TWI790048B - 用於預防冠狀病毒感染之方法及組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種例如由冠狀病毒科病毒引起的病毒感染等病毒感染的預防方法。本發明提供一種用於預防病毒感染的至少具有夾竹桃苷的組成物。

Description

用於預防冠狀病毒感染之方法及組成物
本發明涉及抗病毒組成物以及其用於預防哺乳動物中沙粒病毒科(Arenaviridae)感染、布尼亞病毒科(Bunyaviridae)感染、黃病毒科(Flaviviridae)感染、披膜病毒科(Togaviridae)感染、副黏液病毒科(Paramyxoviridae)感染、反轉錄病毒科(Retroviridae)感染、冠狀病毒科(Coronaviridae)感染或絲狀病毒科(Filoviridae)感染的用途。部分實施方案涉及出血性病毒感染的預防。
作為夾竹桃屬物種( Neriumspecies)成員的歐洲夾竹桃( Nerium oleander)，是一種廣泛分佈於亞洲亞熱帶、美國西南部及地中海的觀賞性植物。它的醫學及毒物學特性早已被認識到已被提議用於例如痔瘡、潰瘍、麻風病、蛇咬傷、癌症、腫瘤、神經學病症、疣及細胞增殖性疾病等的治療。Zibbu等人於文獻中(J. Chem. Pharm. Res. (2010), 2(6), 351-358)提供夾竹桃的化學及藥理活性的概述。
傳統上使用沸水、冷水、超臨界流體或有機溶劑來進行來自夾竹桃屬物種的植物組分之萃取。
ANVIRZEL™ (Ozel的US 5,135,745)含有夾竹桃的熱水萃取物的濃縮形式或粉末形式。Muller等人( Pharmazie .(1991)九月，46(9)，657-663)揭示了關於夾竹桃的水萃取物的分析結果。其等報導，存在的多醣主要是半乳糖醛酸。其他醣類包含鼠李糖、阿拉伯糖及半乳糖。Newman等人(J. Herbal Pharmacotherapy, (2001) vol 1, pp.1-16)也已報導了夾竹桃的熱水萃取物中的多醣含量及多醣的單種糖組成。Newman等人於文獻中(Anal. Chem. (2000), 72(15), 3547-3552)對熱水萃取物ANVIRZEL™的組成分析做了說明。Selvaraj等人的美國專利號5869060涉及夾竹桃屬物種的萃取物及生產方法。為了製備萃取物，將植物材料置於水中並煮沸。接著從植物物質分離粗萃取物並藉由過濾滅菌。接著將所得萃取物凍乾來生產粉末。美國專利號6565897(Selvaraj等人的美國授權前公開號(U.S. Pregrant Publication No. 20020114852及PCT國際公開號WO 2000/016793)揭示用於製備基本上無菌水萃取物之熱水萃取方法。Ishikawa等人(J. Nutr. Sci. Vitaminol. (2007), 53, 166-173)揭示了一夾竹桃的熱水萃取物及利用液相層析法藉由氯仿、甲醇及水之混合物得其級分，他們還報告了夾竹桃的葉萃取物已被用於治療第II型糖尿病。Panyosan於2006年8月24日公開的US20060188585揭示了夾竹桃的熱水萃取物。Smothers於2019年6月18日授權的US 10323055揭示了一種用蘆薈及水來萃取植物材料以提供含有蘆薈及強心苷的萃取物方法。Rashan等人於2007年7月5日公開的US20070154573揭示了夾竹桃的冷水萃取物及其用途。
Erdemoglu等人(J. Ethnopharmacol. (2003) 十一月，89(1)，123-129)揭示了基於植物鎮痛及抗發炎活性，包含夾竹桃在內的植物的水及乙醇萃取物之比較結果。Fartyal等人(J. Sci. Innov. Res. (2014), 3(4), 426-432)揭示了基於夾竹桃的甲醇、水及石油醚萃取物之抗菌活性的比較結果。
Adome等人(Afr. Health Sci. (2003) 八月，3(2)，77-86；乙醇萃取物)、el-Shazly等人(J. Egypt Soc. Parasitol. (1996)，八月，26(2)，461-473；乙醇萃取物)、Begum等人(Phytochemistry (1999) 二月，50(3)，435-438；甲醇萃取物)、Zia等人(J. Ethnolpharmacol. (1995) 十一月，49(1)，33-39；甲醇萃取物)及Vlasenko等人(Farmatsiia. (1972) 九月-十月，21(5)，46-47；酒精萃取物)亦揭示了夾竹桃的有機溶劑萃取物。Turkmen等人(J. Planar Chroma. (2013), 26(3), 279-283)揭示了夾竹桃葉及莖的水性乙醇萃取物。Yamauchi於1974年9月3日授權的US 3833472揭示了用水、有機溶劑或水性有機溶劑萃取紅花夾竹桃SOL(歐洲夾竹桃)葉子，其中將葉子加熱至60°~170°C，接著使用有機溶劑為甲醇、乙醇、丙醚或氯仿進行萃取。
夾竹桃屬物種的超臨界流體萃取物是已知的(US 8394434、 US 8187644、US 7402325)並且已在治療神經學病症(US 8481086、US 9220778、US 9358293、US 20160243143A1、US 9877979、US 10383886)、細胞增殖性病症(US 8367363、US 9494589、US 9846156)及部分病毒感染(US 10596186、WO 2018053123A1、WO2019055119A1)中顯示其功效。
已知三萜具有各種治療活性。部分已知的三萜包含齊墩果酸(oleanolic acid)、熊果酸(ursolic acid)、樺木酸(betulinic acid)、巴多索隆、山楂酸及其他。這些三萜的治療活性主要是被各別地評估，而非以三萜的組合方式被評估。
齊墩果酸屬於以例如巴多索隆等化合物為代表的類三萜化合物的一類，其已顯示是先天性細胞2期排毒途徑的有效活化劑，其中轉錄因子Nrf2的啟動導致含有抗氧化劑轉錄反應元件(ARE)的下游抗氧化劑基因的轉錄程序增加。巴多索隆本身已在發炎條件下的臨床試驗中被廣泛研究；然而，因為發生了數起不良事件，而終止慢性腎臟疾病的第3期臨床試驗，其原因可能與包含巴多索隆的部分類三萜化合物在高濃度下已知會產生的細胞毒性相關。
含有三萜結合其他具治療性的成分的組成物被發現為植物萃取物。Fumiko等人(Biol. Pharm. Bull (2002), 25(11), 1485-1487)揭示了迷迭香( Rosmarimus officinalisL.)的甲醇萃取物用於治療錐蟲病的評估。Addington等人(US 8481086、US 9220778、US 9358293、US 20160243143 A1)揭示了含有夾竹桃苷及三萜的夾竹桃超臨界流體萃取物(SCF；PBI-05204)其用於神經學病況治療。Addington等人(US 9011937、US 20150283191 A1)揭示了含有夾竹桃苷及三萜的夾竹桃超臨界流體萃取物之含三萜的級分(PBI-04711)，其用於神經學病症的治療。Jäger等人(Molecules (2009), 14, 2016-2031)揭示了含有齊墩果酸、熊果酸、樺木酸及其他組分的混合物之各種植物萃取物。Mishra等人(PLoS One 2016 25;11(7):e0159430. Epub 2016年7月25日)揭示了含有齊墩果酸、熊果酸、樺木酸及其他組分混合物的糙皮樺( Betula utilis)樹皮萃取物。Wang等人(Molecules (2016), 21, 139)揭示了含有齊墩果酸、熊果酸、樺木酸及其他組分混合物的黑板樹( Alstonia scholaris)萃取物。L. e Silva等人(Molecules (2012), 17, 12197)揭示了含有齊墩果酸、熊果酸、樺木酸及其他組分混合物的 Eriope blanchetti萃取物。Rui等人(Int. J. Mol. Sci. (2012), 13, 7648-7662)揭示了含有齊墩果酸、熊果酸、樺木酸及其他組分混合物的藍桉( Eucaplyptus globulus)萃取物。Ayatollahi等人(Iran. J. Pharm. Res. (2011), 10(2), 287-294)揭示了含有齊墩果酸、熊果酸、樺木酸及其他組分混合物的 Euphorbia microsciadia萃取物。Wu等人(Molecules (2011), 16, 1-15)揭示含有齊墩果酸、熊果酸、樺木酸及其他組分混合物的女貞屬物種( Ligustrum種)萃取物。Lee等人(Biol. Pharm. Bull (2010), 33(2), 330)揭示了含有齊墩果酸、熊果酸、樺木酸及其他組分混合物的金鐘花( Forsythia viridissima)萃取物。
齊墩果酸(O或OA)、熊果酸(U或UA)及樺木酸(B或BA)是在PBI-05204(PBI-23；夾竹桃的超臨界流體萃取物)及PBI-04711(PBI-05204的含三萜級分0-4)中發現的三種主要的三萜組分。藉由比較三萜在相似濃度下於腦切片糖氧剝奪(OGD)模型試驗中的神經保護活性，我們(發明人中的兩名)先前報導(Van Kanegan等人，在Nature Scientific Reports (2016年5月)，6:25626. doi: 10.1038/srep25626中)三萜對神經保護活性功效的貢獻。我們發現PBI‑05204 (PBI)及PBI-04711(級分0-4)提供神經保護活性。
已知夾竹桃屬物種的萃取物含有許多相異種類的化合物：強心苷、醣體、類固醇、三萜、多醣及其他。具體化合物包含夾竹桃苷；夾竹桃它羅苷；奧多諾苷；齊墩果酸；熊果酸；樺木酸；夾竹桃苷元；夾竹桃苷A；樺木醇(烏索-12-烯-3β,28-二醇)(urs-12-ene-3β,28-diol)；28-去甲烏索-12-烯-3β-醇(28-norurs-12-en-3β-ol)；烏索-12-烯-3β-醇；3β,3β-羥基-12-齊墩果烯-28-酸(3β,3β-hydroxy-12-oleanen-28-oic acid)；3β,20α-二羥基烏索-21-烯-28-酸(3β,20α-dihydroxyurs-21-en-28-oic acid)；3β,27-二羥基-12-烏索烯-28-酸(3β,27-dihydroxy-12-ursen-28-oic acid)；3β,13β-二羥基烏索-11-烯-28-酸(3β,13β-dihydroxyurs-11-en-28-oic acid)；3β,12α-二羥基齊墩果烷-28,13β-內酯(3β,12α-dihydroxyoleanan-28,13β-olide)；3β,27-二羥基-12-齊墩果-28-酸(3β,27-dihydroxy-12-oleanan-28-oic acid)；及其他組分。
病毒性出血熱(VHF)可由5種相異的病毒科導致：沙粒病毒科、布尼亞病毒科、絲狀病毒科、黃病毒科及副黏液病毒科。例如伊波拉病毒(EBOV)及馬堡病毒(MARV)等絲狀病毒是已知對人類致病性最高的病毒，並且是死亡率高達90%的病毒性出血熱爆發的病原體。各病毒體含有一個分子的反義單鏈RNA。除了支持性護理或對症治療外，沒有可用於治療EBOV(伊波拉病毒)及MARV(馬堡病毒)感染(即絲狀病毒感染)的市售治療有效藥及預防藥。五個伊波拉病毒種已被確認：塔伊森林型(Taï Forest)(原名為象牙海岸型，Ivory Coast)、蘇丹型(Sudan)、薩伊型(Zaire)、雷斯頓型(Reston)及班迪布交型(Bundibugyo)。
反義單鏈包膜RNA病毒((-)-(ss)-envRNAV)包含沙粒病毒科、布尼亞病毒科(布尼亞病毒目)、絲狀病毒科、正黏液病毒科、副黏液病毒科及彈狀病毒科中的病毒。反義病毒RNA與mRNA互補，此外在轉譯前必須藉由RNA聚合酶轉化為正義RNA；因此，反義病毒的純化RNA本身不具傳染性，因為必須將其轉換為正義RNA來複製。來自沙粒病毒科的示例性病毒及感染包含賴薩病毒、無菌性腦膜炎、瓜納瑞托病毒(Guanarito virus)、胡寧病毒(Junin virus)、盧約病毒(Lujo virus)、馬秋波病毒(Machupo virus)、薩比亞病毒(Sabia virus)及白水河病毒(Whitewater Arroyo virus)。來自布尼亞病毒科的示例性病毒及感染包含漢他病毒、克里米亞-剛果出血熱正內羅病毒。副黏液病毒科的示例性病毒及感染包含腮腺炎病毒、立百病毒(Nipah virus)、亨德拉病毒(Hendra virus)、呼吸道融合細胞病毒(RSV)、人類副流感病毒(HPIV)及NDV。來自正黏液病毒科的示例性病毒及感染包含流感病毒(A至C)、鮭魚貧血病毒(Isavirus)、托高土病毒(Thogotovirus)、誇蘭紮病毒(Quaranjavirus)、H1N1、H2N2、H3N2、H1N2、西班牙流感、亞洲流感、香港流感、俄羅斯流感。彈狀病毒科的示例性病毒及感染包含狂犬病病毒、水皰病毒、麗沙病毒屬、胞內水稻黃矮炮彈病毒。
黃病毒是正義、單鏈、包膜的RNA病毒((+)‑(ss)-envRNAV)。它們被發現於節肢動物中，主要為蜱及蚊子，並且在全世界引起廣泛的發病率及死亡率。部分蚊子傳播的病毒包含黃熱病、登革熱、日本腦炎、西尼羅病毒及茲卡病毒。部分蜱傳播的病毒感染包含蜱媒腦炎、凱氏森林病、Alkhurma症、鄂木斯克出血熱。儘管不是出血性感染，但波瓦生病毒(Powassan virus)是黃病毒。(+)-(ss)-envRNAV包含冠狀病毒科(人及動物病原體)、黃病毒科(人及動物病原體)、披膜病毒科(人及動物病原體)及動脈炎病毒科(Arterviridae family)(動物病原體)。
冠狀病毒(CoV)是冠狀病毒科的通用名稱。在人類身上，CoV引起的呼吸道感染通常是溫和的，但在諸如SARS(嚴重急性呼吸道症候群)-CoV、MERS(中東呼吸症候群冠狀病毒感染症)-CoV及COVID-19等稀有形式中是致命的。CoV具有螺旋對稱的核衣殼，並且基因組大小範圍為約26至約32千鹼基。其他示例性人類CoV包含CoV 229E、CoV NL63、CoV OC43、CoV HKU1及CoV HKU20。CoV的包膜攜帶三種醣蛋白：S-棘蛋白：受體結合、細胞融合、主要抗原；E-包膜蛋白：小、包膜相關蛋白；及M-膜蛋白：跨膜-出芽及包膜形成。在少數CoV類型中，存在第四種醣蛋白：HE-血凝素酯酶。基因組具有5'甲基化端帽及3'多聚腺苷酸尾，並作為mRNA直接發揮功能。CoV藉由細胞內吞及膜融合進入人類細胞；並在細胞的細胞質中進行複製。CoV藉由呼吸系統分泌物的氣溶膠、糞口途徑及機械傳播來傳播。大多數病毒在上皮細胞生長。偶爾可感染肝、腎、心臟或眼睛以及其他細胞類型諸如巨噬細胞。在感冒型呼吸道感染中，生長似乎侷限於上呼吸道上皮。冠狀病毒感染非常普遍並在全世界發生，其感染率為強季節性的，兒童在冬季的感染率最高，成人感染較為少見。冠狀病毒血清型的數目以及抗原變異程度是未知的。一生中可能出現再次感染的情況，意味著冠狀病毒存在多種血清型(已知至少四種)及/或抗原變異，因此，用單一疫苗針對所有血清型進行免疫的可能性極低。SARS是一種病毒肺炎，症狀包含發熱、乾咳、呼吸困難(呼吸急促)、頭痛及低氧血症(低血氧濃度)。典型的實驗室結果包含淋巴細胞減少症(淋巴細胞數量減少)及胺基轉移酶水平輕度升高(表示肝損傷)。由肺泡損傷引起的進行性呼吸衰竭可能導致死亡。SARS的典型臨床進程包含在感染的第一周症狀改善，接著在第二周惡化。對於能有效抵抗人類冠狀病毒的治療(組成物及方法)仍有著大量的需求。
夾竹桃苷及歐洲夾竹桃的萃取物已顯示出防止HIV-1的gp120包膜醣蛋白混入成熟病毒顆粒，並在體外抑制病毒感染性的功效(Singh等人，“ Nerium oleanderderived cardiac glycoside oleandrin is a novel inhibitor of HIV infectivity” in Fitoterapia (2013) 84，32-39)。
夾竹桃苷已顯示抗HIV活性，但未針對多種病毒進行評估。三萜齊墩果酸、樺木酸及熊果酸已被報導表現相異水平的抗病毒活性，但未針對多種病毒進行評估。樺木酸已顯示針對HSV-1 1C株、甲型流感H7N1、ECHO 6及HIV-1的部分抗病毒活性。齊墩果酸已顯示針對HIV-1、HEP C及HCV H株NS5B的部分抗病毒活性。熊果酸已顯示針對HIV-1、HEP C、HCV H株NS5B、HSV-1、HSV-2、ADV-3、ADV-8、ADV-11、HEP B、ENTV CVB1及ENTV EV71的部分抗病毒活性。就針對特定病毒的功效而言，夾竹桃苷、齊墩果酸、熊果酸及樺木酸的抗病毒活性是不可預測的。存在夾竹桃苷、齊墩果酸、熊果酸及/或樺木酸對其幾乎沒有抗病毒活性的病毒，意味著無法先驗地預測夾竹桃苷、齊墩果酸、熊果酸及/或樺木酸是否會對特定病毒屬表現抗病毒活性。
Barrows等人(“A screen of FDA-approved drugs for inhibitors of Zikavirus infection” in Cell Host Microbe(2016), 20, 259–270)報導了長葉毛地黃苷對茲卡病毒顯示抗病毒活性，但劑量太高且可能有毒。Cheung等人(“Antiviral activity of lanatoside C against dengue virus infection” in Antiviral Res.(2014) 111, 93–99)報導了毛花苷C對登革熱病毒顯示抗病毒活性。
人類嗜T淋巴球細胞病毒1型(HTLV-1)是一種反轉錄病毒，屬反轉錄病毒科及δ反轉錄病毒屬。它具有正義RNA基因組，可被反轉錄為DNA，接著整合至細胞DNA中。一旦整合，HTLV-1僅可以藉由病毒突觸在細胞之間傳播的前病毒形式繼續存在。即便有游離病毒體，也僅產生很少的量，儘管病毒存在於生殖器分泌物中，但血漿中通常沒有可檢測到的病毒。HTLV-1主要感染CD4 +T淋巴細胞，並導致成人T細胞白血病/淋巴瘤(ATLL)──一種罕見但具侵襲性的血液系統惡性腫瘤，除某些自身免疫/發炎病況外，包含傳染性皮膚炎、類風濕性關節炎、葡萄膜炎、角膜結膜炎、乾燥綜合症、休格倫氏症(Sjögren’s syndrome)及HAM/TSP等，還具有高治療抗性率及通常較差的臨床結果。HAM/TSP的臨床特徵是慢性進行性痙攣性輕癱、尿失禁及輕度感覺障礙。儘管ATLL在病因上與病毒潛伏期、致癌性轉化及HTLV-1感染細胞的選殖擴增有關，但例如HTLV-1相關的脊髓病/熱帶痙攣性輕癱(HAM/TSP)等發炎疾病是由自身免疫引起的及/或對前病毒複製及病毒抗原表達的免疫病理學響應引起的。HAM/TSP是一種進行性神經發炎疾病，其導致下部脊髓的退化及脫髓鞘。HTLV-1感染的循環T細胞侵襲中樞神經系統(CNS)，並引起針對病毒及可能的CNS成分的免疫病原學響應。神經損傷及隨後的退化可導致HAM/TSP患者嚴重殘疾。前病毒複製的持久性及HTLV-1感染的細胞在CNS中的增殖，導致針對病毒抗原的細胞毒性T細胞響應，這可能是神經組織自身免疫破壞的原因。
儘管已證明強心苷對少數病毒表現出部分抗病毒活性，特定化合物對不同病毒表現出的抗病毒活性水平非常不同，意味著當對相同病毒(一種或多種)進行評估時，部分會表現出非常差的抗病毒活性，部分則表現出較好的抗病毒活性。
對特定病毒感染具有治療活性的包含有夾竹桃苷、齊墩果酸、熊果酸、樺木酸或其任何組合的藥物組成物仍需改進。 ［先前技術文獻］無 ［專利文獻］無
本發明提供了一種用於治療及/或預防哺乳類受試者中病毒感染的藥物組成物及方法。本發明還提供了一種用於治療哺乳類受試者中例如病毒性出血熱(VHF)感染等病毒感染的藥物組成物及方法。本發明還提供了一種藉由施用前述藥物組成物治療哺乳動物中病毒感染的方法。本發明人已成功製備抗病毒組成物，其表現出足夠的抗病毒活性來證明其在治療人類及動物中病毒感染的用途。本發明人已開發採用特定給藥方案的相應治療方法。本發明還提供了一種處置具有病毒感染風險的受試者的預防方法，該方法包含在受試者感染上病毒之前，在延長的處置期間內以重複方式向受試者長期施用一個或複數個劑量的抗病毒組成物，從而防止受試者感染上病毒；其中前述抗病毒組成物包含夾竹桃苷。
在部分實施方案中，抗病毒組成物施用於具有病毒感染細胞的受試者，其中細胞表現出Na,K-ATP酶的α-3對α-1亞型升高的比例。
在部分實施方案中，病毒感染由任何下述病毒科導致：沙粒病毒科、動脈炎病毒、布尼亞病毒科、絲狀病毒科、黃病毒科、正黏液病毒科、副黏液病毒科、彈狀病毒科、反轉錄病毒科(特別是δ反轉錄病毒屬)、冠狀病毒科或披膜病毒科。在部分實施方案中，病毒感染是由(+)‑ss-envRNAV或(‑)‑ss-envRNAV引起的。
本發明的部分實施方案涉及治療絲狀病毒感染、黃病毒感染、亨尼病毒感染、甲病毒感染或披膜病毒感染的組成物及方法。可以治療的病毒感染至少包含伊波拉病毒、馬堡病毒、甲病毒、黃病毒、黃熱病、登革熱、日本腦炎、西尼羅病毒、茲卡病毒、委內瑞拉馬腦脊髓炎(腦炎)(VEE)病毒、屈公病毒、西部馬腦脊髓炎(腦炎)(WEE)病毒、東部馬腦脊髓炎(腦炎)(EEE)病毒、蜱媒腦炎、凱氏森林病、Alkhurma症、鄂木斯克出血熱、亨德拉病毒、立百病毒、δ反轉錄病毒屬、HTLV-1病毒及其種。
本發明的部分實施方案涉及用於治療來自下述病毒的病毒感染的組成物及方法：沙粒病毒科、動脈炎病毒科、布尼亞病毒科、絲狀病毒科、黃病毒科(黃病毒屬)、正黏液病毒科、副黏液病毒科、彈狀病毒科、反轉錄病毒科(δ反轉錄病毒屬)、冠狀病毒科、(+)-ss-envRNAV、(-)-ss-envRNAV或披膜病毒科。
本發明的部分實施方案涉及用於治療來自亨尼病毒屬、伊波拉病毒屬、黃病毒屬、馬堡病毒屬、δ反轉錄病毒屬、冠狀病毒屬(CoV)或α病毒屬的病毒的病毒感染的組成物及方法。
在部分實施方案中，(+)-ss-envRNAV是選自由下述組成之群組的病毒：冠狀病毒科、黃病毒科、披膜病毒科及動脈炎病毒科。
在部分實施方案中，(+)-ss-envRNAV是對人類有致病性的冠狀病毒。在部分實施方案中，冠狀病毒棘蛋白結合至人類組織中的ACE2(血管收縮素轉化酶2)受體。在部分實施方案中，冠狀病毒選自由下述組成之群組：SARS-CoV、MERS-CoV、COVID-19 (SARS-CoV-2)、CoV 229E、CoV NL63、CoV OC43、CoV HKU1及CoV HKU20。
在部分實施方案中，(+)-ss-envRNAV是選自由下述組成之群組的病毒：黃病毒、黃熱病毒、登革熱病毒、日本腦炎病毒、西尼羅病毒、茲卡病毒、蜱媒腦炎病毒、凱氏森林病病毒、Alkhurma症病毒、鄂木斯克出血熱病毒及波瓦生病毒。
在部分實施方案中，(+)-ss-envRNAV是選自由下述組成之群組的披膜病毒科病毒：蟲媒病毒(arborvirus)、東部馬腦脊髓炎病毒(EEEV)、西部馬腦脊髓炎病毒(WEEV)、委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒(VEEV)、屈公病毒(CHIKV)、阿尼昂尼昂病毒(ONNV)、Pogosta病病毒、辛得比斯病毒、羅斯河熱病毒(RRV)及塞姆利基森林病毒。
在部分實施方案中，(-)-ss-envRNAV是選自由下述組成的組之群組的病毒：沙粒病毒科、布尼亞病毒科(布尼亞病毒目)、絲狀病毒科、正黏液病毒科、副黏液病毒科或彈狀病毒科。
在部分實施方案中，沙粒病毒科病毒選自由下述組成之群組：賴薩病毒、無菌性腦膜炎、瓜納瑞托病毒、胡寧病毒、盧約病毒、馬秋波病毒、薩比亞病毒及白水河病毒。
在部分實施方案中，布尼亞病毒科病毒選自由下述組成之群組：漢他病毒、克裡米亞-剛果出血熱正內羅病毒。
在部分實施方案中，副黏液病毒科病毒選自由下述組成之群組：腮腺炎病毒、立百病毒、亨德拉病毒、呼吸道融合細胞病毒、人類副流感病毒(HPIV)及新城雞瘟病毒(NDV)。
在部分實施方案中，正黏液病毒科病毒選自由下述組成之群組：流感病毒(A至C)、鮭魚貧血病毒、托高土病毒、誇蘭紮病毒、H1N1病毒、H2N2病毒、H3N2病毒、H1N2病毒、西班牙流感病毒、亞洲流感病毒、香港流感病毒及俄羅斯流感病毒。
在部分實施方案中，彈狀病毒科病毒選自由下述組成之群組：狂犬病病毒、水皰病毒、麗沙病毒屬及胞內水稻黃矮炮彈病毒屬。
本發明還提供了用於HTLV-1相關病況或神經發炎疾病的治療的實施方案。在部分實施方案中，HTLV-1相關病況或神經發炎疾病選自由下述組成之群組：脊髓病/熱帶痙攣性輕癱(HAM/TSP)、成人T細胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、自身免疫性疾病、炎性疾病、感染性皮膚炎、類風濕性關節炎、葡萄膜炎、角膜結膜炎、乾燥綜合症、休格倫氏症及糞擬圓蟲。
本發明還提供一種抑制HTLV-1顆粒的感染性釋放至處理的細胞培養上清液中以及藉由抑制病毒突觸的Env依賴性形成來降低HTLV-1於細胞間傳播的方法，前述方法包含向有需要的受試者施用有效量的抗病毒組成物。
在部分實施方案中，本發明提供了一種含有下述(實質上由下述組成)的抗病毒組成物：a)特定強心苷(一種或多種)；b)多種三萜；或c)特定強心苷(一種或多種)及多種三萜的組合。
本發明一方面提供了一種藉由向受試者長期施用抗病毒組成物來治療受試者中病毒感染的方法，藉由向受試者長期施用治療有效量(治療相關劑量)的組成物來治療受試者，從而提供與病毒感染相關的症狀減輕或改善病毒感染。抗病毒組成物的施用可在感染後立即開始，或在感染後1天至5天內的任何時間開始，或在病毒感染明確被診斷後的最早時間開始向受試者施用組成物。病毒可以是本說明書所記載之任何病毒。
因此，本發明還提供了一種治療哺乳動物中病毒感染的方法，前述方法包含向哺乳動物施用一個或複數個治療有效劑量的抗病毒組成物。一個或複數個劑量於每天、每周或每月施用。每天可施用一個或複數個劑量。病毒可以是本說明書所記載之任何病毒。
本發明還提供了一種為有需要的受試者治療病毒感染的方法，前述方法包含： 確定受試者是否具有病毒感染； 指示抗病毒組成物的施用； 根據規定的初始給藥方案向受試者施用初始劑量的抗病毒組成物一段時間； 定期確定受試者對於用抗病毒組成物治療的臨床反應及/或治療反應的適當性；及 如果受試者的臨床反應及/或治療反應是適當的，則持續施用所需的抗病毒組成物治療直至達到期望的臨床終點；或 如果受試者在初始劑量及初始給藥方案下的臨床反應及/或治療反應是不適當的，則遞增或遞減劑量直至在受試者中達到期望的臨床反應及/或治療反應。
持續對受試者施用所需的抗病毒組成物進行治療，可按需調整劑量或給藥方案直至患者達到期望的臨床終點(一個或複數個)，例如減少或緩和與病毒感染相關的特定症狀。可藉由熟悉病毒感染的臨床醫生來進行臨床反應及/或治療反應的適當性的確定。
本發明的方法的各個步驟可在分開的設施或同一設施內進行。
本發明為本說明書所記載之所有實施方案提供代替的實施方案，其中用長葉毛地黃苷代替夾竹桃苷，或將夾竹桃苷與長葉毛地黃苷組合使用。本發明的方法可採用夾竹桃苷、長葉毛地黃苷或夾竹桃苷與長葉毛地黃苷的組合。因此，夾竹桃苷、長葉毛地黃苷、含有夾竹桃苷的組成物、含有長葉毛地黃苷的組成物或含有夾竹桃苷及長葉毛地黃苷的組成物可用於本發明的方法。強心苷可以被認為是夾竹桃苷、長葉毛地黃苷或其組合。含有強心苷的組成物包含夾竹桃苷、長葉毛地黃苷或其組合。
本發明還提供了一種治療冠狀病毒感染，特別是對人類有致病性的冠狀病毒的感染(例如SARS-CoV-2感染)的方法，前述方法包含向患有前述感染的受試者長期施用治療有效劑量的強心苷(含有強心苷的組成物)。
本發明還提供了一種治療冠狀病毒感染，特別是對人類有致病性的冠狀病毒感染例如SARS-CoV-2感染的雙途徑方法，前述方法包含向患有前述感染的受試者長期施用治療有效劑量的強心苷(含有強心苷的組成物)，從而抑制前述冠狀病毒的病毒複製並降低前述冠狀病毒的後代病毒之感染性。
本發明還提供了一種治療冠狀病毒感染，特別是SARS-CoV-2感染的方法，前述方法藉由向患有前述感染的受試者重複施用(藉由任何本說明書所討論的施用方式)複數個治療有效劑量的強心苷(含有強心苷的組成物)。可在每周的一天或多天及任意地每月一周或多周及任意地每年一個月或複數個月內，每天施用一個或複數個劑量。
本發明還提供了一種治療人類冠狀病毒感染的方法，該方法包含在2天至約2個月的治療期內每天向受試者施用1~10個劑量的強心苷(含有強心苷的組成物)。在治療期內，每天可以施用2至8、2至6，或4個劑量。劑量可以施用2天至約60天、2天至約45天、2天至約30天、2天至約21天或2天至約14天。前述施用可以藉由本說明書討論的任何施用方式進行。全身給藥理想為在前述受試者中提供夾竹桃苷及/或長葉毛地黃苷的治療有效的血漿水平。
在部分實施方案中，每天施用一個或複數個劑量的夾竹桃苷，施用多天直到治癒病毒感染。在部分實施方案中，每天施用一個或複數個劑量的強心苷(含有強心苷的組成物)，施用多天及多周直到治癒病毒感染。在一天內可以施用一個或複數個劑量。每天可以施用一個、二個、三個、四個、五個、六個或更多劑量。
在部分實施方案中，在治療患有例如冠狀病毒感染的感染受試者的血漿中，夾竹桃苷及/或長葉毛地黃苷的濃度為約10μg/mL以下、約5μg/mL以下、約2.5μg/mL以下、約2μg/mL以下或約1μg/mL以下。在部分實施方案中，在治療患有冠狀病毒感染的受試者的血漿中，夾竹桃苷及/或長葉毛地黃苷的濃度為約0.0001μg/mL以上、約0.0005μg/mL以上、約0.001μg/mL以上、約0.0015μg/mL以上、約0.01μg/mL以上、約0.015μg/mL以上、約0.1μg/mL以上、約0.15μg/mL以上、約0.05μg/mL以上或約0.075μg/mL以上。在部分實施方案中，在治療感染受試者的血漿中，夾竹桃苷及/或長葉毛地黃苷的濃度為約10μg/mL至約0.0001μg/mL、約5μg/mL至約0.0005μg/mL、約1μg/mL至約0.001μg/mL、約0.5μg/mL至約0.001μg/mL、約0.1μg/mL至約0.001μg/mL、約0.05μg/mL至約0.001μg/mL、約0.01μg/mL至約0.001μg/mL、約0.005μg/mL至約0.001μg/mL。本發明包含本說明書所記載的血漿濃度範圍的所有組合及選擇。
抗病毒組成物可長期施用，即以重複方式，例如每天、每隔一天、每兩天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周、每隔一周、每兩周、每三周、每月、每兩個月(bimonthly)、每半個月、每隔一個月、每隔兩個月、每季度、每隔一個季度、每三個月、季節性地、每半年及/或每年施用。治療期為一周或多周、一個月或複數個月、一季度或複數個季度及/或一年或多年。一天內一次或多次施用有效劑量的強心苷(含有強心苷的組成物)。
在部分實施方案中，向受試者每天施用強心苷140μg至315μg。在部分實施方案中，劑量包含20μg至750μg、12μg至300μg或12μg至120μg的強心苷。強心苷的每日劑量可為20μg至750μg、0.01μg至100mg或0.01μg至100μg的強心苷/天。SCF萃取物中存在的夾竹桃苷的推薦每日劑量通常為約0.25至約50μg每日兩次，或約0.9至5μg每天兩次或約每12小時。劑量可為約0.5至約100μg/天、約1至約80μg/天、約1.5至約60μg/天、約1.8至約60μg/天、約1.8至約40μg/天。最大耐受劑量可為約100μg/天、約80μg/天、約60μg/天、約40μg/天、約38.4μg/天或約30μg/天的含有夾竹桃苷的夾竹桃萃取物，最小有效劑量可為約0.5μg/天、約1μg/天、約1.5μg/天、約1.8μg/天、約2μg/天或約5μg/天。含有強心苷及三萜的合適劑量可為約0.05~0.5mg/kg/天、約0.05~0.35mg/kg/天、約0.05~0.22mg/kg/天、約0.05~0.4mg/kg/天、約0.05~0.3mg/kg/天、約0.05~0.5μg/kg/天、約0.05~0.35μg/kg/天、約0.05~0.22μg/kg/天、約0.05~0.4μg/kg/天，或約0.05~0.3μg/kg/天。在部分實施方案中，夾竹桃苷的劑量為約1mg至約0.05mg、約0.9mg至約0.07mg、約0.7mg至約0.1mg、約0.5mg至約0.1mg、約0.4mg至約0.1mg、約0.3mg至約0.1mg、約0.2mg。本發明包含本說明書所記載的劑量的所有組合。
在部分實施方案中，強心苷以至少兩個給藥階段施用：實施階段及維持階段。持續進行實施階段直到約達到強心苷的穩態血漿水平。維持階段始於治療開始或實施階段大約完成之後。劑量滴定可以發生在實施階段及/或維持階段。
本說明書所記載之所有給藥方案、給藥計劃及劑量均被認為是合適的；但是，某些給藥方案、給藥計劃及劑量對某些受試者比對其他受試者更適合。目標的臨床指標係用作前述給藥之依據。
前述抗病毒組成物可全身性施用。全身施用的方式包含非消化道、經口頰、腸內、肌內、皮下、舌下、經口、肺或口服。前述組成物亦可藉由注射或靜脈內施用。組成物亦可以藉由兩種或更多種途徑施用於同一受試者。在部分實施方案中，藉由選自由下述組成的組的任何兩種或更多種施用方式的組合來施用組成物：非消化道、經口頰、腸內、肌內、皮下、舌下、經口、肺及口服。
本發明還提供了舌下劑型，其包含夾竹桃苷及液體載體。本發明還提供了治療病毒感染，特別是冠狀病毒感染(例如本說明書所定義)的方法，前述方法包含向患有前述病毒感染的受試者舌下施用複數個含有夾竹桃苷(含有長葉毛地黃苷)組成物的劑量。在每周兩天或更多天及在每個月一周或多周內、任意地在每年一個月或複數個月內，每天可施用一個或複數個劑量。
在部分實施方案中，抗病毒組成物包含夾竹桃苷(或長葉毛地黃苷或夾竹桃苷及長葉毛地黃苷的組合)及油。該油可包含中鏈甘油三酯。抗病毒組成物可以包含一種、兩種或更多種含有夾竹桃苷的萃取物及一種或多種藥物賦形劑。
如果存在於抗病毒組成物中，另外的強心苷可進一步包含：奧多諾苷、夾竹桃它羅苷或夾竹桃苷元。在部分實施方案中，組成物進一步包含：a)一種或多種三萜；b)一種或多種類固醇；c)一種或多種三萜衍生物；d)一種或多種類固醇衍生物；或e)其組合。在部分實施方案中，組成物包含強心苷及a)兩種或三種三萜；b)兩種或三種三萜衍生物；c)兩種或三種三萜鹽類；或d)其組合。在部分實施方案中，三萜選自由齊墩果酸、熊果酸、樺木酸及其鹽類或衍生物組成的組。
本發明的部分實施方案包含該等包含至少一種藥物賦形劑及抗病毒組成物的藥物組成物。在部分實施方案中，抗病毒組成物包含：a)至少一種強心苷及至少一種三萜；b)至少一種強心苷及至少兩種三萜；c)至少一種強心苷及至少三種三萜；d)至少兩種三萜且不包含強心苷；e)至少三種三萜且不包含強心苷；或f)至少一種強心苷，例如夾竹桃苷、長葉毛地黃苷。如本說明書所用，除非另外指出，通用術語三萜及強心苷亦包含其鹽類及衍生物。
強心苷可在藥物組成物中以純的形式存在或作為含有一種或多種強心苷萃取物的一部分存在。三萜(一種或多種)可在藥物組成物中以純的形式存在或作為含有三萜(一種或多種)萃取物的一部分存在。在部分實施方案中，強心苷在藥物組成物中作為主要治療組分存在，意味著是主要負責抗病毒活性的組分。在部分實施方案中，三萜(一種或多種)在藥物組成物中作為主要治療組分(一種或多種)存在，意味著是主要負責抗病毒活性的組分(一種或多種)。
在部分實施方案中，藉由植物材料的萃取來獲得含有夾竹桃苷的萃取物。萃取物可包含植物材料的熱水萃取物、冷水萃取物、超臨界流體(SCF)萃取物、亞臨界流體萃取物、有機溶劑萃取物或其組合。在部分實施方案中，萃取物(生物質)已藉由使用任意地包含醇類的萃取流體或亞臨界流體二氧化碳之亞臨界流體萃取夾竹桃屬植物物料(生物質)而製備。在部分實施方案中，含有夾竹桃苷的組成物包含兩種或更多種相異類型的含有夾竹桃苷萃取物。
本發明的實施方案包含其中含有夾竹桃苷的夾竹桃屬物種( Neriumsp.)生物質(植物材料)：歐洲夾竹桃( Nerium oleander, Nerium oleanderL) (夾竹桃科)、紅花夾竹桃( Nerium odourum)、白夾竹桃、粉夾竹桃，黃花夾竹桃屬物種( Thevetiasp.)，黃花夾竹桃( Thevetia peruviana)、黃夾竹桃、黃花夾竹桃 (Thevetia nerifolia)、根癌農桿菌( Agrobacterium tumefaciens)、任何前述種的細胞培養物(細胞團)或其組合。在部分實施方案中，生物質包含葉、莖、花、樹皮、果實、種子、汁液及/或莢。
在部分實施方案中，萃取物包含在萃取時與強心苷一同獲得的至少一種其他藥學活性劑，當將萃取物施用於受試者時，其有助於強心苷的治療功效。在部分實施方案中，組成物進一步包含一種或多種其他非強心苷治療有效劑，即一種或多種不為強心苷的藥劑。在部分實施方案中，組成物進一步包含一種或多種抗病毒化合物。在部分實施方案中，抗病毒組成物不包含藥學活性多醣。
在部分實施方案中，萃取物包含一種或多種強心苷及一種或多種強心苷前體(例如強心甾、強心二內戊酯(cardadienolides)及強心三內戊酯(cardatrienolides)，其全部為強心苷的糖苷配基(aglycone)成分，例如，洋地黃毒苷、乙醯洋地黃毒苷、毛地黃毒苷配基、長葉毛地黃苷、乙醯基長葉毛地黃苷、長葉毛地黃苷配基、甲長葉毛地黃苷、毒毛花苷、磁麻苷、哇巴因或毒毛旋花子苷元)。萃取物可進一步包含強心苷的一種或多種醣體(glycone)成分(例如葡萄糖苷、果糖苷及/或葡萄糖醛酸苷)作為強心苷前體。因此，抗病毒組成物可包含一種或多種強心苷及選自由一種或多種糖苷配基成分及一種或多種醣體成分組成的組的兩種以上的強心苷前體。萃取物亦可包含一種或多種獲得自夾竹桃屬物種或黃花夾竹桃屬物種的植物材料的其他非強心糖苷治療有效劑。
在部分實施方案中，當比較基於夾竹桃苷含量的當量劑量時，含有夾竹桃苷(OL)、齊墩果酸(OA)、熊果酸(UA)及樺木酸(BA)的組成物比純夾竹桃苷更有效。
在部分實施方案中，總三萜含量(OA+UA+BA)與夾竹桃苷的莫耳比的範圍為約15:1至約5:1；或約12:1至約8:1；或約100:1至約15:1；或約100:1至約50:1；或約100:1至約75:1；或約100:1至約80:1；或約100:1至約90:1；或約10:1。
在部分實施方案中，單種三萜與夾竹桃苷的莫耳比的範圍如下：約2~8(OA)：約2~8(UA)：約0.1~1(BA)：約0.5~1.5(OL)；或約3~6(OA)：約3~6(UA)：約0.3~8(BA)：約0.7~1.2(OL)；或約4~5(OA)：約4~5(UA)：約0.4~0.7(BA)：約0.9~1.1(OL)；或約4.6(OA)：約4.4(UA)：約0.6(BA)：約1(OL)。
在部分實施方案中，其他治療劑，例如藉由夾竹桃屬物種或黃花夾竹桃屬物種的植物材料的萃取來獲得的治療劑，不是萃取物製備時得到的多醣，意味著其不是酸性均聚半乳糖醛酸(homopolygalacturonan)或阿拉伯半乳糖醛酸(arabinogalaturonan)。在部分實施方案中，萃取物不包含其它治療劑及/或不包含萃取物製備時得到的均聚半乳糖醛酸或阿拉伯半乳糖醛酸。
在部分實施方案中，其他治療劑，例如藉由夾竹桃屬物種或黃花夾竹桃屬物種的植物材料的萃取來獲得的治療劑是在萃取物製備過程中獲得的多醣，例如酸性均聚半乳糖醛酸或阿拉伯半乳糖醛酸。在部分實施方案中，萃取物包含另一種治療劑及/或包含在從前述植物材料製備萃取物時獲得的酸性均聚半乳糖醛酸或阿拉伯半乳糖醛酸。
在部分實施方案中，萃取物包含夾竹桃苷及至少一種其他選擇由下述組成之群組的化合物：強心苷、醣體、糖苷配基、類固醇、三萜、多醣、醣類、生物鹼、脂肪、蛋白質、夾竹桃它羅苷、奧多諾苷、齊墩果酸、熊果酸、樺木酸、夾竹桃苷元、夾竹桃苷A、樺木醇(烏索-12-烯-3β,28-二醇)、28-去甲烏索-12-烯-3β-醇、烏索-12-烯-3β-醇、3β,3β-羥基-12-齊墩果烯-28-酸、3β,20α-二羥基烏索-21-烯-28-酸、3β,27-二羥基-12-烏索烯-28-酸、3β,13β-二羥基烏索-11-烯-28-酸、3β,12α-二羥基齊墩果烷-28,13β-內酯、3β,27-二羥基-12-齊墩果-28-酸、均聚半乳糖醛酸、阿拉伯半乳糖醛酸、綠原酸，咖啡酸、L-奎寧酸、4-香豆醯輔酶A、3-O-咖啡醯奎寧酸、5-O-咖啡醯奎寧酸、強心苷B-1、強心苷B-2、歐夾竹桃苷元(oleagenin)、神經節苷脂(neridiginoside)、橙花苷(nerizoside)、奧多諾苷-H、由半乳糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖及半乳糖組成的3-β-O-(D-地芰糖苷)-5-β, 14β-二羥基-強心甾-20(22)-烯內酯果膠多醣、MW在17000~120000D的範圍內或MW約為35000D、約3000D、約5500D或約12000D的多醣、強心苷單糖苷(cardenolide monoglycoside)、強心苷N-1、強心苷N-2、強心苷N-3、強心苷N-4、孕烷、4,6-二烯-3,12,20-三酮、20R-羥基孕甾-4,6-二烯-3,12-二酮、16β,17β-環氧-12β-羥基孕甾-4,6-二烯-3,20-二酮、12β-羥基孕甾-4,6,16-三烯-3,20-二酮(歐奕二烯酮A)、20S,21-二羥基孕甾-4,6-二烯-3,12-二酮(歐奕二烯酮B)、夾竹桃香豆酸(neriucoumaric acid)、異夾竹桃香豆酸(isoneriucoumaric acid)、夾竹桃酸(oleanderoic acid)、夾竹桃烯(oleanderen)、8α-甲氧基半日花-18-酸、12-烏索烯、甘露糖苷(kaneroside)、neriumoside、3β-O-(D-地芰糖苷)-2α-羥基-8,14β-環氧基-5β-強心甾-16:17,20:22-二烯內酯、3β-O-(D-地芰糖苷)-2α, 14β-二羥基-5β-強心甾-16:17,20:22-二烯內酯、3β,27-二羥基-烏索-18-烯-13,28-內酯、3β,22α,28-三羥基-25-去甲-羽扇-1(10),20(29)-二烯-2-酮、 順-卡瑞寧(karenin)(3β-羥基-28-Z-對香豆醯氧基-烏索-12-烯-27-酸)、 反-卡瑞寧 (3-β-羥基-28-E-對香豆醯氧基-烏索-12-烯-27-酸)、3β-羥基-5α-強心甾-14(15), 20(22)-二烯內酯(β-脫水烏沙苷元)、3β-O-(D-洋地黃糖苷)-21-羥基-5β-強心甾-8,14,16,20(22)-四烯內酯(夾竹桃苷元-A-3β-D-洋地黃苷(neriumogenin-A-3β-D-digitaloside))、牛角瓜苷元(proceragenin)、歐奕二烯酮A、3β,27-二羥基-12-烏索烯-28-酸、3β,13β-二羥基烏索-11-烯-28-酸、3β-羥基烏索-12-烯-28-醛、28-甲基烏索-12-烯-3β-醇、烏索-12-烯-3β-醇、烏索-12-烯-3β, 28-二醇、3β,27-二羥基-12-齊墩果烯-28-酸、(20S, 24R)-環氧達瑪烷-3β,25-二醇、20β,28-環氧基-28α-甲氧基蒲公英甾-3β-醇、20β,28-環氧基蒲公英甾-21-烯-3β-醇、28-去甲-烏索-12-烯-3β,17β-二醇、3β-羥基烏索-12-烯-28-醛、α-neriursate、β-neriursate、3α-乙醯苯氧基-烏索-12-烯-28-酸、夾竹桃酸、卡那地酮(kanerodione)、3β-對羥基苯氧基-11α-甲氧基-12α-羥基-20-烏索烯-28-酸、28-羥基-20(29)-羽扇烯-3,7-二酮、kanerocin、3α-羥基-烏索-18,20-二烯-28-酸、D-沙門糖、D-地芰糖、神經節苷脂、橙花苷、異蓖麻油酸、龍膽甾苷(龍膽二糖苷神經節苷)、龍膽二糖苷清明花苷(gentiobiosylbeaumontoside)、龍膽二糖苷夾竹桃苷(gentiobiosyloleandrin)、歐夾竹桃苷丙(folinerin)、12β-羥基-5β-carda-8,14,16,20(22)-四烯內酯、8β-羥基-洋地黃毒苷元、Δ16-8β-羥基-洋地黃毒苷元、Δ16-苦參素(neriagenin)、烏髮醇、熊果醛、27(對香豆醯氧)熊果酸、夾竹桃醇、16-脫水-去乙醯基-神經節苷、9-D-羥基-順-12-十八酸、阿迪果苷(adigoside)、歐夾竹桃苷乙、α-香樹精、β-穀甾醇、菜油甾醇、橡膠(caoutchouc)、癸酸、辛酸、膽鹼、cornerin、cortenerin、去乙醯歐夾竹桃苷丙、二乙醯基-神經節苷、歐夾竹桃苷丙、漂筏苔胺(pseudocuramine)、槲皮素、槲皮素-3-鼠李葡糖苷、槲皮苷、rosaginin、蘆丁、硬脂酸、豆甾醇、洋地黃次苷、urehitoxin及烏沙苷元。萃取物中存在的另外成分由Gupta等人(IJPSR(2010(，1(3)，21-27，其全部公開內容藉由引用併入本說明書)揭示。
夾竹桃苷亦可以從源自根癌農桿菌轉化的癒傷組織的懸浮培養物的萃取物中獲得。根據本發明可以使用農桿菌的熱水、有機溶劑、水性有機溶劑或超臨界流體萃取物。
夾竹桃苷亦可以獲得自夾竹桃體外微培養物的萃取物，由此可以從例如Splendens Giganteum、Revanche或Alsace或其他品種等夾竹桃品種的幼苗及/或莖尖開始莖段培養。根據本發明，可以使用微培養的夾竹桃的熱水、有機溶劑、水性有機溶劑或超臨界流體萃取物。
萃取物亦可以藉由任何前述植物種的細胞團(例如存在於細胞培養物中)的萃取來獲得。
本發明還提供了強心苷在製備用於治療受試者中病毒感染的藥物中的用途。在部分實施方案中，前述藥物的製備包含：提供一種或多種本發明的抗病毒化合物；包含一個劑量的藥物劑型中的抗病毒化合物(一種或多種)；及包裝藥物劑型。在部分實施方案中，可如PCT國際申請號PCT/US06/29061中所記載進行製備。製備亦可包含一個或複數個附加步驟，例如：將包裝的劑型遞送至供應商(零售商、批發商及/或經銷商)；向患有病毒感染的受試者銷售或另外提供包裝的劑型；包含藥物標籤及包裝說明書，其提供關於劑型的使用、給藥方案、施用、含量及毒理學概況的說明。在部分實施方案中，病毒感染的治療包含：確定受試者患有病毒感染；根據給藥方案指示對受試者的藥物劑型的施用；向受試者施用一個或複數個藥物劑型，其中根據給藥方案施用前述一個或複數個藥物劑型。
藥物組成物可進一步包含選自由水溶性(混溶性)共溶劑、水不溶性(不混溶性)共溶劑、表面活性劑、抗氧化劑、螯合劑及吸收促進劑組成的組的至少一種材料的組合。
增溶劑至少是單一表面活性劑，但其亦可以是材料的組合，例如下述的組合：a)表面活性劑及水混溶性溶劑；b)表面活性劑及水不混溶性溶劑；c)表面活性劑、抗氧化劑；d)表面活性劑、抗氧化劑及水混溶性溶劑；e)表面活性劑、抗氧化劑及水不混溶性溶劑；f)表面活性劑、水混溶性溶劑及水不混溶性溶劑；或g)表面活性劑、抗氧化劑、水混溶性溶劑及水不混溶性溶劑。
藥物組成物任意地進一步包含：a)至少一種液體載體；b)至少一種乳化劑；c)至少一種增溶劑；d)至少一種分散劑；e)至少一種其他賦形劑；或f)其組合。
在部分實施方案中，水混溶性溶劑是低分子量(小於6000)PEG、乙二醇或乙醇。在部分實施方案中，表面活性劑是聚乙二醇化表面活性劑，意味著表面活性劑含有聚(乙二醇)官能團。
本發明包含本說明書揭示的本發明的方面、實施方案及子實施方案的所有組合。
本發明提供藉由向受試者長期施用或急性施用一種或多種有效劑量的抗病毒組成物(或包含抗病毒組成物及至少一種藥物賦形劑的藥物組成物)來治療受試者中病毒感染的方法。根據最適合受試者的給藥方案施用組成物，根據常規臨床試驗及病毒感染的臨床治療終點確定臨床劑量及給藥方案的適合性。
如本說明書所用，術語「受試者」意指溫血動物如哺乳動物，例如，貓、狗、小鼠、豚鼠、馬、牛、綿羊及人類。
如本說明書所用，具有病毒感染的風險的受試者為：a)居住在特別是伊蚊屬物種( Aedesspecies)(埃及斑蚊( Aedes egypti)、白紋伊蚊( Aedes albopictus))等蚊子生活的地理區域中的受試者；b)與具有病毒感染的個人或人群居住在一起或附近的受試者；c)與具有病毒感染的人存在性關係的受試者；d)居住在特別是壁蝨屬( Ixodesspecies)(種：馬科斯壁蝨( Ixodes marx)、肩突壁蝨( Ixodes scapularis)或考克壁蝨( Ixodes cooke))等蜱生活的地理區域的受試者；e)居住在果蝠生活的地理區域的受試者；f)居住在熱帶地區的受試者；g)居住在非洲的受試者；h)接觸具有病毒感染的其他受試者的體液的受試者；i)兒童；或j)免疫系統低下的受試者。在部分實施方案中，受試者為女性、能夠懷孕的女性或懷孕的女性。
根據本發明治療的受試者將表現治療反應。「治療反應」是指作為用強心苷治療的結果，遭受病毒感染的受試者將享有下述臨床獲益的至少一種：受試者血液或血漿中的活性病毒力價的降低、受試者血液或血漿中的活性病毒的根除、感染的改善、與感染相關的症狀的發生減少、感染的部分或全部緩解或感染進展時間增加，及/或引起前述病毒感染的病毒感染性降低。治療反應可以是全部或部分治療反應。
如本說明書所用，「進展時間」是確診(或治療)病毒感染後直至感染開始惡化的時段、長度或持續時間。這個術語是指感染程度持平而未進一步惡化的時段，且該時段在感染再次開始進展時結束。藉由在治療開始之前或開始時，將遭受感染的受試者「分階段」來確定疾病的進展。例如，在治療開始之前或開始時確定受試者的健康。接著用抗病毒組成物治療受試者，並定期地監測病毒力價。在稍後的時間點，感染的症狀可能惡化，由此標記感染的進展及「進展時間」的結束。期間感染不進展或期間感染的水平或嚴重程度沒有惡化的時間段為「進展時間」。
給藥方案包含根據給藥計劃施用的治療相關劑量(或有效劑量)的一種或多種強心苷及/或三萜(一種或多種)。因此，治療相關劑量是施用抗病毒組成物治療病毒感染所觀察到的治療反應，並且可向受試者施用抗病毒組成物而沒有過量不需要的、或有害副作用的治療劑量。治療相關劑量對於受試者是非致死的，儘管其在患者中可能導致部分副作用。施用治療相關劑量對於施用抗病毒組成物的受試者的臨床獲益水平，會超過因為抗病毒組成物或其組分(一種或多種)的施用而導致受試者經歷的有害副作用的水平。根據各種確立的藥理學、藥效學及藥代動力學原理，治療相關劑量在不同受試者中是不同的。然而，治療相關劑量(例如相對於夾竹桃苷)通常為約25μg、約100μg、約250μg、約500μg或約750μg的強心苷/天，或者其可在每劑量約25~750μg的強心苷範圍中，或者可不超過約25μg、約100μg、約250μg、約500μg或約750μg的強心苷/天。另一個治療相關劑量(例如相對三萜是單獨或共同的)的實施例通常為約0.1μg至100μg、約0.1mg至約500mg、約100至約1000mg每kg體重，約15至約25mg/kg、約25至約50mg/kg、約50至約100mg/kg、約100至約200mg/kg、約200至約500mg/kg、約10至約750mg/kg、約16至約640mg/kg、約15至約750mg/kg、約15至約700mg/kg或約15至約650mg/kg體重的範圍。根據藥劑學的基礎原理，已知在本領域中提供受試者目標治療結果所需的抗病毒組成物之實際量，在不同受試者中是不同的。
可以使用兩個或複數個給藥階段進行長葉毛地黃苷治療：實施階段及維持階段。實施階段可採用下述給藥方案直到達到長葉毛地黃苷的穩態血漿水平，在實施階段完成之後，維持階段可採用下述給藥方案。 [表1]
人類年齡 口服實施階段劑量，mcg/kg/天 口服維持階段劑量，mcg/kg/天
早產兒 20至30或15~25 4.7至7.8 2.3至3.9每天兩次
足月 25至35或20~30 7.5至11.3 3.8至5.6每天兩次
1至24個月 35至60或30~50 11.3至18.8 5.6至9.4每天兩次
2至5歲 30至45或25~35 9.4至13.1 4.7至6.6每天兩次
5至10歲 20至35或15~30 5.6至11.3 2.8至5.6每天兩次
超過10歲 10至15或8~12 3.0至4.5或2.4至3.6或3.4至5.1 3.0至4.5每天一次
可根據通常用於病毒感染治療的任何給藥方案來施用治療相關劑量。治療相關劑量可每天一次、兩次、三次或更多次施用。其可以每隔一天、每三天、每四天、每五天、每半周、每周、每兩周、每三周、每四周、每月、每兩個月(bimonthly)、每半月、每三個月、每四個月、每半年、每年，或根據上述的任何組合來施用以達到合適的給藥計劃。例如，治療相關劑量可以在一周或多周內每天一次或多次施用(最多每天10次以達到最高劑量)。
實施例15提供了體外試驗的詳細描述，前述試驗用於評估含有夾竹桃苷(作為唯一活性的)、Anvirzel™ (夾竹桃的熱水萃取物)及PBI‑05204(夾竹桃的超臨界流體(SCF)萃取物)的組成物對伊波拉病毒(圖1~2)及馬堡病毒(圖3~4)感染的治療功效，伊波拉病毒及馬堡病毒都為絲狀病毒。
熱水萃取物可以口服、舌下、皮下及肌內施用。一個實施方案可以以商品名為ANVIRZEL™ (Nerium Biotechnology, Inc., San Antonio, TX; Salud Integral Medical Clinic, Tegucigalpa, Honduras; www.saludintegral.com; www.anvirzel.com)作為液體劑型獲得。對於舌下施用，典型的給藥方案為1.5mL每天，或一天中三次0.5mL的劑量。對於注射施用，典型的給藥方案為約1至約2mL/天；或約0.1至約0.4ml/m 2/天，施用約1周至約6個月或更長；或約0.4至約0.8ml/m 2/天，施用約1周至約6個月或更長；或約0.8至約1.2ml/m 2/天，施用約1周至約6個月或更長。因為ANVIRZEL™的最大耐受劑量較高，故可以使用較高的劑量。ANVIRZEL™包含從夾竹桃中萃取(熱水萃取)的夾竹桃苷、夾竹桃苷元、多醣。市售小瓶含有約150mg的夾竹桃萃取物作為凍乾粉末(施用前用水複溶之前)，其含有從夾竹桃中萃取的約200至約900μg的夾竹桃苷、約500至約700μg的夾竹桃苷元，及多醣。前述小瓶亦可包含藥學賦形劑例如至少一種滲透劑，例如甘露醇、氯化鈉，至少一種緩衝劑，例如抗壞血酸鈉與抗壞血酸，至少一種防腐劑，例如對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸甲酯。
藉由將組成物以40μg/mL添加至細胞，接著添加病毒並培養1小時來設置實驗。將病毒添加至細胞時，組成物的最終濃度為20μg/mL。根據其含有的夾竹桃苷的濃度，可調節含有相異量的夾竹桃苷的組成，並轉換為莫耳濃度。圖1~4描述了基於萃取物的夾竹桃苷含量的功效。OL本身就是有效的。作為含有OL、OA、UA及BA的夾竹桃的SCF萃取物的PBI-05204實質上比OL本身更有效。作為夾竹桃的熱水萃取物的Anvirzel™比OL本身更有效。兩種萃取物在奈米莫耳範圍中清楚地表現功效。PBI-05204萃取物中的夾竹桃苷的百分比(1.74%)比Anvirzel中的百分比(0.459%，4.59μg/mg)更高。在PBI-05204的最高劑量下，其完全抑制EBOV及MARV感染，然而Anvirzel™不表現完全抑制，因為在高於20μg/mL劑量的Anvirzel™下，觀察到毒性。數據說明PBI-05204對伊波拉病毒及馬堡病毒具有最高抗病毒活性。PBI-05204中的三萜的組合增加了夾竹桃苷的抗病毒活性。
實施例6提供了體外試驗的詳細描述，前述試驗用於評估強心苷治療茲卡病毒(一種黃病毒)感染的功效。在存在夾竹桃苷(圖5)或長葉毛地黃苷(圖6)的情況下，以0.2的MOI用茲卡病毒(ZIKV PRVABC59株)感染Vero E6細胞。用病毒及強心苷培養細胞1小時，接著除去接種物及未吸收的強心苷(如果存在)。在新鮮培養液中浸漬細胞並且培養48小時，接著用福馬林固定細胞並且對ZIKV感染染色。數據說明兩種強心苷對於茲卡病毒具有抗病毒活性；然而，夾竹桃苷表現比長葉毛地黃苷更高(幾乎大8倍)的抗病毒活性。
實施例14提供了用於評估試驗組成物針對茲卡病毒及登革熱病毒的抗病毒活性的實驗的詳細描述。數據說明夾竹桃苷顯示針對茲卡病毒及登革熱病毒的功效。
圖7為總結各種組成物(夾竹桃苷、長葉毛地黃苷及PBI-05204)對於Vero E6細胞中伊波拉病毒(EBOV)的體外劑量反應抗病毒活性的圖表。圖8為描述總結各種組成物(夾竹桃苷、長葉毛地黃苷及PBI-05204)對於Vero E6細胞中馬堡病毒(MARV)的體外劑量反應抗病毒活性的圖表。圖9為描述總結在存在各種組成物(夾竹桃苷、長葉毛地黃苷及PBI-05204)的情況下，Vero E6細胞的體外細胞存活率的圖表。對於圖7~8，將宿主細胞在用病毒感染之前暴露於組成物。在存在夾竹桃苷、長葉毛地黃苷或PBI-05204(一種含夾竹桃苷的植物萃取物)的情況下，用EBOV/Kik(圖7，MOI=1)或MARV/Ci67(圖8，MOI=1)感染Vero E6細胞。1小時後，除去接種物及化合物並向細胞添加新鮮培養液。48小時後，固定細胞並免疫染色來檢測感染EBOV或MARV的細胞。使用Operetta計數感染的細胞。
為了確保在抗病毒活性方面沒有觀察到假陽性，檢測在存在組成物的情況下的細胞存活率。對於圖9中的數據，用上述化合物處理Vero E6細胞。藉由CellTiter-Glo測定ATP水平作為細胞存活率的測定。已確定夾竹桃苷、長葉毛地黃苷及PBI-05204不降低細胞存活率，意味著在本說明書其他圖式中詳述的抗病毒活性不是因為單一化合物的細胞毒性導致的假陽性所引起的。
因此，本發明提供了一種治療哺乳動物或宿主細胞中病毒感染的方法，前述方法包含：在染上前述病毒感染之前，向哺乳動物或宿主細胞施用抗病毒組成物，從而在前述哺乳動物或宿主細胞被病毒感染時，抗病毒組成物降低病毒力價並且改善、降低或消除病毒感染。
本發明的抗病毒組成物及方法在治療在施用抗病毒組成物前發生的病毒感染亦是有用的。用EBOV(圖10A、10B)或MARV(圖11A、11B)感染Vero E6細胞。在感染後2小時(圖10A、11A)或感染後24小時(圖10B、11B)，向細胞添加夾竹桃苷或PBI-05204 1小時，接著丟棄，並且將細胞培養至培養液中。
圖10A及10B為描述總結在暴露於病毒後不久，組成物(夾竹桃苷及PBI-05204)抑制Vero E6細胞中伊波拉病毒的能力的圖表：圖10A──感染後2小時；圖10B──感染後24小時。當在病毒感染後2小時內(或在長達12小時內)施用抗病毒組成物時，病毒力價抗病毒組成物提供有效的治療並且降低EBOV病毒力價。即使在24小時後，病毒組成物亦是有效的；然而，其功效隨著初始病毒感染後時間的增加而降低。對MARV進行相同的評估。圖11A及11B為描述總結在暴露於病毒後不久，組成物(夾竹桃苷及PBI-05204)抑制Vero E6細胞中馬堡病毒的能力的圖表：圖11A──感染後2小時；圖11B──感染後24小時。當在病毒感染後2小時內(或在長達12小時內)施用抗病毒組成物時，病毒力價抗病毒組成物提供有效治療並降低MARV病毒力價。即使在24小時後，病毒組成物亦是有效的；然而，其功效隨著初始病毒感染後時間的增加而降低。
考慮到本說明書組成物的抗病毒活性對於病毒感染細胞的單代為降低的，例如在感染後24小時內，我們評估了抗病毒組成物是否能夠抑制病毒繁殖，意味著是否抑制感染性後代的產生。在存在夾竹桃苷或PBI-05204的情況下，用EBOV或MARV感染Vero E6細胞，並且培養48小時。將來自感染的細胞培養物的上清液轉移至新鮮Vero E6細胞進行培養，培養1小時，接著丟棄。培養含有轉移的上清液的細胞48小時。如本說明書所記載，評估用EBOV(B)或MARV(C)感染的細胞。EBOV的對照感染率為66%，MARV的對照感染率為67%。本發明的抗病毒組成物抑制感染性後代的產生。
因此，本發明的抗病毒組成物：a)可在病毒感染前預防性地施用以在暴露於病毒後抑制病毒感染；b)可在病毒感染後施用以抑制或降低病毒複製以及感染性後代的產生；或c)即a)及b)的組合。
使用Vero E6細胞中的VEE病毒及WEE病毒來評估抗病毒組成物對於披膜病毒科甲病毒屬的抗病毒活性。圖13A及13B為描述總結各種組成物(夾竹桃苷、長葉毛地黃苷及PBI-05204)對於Vero E6細胞中委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒(圖13A)及西部馬腦脊髓炎病毒(圖13B)的體外劑量反應抗病毒活性的圖表。在存在或不存在指示化合物的情況下，用委內瑞拉馬腦炎病毒(圖13A，MOI=0.01)或西部馬腦炎病毒(圖13B，MOI=0.1)感染Vero E6細胞18小時。如前所記載檢測感染的細胞並在Operetta上計數。已發現本發明的抗病毒組成物是有效的。
因此，本發明提供了治療受試者或宿主細胞中由下述導致的病毒感染的方法：沙粒病毒科病毒、絲狀病毒科病毒、黃病毒科病毒(黃病毒屬)、反轉錄病毒科病毒、δ反轉錄病毒屬病毒、冠狀病毒科病毒、副黏液病毒科病毒或披膜病毒科病毒，前述方法包含施用有效量的抗病毒組成物，從而將病毒暴露於抗病毒組成物並治療前述病毒感染。
我們評估了本說明書所記載之夾竹桃苷及萃取物用於HTLV-1(人類嗜T淋巴球病毒1型；包膜反轉錄病毒；δ反轉錄病毒屬)感染的的治療的用途。為了確定純化的夾竹桃苷化合物或歐洲夾竹桃的萃取物是否可以抑制HTLV-1前病毒複製及/或含有p19 Ga的病毒顆粒的產生及釋放，用濃度增加的夾竹桃苷或歐洲夾竹桃萃取物，或無菌對照組載體(MilliQ處理含20% DMSO之ddH 2O )處理產生病毒的轉化HTLV-1 之SLB1淋巴瘤T細胞株，接著在37℃、10% CO 2下培養72小時。隨後藉由離心沉澱細胞，藉由進行抗HTLV-1 p19 GagELISA (Zeptometrix)確定釋放至培養物上清液中的細胞外含有p19 Gag的相對病毒顆粒量。
圖14為描述用對照組載體(1.5μL、7.5μL或15μL)，或濃度增加(10μg/mL、50μg/mL及100μg/mL)的夾竹桃苷化合物或歐洲夾竹桃的萃取物(實施例19及20)處理72小時的HTLV-1+SLB1淋巴瘤T細胞株所表達的HTLV-1 p19 Gag量化的數據。藉由進行抗HTLV-1 p19 GagELISA (Zeptometrix)來量化病毒複製及釋放至培養物上清液中的細胞外顆粒。夾竹桃苷無顯著抑制HTLV-1複製或新合成的病毒顆粒的釋放。我們確定，僅有萃取物或夾竹桃苷都不會顯著抑制病毒複製或含有p19 Gag的顆粒釋放至培養物的上清液。因此，我們預期無進一步的抗病毒活性；然而，我們出乎意料地發現，從處理過的細胞中收集的病毒顆粒對初代人外周血單個核細胞(huPBMC)表現降低的感染性。與HIV-1相異，細胞外HTLV-1顆粒的感染性較差，病毒傳播通常是藉由跨病毒突觸的直接細胞間相互作用而發生的。
本發明因此提供一種產生具有降低感染性的HTLV-1病毒顆粒的方法，前述方法包含用本發明的抗病毒組成物處理HTLV-1病毒顆粒，以提供具有降低感染性的HTLV-1病毒顆粒。
為了確保所觀察的抗病毒活性不是因為抗病毒組成物對HTLV-1+SLB1淋巴母細胞的潛在細胞毒性所引起的人工產物，我們評估了在處理的HTLV-1+SLB1淋巴母細胞培養物中不同稀釋的純化的夾竹桃苷化合物及歐洲夾竹桃萃取物的細胞毒性(實施例21)。如本說明書所記載，用濃度增加(10μg/ml、50及μg/ml 100μg/ml)的夾竹桃苷或歐洲夾竹桃萃取物處理SLB1 T細胞72小時。作為陰性對照組，進一步用增量(1.5μl、7.5μl及15μl)的、與藥物處理的培養物中所用的體積對應的載體溶液處理細胞。環磷醯胺(50μM；Sigma-Aldrich)處理的細胞作為凋亡的陽性對照組包含在內。接著，洗滌樣本並用Annexin V-FITC及碘化丙啶(PI)染色，並藉由共軛焦螢光顯微鏡進行分析。AnnexinV-FITC及/或PI陽性細胞的相對百分比藉由螢光顯微鏡進行定量，並使用20倍物鏡計數三次重複視野。
結果(圖15及圖16A~16F)說明最低濃度(10μg/ml)的夾竹桃苷及歐洲夾竹桃萃取物不誘導顯著的細胞毒性/凋亡。然而，較高濃度(約50及約100μg/ml)的粗植物萃取物比夾竹桃苷化合物要誘導明顯更多的凋亡。這與夾竹桃苷代表約1.23%的歐洲夾竹桃萃取物的事實相一致。由夾竹桃苷引起的細胞毒性不顯著較高於處理的TLV-1+SLB1細胞中之對照組載體。
接著，我們在共培養試驗中研究夾竹桃苷或歐洲夾竹桃萃取物是否可以抑制從表達綠色螢光蛋白(GFP)的HTLV-1+淋巴瘤T細胞株至huPBMC的病毒傳播(實施例20)。對於此等研究，在96孔微量滴定盤中用濃度增加的夾竹桃苷化合物或歐洲夾竹桃萃取物，或對照組載體處理HTLV-1+SLB1淋巴瘤T細胞72小時，接著收集含有病毒的上清液並直接用於感染初代培養的體外人外周血單個核細胞(huPBMC)。72小時後，對作為直接感染結果的、釋放至培養物上清液中的、細胞外含有p19 Gag的病毒顆粒的相對水平，進行抗HTLV-1 p19 GagELISA定量。
用對照組載體、增加濃度(10μg/ml、50μg/ml及100μg/ml)的歐洲夾竹桃萃取物或夾竹桃苷化合物處理HTLV-1+SLB1淋巴瘤T細胞株72小時，接著收集含有病毒的上清液，並直接用於感染初代huPBMC。對照組載體、歐洲夾竹桃萃取物或夾竹桃苷亦包含在huPBMC的培養基內。72小時後，收集培養物上清液並藉由進行抗HTLV-1 p19 GagELISA定量產生的細胞外病毒顆粒的相對量。
數據(圖17)表明：相較於等量的對照組載體，即使在最低濃度(10μg/ml)下，夾竹桃苷及歐洲夾竹桃萃取物二者均能抑制釋放至處理的細胞的培養物上清液中新合成之含有p19 Gag的病毒顆粒感染性。夾竹桃苷及粗萃取物二者都抑制病毒突觸的形成及HTLV-1體外的傳播。由夾竹桃苷處理的HTLV-1+淋巴瘤T細胞產生的細胞外病毒顆粒對初代huPBMC表現降低的感染性。重要的是，夾竹桃苷藉由減少包膜醣蛋白摻入成熟顆粒中而表現出針對包膜病毒的抗病毒活性，這代表了反轉錄病毒感染週期的獨特階段。
為了確保觀察到的抗病毒活性不是因為抗病毒組成物對處理的huPBMC的潛在細胞毒性而引起的人工產物，我們還研究了(實施例21)，與載體陰性對照組相比，處理的huPBMC中的純化的夾竹桃苷及歐洲夾竹桃萃取物的細胞毒性。分離初代血沉棕黃層huPBMC，並用植物血凝素(PHA)刺激，並在重組人類介白素-2(hIL-2)存在下進行培養。接著用濃度增加的夾竹桃苷或歐洲夾竹桃萃取物，或用體積增加的載體處理細胞72小時。隨後將樣本用Annexin V-FITC及PI染色樣本，並藉由共軛焦螢光顯微鏡重複三次計數，對每視野的凋亡(即Annexin V-FITC及/或PI陽性)細胞的相對百分比進行定量。
藉由處理初代huPBMC 72小時，評估對照組載體、歐洲夾竹桃萃取物及夾竹桃苷化合物的細胞毒性作用，接著用AnnexinV-FITC及PI對培養物進行染色。藉由螢光顯微鏡並使用20x物鏡計數重複三次的視野，對凋亡(即AnnexinV-FITC及/或PI陽性)細胞的相對百分比進行定量。使用DIC相位差顯微鏡確定細胞總數。環磷醯胺(50μM)處理的細胞作為凋亡的陽性對照組包含在內。NA表示此樣本中的細胞數太低，因為毒性較高，無法進行準確評估。
數據(圖18)表明與對照組載體相比，夾竹桃苷在huPBMC中顯示中度細胞毒性(例如，在最低濃度下為35~37%)。相反地，歐洲夾竹桃萃取物具有顯著的細胞毒性並且即使在最低濃度下亦能誘導高水平的細胞程序性死亡。與HTLV-1+SLB1淋巴母細胞相比，huPBMC對純化的夾竹桃苷更敏感了一些。然而，huPBMC對粗歐洲夾竹桃萃取物更加敏感，該萃取物還含有其他細胞毒性化合物，例如本說明書所記載之三萜。
我們進一步研究了(實施例22)在共培養實驗中夾竹桃苷或歐洲夾竹桃萃取物是否能夠干預HTLV-1顆粒向目標huPBMC的傳播。對於此等研究，用絲裂黴素C、接著用增加量的夾竹桃苷、歐洲夾竹桃萃取物，或對照組載體處理產生病毒的HTLV-1+SLB1 T細胞株15分鐘或3小時。用無血清培養液洗滌SLB1細胞2次，接著向每個孔中加入等量的huPBMC，並將樣本在加濕培養箱中於37℃、10%CO 2下，在完全培養液中共培養72小時。藉由進行抗HTLV-1 p19 GagELISA測定釋放至培養物上清液中的細胞外病毒水平，評估HTLV-1的相對細胞間傳播。
將初代huPBMC與絲裂黴素C處理的HTLV-1+SLB1淋巴瘤T細胞共培養，用對照組載體、濃度增加(10μg/mL、50μg/mL及100μg/mL)的歐洲夾竹桃萃取物或夾竹桃苷化合物預處理HTLV-1+SLB1淋巴瘤T細胞15分鐘或3小時。對照組載體、萃取物及化合物亦存在於共培養液中。72小時後，收集上清液，藉由進行抗HTLV-1 p19 GagELISA定量釋放的細胞外病毒顆粒的量。
圖19中描述的結果說明與對照組載體相比，夾竹桃苷及歐洲夾竹桃萃取物均抑制HTLV-1的傳播；然而，HTLV-1+SLB1細胞的15分鐘及3小時預處理之間沒有觀察到差異。
我們還研究了在共培養試驗中夾竹桃苷是否抑制病毒突觸的形成及HTLV-1的傳播(實施例22)。藉由用pLenti-6.2/V5-DEST-GFP載體轉導SLB1淋巴瘤T細胞，並使用殺稻瘟菌素(5μg/mL;Life Technologies)進行兩周的篩選，而產生表達GFP的HTLV-1+SLB1 T細胞株。藉由螢光顯微鏡(圖20上圖)及免疫印漬(圖20下圖)篩選GFP陽性選殖，並擴增及重複繼代。提供DIC相位差圖像以進行比較。
藉由螢光顯微鏡可視化huPBMC及絲裂黴素C處理的HTLV-1+SLB1/pLenti-GFP淋巴母細胞(綠色細胞)之間的病毒突觸形成，前述HTLV-1+SLB1/pLenti-GFP淋巴母細胞已用對照組載體或增加量(10μg/mL、50μg/mL及100μg/mL)的歐洲夾竹桃萃取物或夾竹桃苷化合物預處理3小時(圖21)。藉由使用20倍物鏡的螢光顯微鏡在20個視野( n=20)中定量感染的(即，HTLV-1 gp21-正，紅色)huPBMC(GFP-負)的相對百分比來評估病毒傳播(參見對照組載體圖中的箭頭)。計量螢光顯微鏡所獲得之數據(圖22)。可由數據確認：抗病毒組成物抑制了共培養試驗中的病毒突觸形成以及HTLV-1的傳播。
因此，本發明還提供了一種抑制(降低)釋放至處理的細胞培養物上清液的HTLV-1顆粒感染性以及藉由抑制病毒突觸的Env依賴性形成來降低HTLV-1細胞間傳播的方法，前述方法包含用有效量的抗病毒組成物處理病毒感染的細胞(體外或體內)。
針對鼻病毒(rhinovirus)感染評估了本說明書所記載之組成物的抗病毒活性。鼻病毒屬微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae family)及腸病毒屬(Enterovirus genus)。其為無包膜的、(+)極性的ss-RNA病毒。在本說明書採用的濃度及試驗中，已發現夾竹桃苷針對鼻病毒是無活性的，因為其並不抑制病毒複製。
如實施例26中所詳述，CoV感染可在體內治療，其中抗病毒組成物作為單一療法或組合療法施用於受試者。根據實施例27體內確立夾竹桃苷針對CoV的功效。摻在一小份橙汁中，對兒童施用0.25ml的重組ANVIRZEL™，接著每12小時，對兒童施用0.5ml的重組ANVIRZEL™約2~3天的時間，嬰兒從COVID-19感染中恢復。
根據實施例28，藉由體外評估獲得夾竹桃苷(含有夾竹桃苷的組成物)針對冠狀病毒例如SARS-CoV-2(COVID-19)的功效的進一步證明，其中用夾竹桃苷預處理Vero細胞，接著用SARS-CoV-2感染，細胞感染之後，洗去細胞外病毒及夾竹桃苷，接著用夾竹桃苷處理感染的細胞(圖23A：夾竹桃苷於0.1% v/v 水性DMSO中為1μg/mL；圖23C：夾竹桃苷於0.01% v/v 水性DMSO中為0.1μg/mL)或僅有水性DMSO作為對照組載體(圖23B：0.1% v/v 水性DMSO；圖23D：0.01% v/v 水性DMSO)。結果表明a)夾竹桃苷預處理在24小時引起病毒載量1368倍的降低，在48小時時間點引起369倍的降低；b)夾竹桃苷在約0.1至約1.0μg/mL的整個濃度範圍是有效的，其中高劑量比低劑量略好，故夾竹桃苷很可能在甚至更低的濃度，例如0.01至0.1μg/mL是有效的；c)夾竹桃苷應當重複施用，因為單劑量並不足以完全停止病毒複製；及d)使用僅用夾竹桃苷30分鐘預培養Vero細胞僅對減少初始病毒感染略有效，似乎不會影響後代病毒體的感染性。結果還表明濃度為0.1及1.0μg/mL的夾竹桃苷對Vero細胞沒有過度毒性。結果進一步表明夾竹桃苷抑制後代病毒的感染性藉：a)約1 log 10無持續藥物治療；及b)約＞3 log 10持續藥物治療(無毒性)。
為了確定夾竹桃苷是否直接抑制病毒複製，根據實施例29用SARS-CoV-2病毒感染Vero-E6細胞，並用相異濃度的夾竹桃苷處理。結果描述於圖24A及24B中。在24小時時間點(圖24A)，在僅用夾竹桃苷處理的孔中，僅在吸收階段(預處理數據)，觀察到抗病毒活性，近似的IC 50為0.625μg/mL。在用夾竹桃苷處理的孔中，對於試驗持續時間(持續時間數據)，即使在存在大量接種病毒的情況下，夾竹桃苷顯著限制病毒進入及/或病毒複製。在48小時時間點(圖24B)，在用夾竹桃苷處理的孔中僅在吸收階段期間(預處理數據)，在時間段的結束觀察到最低的抗病毒活性。在用夾竹桃苷處理的孔中對於試驗持續時間(持續時間數據)，夾竹桃苷顯著抑制病毒感染。可能的作用方法包含抑制病毒複製、組裝及/或釋放。
為了確保觀察到的夾竹桃苷針對SARS-CoV-2的抗病毒活性不是因為夾竹桃苷針對Vero-E6細胞的細胞外毒性引起的，在24小時(圖24A)及48小時(圖24B)時間點確定細胞力價。在夾竹桃苷的濃度為1.0μg/mL以上時，細胞毒性出現並潛在干擾測定；然而，在夾竹桃苷的濃度為0.625μg/mL以下時，顯著降低了細胞毒性的干擾，從而確認即使在非常低的濃度下的夾竹桃苷的強抗病毒活性。在實施例30的測定中觀察到夾竹桃苷針對Vero-E6細胞的毒性程度之額外證據(圖25)。在夾竹桃苷的濃度為0.625μg/mL時，在24小時時間點，約80%的Vero細胞可以存活，在較低的濃度下觀察到的毒性甚至更低。應理解為夾竹桃苷對Vero-E6細胞的毒性並不表明夾竹桃苷對人類有毒。在測定抗病毒活性時，這種毒性測定僅用於確定背景細胞死亡的潛在影響。
因此，夾竹桃苷至少具有雙重機制(途徑)用於治療病毒感染，特別是冠狀病毒感染，例如SARS-CoV-2感染：a)直接抑制病毒複製；及b)降低後代病毒的感染性。
此外，即使在非常低的劑量下夾竹桃苷亦具有抗病毒活性，並且夾竹桃苷表現出實質性的預防作用。根據實施例31對此進行說明，其中用SARS-CoV-2感染VERO CCL-81細胞。在感染之前用夾竹桃苷預處理細胞。感染後進行2小時的初培養後，洗滌感染的細胞來除去細胞外病毒及夾竹桃苷。接著，如下處理回收的感染細胞。用夾竹桃苷(在作為水溶液組分的各種濃度之夾竹桃苷於具有RPMI 1640培養液的DMSO水溶液中)或僅對照組載體(具有RPMI 1640的DMSO水溶液)處理感染的細胞，並在「處理」後24小時(圖26A)及48小時(圖26B)測定病毒力價。在無夾竹桃苷的情況下，SARS-CoV-2在24小時時間點達到高(約6 log 10噬菌斑形成單位(pfu)/mL)力價，並在隨後的時間點維持那個力價：它始終保持在等於或低於測定的檢測極限。濃度為1μg/mL至0.05μg/mL的夾竹桃苷即使在剛好24小時，亦提供大大降低的病毒力價。兩種較高劑量基本上將病毒力價降至等於或低於檢測極限，並且在任何經檢測的夾竹桃苷濃度下均未觀察到細胞毒性。此等樣本計算出之病毒力價呈倍數降低。在48小時的時間點觀察到病毒力價倍數降低(圖26C及26D)的範圍為約1,000倍至約40,000倍，在24小時的時間點觀察到約1,000倍至約20,000倍。儘管10ng/mL劑量在感染後24小時與其DMSO對照組相比沒有顯著的作用，但其在感染後48小時導致力價顯著降低。值得注意的是，並非在第24小時觀察，而是在第48小時觀察時，才出現了夾竹桃苷造成的病毒力價降低倍數的最高值。夾竹桃苷的預防效力隨時間(24小時與48小時)的增加反映在其EC 50值中，感染後24小時計算為11.98ng/ml，感染後48小時計算為7.07ng/ml。
對上述Vero CCL-81細胞進行基因組分析，以確定對SARS-CoV-2的抑制是全面性的抑制，抑或僅抑制其感染性顆粒產生的水平。從預防性研究的細胞培養物上清液中萃取RNA，並藉由qRT-PCR定量基因組等效物(實施例39)。在基因組等效物的水平上確認最初藉由感染性測定觀察到的夾竹桃苷的預防性作用。在感染後24小時，夾竹桃苷在四個最高劑量中顯著降低上清液中的SARS-CoV-2基因組。在基因組等效物的水平上確認最初藉由感染性測定觀察到的夾竹桃苷的預防性作用。在感染後24小時，夾竹桃苷在四個最高劑量中顯著降低上清液中的SARS-CoV-2基因組。
進行另外的研究以確定在感染後24小時及48小時的COVID-19感染對夾竹桃苷的劑量反應(圖27A~27B)。觀察到一項針對劑量的反應，即增加培養液中的夾竹桃苷濃度會大幅降低病毒力價。即使檢測中最低的濃度(0.05μg/mL)在感染後24小時也會造成力價降低，在感染後48小時甚至造成更大幅度的力價降低。最高劑量導致感染性SARS-CoV-2力價的超過1,000倍的降低，其中0.5µg/mL及100ng/mL劑量導致大於100倍的降低，50ng/ml劑量導致78倍的降低。
圖28A及28B為描述重複研究的結果，每項研究重複三次進行，以確定COVID-19對培養基中夾竹桃苷的相異濃度(0.005至1µg/mL)的處理的劑量反應。在大於0.01µg/mL的濃度下，在Vero CCL-81細胞中，感染後24小時及48小時甚至仍能觀察到大量的抗病毒活性。甚至在0.05µg/mL此一非常低的濃度下，亦會觀察到病毒力價大幅降低。
為了確定感染後夾竹桃苷的抗病毒功效，進行根據實施例34的研究。在感染之前不用夾竹桃苷預處理Vero CCL-81細胞。取而代之，用COVID-19病毒感染細胞，接著用夾竹桃苷(依指定濃度)在感染後12小時及24小時處理。接著在感染後24小時(圖29A)及48小時(圖29B)測定病毒力價。數據說明，即使僅用單一處理，夾竹桃苷可以在感染後至少12小時、至少24小時或至少36小時表現出抗病毒活性。值得注意的是，與人類的病毒感染過程相比，該測定在時間上有所壓縮，24小時時間點相當於人類感染後約5至7天，48小時時間點相當於人類感染後約10至14天。
使用雙重萃取組合組成物(PBI-A，含有溶解於DMSO(98重量%)的1重量%的乙醇萃取物、1重量%的實施例36)。圖30A詳述了根據實施例31的測定評估雙重萃取組合組成物的結果，圖30B詳述了根據實施例34的測定評估雙重萃取物(1重量%)的結果。圖30A中的數據說明基於原始儲備溶液的相對稀釋的PBI-A的相對抗病毒(抗COVID-19)功效。圖30B中的數據是基於測定溶液中的夾竹桃苷的相對濃度(µg/mL)。每幅圖的點狀線為描述可以使用CFU(聚落形成單位)測定檢測的病毒的最低濃度。
基於圖30A及30B的結果，雙重萃取組合組成物在包含0.05至1.0µg/mL的濃度下作為針對抗COVID-19的抗病毒劑是有效的，其與純夾竹桃苷中所觀察到的範圍相同。
同樣重要的是，觀察到在測定中評估的夾竹桃苷的濃度在劑量及血漿濃度方面為臨床相關的。
含有夾竹桃苷的組成物的安全性證據進一步由體外細胞測定提供，前述測定用於確定在前述細胞暴露於含有相異濃度夾竹桃苷的溶液後乳酸脫氫酶的釋放。經確定，在高達1µg/mL的濃度下，與對照組載體相比沒有其他毒性。
夾竹桃苷(含有夾竹桃苷的組成物，含有夾竹桃苷的萃取物)治療COVID-19病毒感染的功效，進一步根據實施例35在FDA擴大取得計劃(Expanded Access program of the FDA)下，藉由向受試者施用含有夾竹桃苷的舌下劑型(實施例32或37)來確立。以約6小時間隔每天四個15μg劑量的夾竹桃苷(作為雙重萃取物組成物)或以約8小時間隔每天三個15mg劑量的速度，每天向18至78歲年齡層的受試者施用。在治療開始前，觀察受試者的臨床狀態及/或病毒力價。部分受試者接受緩和療護(palliative care)或安寧照護(hospice care)。在一至兩周，十至十四天的治療期間，定期確定臨床狀態及/或病毒力價。開始處理後觀察到下述結果。 [表2]
年齡 (歲) 開始臨床表現 開始治療後的結果
78 女性；住院14天後被送回家伴有肺炎；呼吸困難，四肢乏力，咳嗽有痰，吸氧。 36小時後，症狀的緩解開始減輕。一星期後，受試者已完全康復。
51 女性；發燒，咳嗽，頭痛，身體酸痛。 3天內完全緩解症狀。
18 男性；發燒至華氏103.0度，偏頭痛，肌肉疼痛，脖子/肩膀疼痛，精神錯亂，眼睛充血，失去嗅覺，喉嚨痛，呼吸急促。 2天後，症狀減輕。4天後，症狀幾乎完全緩解。
35 女性；症狀35天；疲勞，疼痛，胸悶及呼吸時灼痛。 2天後，總體症狀改善約90%。
18 男性；Covid無症狀/陽性。病毒載量7,500~10,000。 4天後，病毒載量低於檢測極限。
18 男性；發燒，偏頭痛，呼吸困難，頭/頸痛，臥床不起。 36小時後，症狀總體改善約90%。
39 男性；發燒，疼痛，腹瀉。 在最初症狀出現的24小時內服用第一劑。第一劑的24小時內症狀消失。
41 男性；臥床不起，胸悶，發燒，喉嚨痛，嚴重咳嗽。 48小時內症狀幾乎完全消失。
47 女性；低度症狀29天；發燒，疲勞，胸悶。 一周之內可與家人團聚。
42 女性；症狀14天；發燒，疲勞，頭痛。 5天內改善約90%。
27 女性；症狀3天；疼痛，咳嗽，發燒，嗅覺及味覺喪失。 每天僅2劑，在2天後，幾乎完全恢復。
在FDA擴大取得計劃下對第二組顯示不同程度COVID-19相關症狀的受試者進行了另外的體內研究。開始治療之前，確定受試者的臨床狀態及/或病毒力價，以確認COVID-19感染。部分受試者表現出中度至嚴重的症狀。每天以約6小時間隔向年齡不等的受試者施用四組15μg劑量的夾竹桃苷(作為雙重萃取物組成物)。在一至兩周，十至十四天的治療期間，定期確定臨床狀態及/或病毒力價。在開始治療後的五到十二天內，所有受試者均完全從COVID-19感染中恢復過來。
夾竹桃苷已顯示產生強的抗發炎反應，這可以有助於預防SARS-CoV-2感染引起的過度發炎反應。
因此，本發明提供一種治療COVID-19病毒感染的方法，前述方法包含向具有前述感染的受試者施用多劑量的強心苷(含有強心苷的組成物，或含有強心苷的萃取物)。多劑量可以下述頻率施用：每天施用一劑以上的劑量，每周施用兩天以上；任意地，每個月施用一周以上；又任意地，每年施用一個月以上。理想的強心苷是夾竹桃苷。
因此，本發明提供一種治療冠狀病毒感染，特別是對人有致病性的冠狀病毒如SARS-CoV-2感染的方法，前述方法包含向具有前述感染的受試者長期施用治療有效劑量的強心苷(含有強心苷的組成物)。長期施用可以藉由重複施用一個以上(複數個)治療有效劑量的強心苷(含有強心苷的組成物)來實現。可以每周一天以上，任意地每個月一周以上，及任意地每年一個月以上，每天施用一個以上的劑量。
因此，本發明提供一種在有需要的受試者(特別是受試者)中治療病毒，例如CoV感染的方法，前述方法包含向受試者施用一個或複數個劑量的抗病毒組成物，前述抗病毒組成物包含a)夾竹桃苷；或b)萃取自夾竹桃屬物種的夾竹桃苷及一種或多種其他化合物。夾竹桃苷可以作為夾竹桃屬物種的萃取物的一部分而存在，其中萃取物可以是a)超臨界流體萃取物；b)熱水萃取物；c)有機溶劑萃取物；d)水性有機溶劑萃取物；e)使用超臨界流體，任意地，加上至少一種有機溶劑(萃取改性劑)的萃取物；f)使用亞臨界流體，任意地加上至少一種有機溶劑(萃取改性劑)的萃取物；或g)前述萃取物任何兩種或更多種的任何組合。
PBI-05204(如本說明書及Addington的US 8187644 B2(2012年5月29日公告)、Addington的US 7402325 B2(2008年7月22日公告)、Addington等人的US 8394434 B2(2013年3月12日公告)中所記載，其全部公開內容藉由引用併入本說明書)包含強心苷(夾竹桃苷，OL)及三萜(齊墩果酸(OA)、熊果酸(UA)及樺木酸(BA))作為主要藥理學活性組分。OL與全部三萜的莫耳比為約1：(10~96)。OA：UA：BA的莫耳比為約7.8：7.4：1。當基於等莫耳OL進行比較時，PBI-05204中的OA、UA及BA的組合增加了夾竹 桃苷的抗病毒活性。PBI-04711是PBI-05204的級分，但其不含有強心苷(OL)。PBI-04711中的OA：UA：BA的莫耳比為約3：2.2：1。PBI-04711亦具有抗病毒活性。因此，基於等莫耳含量的OL，含有OL、OA、UA及BA的抗病毒組成物比含有OL作為唯一活性成分的組成物更有效。在部分實施方案中，單種三萜與夾竹桃苷的莫耳比範圍如下：約2~8(OA)：約2~8(UA)：約0.1~1(BA)：約0.5~1.5(OL)；或約3~6(OA)：約3~6(UA)：約0.3~8(BA)：約0.7~1.2(OL)；或約4~5(OA)：約4~5(UA)：約0.4~0.7(BA)：約0.9~1.1(OL)；或約4.6(OA)：約4.4(UA)：約0.6(BA)：約1(OL)。
含有夾竹桃苷作為唯一抗病毒劑的抗病毒組成物在本發明的範圍內。含有長葉毛地黃苷作為唯一抗病毒劑的抗病毒組成物在本發明的範圍內。
含有夾竹桃苷及多種三萜作為抗病毒劑的抗病毒組成物在本發明的範圍內。在部分實施方案中，抗病毒組成物含有夾竹桃苷、齊墩果酸(其游離酸、鹽、衍生物或前驅藥)、熊果酸(其游離酸、鹽、衍生物或前驅藥)及樺木酸(其游離酸、鹽、衍生物或前驅藥)。化合物的莫耳比如本說明書所記載。
含有多種三萜作為主要活性成分(意味著不包含類固醇、強心苷及藥理學活性組分)的抗病毒組成物亦在本發明的範圍內。如上所記載，PBI-04711含有OA、UA及BA作為主要活性成分，並且其表現抗病毒活性。在部分實施方案中，基於三萜的抗病毒組成物包含OA、UA及BA，其在每次出現時各自獨立地選自其游離酸形式、鹽形式、氘化形式及衍生物形式。
PBI-01011是含有OA、UA及BA以三萜為基礎改良的抗病毒組成物，其中OA：UA：BA的莫耳比為約9~12：高達約2：高達約2；或約10：約1：約1；或約9~12：約0.1~2：約0.1~2；或約9~11：約0.5~1.5：約0.5~1.5；或約9.5~10.5：約0.75~1.25：約0.75~1.25；或約9.5~10.5：約0.8~1.2：約0.8~1.2；或約9.75~10.5：約0.9~1.1：約0.9~1.1。
在部分實施方案中，抗病毒組成物至少包含以本說明書所記載的OA與UA的莫耳比存在的齊墩果酸(包含其游離酸、鹽、衍生物或前驅藥)及熊果酸(包含其游離酸、鹽、衍生物或前驅藥)。OA的莫耳量大於UA。
在部分實施方案中，抗病毒組成物至少包含以本說明書所記載的OA與BA的莫耳比存在的齊墩果酸(包含其游離酸、鹽、衍生物或前驅藥)及樺木酸(包含其游離酸、鹽、衍生物或前驅藥)。OA的莫耳量大於BA。
在部分實施方案中，抗病毒組成物至少包含以本說明書所記載的OA對UA、OA對BA的莫耳比存在的齊墩果酸(包含其游離酸、鹽、衍生物或前驅藥)、熊果酸(包含其游離酸、鹽、衍生物或前驅藥)及樺木酸包含(其游離酸、鹽、衍生物或前驅藥)。OA的莫耳量大於UA以及BA。
在部分實施方案中，基於三萜的抗病毒組成物不包含強心苷。
通常，如下述記載方法治療具有沙粒病毒科感染、動脈炎病毒感染、絲狀病毒科感染、黃病毒科感染(黃病毒屬)、δ反轉錄病毒屬、冠狀病毒科、副黏液病毒科、正黏液病毒科或披膜病毒科感染的受試者。評估受試者以確定前述受試者是否被前述病毒感染，指示抗病毒組成物的施用，如指示的給藥方案向受試者施用初始劑量的抗病毒組成物一段時間(一個治療期)。定期確定受試者的臨床反應及治療反應水平，如果治療反應水平在一個劑量下過低，則如預先確定的劑量遞增計劃來遞增劑量直至在受試者身上達到期望的治療反應水平，按需繼續對受試者進行抗病毒組成物的治療。可按需調節劑量或給藥方案直至患者達到期望的一個或複數個臨床終點，例如感染自身的中止、感染相關症狀的減少，及/或感染的進展的減少。
如果臨床醫生欲用抗病毒組成物及一種或多種其他治療劑的組合來治療具有病毒感染的受試者，並且已知受試者具有的病毒感染對前述一種或多種其他治療劑的治療具有至少部分地治療反應，則本方法發明包含：向有需要的受試者施用治療相關劑量的抗病毒組成物及治療相關劑量的前述一種或多種其他治療劑，其中如第一給藥方案施用抗病毒組成物並且如第二給藥方案施用一種或多種其他治療劑。在部分實施方案中，第一及第二給藥方案是相同的。在部分實施方案中，第一及第二給藥方案是不同的。
本發明的抗病毒組成物(一種或多種)可作為主要抗病毒療法、輔助抗病毒療法或聯合抗病毒療法來施用。本發明的方法包含將抗病毒組成物與至少一種其他已知抗病毒組成物的分開施用或共同施用，意味著本發明的抗病毒組成物可在已知抗病毒組成物(一種或多種化合物)或用於治療病毒感染相關症狀的組成物的施用之前、期間或之後施用。例如，用於治療炎症、嘔吐、噁心、頭痛、發熱、腹瀉、蕁麻疹、結膜炎、身體不適、肌肉痛、關節痛、癲癇或麻痺的藥物可與本發明的抗病毒組成物一起施用或分開施用。
一種或複數種其他治療劑可以以臨床醫生公認的治療有效的劑量及基準給藥方案，或以臨床醫生公認的低於治療有效劑量的劑量施用。藉由抗病毒組成物及一種或多種其他治療劑的組合的施用來提供的臨床獲益及/或治療效果可以是累加的或協同的，這種獲益或效果的程度可以藉由比較組合施用，與單獨的抗病毒組成物組分(一種或多種)，以及一種或多種其他治療劑的施用來確定。可以藉由美國食品藥物管理局、世界衛生組織、歐洲藥品管理局(E.M.E.A.)、藥物管理局(TGA，澳大利亞)、泛美衛生組織(PAHO)、藥品及醫療器械安全管理局(Medsafe，紐西蘭)或各種世界衛生部門推薦或描述的劑量及基準給藥方案來施用一種或多種其他治療劑。
本發明的抗病毒組成物中包含示例性地其他治療劑可用於治療病毒感染，其包含抗反轉錄病毒劑、α-干擾素(IFN-a)、齊多夫定(zidovudine)、拉米夫定(lamivudine)、環孢黴素A(cyclosporine A)、具有三氧化二砷的CHOP、丙戊酸鈉、胺甲蝶呤、硫唑嘌呤、一種或多種症狀緩解藥物、節制類固醇藥物(steroid sparing drug)、皮質類固醇、環磷醯胺、免疫抑制劑、抗炎劑、Janus激酶抑制劑、托法替尼(tofacitinib)、鈣調磷酸酶抑制劑、他克莫司(tacrolimus)、mTOR抑制劑、西羅莫司(sirolimus)、依維莫司(everolimus)、IMDH抑制劑、硫唑嘌呤、來氟米特(leflunomide)、黴酚酸酯(mycophenolate)、生物製劑、阿巴西普(abatacept)、阿達木單抗(adalimumab)、阿那白滯素(anakinra)、賽妥珠單抗(certolizumab)、依那西普(etanercept)、戈利木單抗(golimumab)、英利昔單抗(infliximab)、伊西貝單抗(ixekizumab)、那他珠單抗(natalizumab)、利妥昔單抗(rituximab)、蘇金單抗(secukinumab)、托珠單抗(tocilizumab)、烏司奴單抗(ustekinumab)、維多珠單抗(vedolizumab)、單克隆抗體、巴利昔單抗(basiliximab)、達昔單抗(daclizumab)、多株抗體、核苷類似物、逆轉錄酶抑制劑、恩曲他濱(emtricitabine)、替比夫定(telbivudine)、阿巴卡韋(abacavir)、阿德福韋(adefovir)、地達諾辛(didanosine)、恩曲他濱(emtricitabine)、恩替卡韋(entecavir)、司他夫定(stavudine)、泰諾福韋(tenofovir)、阿奇黴素(azithromycin)、大環內酯型抗生素(macrolide-type antibiotic)、蛋白酶抑制劑、干擾素、免疫反應調節劑、mRNA合成抑制劑、蛋白質合成、抑制劑、噻唑化物(thiazolide)、CYP3A4抑制劑、雜環雙胍、CCR5受體抑制劑及其組合。研究的療法還包含血漿置換及/或放射。針對特定病毒的抗體亦可以施用於用本發明的抗病毒組成物治療的受試者。可以將獲得自第一病毒感染的倖存者的血液的血漿施用於具有相同類型的病毒感染的其他受試者，前述其他受試者亦被施用本發明的抗病毒組成物。例如，可以將來自COVID-19感染倖存者的血漿施用於患有COVID-19感染的另一名受試者，前述另一名受試者亦被施用本發明的抗病毒組成物。
實施例5提供了哺乳動物中茲卡病毒感染的示例性治療步驟。實施例12提供了哺乳動物中絲狀病毒感染(伊波拉病毒、馬堡病毒)的示例性治療步驟。圖13提供了哺乳動物中黃病毒感染(黃熱病、登革熱、日本腦炎、西尼羅病毒、茲卡病毒、蜱媒腦炎、凱氏森林病、Alkhurma症、鄂木斯克出血熱、波瓦生病毒感染)的示例性治療步驟。實施例25提供δ反轉錄病毒屬(HTLV-1)感染的示例性治療步驟。
存在於藥物組成物中的抗病毒化合物(如一種或多種三萜、一種或多種強心苷等等……)可以其未修飾形式、鹽形式、衍生物形式或其組合存在。如本說明書所用，術語「衍生物」是指：a)與第一化學物質結構上相關並且理論上可衍生自其的化學物質；b)由類似的第一化合物產生的化合物；或可想像因為第一化合物的一個原子被另一個原子或原子團取代，從而產生的化合物；c)由母體化合物衍生或獲得的，並且含有母體化合物的基本元素的化合物；或d)以一個或複數個步驟從相似結構的第一化合物產生的化學化合物。例如，衍生物可包含其氘化形式、氧化形式、脫水的、不飽及的、聚合物共軛的或其糖苷化形式，或可包含其酯、醯胺、內酯、同系物、醚、硫醚、氰基、胺基、烷基胺基、硫氫基、雜環、稠合雜環、聚合、聚乙二醇化、亞苄基、三唑基、哌嗪基或氘化形式。
如本說明書所用，除非另外指出，否則術語「夾竹桃苷」是指夾竹桃苷的所有已知形式。夾竹桃苷可以外消旋的、光學純的或光學富集的形式存在。可從例如諸如Aldridge Nursery(Atascosa, Texas)等商業植物供應商處獲得夾竹桃植物材料。
可以如US 7402325、US 8394434、US 8187644或PCT國際公開號WP 2007/016176 A2中所記載製備超臨界流體(SCF)萃取物，其全部公開內容藉由引用結合在此。可以在存在或不存在例如乙醇等改性劑(有機溶劑)的情況下，用超臨界二氧化碳進行萃取。
其他含有強心苷、特別是夾竹桃苷的萃取物可藉由各種相異的工藝製備。可藉由Huseyin Ziya Ozel博士開發的工藝(美國專利號5135745)來製備萃取物，其描述了用於製備熱水萃取物的步驟。據報導，水性萃取物含有分子量在2KD至30KD變化的多種多醣、夾竹桃苷、夾竹桃苷元、奧多諾苷及夾竹桃它羅苷。據報導，多醣包含酸性均聚半乳糖醛酸或阿拉伯半乳糖醛酸。Selvaraj等人的美國專利號5869060揭示夾竹桃屬物種的熱水萃取物及其生產方法，例如實施例2。接著凍乾所得萃取物來產生粉末。美國專利號6565897(Selvaraj等人的美國授權前公開號20020114852及PCT國際公開號WO 2000/016793)揭示了用於製備基本上無菌萃取物的熱水萃取工藝。Erdemoglu等人( J. Ethnopharmacol. (2003) 十一月. 89(1)，123-129)揭示了基於其鎮痛及抗發炎活性，包含夾竹桃的植物的水性及乙醇萃取物的比較結果。Adome等人( Afr. Health Sci.(2003) 八月. 3(2)，77-86；乙醇萃取物)、el-Shazly等人( J. Egypt Soc. Parasitol.(1996)，八月. 26(2)，461-473；乙醇萃取物)、Begum等人( Phytochemistry(1999) 二月. 50(3)，435-438；甲醇萃取物)、Zia等人( J. Ethnolpharmacol.(1995) 十一月. 49(1)，33-39；甲醇萃取物)及Vlasenko等人( Farmatsiia .(1972) 九月-十月. 21(5)，46-47；醇萃取物)揭示了歐洲夾竹桃的有機溶劑萃取物。Singh等人的美國授權前專利申請公開號20040247660揭示了用於癌症治療的夾竹桃苷的蛋白質穩定的脂質體製劑(protein stabilized liposomal formulation)的製備。Singh等人的美國授權前專利申請公開號20050026849揭示了含有環糊精的夾竹桃苷的水溶性製劑。Singh等人的美國授權前專利申請公開號20040082521揭示了來自熱水萃取物的夾竹桃苷的蛋白質穩定的奈米顆粒製劑的製備。
夾竹桃苷亦可以獲得自源自根癌農桿菌轉化的癒傷組織的上清液培養物的萃取物(Ibrahim等人，“Stimulation of oleandrin production by combined Agrobacterium tumefaciens mediated transformation and fungal elicitation in Nerium oleander cell cultures” in Enz. Microbial Techno. (2007)，41(3)，331-336，其全部公開內容藉由引用併入本說明書)。根據本發明，可以使用土壤桿菌的熱水、有機溶劑、水性有機溶劑或超臨界流體萃取物。
夾竹桃苷亦可以獲得自夾竹桃體外微培養物的萃取物，從而可以從Splendens Giganteum、Revanche、Alsace或其他品種等夾竹桃品種的幼苗及/或莖尖開始莖段培養(Vila等人，“Micropropagation of Oleander (Nerium oleander L.)” in HortScience (2010)，45(1)，98-102，其全部公開內容藉由引用併入本說明書)。根據本發明可以使用微量培養的夾竹桃的熱水、有機溶劑、水性有機溶劑或超臨界流體萃取物。
萃取物的多醣及碳水化合物的含量亦不同。相對於用葡萄糖製作的標準曲線，熱水萃取物含有407.3葡萄糖當量單位的碳水化合物，而針對SCF CO 2萃取物的分析發現了其中存在含量遠低於定量所需最低水平的碳水化合物。然而，夾竹桃的熱水萃取物中的碳水化合物的量比SCF CO 2萃取物中的碳水化合物的量高至少100倍。SCF萃取物的多醣含量可為0重量%、＜0.5重量%、＜0.1重量%、＜0.05重量%，或＜0.01重量%。在部分實施方案中，SCF萃取物不包含在植物物料的萃取期間得到的多醣。 [表3]
夾竹桃的製備 多醣 含量 ( μ g 葡萄糖當量 /mg 植物萃取物 )
熱水萃取物 407.3 ± 6.3
SCF CO 2萃取物 BLQ (低於定量極限)
藉由JEOL AccuTOF-DART質譜儀(JEOL USA, Peabody, MA, USA)上DART TOF-MS (直接分析即時飛行時間質譜儀，Direct Analysis in Real Time Time of Flight Spectrometry)來確定SCF CO 2萃取物及熱水萃取物的部分組成物。
夾竹桃屬物種或黃花夾竹桃屬物種的SCF萃取物是例如夾竹桃苷及三萜等藥理學活性化合物的混合物。藉由SCF工藝得到的萃取物，在環境溫度下為基本上不溶於水的黏性半固體(在去除溶劑後)。SCF萃取物包含許多具有各種相異水溶解度範圍的相異組分。來自超臨界流體工藝的萃取物含有以重量計理論範圍為0.9重量%至2.5重量%的夾竹桃苷，或1.7重量%至2.1重量%的夾竹桃苷，或1.7重量%至2.0重量%的夾竹桃苷。已得到包含相異量的夾竹桃苷的SCF萃取物。在一個實施方案中，SCF萃取物包含約2重量%的夾竹桃苷。與熱水萃取物相比，SCF萃取物含有3~10倍更高濃度的夾竹桃苷。這由HPLC及LC/MS/MS(串聯質譜)分析二者證實。
SCF萃取物包含夾竹桃苷及三萜齊墩果酸、樺木酸及熊果酸以及任意的本說明書所記載之其他組分。夾竹桃苷及三萜的含量可在批次之間相異；然而，變化程度不得過大。例如，針對一批SCF萃取物(PBI-05204)分析這四種組分，發現每種含有如下近似量。 [表4]
  夾竹桃苷 齊墩果酸 熊果酸 樺木酸
組分的含量(mg/g SCF萃取物) 20 73 69 9.4
組分的含量(重量%，WRT g SCF萃取物) 2 7.3 6.9 0.94
組分的含量(毫莫耳/g SCF萃取物) 34.7 160 152 20.6
相對於夾竹桃苷組分的莫耳比 1 4.6 4.4 0.6
WRT表示「相對於」。
相對於指示的值，各個組分的含量可以在±25%、±20%、±15%、±10%或±5%之間變化。因此，SCF萃取物中的夾竹桃苷的含量範圍可為：每mg SCF萃取物為20mg±5mg(其為20mg的±25%)。
夾竹桃苷、齊墩果酸、熊果酸、樺木酸及其衍生物亦可購自Sigma-Aldrich( www.sigmaaldrich.com；St. Louis, MO, USA)。長葉毛地黃苷可從HIKMA Pharmaceuticals International LTD(NDA N012648，酏劑，0.05 mg/mL；片劑，0.125 mg，0.25 mg)、VistaPharm Inc.(NDA A213000，酏劑，0.05 mg/mL)、Sandoz Inc.(NDA A040481，注射液，0.25 mg/mL)、West-Ward Pharmaceuticals International LTD (NDA A083391，注射液，0.25 mg/mL)、Covis Pharma BV(NDA N009330, 0.1 mg/mL, 0.25 mg/mL)、Impax Laboratories(NDA A078556，片劑，0.125 mg，0.25 mg)、Jerome Stevens Pharmaceuticals Inc.(NDA A076268，片劑，0.125 mg，0.25 mg)、Mylan Pharmaceuticals Inc.(NDA A040282，片劑，0.125 mg，0.25 mg)、Sun Pharmaceutical Industries Inc.(NDA A076363，片劑，0.125 mg，0.25 mg)、Concordia Pharmaceuticals Inc.(NDA A020405，片劑，0.0625，0.125 mg，0.1875 mg，0.25 mg，0.375 mg，0.5 mg，LANOXIN)、GlaxoSmithKline LLC(NDA 018118，膠囊，0.05 mg，0.1 mg，0.15 mg，0.2 mg，LANOXICAPS)購得。
如本說明書所用，單獨命名的三萜可在每次出現時獨立地選自其天然(未修飾、游離酸)形式、其鹽形式、衍生物形式、前驅藥形式或其組合。含有氘化形式的三萜的組成物及採用氘化形式的三萜的方法亦在本發明的範圍內。
齊墩果酸衍生物、前驅藥及鹽在下述文獻中被揭示：Gribble等人的US 20150011627 A1(2015年1月8日公開)、Rong等人的US 20140343108 A1(2014年11月20日公開)、Xu等人的US 20140343064 A1(2014年11月20日公開)、Anderson等人的US 20140179928 A1(2014年6月26日公開)、Bender等人的US 20140100227 A1(2014年4月10日公開)、Jiang等人的US 20140088188 A1(2014年3月27日公開)、Jiang等人的US 20140088163 A1(2014年3月27日公開)、Jiang等人的US 20140066408 A1(2014年3月6日公開)、Anderson等人的US 20130317007 A1(2013年11月28日公開)、Gribble等人的US 20130303607 A1(2013年11月14日公開)、Anderson等人的US 20120245374(2012年9月27日公開)、Jiang等人的US 20120238767 A1(2012年9月20日公開)、Shode等人的US 20120237629 A1(2012年9月20日公開)、Anderson等人的US 20120214814 A1(2012年8月23日公開)、Lee等人的US 20120165279 A1(2012年6月28日公開)、Arntzen等人的US 20110294752 A1(2011年12月1日公開)、Majeed等人的US 20110091398 A1(2011年4月21日公開)、Arntzen等人的US 20100189824 A1(2010年7月29日公開)、Jiang等人的US 20100048911 A1(2010年2月25日公開)，及Arntzen等人的US 20060073222 A1(2006年4月6日公開)，其全部公開內容藉由引用結合在此。
熊果酸衍生物、前驅藥及鹽在下述文獻中被揭示：Gribble等人的US 20150011627 A1(2015年1月8日公開)、Gribble等人的US 20130303607 A1(2013年11月14日公開)、Yoon等人的US 20150218206 A1(2015年8月6日公開)、Fritsche等人的US 6824811(2004年11月30日授權)、Ochiai等人的US 7718635(2010年5月8日授權)、Lin等人的US 8729055(2014年5月20日授權)，及Yoon等人的US 9120839(2015年9月1日授權)，其全部公開內容藉由引用併入本說明書。
樺木酸衍生物、前驅藥及鹽在下述文獻中被揭示：Gribble等人的US 20150011627 A1(2015年1月8日公開)、Gribble等人的US 20130303607 A1(2013年11月14日公開)、Shode等人的US 20120237629 A1(2012年9月20日公開)、Regueiro-Ren等人的US 20170204133 A1(2017年7月20日公開)、Nitz等人的US 20170096446 A1(2017年4月6日公開)、Parthasaradhi Reddy等人的US 20150337004 A1(2015年11月26日公開)、Parthasaradhi Reddy等人的US 20150119373 A1(2015年4月30日公開)、Yan等人的US 20140296546 A1(2014年10月2日公開)、Swidorski等人的US 20140243298 A1(2014年8月28日公開)、Parthasaradhi Reddy等人的US 20140221328 A1(2014年8月7日公開)、Leunis等人的US 20140066416 A1(2014年3月6日公開)、Durst等人的US 20130065868 A1(2013年3月14日公開)、Regueiro-Ren等人的US 20130029954 A1(2013年1月31日公開)、Zhang等人的US 20120302530 A1(2012年11月29日公開)、Power等人的US 20120214775 A1(2012年8月23日公開)、Honda等人的US 20120101149 A1(2012年4月26日公開)、Bullock等人的US 20110224182(2011年9月15日公開)、Hemp等人的US 20110313191 A1(2011年12月22日公開)、Pichette等人的US 20110224159 A1(2011年9月15日公開)、Parthasaradhi Reddy等人的US 20110218204(2011年9月8日公開)、Safe等人的US 20090203661 A1(2009年8月13日公開)、Krasutsky等人的US 20090131714 A1(2009年5月21日公開)、Krasutsky等人的US 20090076290(2009年3月19日公開)、Leunis等人的US 20090068257 A1(2009年3月12日公開)、Mukherjee等人的US 20080293682(2008年11月27日公開)、Pezzuto等人的US 20070072835 A1(2007年3月29日公開)、Jansen等人的US 20060252733 A1(2006年11月9日公開)，及O’Neill等人的US 2006025274 A1(2006年11月9日公開)，其全部公開內容藉由引用併入本說明書。
抗病毒組成物可以以任何合適的、藥學上可接受的劑型配製。非消化道、耳、眼、鼻、可吸入的、經口頰、舌下、腸內、局部的、口服、經口以及可注射劑型是特別有用的。特定劑型包含固體或液體劑型。示例性合適的劑型包含片劑、膠囊、丸劑、囊片、錠劑、沖劑、溶液、混懸劑、分散劑、小瓶、袋、瓶、可注射液體、 i.v.(靜脈內)、 i.m.(肌肉內)或 i.p.(腹腔內)可施用的液體，及藥學領域具有通常知識者已知的其他此類劑型。
因為病毒感染可同時影響複數個器官並引起多器官衰竭，藉由超過一種途徑施用組成物是有利的。例如，已知COVID-19影響肺、心臟、胃腸道及大腦。因此，含有強心苷的組成物可以有利地作為可吸入組成物及經口組成物施用；舌下組成物及經口組成物；可吸入組成物及舌下組成物；可吸入組成物及非消化道組成物；舌下組成物及非消化道組成物；經口組成物及非消化道組成物，或其他如此的組合。
可藉由將抗病毒組成物及藥學上可接受的賦形劑混合來製備含有抗病毒組成物的合適的 劑型，如本說明書或下述文獻中所記載：Pi等人(“Ursolic acid nanocrystals for dissolution rate and bioavailability enhancement: influence of different particle size” in Curr. Drug Deliv. (Mar 2016), 13(8), 1358-1366)、Yang等人(“Self-microemulsifying drug delivery system for improved oral bioavailability of oleanolic acid: design and evaluation” in Int. J. Nanomed. (2013), 8(1), 2917-2926)、Li等人(Development and evaluation of optimized sucrose ester stabilized oleanolic acid nanosuspensions prepared by wet ball milling with design of experiments” in Biol. Pharm. Bull. (2014), 37(6), 926-937)、Zhang等人(“Enhancement of oral bioavailability of triterpene through lipid nanospheres: preparation, characterization, and absorption evaluation” in J. Pharm. Sci. (June 2014), 103(6), 1711-1719)、Godugu等人(“Approaches to improve the oral bioavailability and effects of novel anticancer drugs berberine and betulinic acid” in PLoS One (Mar 2014), 9(3):e89919)、Zhao等人(“Preparation and characterization of betulin nanoparticles for oral hypoglycemic drug by antisolvent precipitation” in Drug Deliv. (Sep 2014), 21(6), 467-479)、Yang等人(“Physicochemical properties and oral bioavailability of ursolic acid nanoparticles using supercritical anti-solvent (SAS) process” in Food Chem. (May 2012), 132(1), 319-325)、Cao等人(“Ethylene glycol-linked amino acid diester prodrugs of oleanolic acid for PEPT1-mediated transport: synthesis, intestinal permeability and pharmacokinetics” in Mol. Pharm. (Aug. 2012), 9(8), 2127-2135)、Li等人(“Formulation, biological and pharmacokinetic studies of sucrose ester-stabilized nanosuspensions of oleanolic acid” in Pharm. Res. (Aug 2011), 28(8), 2020-2033)、Tong等人(“Spray freeze drying with polyvinylpyrrolidone and sodium caprate for improved dissolution and oral bioavailablity of oleanolic acid, a BCS Class IV compound” in Int. J. Pharm. (Feb 2011), 404(1-2), 148-158)、Xi等人(Formulation development and bioavailability evaluation of a self-nanoemulsified drug delivery system of oleanolic acid” in AAPS PharmSciTech (2009), 10(1), 172-182)、Chen等人(“Oleanolic acid nanosuspensions: preparation, in-vitro characterization and enhanced hepatoprotective effect” in J. Pharm. Pharmacol. (Feb 2005), 57(2), 259-264)，其全部公開內容藉由引用併入本說明書。
亦可根據Addington的US 8187644 B2(2012年5月29日授權)、Addington的US 7402325 B2(2008年7月22日授權)、Addington等人的US 8394434 B2(2013年3月12日授權)來製備合適的劑型，其全部內容藉由引用結合在此。亦可如實施例13~15中記載製備合適的劑型。
應特別注意的是：抗病毒化合物(強心苷、三萜或其組合)的有效量或治療相關量。術語「有效量」應理解為預期藥學有效量。藥學有效量是指：足以達到所需或期望的治療反應的活性成分的數量(amount)或含量(quantity)；或換言之，當向患者施用時足以產生可覺察的生物反應的量。可覺察的生物反應可作為活性物質的單一或複數個劑量的施用結果而產生。一個劑量可包含一種或多種劑型。應理解的是，任何患者的特定劑量水平將取決於多種因素，包含治療的適應症、適應症的嚴重程度、患者健康、年齡、性別、體重、飲食、藥理反應、採用的特定劑型及其他此類因素。
口服施用的期望劑量為至多5個劑型，儘管少至1個及多至10個劑型仍可作為單一劑量施用。示例性劑型可為每劑型包含0.01~100mg或0.01~100μg的抗病毒組成物，對於每劑量總計0.1至500mg(1至10劑量水平)。將根據可預先確定的及/或定製的以在受試者身上實現特定治療反應或臨床獲益的給藥方案來施用劑量。
強心苷可以以足夠向受試者提供的量，約20至約100μg、約12μg至約300μg或約12μg至約120μg的夾竹桃苷初始劑量存在於劑型中。劑型可包含約20至約100μg的夾竹桃苷、約0.01μg至約100mg或約0.01μg至約100μg夾竹桃苷、夾竹桃苷萃取物或含有夾竹桃苷的歐洲夾竹桃的萃取物。
抗病毒劑可包含在口服劑型中。劑型的部分實施方案為沒有腸溶衣的並且在0.5至1小時或更短的時間內釋放其攜帶的抗病毒組成物。劑型的部分實施方案為有腸溶衣的並且例如從空腸、迴腸、小腸及/或大腸(結腸)等胃的下游釋放其攜帶的抗病毒組成物。有腸溶衣的劑型將在口服施用後1~10小時內將抗病毒組成物釋放至體循環。
抗病毒組成物可以包含在快速釋放、立即釋放、受控釋放、緩釋、延長釋放、延遲釋放、突釋、連續釋放、緩慢釋放，或脈衝釋放劑型中，或在表現此等釋放類型的兩種或更多種的劑型中。來自劑型的抗病毒組成物的釋放曲線可為零級、偽零級、一級、偽一級或S型釋放曲線。在其中施用抗病毒組成物的受試者中的三萜的血漿濃度曲線可表現一個或複數個極大值(maxima)。
基於人類臨床數據，預期50%至75%夾竹桃苷的施用劑量將是可透過口服利用的，因此提供每劑型約10至約20μg、約20至約40μg、約30至約50μg、約40至約60μg、約50至約75μg，或約75至約100μg的夾竹桃苷。考慮到成年人的平均血容量為5公升，預期的夾竹桃苷的血漿濃度將在約0.05至約2ng/ml、約0.005至約10ng/ml、約0.005至約8ng/ml、約0.01至約7ng/ml、約0.02至約7ng/ml、約0.03至約6ng/ml、約0.04至約5ng/ml，或約0.05至約2.5ng/ml的範圍內。存在於SCF萃取物中的夾竹桃苷的推薦每日劑量通常為約0.2μg至約4.5μg/kg體重，一日兩次。夾竹桃苷的劑量可為約0.2μg至約1μg/kg體重/天、約0.5至約1.0μg/kg體重/天、約0.75至約1.5μg/kg體重/天、約1.5至約2.52μg/kg體重/天、約2.5至約3.0μg/kg體重/天、約3.0至約4.0μg/kg體重/天，或約3.5至4.5μg夾竹桃苷/kg體重/天。夾竹桃苷的最大耐受劑量可為約3.5μg/kg體重/天至約4.0μg/kg體重/天。最小有效劑量可為約0.5μg/天、約1μg/天、約1.5μg/天、約1.8μg/天、約2μg/天或約5μg/天。
因為其中存在不同的三萜的組合以及不同的莫耳比，可以由低至高劑量施用抗病毒組成物。用於人類的治療有效劑量為約100~1000mg或約100~1000μg的抗病毒組成物/Kg體重。上述劑量可在24小時內最高施用10次。以下指定其他合適的劑量範圍。 [表5]
組成物 夾竹桃苷 (莫耳) 齊墩果酸 (莫耳) 熊果酸 (莫耳) 樺木酸 (莫耳) 合適劑量
A 0.5~1.5 4~6 - - 0.05至0.5mg/kg/天
B 0.5~1.5 4~6 4~6 - 0.05至0.35mg/kg/天
C (PBI‑05204) 0.5~1.5 4~6 4~6 0.1~1 0.05至0.22mg/kg/天
D 0.5~1.5 - 4~6 - 0.05至0.4 mg/kg/天
E 0.5~1.5 - - 0.1~1 0.05至0.4 mg/kg/天
AA 約1 - - 0.3~0.7 0.05至0.4 mg/kg/天
AB 約1 約4.7 - - 0.05至0.5mg/kg/天
AC 約1 約4.7 約4.5 - 0.05至0.4mg/kg/天
AD (PBI‑05204) 約1 約4.7 約4.5 約0.6 0.05至0.22mg/kg/天
AE 約1 - 約4.5 - 0.05至0.4mg/kg/天
AF 約1 - - 約0.6 0.05至0.3mg/kg/天
所有數值均為近似值，意味著「約略等於」上述數值。
應注意的是，本說明書化合物在本發明的組成物或製劑中可具有一種或多種功能。例如，化合物可用作表面活性劑及水混溶性溶劑二者或用作表面活性劑及水不混溶性溶劑二者。
液體組成物可包含一種或多種藥學上可接受的液體載體。液體載體可為水性、非水性、極性、非極性及/或有機載體。液體載體包含─例如但不限於─水混溶性溶劑、水不混溶性溶劑、水、緩衝液及其混合物。
如本說明書所用，可交換使用的術語「水溶性溶劑」或「水混溶性溶劑」是指與水不形成兩相混合物的有機液體，或充分溶於水來提供含有至少5%的溶劑且無液相分離的水性溶劑混合物的有機液體。溶劑適用於施用給人類或動物。示例性水溶性溶劑包含─例如但不限於─PEG(聚(乙二醇))、PEG 400(具有約400分子量的聚(乙二醇))、乙醇、丙酮、烷醇、醇、乙醚、丙二醇、丙三醇、三乙酸甘油酯、聚(丙二醇)、PVP(聚(乙烯基吡咯烷酮))、二甲基亞碸、N,N-二甲基甲醯胺、甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、吡啶、丙醇、N-甲基乙醯胺、丁醇、soluphor(2-吡咯烷酮)、pharmasolve(N-甲基-2-吡咯烷酮)。
如本說明書所用，可交換使用的術語「水不溶性溶劑」或「水不混溶性溶劑」是指其與水形成兩相混合物的有機液體，或當水中的溶劑的濃度超過5%時形成相分離的有機液體。溶劑適用於施用給人類或者動物。示例性水不溶性溶劑包含─例如但不限於─中/長鏈甘油三酯、油、蓖麻油、玉米油、維生素E、維生素E衍生物、油酸、脂肪酸、橄欖油、softisan 645 (二甘油辛酸酯/癸酸酯/硬脂酸酯/羥硬脂酸酯己二酸酯)、miglyol、captex(Captex 350：甘油三辛酸酯/癸酸酯/月桂酸甘油三酯；Captex 355：甘油三辛酸酯/癸酸甘油三酯；Captex 355 EP/NF：甘油三辛酸酯/癸酸中鏈甘油三酯)。
在「國際醫藥法規協和會(ICH)工業指南 Q3C 雜質：殘留溶劑(International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) guidance for industry Q3C Impurities: Residual Solvents)」(1997)中列出合適的溶劑，這對在藥物中多少量的殘留溶劑被視為安全的提出了建議。示例性溶劑被列為第2類或第3類溶劑。第3類溶劑包含─例如─乙酸、丙酮、苯甲醚、1-丁醇、2-丁醇、乙酸丁酯、叔丁基甲基醚、異丙基苯、乙醇、乙醚、乙酸乙酯、甲酸乙酯、甲酸、庚烷、乙酸異丁酯、乙酸異丙酯、乙酸甲酯、甲基-1-丁醇、甲基乙基酮、甲基異丁基酮、2-甲基-1-丙醇、戊烷、1-戊醇、1-丙醇、2-丙醇或乙酸丙酯。
可在本發明中用作水不混溶性溶劑的其他材料包含：Captex 100：丙二醇二癸酸酯；Captex 200：丙二醇二辛酸酯/二癸酸酯；Captex 200 P：丙二醇二辛酸酯/二癸酸酯；丙二醇二辛酸癸酸酯( Propylene Glycol Dicaprylocaprate)；Captex 300：甘油三辛酸酯/癸酸酯；Captex 300 EP/NF：甘油三辛酸酯/癸酸中鏈甘油三酯；Captex 350：甘油三辛酸酯/癸酸酯/月桂酸酯；Captex 355：甘油三辛酸酯/癸酸酯；Captex 355 EP/NF：甘油三辛酸酯/癸酸中鏈甘油三酯；Captex 500：三乙酸甘油酯；Captex 500 P：三乙酸甘油酯(醫藥級)；Captex 800：丙二醇二(2-乙基己酸酯)；Captex 810 D：甘油三辛酸酯/癸酸酯/亞油酸酯；Captex 1000：甘油三癸酸酯；Captex CA：中鏈甘油三酯；Captex MCT-170：中鏈甘油三酯；Capmul GMO：甘油單油酸酯；Capmul GMO-50 EP/NF：甘油單油酸酯；Capmul MCM：中鏈甘油單酯&中鏈甘油二酯(Medium Chain Mono- & Diglycerides)；Capmul MCM C8：甘油單辛酸酯；Capmul MCM C10：甘油單癸酸酯；Capmul PG-8：丙二醇單辛酸酯；Capmul PG-12：丙二醇單月桂酸酯；Caprol 10G10O：十油酸十甘油酯；Caprol 3GO：三聚甘油單油酸酯；Caprol ET：混合的脂肪酸的聚甘油酯；Caprol MPGO：六聚甘油二油酸酯；Caprol PGE 860：十聚甘油單、二油酸酯(Decaglycerol Mono-, Dioleate)。
如本說明書所用，「表面活性劑」是指含有極性或帶電的親水性部分以及非極性疏水性(親脂性)部分的化合物；亦即，表面活性劑是兩親性的。術語表面活性劑可指一種化合物或多種化合物的混合物，表面活性劑可以是增溶劑、乳化劑或分散劑，表面活性劑可為親水性的或疏水性的。
親水性表面活性劑可為任何適用於藥物組成物的親水性表面活性劑，上述表面活性劑可為陰離子型、陽離子型、兩性離子型或非離子型，儘管目前以非離子型親水性表面活性劑為佳。如上述所記載，此等非離子型親水性表面活性劑通常將具有大於約10的HLB值。親水性表面活性劑的混合物亦在本發明的範圍內。
類似地，疏水性表面活性劑可為任何適用於藥物組成物的疏水性表面活性劑。通常，合適的疏水性表面活性劑將具有小於約10的HLB值。疏水性表面活性劑的混合物亦在本發明的範圍內。
其他合適的增溶劑的實例包含：醇類及多元醇類，例如乙醇、異丙醇、丁醇、苯甲醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇及其異構體、甘油、季戊四醇、山梨醇、甘露醇、卡必醇(transcutol)、異山梨醇二甲基醚、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、羥丙基甲基纖維素及其他纖維素衍生物、環糊精及環糊精衍生物；具有約200至約6000平均分子量的聚乙二醇的醚類，例如四氫糠醇聚乙二醇醚(三縮四乙二醇，可商購自BASF，商品名為Tetraglycol)或甲氧基聚乙二醇(Union Carbide)；醯胺類，例如2-吡咯烷酮、2-哌啶酮、己內醯胺、N-烷基吡咯烷酮、N-羥基烷基吡咯烷酮、N-烷基哌啶酮、N-烷基己內醯胺、二甲基乙醯胺，及聚乙烯吡咯烷酮；酯類，例如丙酸乙酯、檸檬酸三丁酯、乙醯檸檬酸三乙酯、乙醯檸檬酸三丁酯、檸檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、三乙酸甘油酯、丙二醇單乙酸酯、丙二醇二乙酸酯、己內酯及其異構體、戊內酯及其異構體、丁內酯及其異構體；以及其他本領域已知的增溶劑，例如二甲基乙醯胺、異山梨醇二甲基醚(Arlasolve DMI (ICI))、N-甲基吡咯烷酮(Pharmasolve (ISP))、單辛酸甘油酯、二甘醇單乙醚(可購自Gattefosse，商品名Transcutol)及水。增溶劑的混合物亦在本發明的範圍內。
除非另外指出，本說明書提及的化合物可容易地從標準商業來源獲得。
儘管不是必需的，組成物或製劑可進一步包含一種或多種螯合劑、一種或多種防腐劑、一種或多種抗氧化劑、一種或多種吸附劑、一種或多種酸化劑、一種或多種鹼化劑、一種或多種消泡劑、一種或多種緩衝劑、一種或多種著色劑、一種或多種電解質、一種或多種鹽、一種或多種穩定劑、一種或多種張力調節劑(tonicity modifier)、一種或多種稀釋劑，或其組合。
本發明的組成物亦可包含油類，例如固定油、花生油、芝麻油、棉籽油、玉米油及橄欖油；脂肪酸類，例如油酸、硬脂酸及異硬脂酸；以及脂肪酸酯類，例如油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、脂肪酸甘油酯及乙醯化脂肪酸甘油酯。組成物亦可包含醇類，例如乙醇、異丙醇、十六烷醇、甘油及丙二醇；甘油縮酮類，例如2,2-二甲基-1,3-二氧戊環-4-甲醇；醚類，例如聚(乙二醇)450；石油烴類，例如礦物油及凡士林；水；藥學上適合的表面活性劑、懸浮劑或乳化劑；或其混合物。
應理解的是，用於藥物製劑領域的化合物通常具有多種功能或目的。因此，如果本說明書命名的化合物僅被提及一次或被用於定義一個以上的本說明書的術語，其目的或功能不應解釋為僅限於所聲稱的一個或複數個目的，或一種或多種功能。
製劑的一種或多種組分可以以其游離鹼、游離酸或者藥學上或分析上可接受的鹽形式存在。如本說明書所用，「藥學上或分析上可接受的鹽」是指已經按需要將其與酸反應來形成離子鍵對而修飾成的化合物。可接受的鹽類的實例包含由例如無毒無機或有機酸形成的常規無毒鹽類。適合的無毒鹽類包含源自如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磺酸、胺磺酸、磷酸、硝酸等無機酸的那些，及本領域具有通常知識者已知的其他鹽類。由有機酸製備的鹽類，及本領域具有通常知識者已知的其他鹽類，前述有機酸為例如胺基酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、帕莫酸、馬來酸、羥基馬來酸、苯乙酸、麩胺酸、苯甲酸、水楊酸、對胺基苯磺酸、2-乙醯氧基苯甲酸、富馬酸、甲苯磺酸、甲基磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羥乙基磺酸。另一方面，在藥學上活性成分具有酸性官能團的情況下，添加藥學上可接受的鹼來形成藥學上可接受的鹽。在Remington´s Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Company, Easton，PA，1985，p. 1418中發現其他合適的鹽類列表，相關公開內容藉由引用結合在此。
本說明書採用的用語「藥學上可接受的」是指在合理的醫學判斷範圍內，適用於與人類及動物的組織接觸而沒有過度毒性、刺激、過敏反應或任何其他問題或併發症，與合理的受益/風險比相稱的該等化合物、材料、組成物及/或劑型。
可以藉由製藥工廠中習知的任何常規手段來製造劑型。可藉由在容器中提供至少一種液體載體及抗病毒組成物來製備液體劑型。一種或多種其他賦形劑可包含在液體劑型中。可藉由提供至少一種固體載體及抗病毒組成物來製備固體劑型。一種或多種其他賦形劑可包含在固體劑型中。
可以使用常規包裝設備及材料來包裝劑型。其可包含在包裝、瓶、小瓶、袋、注射器、包膜(envelope)、小包(packet)、泡罩包裝、盒、安瓿瓶或其他同類的容器中。
本發明的組成物可包含在任何劑型中。特定劑型包含固體或液體劑型。示例性合適的劑型包含片劑、膠囊、丸劑、囊片、錠劑、沖劑及藥學領域具有通常知識者已知的其他同類的劑型。
鑑於前述描述及下述實施例，本技術領域中具有通常知識者將能夠實施所要求保護的本發明而無需過度試驗。參考下述實施例將更好地瞭解前述內容，此等實施例詳述製備本發明的實施方案的特定過程。下述實施例中的所有參考文獻都是為了說明的目的。下述實施例不應被認為是窮舉的，而是僅說明了本發明所預期的許多實施方案中的少數。
Vero CCL81細胞用於預防及治療試驗(ATCC, Manassas, VA)。在Vineet Menachery(UTMB, Galveston, TX)惠贈的Vero E6細胞中進行噬斑測定。將細胞維持在具有5% CO 2的37⁰C培養箱中。利用補充有5%胎牛血清(FBS)(Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA)及1%青黴素/鏈黴素(Gibco, NY)的Dulbecco改良Eagle培養基(Gibco, Grand Island, NY)來培養細胞。維持培養基將FBS降低到2%，但在其他方面相同。SARS-CoV-2，USA_WA1/2020株(Genbank登錄號MT020880)由世界新興病毒及蟲媒病毒參考中心(World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses)提供。所有研究均使用了SARS-CoV-2的NextGen定序的Vero第4代儲備。 ［實施例］
實施例 1粉末狀夾竹桃葉的超臨界流體萃取
方法A. 用二氧化碳 收成、清洗並乾燥夾竹桃葉材料，接著藉由例如美國專利號5,236,132、5,598,979、6,517,015及6,715,705中記載的該等粉碎及脫水設備，來製備粉末狀夾竹桃葉。使用的起始材料的重量為3.94kg。 在萃取器裝置中，在300bar(30MPa，4351psi)的壓力及50℃(122℉)的溫度下，將起始材料與純CO 2組合。使用了總計197kg的CO 2，以達到溶劑與原材料比為50:1。接著，將CO 2及原材料的混合物送入分離裝置，藉由改變混合物的壓力及溫度以分離萃取物與二氧化碳。 獲得具有良好香味(fragrance)的、褐色的、膠黏的(sticky)、黏稠(viscous)的萃取物(65g)。顏色可能是因為葉綠素及其他殘留的發色化合物所導致的。為了確定準確的產率，用丙酮沖洗管及分離器，並且蒸發丙酮來得到另外9g的萃取物。總萃取量為74g。基於起始材料的重量，萃取物的產率為1.88%。使用高壓液相色譜法及質譜法計算的萃取物中的夾竹桃苷的含量為560.1mg，或0.76%之產率。
方法B. 用二氧化碳及乙醇的混合物 收成、清洗、並乾燥夾竹桃葉材料，接著藉由例如美國專利號5,236,132、5,598,979、6,517,015及6,715,705中記載的該等粉碎及脫水設備，來製備粉末狀夾竹桃葉。使用的起始材料的重量為3.85kg。 在萃取器裝置中，在280bar(28MPa，4061psi)的壓力及50℃(122℉)的溫度下，將起始材料與純CO 2以及作為改性劑的5%乙醇組合。使用了總計160kg的CO 2及8kg的乙醇，以達到溶劑與原材料比為43.6:1。接著，將CO 2、乙醇及原材料的混合物送入分離裝置，藉由改變混合物的壓力及溫度以分離萃取物與二氧化碳。 去除乙醇後，得到深綠色、膠黏的、黏稠塊狀的萃取物(207g)，其成分明顯含有部分葉綠素。基於起始材料的重量，萃取物的產率為5.38%。使用高壓液相色譜法及質譜法計算的萃取物中的夾竹桃苷的含量為1.89g，或0.91%之產率。
實施例2 粉末狀夾竹桃葉的熱水萃取物。 (比較例) 通常使用熱水萃取以從夾竹桃葉中萃取夾竹桃苷及其他活性組分。熱水萃取工藝的實例可在美國專利號5,135,745及5,869,060中找到。 使用5g粉末狀夾竹桃葉來進行熱水萃取。向粉末狀夾竹桃葉添加10體積的沸水(按夾竹桃起始材料的重量計)，並持續攪拌混合物6小時。接著過濾混合物並收集葉殘留物，在相同條件下再萃取一次。合併濾液並凍乾。萃取物的外觀為褐色。乾燥的萃取物材料的重量為約1.44g。在水中溶解34.21mg的萃取物材料並使用高壓液相色譜法及質譜法進行夾竹桃苷含量分析。確定夾竹桃苷的量為3.68mg。基於萃取物的量，夾竹桃苷的產率計算後為0.26%。
實施例 3藥物組成物的製備。
方法A. 基於Cremophor的藥物遞送系統 以下成分以所示量提供。 載體#1 (LN2005-055-035) [表6]
試劑名稱 功能 製劑的百分比 (% w/w)
抗病毒組成物 活性劑 3.7
維生素E 抗氧化劑 0.1
Labrasol 表面活性劑 9.2
乙醇 共溶劑 9.6
Cremophor EL 表面活性劑 62.6
Cremophor RH40 表面活性劑 14.7
將賦形劑分配至廣口瓶中並在60℃下在New Brunswick Scientific C24KC冷凍培養箱搖床(Refrigerated Incubator shaker)中搖動24小時以確保均勻。接著取出樣本並目視檢查是否溶解。24小時後，在所有製劑中，賦形劑及抗病毒組成物均全部溶解。
方法B. 基於GMO/Cremophor的藥物遞送系統 以下成分以所示量提供。 載體#2 (LN2005-055-045) [表7]
試劑名稱 功能 製劑的百分比 (% w/w)
抗病毒組成物 活性劑 4.7
維生素E 抗氧化劑 0.1
Labrasol 表面活性劑 8.5
乙醇 共溶劑 7.6
Cremophor EL 表面活性劑 56.1
甘油單油酸酯 表面活性劑 23.2
遵循方法A的步驟。
方法C. 基於Labrasol的藥物遞送系統 以下成分以所示量提供。 載體#3 (LN2005-055-047) [表8]
試劑名稱 功能 製劑的百分比 (% w/w)
抗病毒組成物 活性劑 3.7
維生素E 抗氧化劑 0.1
Labrasol 表面活性劑 86.6
乙醇 共溶劑 9.6
遵循方法A的步驟。
方法D. 基於維生素E-TPGS的膠束形成系統 以下成分以所示量提供。 [表9]
組分 功能 重量 % (w/w)
維生素E 抗氧化劑 1.0
維生素E TPGS 表面活性劑 95.2
抗病毒組成物 活性劑 3.8
遵循方法A的步驟。
方法E. 多組分藥物遞送系統 以下成分以所示量提供。 [表10]
組分 重量 (g) 重量 % (w/w)
維生素E 10.0 1.0
Cremophor ELP 580.4 55.9
Labrasol 89.0 8.6
甘油單油酸酯 241.0 23.2
乙醇 80.0 7.7
抗病毒組成物 38.5 3.7
總計 1038.9 100
遵循方法A的步驟。
方法F. 多組分藥物遞送系統 以下成分以所示的包含在膠囊中的量提供。 [表11]
組分 商品名 重量 % (w/w)
抗病毒組成物 FLAVEX Naturextrakte 0.6
維生素E   1.3
辛醯己醯聚氧甘油酯 Labrasol Gattefosse 3074TPD 11.1
月桂醯聚氧甘油酯 Gelucire 44/14 Gattefosse 3061TPD 14.6
聚乙二醇35蓖麻油 Kolliphor BASF Corp. 50251534 72.4
總計   100
遵循方法A的步驟。
實施例 4腸溶膠囊的製備
步驟I：充液膠囊的製備 用實施例3的液體組成物填充硬明膠膠囊(50個，00尺寸)。將此等膠囊手動填充800mg的製劑，接著用50%乙醇/50%水溶液手動密封。接著用以指示量含有下述成分的22%明膠溶液手動捆紮此等膠囊。 [表12]
成分 重量 (g)
明膠 140.0
聚山梨醇酯80 6.0
水 454.0
總計 650.0
充分混合明膠溶液並溶脹1~2小時。溶脹期過後，蓋緊溶液並置於55℃烘箱中使其液化。一旦全部明膠溶液變為液體，進行捆紮(banding)。 使用尖圓頭3/0繪畫畫筆將溶膠溶液塗在膠囊上。使用Shionogi提供的捆紮工具。捆紮後，在環境條件下保持膠囊12小時以使捆紮固化。
步驟II：充液膠囊的包衣 由下表中列出的成分製備包衣分散液。 [表13]
成分 重量 % 固體 % 固體 (g) g/ 批
Eudragit L30D55 40.4 60.5 76.5 254.9
TEC 1.8 9.0 11.4 11.4
AlTalc 500V 6.1 30.5 38.5 38.5
水 51.7 na na 326.2
總計 100.0 100.0 126.4 631.0
參數 設置
包衣設備 Vector LDCS-3
批量 500g
進氣溫度 40℃
排氣溫度 27~30℃
進氣量 20~25CFM
包衣鍋轉速(Pan Speed) 20 rpm
幫浦速度 9rpm(3.5至4.0g/分鐘)
噴嘴壓力 15psi
噴嘴直徑 1.0 mm
與平板床(tablet bed)的距離* 2~3 in
若使用如步驟I捆紮的膠囊，將分散液以20.0mg/cm 2的塗覆水平施塗至膠囊。下述條件用於進行膠囊的包衣。 [表14] *依此設置噴霧噴嘴使得噴嘴及噴霧通路均在進氣流路的下方。
實施例 5受試者中茲卡病毒的治療
方法A. 抗病毒組成物療法 對呈現出茲卡病毒感染的受試者給予抗病毒組成物，並且如指定的給藥方案向受試者施用治療相關劑量一段時間。定期確定受試者的治療反應水平。可藉由確定受試者血液或血漿中的茲卡病毒力價來確定治療反應水平。如果一個劑量下的治療反應水平過低，則如預先確定的劑量遞增計劃來遞增劑量直至在受試者身上達到期望的治療反應水平。按需繼續對受試者進行抗病毒組成物的治療，並且可按需調節劑量或給藥方案直至患者達到期望的臨床終點。
方法B. 組合療法：抗病毒組成物與其它藥劑 除了向受試者指示並施用一種或多種其他用於治療Zika病毒感染或其症狀的治療劑之外，遵循上述方法A。於是，一種或多種其他治療劑可以在抗病毒組成物之前、之後或與其一起施用。亦可進行一種或多種其他治療劑的劑量遞增(或遞減)。
實施例 6針對茲卡病毒感染的抗病毒活性的體外評估
方法A. 純化合物 在強心苷的存在下，以0.2的病毒感染劑量(MOI)用茲卡病毒(ZIKV；PRVABC59株；ATCC VR-1843；https://www.atcc.org/Products/All/VR-1843.aspx)感染Vero E6細胞(亦稱為Vero C1008細胞，ATTC No. CRL-1586；https://www.atcc.org/Products/All/CRL-1586.aspx)。用病毒及化合物培養細胞1小時，其後丟棄接種物及化合物。給予細胞新鮮培養液並培養48小時，其後用福馬林固定並對於ZIKV感染染色。描述了由閃爍掃描法確定夾竹桃苷(圖1A)及長葉毛地黃苷(圖1B)的代表性感染率。在相同條件下評估其他化合物，並且它們顯示出針對茲卡病毒的非常不同程度的抗病毒活性。
方法B. 萃取物形式的化合物 除了將萃取物的量歸一化為萃取物中目標化合物的量之外，如方法A中詳述地評估含有待檢測的目標化合物的萃取物。例如，含有2重量%的夾竹桃苷的萃取物含有20μg的夾竹桃苷/1mg萃取物。因此，如果用於評估的夾竹桃苷的預期量為20μg，則1mg的萃取物將用於測定。
實施例 7含有抗病毒組成物的片劑的製備 混合3% Syloid 244FP及97%微晶纖維素(MCC)的初始製片混合物。接著，藉由濕法造粒將根據實施例3製備的組成物現有批次混入Syloid/MCC混合物中。該混合物在下表中標記為「初始製片混合物」。顆粒外添加另外的MCC來增加壓縮性。向初始製片混合物的該添加標記為「顆粒外添加」。來自顆粒外添加的所得混合物與「最終製片混合物」為相同組成物。 [表15]
組分 重量(g) 重量% (w/w)
初始製片混合物    
微晶纖維素 48.5 74.2
膠態二氧化矽/Syloid 244FP 1.5 2.3
來自實施例3的製劑 15.351 23.5
總計 65.351 100.0
  顆粒外添加 [表16]    
組分 重量(g) 重量% (w/w)
初始製片混合物 2.5 50.0
微晶纖維素 2.5 50.0
總計 5 100.0
  最終製片混合物： 縮略的 [表17]    
組分 重量(g) 重量% (w/w)
微晶纖維素 4.36 87.11
膠態二氧化矽/Syloid 244FP 0.06 1.15
來自實施例3的製劑 0.59 11.75
總計 5.00 100
  最終製片混合物： 詳細的 [表18]    
組分 重量(g) 重量% (w/w)
微晶纖維素 4.36 87.11
膠態二氧化矽/Syloid 244FP 0.06 1.15
維生素E 0.01 0.11
Cremophor ELP 0.33 6.56
Labrasol 0.05 1.01
甘油單油酸酯 0.14 2.72
乙醇 0.05 0.90
SCF萃取物 0.02 0.44
總計 5.00 100.00
Syloid 244FP是由Grace Davison製造的膠態二氧化矽。膠態二氧化矽通常用於提供各種功能，例如吸附劑、助流劑及片劑崩解劑。選擇Syloid 244FP是因其具備在油中吸收3倍其重量的能力，且具有5.5微米的粒徑。
實施例 8含有夾竹桃苷的溶液的HPLC分析 使用下述條件在HPLC(Waters)中分析樣本(夾竹桃苷標準，SCF萃取物及熱水萃取物)：對稱(Symmetry)C18柱(5.0mm, 150´4.6mm I.D.;Waters)；MeOH:水=54:46(v/v)的流動相以及1.0ml/分鐘的流速。檢測波長設定為217nm。藉由在固定量的HPLC溶劑中溶解化合物或萃取物來製備樣本以實現近似目標濃度的夾竹桃苷。藉由使用內標物確定夾竹桃苷的保留時間。可藉由使用內標物形成訊號響應曲線來確定/校正夾竹桃苷的濃度。
實施例 9藥物組成物的製備 可藉由任何下述方法來製備本發明的藥物組成物。可以在濕或乾燥條件下進行混合。在製備期間，可壓製、乾燥或壓製並乾燥藥物組成物。藥物組成物可被分配至劑型中。
方法A. 將至少一種藥物賦形劑與本說明書揭示的至少一種抗病毒化合物混合。
方法B. 將至少一種藥物賦形劑與本說明書揭示的至少兩種抗病毒化合物混合。
方法C. 將至少一種藥物賦形劑與本說明書揭示的至少一種強心苷混合。
方法D. 將至少一種藥物賦形劑與本說明書揭示的至少兩種三萜混合。
方法E. 將至少一種藥物賦形劑與本說明書揭示的至少一種強心苷及本說明書揭示的至少兩種三萜混合。
方法F. 將至少一種藥物賦形劑與本說明書揭示的至少三種三萜混合。
實施例 10三萜混合物的製備 藉由將指定的三萜以所示的近似莫耳比混合來製備下述組成物。 [表19]
  三萜(近似相對莫耳含量)
組成物 齊墩果酸(O) 熊果酸(U) 樺木酸(B)
I (A-C) 3 2.2 1
II (A-C) 7.8 7.4 1
III (A-C) 10 1 1
IV (A-C) 1 10 1
V (A-C) 1 1 10
VI (A-C) 1 1 0
VII (A-C) 1 1 1
VIII (A-C) 10 1 0
IX (A-C) 1 10 0
對於各組成物，製備三種相異的各自的溶液，由此各溶液中的三萜的總濃度為約9μM、18μM或36μM。 [表20]
組成物 (總三萜含量，μM) 三萜(各自的近似含量，μM)
齊墩果酸(O) 熊果酸(U) 樺木酸(B)
I-A(36) 17.4 12.8 5.8
I-B(18) 8.7 6.4 2.9
I-C(9) 4.4 3.2 1.5
II-A(36) 17.3 16.4 2.2
II-B(18) 8.7 8.2 1.1
II-C(9) 4.3 4.1 0.6
III-A(36) 30 3 3
III-B(18) 15 1.5 1.5
III-C(9) 7.5 0.75 0.75
IV-A(36) 3 30 3
IV-B(18) 1.5 15 1.5
IV-C(9) 0.75 7.5 0.75
V-A(36) 3 3 30
V-B(18) 1.5 1.5 15
V-C(9) 0.75 0.75 7.5
VI-A(36) 18 18 0
VI-B(18) 9 9 0
VI-C(9) 4.5 4.5 0
VII-A(36) 12 12 12
VII-B(18) 6 6 6
VII-C(9) 3 3 3
VIII-A(36) 32.7 3.3 0
VIII-B(18) 16.35 1.65 0
VIII-C(9) 8.2 0.8 0
IX-A(36) 3.3 32.7 0
IX-B(18) 1.65 16.35 0
IX-C(9) 0.8 8.2 0
實施例 1 1抗病毒組成物的製備 可藉由將單獨的三萜組分混合以形成混合物來製備抗病毒組成物。可將前述製備的、提供可接受的抗病毒活性的三萜混合物配製成抗病毒組成物。
具有齊墩果酸及熊果酸的抗病毒組成物 根據如本說明書所定義的組分的預定莫耳比，混合已知量的齊墩果酸及熊果酸。組分以固體形式混合或在下述溶劑(一種或多種)中混合：例如甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、丙醇、二甲基亞碸(DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺(DMAC)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、水或其混合物。所得混合物含有如本說明書所記載之相對莫耳比的組分。 對於藥學上可接受的抗病毒組成物，將至少一種藥學上可接受的賦形劑與藥理學活性劑混合。配製抗病毒組成物以用於施用於哺乳動物。
具有齊墩果酸及樺木酸的抗病毒組成物 根據如本說明書所定義的組分的預定莫耳比，混合已知量的齊墩果酸及樺木酸。組分以固體形式混合或在下述溶劑(一種或多種)中混合：例如甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、丙醇、二甲基亞碸(DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺(DMAC)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、水或其混合物。所得混合物含有如本說明書記載之相對莫耳比的組分。 對於藥學上可接受的抗病毒組成物，將至少一種藥學上可接受的賦形劑與藥理學活性劑混合。配製抗病毒組成物以用於施用於哺乳動物。
具有齊墩果酸、熊果酸及樺木酸的抗病毒組成物 根據本說明書所定義的組分的預定莫耳比，混合已知量的齊墩果酸、熊果酸及樺木酸。組分以固體形式混合或在下述溶劑(一種或多種)中混合：例如甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、丙醇、二甲基亞碸(DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺(DMAC)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、水或其混合物。所得混合物含有如本說明書記載之相對莫耳比的組分。 對於藥學上可接受的抗病毒組成物，將至少一種藥學上可接受的賦形劑與藥理學活性劑混合。配製抗病毒組成物以用於施用於哺乳動物。
具有夾竹桃苷、齊墩果酸、熊果酸及樺木酸的抗病毒組成物 根據如本說明書所定義的組分的預定莫耳比，混合已知量的夾竹桃苷、齊墩果酸、熊果酸及樺木酸。組分以固體形式混合或在下述溶劑(一種或多種)中混合：例如甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、丙醇、二甲基亞碸(DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺(DMAC)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、水或其混合物。所得混合物含有如本說明書記載之相對莫耳比的組分。 對於藥學上可接受的抗病毒組成物，將至少一種藥學上可接受的賦形劑與藥理學活性劑混合。配製抗病毒組成物以用於施用於哺乳動物。
實施例 12受試者中絲狀病毒感染的治療 示例性絲狀病毒感染包含伊波拉病毒及馬堡病毒。
方法A. 抗病毒組成物療法 對呈現出絲狀病毒感染的受試者給予抗病毒組成物，此外如指定的給藥方案向受試者施用治療相關劑量一段時間。定期確定受試者的治療反應水平。可藉由確定受試者血液或血漿中的絲狀病毒力價來確定治療反應水平。如果一個劑量下的治療反應水平過低，則如預先確定的劑量遞增計劃來遞增劑量直至達到在受試者中期望的治療反應水平。按需繼續對受試者進行抗病毒組成物的治療，此外可按需調節劑量或給藥方案直至患者達到期望的臨床終點。
方法B. 組合療法：抗病毒組成物與其它藥劑 除了向受試者指示並施用一種或多種用於治療絲狀病毒感染或其症狀的其他治療劑之外，遵循上述方法A。於是，一種或多種其他治療劑可以在抗病毒組成物之前、之後或與其一起施用。亦可進行一種或多種其他治療劑的劑量遞增(或遞減)。
實施例 13受試者中黃病毒感染的治療 例性黃病毒感染包含黃熱病、登革熱、日本腦炎、西尼羅病毒、茲卡病毒、蜱媒腦炎、凱氏森林病、Alkhurma症、屈公病毒、鄂木斯克出血熱及波瓦生病毒感染。
方法A. 抗病毒組成物療法 對呈現出黃病毒感染的受試者給予抗病毒組成物，此外如指定的給藥方案向受試者施用治療相關劑量一段時間。定期確定受試者的治療反應水平。可藉由確定受試者血液或血漿中的黃病毒力價來確定治療反應水平。如果一個劑量下的治療反應水平過低，則如預先確定的劑量遞增計劃來遞增劑量直至達到在受試者中期望的治療反應水平。按需繼續對受試者進行抗病毒組成物的治療，此外可按需調節劑量或給藥方案直至患者達到期望的臨床終點。
方法B. 組合療法：抗病毒組成物與其它藥劑 除了向受試者指示並施用一種或多種用於治療黃病毒感染或其症狀的其他治療劑之外，遵循上述方法A。於是，一種或多種其他治療劑可以在抗病毒組成物之前、之後或與其一起施用。亦可進行一種或多種其他治療劑的劑量遞增(或遞減)。
實施例 14針對茲卡病毒及登革熱病毒的抗病毒活性的評估 在存在或不存在試驗組成物的情況下，在一定濃度範圍內感染目標細胞並進行基於CPE的抗病毒測定。感染目標細胞導致細胞病變效應及細胞死亡。在該類型的測定中，將在存在試驗組成物的情況下CPE的降低及細胞存活率的相應增加用作抗病毒活性的指標。對於基於CPE的測定，用中性紅讀數確定細胞存活率。活細胞在其溶酶體中結合中性紅。中性紅的攝取依賴於活細胞維持其溶酶體內的pH低於細胞質中的pH的能力，該活性過程需要ATP。一旦進入溶酶體，中性紅染料變得帶電並且保留在細胞內。在用中性紅(0.033%)培養3小時後，去除細胞外染料，用PBS洗滌細胞，並用50%乙醇+1%乙酸的溶液溶解細胞內的中性紅。藉由在490nm下讀取各個孔的吸光度(光密度)來定量溶液中的中性紅的量。 貼壁細胞係用於評估組成物針對一組病毒的抗病毒活性。在向細胞添加病毒前，將組成物與目標細胞預先培養30分鐘。組成物在感染潛伏期間存在於細胞培養液中。對於各個感染試驗，使用相同濃度的組成物(一式兩份)平行建立存活率試驗，以確定在不存在病毒的情況下組成物的細胞毒性效果。 藉由將試驗條件下細胞的感染水平(基於免疫染色的試驗)或存活率(基於CPE的試驗)與未感染細胞的感染水平或存活率相比較，來確定試驗組成物的抗病毒活性。藉由將存在抑制劑的情況下的存活率與假處理的細胞的存活率相比較，在未感染的細胞中評估細胞毒性效果。藉由XTT存活率試驗來確定細胞毒性，前述XTT存活率試驗在與相應感染試驗的讀數的相同時間點進行。 將試驗組成物溶於100%甲醇中。藉由進行8倍稀釋來產生8種濃度的組成物(一式兩份)，以50μM作為最高試驗濃度開始。組成物的最高試驗濃度(50μM)致使培養液中的甲醇的最終濃度為0.25%(v/v%)。在各個試驗盤中含有8倍稀釋系列的甲醇載體，其濃度反映了各個組成物試驗條件中甲醇的最終濃度。在可能的情況下，使用 GraphPad Prism軟體確定各個試驗的組成物的EC50及CC50。 藉由針對病毒誘導的細胞病變效應(CPE)的保護程度來評估抗病毒活性。在存在相異濃度的對照組或組成物的情況下，用病毒攻擊細胞。在感染6天後(ZIKV，茲卡病毒)或7天後(DENV，登革熱病毒)，藉由定量相異試驗條件下的細胞存活率並將數值與未處理的細胞及僅用載體(感染培養基)處理的細胞進行比較，來監測針對CPE的保護程度。 在每個盤上進行中和檢測的品質管控，以確定：i)訊號對背景(S/B)值；ii)由已知抑制劑的抑制；及iii)試驗的變化，其由所有數據點的變化係數(C.V.)來測定。感染試驗中的總體變化範圍為3.4%至9.5%，此外存活率試驗中的總體變化範圍為1.4%至3.2%，以全部C.V.值的平均值計算。感染試驗的訊號對背景(S/B)範圍為2.9至11.0，而存活率試驗的訊號對背景(S/B)範圍為6.5至29.9。 DENV2-誘導的細胞病變效應(CPE)用中性紅讀數保護：對於DENV2抗病毒試驗，使用08-10381 Montserrat株。在C6/36昆蟲細胞中產生病毒原液。在具有5% FBS的MEM(MEM5)中培養Vero細胞(源自綠猴( Cercopithecus aethiops)的上皮腎細胞)。就感染及存活率試驗二者，均在96孔透明平底盤中以10,000顆細胞/孔接種細胞，並且在37℃下在MEM5中維持24小時。在感染當天，將樣本使用具有1%牛血清白蛋白(BSA)的MEM在U底盤中稀釋8倍。以1.25X的終濃度製備試驗材料稀釋液，並且取40μl與目標細胞在37℃下培養30分鐘。試驗材料預培養之後，將10μl的在具有1% BSA的MEM中製備的病毒稀釋液添加至各個孔(50μl最終體積/孔)中並且將盤在具有5% CO 2的加濕培養箱中在37℃下培養3小時。預先確定用於試驗的病毒的體積以產生被利巴韋林(Ribavirin)及化合物A3(已知的DENV2的抑制劑)抑制的線性範圍中的訊號。感染培養後，用PBS，接著用含有2%FBS的MEM(MEM2)洗滌細胞以除去未結合的病毒。其後，將50μl的含有在MEM2中以1X濃度製備的抑制劑稀釋液的培養液添加至各個孔中。在培養箱(5% CO 2)中在37℃下將96孔透明平底盤培養7天。試驗板中包含無病毒對照組(「假感染」)、僅用培養液培養的感染細胞、僅用載體(甲醇)培養的感染細胞及無細胞的孔(以確定背景)。試驗盤上還包含含有50μM利巴韋林及0.5μM化合物A3的對照孔。感染7天後，將細胞用中性紅染色以監測細胞存活率。使用感染培養液中的序列8倍稀釋液一式兩份地評估試驗材料。對照組包含用無病毒培養的細胞(「假感染」)、僅用培養基液養的感染細胞，或存在有利巴韋林(0.5μM)或A3(0.5μM)的感染細胞。在同一試驗盤上包含僅具有甲醇載體的完全重複抑制曲線。 ZIKV誘導的細胞病變效應(CPE)用中性紅讀數保護：對於ZIKV抗病毒試驗，使用PLCal_ZV株。在具有5%FBS的MEM(MEM5)中培養Vero細胞(源自綠猴的上皮腎細胞)。對於感染及存活率試驗二者，在96孔透明平底盤中以10,000顆細胞/孔接種細胞，並且在37℃下在MEM5中維持24小時。在感染當天，將樣本使用具有1%牛血清白蛋白(BSA)的MEM在U底盤中稀釋8倍。以1.25X的終濃度製備試驗材料稀釋液，並且取40μl與目標細胞在37℃下培養30分鐘。試驗材料預培養之後，將10μl的在具有1% BSA的MEM中製備的病毒稀釋液添加至各個孔(50μl最終體積每孔)中並且將盤在具有5%CO 2的加濕培養箱中在37℃下培養3小時。感染培養後，先用PBS洗滌細胞，接著再用含有2% FBS的MEM(MEM2)洗滌細胞以除去未結合的病毒。其後，將50μl的含有在MEM2中以1X濃度製備的抑制劑稀釋液的培養液添加至各個孔中。在培養箱(5% CO 2)中在37℃下將盤培養6天。在試驗盤中包含無病毒對照組(「假感染」)、僅用培養液培養的感染細胞、僅用載體(甲醇)培養的感染細胞及無細胞的孔(以確定背景)。感染6天後，將細胞用中性紅染色以監測細胞存活率。使用感染培養基中的序列8倍稀釋液一式兩份地評估試驗材料。對照組包含無病毒培養的細胞(「假感染」)、僅用培養液培養的感染細胞或存在有A3(0.5μM)的感染細胞。在同一試驗盤上包含僅具有甲醇載體的完全重複抑制曲線。 基於CPE的存活率數據的分析：對於中性紅試驗，藉由監測490nm處的吸光度來確定細胞存活率。從所有樣本中減去在無細胞的孔中獲得的平均訊號。接著，將所有數據點以在相同試驗盤上在假(未感染)細胞的8個孔中觀察到的平均訊號的百分比計算。僅用培養液處理的感染細胞將訊號降低至未感染細胞中觀察到的訊號的平均4.2%(對於HRV)、26.9%(對於DENV)及5.1%(對於ZIKV)。該試驗的訊號-對-背景(S/B)為2.9(對於DENV)及7.2(對於ZIKV)，其確定為與僅用載體處理的感染細胞的存活率百分比比較的「假感染」細胞中的存活率百分比。 評估化合物誘導的細胞毒性的存活率試驗(XTT)：使用與相應感染試驗中所用的相同實驗設置及抑制劑濃度，用抑制劑稀釋液(或僅培養液)培養假感染的細胞。培養溫度及培養期持續時間與相應感染試驗的條件相同。用XTT法評估細胞存活率。XTT試驗測量了粒線體活性並且是基於黃色四唑鹽(XTT)的裂解，其形成橙色甲臢染料。前述反應僅在具有活性粒線體的活細胞中發生。使用掃描多孔分光光度計直接定量甲臢染料。從所有數據點減去從無細胞的孔獲得的背景水平。存活率試驗盤中包含僅用甲醇載體的對照組(7個濃度，與各個夾竹桃苷試驗孔的甲醇終百分比相同)。藉由測量490nm處的吸光度來監測存活能力。 細胞毒性數據的分析：對於XTT實驗，藉由監測490nm處的吸光度來確定細胞存活率。從所有樣本減去無細胞的孔中獲得的平均訊號。接著，所有數據點以在相同試驗板上在假(未感染)細胞的8個孔中觀察到的平均訊號的百分比計算。該試驗的訊號對背景(S/B)為29.9(對於IVA)、8.7(對於HRV)、6.5(對於DENV)及6.7(對於ZIKV)，其確定為與無細胞的孔觀察到的訊號比較的「假感染」細胞中的存活率百分比。
實施例 15針對絲狀病毒(伊波拉病毒及馬堡病毒)的抗病毒活性的評估
方法A .在存在夾竹桃苷、長葉毛地黃苷或PBI-05204(含夾竹桃苷的植物萃取物)的情況下，用EBOV/Kik(A，MOI=1)或MARV/Ci67(B，MOI=1)感染Vero E6細胞。1小時後，除去接種物及化合物並向細胞添加新鮮培養液。48小時後，固定細胞並免疫染色細胞以檢測感染EBOV或MARV的細胞。使用Operetta計數感染的細胞。C)用上述化合物處理Vero E6細胞。藉由CellTiter-Glo測定ATP水平作為細胞存活率的度量。
方法B. 用EBOV(A、B)或MARV(C、D)感染Vero E6細胞。感染後2小時(A、C)或感染後24小時(B、D)，向細胞添加夾竹桃苷或PBI-05204 1小時，接著丟棄並將細胞養回至培養液。感染後48小時，感染細胞的分析如圖1所示。
方法C .在存在夾竹桃苷或PBI-05204的情況下，用EBOV或MARV感染Vero E6細胞並且培養48小時。將來自感染細胞培養物的上清液移轉至新鮮Vero E6細胞，培養1小時，接著丟棄(如A中所記載)。培養含有移轉的上清液的細胞48小時。如前所記載檢測感染EBOV(B)或MARV(C)的細胞。EBOV的對照感染率為66%，MARV的對照感染率為67%。
實施例 16針對披膜病毒科病毒的抗病毒活性的評估 (甲病毒：VEEV及WEEV) 在存在或不存在指示化合物的情況下，用委內瑞拉馬腦炎病毒(A，MOI=0.01)或西部馬腦炎病毒(B，MOI=0.1)感染Vero E6細胞18小時。如本說明書記載檢測感染的細胞並在Operetta上計數。
實施例 17受試者中副黏液病毒科感染的治療 示例性副黏液病毒科病毒感染包含亨尼病毒屬感染、立百病毒感染或亨德拉病毒感染。
方法A. 抗病毒組成物療法 對呈現出副黏液病毒科感染的受試者給予抗病毒組成物，此外如指定的給藥方案向受試者施用治療相關劑量一段時間。定期確定受試者的治療反應水平。可藉由確定受試者血液或血漿中的病毒力價來確定治療反應水平。如果一個劑量下的治療反應水平過低，則如預先確定的劑量遞增計劃來遞增劑量直至達到在受試者中期望的治療反應水平。按需繼續對受試者進行抗病毒組成物的治療，此外可按需調節劑量或給藥方案直至患者達到期望的臨床終點。
方法B. 組合療法：抗病毒組成物與其它藥劑 除了向受試者指示並施用一種或多種用於治療副黏液病毒科感染或其症狀的其他治療劑之外，遵循上述方法A。於是，一種或多種其他治療劑可以在抗病毒組成物之前、之後或與其一起施用。亦可進行一種或多種其他治療劑的劑量遞增(或遞減)。
實施例 18初代huPBMC的細胞株及分離 在加濕培養箱中於37℃、10% CO 2下在補充有10%熱滅活胎牛血清(FBS；Biowest)、100U/mL盤尼西林、100μg/mL硫酸鏈黴素及20μg/mL硫酸慶大黴素(Life Technologies)的Iscove’s改良的Dulbecco’s培養液(IMDM；ATCC No. 30-2005)中培養產生病毒的HTLV-1轉化的(HTLV-1+)SLB1淋巴瘤T細胞株(Arnold等人，2008；由P. Green，The Ohio State University-Comprehensive Cancer Center惠贈)。 從全血樣本中分離初代人外周血單個核細胞(huPBMC)，前述樣本係由SMU紀念健康中心(SMU Memorial Health Center)，根據SMU機構審查委員會(SMU Institutional Review Board)批準的協議所提供的、無識別碼且符合赫爾辛基原則宣言(Declaration of Helsinki principles)的樣本。簡而言之，將2ml全血與等體積的pH7.4的無菌磷酸鹽緩衝鹽水溶液(PBS)在聚丙烯錐形管(Corning)中混合，接著將樣本輕輕鋪在3ml的淋巴細胞分離培養基(MP Biomedicals)上。將樣本在室溫下在擺式轉子中以400x g離心30分鐘，隨後將血沉棕黃層的huPBMC吸出，在RPMI-1640培養液(ATCC No. 30-2001)中洗滌2次，並以260x g離心7分鐘沉澱。將細胞重新懸浮於補充有20%FBS、100U/ml青黴素、100μg/ml硫酸鏈黴素、20μg/ml硫酸慶大黴素及50U/ml重組人類介白素-2(hu-IL-2；Roche Applied Science)的RPMI-1640培養液中，並用10ng/ml植物血凝素(PHA；Sigma-Aldrich)刺激24小時，並在加濕培養箱中在37℃、10%CO 2下生長。第二天，將細胞以260x g離心7分鐘以沉澱細胞，並用RPMI-1640培養液洗滌2次以除去PHA，接著在補充有抗生素及50U/ml hu-IL-2的完全培養液中重新懸浮並培養。
實施例 19表達GFP的HTLV-1+SLB1/pLenti-GFP T細胞殖株的產生 為了產生表達GFP的HTLV-1+SLB1 T細胞殖株，將2x10 6個SLB1細胞鋪板在補充有10%熱滅活FBS及抗生素的IMDM的60mm 2組織培養皿(Corning)中，接著用含有pLenti-6.2/V5-DEST綠色螢光蛋白表達載體，並且攜帶了殺稻瘟菌素抗性基因的的慢病毒顆粒進行轉導。6小時後，將轉導的細胞在室溫下以260 x g離心7分鐘沉澱，用無血清IMDM洗滌2次，接著重新懸浮於補充有5μg/mL殺稻瘟菌素的完全培養基(Life Technologies)中，並等分加入96孔微量滴定盤(Corning)中。在37℃及10%CO 2的加濕培養箱中，用殺稻瘟菌素篩選維持培養物兩周。藉由螢光顯微鏡篩選表達GFP的淋巴母細胞，接著藉由在96孔微量滴定盤中有限稀釋鋪板來獲得表達GFP的同質細胞殖株。擴大得到的HTLV-1+SLB1/pLenti-GFP T淋巴細胞殖株並重複傳代；GFP的表達藉由十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及使用兔抗GFP(FL)多株抗體的免疫印漬(Santa Cruz Biotechnology)證實。
實施例 20藉由抗HTLV-1 p19 GagELISA定量病毒產生及顆粒感染性 為了確定夾竹桃苷或歐洲夾竹桃萃取物對HTLV-1原病毒複製及新合成的細胞外病毒顆粒釋放的影響，將HTLV-1+SLB1淋巴瘤T細胞株以2x10 4個細胞/孔鋪板在96孔微量滴定盤中的300μl補充有抗生素的完全培養液中，並在37℃、10% CO 2下培養。將純化的夾竹桃苷化合物及歐洲夾竹桃萃取物(Phoenix Biotechnology；參見Singh等人，2013)重新懸浮於載體溶液中(20%v/v二甲基亞碸，DMSO，在MilliQ蒸餾/去離子H 2O中)，原液濃度為2mg/ml，接著使用luer-lock 0.2µm注射器過濾器(Millipore)滅菌。以濃度為10、50及100μg/ml的夾竹桃苷或歐洲夾竹桃萃取物，或用增量(1.5、7.5及15µl)的載體對照組處理HTLV-1+SLB1細胞72小時。接著使用Eppendorf A-2-DWP在室溫下在擺式轉子中以260x g將96孔微量滴定盤離心7分鐘，以沉澱細胞，並藉由進行比色抗p19 Gag酶聯免疫吸附試驗(ELISA; Zeptometrix)，定量釋放至培養物上清液中的、細胞外含有p19 Gag的HTLV-1顆粒，相對於p19 Gag蛋白質標準的水平。在Berthold Tristar LB 941多模式酶標儀上在450nm下以吸光度模式對樣本進行三次重複分析。 為了評估從夾竹桃苷處理的細胞中收集的新合成的細胞外HTLV-1顆粒的感染性，將2x10 4個HTLV-1+SLB1 T淋巴母細胞鋪板在300μl補充有抗生素的完全培養液中，以濃度增加(10、50及100μg/ml)的夾竹桃苷或歐洲夾竹桃萃取物，或對照組載體(1.5、7.5及15µl)處理培養物72小時。接著，將50μl含有病毒的上清液用於直接感染以2x10 4個細胞/孔的密度鋪板於96孔微量滴定盤中補充有抗生素及hu-IL-2的完全培養液上的huPBMC。在huPBMC培養基中維持夾竹桃苷化合物、歐洲夾竹桃萃取物或對照組載體以控制可能由新產生的顆粒引起的再感染事件。72小時後，藉由抗HTLV-1 p19 GagELISA定量細胞外含有p19 Gag的HTLV-1病毒體釋放至感染的huPBMC的培養物上清液的相對水平。
實施例 21測定細胞凋亡 為了評估處理的細胞培養物中的夾竹桃苷化合物、歐洲夾竹桃的萃取物或對照組載體的相對細胞毒性，將2x10 4個HTLV-1+SLB1淋巴瘤T細胞或活化的/培養的huPBMC鋪板在300μl的補充有抗生素的完全培養基中，並在加濕培養箱中在37℃、10% CO 2下維持。以濃度增加(10、50及100μg/ml)的夾竹桃苷或歐洲夾竹桃萃取物，或對照組載體(1.5、7.5及15ml)培養72小時。將環磷醯胺(50μM；Sigma-Aldrich)處理的細胞包含在內作為凋亡的陽性對照組。接著將細胞吸出並鋪板於Permanox 8室組織培養玻片(Nalge)上，該玻片已用0.01%的Poly- L-離胺酸及伴刀豆球蛋白A(1mg/mL; Sigma-Aldrich)的無菌溶液預處理。隨後使用顯微鏡凋亡檢測試劑盒對樣本進行染色，將磷脂結合蛋白V與異硫氰酸螢光素(磷脂結合蛋白V-FITC)及碘化丙啶(PI; BD-Pharmingen)綴合，並藉由使用20x物鏡的共軛焦螢光顯微鏡重複三次定量每個視野的凋亡(即，磷脂結合蛋白V-FITC及/或PI-陽性)細胞的相對百分比。藉由使用DIC相位差濾光片的顯微鏡定量每個視野的細胞總數。
實施例 22共培養試驗中HTLV-1傳播及病毒突觸形成 因為HTLV-1的傳播通常是藉由感染的細胞及未感染的目標細胞之間跨病毒突觸的直接接觸而發生(Igakura等人，2003；Pais-Correia等人，2010；Gross等人，2016；Omsland等人，2018；Majorovits等人，2008)，我們試驗夾竹桃苷、歐洲夾竹桃萃取物或對照組載體是否可以影響病毒突觸的形成及/或感染性HTLV-1顆粒在體外藉由細胞間相互作用的傳播。對於此等實驗，將2x10 4個產生病毒的HTLV-1+ SLB1 T細胞鋪板於96孔微量滴定盤中，並在37℃、10%CO 2下在300μl的完全培養液中用絲裂黴素C(100μg/mL)處理2小時(Bryja等人，2006)。接著去除培養液，用無血清的IMDM洗滌細胞2次，以增量(10、50及100μg/ml)的夾竹桃苷或歐洲夾竹桃萃取物，或對照組載體(1.5、7.5及15μl)處理細胞15分鐘或3小時。選擇性地，將2x10 4個表達GFP的HTLV-1+SLB1/pLenti-GFP T細胞鋪板於300μl完全培養液中的8室組織培養玻片上，並用絲裂黴素C處理，用不含血清的IMDM洗滌2次，接著如共軛焦顯微鏡實驗所記載，用夾竹桃苷、歐洲夾竹桃萃取物或對照組載體進行處理。接著，我們吸出培養液，用無血清培養液洗滌HTLV-1+SLB1細胞2次，並將2x10 4個huPBMC添加至在300μl的，補充有20%FBS、抗生素及50U/ml hu-IL-2的RPMI-1640培養基中的各個孔中，接著在加濕培養箱中在37℃、10% CO 2下再共培養細胞72小時(將細胞共培養6小時，使用SLB1/pLenti-GFP淋巴母細胞藉由共軛焦顯微鏡觀察病毒突觸的形成及病毒傳播)。作為陰性對照組，在沒有產生病毒的細胞的情況下單獨培養huPBMC。在共培養基中維持夾竹桃苷、歐洲夾竹桃萃取物及載體。藉由進行抗HTLV-1 p19 GagELISA定量因為細胞間病毒傳播而釋放至共培養物上清液中的細胞外含有p19 Gag的HTLV-1顆粒的相對水平。使用免疫螢光共軛焦顯微鏡藉由用抗HTLV-1 gp21 Env一抗及羅丹明紅偶聯的二抗對固定樣本染色來觀察GFP陽性HTLV-1+SLB/pLenti-GFP細胞與huPBMC之間形成的病毒突觸。將二脒基-2-苯基吲哚、二鹽酸化物(DAPI；分子探針)核染色包含在內用於比較及觀察未感染(即HTLV-1陰性)的細胞。藉由使用20x物鏡計數20個視野中HTLV-1 gp21 Env陽性(及GFP陰性)的huPBMC的相對百分比，定量共培養試驗中HTLV-1向huPBMC的細胞間傳播。
實施例 23顯微鏡 使用Plan-Apochromat 20x/0.8物鏡及Zeiss ZEN系統軟體(Carl Zeiss Microscopy)在裝備有Airyscan檢測器及載物臺式CO 2培養箱的Zeiss LSM800儀器上的共軛焦螢光顯微鏡來觀察磷脂結合蛋白V-FITC/PI染色的樣本以定量細胞凋亡及細胞毒性。藉由免疫螢光共軛焦顯微鏡使用Plan-Apochromat 20x/0.8物鏡觀察絲裂黴素C處理的HTLV-1+SLB1/pLenti-GFP淋巴母細胞及培養的huPBMC之間的病毒突觸的形成及病毒傳播(即，藉由定量抗HTLV-1 gp21 Env陽性huPBMC的相對百分比來確定)。使用Zen 2.5D分析工具(Carl Zeiss Microscopy)圖形化定量DAPI、抗HTLV-1 gp21 Env特異性(羅丹明紅陽性)及GFP訊號的相對螢光強度。藉由裝備有633nm及543nm He/Ne及488nm Ar雷射的Nikon Eclipse TE2000-U倒置顯微鏡及D-Eclipse共軛焦成像系統上的共軛焦螢光顯微鏡使用Plan Fluor 10x/0.30物鏡及DIC相位差濾光片(Nikon Instruments)來篩選表達GFP的HTLV-1+SLB1/pLenti-GFP T細胞選殖。
實施例 24統計分析 使用不成對的雙尾Student’s t檢驗(α=0.05)確定實驗數據集的統計顯著性，並使用Shapiro-Wilk正態性檢驗及Graphpad Prism 7.03軟體計算P值。P值定義為：0.1234(ns)，0.0332(*)，0.0021(**)，0.0002(***)，＜0.0001(****)。除非另有說明，否則誤差線代表來自至少三個獨立實驗的SEM。
實施例 25受試者中δ反轉錄病毒感染的治療 包含HTLV-1的示例性δ反轉錄病毒感染
方法A. 抗病毒組成物療法 對呈現出HTLV-1感染的受試者給予抗病毒組成物，此外如指定的給藥方案向受試者施用治療相關劑量一段時間。定期確定受試者的治療反應水平。可藉由確定受試者血液或血漿中的HTLV-1病毒力價來確定治療反應水平。如果一個劑量下的治療反應水平過低，則如預先確定的劑量遞增計劃來遞增劑量直至達到在受試者中期望的治療反應水平。按需繼續對受試者進行抗病毒組成物的治療，此外可按需調節劑量或給藥方案直至患者達到期望的臨床終點。
方法B. 組合療法：抗病毒組成物與其它藥劑 除了向受試者指示並施用一種或多種用於治療HTLV-1感染或其症狀的其他治療劑之外，遵循上述方法A。於是，一種或多種其他治療劑可以在抗病毒組成物之前、之後或與其一起施用。亦可進行一種或多種其他治療劑的劑量遞增(或遞減)。示例性其他治療劑如本說明書所記載。
實施例 26受試者中CoV感染的治療 示例性CoV感染包含SARS-CoV、MERS-CoV、COVID-19 (SARS-CoV-2)、CoV 229E、CoV NL63、CoV OC43、CoV HKU1及CoV HKU20。
方法A. 抗病毒組成物療法 對呈現出CoV感染的受試者給予抗病毒組成物，此外如指定的給藥方案向受試者施用治療相關劑量一段時間。定期確定受試者的治療反應水平。可藉由確定受試者血液或血漿中的CoV病毒力價來確定治療反應水平。如果一個劑量下的治療反應水平過低，則如預先確定的劑量遞增計劃來遞增劑量直至達到在受試者中期望的治療反應水平。按需繼續對受試者進行抗病毒組成物的治療，此外可按需調節劑量或給藥方案直至患者達到期望的臨床終點。
方法B. 組合療法：抗病毒組成物與其它藥劑 除了向受試者指示並施用一種或多種用於治療CoV感染或其症狀的其他治療劑之外，遵循上述方法A。於是，一種或多種其他治療劑可以在抗病毒組成物之前、之後或與其一起施用。亦可進行一種或多種其他治療劑的劑量遞增(或遞減)。示例性其他治療劑如本說明書所記載。
實施例 27使用ANVIRZEL™在受試者身上治療COVID-19感染 對呈現出COVID-19的兒童(嬰兒)，如以下方法施用ANVIRZEL™以治療與COVID-19相關的症狀。在施用ANVIRZEL™之前，受試者的病毒感染惡化。根據下述給藥方案對受試者指定並施用ANVIRZEL™：初始劑量0.25mL重組ANVIRZEL™，接著每十二小時施用0.5mL的重組ANVIRZEL™，為期兩到三天，受試者的COVID-19感染得到解決，並且沒有觀察到藥物相關的毒性。
實施例 28夾竹桃苷針對COVID-19感染的體外評估 本研究的目的是確定夾竹桃苷對後代病毒體的感染性的影響。 製備夾竹桃苷在甲醇中的儲備溶液(10mg夾竹桃苷/mL)，前述儲備溶液用於製備含有DMSO(在水性培養液RPMI 1640及夾竹桃苷(20μg/mL、10μg/mL、1.0μg/mL或0.1μg/mL)為0.1%或0.01% v/v)的培養液，培養液如下所示。 [表21]
  培養基ID
夾竹桃苷濃度 (μg/mL) 0.1% aq. DMSO 0.01% aq. DMSO
20 20A 20B
10 10A 10B
1.0 1.0A 1.0B
0.1 0.1A 0.1B
0 (對照組培養基)      → 0A 0B
將培養物中未感染的VERO E6細胞(目標初始細胞計數為1x10 6)在37°C下在每個指示培養液的小瓶中培養30分鐘。接著將SARS-CoV-2的病毒接種物添加到每個小瓶中，以達到目標初始病毒力價(約PFU/mL 1x10 4)。目標MOI(病毒感染劑量)為約0.1。將溶液在37℃下再培養2小時以實現VERO E6細胞的感染。接著用對照組載體洗滌感染的VERO E6細胞以除去細胞外病毒及夾竹桃苷。將各個培養液的新等分試樣添加至感染的VERO E6細胞的各自相應的小瓶中。在第二等分試樣中接受夾竹桃苷的那些被表示為「+感染後處理」，而在第二等分試樣中沒有接受夾竹桃苷的那些被表示為「-感染後處理」(圖23A~23D)。在感染後約24小時及約48小時確定每個小瓶的病毒力價。 作為確定夾竹桃苷針對VERO E6細胞的潛在毒性的手段，基於上述培養液，針對未感染的VERO E6細胞製備平行培養物。 獲得的數據包含所產生的病毒數量、後代病毒的感染性、以及感染及未感染的細胞中的夾竹桃苷的相對安全性(無毒)。
實施例 29夾竹桃苷針對COVID-19病毒的體外評估 本試驗的目的是確定夾竹桃苷針對SARS-CoV-2的直接抗病毒活性。 從6孔盤中約10 6個Vero -E6細胞的匯合單層中除去生長培養基。將夾竹桃苷在培養液中連續稀釋，接著添加到接種在96孔盤中的Vero -E6細胞中。將生長培養液替換為200µl的維持培養液，其中包含10µg/mL、5µg/mL、1µg/mL、0.5µg/mL、100ng/mL或50ng/mL夾竹桃苷，或匹配的僅含DMSO對照組。在添加病毒之前，將盤在37℃下培養約30分鐘。 將SARS-CoV-2病毒以0.4(進入試驗)或0.02(複製試驗)的MOI(病毒感染劑量)添加到夾竹桃苷處理的細胞及未處理的細胞中。在37°C培養1小時後，將夾竹桃苷保留在孔中。 吸收1小時後，除去接種培養基，並用PBS(標準磷酸鹽緩衝鹽水溶液)洗滌1次。 將單獨的培養基(無夾竹桃苷)加回到數據玻片上指定為「預處理」的夾竹桃苷處理的孔中。將具有指定濃度的夾竹桃苷的培養基加回到數據玻片上指定為「持續時間」的孔中。 將盤在感染後24小時(進入試驗)或48小時(複製試驗)固定，並用病毒特異性抗體及螢光標記的二抗免疫染色。 使用Operetta對細胞進行成像，並使用Harmonia軟體中的定製算法分析數據，以確定每個孔中感染細胞的百分比。 結果示於圖24A及24B。
實施例 30夾竹桃苷針對Vero-E6細胞的毒性的體外評估 本試驗的目的是確定夾竹桃苷針對Vero-E6細胞的相對潛在毒性。 將夾竹桃苷在培養液中連續稀釋，並添加至接種在96孔盤中的Vero-E6細胞中，並在37°C下培養24小時。使用CellTiter Glo測定獲得細胞計數。 結果示於圖25。
實施例 31夾竹桃苷針對COVID-19病毒的體外評估 本研究的目的是確定COVID-19病毒針對夾竹桃苷處理的劑量反應。 除了使用下述較低濃度的夾竹桃苷之外，重複實施例28的步驟：1μg/mL、0.5μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.01μg/mL及0.005μg/mL。此外，VERO CCL-81細胞用於代替VERO E6細胞。 根據實施例28確定病毒力價，並且藉由與對照組樣本比較計算病毒力價的降低倍數。結果示於圖26A~26D、27A~27D及28A和28B。
實施例 32舌下液體劑型 舌下液體劑型包含藉由將夾竹桃苷或含有夾竹桃苷的組成物(例如含有夾竹桃苷的萃取物；2重量%)與中鏈甘油三酸酯(95重量%)及調味劑(3重量%)混合製成的夾竹桃苷。劑型中的夾竹桃苷含量為約25μg/mL。
實施例 33夾竹桃亞臨界流體萃取物的製備 藉由採用亞臨界流體萃取而不是超臨界液體萃取夾竹桃生物質，開發用於含有夾竹桃苷的萃取物的製備的改進方法。 將乾燥及粉末狀的生物質置於萃取室中，接著將其密封。將二氧化碳(約95重量%)及醇(約5重量%；甲醇或乙醇)注入室中。室的內部溫度及壓力使萃取介質在大部分或基本上所有萃取時間段內保持在亞臨界流體相而不是超臨界流體相中：溫度在約2°C至約16°C(約7℃至約8℃)的範圍內，壓力在約115至約135bar(約124bar)的範圍內。萃取時間為約4小時至約12小時(約6小時至約10小時)。接著將萃取環境過濾並收集上清液。從上清液中排出二氧化碳，並將所得的粗萃取物稀釋到乙醇中(約9份乙醇：約1份萃取物)，並在約-50℃下冷凍至少12小時。將溶液解凍並過濾(100微米孔徑的過濾器)。將濾液濃縮至其原始體積的約10%，接著無菌過濾(0.2微米孔徑的過濾器)。接著，將濃縮的萃取物用50%乙醇水溶液稀釋至每mL溶液約1.5mg的萃取物的濃度。 所得的亞臨界流體(SbCL)萃取物包含可萃取自夾竹桃的夾竹桃苷及一種或多種其他化合物，前述一種或多種其他化合物如本說明書所定義。
實施例 34夾竹桃苷針對COVID-19病毒的體外評估 本研究的目的是確定夾竹桃苷對沒有夾竹桃苷預處理的後代病毒體的感染性的影響(根據實施例28)。 除了在感染之前沒有用夾竹桃苷預處理之外，重複實施例28的步驟。取而代之的是，在感染後12小時及24小時用夾竹桃苷或對照組載體處理感染的細胞。此外，VERO CCL-81用於代替VERO E6細胞，並使用較低濃度的夾竹桃苷：1μg/mL、0.5μg/mL、0.1μg/mL及0.05μg/mL。數據示於圖29A及29B。
實施例 35夾竹桃苷針對COVID-19病毒的體內評估 本研究的目的是確定含有夾竹桃苷的萃取物(OCE)治療已遭COVID-19病毒感染的受試者的功效。 在舌下、經口頰或經口施用根據實施例32的劑型製備的OCE之前，評估足以代表大範圍的人口分布且呈現出COVID-19感染的受試者，以確定其臨床狀態。藉由將液體滴入受試者口腔，將組成物安全地施用於受試者。給藥方案為每劑量約0.5mL，每天四劑量(約每六小時一劑量)，大約每天約50微克夾竹桃苷。選擇性地，得僅施用每天的總劑量的一半。所有受試者均完全康復。
實施例 36夾竹桃的乙醇萃取物的製備 本研究的目的是藉由用乙醇水溶液萃取夾竹桃生物質來製備乙醇萃取物。 用乙醇水溶液(90% v/v乙醇；10% v/v水)重複處理磨碎的乾燥葉子。合併結合的乙醇上清液並過濾，接著藉由真空蒸發濃縮來降低其中的乙醇及水的量，提供包含約25mg的夾竹桃苷/mL的萃取物的粗乙醇萃取物(具有約50% v/v乙醇含量)。
實施例 37包含夾竹桃的萃取物的組合的劑型的製備 本研究的目的是製備如實施例32的劑型，相異之處在於將實施例36的乙醇萃取物的部分(1重量%)與實施例33的SbCL萃取物的部分(1重量%)、中鏈甘油三酸酯(95重量%)及調味劑(3重量%)相組合。
實施例 38長葉毛地黃苷針對COVID-19病毒的體內評估 本研究的目的是確定含有長葉毛地黃苷的組成物(DCC)治療已被COVID-19病毒感染的受試者的功效。使用市售的含有長葉毛地黃苷的劑型。 在經口或系統施用DCC之前評估呈現出COVID-19感染的受試者以確定臨床狀態。市售的組成物如本說明書所記載。各安全給藥方案均在各自的NDA及包裝插頁中描述。如預定的施用方式將組成物安全地施用於每個受試者。進行臨床監測以確定治療反應並相應地滴定劑量。
實施例 39用夾竹桃苷處理的SARS-CoV-2感染中的基因組與感染顆粒比的確定 本研究的目的是確定夾竹桃苷對SARS-CoV-2的抑制是處於總顆粒生產的水平還是感染性顆粒生產的水平。 為了定量樣本的基因組拷貝，使用標準製造商方案以5:1體積比的TRIzol LS(Ambion, Carlsbad, CA)萃取200µl樣本，並重新懸浮於11µl水中。按照先前揭示的試驗(26)，藉由qRT-PCR對萃取的RNA檢測SARS-CoV-2。簡而言之，使用下述引子及探針擴增N基因：正向引子[5’-TAATCAGACAAGGAACTGATTA-3’] (SEQ ID NO. 1)；反向引子[5’-CGAAGGTGTGACTTCCATG-3’] (SEQ ID NO. 2)；探針[[5’-FAM-GCAAATTGTGCAATTTGCGG-TAMRA-3’; (SEQ ID NO. 3)]。使用iTaq Universal探針一步試劑盒(One-Step kit)(BioRad，Hercules，CA)，按照製造商說明製備20µl反應混合物：反應混合物(2x:10μL)、iScript逆轉錄酶(0.5µL)、引子(10µM:1.0μL)、探針(10µM:0.5μL)、萃取的RNA(4µL)及水(3µL)。使用熱循環儀StepOnePlus™即時PCR系統(Applied Biosystems)進行qRT-PCR反應。將反應在50°C下進行5分鐘、95°C下進行20秒，接著在95°C下進行5秒、60°C下進行30秒的40個循環下反應。陽性對照組RNA序列(COVID-2019基因組的核苷酸26,044~29,883)用於估計被評估的樣本中N基因的RNA拷貝數。
如本說明書所用，術語「約(about)」或「近似(approximately)」是指特定值的±10%、±5%、±2.5%或±1%。如本說明書所用，術語「基本上」是指「在很大程度上」或「至少大部分的」或「多於50%的」。
如本說明書所用，術語「治療有效量(therapeutically effective amount)」或「治療有效劑量(therapeutically effective dose)」意指抗病毒組成物、萃取物、化合物、含有萃取物之組成物、含有化合物之組成物或藥劑在投予個體後足以產生治療效應之量。因此，其為預防、治癒、改善、抑制或部分抑制疾病或病症之症狀所必需之量。
以上是本發明的特定實施方案的詳細描述。應理解的是，儘管出於說明的目的，本說明書已描述了本發明的特定實施方案，可在不脫離本發明的精神及範圍的情況下進行各種修改。因此，除所附申請專利範圍以外，本發明不受限制。根據本發明內容，可在不過度實驗的情況下，製造並實施本說明書揭示的及要求保護的所有實施方案。
依照37 CFR 1.52(e)(5)，本申請包含序列表，其已經通過EFS以電子格式提交，在此通過引用併入。使用Patent-in 3.5.1和Checker 4.4.6、創建於2020年7月10日，其命名為PBI22PCT9_SEQ_ST25.txt，大小為1KB的電子文件中包含的序列訊息通過引用其整體併入本文。
無
下述圖式形成本說明書的一部分並且描述了要求保護的發明示例性實施方案。根據此等圖式及本說明書的描述，所屬領域中具有通常知識者可在無過度實驗的情況下實施本發明。
圖1~2為描述總結各種組成物對伊波拉病毒的體外劑量反應抗病毒活性的圖表。
圖3~4為描述總結各種組成物對馬堡病毒的體外劑量反應抗病毒活性的圖表。
圖5為描述總結夾竹桃苷對Vero E6細胞中茲卡病毒(SIKV PRVABC59株)的體外劑量反應抗病毒活性的圖表。
圖6為描述總結長葉毛地黃苷對Vero E6細胞中茲卡病毒(SIKV PRVABC59株)的體外劑量反應抗病毒活性的圖表。
圖7為描述總結各種組成物(夾竹桃苷、長葉毛地黃苷及PBI-05204)對Vero E6細胞中伊波拉病毒的體外劑量反應抗病毒活性的圖表。
圖8為描述總結各種組成物(夾竹桃苷、長葉毛地黃苷及PBI-05204)對Vero E6細胞中馬堡病毒的體外劑量反應抗病毒活性的圖表。
圖9為描述總結在存在各種組成物(夾竹桃苷、長葉毛地黃苷及PBI-05204)的情況下，Vero E6細胞的體外細胞存活率的圖表。
圖10A及10B為描述總結在暴露於病毒後不久，組成物(夾竹桃苷及PBI-05204)抑制Vero E6細胞中伊波拉病毒的能力的圖表：圖10A─感染後2小時；圖10B─感染後24小時。
圖11A及11B為描述總結在暴露於病毒後不久，組成物(夾竹桃苷及PBI-05204)抑制Vero E6細胞中馬堡病毒的能力的圖表：圖11A─感染後2小時；圖11B─感染後24小時。
圖12A及12B為描述總結組成物(夾竹桃苷及PBI-05204)藉由已暴露於夾竹桃苷的病毒感染的Vero E6細胞來抑制感染性後代產物能力的圖表：圖12A─伊波拉病毒；圖12B─馬堡病毒。
圖13A及13B為描述總結各種組成物(夾竹桃苷、長葉毛地黃苷及PBI-05204)對Vero E6細胞中委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒(圖13A)及西部馬腦脊髓炎病毒(圖13B)的體外劑量反應抗病毒活性的圖表。
圖14為描述總結藉由HTLV-1 p19 Gag的定量來確定的載體對照組(vehicle control)、夾竹桃苷或歐洲夾竹桃的萃取物對HTLV-1複製或新合成的病毒顆粒的釋放作用(參見實施例19及20)的圖表。顯示未處理(UT)細胞用於比較。任一數據代表至少三個獨立實驗。數據代表實驗的平均值±標準偏差(誤差線)。
圖15為描述總結載體對照組、夾竹桃苷及歐洲夾竹桃萃取物對HTLV-1+SLB1淋巴瘤T細胞株的相對細胞毒性的圖表。任一數據代表至少三個獨立的實驗。數據代表實驗的平均值±標準偏差(誤差線)。
圖16A~16F為描述在合併的圖像中藉由DIC相位差顯示的磷脂結合蛋白V-FITC(綠色)及PI(紅色)染色結果的代表性顯微圖。還提供單獨的磷脂結合蛋白V-FITC及PI螢光通道圖像。比例尺，20μm。
圖17為描述總結載體對照組、夾竹桃苷或歐洲夾竹桃的萃取物對來自夾竹桃苷處理的HTLV-1+淋巴瘤T細胞的HTLV-1複製或新合成的病毒顆粒的釋放作用的圖表。
圖18為描述總結載體對照組、夾竹桃苷或歐洲夾竹桃萃取物對處理的huPBMC的相對細胞毒性的圖表。
圖19為描述總結在含有huPBMC的載體對照組、夾竹桃苷歐洲夾竹桃的萃取物的huPBMC共培養試驗中HTLV-1傳播的相對抑制的圖表。
圖20為描述表達GFP之HTLV-1+ SLB1 T細胞株的代表性顯微圖：螢光顯微法(上圖)及免疫印漬術(下圖)。
圖21為描述huPBMC及絲裂黴素C處理的HTLV-1+SLB1/pLenti-GFP淋巴母細胞(綠色細胞)之間的病毒突觸的代表性顯微圖像。
圖22為描述來自圖21的顯微圖像定量的具有標準誤差(誤差線)的平均數據圖表。
圖23A~23D為描述「處理」後24小時及48小時，對於用SARS-CoV-2病毒感染、並用夾竹桃苷(紅色條)或對照組載體(培養基)(黑色條)處理的VERO E6細胞的SARS-CoV-2病毒力價(PFU/mL)之對數相對於時間(小時)的圖表(實施例28)。在感染之前用夾竹桃苷預處理細胞。在感染後起始的2小時培養後，洗滌感染的細胞以除去細胞外的病毒及夾竹桃苷。接著，按下述處理回收的感染細胞。用夾竹桃苷處理感染的細胞(圖23A：1μg/mL作為水性組分於具有RPMI 1640培養基的0.1%DMSO水溶液中；圖23C：在具有RPMI 1640的0.01%DMSO水溶液中為0.1μg/mL)或僅對照組載體(圖23B：具有RPMI 1640的0.1%DMSO水溶液；圖23D：具有RPMI 1640的0.01%DMSO水溶液)，並測定病毒力價。
圖24A為描述在感染後24小時在培養基中的病毒複製(Y1，左軸)及Vero-E6細胞計數(Y2，右軸：夾竹桃苷針對前述細胞的潛在細胞毒性的表達)相對於夾竹桃苷濃度(μg/mL)的抑制百分比的雙y軸圖(實施例29)。圖24B是用於圖24A的培養物，但在感染後48小時所得。
圖25為描述在細胞持續暴露於指示濃度的夾竹桃苷後24小時，在培養基中的Vero-E6細胞(細胞力價)相對於夾竹桃苷的濃度(μg/mL)的百分比圖表(實施例30)。
圖26A~26B為描述「處理」後24小時(圖26A)及48小時(圖26B)，對於用SARS-CoV-2病毒感染、接著用夾竹桃苷(藍色圓圈)或對照組載體(培養基)(紅色正方形)進行處理的VERO CCL-81細胞(嗜鹽擬青猴腎正常細胞；https://www.atcc.org/products/all/CCL-81.aspx)，在培養基中SARS-CoV-2病毒力價(PFU/mL)的對數相對於夾竹桃苷濃度的圖表(實施例31)。
對於圖26A及26B的樣本，在24小時(圖26C)及48小時(圖26D)測定病毒力價的倍數降低。
圖27A~27D為描述「處理」後24小時及48小時，對於用SARS-CoV-2病毒感染、並用夾竹桃苷(藍色圓圈)或對照組載體(培養基)(紅色正方形)處理的VERO CCL-81細胞，SARS-CoV-2病毒力價(PFU/mL)的對數相對於時間(小時)的圖表(實施例28)。在感染之前用夾竹桃苷預處理細胞。在感染後起始的2小時培養後，洗滌感染的細胞以除去細胞外的病毒及夾竹桃苷。接著，按下述處理回收的感染的細胞。用夾竹桃苷處理感染的細胞(圖27A：在以RPMI 1640培養基為水溶液成分的DMSO(0.005%)水溶液中為0.05μg/mL；圖27B：在具有RPMI 1640的DMSO(0.01%)水溶液中為0.1μg/mL)；圖27C：在具有RPMI 1640的DMSO(0.05%)水溶液中為0.5μg/mL；圖27D：在具有RPMI 1640的DMSO(0.1%)水溶液中為1μg/mL)，並測定病毒力價。
圖28A及28B為描述「處理」後24小時(圖28A)及48小時(圖28B)的，在對於用SARS-CoV-2病毒感染、接著用夾竹桃苷(深藍色圓圈(實施例2)及淺藍色圓圈(實施例3))或對照組載體(培養基)(深紅色正方形(實施例2)及淺紅色正方形(實施例3))處理的VERO CCL-81細胞，在培養基中的SARS-CoV-2病毒力價(PFU/mL)的對數相對於夾竹桃苷的濃度的圖表。實施例2及實施例3僅僅是該測定的重複進行。
圖29A及29B為描述培養基中的病毒力價相對於夾竹桃苷濃度的條形圖，其中在感染後24小時(圖29A)及48小時(圖29B)測定病毒力價。對於某些樣本，在感染前後(2小時)，用夾竹桃苷(藍色實心條)或僅含DMSO對照組載體(紅色實心條)處理細胞。對於其他樣本，用夾竹桃苷(藍色虛線條：感染後12小時；空心藍色條：感染後24小時)或僅含DMSO對照組載體(紅色虛線條：感染後12小時；空心紅色條：感染後24小時)處理細胞。
圖30A及30B為描述用於評估雙重萃取物組合組成物(PBI-A)的抗COVID-19活性的圖表。於圖30B，μg/ml (夾竹桃苷濃度)的文字說明是指PBI-A係以1μg/ml (夾竹桃苷濃度)溶液提供。確定病毒力價(Log 10(PFU/mL))相對於Log 10稀釋指數(圖30A)或相對於夾竹桃苷的Log 10濃度(圖30B)。圖30A針對實施例31的感染前測定的數據處理，圖30B針對實施例34的感染後測定的處理。 
                         序列表
          <![CDATA[<110>  美商菲尼克斯生物技術公司(Phoenix Biotechnology, Inc.)      ]]>
          <![CDATA[<120>  用於預防冠狀病毒感染之方法及組成物]]>
          <![CDATA[<130>  PBI-22-PCT9]]>
          <![CDATA[<150>  US 63/002735]]>
          <![CDATA[<151>  2020-03-31]]>
          <![CDATA[<150>  US 63/010246]]>
          <![CDATA[<151>  2020-04-15]]>
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          <![CDATA[<151>  2020-04-23]]>
          <![CDATA[<150>  US 63/017263]]>
          <![CDATA[<151>  2020-04-29]]>
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          <![CDATA[<151>  2020-05-24]]>
          <![CDATA[<150>  US 63/034800]]>
          <![CDATA[<151>  2020-06-04]]>
          <![CDATA[<150>  US 16/895920]]>
          <![CDATA[<151>  2020-06-08]]>
          <![CDATA[<150>  US 63/042656]]>
          <![CDATA[<151>  2020-06-23]]>
          <![CDATA[<150>  US 63/051576]]>
          <![CDATA[<151>  2020-07-14]]>
          <![CDATA[<160>  3  ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  正向引子(5'端到 3'端)序列]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          taatcagaca aggaactgat ta                                               22
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  反向引子(5'端到 3'端)序列]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          cgaaggtgtg acttccatg                                                   19
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223> 探針序列(5'‐FAM‐序列‐TAMRA‐3'); FAM為6-螢光素醯胺(6-fluorescein ]]>
          amidite); TAMRA為羧基四甲基羅丹明(Carboxytetramethylrhodamine)
          <![CDATA[<400>  3]]>
          gcaaattgtg caatttgcgg                                                   20
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002

Claims (14)

  1. 一種包含夾竹桃苷之抗病毒組成物在製備用於預防COVID-19或SARS-CoV-2冠狀病毒感染藥物的用途，其特徵係包含處置期中向有需要的受試者施用一或複數劑處置有效劑量的該抗病毒組成物。
  2. 如請求項1所述之用途，其中，處置期為至少5天至一個月或複數個月。
  3. 如請求項1所述之用途，其中，處置期中施用頻率為每周施用兩天以上。
  4. 如請求項1至2中任一項所述之用途，其中，每天夾竹桃苷的總劑量為0.01μg至750μg。
  5. 如請求項1至3中任一項所述之用途，其中，該抗病毒組成物劑量為0.05~0.5mg/kg/天或0.05~0.5μg/kg/天，其係基於每日受試者體重每kg的夾竹桃苷的單位量。
  6. 如請求項1至2中任一項所述之用途，其中，a)夾竹桃苷的每日劑量最大為：100μg/天；及/或b)夾竹桃苷的每日劑量最小為：0.5μg/天。
  7. 如請求項1至2中任一項所述之用途，其中，為處置期中每天向有需要的受試者施用兩劑或每12小時施用一劑處置有效劑量的該抗病毒組成物，且該劑中的夾竹桃苷的量為0.25μg至50μg。
  8. 如請求項1至2中任一項所述之用途，其中，該一或複數劑為2至10劑處置有效劑量的該抗病毒組成物。
  9. 如請求項1至2中任一項所述之用途，其中，夾竹桃苷存在於 包含至少一種從含有夾竹桃苷之生物質獲得之萃取物的組成物中；其中，該萃取物在每次出現時獨立地選自由以下組成的群組：熱水萃取物、溶劑萃取物、亞臨界流體萃取物及超臨界流體萃取物；其中，該萃取物包含夾竹桃苷及一或複數種萃取自該含夾竹桃苷之生物質之化合物的組合；其中，該一或複數種萃取自該含夾竹桃苷之生物質之化合物包含一種或複數種強心苷前體、強心苷的一或複數種醣體成分或其組合。
  10. 如請求項1至2中任一項所述之用途，其中，在施用該一或複數劑後，該受試者的夾竹桃苷之血漿濃度在0.005至10ng/mL的範圍內，其係以每mL血漿的夾竹桃苷的量計。
  11. 如請求項1至2中任一項所述之用途，其中，每個月持續給藥一周或多周，或每年持續給藥一個月或複數個月。
  12. 如請求項1至2中任一項所述之用途，其中，該施用係全身施用。
  13. 如請求項1至2中任一項所述之用途，其中，該抗病毒組成物作為主要抗病毒療法、輔助抗病毒療法或聯合抗病毒療法來施用，且該施用包含：將該組成物與至少一種其他抗病毒組成物或與至少一種用於預防與該病毒感染相關之症狀的其他組成物分開施用或共同施用。
  14. 如請求項9所述之用途，其中，該萃取物包含夾竹桃苷及一或複數種選自由以下組成的群組的化合物：強心苷、糖苷配基、類固醇、醣類、生物鹼、脂肪、蛋白質。
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