h和48h的COVID-19感染对夹竹桃苷的剂量反应(图27A-27B)。观察到剂量反应，其中增加培养基中的夹竹桃苷浓度提供大大降低的病毒滴度，然而，即使最低的检测浓度(0.05μg/mL)导致在24h时滴度的降低，在感染后48h甚至更大的滴度降低。最高剂量导致感染性SARS-CoV-2滴度的超过1,000-倍的降低，其中0.5μg/mL和100ng/mL剂量引起大于100-倍的降低，50ng/ml剂量导致78-倍的降低。
图28A和28B为描述重复研究的结果，每个重复三次进行，以确定COVID-19对培养基中夹竹桃苷的不同浓度(0.005至1μg/mL)的处理的剂量反应。甚至在大于0.01μg/mL的浓度下在Vero 81细胞中在感染后24h和48h观察到大量的抗病毒活性。甚至在0.05μg/mL非常低的浓度下，也会观察到病毒滴度大幅降低。
为了确定感染后夹竹桃苷的抗病毒功效，进行根据实施例34的研究。在感染之前不用夹竹桃苷预处理Vero 81细胞。取而代之，用COVID-19病毒感染细胞，然后用夹竹桃苷(以指示浓度)在感染后12h和24h处理。然后在感染后24h(图29A)和48h(图29B)测定病毒滴度。数据说明，即使仅用单一处理，夹竹桃苷可以在感染后至少12、至少24h、或至少36h表现出抗病毒活性。重要的是要注意，与人病毒感染相比，该测定是时间压缩的测定。24h时间点相当于人感染后约5至7天，48h时间点相当于人感染后约10至14天。
使用双重提取组合组合物(PBI-A，含有溶解于DMSO(98重量％)的1重量％的乙醇提取物、1重量％的实施例36)。图30A详述了根据实施例31的测定评价双重提取组合组合物的结果，图30B详述了根据实施例34的测定评价双重提取物(1重量％)的结果。图30A中的数据说明基于原始储备溶液的相对稀释的PBI-A的相对抗病毒(抗-COVID-19)功效。图30B中的数据是基于测定溶液中的夹竹桃苷的相对浓度(μg/mL)。每幅图的点状线为描述可以使用CFU(病毒集落形成单位)测定检测的病毒的最低浓度。
基于图30A和30B的结果，双重提组合组合物在包括0.05至1.0μg/mL的浓度下作为针对抗COVID-19的抗病毒剂是有效的，其与纯夹竹桃苷中所观察到的范围相同。
同样重要的是，观察到在测定中评价的夹竹桃苷的浓度在剂量和血浆浓度方面为临床相关的。
含有夹竹桃苷的组合物的安全性的证据进一步由体外细胞测定提供，所述测定用于确定在所述细胞暴露于含有不同浓度夹竹桃苷的溶液后乳酸脱氢酶的释放。经确定，在高达1μg/mL的浓度下，与对照媒介物相比没有其他毒性。
夹竹桃苷(含有夹竹桃苷的组合物，含有夹竹桃苷的提取物)治疗COVID-19病毒感染的功效进一步根据实施例35在FDA扩大准入计划(Expanded Access program of theFDA)下通过向受试者施用含有夹竹桃苷的舌下剂型(实施例32或37)来确立。以约6h间隔每天四个15μg剂量的夹竹桃苷(作为双重提取物组合物)或以约8h间隔每天三个15mg剂量的速度，每天向18至78岁年龄段的受试者施用。在治疗开始前，观察受试者的临床状态和/或病毒滴度。一些受试者接受姑息治疗(palliative care)或临终关怀治疗(hospice care)。在一至两周，十至十四天的治疗期间，定期确定临床状态和/或病毒滴度。开始处理后观察到以下结果。
Figure BDA0002816516430000401
在FDA扩大准入计划下对第二组显示不同水平COVID-19相关症状的人受试者进行了另外的体内研究。开始治疗之前，确定受试者的临床状态和/或病毒滴度，以确认COVID-19感染。一些受试者表现出中度至严重的症状。每天以约6小时间隔向年龄不等的受试者施用四组15μg剂量的夹竹桃苷(作为双重提取物组合物)。在一至两周，十至十四天的治疗期间，定期确定临床状态和/或病毒滴度。在开始治疗后的五到十二天内，所有受试者均完全从COVID-19感染中恢复过来。
夹竹桃苷已显示产生强的抗炎反应，这可以有助于预防SARS-CoV-2感染引起的过度炎症反应。
本发明因此提供一种治疗COVID-19病毒感染的方法，所述方法包括向具有所述感染的受试者施用多剂量的强心苷(含有强心苷的组合物，或含有强心苷的提取物)。多剂量可以分为每周两天以上，任选地，每个月一周以上，还任选地，每年一个月以上，每天一个以上的剂量。优选的强心苷是夹竹桃苷。
本发明因此提供一种治疗冠状病毒感染，特别是对人有致病性的冠状病毒如SARS-CoV-2感染的方法，所述方法包括向具有所述感染的受试者长期施用治疗有效剂量的强心苷(含有强心苷的组合物)。长期施用可以通过重复施用一个以上(多个)治疗有效剂量的强心苷(含有强心苷的组合物)来实现。可以每周一天以上，任选地每个月一周以上，和任选地每年一个月以上，每天施用一个以上的剂量。
因此，本发明提供一种在有需要的受试者(特别是人受试者)中治疗病毒、例如CoV感染的方法，所述方法包括向受试者施用一个或多个剂量的抗病毒组合物，所述抗病毒组合物包含a)夹竹桃苷；或b)提取自夹竹桃属物种的夹竹桃苷和一种或多种其他化合物。夹竹桃苷可以作为夹竹桃属物种的提取物的一部分而存在，其中提取物可以是a)超临界流体提取物；b)热水提取物；c)有机溶剂提取物；d)水性有机溶剂提取物；e)使用超临界流体，任选地，加上至少一种有机溶剂(提取改性剂)的提取物；f)使用超临界流体，任选地加上至少一种有机溶剂(提取改性剂)的提取物；或g)所述提取物任何两种或更多种的任何组合。
PBI-05204(如本文和Addington的US 8187644B2(2012年5月29日授权)、Addington的US 7402325B2(2008年7月22日授权)、Addington等人的US8394434B2(2013年3月12日授权)中所述，其全部公开内容通过引用并入本文)包含强心苷(夹竹桃苷，OL)和三萜(齐墩果酸(OA)、熊果酸(UA)和桦木酸(BA))作为主要药理学活性组分。OL与全部三萜的摩尔比为约1:(10-96)。OA:UA:BA的摩尔比为约7.8:7.4:1。当基于等摩尔OL进行比较时，PBI-05204中的OA、UA和BA的组合增加了夹竹桃苷的抗病毒活性。PBI-04711是PBI-05204的级分，但其不含有强心苷(OL)。PBI-04711中的OA:UA:BA的摩尔比为约3:2.2:1。PBI-04711也具有抗病毒活性。因此，基于等摩尔含量的OL，含有OL、OA、UA、和BA的抗病毒组合物比含有OL作为唯一活性成分的组合物更有效。在一些实施方案中，单种三萜与夹竹桃苷的摩尔比范围如下：约2-8(OA):约2-8(UA):约0.1-1(BA):约0.5-1.5(OL)；或约3-6(OA):约3-6(UA):约0.3-8(BA):约0.7-1.2(OL)；或约4-5(OA):约4-5(UA):约0.4-0.7(BA):约0.9-1.1(OL)；或约4.6(OA):约4.4(UA):约0.6(BA):约1(OL)。
含有夹竹桃苷作为唯一抗病毒剂的抗病毒组合物在本发明的范围内。含有地高辛作为唯一抗病毒剂的抗病毒组合物在本发明的范围内。
含有夹竹桃苷和多种三萜作为抗病毒剂的抗病毒组合物在本发明的范围内。在一些实施方案中，抗病毒组合物含有夹竹桃苷、齐墩果酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)、熊果酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)、和桦木酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)。化合物的摩尔比如本文所述。
含有多种三萜作为主要活性成分(意味着不包含类固醇、强心苷和药理学活性组分)的抗病毒组合物也在本发明的范围内。如上所述，PBI-04711含有OA、UA和BA作为主要活性成分，并且其表现抗病毒活性。在一些实施方案中，基于三萜的抗病毒组合物包含OA、UA和BA，其在每次出现时各自独立地选自其游离酸形式、盐形式、氘化形式和衍生物形式。
PBI-01011是含有OA、UA和BA的、改善的基于三萜的抗病毒组合物，其中OA:UA:BA的摩尔比为约9-12:高达约2:高达约2、或约10:约1:约1、或约9-12:约0.1-2:约0.1-2、或约9-11:约0.5-1.5:约0.5-1.5、或约9.5-10.5:约0.75-1.25:约0.75-1.25、或约9.5-10.5:约0.8-1.2:约0.8-1.2、或约9.75-10.5:约0.9-1.1:约0.9-1.1。
在一些实施方案中，抗病毒组合物至少包含以本文所述的OA与UA的摩尔比存在的、齐墩果酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)和熊果酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)。OA以超过UA的大摩尔过量存在。
在一些实施方案中，抗病毒组合物至少包含以本文所述的OA与BA的摩尔比存在的、齐墩果酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)和桦木酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)。OA以超过BA的大摩尔过量存在。
在一些实施方案中，抗病毒组合物至少包含以本文所述的OA与UA对BA的摩尔比存在的、齐墩果酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)、熊果酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)和桦木酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)。OA以超过UA和BA两者的大摩尔过量存在。
在一些实施方案中，基于三萜的抗病毒组合物不包含强心苷。
通常，如下所述治疗具有沙粒病毒科感染、动脉炎病毒感染、丝状病毒科感染、黄病毒科感染(黄病毒属)、δ逆转录病毒属、冠状病毒科、副粘病毒科、正粘病毒科、或披膜病毒科感染的受试者。评价受试者来确定所述受试者是否被所述病毒感染。指示抗病毒组合物的施用。根据指示的给药方案向受试者施用初始剂量的抗病毒组合物一段时间(一个治疗期)。定期确定受试者的临床反应和治疗反应水平。如果治疗反应水平在一个剂量下过低，则根据预先确定的剂量递增计划来递增剂量直至在受试者中达到期望的治疗反应水平。按需继续对受试者进行抗病毒组合物的治疗。可按需调节剂量或给药方案直至患者达到期望的临床终点(一个或多个)，例如感染自身的中止、感染相关症状的减少、和/或感染的进展的减少。
如果临床医生打算用抗病毒组合物和一种或多种其他治疗剂的组合来治疗具有病毒感染的受试者，并且已知受试者具有的病毒感染对所述一种或多种其他治疗剂的治疗具有至少部分地治疗反应，则本方法发明包括：向有需要的受试者施用治疗相关剂量的抗病毒组合物和治疗相关剂量的所述一种或多种其他治疗剂，其中根据第一给药方案施用抗病毒组合物并且根据第二给药方案施用一种或多种其他治疗剂。在一些实施方案中，第一和第二给药方案是相同的。在一些实施方案中，第一和第二给药方案是不同的。
本发明的抗病毒组合物(一种或多种)可作为主要抗病毒疗法、辅助抗病毒疗法、或联合抗病毒疗法来施用。本发明的方法包括将抗病毒组合物与至少一种其他已知抗病毒组合物的分开施用或共同施用，意味着本发明的抗病毒组合物可在已知抗病毒组合物(化合物(一种或多种))或用于治疗病毒感染相关症状的组合物的施用之前、期间或之后施用。例如，用于治疗炎症、呕吐、恶心、头痛、发热、腹泻、恶心、荨麻疹、结膜炎、身体不适、肌肉痛、关节痛、癫痫、或麻痹的药物可与本发明的抗病毒组合物一起施用或分开施用。
一个或多个其他治疗剂可以以临床医生公认的治疗有效的剂量和根据给药方案或以临床医生公认的亚治疗有效的剂量施用。通过抗病毒组合物和一种或多种其他治疗剂的组合的施用来提供的临床受益和/或治疗效果可以是累加的或协同的，这种受益或效果的水平通过比较组合施用与单独的抗病毒组合物组分(一种或多种)以及一种或多种其他治疗剂的施用来确定。可以以美国食品药品监督管理局、世界卫生组织、欧洲药品管理局(E.M.E.A.)、药物管理局(TGA，澳大利亚)、泛美卫生组织(PAHO)、药品和医疗器械安全管理局(Medsafe，新西兰)或各种世界卫生部门推荐或描述的剂量和根据给药方案来施用一种或多种其他治疗剂。
可以包括在用于治疗病毒感染的本发明的抗病毒组合物中的示例性其他治疗剂包括抗逆转录病毒剂、α-干扰素(IFN-a)、齐多夫定(zidovudine)、拉米夫定(lamivudine)、环孢霉素A(cyclosporine A)、具有三氧化二砷的CHOP、丙戊酸钠、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤、一种或多种症状缓解药物、节制类固醇药物(steroid sparing drug)、皮质类固醇、环磷酰胺、免疫抑制剂、抗炎剂、Janus激酶抑制剂、托法替尼(tofacitinib)、钙调磷酸酶抑制剂、他克莫司(tacrolimus)、mTOR抑制剂、西罗莫司(sirolimus)、依维莫司(everolimus)、IMDH抑制剂、硫唑嘌呤、来氟米特(leflunomide)、霉酚酸酯(mycophenolate)、生物制剂、阿巴西普(abatacept)、阿达木单抗(adalimumab)、阿那白滞素(anakinra)、赛妥珠单抗(certolizumab)、依那西普(etanercept)、戈利木单抗(golimumab)、英利昔单抗(infliximab)、伊西贝单抗(ixekizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、苏金单抗(secukinumab)、托珠单抗(tocilizumab)、乌司奴单抗(ustekinumab)、维多珠单抗(vedolizumab)、单克隆抗体、巴利昔单抗(basiliximab)、达昔单抗(daclizumab)、多克隆抗体、核苷类似物、逆转录酶抑制剂、恩曲他滨(emtricitabine)、替比夫定(telbivudine)、阿巴卡韦(abacavir)、阿德福韦(adefovir)、地达诺辛(didanosine)、恩曲他滨(emtricitabine)、恩替卡韦(entecavir)、司他夫定(stavudine)、泰诺福韦(tenofovir)、阿奇霉素(azithromycin)、大环内酯型抗生素(macrolide-type antibiotic)、蛋白酶抑制剂、干扰素、免疫应答调节剂、mRNA合成抑制剂、蛋白质合成、抑制剂、噻唑化物(thiazolide)、CYP3A4抑制剂、杂环双胍、CCR5受体抑制剂、及其组合。研究的疗法还包括血浆置换和/或放射。针对特定病毒的抗体也可以施用于用本发明的抗病毒组合物治疗的受试者。可以将获得自第一病毒感染的幸存者的血液的血浆施用于具有相同类型的病毒感染的其他受试者，所述其他受试者也被施用本发明的抗病毒组合物。例如，可以将来自COVID-19感染幸存者的血浆施用于患有COVID-19感染的另一名受试者，所述另一名受试者也被施用本发明的抗病毒组合物。
实施例5提供了哺乳动物中寨卡病毒感染的治疗的示例性步骤。实施例12提供了哺乳动物中丝状病毒感染(埃博拉病毒、马尔堡病毒)的治疗的示例性步骤。图13提供了哺乳动物中黄病毒感染(黄热病、登革热、日本脑炎、西尼罗病毒、寨卡病毒、蜱媒脑炎、科萨努尔森林病、Alkhurma症、鄂木斯克出血热、波瓦生病毒感染)的治疗的示例性步骤。实施例25提供δ逆转录病毒属(HTLV-1)感染的治疗的示例性步骤。
存在于药物组合物中的抗病毒化合物(一种或多种)(三萜(一种或多种)、强心苷(一种或多种)，等)可以其未修饰形式、盐形式、衍生物形式或其组合存在。如本文所用，术语“衍生物”是指：a)与第一化学物质结构上相关并且理论上可衍生自其的化学物质；b)如果第一化合物的一个原子被另一个原子或原子团取代，则为由相似的第一化合物形成的化合物或可构象成由另一个第一化合物产生的化合物；c)由母体化合物衍生或获得的并且含有母体化合物的基本元素的化合物；或d)以一个或多个步骤从相似结构的第一化合物产生的化学化合物。例如，衍生物可包括其氘化形式、氧化形式、脱水的、不饱和的、聚合物共轭的或其糖基化形式，或可包括其酯、酰胺、内酯、同系物、醚、硫醚、氰基、氨基、烷基氨基、硫氢基、杂环、稠合杂环、聚合、聚乙二醇化、亚苄基、三唑基、哌嗪基或氘化形式。
如本文所用，除非另外指出，否则术语“夹竹桃苷”是指夹竹桃苷的所有已知形式。夹竹桃苷可以外消旋的、光学纯的或光学富集的形式存在。可从例如诸如AldridgeNursery(Atascosa,Texas)等商业植物供应商处获得夹竹桃植物材料。
可以如US 7,402,325、US 8394434、US 8187644、或PCT国际公开号WP2007/016176A2中所述制备超临界流体(SCF)提取物，其全部公开内容通过引用结合在此。可以在存在或不存在例如乙醇等改性剂(有机溶剂)的情况下，用超临界二氧化碳进行提取。
其他含有强心苷、特别是夹竹桃苷的提取物可通过各种不同的工艺制备。可通过Huseyin Ziya Ozel博士开发的工艺(美国专利号5,135,745)来制备提取物，其描述了用于制备热水提取物的步骤。据报道，水性提取物含有分子量在2KD至30KD变化的多种多糖、夹竹桃苷、夹竹桃甙元、奥多诺甙和夹竹桃它罗苷。据报道，多糖包括酸性均聚半乳糖醛酸或阿拉伯半乳糖醛酸。Selvaraj等人的美国专利号5,869,060公开了夹竹桃属物种的热水提取物及其生产方法，例如实施例2。然后冻干所得提取物来产生粉末。美国专利号6,565,897(Selvaraj等人的美国授权前公开号20020114852和PCT国际公开号WO 2000/016793)公开了用于制备基本上无菌的提取物的热水提取工艺。Erdemoglu等人(J.Ethnopharmacol.(2003)十一月.89(1),123-129)公开了基于其镇痛和抗炎活性，包括夹竹桃的植物的水性和乙醇提取物的比较结果。Adome等人(Afr.Health Sci.(2003)八月.3(2),77-86；乙醇提取物)、el-Shazly等人(J.Egypt Soc.Parasitol.(1996),八月.26(2),461-473；乙醇提取物)、Begum等人(Phytochemistry(1999)二月.50(3),435-438；甲醇提取物)、Zia等人(J.Ethnolpharmacol.(1995)十一月.49(1),33-39；甲醇提取物)、和Vlasenko等人(Farmatsiia.(1972)九月-十月.21(5),46-47；醇提取物)公开了欧洲夹竹桃的有机溶剂提取物。Singh等人的美国授权前专利申请公开号20040247660公开了用于癌症治疗的夹竹桃苷的蛋白质稳定的脂质体制剂(protein stabilized liposomal formulation)的制备。Singh等人的美国授权前专利申请公开号20050026849公开了含有环糊精的夹竹桃苷的水溶性制剂。Singh等人的美国授权前专利申请公开号20040082521公开了来自热水提取物的夹竹桃苷的蛋白质稳定的纳米颗粒制剂的制备。
夹竹桃苷也可以获得自源自根癌农杆菌转化的愈伤组织的上清液培养物的提取物(Ibrahim等人,“Stimulation of oleandrin production by combined Agrobacteriumtumefaciens mediated transformation and fungal elicitation in Nerium oleandercell cultures”in Enz.Microbial Techno.(2007),41(3),331-336,其全部公开内容通过引用并入本文)。根据本发明，可以使用土壤杆菌的热水、有机溶剂、水性有机溶剂、或超临界流体提取物。
夹竹桃苷也可以获得自夹竹桃体外微培养物的提取物，从而可以从SplendensGiganteum、Revanche或Alsace、或其他品种等夹竹桃品种的幼苗和/或茎尖开始茎段培养(Vila等人,“Micropropagation of Oleander(Nerium oleander L.)”in HortScience(2010),45(1),98-102,其全部公开内容通过引用并入本文)。根据本发明可以使用微量培养的夹竹桃的热水、有机溶剂、水性有机溶剂、或超临界流体提取物。
提取物的多糖和碳水化合物的含量也不同。相对于用葡萄糖制作的标准曲线，热水提取物含有407.3葡萄糖当量单位的碳水化合物，而SCF CO2提取物的分析发现了以低于定量限的非常低的水平发现的碳水化合物。然而，夹竹桃的热水提取物中的碳水化合物的量比SCF CO2提取物中的碳水化合物的量高至少100倍。SCF提取物的多糖含量可为0重量％、<0.5重量％、<0.1重量％、<0.05重量％、或<0.01重量％。在一些实施方案中，SCF提取物不包括在植物块的提取期间得到的多糖。
Figure BDA0002816516430000481
通过JEOL AccuTOF-DART质谱仪(JEOL USA,Peabody,MA,USA)上DART TOF-MS(实时飞行时间质谱仪中的直接分析，Direct Analysis in Real Time Time of FlightSpectrometry)来确定SCF CO2提取物和热水提取物的部分组成。
夹竹桃属物种或黄花夹竹桃属物种的SCF提取物是例如夹竹桃苷和三萜等药理学活性化合物的混合物。通过SCF工艺得到的提取物在环境温度下为基本上水不溶的、粘性半固体(在去除溶剂后)。SCF提取物包含许多具有各种不同水溶解度范围的不同组分。来自超临界流体工艺的提取物含有以重量计理论范围为0.9重量％至2.5重量％的夹竹桃苷、或1.7重量％至2.1重量％的夹竹桃苷、或1.7重量％至2.0重量％的夹竹桃苷。已得到包含不同量的夹竹桃苷的SCF提取物。在一个实施方案中，SCF提取物包含约2重量％的夹竹桃苷。与热水提取物相比，SCF提取物含有3-10倍更高浓度的夹竹桃苷。这由HPLC和LC/MS/MS(串联质谱)分析二者证实。
SCF提取物包含夹竹桃苷和三萜齐墩果酸、桦木酸和熊果酸以及任选地本文所述的其他组分。夹竹桃苷和三萜的含量可在批次之间不同；然而，变化程度不是过度的。例如，针对一批SCF提取物(PBI-05204)分析这四种组分，发现每种含有如下近似量。
Figure BDA0002816516430000491
WRT表示“相对于”。
相对于指示的值，各个组分的含量可以±25％、±20％、±15％、±10％或±5％变化。因此，SCF提取物中的夹竹桃苷的含量范围可为：每mg SCF提取物为20mg±5mg(其为20mg的±25％)。
夹竹桃苷、齐墩果酸、熊果酸、桦木酸及其衍生物也可购自Sigma-Aldrich(www.sigmaaldrich.com；St.Louis,MO,USA)。地高辛从HIKMA PharmaceuticalsInternational LTD(NDA N012648,酏剂,0.05mg/mL；片剂,0.125mg,0.25mg)、VistaPharmInc.(NDA A213000,酏剂,0.05mg/mL)、Sandoz Inc.(NDA A040481,注射液,0.25mg/mL)、West-Ward Pharmaceuticals International LTD(NDA A083391,注射液,0.25mg/mL)、Covis Pharma BV(NDA N009330,0.1mg/mL,0.25mg/mL)、Impax Laboratories(NDAA078556,片剂,0.125mg,0.25mg)、Jerome Stevens Pharmaceuticals Inc.(NDA A076268,片剂,0.125mg,0.25mg)、Mylan Pharmaceuticals Inc.(NDA A040282,片剂,0.125mg,0.25mg)、Sun Pharmaceutical Industries Inc.(NDA A076363,片剂,0.125mg,0.25mg)、Concordia Pharmaceuticals Inc.(NDA A020405,片剂,0.0625,0.125mg,0.1875mg,0.25mg,0.375mg,0.5mg,LANOXIN)、GlaxoSmithKline LLC(NDA 018118,胶囊,0.05mg,0.1mg,0.15mg,0.2mg,LANOXICAPS)市售取得。
如本文所用，单独命名的三萜可在每次出现时独立地选自其天然(未修饰、游离酸)形式、其盐形式、衍生物形式、前药形式、或其组合。含有氘化形式的三萜的组合物和采用氘化形式的三萜的方法也在本发明的范围内。
齐墩果酸衍生物、前药和盐在以下文献中公开：Gribble等人的US 20150011627A1(2015年1月8日公开)、Rong等人的US 20140343108 A1(2014年11月20日公开)、Xu等人的US 20140343064 A1(2014年11月20日公开)、Anderson等人的US 20140179928 A1(2014年6月26日公开)、Bender等人的US 20140100227 A1(2014年4月10日公开)、Jiang等人的US20140088188 A1(2014年3月27日公开)、Jiang等人的US 20140088163 A1(2014年3月27日公开)、Jiang等人的US 20140066408 A1(2014年3月6日公开)、Anderson等人的US20130317007 A1(2013年11月28日公开)、Gribble等人的US 20130303607 A1(2013年11月14日公开)、Anderson等人的US 20120245374(2012年9月27日公开)、Jiang等人的US20120238767 A1(2012年9月20日公开)、Shode等人的US 20120237629 A1(2012年9月20日公开)、Anderson等人的US 20120214814 A1(2012年8月23日公开)、Lee等人的US20120165279 A1(2012年6月28日公开)、Arntzen等人的US 20110294752 A1(2011年12月1日公开)、Majeed等人的US 20110091398 A1(2011年4月21日公开)、Arntzen等人的US20100189824 A1(2010年7月29日公开)、Jiang等人的US 20100048911 A1(2010年2月25日公开)、和Arntzen等人的US 20060073222 A1(2006年4月6日公开)，其全部公开内容通过引用结合在此。
熊果酸衍生物、前药和盐在以下文献中公开：Gribble等人的US 20150011627 A1(2015年1月8日公开)、Gribble等人的US 20130303607 A1(2013年11月14日公开)、Yoon等人的US 20150218206 A1(2015年8月6日公开)、Fritsche等人的US 6824811(2004年11月30日授权)、Ochiai等人的US 7718635(2010年5月8日授权)、Lin等人的US 8729055(2014年5月20日授权)、和Yoon等人的US 9120839(2015年9月1日授权)，其全部公开内容通过引用并入本文。
桦木酸衍生物、前药和盐在以下文献中公开：Gribble等人的US 20150011627 A1(2015年1月8日公开)、Gribble等人的US 20130303607 A1(2013年11月14日公开)、Shode等人的US 20120237629 A1(2012年9月20日公开)、Regueiro-Ren等人的US 20170204133 A1(2017年7月20日公开)、Nitz等人的US 20170096446 A1(2017年4月6日公开)、Parthasaradhi Reddy等人的US 20150337004 A1(2015年11月26日公开)、ParthasaradhiReddy等人的US 20150119373 A1(2015年4月30日公开)、Yan等人的US 20140296546 A1(2014年10月2日公开)、Swidorski等人的US 20140243298 A1(2014年8月28日公开)、Parthasaradhi Reddy等人的US 20140221328 A1(2014年8月7日公开)、Leunis等人的US20140066416 A1(2014年3月6日公开)、Durst等人的US 20130065868A1(2013年3月14日公开)、Regueiro-Ren等人的US 20130029954 A1(2013年1月31日公开)、Zhang等人的US20120302530 A1(2012年11月29日公开)、Power等人的US 20120214775 A1(2012年8月23日公开)、Honda等人的US 20120101149 A1(2012年4月26日公开)、Bullock等人的US20110224182(2011年9月15日公开)、Hemp等人的US 20110313191 A1(2011年12月22日公开)、Pichette等人的US 20110224159 A1(2011年9月15日公开)、Parthasaradhi Reddy等人的US 20110218204(2011年9月8日公开)、Safe等人的US 20090203661 A1(2009年8月13日公开)、Krasutsky等人的US 20090131714 A1(2009年5月21日公开)、Krasutsky等人的US20090076290(2009年3月19日公开)、Leunis等人的US 20090068257 A1(2009年3月12日公开)、Mukherjee等人的US 20080293682(2008年11月27日公开)、Pezzuto等人的US20070072835 A1(2007年3月29日公开)、Jansen等人的US 20060252733 A1(2006年11月9日公开)、和O’Neill等人的US 2006025274 A1(2006年11月9日公开)，其全部公开内容通过引用并入本文。
抗病毒组合物可以以任何合适的药学上可接受的剂型配制。肠胃外、耳、眼、鼻、可吸入的、颊部、舌下、肠内、局部的、口服、经口、以及可注射剂型是特别有用的。特定剂型包括固体或液体剂型。示例性合适的剂型包括片剂、胶囊、丸剂、囊片、锭剂、冲剂、溶液、混悬剂、分散剂、小瓶、袋、瓶、可注射液体、i.v.(静脉内)、i.m.(肌肉内)或i.p.(腹腔内)可施用的液体和药学领域普通技术人员已知的其他此类剂型。
由于病毒感染可同时影响多个器官并引起多器官衰竭，通过超过一种途径施用组合物是有利的。例如，已知COVID-19影响肺、心脏、胃肠道、和大脑。因此，含有强心苷的组合物可以有利地施用作为可吸入组合物和经口组合物、舌下组合物和经口组合物、可吸入组合物和舌下组合物、可吸入组合物和肠胃外组合物、舌下组合物和肠胃外组合物、经口组合物和肠胃外组合物、或其他这样的组合。
可通过将抗病毒组合物和药学上可接受的赋形剂混合来制备含有抗病毒组合物的合适的剂型，如本文或以下文献中所述：Pi等人(“Ursolic acid nanocrystals fordissolution rate and bioavailability enhancement:influence of differentparticle size”in Curr.Drug Deliv.(Mar 2016),13(8),1358-1366),Yang等人(“Self-microemulsifying drug delivery system for improved oral bioavailability ofoleanolic acid:design and evaluation”in Int.J.Nanomed.(2013),8(1),2917-2926),Li等人(Development and evaluation of optimized sucrose ester stabilizedoleanolic acid nanosuspensions prepared by wet ball milling with design ofexperiments”in Biol.Pharm.Bull.(2014),37(6),926-937),Zhang等人(“Enhancementof oral bioavailability of triterpene through lipid nanospheres:preparation,characterization,and absorption evaluation”in J.Pharm.Sci.(June 2014),103(6),1711-1719),Godugu等人(“Approaches to improve the oral bioavailability andeffects of novel anticancer drugs berberine and betulinic acid”in PLoS One(Mar 2014),9(3):e89919),Zhao等人(“Preparation and characterization of betulinnanoparticles for oral hypoglycemic drug by antisolvent precipitation”in DrugDeliv.(Sep 2014),21(6),467-479),Yang等人(“Physicochemical properties and oralbioavailability of ursolic acid nanoparticles using supercritical anti-solvent(SAS)process”in Food Chem.(May 2012),132(1),319-325),Cao等人(“Ethyleneglycol-linked amino acid diester prodrugs of oleanolic acid for PEPT1-mediated transport:synthesis,intestinal permeability and pharmacokinetics”inMol.Pharm.(Aug.2012),9(8),2127-2135),Li等人(“Formulation,biological andpharmacokinetic studies of sucrose ester-stabilized nanosuspensions ofoleanolic acid”in Pharm.Res.(Aug2011),28(8),2020-2033),Tong等人(“Spray freezedrying with polyvinylpyrrolidone and sodium caprate for improved dissolutionand oral bioavailablity of oleanolic acid,a BCS Class IV compound”inInt.J.Pharm.(Feb 2011),404(1-2),148-158),Xi等人(Formulation development andbioavailability evaluation of a self-nanoemulsified drug delivery system ofoleanolic acid”in AAPS PharmSciTech(2009),10(1),172-182),Chen等人(“Oleanolicacid nanosuspensions:preparation,in-vitro characterization and enhancedhepatoprotective effect”in J.Pharm.Pharmacol.(Feb 2005),57(2),259-264),其全部公开内容通过引用并入本文。
还可根据Addington的US 8187644 B2(2012年5月29日授权)、Addington的US7402325 B2(2008年7月22日授权)、Addington等人的US 8394434 B2(2013年3月12日授权)来制备合适的剂型，其全部内容通过引用结合在此。还可如实施例13-15中所述制备合适的剂型。
特别考虑了抗病毒化合物(强心苷、三萜或其组合)的有效量或治疗相关量。术语“有效量”应理解为预期药学有效量。药学有效量是足以用于所需或期望的治疗反应的活性成分的量(amount)或量(quantity)，或换言之，当向患者施用时足以产生可觉察的生物反应的量。可觉察的生物反应可作为活性物质的单一或多个剂量的施用结果而产生。一个剂量可包括一种或多种剂型。应理解的是，任何患者的特定剂量水平将取决于多种因素，包括治疗的适应症、适应症的严重程度、患者健康、年龄、性别、体重、饮食、药理反应、采用的特定剂型、和其他此类因素。
口服施用的期望剂量为至多5个剂型，尽管少至1个和多至10个剂型可作为单一剂量施用。示例性剂型可包括每剂型0.01-100mg或0.01-100μg的抗病毒组合物，对于每剂量总计0.1至500mg(1至10剂量水平)。将根据可预先确定的和/或定制的以在受试者中实现特定治疗反应或临床受益的给药方案来施用剂量。
强心苷可以以足以向受试者提供约20至约100μg、约12μg至约300μg、或约12μg至约120μg的初始剂量的夹竹桃苷的量存在于剂型中。剂型可包含约20至约100μg的夹竹桃苷、约0.01μg至约100mg或约0.01μg至约100μg夹竹桃苷、夹竹桃苷提取物或含有夹竹桃苷的欧洲夹竹桃的提取物。
抗病毒剂可包含在口服剂型中。剂型的一些实施方案为没有肠溶衣的并且在0.5至1小时或更短的时间内释放其携带的抗病毒组合物。剂型的一些实施方案为有肠溶衣的并且例如从空肠、回肠、小肠、和/或大肠(结肠)等胃的下游释放其携带的抗病毒组合物。有肠溶衣的剂型将在口服施用后1-10小时内将抗病毒组合物释放至体循环。
抗病毒组合物可以包含在快速释放、立即释放、受控释放、缓释、延长释放、延迟释放、突释、连续释放、缓慢释放、或脉冲释放剂型中、或在表现这些释放类型的两种或更多种的剂型中。来自剂型的抗病毒组合物的释放曲线可为零阶、伪零阶、一阶、伪一阶或S型释放曲线。在其中施用抗病毒组合物的受试者中的三萜的血浆浓度曲线可表现一个或多个极大值(maxima)。
基于人类临床数据，预期夹竹桃苷的施用剂量的50％至75％将是口服生物可利用的，因此提供每剂型约10至约20μg、约20至约40μg、约30至约50μg、约40至约60μg、约50至约75μg、约75至约100μg的夹竹桃苷。考虑到成年人的平均血容量为5升，预期的夹竹桃苷的血浆浓度将在约0.05至约2ng/ml、约0.005至约10ng/ml、约0.005至约8ng/ml、约0.01至约7ng/ml、约0.02至约7ng/ml、约0.03至约6ng/ml、约0.04至约5ng/ml、或约0.05至约2.5ng/ml的范围内。存在于SCF提取物中的夹竹桃苷的推荐日剂量通常为约0.2μg至约4.5μg/kg体重，一日两次。夹竹桃苷的剂量可为约0.2μg至约1μg/kg体重/天、约0.5至约1.0μg/kg体重/天、约0.75至约1.5μg/kg体重/天、约1.5至约2.52μg/kg体重/天、约2.5至约3.0μg/kg体重/天、约3.0至约4.0μg/kg体重/天或约3.5至4.5μg夹竹桃苷/kg体重/天。夹竹桃苷的最大耐受剂量可为约3.5μg/kg体重/天至约4.0μg/kg体重/天。最小有效剂量可为约0.5μg/天、约1μg/天、约1.5μg/天、约1.8μg/天、约2μg/天、或约5μg/天。
由于存在的三萜的组合以及它们存在时的摩尔比，可以以低至高剂量施用抗病毒组合物。用于人的治疗有效剂量为约100-1000mg或约100-1000μg的抗病毒组合物/Kg体重。可以在24小时内高达10次施用这样的剂量。以下指定其他合适的剂量范围。
Figure BDA0002816516430000551
所有值为近似的，意味着“约”指定值。
应注意的是，本文化合物在本发明的组合物或制剂中可具有一种或多种功能。例如，化合物可用作表面活性剂和水混溶性溶剂二者或用作表面活性剂和水不混溶性溶剂二者。
液体组合物可包含一种或多种药学上可接受的液体载体。液体载体可为水性、非水性、极性、非极性、和/或有机载体。液体载体包括，例如但不限于，水混溶性溶剂、水不混溶性溶剂、水、缓冲液及其混合物。
如本文所用，可交换使用的术语“水溶性溶剂”或“水混溶性溶剂”是指与水不形成两相混合物的有机液体、或充分溶于水来提供含有至少5％的溶剂且无液相分离的水性溶剂混合物的有机液体。溶剂适用于施用给人类或动物。示例性水溶性溶剂包括，例如但不限于，PEG(聚(乙二醇))、PEG 400(具有约400的分子量的聚(乙二醇))、乙醇、丙酮、烷醇、醇、乙醚、丙二醇、丙三醇、三乙酸甘油酯、聚(丙二醇)、PVP(聚(乙烯基吡咯烷酮))、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、吡啶、丙醇、N-甲基乙酰胺、丁醇、soluphor(2-吡咯烷酮)、pharmasolve(N-甲基-2-吡咯烷酮)。
如本文所用，可交换使用的术语“水不溶性溶剂”或“水不混溶性溶剂”是指其与水形成两相混合物的有机液体、或当水中的溶剂的浓度超过5％时形成相分离的有机液体。溶剂适用于施用给人类或者动物。示例性水不溶性溶剂包括，例如但不限于，中/长链甘油三酯、油、蓖麻油、玉米油、维生素E、维生素E衍生物、油酸、脂肪酸、橄榄油、softisan 645(二甘油辛酸酯/癸酸酯/硬脂酸酯/羟硬脂酸酯己二酸酯)、miglyol、captex(Captex 350：甘油三辛酸酯/癸酸酯/月桂酸甘油三酯；Captex 355：甘油三辛酸酯/癸酸甘油三酯；Captex355EP/NF：甘油三辛酸酯/癸酸中链甘油三酯)。
在“人用药品注册技术要求国际协调会议(ICH)工业指南Q3C杂质：残留溶剂(International Conference on Harmonisation of Technical Requirements forRegistration of Pharmaceuticals for Human Use(ICH)guidance for industry Q3CImpurities:Residual Solvents)”(1997)中列出合适的溶剂，这对在药物中多少量的残留溶剂被视为安全的提出了建议。示例性溶剂被列为2类或3类溶剂。3类溶剂包括，例如，乙酸、丙酮、苯甲醚、1-丁醇、2-丁醇、乙酸丁酯、叔丁基甲基醚、异丙基苯、乙醇、乙醚、乙酸乙酯、甲酸乙酯、甲酸、庚烷、乙酸异丁酯、乙酸异丙酯、乙酸甲酯、甲基-1-丁醇、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、2-甲基-1-丙醇、戊烷、1-戊醇、1-丙醇、2-丙醇、或乙酸丙酯。
可在本发明中用作水不混溶性溶剂的其他材料包括：Captex 100：丙二醇二癸酸酯；Captex 200：丙二醇二辛酸酯/二癸酸酯；Captex 200P：丙二醇二辛酸酯/二癸酸酯；丙二醇二辛酸癸酸酯(Propylene Glycol Dicaprylocaprate)；Captex 300：甘油三辛酸酯/癸酸酯；Captex 300EP/NF：甘油三辛酸酯/癸酸中链甘油三酯；Captex 350：甘油三辛酸酯/癸酸酯/月桂酸酯；Captex 355：甘油三辛酸酯/癸酸酯；Captex 355EP/NF：甘油三辛酸酯/癸酸中链甘油三酯；Captex 500：三乙酸甘油酯；Captex 500P：三乙酸甘油酯(医药级)；Captex 800：丙二醇二(2-乙基己酸酯)；Captex 810D：甘油三辛酸酯/癸酸酯/亚油酸酯；Captex 1000：甘油三癸酸酯；Captex CA：中链甘油三酯；Captex MCT-170：中链甘油三酯；Capmul GMO：甘油单油酸酯；Capmul GMO-50EP/NF：甘油单油酸酯；Capmul MCM：中链甘油单酯&中链甘油二酯(Medium Chain Mono-&Diglycerides)；Capmul MCM C8：甘油单辛酸酯；Capmul MCM C10：甘油单癸酸酯；Capmul PG-8：丙二醇单辛酸酯；Capmul PG-12：丙二醇单月桂酸酯；Caprol 10G10O：十油酸十甘油酯；Caprol 3GO：三聚甘油单油酸酯；Caprol ET：混合的脂肪酸的聚甘油酯；Caprol MPGO：六聚甘油二油酸酯；Caprol PGE 860：十聚甘油单、二油酸酯(Decaglycerol Mono-,Dioleate)。
如本文所用，“表面活性剂”是指含有极性或带电的亲水性部分以及非极性疏水性(亲脂性)部分的化合物；即，表面活性剂是两亲性的。术语表面活性剂可指一种化合物或多种化合物的混合物。表面活性剂可以是增溶剂、乳化剂、或分散剂。表面活性剂可为亲水性的或疏水性的。
亲水性表面活性剂可为任何适用于药物组合物的亲水性表面活性剂。这样的表面活性剂可为阴离子型、阳离子型、两性离子型或非离子型，尽管目前优选非离子型亲水性表面活性剂。如上所述，这些非离子型亲水性表面活性剂通常将具有大于约10的HLB值。亲水性表面活性剂的混合物也在本发明的范围内。
类似地，疏水性表面活性剂可为任何适用于药物组合物的疏水性表面活性剂。通常，合适的疏水性表面活性剂将具有小于约10的HLB值。疏水性表面活性剂的混合物也在本发明的范围内。
其他合适的增溶剂的实例包括：醇类和多元醇类，例如乙醇、异丙醇、丁醇、苯甲醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇及其异构体、甘油、季戊四醇、山梨醇、甘露醇、卡必醇(transcutol)、异山梨醇二甲基醚、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、羟丙基甲基纤维素及其他纤维素衍生物、环糊精及环糊精衍生物；具有约200至约6000平均分子量的聚乙二醇的醚类，例如四氢糠醇聚乙二醇醚(三缩四乙二醇，可商购自BASF，商品名为Tetraglycol)或甲氧基聚乙二醇(Union Carbide)；酰胺类，例如2-吡咯烷酮、2-哌啶酮、己内酰胺、N-烷基吡咯烷酮、N-羟基烷基吡咯烷酮、N-烷基哌啶酮、N-烷基己内酰胺、二甲基乙酰胺、和聚乙烯吡咯烷酮；酯类，例如丙酸乙酯、柠檬酸三丁酯、乙酰柠檬酸三乙酯、乙酰柠檬酸三丁酯、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、三乙酸甘油酯、丙二醇单乙酸酯、丙二醇二乙酸酯、己内酯及其异构体、戊内酯及其异构体、丁内酯及其异构体；以及其他本领域已知的增溶剂，例如二甲基乙酰胺、异山梨醇二甲基醚(Arlasolve DMI(ICI))、N-甲基吡咯烷酮(Pharmasolve(ISP))、单辛酸甘油酯、二甘醇单乙醚(可购自Gattefosse，商品名Transcutol)、和水。增溶剂的混合物也在本发明的范围内。
除非另外指出，本文提及的化合物可容易地从标准商业来源获得。
尽管不是必需的，组合物或制剂可进一步包括一种或多种螯合剂、一种或多种防腐剂、一种或多种抗氧化剂、一种或多种吸附剂、一种或多种酸化剂、一种或多种碱化剂、一种或多种消泡剂、一种或多种缓冲剂、一种或多种着色剂、一种或多种电解质、一种或多种盐、一种或多种稳定剂、一种或多种张力调节剂(tonicity modifier)、一种或多种稀释剂、或其组合。
本发明的组合物还可包括油类，例如固定油、花生油、芝麻油、棉籽油、玉米油和橄榄油；脂肪酸类，例如油酸、硬脂酸和异硬脂酸；以及脂肪酸酯类，例如油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、脂肪酸甘油酯和乙酰化脂肪酸甘油酯。组合物还可包括醇类，例如乙醇、异丙醇、十六烷醇、甘油和丙二醇；甘油缩酮类，例如2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醇；醚类，例如聚(乙二醇)450；石油烃类，例如矿物油和凡士林；水；药学上适合的表面活性剂、悬浮剂或乳化剂；或其混合物。
应理解的是，用于药物制剂领域的化合物通常具有多种功能或目的。因此，如果本文命名的化合物仅被提及一次或被用于定义一个以上的本文的术语，其目的或功能不应解释为仅限于所声称的目的(一个或多个)或功能(一种或多种)。
制剂的一种或多种组分可以以其游离碱、游离酸或者药学上或分析上可接受的盐形式存在。如本文所用，“药学上或分析上可接受的盐”是指已经按需要通过将其与酸反应来形成离子键对而改性的化合物。可接受的盐的实例包括由例如无毒无机或有机酸形成的常规无毒盐。适合的无毒盐类包括源自如盐酸、氢溴酸、硫酸、磺酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等无机酸的那些，和本领域普通技术人员已知的其他那些。由有机酸制备的盐，和本领域普通技术人员已知的其他那些，所述有机酸为例如氨基酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、帕莫酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲基磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙基磺酸。另一方面，在药学上活性成分具有酸性官能团的情况下，添加药学上可接受的碱来形成药学上可接受的盐。在Remington′s Pharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing Company,Easton,PA,1985,p.1418中发现其他合适的盐的列表，相关公开内容通过引用结合在此。
本文采用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适用于与人类和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应、或任何其他问题或并发症，与合理的受益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物、和/或剂型。
可以通过制药工厂中公知的任何常规手段来制造剂型。可通过在容器中提供至少一种液体载体和抗病毒组合物来制备液体剂型。一种或多种其他赋形剂可包含在液体剂型中。可通过提供至少一种固体载体和抗病毒组合物来制备固体剂型。一种或多种其他赋形剂可包含在固体剂型中。
可以使用常规包装设备和材料来包装剂型。其可包含在包装、瓶、小瓶、袋、注射器、包膜(envelope)、小包(packet)、泡罩包装、盒、安瓿瓶、或其他这样的容器中。
本发明的组合物可包含在任何剂型中。特定剂型包括固体或液体剂型。示例性合适的剂型包括片剂、胶囊、丸剂、囊片、锭剂、冲剂、和药学领域普通技术人员已知的其他这样的剂型。
鉴于以上描述和以下实施例，本领域普通技术人员将能够实施所要求保护的本发明而无需过度试验。参考以下实施例将更好地了解前述内容，这些实施例详述了制备本发明的实施方案的特定过程。对于这些实施例做出的所有参考都是为了说明的目的。以下实施例不应被认为是穷举的，仅说明了本发明所预期的许多实施方案的少数。
Vero CCL81细胞用于预防和治疗试验(ATCC，Manassas，VA)。在Vineet Menachery(UTMB，Galveston，TX)惠赠的Vero E6细胞中进行噬斑测定。将细胞维持在具有5％CO2的37℃培养箱中。利用补充有5％胎牛血清(FBS)(Atlanta Biologicals，Lawrenceville，GA)和1％青霉素/链霉素(Gibco，NY)的Dulbecco改良Eagle培养基(Gibco,Grand Island,NY)增殖细胞。维持培养基将FBS降低到2％，但在其他方面相同。SARS-CoV-2，USA_WA1/2020株(Genbank登录号MT020880)由世界新兴病毒和虫媒参考中心(World Reference Centerfor Emerging Viruses and Arboviruses)提供。所有研究均使用了SARS-CoV-2的NextGen测序的Vero第4代储备。
实施例1
粉末状夹竹桃叶的超临界流体提取
方法A.用二氧化碳
通过收获、清洗、并干燥夹竹桃叶材料，然后将夹竹桃叶材料通过例如美国专利号5,236,132、5,598,979、6,517,015、和6,715,705中所述的那些等的粉碎和脱水设备，来制备粉末状夹竹桃叶。使用的起始材料的重量为3.94kg。
在提取器装置中、在300bar(30MPa，4351psi)的压力和50℃(122℉)的温度下，将起始材料与纯CO2组合。使用了总计197kg的CO2，以达到50:1的溶剂与原材料比。然后，使CO2和原材料的混合物通过分离器装置，其改变混合物的压力和温度并将提取物与二氧化碳分离。
获得具有良好香味(fragrance)的褐色的、胶黏的(sticky)、粘稠(viscous)材料的提取物(65g)。颜色可能是由于叶绿素和其他残留的发色化合物所导致的。为了确定准确的产率，用丙酮冲洗管和分离器，并且蒸发丙酮来得到另外9g的提取物。总提取量为74g。基于起始材料的重量，提取物的产率为1.88％。使用高压液相色谱法和质谱法计算的提取物中的夹竹桃苷的含量为560.1mg、或产率为0.76％。
方法B.用二氧化碳和乙醇的混合物
通过收获、清洗、并干燥夹竹桃叶材料，然后将夹竹桃叶材料通过例如美国专利号5,236,132、5,598,979、6,517,015、和6,715,705中所述的那些等的粉碎和脱水设备，来制备粉末状夹竹桃叶。使用的起始材料的重量为3.85kg。
在提取器装置中、在280bar(28MPa，4061psi)的压力和50℃(122℉)的温度下，将起始材料与纯CO2以及作为改性剂的5％乙醇组合。使用了总计160kg的CO2和8kg的乙醇，以达到43.6:1的溶剂与原材料比。然后，将CO2、乙醇和原材料的混合物通过分离器装置，其改变混合物的压力和温度并且将提取物与二氧化碳分离。
去除乙醇后得到为明显含有一些叶绿素的深绿色、胶黏的、粘稠块的提取物(207g)。基于起始材料的重量，提取物的产率为5.38％。使用高压液相色谱法和质谱法计算的提取物中的夹竹桃苷的含量为1.89g、或产率为0.91％。
实施例2
粉末状夹竹桃叶的热水提取物。
(比较例)
通常使用热水提取以从夹竹桃叶中提取夹竹桃苷和其他活性组分。热水提取工艺的实例可在美国专利号5,135,745和5,869,060中找到。
使用5g粉末状夹竹桃叶来进行热水提取。向粉末状夹竹桃叶添加10体积的沸水(按夹竹桃起始材料的重量计)，并持续搅拌混合物6小时。然后过滤混合物并收集叶残留物，在相同条件下再提取一次。合并滤液并冻干。提取物的外观为褐色。干燥的提取物材料的重量为约1.44g。在水中溶解34.21mg的提取物材料并使用高压液相色谱法和质谱法进行夹竹桃苷含量分析。确定夹竹桃苷的量为3.68mg。基于提取物的量，夹竹桃苷的产率计算为0.26％。
实施例3
药物组合物的制备。
方法A.基于Cremophor的药物递送系统
以下成分以所示量提供。
[媒介物#1(LN2005-055-035)
试剂名称 功能 制剂的百分比(％w/w)
抗病毒组合物 活性剂 3.7
维生素E 抗氧化剂 0.1
Labrasol 表面活性剂 9.2
乙醇 共溶剂 9.6
Cremophor EL 表面活性剂 62.6
Cremophor RH40 表面活性剂 14.7
将赋形剂分配至广口瓶中并在60℃下在New Brunswick Scientific C24KC冷冻培养箱摇床(Refrigerated Incubator shaker)中摇动24小时以确保均匀。然后拉出样品并目视检查是否溶解。24小时后，对于所有制剂，赋形剂和抗病毒组合物均全部溶解。
方法B.基于GMO/Cremophor的药物递送系统
以下成分以所示量提供。
媒介物#2(LN2005-055-045)
试剂名称 功能 制剂的百分比(％w/w)
抗病毒组合物 活性剂 4.7
维生素E 抗氧化剂 0.1
Labrasol 表面活性剂 8.5
乙醇 共溶剂 7.6
Cremophor EL 表面活性剂 56.1
甘油单油酸酯 表面活性剂 23.2
遵循方法A的步骤。
方法C.基于Labrasol的药物递送系统
以下成分以所示量提供。
媒介物#3(LN2005-055-047)
试剂名称 功能 制剂的百分比(％w/w)
抗病毒组合物 活性剂 3.7
维生素E 抗氧化剂 0.1
Labrasol 表面活性剂 86.6
乙醇 共溶剂 9.6
遵循方法A的步骤。
方法D.基于维生素E-TPGS的胶束形成系统以下成分以所示量提供。
Figure BDA0002816516430000631
遵循方法A的步骤。
方法E.多组分药物递送系统
以下成分以所示量提供。
组分 重量(g) 重量％(w/w)
维生素E 10.0 1.0
Cremophor ELP 580.4 55.9
Labrasol 89.0 8.6
甘油单油酸酯 241.0 23.2
乙醇 80.0 7.7
抗病毒组合物 38.5 3.7
总计 1038.9 100
遵循方法A的步骤。
方法F.多组分药物递送系统
以下成分以所示的包含在胶囊中的量提供。
Figure BDA0002816516430000641
遵循方法A的步骤。
实施例4
肠溶胶囊的制备
步骤I：充液胶囊的制备
用实施例3的液体组合物填充硬明胶胶囊(50只，00尺寸)。将这些胶囊手动填充800mg的制剂，然后用50％乙醇/50％水溶液手动密封。然后用以指示量含有以下成分的22％明胶溶液手动捆扎这些胶囊。
成分 重量(g)
明胶 140.0
聚山梨醇酯80 6.0
水 454.0
总计 650.0
充分混合明胶溶液并溶胀1-2小时。溶胀期后，盖紧溶液并置于55℃烘箱中使其液化。一旦全部明胶溶液变为液体，进行捆扎(banding)。
使用尖圆头3/0绘画画笔将溶胶溶液涂在胶囊上。使用Shionogi提供的捆扎工具。捆扎后，在环境条件下保持胶囊12小时以使捆扎固化。
步骤II：充液胶囊的包衣
由下表中列出的成分制备包衣分散液。
成分 重量％ 固体％ 固体(g) g/批
Eudragit L30D55 40.4 60.5 76.5 254.9
TEC 1.8 9.0 11.4 11.4
AlTalc 500V 6.1 30.5 38.5 38.5
水 51.7 na na 326.2
总计 100.0 100.0 126.4 631.0
如果使用根据步骤I的捆扎的胶囊，将分散液以20.0mg/cm2的涂覆水平施涂至胶囊。以下条件用于包衣胶囊。
参数 设置
包衣设备 Vector LDCS-3
批量 500g
进气温度 40℃
排气温度 27-30℃
进气量 20-25CFM
包衣锅转速(Pan Speed) 20rpm
泵速 9rpm(3.5至4.0g/min)
喷嘴压力 15psi
喷嘴直径 1.0mm
与平板床(tablet bed)的距离* 2-3in
*设置喷雾喷嘴使得喷嘴和喷雾通路均在进气流路的下方。
实施例5
受试者中寨卡病毒感染的治疗
方法A.抗病毒组合物疗法
对呈现出寨卡病毒感染的受试者给予抗病毒组合物，并且根据指定的给药方案向受试者施用治疗相关剂量一段时间。定期确定受试者的治疗反应水平。可通过确定受试者血液或血浆中的寨卡病毒滴度来确定治疗反应水平。如果一个剂量下的治疗反应水平过低，则根据预先确定的剂量递增计划来递增剂量直至在受试者中达到期望的治疗反应水平。按需继续对受试者进行抗病毒组合物的治疗，并且可按需调节剂量或给药方案直至患者达到期望的临床终点。
方法B.组合疗法：抗病毒组合物与其它药剂
除了向受试者指示并施用一种或多种其他用于治疗Zika病毒感染或其症状的治疗剂之外，遵循上述方法A。于是，一种或多种其他治疗剂可以在抗病毒组合物之前、之后或与其一起施用。也可进行一种或多种其他治疗剂的剂量递增(或递减)。
实施例6
针对寨卡病毒感染的抗病毒活性的体外评价
方法A.纯化合物
在强心苷的存在下，以0.2的MOI(感染复数)用ZIKV(寨卡病毒PRVABC59株；ATCCVR-1843；https://www.atcc.org/Products/All/VR-1843.aspx)感染Vero E6细胞(也称为Vero C1008细胞，ATTC No.CRL-1586；https://www.atcc.org/Products/All/CRL-1586.aspx)。用病毒和化合物孵育细胞1小时，其后丢弃接种物和化合物。给予细胞新鲜培养基并孵育48小时，其后用福尔马林固定并对于ZIKV感染染色。描述了由闪烁扫描法确定夹竹桃苷(图1A)和地高辛(图1B)的代表性感染率。在相同条件下评价其他化合物，并且它们显示出针对寨卡病毒的非常不同程度的抗病毒活性。
方法B.提取物形式的化合物
除了将提取物的量归一化为提取物中目标化合物的量之外，如方法A中详述地评价含有待检测的目标化合物的提取物。例如，含有2重量％的夹竹桃苷的提取物含有20μg的夹竹桃苷/1mg提取物。因此，如果用于评价的夹竹桃苷的预期量为20μg，则1mg的提取物将用于测定。
实施例7
含有抗病毒组合物的片剂的制备
混合3％Syloid 244FP和97％微晶纤维素(MCC)的初始制片混合物。然后，通过湿法造粒将根据实施例3制备的组合物现有批次混入Syloid/MCC混合物中。该混合物在下表中标记为“初始制片混合物”。颗粒外添加另外的MCC来增加压缩性。向初始制片混合物的该添加标记为"颗粒外添加"。来自颗粒外添加的所得混合物与"最终制片混合物"为相同组合物。
组分 重量(g) 重量％(w/w)
初始制片混合物
微晶纤维素 48.5 74.2
胶态二氧化硅/Syloid 244FP 1.5 2.3
来自实施例3的制剂 15.351 23.5
总计 65.351 100.0
颗粒外添加
组分 重量(g) 重量％(w/w)
初始制片混合物 2.5 50.0
微晶纤维素 2.5 50.0
总计 5 100.0
最终制片混合物：
缩略的
组分 重量(g) 重量％(w/w)
微晶纤维素 4.36 87.11
胶态二氧化硅/Syloid 244FP 0.06 1.15
来自实施例3的制剂 0.59 11.75
总计 5.00 100
最终制片混合物：
详细的
组分 重量(g) 重量％(w/w)
微晶纤维素 4.36 87.11
胶态二氧化硅/Syloid 244FP 0.06 1.15
维生素E 0.01 0.11
Cremophor ELP 0.33 6.56
Labrasol 0.05 1.01
甘油单油酸酯 0.14 2.72
乙醇 0.05 0.90
SCF提取物 0.02 0.44
总计 5.00 100.00
Syloid 244FP是由Grace Davison制造的胶态二氧化硅。胶态二氧化硅通常用于提供各种功能，例如吸附剂、助流剂、和片剂崩解剂。选择Syloid 244FP因其在油中吸收3倍其重量的能力且具有5.5微米的粒径。
实施例8
含有夹竹桃苷的溶液的HPLC分析
使用以下条件在HPLC(Waters)中分析样品(夹竹桃苷标准，SCF提取物和热水提取物)：对称(Symmetry)C18柱(5.0μm，150×4.6mm I.D.；Waters)；MeOH:水＝54:46(v/v)的流动相以及1.0ml/min的流速。检测波长设定为217nm。通过在固定量的HPLC溶剂中溶解化合物或提取物来制备样品以实现近似目标浓度的夹竹桃苷。通过使用内标物确定夹竹桃苷的保留时间。可通过使用内标物形成信号响应曲线来确定/校正夹竹桃苷的浓度。
实施例9
药物组合物的制备
可通过任何以下方法来制备本发明的药物组合物。可以在湿或干燥条件下进行混合。在制备期间，可压制、干燥或压制并干燥药物组合物。药物组合物可被分配至剂型中。
方法A.
将至少一种药物赋形剂与本文公开的至少一种抗病毒化合物混合。
方法B.
将至少一种药物赋形剂与本文公开的至少两种抗病毒化合物混合。
方法C.
将至少一种药物赋形剂与本文公开的至少一种强心苷混合。
方法D.
将至少一种药物赋形剂与本文公开的至少两种三萜混合。
方法E.
将至少一种药物赋形剂与本文公开的至少一种强心苷和本文公开的至少两种三萜混合。
方法D.
将至少一种药物赋形剂与本文公开的至少三种三萜混合。
实施例10
三萜混合物的制备
通过将指定的三萜以所示的近似摩尔比混合来制备以下组合物。
Figure BDA0002816516430000701
对于各组合物，制备三种不同的各自的溶液，由此各溶液中的三萜的总浓度为约9μM、18μM、或36μM。
Figure BDA0002816516430000711
实施例11
抗病毒组合物的制备
可通过将其单独的三萜组分混合以形成混合物来制备抗病毒组合物。将提供可接受的抗病毒活性的、上述制备的三萜混合物配制成抗病毒组合物。
具有齐墩果酸和熊果酸的抗病毒组合物
根据如本文所定义的组分的预定摩尔比，混合已知量的齐墩果酸和熊果酸。组分以固体形式混合或在以下溶剂(一种或多种)中混合：例如甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、丙醇、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMAC)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、水或其混合物。所得混合物含有如本文所述相对摩尔比的组分。
对于药学上可接受的抗病毒组合物，将至少一种药学上可接受的赋形剂与药理学活性剂混合。配制抗病毒组合物以用于施用于哺乳动物。
具有齐墩果酸和桦木酸的抗病毒组合物
根据如本文所定义的组分的预定摩尔比，混合已知量的齐墩果酸和桦木酸。组分以固体形式混合或在以下溶剂(一种或多种)中混合：例如甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、丙醇、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMAC)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、水或其混合物。所得混合物含有如本文所述相对摩尔比的组分。
对于药学上可接受的抗病毒组合物，将至少一种药学上可接受的赋形剂与药理学活性剂混合。配制抗病毒组合物以用于施用于哺乳动物。
具有齐墩果酸、熊果酸、和桦木酸的抗病毒组合物
根据本文所定义的组分的预定摩尔比，混合已知量的齐墩果酸、熊果酸和桦木酸。组分以固体形式混合或在以下溶剂(一种或多种)中混合：例如甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、丙醇、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMAC)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、水或其混合物。所得混合物含有如本文所述相对摩尔比的组分。
对于药学上可接受的抗病毒组合物，将至少一种药学上可接受的赋形剂与药理学活性剂混合。配制抗病毒组合物以用于施用于哺乳动物。
具有夹竹桃苷、齐墩果酸、熊果酸、和桦木酸的抗病毒组合物
根据如本文所定义的组分的预定摩尔比，混合已知量的夹竹桃苷、齐墩果酸、熊果酸和桦木酸。组分以固体形式混合或在以下溶剂(一种或多种)中混合：例如甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、丙醇、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMAC)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、水或其混合物。所得混合物含有如本文所述相对摩尔比的组分。
对于药学上可接受的抗病毒组合物，将至少一种药学上可接受的赋形剂与药理学活性剂混合。配制抗病毒组合物以用于施用于哺乳动物。
实施例12
受试者中丝状病毒感染的治疗
示例性丝状病毒感染包括埃博拉病毒和马尔堡病毒。
方法A.抗病毒组合物疗法
对呈现出丝状病毒感染的受试者给予抗病毒组合物，并且根据指定的给药方案向受试者施用治疗相关剂量一段时间。定期确定受试者的治疗反应水平。可通过确定受试者血液或血浆中的丝状病毒滴度来确定治疗反应水平。如果一个剂量下的治疗反应水平过低，则根据预先确定的剂量递增计划来递增剂量直至达到在受试者中期望的治疗反应水平。按需继续对受试者进行抗病毒组合物的治疗，并且可按需调节剂量或给药方案直至患者达到期望的临床终点。
方法B.组合疗法：抗病毒组合物与其它药剂
除了向受试者指示并施用一种或多种用于治疗丝状病毒感染或其症状的其他治疗剂之外，遵循上述方法A。于是，一种或多种其他治疗剂可以在抗病毒组合物之前、之后或与其一起施用。也可进行一种或多种其他治疗剂的剂量递增(或递减)。
实施例13
受试者中黄病毒感染的治疗
示例性黄病毒感染包括黄热病、登革热、日本脑炎、西尼罗病毒、寨卡病毒、蜱媒脑炎、科萨努尔森林病、Alkhurma症、基孔肯雅病毒、鄂木斯克出血热、波瓦生病毒感染
方法A.抗病毒组合物疗法
对呈现出黄病毒感染的受试者给予抗病毒组合物，并且根据指定的给药方案向受试者施用治疗相关剂量一段时间。定期确定受试者的治疗反应水平。可通过确定受试者血液或血浆中的黄病毒滴度来确定治疗反应水平。如果一个剂量下的治疗反应水平过低，则根据预先确定的剂量递增计划来递增剂量直至达到在受试者中期望的治疗反应水平。按需继续对受试者进行抗病毒组合物的治疗，并且可按需调节剂量或给药方案直至患者达到期望的临床终点。方法B.组合疗法：抗病毒组合物与其它药剂
除了向受试者指示并施用一种或多种用于治疗黄病毒感染或其症状的其他治疗剂之外，遵循上述方法A。于是，一种或多种其他治疗剂可以在抗病毒组合物之前、之后或与其一起施用。也可进行一种或多种其他治疗剂的剂量递增(或递减)。
实施例14
针对寨卡病毒和登革热病毒的抗病毒活性的评价
通过在存在或不存在试验组合物的情况下、以一定浓度范围下感染目标细胞来进行基于CPE的抗病毒测定。感染目标细胞导致细胞病变效应和细胞死亡。在该类型的测定中，将在存在试验组合物的情况下CPE的降低和细胞存活率的相应增加用作抗病毒活性的指标。对于基于CPE的测定，用中性红读数确定细胞存活率。活细胞在其溶酶体中结合中性红。中性红的摄取依赖于活细胞维持其溶酶体内的pH低于细胞质中的pH的能力，该活性过程需要ATP。一旦进入溶酶体，中性红染料变得带电并且保留在细胞内。在用中性红(0.033％)孵育3小时后，去除细胞外染料，用PBS洗涤细胞，并用50％乙醇+1％乙酸的溶液溶解细胞内的中性红。通过在490nm下读取各个孔的吸光度(光密度)来定量溶液中的中性红的量。
贴壁细胞系用于评价组合物针对一组病毒的抗病毒活性。在向细胞添加病毒前，将组合物与目标细胞预先孵育30分钟。组合物在感染潜伏期间存在于细胞培养基中。对于各个感染试验，使用相同浓度的组合物(一式两份)平行建立存活率试验，以确定在不存在病毒的情况下组合物的细胞毒性效果。
通过将试验条件下细胞的感染水平(基于免疫染色的试验)或存活率(基于CPE的试验)与未感染细胞的感染水平或存活率相比较，来确定试验组合物的抗病毒活性。通过将存在抑制剂的情况下的存活率与假处理的细胞的存活率相比较，在未感染的细胞中评价细胞毒性效果。通过XTT存活率试验来确定细胞毒性，所述XTT存活率试验在与相应感染试验的读数的相同时间点进行。
将试验组合物溶于100％甲醇中。通过进行8倍稀释来产生8种浓度的组合物(一式两份)，以50μM作为最高试验浓度开始。组合物的最高试验浓度(50μM)致使培养基中的甲醇的最终浓度为0.25％(v/v％)。在各个试验板中含有8倍稀释系列的甲醇媒介物，其浓度反映了各个组合物试验条件中甲醇的最终浓度。在可能的情况下，使用GraphPad Prism软件确定各个试验的组合物的EC50和CC50。
通过针对病毒诱导的细胞病变效应(CPE)的保护程度来评价抗病毒活性。在存在不同浓度的对照或组合物的情况下，用病毒攻击细胞。在感染6天后(ZIKV，寨卡病毒)或7天后(DENV，登革热病毒)，通过定量不同试验条件下的细胞存活率并将数值与未处理的细胞和仅用媒介物(感染培养基)处理的细胞进行比较，来监测针对CPE的保护程度。
在每个板上进行中和测定的质量控制以确定：i)信号对背景(S/B)值；ii)由已知抑制剂的抑制，和iii)试验的变化，其由所有数据点的变化系数(C.V.)来测定。感染试验中的总体变化范围为3.4％至9.5％，并且存活率试验中的总体变化范围为1.4％至3.2％，以全部C.V.值的平均值计算。感染试验的信号-对-背景(S/B)范围为2.9至11.0，而存活率试验的信号-对-背景(S/B)范围为6.5至29.9。
DENV2-诱导的细胞病变效应(CPE)用中性红读数保护：对于DENV2抗病毒试验，使用08-10381Montserrat株。在C6/36昆虫细胞中产生病毒原液。在具有5％FBS的MEM(MEM5)中维持Vero细胞(源自绿猴(Cercopithecus aethiops)的上皮肾细胞)。对于感染和存活率试验二者，在96孔透明平底板中以10,000细胞/孔接种细胞，并且在37℃下在MEM5中维持24小时。在感染当天，将样品使用具有1％牛血清白蛋白(BSA)的MEM在U底板中稀释8倍。以1.25X的终浓度制备试验材料稀释液，并且取40μl与目标细胞在37℃下孵育30分钟。试验材料预孵育之后，将10μl的在具有1％BSA的MEM中制备的病毒稀释液添加至各个孔(50μl最终体积/孔)中并且将板在具有5％CO2的加湿培养箱中在37℃下孵育3小时。预先确定用于试验的病毒的体积以产生被利巴韦林(Ribavirin)和化合物A3(已知的DENV2的抑制剂)抑制的线性范围中的信号。感染孵育后，用PBS、接着用含有2％FBS的MEM(MEM2)洗涤细胞以除去未结合的病毒。其后，将50μl的含有在MEM2中以1X浓度制备的抑制剂稀释液的培养基添加至各个孔中。在培养箱(5％CO2)中在37℃下将板孵育7天。试验板中包括无病毒对照(“假感染”)、仅用培养基孵育的感染细胞、仅用媒介物(甲醇)孵育的感染细胞、和无细胞的孔(以确定背景)。试验板上还包括含有50μM利巴韦林和0.5μM化合物A3的对照孔。感染7天后，将细胞用中性红染色以监测细胞存活率。使用感染培养基中的系列8倍稀释液一式两份地评价试验材料。对照包括用无病毒孵育的细胞(“假感染”)、仅用培养基培养的感染细胞、或存在有利巴韦林(0.5μM)或A3(0.5μM)的感染细胞。在同一试验板上包括仅具有甲醇媒介物的完全重复抑制曲线。
ZIKV-诱导的细胞病变效应(CPE)用中性红读数保护：对于ZIKV抗病毒试验，使用PLCal_ZV株。在具有5％FBS的MEM(MEM5)中维持Vero细胞(源自绿猴的上皮肾细胞)。对于感染和存活率试验二者，在96孔透明平底板中以10,000细胞/孔接种细胞，并且在37℃下在MEM5中维持24小时。在感染当天，将样品使用具有1％牛血清白蛋白(BSA)的MEM在U底板中稀释8倍。以1.25X的终浓度制备试验材料稀释液，并且取40μl与目标细胞在37℃下孵育30分钟。试验材料预孵育之后，将10μl的在具有1％BSA的MEM中制备的病毒稀释液添加至各个孔(50μl最终体积每孔)中并且将板在具有5％CO2的加湿培养箱中在37℃下孵育3小时。感染孵育后，用PBS、接着用含有2％FBS的MEM(MEM2)洗涤细胞以除去未结合的病毒。其后，将50μl的含有在MEM2中以1X浓度制备的抑制剂稀释液的培养基添加至各个孔中。在培养箱(5％CO2)中在37℃下将板孵育6天。在试验板中包括无病毒对照(“假感染”)、仅用培养基孵育的感染细胞、仅用媒介物(甲醇)孵育的感染细胞、和无细胞的孔(以确定背景)。感染6天后，将细胞用中性红染色以监测细胞存活率。使用感染培养基中的系列8倍稀释液一式两份地评价试验材料。对照包括无病毒孵育的细胞(“假感染”)、仅用培养基孵育的感染细胞、或存在有A3(0.5μM)的感染细胞。在同一试验板上包括仅具有甲醇媒介物的完全重复抑制曲线。
基于CPE的存活率数据的分析：对于中性红试验，通过监测490nm处的吸光度来确定细胞存活率。从所有样品中减去在无细胞的孔中获得的平均信号。然后，将所有数据点以在相同试验板上在假(未感染)细胞的8个孔中观察到的平均信号的百分比计算。仅用培养基处理的感染细胞将信号降低至未感染细胞中观察到的信号的平均4.2％(对于HRV)、26.9％(对于DENV)、和5.1％(对于ZIKV)。该试验的信号-对-背景(S/B)为2.9(对于DENV)、和7.2(对于ZIKV)，其确定为与仅用载体处理的感染细胞的存活率百分比比较的“假感染”细胞中的存活率百分比。
评价化合物诱导的细胞毒性的存活率试验(XTT)：使用与相应感染试验中所用的相同实验设置和抑制剂浓度、用抑制剂稀释液(或仅培养基)孵育假感染的细胞。孵育温度和孵育期持续时间与相应感染试验的条件相同。用XTT法评价细胞存活率。XTT试验测量了线粒体活性并且是基于黄色四唑盐(XTT)的裂解，其形成橙色甲臜染料。所述反应仅在具有活性线粒体的活细胞中发生。使用扫描多孔分光光度计直接定量甲臜染料。从所有数据-点减去从无细胞的孔获得的背景水平。存活率试验板中包括仅用甲醇媒介物的对照(7个浓度，与各个夹竹桃苷试验孔的甲醇终百分比相同)。通过测量490nm处的吸光度来监测存活能力。
细胞毒性数据的分析：对于XTT实验，通过监测490nm处的吸光度来确定细胞存活率。从所有样品减去无细胞的孔中获得的平均信号。然后，所有数据点以在相同试验板上在假(未感染)细胞的8个孔中观察到的平均信号的百分比计算。该试验的信号-对-背景(S/B)为29.9(对于IVA)、8.7(对于HRV)、6.5(对于DENV)、和6.7(对于ZIKV)，其确定为与无细胞的孔观察到的信号比较的“假感染”细胞中的存活率百分比。
实施例15
针对丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)的抗病毒活性的评价
方法A.
在存在夹竹桃苷、地高辛或PBI-05204(含夹竹桃苷的植物提取物)的情况下，用EBOV/Kik(A，MOI＝1)或MARV/Ci67(B，MOI＝1)感染Vero E6细胞。1小时后，除去接种物和化合物并向细胞添加新鲜培养基。48小时后，固定细胞并免疫染色细胞以检测感染EBOV或MARV的细胞。使用Operetta计数感染的细胞。C)用上述化合物处理Vero E6细胞。通过CellTiter-Glo测定ATP水平作为细胞存活率的度量。
方法B.
用EBOV(A、B)或MARV(C、D)感染Vero E6细胞。感染后2小时(A、C)或感染后24小时(B、D)，向细胞添加夹竹桃苷或PBI-05204 1小时，然后丢弃并将细胞返回至培养基。感染后48小时，感染细胞的分析如图1所示。
方法C.
在存在夹竹桃苷或PBI-05204的情况下，用EBOV或MARV感染Vero E6细胞并且孵育48小时。将来自感染细胞培养物的上清液传递至新鲜Vero E6细胞，孵育1小时，然后丢弃(如A中所述)。孵育含有传递的上清液的细胞48小时。如前所述检测感染EBOV(B)或MARV(C)的细胞。EBOV的对照感染率为66％，MARV的对照感染率为67％。
实施例16
针对披膜病毒科病毒的抗病毒活性的评价
(甲病毒：VEEV和WEEV)
在存在或不存在指示化合物的情况下，用委内瑞拉马脑炎病毒(A，MOI＝0.01)或西部马脑炎病毒(B，MOI＝0.1)感染Vero E6细胞18小时。如本文所述检测感染的细胞并在Operetta上计数。
实施例17
受试者中副粘病毒科感染的治疗
示例性副粘病毒科病毒感染包括亨尼病毒属感染、尼帕病毒感染、或亨德拉病毒感染。
方法A.抗病毒组合物疗法
对呈现出副粘病毒科感染的受试者给予抗病毒组合物，并且根据指定的给药方案向受试者施用治疗相关剂量一段时间。定期确定受试者的治疗反应水平。可通过确定受试者血液或血浆中的病毒滴度来确定治疗反应水平。如果一个剂量下的治疗反应水平过低，则根据预先确定的剂量递增计划来递增剂量直至达到在受试者中期望的治疗反应水平。按需继续对受试者进行抗病毒组合物的治疗，并且可按需调节剂量或给药方案直至患者达到期望的临床终点。
方法B.组合疗法：抗病毒组合物与其它药剂
除了向受试者指示并施用一种或多种用于治疗副粘病毒科感染或其症状的其他治疗剂之外，遵循上述方法A。于是，一种或多种其他治疗剂可以在抗病毒组合物之前、之后或与其一起施用。也可进行一种或多种其他治疗剂的剂量递增(或递减)。
实施例18
原代huPBMC的细胞系和分离
在加湿培养箱中于37℃、10％CO2下在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS；Biowest)、100U/mL盘尼西林、100μg/mL硫酸链霉素、和20μg/mL硫酸庆大霉素(LifeTechnologies)的Iscove’s改良的Dulbecco’s培养基(IMDM；ATCC No.30-2005)中培养产生病毒的HTLV-1转化的(HTLV-1+)SLB1淋巴瘤T细胞系(Arnold等人,2008；由P.Green,TheOhio State University-Comprehensive Cancer Center惠赠)。
从全血样品中分离原代人外周血单核细胞(huPBMC)，全血样品由SMU纪念健康中心(SMU Memorial Health Center)根据SMU机构审查委员会(SMU Institutional ReviewBoard)批准的协议提供的无标识符且符合赫尔辛基原则宣言(Declaration of Helsinkiprinciples)。简而言之，将2ml全血与等体积的pH7.4的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)在聚丙烯锥形管(Corning)中混合，然后将样品轻轻铺在3ml的淋巴细胞分离培养基(MPBiomedicals)上。将样品在室温下在摆式转子中以400x g离心30分钟。随后将血沉棕黄层的huPBMC吸出，在RPMI-1640培养基(ATCC No.30-2001)中洗涤2次，并通过以260x g离心7分钟沉淀。将细胞重悬于补充有20％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素、20μg/ml硫酸庆大霉素和50U/ml重组人白介素-2(hu-IL-2；Roche Applied Science)的RPMI-1640培养基中，并用10ng/ml植物血凝素(PHA；Sigma-Aldrich)刺激24小时，并在加湿培养箱中在37℃、10％CO2下生长。第二天，将细胞以260x g离心7分钟以沉淀细胞，并用RPMI-1640培养基洗涤2次以除去PHA，然后在补充有抗生素和50U/ml hu-IL-2的完全培养基中重悬并培养。
实施例19
表达GFP的HTLV-1+SLB1/pLenti-GFP T细胞克隆的产生
为了产生表达GFP的HTLV-1+SLB1 T细胞克隆，将2x106个SLB1细胞铺板在补充有10％热灭活FBS和抗生素的IMDM的60mm2组织培养皿(Corning)中，然后用含有也携带杀稻瘟菌素抗性基因的pLenti-6.2/V5-DEST绿色荧光蛋白表达载体的慢病毒颗粒进行转导。6小时后，将转导的细胞在室温下以260x g离心7分钟沉淀，用无血清IMDM洗涤2次，然后重悬于补充有5μg/mL杀稻瘟菌素的完全培养基(Life Technologies)中，并等分加入96孔微量滴定板(Corning)中。在37℃和10％CO2的加湿培养箱中，用杀稻瘟菌素筛选维持培养物两周。通过荧光显微镜筛选表达GFP的淋巴母细胞，然后通过在96孔微量滴定板中有限稀释铺板来获得表达GFP的同质细胞克隆。扩大得到的HTLV-1+SLB1/pLenti-GFP T淋巴细胞克隆并重复传代；GFP的表达通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和使用兔多克隆抗GFP(FL)抗体的免疫印迹(Santa Cruz Biotechnology)证实。
实施例20
通过抗HTLV-1p19Gag ELISA定量病毒产生和颗粒感染性
为了确定夹竹桃苷或欧洲夹竹桃提取物对HTLV-1原病毒复制和新合成的细胞外病毒颗粒释放的影响，将HTLV-1+SLB1淋巴瘤T细胞系以2x104个细胞/孔铺板在96孔微量滴定板中的300μl的补充有抗生素的完全培养基中，并在37℃、10％CO2下孵育。将纯化的夹竹桃苷化合物和欧洲夹竹桃提取物(Phoenix Biotechnology；参见Singh等人，2013)重悬于媒介物溶液中(20％v/v二甲基亚砜，DMSO，在MilliQ蒸馏/去离子H2O中)，原液浓度为2mg/ml，然后使用luer-lock 0.2μm注射器过滤器(Millipore)灭菌。以浓度为10、50和100μg/ml的夹竹桃苷或欧洲夹竹桃提取物或用增加量(1.5、7.5、和15μl)的媒介物对照处理HTLV-1+SLB1细胞72小时。然后使用Eppendorf A-2-DWP在室温下在摆式转子中以260x g将96孔微量滴定板离心7分钟，以沉淀细胞，并通过进行比色抗p19Gag酶联免疫吸附试验(ELISA；Zeptometrix)相对于p19Gag蛋白标准品定量细胞外含有p19Gag的HTLV-1颗粒释放至培养物上清液中的水平。在Berthold Tristar LB 941多模式酶标仪上在450nm下以吸光度模式对样品进行三次重复分析。
为了评价从夹竹桃苷处理的细胞中收集的新合成的细胞外HTLV-1颗粒的感染性，将2x104个HTLV-1+SLB1 T-淋巴母细胞铺板在300μl的补充有抗生素的完全培养基中，以浓度增加(10、50和100μg/ml)的夹竹桃苷或欧洲夹竹桃提取物或媒介物对照(1.5、7.5、和15μl)处理培养物72小时，然后，将50μl含有病毒的上清液用于直接感染以2x104个细胞/孔的密度铺板于96孔微量滴定板中的补充有抗生素和hu-IL-2的完全培养基上的huPBMC。在huPBMC培养基中维持夹竹桃苷化合物、欧洲夹竹桃提取物、或媒介物对照以控制可能由新产生的颗粒引起的再感染事件。72小时后，通过抗HTLV-1p19Gag ELISA定量细胞外含有p19Gag的HTLV-1病毒体释放至感染的huPBMC的培养物上清液的相对水平。
实施例21
测定细胞凋亡
为了评价处理的细胞培养物中的夹竹桃苷化合物、欧洲夹竹桃的提取物、或媒介物对照的相对细胞毒性，将2x104个HTLV-1+SLB1淋巴瘤T细胞或活化的/培养的huPBMC铺板在300μl的补充有抗生素的完全培养基中，并在加湿培养箱中在37℃、10％CO2下维持。以浓度增加(10、50和100μg/ml)的夹竹桃苷或欧洲夹竹桃提取物或媒介物对照(1.5、7.5、和15ml)孵育72小时。将环磷酰胺(50μM；Sigma-Aldrich)处理的细胞包括在内作为凋亡的阳性对照。然后将细胞吸出并铺板于Permanox 8室组织培养玻片(Nalge)上，该玻片已用0.01％的Poly-L-赖氨酸和伴刀豆球蛋白A(1mg/mL；Sigma-Aldrich)的无菌溶液预处理。随后使用显微镜凋亡检测试剂盒对样品进行染色，将膜联蛋白V与异硫氰酸荧光素(膜联蛋白V-FITC)和碘化丙啶(PI；BD-Pharmingen)缀合，并通过使用20x物镜的共聚焦荧光显微镜重复三次定量每个视野的凋亡(即，膜联蛋白V-FITC和/或PI-阳性)细胞的相对百分比。通过使用DIC相衬滤光片的显微镜定量每个视野的细胞总数。
实施例22
共培养试验中HTLV-1传播和病毒突触形成
由于HTLV-1的传播通常是通过感染的细胞和的未感染的目标细胞之间跨病毒突触的直接接触而发生(Igakura等人,2003；Pais-Correia等人,2010；Gross等人,2016；Omsland等人,2018；Majorovits等人,2008)，我们试验夹竹桃苷、欧洲夹竹桃提取物、或媒介物对照是否可以影响病毒突触的形成和/或感染性HTLV-1颗粒在体外通过细胞间相互作用的传播。对于这些实验，将2x104个产生病毒的HTLV-1+SLB1 T细胞铺板于96孔微量滴定板中，并在37℃、10％CO2下在300μl的完全培养基中用丝裂霉素C(100μg/mL)处理2小时(Bryja等人,2006)。然后去除培养基，用无血清的IMDM洗涤细胞2次，以量增加(10、50和100μg/ml)的夹竹桃苷或欧洲夹竹桃提取物、或媒介物对照(1.5、7.5、和15μl)处理细胞15分钟或3小时。可选地，将2x104个表达GFP的HTLV-1+SLB1/pLenti-GFP T细胞铺板于300μl完全培养基中的8室组织培养玻片上，并用丝裂霉素C处理，用不含血清的IMDM洗涤2次，然后如共聚焦显微镜实验所述，用夹竹桃苷、欧洲夹竹桃提取物或媒介物对照进行处理。接下来，我们吸出培养基，用无血清培养基洗涤HTLV-1+SLB1细胞2次，并将2x104个huPBMC添加至在300μl的补充有20％FBS、抗生素和50U/ml hu-IL-2的RPMI-1640培养基中的各个孔中，然后在加湿培养箱中在37℃、10％CO2下再共培养细胞72小时(将细胞共培养6小时，使用SLB1/pLenti-GFP淋巴母细胞通过共聚焦显微镜观察病毒突触的形成和病毒传播)。作为阴性对照，在没有产生病毒的细胞的情况下单独培养huPBMC。在共培养基中维持夹竹桃苷、欧洲夹竹桃提取物和媒介物。通过进行抗HTLV-1p19Gag ELISA定量由于细胞间病毒传播而释放至共培养物上清液中的细胞外含有p19Gag的HTLV-1颗粒的相对水平。使用免疫荧光共聚焦显微镜通过用抗HTLV-1gp21Env一抗和罗丹明红偶联的二抗对固定样品染色来观察GFP阳性HTLV-1+SLB/pLenti-GFP细胞与huPBMC之间形成的病毒突触。将二脒基-2-苯基吲哚、二盐酸化物(DAPI；分子探针)核染色包括在内用于比较和观察未感染(即HTLV-1阴性)的细胞。通过使用20x物镜计数20个视野中HTLV-1gp21Env阳性(和GFP阴性)的huPBMC的相对百分比，定量共培养试验中HTLV-1向huPBMC的细胞间传播。
实施例23
显微镜
使用Plan-Apochromat 20x/0.8物镜和Zeiss ZEN系统软件(Carl ZeissMicroscopy)在装备有Airyscan检测器和载物台式CO2培养箱的Zeiss LSM800仪器上的共聚焦荧光显微镜来观察膜联蛋白V-FITC/PI染色的样品以定量细胞凋亡和细胞毒性。通过免疫荧光共聚焦显微镜使用Plan-Apochromat20x/0.8物镜观察丝裂霉素C处理的HTLV-1+SLB1/pLenti-GFP淋巴母细胞和培养的huPBMC之间的病毒突触的形成和病毒传播(即，通过定量抗HTLV-1gp21Env阳性huPBMC的相对百分比来确定)。使用Zen 2.5D分析工具(CarlZeiss Microscopy)图形化定量DAPI、抗HTLV-1gp21Env特异性(罗丹明红阳性)、和GFP信号的相对荧光强度。通过装备有633nm和543nm He/Ne和488nm Ar激光的Nikon EclipseTE2000-U倒置显微镜和D-Eclipse共聚焦成像系统上的共聚焦荧光显微镜使用Plan Fluor10x/0.30物镜和DIC相衬滤光片(Nikon Instruments)来筛选表达GFP的HTLV-1+SLB1/pLenti-GFP T细胞克隆。
实施例24
统计分析
使用不成对的两尾Student’s t检验(α＝0.05)确定实验数据集的统计显著性，并使用Shapiro-Wilk正态性检验和Graphpad Prism 7.03软件计算P值。P值定义为：0.1234(ns)，0.0332(*)，0.0021(**)，0.0002(***)，<0.0001(****)。除非另有说明，否则误差线代表来自至少三个独立实验的SEM。
实施例25
受试者中δ逆转录病毒感染的治疗
包括HTLV-1的示例性δ逆转录病毒感染
方法A.抗病毒组合物疗法
对呈现出HTLV-1感染的受试者给予抗病毒组合物，并且根据指定的给药方案向受试者施用治疗相关剂量一段时间。定期确定受试者的治疗反应水平。可通过确定受试者血液或血浆中的HTLV-1病毒滴度来确定治疗反应水平。如果一个剂量下的治疗反应水平过低，则根据预先确定的剂量递增计划来递增剂量直至达到在受试者中期望的治疗反应水平。按需继续对受试者进行抗病毒组合物的治疗，并且可按需调节剂量或给药方案直至患者达到期望的临床终点。
方法B.组合疗法：抗病毒组合物与其它药剂
除了向受试者指示并施用一种或多种用于治疗HTLV-1感染或其症状的其他治疗剂之外，遵循上述方法A。于是，一种或多种其他治疗剂可以在抗病毒组合物之前、之后或与其一起施用。也可进行一种或多种其他治疗剂的剂量递增(或递减)。示例性其他治疗剂如本文所述。
实施例26
受试者中CoV感染的治疗
示例性CoV感染包括SARS-CoV、MERS-CoV、COVID-19(SARS-CoV-2)、CoV 229E、CoVNL63、CoV OC43、CoV HKU1、和CoV HKU20。
方法A.抗病毒组合物疗法
对呈现出CoV感染的受试者给予抗病毒组合物，并且根据指定的给药方案向受试者施用治疗相关剂量一段时间。定期确定受试者的治疗反应水平。可通过确定受试者血液或血浆中的CoV病毒滴度来确定治疗反应水平。如果一个剂量下的治疗反应水平过低，则根据预先确定的剂量递增计划来递增剂量直至达到在受试者中期望的治疗反应水平。按需继续对受试者进行抗病毒组合物的治疗，并且可按需调节剂量或给药方案直至患者达到期望的临床终点。
方法B.组合疗法：抗病毒组合物与其它药剂
除了向受试者指示并施用一种或多种用于治疗CoV感染或其症状的其他治疗剂之外，遵循上述方法A。于是，一种或多种其他治疗剂可以在抗病毒组合物之前、之后或与其一起施用。也可进行一种或多种其他治疗剂的剂量递增(或递减)。示例性其他治疗剂如本文所述。
实施例27
使用ANVIRZELTM在受试者中治疗COVID-19感染
对呈现出COVID-19的儿童(婴儿)如下施用ANVIRZELTM以治疗与COVID-19相关的症状。在施用ANVIRZELTM之前，受试者的病毒感染恶化。根据下述给药方案对受试者指定并施用ANVIRZELTM：初始剂量-0.25mL重组ANVIRZELTM，然后每十二小时施用0.5mL的重组ANVIRZELTM，为期两到三天。受试者的COVID-19感染得到解决，并且没有观察到药物相关的毒性。
实施例28
夹竹桃苷针对COVID-19感染的体外评价
本研究的目的是确定夹竹桃苷对后代病毒体的感染性的影响。
制备夹竹桃苷在甲醇中的储备溶液(10mg夹竹桃苷/mL)。所述储备溶液用于制备含有DMSO(在水性培养基RPMI 1640和夹竹桃苷(20μg/mL、10μg/mL、1.0μg/mL、或0.1μg/mL)为0.1％或0.01％v/v)的培养基。培养液如下所示。
Figure BDA0002816516430000861
将培养物中未感染的Vero细胞(目标初始细胞计数为1x106)在37℃下在每个指示培养基的小瓶中孵育30分钟。然后将SARS-CoV-2的病毒接种物添加到每个小瓶中，以达到目标初始病毒滴度(约PFU/mL 1x104)。目标MOI(感染复数)为约0.1。将溶液在37℃下再孵育2小时以实现Vero细胞的感染。然后用对照媒介物洗涤感染的Vero细胞以除去细胞外病毒和夹竹桃苷。将各个孵育培养基的新等分试样添加至感染的Vero细胞的各自相应的小瓶中。在第二等分试样中接受夹竹桃苷的那些被表示为“+感染后处理”，而在第二等分试样中没有接受夹竹桃苷的那些被表示为“-感染后处理”(图23A-23D)。在感染后约24小时和约48小时确定每个小瓶的病毒滴度。
作为确定夹竹桃苷针对Vero细胞的潜在毒性的手段，基于上述培养基，针对未感染的Vero细胞制备平行培养物。
获得的数据包括所产生的病毒数量、后代病毒的感染性、以及感染和未感染的细胞中的夹竹桃苷的相对安全性(无毒)。
实施例29
夹竹桃苷针对COVID-19病毒的体外评价
本试验的目的是确定夹竹桃苷针对SARS-CoV-2的直接抗病毒活性。
从6孔板中约106个Vero CCL81细胞的汇合单层中除去生长培养基。将夹竹桃苷在培养基中连续稀释，然后添加到接种在96孔板中的Vero-E6细胞中。将生长培养基替换为200μl的维持培养基，其中包含1.0μg/mL、0.5μg/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL或5ng/mL夹竹桃苷，或匹配的仅DMSO对照。在添加病毒之前，将板在37℃下孵育约30分钟。
将SARS-CoV-2病毒以0.4(进入试验)或0.02(复制试验)的MOI(感染复数)添加到夹竹桃苷处理的细胞和未处理的细胞中。在37℃孵育1小时后，将夹竹桃苷保留在孔中。
吸收1小时后，除去接种培养基，并用PBS(标准磷酸盐缓冲盐水)洗涤1次。
将单独的培养基(无夹竹桃苷)加回到数据玻片上指定为“预处理”的夹竹桃苷处理的孔中。将具有指定浓度的夹竹桃苷的培养基加回到数据玻片上指定为“持续时间”的孔中。
将板在感染后24小时(进入试验)或48小时(复制试验)固定，并用病毒特异性抗体和荧光标记的二抗免疫染色。
使用Operetta对细胞进行成像，并使用Harmonia软件中的定制算法分析数据，以确定每个孔中感染细胞的百分比。
结果示于图24A和24B。
实施例30
夹竹桃苷针对Vero-E6细胞的毒性的体外评价
本试验的目的是确定夹竹桃苷针对Vero-E6细胞的相对潜在毒性。
将夹竹桃苷在培养基中连续稀释，并添加至接种在96孔板中的Vero-E6细胞中，并在37℃下孵育24小时。使用CellTiter Glo测定获得细胞计数。
结果示于图25。
实施例31
夹竹桃苷针对COVID-19病毒的体外评价
本研究的目的是确定COVID-19病毒针对夹竹桃苷处理的剂量反应。
除了使用以下较低浓度的夹竹桃苷之外，重复实施例28的步骤：1μg/mL、0.5μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.01μg/mL、和0.005μg/mL。此外，VERO CCL-81细胞用于代替VEROE6细胞。
根据实施例28确定病毒滴度，并且通过与对照样品比较计算病毒滴度的降低倍数。结果示于图26A-26D、27A-27D、和28A和28B。
实施例32
舌下液体剂型
舌下液体剂型包含通过将夹竹桃苷或含有夹竹桃苷的组合物(例如含有夹竹桃苷的提取物；2重量％)与中链甘油三酸酯(95重量％)和调味剂(3重量％)混合制成的夹竹桃苷。剂型中的夹竹桃苷含量为约25μg/mL。
实施例33
夹竹桃亚临界流体提取物的制备
通过采用亚临界流体提取而不是超临界液体提取夹竹桃生物质，开发用于含有夹竹桃苷的提取物的制备的改进方法。
将干燥和粉末状的生物质置于提取室中，然后将其密封。将二氧化碳(约95重量％)和醇(约5重量％；甲醇或乙醇)注入室中。室的内部温度和压力使提取介质在大部分或基本上所有提取时间段内保持在亚临界流体相而不是超临界流体相中：温度在约2℃至约16℃(约7℃至约8℃)的范围内，压力在约115至约135bar(约124bar)的范围内。提取时间为约4小时至约12小时(约6小时至约10小时)。然后将提取环境过滤并收集上清液。从上清液中排出二氧化碳，并将所得的粗提取物稀释到乙醇中(约9份乙醇：约1份提取物)，并在约-50℃下冷冻至少12小时。将溶液解冻并过滤(100微米孔径的过滤器)。将滤液浓缩至其原始体积的约10％，然后无菌过滤(0.2微米孔径的过滤器)。然后，将浓缩的提取物用50％乙醇水溶液稀释至每mL溶液约1.5mg的提取物的浓度。
所得的亚临界流体(SbCL)提取物包含可提取自夹竹桃的夹竹桃苷和一种或多种其他化合物，所述一种或多种其他化合物如本文所定义。
实施例34
夹竹桃苷针对COVID-19病毒的体外评价
本研究的目的是确定夹竹桃苷对没有夹竹桃苷预处理的后代病毒体的感染性的影响(根据实施例28)。
除了在感染之前没有用夹竹桃苷预处理之外，重复实施例28的步骤。取而代之的是，在感染后12h和24h用夹竹桃苷或对照媒介物处理感染的细胞。此外，VERO CCL-81用于代替VERO E6细胞，并使用较低浓度的夹竹桃苷：1μg/mL、0.5μg/mL、0.1μg/mL、和0.05μg/mL。数据示于图29A和29B。
实施例35
夹竹桃苷针对COVID-19病毒的体内评价
本研究的目的是确定含有夹竹桃苷的提取物(OCE)治疗已由COVID-19病毒感染的受试者的功效。
在舌下、颊部或经口施用根据实施例32的剂型制备的OCE之前，评价代表广泛的人口分布并呈现出COVID-19感染的受试者以确定其临床状态。通过将液体滴入受试者口腔，将组合物安全地施用于受试者。给药方案为每剂量约0.5mL，每天四剂量(约每六小时一剂量)，大约每天约50微克夹竹桃苷。可选地，施用每天的总剂量的一半。所有受试者均完全康复。
实施例36
夹竹桃的乙醇提取物的制备
本研究的目的是通过用乙醇水溶液提取夹竹桃生物质来制备乙醇提取物。
用乙醇水溶液(90％v/v乙醇；10％v/v水)重复处理磨碎的干燥叶子。合并结合的乙醇上清液并过滤，然后通过真空蒸发浓缩来降低其中的乙醇和水的量，提供包含约25mg的夹竹桃苷/mL的提取物的粗乙醇提取物(具有约50％v/v乙醇含量)。
实施例37
包含夹竹桃的提取物的组合的剂型的制备
本研究的目的是制备根据实施例32的剂型，不同之处在于实施例36的乙醇提取物的部分(1重量％)与实施例33的SbCL提取物的部分(1重量％)、中链甘油三酸酯(95重量％)、和调味剂(3重量％)组合。
实施例38
地高辛针对COVID-19病毒的体内评价
本研究的目的是确定含有地高辛的组合物(DCC)治疗已被COVID-19病毒感染的受试者的功效。购买市售的含有地高辛的剂型。
在经口或系统施用DCC之前评价呈现出COVID-19感染的受试者以确定临床状态。市售的组合物如本文所述。各安全给药方案均在各自的NDA和包装插页中描述。根据预定的施用方式将组合物安全地施用于每个受试者。进行临床监测以确定治疗反应并相应地滴定剂量。
实施例39
用夹竹桃苷处理的SARS-CoV-2感染中的基因组与感染颗粒比的确定
本研究的目的是确定夹竹桃苷对SARS-CoV-2的抑制是处于总颗粒生产的水平还是感染性颗粒生产的水平。
为了定量样品的基因组拷贝，使用标准制造商方案以5:1体积比的TRIzol LS(Ambion，Carlsbad，CA)提取200μl样品，并重悬于11μl水中。按照先前公开试验(26)，通过qRT-PCR对提取的RNA检测SARS-CoV-2。简而言之，使用以下引物和探针扩增N基因：正向引物[5’-TAATCAGACAAGGAACTGATTA-3’](SEQ ID NO.1)；反向引物[5’-CGAAGGTGTGACTTCCATG-3’](SEQ ID NO.2)；探针[[5’-FAM-GCAAATTGTGCAATTTGCGG-TAMRA-3’；(SEQ ID NO.3)]。使用iTaq Universal探针一步试剂盒(One-Step kit)(BioRad，Hercules，CA)，按照制造商说明制备20μl反应混合物：反应混合物(2x:10μL)、iScript逆转录酶(0.5μL)、引物(10μM:1.0μL)、探针(10μM:0.5μL)、提取的RNA(4μL)和水(3μL)。使用热循环仪StepOnePlusTM实时PCR系统(Applied Biosystems)进行qRT-PCR反应。将反应在50℃ 5分钟、95℃ 20秒，接着95℃ 5秒、60℃ 30秒的40个循环下孵育。阳性对照RNA序列(COVID-2019基因组的核苷酸26,044-29,883)用于估计评价样品中N基因的RNA拷贝数。
如本文所用，术语“约(about)”或“近似(approximately)”是指特定值的±10％、±5％、±2.5％或±1％。如本文所用，术语“基本上”是指“在很大程度上”或“至少大部分的”或“多于50％的”。
以上是本发明的特定实施方案的详细描述。应理解的是，尽管出于说明的目的，本文已描述了本发明的特定实施方案，可在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行各种修改。因此，除所附权利要求书以外，本发明不受限制。根据本公开内容，可在不过度实验的情况下，制造并实施本文公开的和要求保护的所有实施方案。
序列表
<110> 菲尼克斯生物技术公司(PHOENIX BIOTECHNOLOGY, INC.)
<120> 用于治疗冠状病毒感染的方法和组合物
<130> PBI-22-PCT9
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向 (5' 至 3') 引物序列
<400> 1
taatcagaca aggaactgat ta 22
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向 (5' 至 3') 引物序列
<400> 2
cgaaggtgtg acttccatg 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针序列 (5'-FAM-序列-TAMRA-3')；FAM为6-荧光素亚磷酰胺(amidite)；TAMRA为羧基四甲基罗丹明
<400> 3
gcaaattgtg caatttgcgg 20

Claims (38)

1.夹竹桃苷在制备用于通过以下方法治疗COVID-19(SARS-CoV-2)冠状病毒感染的药物中的用途，所述方法包括每天向有需要的受试者施用一个或多个治疗有效剂量的夹竹桃苷，治疗期为至少5天至一个月或多个月。
2.根据权利要求1所述的用途，其中每天夹竹桃苷的总剂量在1μg至180μg的范围内。
3.根据权利要求1所述的用途，其中每天夹竹桃苷的总剂量在140μg至315μg的范围内。
4.根据权利要求1所述的用途，其中每天夹竹桃苷的总剂量在20μg至750μg的范围内。
5.根据权利要求1所述的用途，其中每天夹竹桃苷的总剂量在12μg至300μg的范围内。
6.根据权利要求1所述的用途，其中每天夹竹桃苷的总剂量在0.01μg至100μg的范围内。
7.根据权利要求1所述的用途，其中剂量包含0.05-0.5mg/kg/天，基于夹竹桃苷的单位量/kg受试者体重/天。
8.根据权利要求1所述的用途，其中夹竹桃苷的日剂量最大为100μg/天。
9.根据权利要求1所述的用途，其中夹竹桃苷的日剂量最小为0.5μg/天。
10.根据权利要求1所述的用途，其中剂量每天两次或每12小时施用，和所述剂量中的夹竹桃苷的量在0.25至50μg的范围内。
11.根据权利要求1所述的用途，其中每天夹竹桃苷的所述一个或多个剂量为2至10个剂量/天。
12.根据权利要求1所述的用途，其中夹竹桃苷存在于包含至少一种获得自含有夹竹桃苷的生物质的提取物的组合物中。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述提取物在每次出现时独立地选自由以下组成的组：热水提取物、有机溶剂提取物、和超临界流体提取物。
14.根据权利要求1所述的用途，其中在施用所述一个或多个剂量后，所述受试者中的夹竹桃苷的血浆浓度在0.005至10ng/mL的范围内，以每mL血浆的夹竹桃苷的量计。
15.夹竹桃苷在制备用于通过以下方法治疗COVID-19(SARS-CoV-2)冠状病毒感染的药物中的用途，所述方法包括向患有所述感染的受试者施用多个治疗有效剂量的夹竹桃苷。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述多个治疗有效剂量为在每周两天或更多天内每天施用一个或多个剂量。
17.根据权利要求16所述的用途，其中每个月继续给药一周或多周。
18.根据权利要求17所述的用途，其中每年继续给药一个月或多个月。
19.根据权利要求15所述的用途，其中夹竹桃苷存在于包含至少一种获得自含有夹竹桃苷的生物质的提取物的组合物中。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述提取物在每次出现时独立地选自由以下组成的组：热水提取物、有机溶剂提取物、和超临界流体提取物。
21.根据权利要求19所述的用途，其中所述提取物包含夹竹桃苷和一种或多种提取自所述生物质的化合物的组合。
22.根据权利要求21所述的用途，其中所述一种或多种化合物包含一种或多种强心苷前体、强心苷的一种或多种糖基成分、或其组合。
23.根据权利要求15所述的用途，其中所述施用是全身、肠胃外、颊部、肠内、肌肉内、皮下、舌下、经口、口服、或其组合。
24.根据权利要求15所述的用途，其中所述夹竹桃苷在感染后立即施用，或在感染后的1天至5天内任何时间施用，或在病毒感染的诊断后的最早时间施用。
25.根据权利要求15所述的用途，其中所述夹竹桃苷作为主要抗病毒疗法、辅助抗病毒疗法、或联合抗病毒疗法来施用，或其中所述施用包括所述夹竹桃苷与至少一种其他抗病毒组合物或与至少一种用于治疗与所述病毒感染相关的症状的其他组合物分开施用或共同施用。
26.根据权利要求15所述的用途，其中每天夹竹桃苷的总剂量在1μg至180μg的范围内。
27.根据权利要求15所述的用途，其中每天夹竹桃苷的总剂量在140μg至315μg的范围内。
28.根据权利要求15所述的用途，其中每天夹竹桃苷的总剂量在20μg至750μg的范围内。
29.根据权利要求15所述的用途，其中每天夹竹桃苷的总剂量在12μg至300μg的范围内。
30.根据权利要求15所述的用途，其中每天夹竹桃苷的总剂量在0.01μg至100μg的范围内。
31.根据权利要求15所述的用途，其中剂量包含0.05-0.5mg/kg/天，基于夹竹桃苷的单位量/kg受试者体重/天。
32.根据权利要求15所述的用途，其中夹竹桃苷的日剂量最大为100μg/天。
33.根据权利要求15所述的用途，其中夹竹桃苷的日剂量最小为0.5μg/天。
34.根据权利要求15所述的用途，其中剂量每天两次或每12小时施用，和所述剂量中的夹竹桃苷的量为0.25至50μg。
35.根据权利要求15所述的用途，其中每天夹竹桃苷的所述一个或多个剂量在2至10个剂量/天的范围内。
36.根据权利要求15所述的用途，其中在施用所述一个或多个剂量后，所述受试者中的夹竹桃苷的血浆浓度在0.005至10ng/mL的范围内，以每mL血浆的夹竹桃苷的量计。
37.根据权利要求21所述的用途，其中所述提取物包含夹竹桃苷和选自由以下组成的组的一种或多种化合物：类固醇、三萜、糖类、生物碱、脂肪、蛋白质。
38.根据权利要求21所述的用途，其中所述提取物包含夹竹桃苷和选自由以下组成的组的一种或多种化合物：夹竹桃它罗苷、奥多诺甙、齐墩果酸、熊果酸、桦木酸、夹竹桃甙元、夹竹桃苷A、桦木醇(乌索-12-烯-3β,28-二醇)、28-去甲乌索-12-烯-3β-醇、乌索-12-烯-3β-醇、3β,3β-羟基-12-齐墩果烯-28-酸、3β,20α-二羟基乌索-21-烯-28-酸、3β,27-二羟基-12-乌索烯-28-酸、3β,13β-二羟基乌索-11-烯-28-酸、3β,12α-二羟基齐墩果烷-28,13β-内酯、3β,27-二羟基-12-齐墩果-28-酸、均聚半乳糖醛酸、阿拉伯半乳糖醛酸、绿原酸，咖啡酸、L-奎宁酸、4-香豆酰辅酶A、3-O-咖啡酰奎宁酸、5-O-咖啡酰奎宁酸、强心苷B-1、强心苷B-2、欧夹竹桃甙元、神经节苷脂、橙花苷、奥多诺甙-H、由半乳糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖和半乳糖组成的3-β-O-(D-地芰糖基)-5-β,14β-二羟基-强心甾-20(22)-烯内酯果胶多糖、MW在17000-120000D的范围内或MW为35000D、3000D、5500D、或12000D的多糖、强心苷单糖苷、强心苷N-1、强心苷N-2、强心苷N-3、强心苷N-4、孕烷、4,6-二烯-3,12,20-三酮、20R-羟基孕甾-4,6-二烯-3,12-二酮、16β,17β-环氧-12β-羟基孕甾-4,6-二烯-3,20-二酮、12β-羟基孕甾-4,6,16-三烯-3,20-二酮(欧奕二烯酮A)、20S,21-二羟基孕甾-4,6-二烯-3,12-二酮(欧奕二烯酮B)、夹竹桃香豆酸、异夹竹桃香豆酸、夹竹桃酸、夹竹桃烯、8α-甲氧基半日花-18-酸、12-乌索烯、甘露糖苷、neriumoside、3β-O-(D-地芰糖基)-2α-羟基-8,14β-环氧基-5β-强心甾-16:17,20:22-二烯内酯、3β-O-(D-地芰糖基)-2α,14β-二羟基-5β-强心甾-16:17,20:22-二烯内酯、3β,27-二羟基-乌索-18-烯-13,28-内酯、3β,22α,28-三羟基-25-去甲-羽扇-1(10),20(29)-二烯-2-酮、顺-卡瑞宁(3β-羟基-28-Z-对香豆酰氧基-乌索-12-烯-27-酸)、反-卡瑞宁(3-β-羟基-28-E-对香豆酰氧基-乌索-12-烯-27-酸)、3β-羟基-5α-强心甾-14(15),20(22)-二烯内酯(β-脱水乌沙甙元)、3β-O-(D-洋地黄糖基)-21-羟基-5β-强心甾-8、14,16,20(22)-四烯内酯(夹竹桃甙元-A-3β-D-洋地黄苷)、牛角瓜甙元、欧奕二烯酮A、3β-羟基乌索-12-烯-28-醛、28-甲基乌索-12-烯-3β-醇、乌索-12-烯-3β,28-二醇、3β,27-二羟基-12-齐墩果烯-28-酸、(20S,24R)-环氧达玛烷-3β,25-二醇、20β,28-环氧基-28α-甲氧基蒲公英甾-3β-醇、20β,28-环氧基蒲公英甾-21-烯-3β-醇、28-去甲-乌索-12-烯-3β,17β-二醇、3β-羟基乌索-12-烯-28-醛、α-neriursate、β-neriursate、3α-乙酰苯氧基-乌索-12-烯-28-酸、3β-乙酰苯氧基-乌索-12-烯-28-酸、夹竹桃脑酸、卡那地酮、3β-对羟基苯氧基-11α-甲氧基-12α-羟基-20-乌索烯-28-酸、28-羟基-20(29)-羽扇烯-3,7-二酮、kanerocin、3α-羟基-乌索-18,20-二烯-28-酸、D-沙门糖、D-地芰糖、异蓖麻油酸、龙胆二糖基神经节苷、龙胆二糖基清明花苷、龙胆二糖基夹竹桃苷、12β-羟基-5β-强心甾-8,14,16,20(22)-四烯内酯、8β-羟基-洋地黄毒苷元、Δ16-8β-羟基-洋地黄毒苷元、Δ16-苦参素、乌发醇、熊果醛、2,7(对香豆酰氧)熊果酸、夹竹桃醇、16-脱水-去乙酰基-神经节苷、9-D-羟基-顺-12-十八酸、阿迪果甙、欧夹竹桃苷乙、α-香树精、β-谷甾醇、菜油甾醇、癸酸、辛酸、胆碱、cornerin、cortenerin、去乙酰欧夹竹桃苷丙、二乙酰基-神经节苷、漂筏苔胺、槲皮素、槲皮素-3-鼠李葡糖苷、槲皮甙、rosaginin、芦丁、硬脂酸、豆甾醇、洋地黄次甙、urehitoxin、和乌沙甙元。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN87104312A (zh) * 1986-05-13 1988-01-13 胡塞因·兹亚·奥泽尔 夹竹桃属植物提取物及其制备方法和应用
WO2019055119A1 (en) * 2017-09-14 2019-03-21 Phoenix Biotechnology, Inc. METHOD AND COMPOSITION FOR TREATING VIRAL INFECTION
US20190328809A1 (en) * 2016-09-14 2019-10-31 Phoenix Biotechnology, Inc. Method and Compositions for Treating Viral Infection

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN87104312A (zh) * 1986-05-13 1988-01-13 胡塞因·兹亚·奥泽尔 夹竹桃属植物提取物及其制备方法和应用
US20190328809A1 (en) * 2016-09-14 2019-10-31 Phoenix Biotechnology, Inc. Method and Compositions for Treating Viral Infection
WO2019055119A1 (en) * 2017-09-14 2019-03-21 Phoenix Biotechnology, Inc. METHOD AND COMPOSITION FOR TREATING VIRAL INFECTION

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Determination of in vitro antiviral activity of Nerium oleander distillate against to paralnfluenza-3 virus;AVCI等;《Anim Vet Sci》;20140920;第2卷(第5期);第150-153页 *
Identification of anti-viral activity of the cardenolides,Na+/K+ATPase inhibitors， against porcine transmissible gastroenteritis virus;YANG等;《Toxicol Appl Pharmacol》;20170423;第332卷;第129-137页 *

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