CN104147088A

CN104147088A - 金合欢提取物在抗衰老中的应用

Info

Publication number: CN104147088A
Application number: CN201310179837.2A
Authority: CN
Inventors: 方兆华; 李慧; 夏增华; 曹平
Original assignee: JALA CORP
Current assignee: JALA CORP
Priority date: 2013-05-15
Filing date: 2013-05-15
Publication date: 2014-11-19

Abstract

一种金合欢的提取物，应用于皮肤抗衰老领域，该提取物先使用极性溶剂进行提取，所得粗提液经吸附树脂吸附并以水和乙醇组成的洗脱液洗脱后制得。本发明以单一的金合欢植物为原材料制取，简单高效，对弹性蛋白酶活性具有抑制作用，能显著清除自由基。以该提取物为活性成分制成食品、动物用饲料、药品、准药品和化妆品等产品。

Description

金合欢提取物在抗衰老中的应用

技术领域

本发明涉及一种植物提取物的用途，尤其涉及一种金合欢植物的提取物，作为抗衰老剂在化妆品，或在食品、动物用饲料、药品和准药品等中的应用。

背景技术

“金合欢”是指豆科金合欢属植物，如：阿拉伯胶树、阿拉伯金合欢、大叶相思、钝叶金合欢、儿茶、粉被金合欢、光叶金合欢、黑荆、灰金合欢、尖叶相思、金合欢、台湾相思、藤金合欢、无刺金合欢、线叶金合欢、绿荆、银荆、羽叶金合欢和云南相思树等，这些植物的花蕾、枝干、根茎、树皮和树叶部分均可用于制取抑制弹性蛋白酶的提取物，优选源自豆科金合欢属植物黑荆（Acacia mearnsii De Wild.），尤其是其花蕾、树皮和树叶。从黑荆中提取物的多酚化合物可用于防止皮肤干燥，抑制特异性皮炎引起的瘙痒（Evid Based Complement Alternat Med.2012,doi:10.1155/2012/120389）。研究显示黑荆多酚提取物具有抑制脂肪酶和糖苷酶的活性，可以减少血脂和血糖的水平，具有减肥的功效。在欧洲，黑荆树皮中提取的多酚被用于消除葡萄酒的沉积物。澳大利亚原住民则将黑荆的嫩叶和果实作为食物。研究显示一天摄入3000mg/kg黑荆水醇提取物的大白鼠没有出现死亡，15天每天摄入300mg/kg和600mg/kg黑荆提取物的小白鼠没有表现出任何显著的体重变化，也未发现血液和生化指标的改变。说明黑荆提取物在急性和亚急性毒性方面是安全的。

弹性蛋白酶（Elastase，CAS No.39445-21-1）是一种分布于多种组织和细胞中的破坏性酶，它能水解结缔组织成分如：弹性蛋白、蛋白多糖和某些胶原质。结缔组织蛋白质中的弹性蛋白被弹性蛋白酶消化分解后，可使皮肤失去弹性，表现出皮肤松弛、显露暗纹和出现皱纹等皮肤衰老现象。

目前，尚未发现金合欢在抗衰老领域中的应用，尤其未涉及抑制弹性蛋白酶相关技术方案。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种金合欢的提取物，具有抑制弹性蛋白酶活性的作用。

本发明的另一个目的在于提供一种金合欢的提取物，用于皮肤的抗衰老护理，使皮肤的紧致得到增强，皮肤弹性得以提高，显著减少暗纹和皱纹。

本发明的又一个目的在于提供一种金合欢的提取物，作为活性组分应用于食品、动物用饲料、药品、准药品和化妆品等产品。

本发明所称的“金合欢”是指金合欢属植物，如：阿拉伯胶树、阿拉伯金合欢、大叶相思、钝叶金合欢、儿茶、粉被金合欢、光叶金合欢、黑荆、灰金合欢、尖叶相思、金合欢、台湾相思、藤金合欢、无刺金合欢、线叶金合欢、银荆、绿荆、羽叶金合欢和云南相思树等，这些植物的花蕾、枝干、根茎、树皮和树叶部分均可用于制取抑制酪氨酸酶的提取物，优选选择源自豆科金合欢属植物澳洲金合欢（Acacia dealbata link.），尤其是其花蕾、树皮和树叶。

本发明所称的“提取物”是指提取自金合欢的含有一种或多种具有抑制酪氨酸酶活性物质的组合物或混合物。各个活性物质按比例简单混合，或与其它物质形成另一种形式，如：但不仅限于胶束、脂质体和悬浊液等。

本发明所称的“活性物质”或“活性成分”是指通过体外酶抑制实验证明能够抑制酪氨酸酶活性的化合物、聚合物、核酸、多肽、蛋白质及各自以离子键、共价键、配位键或疏水相互作用等化学键形成的复合物和结合物。

本发明所称的“加工”或“预加工”应理解为以物理方式对原材料进行的分解或拆分，以各种方式（如：切、锯、压、研磨、搅拌或粉碎等）将体积较大的材料分为体积较小的材料，如：段状、块状、片状、条状、颗粒状、粉状或末状。

本发明所称的“极性溶剂”是指含有羟基或羰基等极性基团的有机溶剂，如：但不仅限于水、甲酰胺、二甲基甲酰胺、六甲基磷酰胺、四甲基乙二胺、三乙胺、三丁胺、三辛胺、乙酸、三氟乙酸、乙腈、甲酸甲酯、乙酸乙酯、碳酸二甲酯、二甲亚砜、丙酮、甲乙酮、二氧六环、吡啶、四氢呋喃、甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇和乙醚等一种或几种，优先选择乙醇水溶液，浓度为30v/v%-90v/v%，或为50v/v%-90v/v%，或为30v/v%-39v/v%、40v/v%-49v/v%、50v/v%-70v/v%和70v/v%-90v/v%之一种或几种，或为50v/v%、55v/v%、60v/v%、65v/v%、66v/v%、67v/v%、68v/v%、69v/v%、70v/v%、71v/v%、72v/v%、73v/v%、74v/v%、75v/v%、76v/v%、77v/v%、78v/v%、79v/v%、80v/v%、81v/v%、82v/v%、83v/v%、84v/v%、85v/v%、86v/v%、87v/v%、88v/v%、89v/v%和90v/v%之一种或几种。

本发明所称的“吸附树脂”是本领域一般技术人员的所了解的大孔吸附树脂，优先选择弱极性的或中等极性的吸附树脂，如：但不仅限于X-5、AB-8、D101、XDA-6、LX-21、NK-9、D3520和WLD等，尤其是AB-8树脂。

本发明中，浸泡金合欢所用的极性溶剂量并没有特别的限定，应使金合欢与极性溶剂充分接触。由于原材料通常具有较大的体积，堆叠一起而占据较多空间，因此需要相当的极性溶剂，如：但不仅限于使用重量10-60倍于金合欢的极性溶剂即可实现对金合欢原材料的浸泡，并取得良好的效果。可应用于本发明的重量倍数如：但不仅限于10-50、10-20、20-50，以及10、15、20、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59和60。

如技术人员通常所能理解的，在用极性溶剂浸泡金合欢阶段，提高金合欢与溶剂的接触面积能显著提高物质的溶出率，从而提高活性成分的提取效果。因此，用于浸泡的金合欢也应理解为已进行过加工，如：切成块、片和条，尤其是制成粉末（如：平均粒径小于2.5mm）。

极性溶剂能浸润金合欢，但活性物质的浸出率或溶出率仍较低，有必要采用进一步方法如：但不仅限于煎、煮、回流、搅拌、匀浆和超声等提取方式，以提高作业效率。这些方法可单独或组合使用，也可以重复多次。上述提取方式经适量的时间（不超过2小时）如：但不仅限于0.5-1.0小时，0.5-2.0小时以及1.0-2.0小时等即可增加活性物质的浸出率或溶出率。

洗脱液洗脱是本发明获得活性物质的关键步骤之一，有助于提取物对酪氨酸酶抑制效果的提高，但是其洗脱的具体方式，如：线性梯度洗脱、等度洗脱和阶梯式梯度洗脱等不得限定本发明。为了适应生产规模和分离介质（如：吸附树脂）的需要，本领域技术人员可选择并适用任何一种或几种洗脱方式，并收集相应的洗脱液。本发明提供的洗脱方式，如：以水和乙醇组成洗脱液，依次以水、20v/v%±5v/v%乙醇、40v/v%±5v/v%乙醇、60v/v%±5v/v%乙醇和80v/v%±5v/v%乙醇进行洗脱，并分别收集洗脱液；又如：以水和乙醇组成洗脱液，依次以水、40v/v%±5v/v%乙醇和80v/v%±5v/v%乙醇进行洗脱，并分别收集洗脱液；再如：以水和乙醇组成洗脱液，进行20v/v%-80v/v%乙醇、20v/v%-60v/v%乙醇或30v/v%-50v/v%乙醇线性梯度洗脱，并收集洗脱液。

本发明提供的一种金合欢的提取物，其按如下方法制得：

使用极性溶剂对金合欢进行提取，如：但不仅限于施以煎、煮、回流、搅拌、匀浆和超声之一种或几种提取方式处理而得金合欢粗提液，再经吸附树脂吸附后，以水和乙醇组成的洗脱液洗脱，并收集洗脱液而得。

经测定，本发明制得各种金合欢的提取物，具有抑制弹性蛋白酶和清除自由基活性的作用。进一步实验验证，以此护理皮肤具有抗衰老效果，可应用于食品、动物用饲料、药品、准药品和化妆品等产品。

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明以单一的金合欢植物为原材料，尤其是金合欢植物的花蕾、树皮和树叶，使产品质量可控，效用稳定。

本发明先使用极性溶剂进行提取，所得粗提液经吸附树脂吸附并洗脱后制得金合欢提取物。该技术方案简单高效，适合于以工业化方式对金合欢植物中的活性物质进行提取、利用和开发。

本发明制取提取物的方法安全可靠，所得提取物具有抑制弹性蛋白酶和清除自由基的作用，可作为活性成分制成食品、动物用饲料、药品、准药品和化妆品等产品，用于增强皮肤紧致度，提高皮肤弹性，以及减少暗纹和皱纹等。

具体实施方式

以下详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

实施例1 金合欢提取条件的优选

新鲜金合欢10g，采用L₉(3₄)正交试验（药物研究常用数学方法及计算机程序[P]，贵州科技出版社，1997）进行提取工艺的优化，以料液比（A）、乙醇浓度（B）、提取时间（C）为试验因素，以及空白列（D）。以提取率为指标进行正交设计试验，优化提取工艺条件。因素水平设计见表1，其中从生产成本考虑，提取时间一般不超过2小时，结果见表2。

表1正交试验因素水平

表2L₉(3₄)正交试验设计及结果表

表3正交试验直观分析表

表4正交试验方差分析表

F_0.05(2,2)＝19.0

正交试验方差分析表明：置信度为0.95时，乙醇浓度和提取时间是显著性因素，料液比在所选择的三个水平中为不显著因素。直观分析可得，A3B1C3即50倍料液比、50%乙醇浓度以及提取时间2小时，是金合欢提取物的最佳提取条件。因为料液比对提取率影响效果不显著，基于溶剂成本的考虑，实际生产中亦可以采用20倍料液比。

实施例2金合欢花蕾提取物的制取

将100g金合欢花蕾清洗后，与2L70v/v%乙醇溶液混合，在室温下，超声提取1小时，分离出粗提液，经减压蒸出乙醇溶液后，得到金合欢花蕾粗提物6g。

取金合欢花蕾粗提物1g，用去离子水溶解后，上样到AB-8树脂填充柱，依次用去离子水、20v/v%乙醇、40v/v%乙醇、60v/v%乙醇和80v/v%乙醇梯度洗脱，分别收集洗脱液，减压蒸出乙醇和水，分别得到水洗部位、20v/v%乙醇部位、40v/v%乙醇部位、60v/v%乙醇部位和80v/v%乙醇部位的金合欢花蕾提取物，-20℃下冷冻保存。

实施例3金合欢树皮提取物的制取

将50g金合欢树皮清洗后，与1L70v/v%乙醇溶液混合，用循环逆流提取法提取2小时，分离出粗提液，经减压蒸出去离子水后，得到金合欢树皮粗提物5g。

取金合欢树皮粗提物5g，用去离子水溶解后，上样到X-5树脂填充柱，依次用去离子水、20v/v%乙醇、40v/v%乙醇、60v/v%乙醇和80v/v%乙醇梯度洗脱，分别收集洗脱液，减压蒸出乙醇和水，分别得到水洗部位、20v/v%乙醇部位、40v/v%乙醇部位、60v/v%乙醇部位和80v/v%乙醇部位的金合欢树皮提取物，-20℃下冷冻保存。

实施例4金合欢树叶提取物的制取

将200g金合欢树叶清洗后，与4L50v/v%乙醇溶液混合，在室温下，搅拌提取1.5小时，分离出粗提液，经减压蒸出乙醇溶液后，得到金合欢树叶粗提物8g。

取金合欢树叶粗提物1g，用去离子水溶解后，上样到AB-8树脂填充柱，依次用去离子水、20v/v%乙醇、40v/v%乙醇、60v/v%乙醇和80v/v%乙醇梯度洗脱，分别收集洗脱液，减压蒸出乙醇和水，分别得到水洗部位、20v/v%乙醇部位、40v/v%乙醇部位、60v/v%乙醇部位和80v/v%乙醇部位的金合欢树叶提取物，-20℃下冷冻保存。

实施例5弹性蛋白酶抑制活性的检测

分别按照实施例2、实施例3和实施例4制备的样品，溶于去离子水，配制成水溶液，用于测定弹性蛋白酶抑制活性。测定方法按照文献（Am.J.Pharmacol.Toxicol.,2009,4,127-129）方法进行，测定步骤为：在96孔板中加入10uL样品溶液和130uL含有1.015mM反应底物Succ-Ala-Ala-Ala-p-硝基酰替苯胺的0.1M Tris-Cl缓冲溶液（PH8.0），在25℃下温育5分钟，加入15uL弹性蛋白酶溶液（0.5U/ml），继续在25℃下温育30min，然后用酶标仪测定410nm波长的吸光度A₄₁₀。用去离子水替换样品水溶液，作为参比溶液同样测定吸光度，结果见表5。

弹性蛋白酶活性抑制率计算公式为：抑制率（%）=（A₀-（A₄₁₀-B））/A₀×100%，其中A₀是参比溶液的吸光度，A₄₁₀是样品溶液的吸光度，B是样品水溶液稀释3倍后的吸光度。

表5弹性蛋白酶活性抑制的测定结果

由表5可见，分别从金合欢植物的花蕾、树皮和树叶获得的提取物，经吸附树脂分离后，所得40v/v%乙醇洗脱部位均能实现对弹性蛋白酶活性的抑制，其中金合欢花蕾的提取物对弹性蛋白酶活性的抑制作用最强。

实施例6清除自由基活性的检测

分别按实施例2、实例3和实例4方法制备得到的金合欢提取物，用DPPH法测定其清除自由基活性，以V_C为参照物。测定步骤为：准确移取提取液2mL于10mL具塞试管中，加人2mL DPPH乙醇溶液（2×10^-4mol/L），充分混匀，室温静置，30min后用分光光度计测定517nm波长的吸光度A₅₁₇（以乙醇为参比）；同时测定2mL DPPH溶液与2mL乙醇混合后的吸光度A_c，以及2mL提取液与2mL乙醇溶液混合后的吸光度A₀。平行测定三次，取平均值，根据以下公式计算自由基清除率。

自由基清除率=（1-（A₅₁₇-A₀）/A_c）×100%。

表6DPPH法清除自由基活性的检测结果

由表6可见，分别从金合欢植物的花蕾、树皮和树叶获得的提取物，经吸附树脂分离后，所得20v/v%乙醇、40v/v%乙醇、60v/v%乙醇和80v/v%乙醇洗脱部位均能实现对DPPH自由基的清除，其中金合欢植物花蕾提取物的40v/v%乙醇洗脱部位对自由基的清除作用最强。

Claims

1.一种金合欢的提取物在皮肤抗衰老领域的应用。

2.一种金合欢的提取物在抑制弹性蛋白酶酶活性中的应用。

3.一种金合欢的提取物用于清除自由基。

4.根据权利要求1-3之一所述的金合欢提取物的应用，其特征在于用于制成食品、动物用饲料、药品、准药品或化妆品。

5.根据权利要求1-3之一所述的金合欢提取物的应用，其特征在于所述的金合欢提取物按如下方法制得：使用极性溶剂对金合欢进行提取处理而得金合欢粗提液，再经吸附树脂吸附后，以水和乙醇组成的洗脱液洗脱，并收集洗脱液而得。

6.根据权利要求5所述的金合欢的提取物的应用，其特征在于所述极性溶剂为乙醇水溶液。

7.根据权利要求5所述的金合欢的提取物的应用，其特征在于所述乙醇水溶液的浓度为50v/v%—90v/v%。

8.根据权利要求5所述的金合欢的提取物的应用，其特征在于所述极性溶剂的用量为金合欢重量的10-60倍。

9.根据权利要求5所述的金合欢的提取物的应用，其特征在于所述洗脱液为20v/v%-80v/v%乙醇。

10.根据权利要求5所述的金合欢的提取物的应用，其特征在于所述吸附树脂为AB-8。