JP2002506079A - 種々の選択された器官または組織にホーミングする分子 - Google Patents

種々の選択された器官または組織にホーミングする分子

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、種々の正常な器官または組織（肺、膵臓、皮膚、網膜、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓または腸を含む）に選択的にホーミングする分子を提供し、そして腫瘍を保有する器官または組織（膵臓腫瘍を有する膵臓または肺腫瘍を有する肺を含む）に選択的にホーミングする分子を提供する。本発明はまた、部分に連結した器官または組織ホーミング分子を含む結合体を提供する。このような機能基は、例えば、治療的薬剤または検出可能な薬剤であり得る。本発明はまた、肺内皮細胞に選択的にホーミングする、膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ）−結合ホーミング分子を同定する方法を提供する。この方法は、ＭＤＰを１以上の分子と接触させる工程；および分子のこのＭＤＰへの特異的な結合を測定する工程を包含し、ここで特異的な結合の存在は、その分子を、肺内皮細胞に選択的にホーミングする、ＭＤＰ−結合ホーミング分子として同定する。このようなＭＤＰ−結合ホーミング分子は部分に連結され得、そして結合体として被験体に投与される場合、この結合体は、被験体においてこの機能基を肺内皮細胞へ選択的に指向する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は、１９９８年３月１３日に出願された米国出願番号第０９／０４２，
１０７号の一部継続出願であり、この内容の全体を本明細書中に参考として援用
する。
【０００２】 本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられる助成金番号ＣＡ ７４２３
８およびＣＡ ３０１９９のもとで政府支援が行われた。
【０００３】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、一般に、分子医学および薬物送達の分野に、そしてより詳細には特
定の器官または組織にホーミングする分子に関する。
【０００４】 （背景情報） 特定の病理学の効果はしばしば、罹患した人の身体全体に現れるが、一般に、
基礎になる病理は、単一の器官または組織のみに影響を与え得る。しかし、薬物
または他の処置が、罹病器官または罹病組織のみを標的化することは稀である。
より一般的には、処置は、例えば、患者の身体全体での全身毒性効果に起因して
、望ましくない副作用をもたらす。例えば、標的器官または標的組織に関連した
疾患の処置のために器官または組織を選択的に標的化することが望ましい。詳細
には、器官または組織の標的化は、遺伝子の発現を、特定の器官または組織に指
向させるために有用であり得る。なぜなら、非標的細胞への外来遺伝子の取り込
みは、望ましくない副作用（例えば、悪性トランスフォーメーション）を生じ得
るからである。
【０００５】 大部分の治療物質は、標的器官または標的組織に循環を介して送達される。血
管の内部表面の内側を覆う内皮は、標的器官または標的組織における循環治療物
質が遭遇する最初の細胞型である。これらの細胞は、治療を器官または組織へと
選択的に指向するための標的を提供する。
【０００６】 内皮は、独特の形態および生化学的マーカーを種々の組織において有し得る。
リンパ系の血管は、例えば、リンパ球のホーミングを導くように作用する種々の
接着タンパク質を発現する。例えば、リンパ節に存在する内皮細胞は、Ｌ−セレ
クチンについてのリガンドである細胞表面マーカーを発現し、そしてパイアー斑
細静脈における内皮細胞は、α4β7インテグリンについてのリガンドを発現する
。これらのリガンドは、それらのそれぞれのリンパ系器官への特異的リンパ球ホ
ーミングに関与する。従って、薬物をＬ−セレクチンまたはα4β7インテグリン
に連結することにより、この薬物を、それぞれ、罹病リンパ節またはパイアー斑
へと標的化するための手段を提供し得る。ただし、これらの分子は、有意な数の
他の器官または組織において存在する類似のリガンドには結合しない。
【０００７】 非リンパ系組織の血管に存在するホーミング分子は明確には規定されていない
が、リンパ球の循環の特定の観察によって、器官特異的内皮マーカーおよび組織
特異的内皮マーカーが存在することが示唆される。同様に、特定の器官または組
織への特定の型の腫瘍細胞のホーミングまたは転移は、器官特異的マーカーおよ
び組織特異的マーカーが存在し得ることをさらに示唆する。従って、このような
器官特異的マーカーまたは組織特異的マーカーに結合し得、それゆえ、この器官
または組織にホーミングし得る分子を同定する必要性が存在する。本発明は、こ
の必要性を満たし、そして関連する利点も提供する。
【０００８】 （発明の要旨） 本発明は、種々の正常な器官または組織（肺、皮膚、膵臓、網膜、前立腺、卵
巣、リンパ節、副腎、肝臓または腸を含む）に選択的にホーミングする分子を提
供する。例えば、本発明は、ペプチドＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１
）およびＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２）を含む肺ホーミングペプチド（例えば
、ＧＦＥモチーフを含む肺ホーミングペプチド）；ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ
（配列番号３）のような皮膚ホーミングペプチド；ペプチドＳＷＣＥＰＧＷＣＲ
（配列番号４）のような膵臓ホーミングペプチド；ならびにペプチドＣＳＣＦＲ
ＤＶＣＣ（配列番号５）およびＣＲＤＶＶＳＶＩＣ（配列番号６）を含む網膜ホ
ーミングペプチド（例えば、ＲＤＶモチーフを含む網膜ホーミングペプチド）を
提供する。
【０００９】 本発明はまた、部分に連結された器官ホーミング分子または組織ホーミング分
子を含む、結合体を提供する。このような部分は、毒素、細胞死を阻害する薬剤
、細胞による有害もしくは有用な物質の産生もしくは活性を変化させる薬剤、ま
たはこの薬剤に曝露された細胞の増殖を変更する薬剤のような治療的薬剤であり
得る。部分はまた、放射性核種のような検出可能な薬剤、または室のあるマイク
ロデバイスまたは不溶性クロマトグラフィー支持体のようなタグであり得る。本
発明のこのような結合体は、この部分を選択された器官または組織へ指向させる
ために有用である。
【００１０】 本発明はまた、選択された器官または組織にホーミングする分子を、病理を有
するかまたは病理を有する疑いのある被験体に投与することによって、本発明の
器官ホーミング分子を使用して、肺、皮膚、膵臓、網膜、前立腺、卵巣、リンパ
節、副腎、肝臓または腸の病理を診断または処置する方法を提供する。例えば、
肺、皮膚、膵臓、網膜、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓または腸の病理は
、この病理を有する被験体に、治療的薬剤に連結した、適切な器官ホーミング分
子を含む結合体を投与することによって処置され得る。同様に、検出可能な薬剤
に連結した適切な器官ホーミング分子を含む結合体を被験体に投与することによ
り、選択された器官もしくは組織を同定する方法、または選択された器官におけ
る病理を診断する方法。
【００１１】 本発明はさらに、肺、皮膚、膵臓、網膜、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝
臓または腸のホーミング分子に対する標的分子の選択的結合を検出することによ
り、それぞれ、肺、膵臓、皮膚、網膜、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓ま
たは腸における標的分子を同定する方法を提供する。例えば、肺に選択的にホー
ミングするペプチドは、固体マトリックスに結合され得、肺のサンプルが入手さ
れ得、そしてこの標的分子の特異的結合を可能にする条件下でアフィニティーマ
トリックスに通過させられ得、そして標的分子が収集および同定され得る。従っ
て、本発明はまた、器官ホーミング分子、特に、肺、皮膚、膵臓、網膜、前立腺
、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓または腸のホーミング分子を結合する標的分子を
提供する。このような標的分子は、例えば、この標的分子に特異的な抗体を惹起
するために有用であり得る。
【００１２】 本明細書中ではまた、肺内皮に選択的にホーミングする分子である、膜ジペプ
チダーゼ（ＭＤＰ）結合ホーミング分子を同定する方法が提供される。この方法
は、ＭＤＰを１以上の分子と接触させる工程；およびこのＭＤＰへの分子の特異
的な結合を決定する工程を包含し、ここで、特異的結合の存在は、この分子を、
肺内皮に選択的にホーミングするＭＤＰ結合ホーミング分子として同定する。本
発明の１つの方法では、このＭＤＰは、例えば、その天然の状態にあり得るか、
または実質的に精製され得、そして所望であれば、支持体に固定化される。膜ジ
ペプチダーゼは、任意の哺乳動物ＭＤＰ、例えば、配列番号４４８を有するヒト
ＭＤＰであり得る。
【００１３】 本発明によってさらに、肺内皮に選択的にホーミングするＭＤＰ結合ホーミン
グ分子に連結された部分を含む結合体を被験体に投与し、それによって、この部
分がこの被験体における肺内皮に選択的に指向されることによる、被験体におい
て、部分を肺内皮に選択的に指向させる方法が提供される。このような方法は、
例えば、肺への薬物標的化に有用であり得る。本発明の１つの方法では、ＭＤＰ
結合ホーミング部分は、膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ）を１以上の分子と接触させ
る工程；およびこのＭＤＰへの分子の特異的な結合を決定する工程によって同定
され、ここで、特異的結合の存在は、この分子を、肺内皮に選択的にホーミング
するＭＤＰ結合ホーミング分子として同定する。種々の部分は、本発明の方法に
従って肺内皮に選択的に指向され得る。本発明において有用な部分は、例えば、
遺伝子治療ベクターまたは薬物であり得る。
【００１４】 １つの実施態様では、本発明は、肺内皮へ部分を選択的に指向するための方法
を提供し、ここで、ＭＤＰ結合ホーミング分子は、配列Ｘ1−Ｇ−Ｆ−Ｅ−Ｘ2（
配列番号１７）を含むペプチドであり、ここで、Ｘ1およびＸ2の各々は、独立し
て選択される１〜１０個のアミノ酸である。このようなＭＤＰ結合ホーミングペ
プチドとしては、例えば、配列ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）また
はＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２）が挙げられ得る。
【００１５】 別の実施態様では、本発明は、肺内皮へ部分を選択的に指向するための方法を
提供し、ここで、ＭＤＰ結合ホーミング分子は、以下の構造１：
【００１６】
【化３】 を含み、ここで、Ｒ2およびＲ3は、それぞれ、３〜１０個の炭素原子および１〜
１５個の炭素原子の範囲の炭化水素ラジカルであり；これらのＲ2炭化水素鎖も しくはＲ3炭化水素鎖のいずれか１つでは、１〜６個の水素がハロゲンによって 置換され得るか、または非末端メチレンが酸素もしくは硫黄（硫黄の酸化型形態
を含む）によって置換され得；さらに、Ｒ3の末端水素もまたヒドロキシルもし くはチオールによって置換され得、これは、アシル化もしくはカルバモイル化さ
れ得；あるいは、この水素はアミノによって置換され得、これはアシルアミノ基
、ウレイド基、アミジノ基、グアニジノ（ｑｕａｎｉｄｉｎｏ）基もしくはアル
キル基または置換されたアミノ基（四級窒素基化を含む）におけるように誘導体
化され得；あるいはカルボン酸基、ホスホン酸基もしくはスルホン酸基のような
酸性基、またはそれらのエステルもしくはアミド、またはシアノによる置換が存
在し得；あるいは末端アミノ酸基化のようなそれらの組み合わせ；ならびにＲ1 は、水素もしくは低級アルキル（Ｃ1-6）もしくはジアルキルアミノアルキル、 または薬学的に受容可能な陽イオンである。肺転移を低減または予防するための
このようなＭＤＰ結合ホーミング分子は、例えば、シラスタチンとしても公知の
、７−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチ
ルシクロプロパンカルボキサミド）−２−ヘプテン酸であり得る。
【００１７】 ＭＤＰ結合ホーミング分子は、例えば、Ｒ2が、カルボニルに隣接した炭素が 第三級ではあり得ないという制限を有する、分枝したアルキルまたはシクロアル
キルである、構造１を有する化合物であり得る。
【００１８】 ＭＤＰ結合ホーミング分子はまた、例えば、Ｒ2が、カルボニルに隣接した炭 素が第三級ではあり得ないという制限を有する、分枝したアルキルまたはシクロ
アルキルであり、そしてＲ3が第四級窒素、アミン誘導体またはアミノ酸誘導基 である末端置換基を有する、ｎ−アルキル（１〜９個の炭素）またはｎ−アルキ
ル（１〜９個の炭素）である、構造１を有する化合物であり得る。ＭＤＰ結合ホ
ーミング分子は、例えば、Ｒ2が、２，２−ジメチルシクロプロピルもしくは２ ，２−ジクロロシクロプロピルであり、そしてＲ3が、末端置換基を有さないか 、またはトリメチルアンモニウム、アミジノ、グアニジノもしくは２−アミノ−
２−カルボエチルチオである末端置換基を有する、３〜７個の炭素原子の炭化水
素鎖である、構造１を有する化合物であり得る。
【００１９】 本発明において有用な、構造１を有する例示的なＭＤＰ結合ホーミング分子と
しては、以下が挙げられる：Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボ
キサミド）−８−トリメチルアンモニウムヒドロキシド−２−オクテン酸内部塩
；Ｚ−２−（２，２−ジクロロシクロプロパンカルボキサミド）−８−トリメチ
ルアンモニウムヒドロキシド−２−オクテン酸内部塩；Ｚ−２−（２，２−ジメ
チルシクロプロパンカルボキサミド）−８−グアニジノ−２−オクテン酸；Ｚ−
２−（２，２−ジメチルクロロプロパンカルボキサミド）−８−グアニジノ−２
−オクテン酸；Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−
８−ウレイド−２−オクテン酸；Ｚ−８−（１−２−アミノ−２−カルボキシエ
チルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−オ
クテン酸；Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−
オクテン酸（ラセミ形および右旋性形）；Ｚ−２−（２，２−ジクロロシクロプ
ロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸；７−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボ
キシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−
２−へプテン酸；および６−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−
２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−ヘキセン酸。
【００２０】 本発明はまた、被験体に膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ）結合ホーミング分子を投
与することによって、癌を有する被験体において、肺転移を低減または予防する
方法を提供する。好ましい実施態様では、ＭＤＰ結合ホーミング分子は、配列Ｘ 1 −Ｇ−Ｆ−Ｅ−Ｘ2（配列番号１７）を含みむ肺ホーミングペプチドである（こ
こで、Ｘ1およびＸ2の各々は、独立して選択される１〜１０個のアミノ酸（例え
ば、配列ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）またはＣＧＦＥＬＥＴＣ（
配列番号２）を含むペプチド）である）。
【００２１】 別の好ましい実施態様では、ＭＤＰ結合ホーミング分子は、本明細書中上記の
、構造１を含む分子である。このようなＭＤＰ結合ホーミング分子は、例えば、
シラスタチンとして通常公知の、７−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチル
チオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−ヘプテ
ン酸であり得る。
【００２２】 １つの実施態様では、本発明において有用なＭＤＰ結合ホーミング分子は、Ｍ
ＤＰインヒビターである。このようなＭＤＰインヒビターは、例えば、ＭＤＰに
対して、１０００ｎＭ以下のＫｉを示し得る。別の実施態様では、肺転移を低減
または予防する際に有用なＭＤＰインヒビターは、ＭＤＰに対して１００ｎＭ以
下のＫｉ、またはＭＤＰに対して１ｎＭ以下のＫｉを示す。
【００２３】 本発明はまた、被験体にＭＤＰ陰性調節因子を投与することによって、癌を有
する被験体において、肺転移を低減または予防する方法を提供する。本発明にお
いて有用なＭＤＰ陰性調節因子は、例えば、可溶性ＭＤＰポリぺプチド、または
ＭＤＰと選択的に反応する抗体であり得る。
【００２４】 本明細書中でさらに、被験体にＭＤＰ陰性調節因子を投与することによって、
被験体において、肺内皮への細胞ホーミングを低減または予防する方法が提供さ
れる。肺内皮への細胞ホーミングを低減または予防するために有用なＭＤＰ陰性
調節因子は、例えば、可溶性ＭＤＰポリぺプチド、またはＭＤＰと選択的に反応
する抗体であり得る。
【００２５】 本発明はまた、肺転移を低減または予防する分子を同定する方法を提供し、こ
の方法は、膜ジアミノペプチダーゼ（ＭＤＰ）を１以上の分子と接触させる工程
；およびこの分子の存在下でのＭＤＰ活性をコントロール値と比較して決定する
工程を包含し、ここで、この分子の存在下での減少したＭＤＰ活性は、肺転移を
低減または予防する分子としてこの分子を同定する。膜ジアミノペプチダーゼは
、例えば、実質的に精製され得る。ＭＤＰ活性は、例えば、Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ
からのＤ−Ｐｈｅの放出により決定され得る。
【００２６】 １つの実施態様において、本発明は、以下の工程によって肺転移を減少または
予防する分子を同定する方法を提供する；ＭＤＰを１つ以上の分子と接触させる
工程；コントロール値と比較して、その分子の存在下でＭＤＰ活性を決定する工
程；癌を有する被験体に、その分子を投与する工程；および転移のコントロール
レベルと比較して、被験体における肺転移をアッセイする工程であって、ここで
その分子の存在下においてＭＤＰ活性の減少が、その分子を、肺転移を減少また
は予防する分子として同定する工程。
【００２７】 （発明の詳細な説明） 本発明は、器官および組織ホーミング分子、ならびに選択された器官または組
織に部分を標的とするためにこれらの分子を使用する方法を提供する。本発明の
分子は、インビボパンニングの方法（１９９７年４月２２日に発行された、米国
特許第５，６２２，６９９号、これを本明細書中で参考として援用する）によっ
て本質的に同定され、種々の正常器官または組織（肺、皮膚、膵臓、網膜、前立
腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓または腸を含む）および腫瘍を保有する器官（
肺腫瘍を保有する肺および膵臓腫瘍を保有する膵臓を含む）にホーミングするペ
プチドを含む。例えば、本発明は、肺ホーミングペプチドを提供し、このペプチ
ドとしては、ペプチドＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）およびＣＧＦ
ＥＬＥＴＣ（配列番号２）（これらの各々は、トリペプチドＧＦＥモチーフを含
む）、ならびにペプチドＧＩＧＥＶＥＶＣ（配列番号８）が挙げられる。本発明
はまた、ペプチドＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）のような皮膚ホー
ミングペプチド；ペプチドＳＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号４）のような膵臓ホー
ミングペプチドならびにペプチドＣＳＣＦＲＤＶＣＣ（配列番号５）およびＣＲ
ＤＶＶＳＶＩＣ（配列番号６）のような網膜ホーミングペプチド（これらの各々
は、トリペプチドＲＤＶモチーフを含む）を提供する。前立腺、卵巣、リンパ節
、副腎、肝臓および腸にホーミングするペプチドの例もまた提供される（表２〜
１１を参照のこと）。特定の器官ホーミングペプチドに共通のモチーフがこのペ
プチドの単純な検査によって同定され得ることが認識されるべきである。例えば
、表９の検査は、以下のことを明らかにする：ペプチドＡＧＣＳＶＴＶＣＧ（配
列番号３１５）およびＡＧＣＶＱＳＱＣＹ（配列番号３７０）はＡＧＣモチーフ
を共有する；ペプチドＬＥＣＲＲＷＲＣＤ（配列番号３２８）およびＬＥＣＶＡ
ＮＬＣＴ（配列番号３３７）はＬＥＣモチーフを共有する；ならびにペプチドＳ
ＥＣＡＹＲＡＣＳ（配列番号３１９）およびＳＥＣＹＴＧＳＣＰ（配列番号３７
５）はＳＥＣモチーフを共有する。さらに、これらのペプチドのいくつかは、１
回を超えて単離され（表９のアスタリスクを参照のこと）、このことは、そのよ
うなモチーフが、選択的にホーミングするペプチドの能力に関連することを示す
。本明細書中に開示される特定のモチーフ、および開示されたペプチドの検査に
よって同定可能な他のモチーフを含むペプチドは、このモチーフがＲＧＤモチー
フではない場合、本願発明の範囲内であると考えられる。
【００２８】 本発明のホーミング分子は、特定の器官または組織に部分を標的とするために
有用である。従って、本発明は、部分に連結される器官ホーミング分子を含む結
合体を提供する。このような部分は、ウイルスのような治療剤；ウイルス遺伝子
療法ベクター；薬物；放射性核種のような検出可能化剤もしくは画像化剤；また
はビオチンのようなタグであり得る。本明細書中に開示されるように、本発明の
そのような器官ホーミング分子（特に、本発明の結合体）は、選択された器官も
しくは組織を検出もしくは可視化するため、または選択された器官もしくは組織
における病理を診断もしくは処置するために使用され得る。本発明の器官ホーミ
ング分子はまた、選択された器官もしくは組織において発現され、そして器官ホ
ーミング分子を結合する標的分子を単離するために使用され得る。便宜上、選択
された器官または分子にホーミングする本発明の分子は、「器官ホーミング分子
」と称される。
【００２９】 本明細書中で使用されるように、用語「分子」は、１つ以上の異なる基を置換
することによって変化され得る少なくとも１つの反応基を有する有機化合物を意
味するために幅広く使用される。有機分子は、薬物；核酸分子（ＲＮＡまたはＤ
ＮＡを含む）；ペプチド；改変体もしくは修飾ペプチドまたはペプチド模倣物；
タンパク質もしくはそのフラグメント；オリゴ糖；脂質；糖脂質；あるいはリポ
タンパク質であり得る。
【００３０】 有機分子は、天然に存在する分子であり得、これは、有機分子を含む基および
その基を連結する結合が生物学的プロセスによって産生される天然の産物であり
得る。例えば、天然に存在する有機分子は、ＲＮＡ分子またはそのフラグメント
であり得、これは、細胞から単離され得るか、または組換え核酸分子から発現さ
れ得る。同様に、ペプチドは、化学合成によって産生される場合でさえ、天然に
存在する有機分子であると考えられる。なぜなら、アミノ酸基およびその基に連
結する結合は、通常の生物学的プロセスによって産生され得、そしてペプチド自
体が、例えば、ペプチドを含有するタンパク質のタンパク質分解性分解に起因し
て細胞中で産生され得るからである。
【００３１】 有機分子はまた、天然には存在しない分子であり得る。このような分子は、生
物学的プロセスによって天然に産生されない化学基または結合を有する。例えば
、天然に存在しないヌクレオシドアナログ、またはヌクレオチドを連結しそして
ヌクレアーゼによる分解に対して保護するホスホロチオエート結合を含む核酸配
列は、天然に存在しない分子の例である。通常のヒドロキシル基のかわりに、リ
ボース残基の２’炭素原子に結合される２−メチル基を含むリボヌクレオチドは
、酵素分解および化学分解に対して耐性である天然に存在しないＲＮＡ分子の例
である。天然に存在しない有機分子の他の例としては、ＲＮＡ含有２’−アミノ
ピリミジンが挙げられ、そのようなＲＮＡは、天然に存在するＲＮＡと比較して
、ヒト血清および尿素において１０００倍を超えて安定である（Ｌｉｎら、Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２：５２２９−５２３４（１９９４）；および
Ｊｅｌｌｉｎｅｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４：１１３６３−１１３７
２（１９９５）（これらの各々を本明細書中で参考として援用する）を参照のこ
と）。
【００３２】 便宜上、用語「ペプチド」は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質およびタ
ンパク質のフラグメントを意味するように本明細書中で広く使用される。本発明
に有用な他の分子としては、ペプトイド、ペプチド模倣物などが挙げられる。本
発明の器官または組織ホーミングペプチドに関して、ペプチド模倣物（これは、
化学修飾されたペプチド、天然に存在しないアミノ酸分子を含むペプチド様分子
、ペプトイドなどを含む）は、ペプチド模倣物が由来する器官ホーミングペプチ
ドの結合活性を有する（例えば、「Ｂｕｒｇｅｒ’ｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」第５版、第１〜３
巻（Ｍ．Ｅ．Ｗｏｌｆｆ編；Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ １９９５
）（これを本明細書中で参考として援用する）を参照のこと）。ペプチド模倣物
は、ペプチドを超える様々な利点を提供し、この利点としては、ペプチド模倣物
は、被験体に投与される場合、例えば、消化管を通過する間安定であり得、それ
ゆえ経口投与に有用であることが挙げられる。
【００３３】 ペプチド模倣物を同定する方法は当該分野で周知であり、そして、その方法に
は、例えば、可能性のあるペプチド模倣物のライブラリーを含むデータベースの
スクリーニングが挙げられる。例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒ
ａｌ Ｄａｔａｂａｓｅは、公知の結晶構造を有する３００，０００より多くの
化合物の収集物を含む（Ａｌｌｅｎら，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｂ
項，３５：２３３１（１９７９））。この構造寄託は、新しい結晶構造が決定さ
れるにつれて絶えず更新され、そして適切な形状、例えば、器官もしくは組織ホ
ーミング分子と同じ形状を有する化合物について、ならびに器官もしくは組織ホ
ーミングペプチドによって結合された標的分子への可能性のある幾何学的および
化学的に相補性についてスクリーニングされ得る。ホーミングペプチド、または
器官もしくは組織ホーミング分子を結合する標的分子の結晶構造が利用可能でな
い場合、構造は、例えば、プログラムＣＯＮＣＯＲＤ（Ｒｕｓｉｎｋｏら，Ｊ．
Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．２９：２５１（１９８９））を使用
して生成され得る。別のデータベース、Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ
，Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ ＣＡ
）は、市販されている約１００，０００化合物を含み、そしてまた器官または組
織ホーミング分子の可能性のあるペプチド模倣物を同定するために検索され得る
。
【００３４】 用語「核酸分子」はまた、２つ以上のヌクレオチドの任意のポリマーを意味す
るために幅広く使用され、このヌクレオチドは、ホスホジエステル結合のような
共有結合、チオエステル結合、またはヌクレオチドを連結するために有用かつ有
効であることが当該分野で公知の任意の様々な他の結合によって連結される。こ
のような核酸分子は、線状、環状、またはスーパーコイルであり得、そして一本
鎖もしくは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡであり得るか、またはＤＮＡ／ＲＮＡハ
イブリッドであり得る。
【００３５】 本明細書中で使用されるように、用語「ライブラリー」は、分子の収集物を意
味する。ライブラリーは、少数または多数の異なる分子を含み得、約２〜約１０ 15 分子以上まで変動する。ライブラリーの分子の化学構造は、互いに関連し得る
か、または多様であり得る。所望される場合、ライブラリーを構成する分子は、
共通タグまたは独特のタグに連結され得、このタグは、分子の回収および／また
は同定を促進し得る。
【００３６】 ペプチド、ペプトイド、およびペプチド模倣物のような分子の種々の型の多様
な集団を含むライブラリーを調製するための方法は、当該分野で周知であり、そ
して種々のライブラリーが市販されている（例えば、ＥｃｋｅｒおよびＣｒｏｏ
ｋｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：３５１−３６０（１９９５）、なら
びにＢｌｏｎｄｅｌｌｅら，Ｔｒｅｎｄｓ Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１４：８３−
９２（１９９５）、およびその中で引用される参考文献（それらの各々が参考と
して本明細書中に援用される）を参照のこと；ＧｏｏｄｍａｎおよびＲｏ，Ｐｅ
ｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，「Ｂｕｒｇｅ
ｒ’ｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓ
ｃｏｖｅｒｙ」第１巻（Ｍ．Ｅ．Ｗｏｌｆｆ編；Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓ
ｏｎｓ １９９５），８０３−８６１頁、ならびにＧｏｒｄｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ
．Ｃｈｅｍ．３７：１３８５−１４０１（１９９４）（それらの各々が参考とし
て本明細書中に援用される）も参照のこと）。ある分子が、ペプチド、タンパク
質、またはそのフラグメントである場合、その分子は、インビトロで直接生成さ
れ得るか、またはインビトロで生成され得る核酸から発現され得る。合成ペプチ
ドおよび核酸化学の方法は当該分野で周知である。
【００３７】 ペプチド分子のライブラリーはまた、例えば、目的の細胞、組織、器官、また
は生物から集められたｍＲＮＡからｃＤＮＡ発現ライブラリーを構築することに
よって産生され得る。このようなライブラリーを産生する方法は当該分野で周知
である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８９）（これは参考として本明
細書中に援用される）を参照のこと）。好ましくは、ｃＤＮＡによってコードさ
れるペプチドは、ｃＤＮＡを含む細胞またはウイルスの表面上で発現される。例
えば、ｃＤＮＡは、融合物５（実施例Ｉ）のようなファージベクター中にクロー
ン化され得、ここで、発現の際、コードされたペプチドは、そのファージの表面
上で融合タンパク質として発現される。
【００３８】 さらに分子のライブラリーは、核酸分子のライブラリーであり得、この核酸分
子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそのアナログであり得る。例えば、ｃＤＮＡライ
ブラリーは、目的の細胞、組織、器官、または生物から収集されるｍＲＮＡから
か、または制限エンドヌクレアーゼもしくはゲノムＤＮＡを無作為にフラグメン
ト化する方法を使用して適切な大きさのフラグメントを生じるように処理され得
る、ゲノムＤＮＡを収集することによって構築され得る。ＲＮＡ分子を含むライ
ブラリーはまた、細胞由来のＲＮＡを収集することによってか、またはＲＮＡ分
子を化学的に合成することによって構築され得る。核酸分子の多様なライブラリ
ーは、分子中の無作為化された領域の産生を容易にする、固相合成を使用して作
製され得る。所望される場合、無作為化は、分子中の位置で特定の割合の１以上
のヌクレオチドを含む核酸分子のライブラリーを生じるように偏られ得る（米国
特許第５，２７０，１６３号、１９９３年１２月１４日発行、これは、本明細書
中で参考として援用される）。
【００３９】 所望の場合、核酸分子は、ヌクレアーゼによる分解に感受性がより低い、核酸
アナログであり得る。例えば、リボース残基に２’−Ｏ−メチルプリン置換を、
および３’末端および５’末端に短いホスホロチオエートキャップを含むＲＮＡ
分子は、ヌクレアーゼに対して抵抗性の増強を示す（Ｇｒｅｅｎら、Ｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｌ．、２：６８３〜６９５（１９９５）、これは、本明細書中で参考とし
て援用される）。同様に、２’−アミノ−２’−デオキシピリミジンまたは２’
−フルオロ−２’−デオキシピリミジンを含むＲＮＡは、ヌクレアーゼ活性に対
してより感受性が低い（Ｐａｇｒａｔｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ．１５：６８〜７３（１９９７）、これは、本明細書中で参考として援用さ
れる）さらに、Ｌ−ＲＮＡ（これは、天然に生じるＤ−ＲＮＡの立体異性体であ
る）は、ヌクレアーゼ活性に対して抵抗性である（Ｎｏｌｔｅら、Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４：１１１６〜１１１９（１９９６）；Ｋｌｏｂ
ｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４：１１１２〜１１１
５（１９９６）これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）。このよ
うなＲＮＡ分子およびこれらを産生する方法は、周知でありかつ慣用的である（
ＥａｔｏｎおよびＰｉｅｋｅｒｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６４：
８３７〜８６３（１９９５）を参照のこと。これは、本明細書中で参考として援
用される）。オリゴヌクレオチドに連結されるホスホロチオエートを含むＤＮＡ
分子は、ヌクレアーゼ抵抗性である（Ｒｅｅｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０
：６５６５〜６５７０（１９９０）、これは、本明細書中で参考として援用され
る）。ホスホジエステル結合のホスホロチオエート−３’ヒドロキシプロピルア
ミン改変はまた、ヌクレアーゼ分解に対するＤＮＡ分子の感受性を減少する（Ｔ
ａｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２２：９７７〜９８６（１９９４）
（これは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。所望される場
合、ＤＮＡライブラリーの多様性は、チミジンを５−（１−ペンチニル）−２’
−デオキソウリジンと置換することによって増強され得る（Ｌａｔｈａｍら、Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２８１７〜２８２２（１９９４）、これは
、本明細書中で参考として援用される）。このような改変された核酸分子は、ラ
イブラリーの製造またはタグとする目的のために有用であり得る（下記）。
【００４０】 本明細書中で開示されるように、器官または組織のホーミング分子を同定する
ためのインビボでのパニングは、被検体にライブラリーを投与する工程、器官ま
たは組織のサンプルを収集する工程および当該分野にて周知の種々の方法を使用
して、器官または組織のホーミング分子を同定する工程を包含する。一般に、収
集された器官または組織中の器官または組織ホーミング分子の存在は、ライブラ
リー中に存在する分子に共通である、１以上の特性に基づいて同定され、次いで
、特定の器官または組織のホーミング分子の構造を、決定し得る。
【００４１】 高感度の検出方法（例えば、質量分析（ＭＳ））は、単独またはガスクロマト
グラフィー（ＧＣ）のような方法との組合せのいずれかで、選択された器官また
は組織中に少量存在する場合であっても、密接に関連したホーミング分子を同定
するために使用され得る。例えば、ＭＳとの組み合わせでＧＣを使用して、ラッ
トへのリドカインの注射および尿の分析の後に、２つの主要なリドカイン代謝物
および４つの微量なリドカイン代謝物を同定した（Ｃｏｕｔｔｓら、Ｊ．Ｃｈｒ
ｏｍｏｔｏｇｒ．４２１：２６７〜２８０（１９８７）、これは、本明細書中で
参考として援用される）。同様に、ライブラリーが、有機分子（例えば、薬物）
の構造に一般的に基づく多様な分子を含む場合、器官または組織のホーミング分
子は、特定分子のもとのピークの存在を決定することによって同定され得る。
【００４２】 所望される場合、選択された器官または組織は、ＨＰＬＣのような方法を使用
して処理され得、これらの方法は、規定された範囲の分子量または極性などを有
する分子の濃縮した画分を、複雑な混合物から得るために使用され得る。次いで
、分子の濃縮した画分は、器官または組織のホーミング分子を同定するためにさ
らに分析され得る。例えば、ＧＣおよびＭＳと連結したＨＰＬＣを使用して、ラ
ットへのジヒドロタキステロール３の注射および単離され灌流された腎臓の分画
後に、ビタミンＤアナログの７つの代謝物を同定した（Ｐｏｒｔｅｏｕｓら、Ｂ
ｉｏｍｅｄ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ １６：８７〜９２
（１９８８）、これは、本明細書中で参考として援用される）。ＨＰＬＣについ
ての条件は、特定の分子の構造に依存し、そしてその分子の知識に基づいて、当
業者により最適化され得る。
【００４３】 収集された器官または組織のサンプル中に存在する、器官のホーミング分子は
、規定された塩濃度および温度を有する溶液中でのインキュベーションにより、
そのサンプルから回収され得る。選択的な抽出もまた使用して、１以上の溶液中
で収集されたサンプルを連続してインキュベーションすることによって有機分子
の異なる画分を入手し得る。このような溶液は、異なる塩濃度を有し得るか、ま
たは特定の温度で有機ホーミング分子の抽出をもたらし得る。収集されたサンプ
ルから得られた溶出液を、別々に収集し得るか、または１以上の画分中にプール
し得、そして器官のホーミング分子を検出および同定し得る。同様に、潜在的に
妨害する細胞性物質（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質または炭水化
物）の大量除去のための方法は、当該分野で周知である。このような方法を使用
して、収集されたサンプル中の潜在的に混入している物質から、特定の器官のホ
ーミング分子を濃縮し得、そしてその分子を検出する感度を上昇させ得る。
【００４４】 器官または組織のホーミング分子、特にタグ化されていない分子の同定の容易
さは、種々の因子に依存し、この因子としては、潜在的に混入しているバックグ
ラウンド細胞性物質の存在が挙げられる。例えば、ホーミング分子が非タグ化ペ
プチドである場合、細胞性タンパク質のバックグランドを超える特定のペプチド
を同定するために、より多数が、器官または組織にホーミングしなければならな
い。対照的に、はるかに少量の非タグ化ホーミング分子（例えば、薬物）が同定
可能である。なぜなら、このような分子は通常、体内において、一般に存在しな
いか、または非常に少数で存在するからである。この状況において、高感度の方
法（例えば、ＭＳ）を使用して、器官のホーミング分子を同定し得る。当業者は
、分子を同定する方法が、部分的に、特定の分子の構造に依存することを認識す
る。
【００４５】 本明細書中で開示されるように、インビボでのパニングの間に、十分な数の分
子が、この分子を容易に同定し得るように、選択された器官または組織に選択的
にホーミングする。例えば、特定の収集された器官において、ペプチドが２回以
上同定された（表１を参照のこと）。例えば、種々の選択された器官から配列決
定された４０個のクローンのうち、腸のホーミングペプチドであるＹＳＧＫＷＧ
Ｋ（配列番号９）は、そのクローンの２２％に存在した；卵巣のホーミングペプ
チドであるＥＶＲＳＲＬＳ（配列番号１０）およびＲＶＧＬＶＡＲ（配列番号１
１）の各々は、クローンの２２％に存在した；そして肝臓のホーミングペプチド
であるＶＫＳＶＣＲＴ（配列番号１２）は、クローンの１１％に存在した（表１
を参照のこと）。同様に、肺のホーミングペプチドであるＣＬＡＫＥＮＶＶＣ（
配列番号１３）およびＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）；皮膚のホー
ミングペプチドであるＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）；および網膜
のホーミングペプチドであるＣＧＥＦＫＶＣ（配列番号１４）の各々は、他の器
官のホーミングペプチド（表２〜１１；ペプチドをアステリスクで印を付ける）
のように、それぞれの器官のインビボでのパニングの間に、数回独立して単離さ
れた。こららの結果は、同定された器官のホーミング分子の実質的な画分が同じ
構造を有するか、または、多くの場合、保存されたモチーフを共有することを実
証する。
【００４６】 種々のインビボでのパニングスクリーニングの後に、数十万から数百万のホー
ミングペプチドを発現するファージを、それぞれの器官または組織から回収した
。一般に、１回のインビボでのパニングから収集されたファージを、寒天上に播
種し、約２５０〜約３００個のクローンを選択し、５ｍｌ培養で増殖させ、次い
でプールし、そしてインビボでのパニングの引き続く回のために再投与した（「
規則的な方法」）。しかし、いくつかの実験において、１０００個のクローンを
選択し、２ｍｌ培養中で増殖させ、次いでプールし、そしてスクリーニングの引
き続く回のために投与するか；または寒天プレート全体をこすり取り、そして全
てのファージを一緒に培養し、そしてスクリーニングの引き続く回のために投与
した。種々の単離されたファージのペプチド挿入物を、ホーミングした数百万の
うちの、少数の配列のみを同定するように測定した。これらの結果は、特定の型
のホーミング分子が、インビボでのホーミングの後に器官または組織中に相対的
に高い比率で存在し得、これによってその分子を同定し得る容易さを増大させる
ことを示す。
【００４７】 器官または組織のホーミング分子が核酸分子である場合、種々のアッセイ方法
を使用して、その分子を実質的に単離または同定し得る。例えば、ＰＣＲは、ホ
ーミング分子の存在を同定するために特に有用である。なぜなら、原理的に、Ｐ
ＣＲは、単一の核酸分子の存在を検出し得るからである（例えば、Ｅｒｌｉｃｈ
、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｔｏｃｋｔ
ｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（これは、本明細書中で参考として援用される）
を参照のこと）。ＰＣＲはまた、インビトロで所定の標的に結合する核酸分子を
増幅するために使用されており、核酸がヌクレアーゼに抵抗性になり、そして被
検体に投与される場合に、それらは、生物学的プロセス（例えば、インビボでの
リンパ球輸送）を調節した（例えば、Ｈｉｃｋｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．９８：２６８８〜２６９２（１９９６）（これは、本明細書中で参考として
援用される）を参照のこと）。これらの知見は、インビボでのパニングを使用し
て、インビボで器官または組織に選択的にホーミングする核酸分子を同定するよ
うに、被検体の循環中に投与される場合、この核酸分子が十分に安定であること
を示す。
【００４８】 ライブラリーの分子は、タグ化され得、これは、器官のホーミング分子の回収
または同定を容易にし得る。本明細書中で使用される場合、用語「タグ」とは、
そのライブラリーの分子に連結されている、それぞれプラスチックまたは金属マ
イクロビーズ、オリゴヌクレオチド、またはバクテリオファージのような物理的
部分、化学的部分、または生物学的部分を意味する。分子をタグ化する方法は当
該分野で周知である（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ、（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９６）、これは参考と
して本明細書中に援用される）。分子とタグとの間の結合は、共有結合または非
共有結合であり得、そして所望される場合、この結合は、その分子から選択的に
切断可能であり得る。
【００４９】 本明細書中で使用される場合、用語「共有されたタグ」とは、ライブラリー中
の各々の分子に共通である、物理的部分、化学的部分、または生物学的部分を意
味する。共有されたタグを使用し、サンプル中のそのライブラリーの分子の存在
を同定し得るか、またはインビボでのパニングの後に、サンプルからその分子を
実質的に単離し得る。例えば、多様な分子（例えば、核酸）の集団を含むライブ
ラリーを、共有されたタグに結合し得る。例えば、共有されたタグがビオチンで
ある場合、核酸ホーミング分子は、例えば、ストレプトアビジンアフィニティー
カラムに結合することによって、選択された器官または組織から実質的に単離さ
れ得る。器官または組織のホーミング核酸分子の存在はまた、標識されたストレ
プトアビジンと結合することによって検出され得る。血球凝集素抗原のようなペ
プチドはまた、共有されたタグであり得、これは、ライブラリー中の各分子に結
合されている場合、選択された器官または組織からホーミング分子を実質的に単
離する、血球凝集素抗原に特異的である抗体の使用を可能にする。さらに、分子
または分子を含む支持体は、４−エトキシ−メチレン−２−フェニル−２−オキ
サゾリン−５−オン（ｐｈＯｘ）のようなハプテンに結合され、これはホーミン
グ分子を回収する手段として、磁気ビーズに連結された抗ｐｈＯｘ抗体により結
合され得る。ｐｈＯｘ標識された結合体を精製するための方法は、当該分野で公
知であり、そしてこれらの手順を実行するための材料は、市販されている（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、Ｍ
ａｄｉｓｏｎ ＷＩ）。
【００５０】 共有されたタグはまた、サンプル中のそのライブラリーの分子の存在を同定す
るために、またはサンプルからのライブラリーの分子を実質的に単離するために
使用され得る核酸配列であり得る。例えば、ライブラリーの各々の分子は、共有
されたタグを構成する、選択された同じヌクレオチド配列に結合され得る。次い
で、共有されたタグに相補的なヌクレオチド配列を含むアフィニティーカラムは
、その分子に結合した共有されたタグにハイブリダイズすることにより、器官ま
たは組織のサンプルからホーミング分子を単離するために使用され得る。共有さ
れたタグの一部に相補的なヌクレオチド配列もまた、共有されたタグを含む分子
の存在が、ＰＣＲによってサンプル中で同定され得るように、ＰＣＲプライマー
として使用され得る。
【００５１】 タグはまた、特異的タグまたは独特のタグであり得る。本明細書中で使用され
る場合、用語「特異的タグ」とは、ライブラリー中である分子に連結される物理
的、化学的、または生物学的タグを意味し、そしてその特定の分子に対して独特
である。特異的タグは、それが容易に同定可能であるならば、特に有用である。
あるライブラリーの特定の分子に独特であるヌクレオチド配列は、特異的タグ（
例えば、あるライブラリーまたはペプチドの各ペプチドに連結された独特のオリ
ゴヌクレオチドタグ（例えば、ＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８９：５３８１−５３８３ （１９９
２）を参照のこと、これは参考として本明細書中に援用される））の例である。
器官または組織へのホーミングの際、そのホーミングペプチドは、独特のオリゴ
ヌクレオチドタグの配列を、例えば、ＰＣＲを用いて決定することによって同定
され得る（例えば、Ｅｒｌｉｃｈ，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃ
ｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ １９８９）を参照のこと、
これは参考として本明細書中に援用される）。同様に、ファージで提示されるペ
プチドをコードする核酸配列は、特異的な核酸タグの別の例である。なぜなら、
核酸の配列決定が、発現されたペプチドのアミノ酸配列を同定するからである（
実施例Ｉを参照のこと）。そのような独特のオリゴヌクレオチド配列タグは、分
子の他のライブラリーに連結される場合、それに連結されたホーミング分子の配
列を同定するために使用され得る。
【００５２】 共有されたタグおよび特異的タグは、組み合わせると、ホーミング分子がわず
かな量で存在する場合、器官または組織のホーミング分子を単離し、そして同定
するために特に有用であり得る。例えば、あるライブラリーの各分子は、２つの
部分を含むオリゴヌクレオチドタグに連結され得る；内部の独特のヌクレオチド
配列タグおよびＰＣＲにおける使用のためのプライマー結合部位として作用する
共有の隣接５’および３’ヌクレオチドタグ。従って、各分子は、そのホーミン
グ分子を同定するための独特の部分、およびＰＣＲプライマー結合部位を提供す
るための共有部分を有するオリゴヌクレオチドタグを含む。このようなタグ化分
子は、選択された器官または組織へのホーミングの際に、共有された隣接５’お
よび３’ヌクレオチドタグにハイブリダイズするプライマーを用いてＰＣＲを実
行すること、次いでＤＮＡ配列決定を行って内部の独特の配列タグのヌクレオチ
ド配列を決定することによって、同定され得る。そのＰＣＲ産物は、ＰＣＲプラ
イマーの一つを用いて直接配列決定され得るか、またはそのＰＣＲ産物は、ベク
ターにクローニングされ得、そしてそのＤＮＡ配列は、当該分野で周知の慣用方
法によって決定され得る。
【００５３】 共有されたタグおよび独特のタグの種々の他の組合せが使用され得る。例えば
、あるライブラリーにおけるその分子の各々は、特定のヌクレオチド配列タグに
連結され得る（例えば、ＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ、前出、１９９２を
参照のこと）。これはまた、共有された３’ヌクレオチド配列を含み、その配列
は、ＰＣＲにおける使用のためのプライマー結合部位であり得、そしてビオチン
のような共有されたタグへとさらに連結され得る。器官または組織へのホーミン
グの際に、その特定のホーミング分子は、ビオチンタグに基づいて、器官または
組織のサンプルから実質的に単離され得る。次いで、単離された分子は、例えば
、そのヌクレオチドタグの共有された３’ヌクレオチド配列をプライマー結合部
位として用いて、ＰＣＲに基づいた特異的タグのＤＮＡ配列決定によって同定さ
れ得る。
【００５４】 タグはまた、支持体として役立ち得る。本明細書中で使用される場合、用語「
支持体」とは、分子が付着され得る所定の表面を有するタグを意味する。一般に
、支持体として有用なタグは、共有されたタグである。例えば、支持体は、ウイ
ルスまたはバクテリオファージのようなウイルス様粒子（「ファージ」）；Ｅ．
ｃｏｌｉのような細菌；あるいは酵母、昆虫、または哺乳動物細胞のような真
核生物細胞のような生物学的タグであり得；あるいはリポソームまたはマイクロ
ビーズのような物理的タグであり得、これは、プラスチック、アガロース、ゼラ
チン、または他の生物学的もしくは人工的物質から構成され得る。所望であれば
、支持体として有用な共有されたタグは、特異的タグをそこに連結し得る。
【００５５】 本明細書において示されるように、選択された正常な器官もしくは組織（例え
ば、肺、皮膚、膵臓、網膜、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓または腸）へ
、または腫瘍を含む器官もしくは組織（例えば、肺腫瘍を含む肺もしくは膵臓腫
瘍を含む膵臓）へホーミングし得ることが疑われるペプチドは、融合タンパク質
のＮ末端として発現され、ここで、Ｃ末端は、ファージ被覆タンパク質からなっ
た（実施例Ｉを参照のこと）。その融合タンパク質の発現の際に、融合タンパク
質の発現の際、Ｃ末端コートタンパク質は、Ｎ末端ペプチドがその器官または組
織において標的分子と相互作用する位置にあるように、ファージの表面に対して
融合タンパク質を連結した。従って、共有されたタグを有する分子を、ペプチド
のファージへの連結によって形成し、ここで、ファージは生物学的支持体を提供
し、ペプチド分子は融合タンパク質として連結され、融合タンパク質のファージ
コード部分はスペーサー分子として作用し、そしてそのペプチドをコードする核
酸は、器官および組織のホーミングペプチドの同定を可能にする特異的タグを提
供した。
【００５６】 分子が支持体に連結される場合、タグ化された分子は、支持体の表面に付着さ
れた分子を含み、その結果、被験体において細胞中の標的分子と相互作用し得る
疑いのある分子の一部が、相互作用に関与し得るように配置される。例えば、ホ
ーミング分子が増殖因子レセプターのリガンドである疑いがある場合、支持体に
付着された分子の結合部分は、器官または組織における細胞上の増殖因子レセプ
ターと相互作用し得るように配置される。所望であれば、適切なスペーサーが、
分子と支持体との間に配置され得、その結果、可能性のある器官または組織のホ
ーミング分子が標的分子と相互作用する能力は妨害されない。スペーサー分子は
また、反応性基を含み得、これは分子を支持体に連結する便利かつ効率的な手段
を提供し、そして所望であれば、分子の回収または同定を容易にし得るタグを含
み得る（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、前出、１９９６を参照のこと）。
【００５７】 一般的に、支持体は、その支持体が、被験体に存在するキャピラリーベッドを
通して比較的妨害されずに通過し得、そして循環を塞ぎ得ないように、その最短
の寸法で約１０μｍ未満から約５０μｍの直径を有するべきである。さらに、支
持体は、生物学的に不活性であり得、そのため、細胞表面分子の正常発現または
被験体の正常生理状態を混乱させない。さらに、支持体は、特にインビボパニン
グに使用される被験体が選択された器官または組織をのサンプルを収集するため
に屠殺されない場合には、分泌性であり得るか、または生分解性であり得る。
【００５８】 本明細書中で使用される場合、器官または組織のホーミング分子の同定に関し
て使用される場合に、用語「インビボパニング」とは、ライブラリーを被験体に
投与する工程、および被験体において器官または組織に選択的にホーミングする
分子を同定する工程によって、ライブラリーをスクリーニングする方法を意味す
る（米国特許第５，６２２，６９９号、前出を参照のこと）。分子のライブラリ
ーまたはこのようなライブラリーの一部に関して使用される場合、用語「被験体
に投与する（こと）」は、ライブラリーが、一般的に脊椎動物、特にヒトのよう
な哺乳動物である被験体において選択された器官または組織に送達されることを
意味するために、その最も広義に使用される。分子のライブラリーは、投与の任
意の経路または手段（例えば、静脈内、筋肉内、経口的、眼科的、眼球的、腹膜
内、鼻内、膣内、直腸内、子宮内、眼の房内、中枢神経系内または末梢神経系内
、吸入により、局所投与により、あるいは任意の正常な器官もしくは組織、ある
いは腫瘍または病因に関与する器官もしくは組織のような病理学的領域（特に、
その器官または組織の循環系）への注射による）によって投与され得る。
【００５９】 ライブラリーは、例えば、分子が選択された器官または組織を透過するように
被験体の循環中にライブラリーを注射することによって被験体に投与され得；適
切な時間の後、循環は、例えば、心臓を通る灌流によって、あるいはその器官ま
たは組織のサンプルを取り出すことによって終結される（実施例Ｉ；米国特許第
５，６２２，６９９号 前出、１９９７；ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓ
ｌａｈｔｉ，Ｎａｔｕｒｅ ３８０：３６４−３６６（１９９６）もまた参照の
こと、これらは、本明細書において参考として援用される。）。あるいは、カニ
ューレが被験体の血管中に挿入され得、その結果、ライブラリーは適切な時間の
灌流によって投与され、その後、そのライブラリーはカニューレを通して循環か
ら取り出され得るか、またはその被験体が器官サンプルまたは組織サンプルを収
集するために屠殺され得るか、あるいは麻酔にかけられ得る。ライブラリーはま
た、被験体における適切な血管のカニュレーションによって、選択された器官ま
たは組織を含む１つまたはいくつかの器官または組織を通して分流され得る。ラ
イブラリーがまた単離された潅流した器官または組織に投与され得ることが認識
される。単離された潅流した器官または組織におけるこのようなパニングは、そ
の器官または組織に結合する分子を同定するために有用であり得る。
【００６０】 器官または組織のホーミング分子を同定するためのインビボパニングの使用は
、マウスにおいてファージペプチド提示ライブラリーをスクリーニングすること
、および網膜へホーミングするペプチドについて、ラットにおいて肺、膵臓、皮
膚などに選択的にホーミングするペプチドを同定することによって、本明細書中
で例示される（実施例ＩおよびＩＩ）。しかし、例えば、抗体または抗体の抗原
結合フラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆｄ、またはＦａｂフラグメント）；増殖因
子レセプターのようなホルモンレセプター；またはインテグリンまたはセレクチ
ンのような細胞接着レセプターを含む、他のタンパク質分子を提示するファージ
ライブラリーはまた、本発明を実施するために使用され得る。このような分子の
改変体は、ランダム、部位特異的、またはコドンに基づく変異誘発のような周知
の方法を使用して構築され得（Ｈｕｓｅ，１９９３年１１月２３日に発行された
米国特許第５，２６４，５６３号を参照のこと、これは本明細書中で参考として
援用される）、そして所望であれば、ペプチドは、ファージの発現後であるが被
験体への投与の前に、例えば、ジスルフィド架橋を導入することによって、化学
的に改変され得る。従って、多くの異なるタイプのファージ提示ライブラリーが
、インビボパニングによってスクリーニングされ得る。
【００６１】 ファージ提示技術は、ランダムまたは選択的にランダムにされたペプチドの多
様な集団を発現する手段を提供する。ファージ提示の種々の方法およびペプチド
の多様な集団を産生する方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｌａｄｎｅｒ
ら（１９９３年６月２９日に発行された米国特許第５，２２３，４０９号、これ
は本明細書中で参考として援用される）は、ファージの表面上の結合ドメインの
異なる集団を調製する方法を記載する。特に、Ｌａｄｎｅｒらは、ファージ提示
ライブラリーを産生するために有用なファージベクター、ならびに可能性のある
結合ドメインを選択しそしてランダムにまたは選択的に変異した結合ドメインを
産生する方法を記載する。
【００６２】 同様に、ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：
２２８−２５７（１９９３）；ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４９：３８６−３９０（１９９０）もまた参照のこと、その各々は本明細書中
で参考として援用される）は、ファージペプチド提示ライブラリーを産生する方
法（発現されるペプチドの集団を多様化させるベクターおよび方法を含む）を記
載する（Ｈｕｓｅ，ＷＯ ９１／０７１４１およびＷＯ９１／０７１４９もまた
参照のこと、その各々は本明細書中で参考として援用される；実施例Ｉもまた参
照のこと）。ファージ提示技術は、例えば、コドンに基づく変異誘発法とともに
使用される場合、特に強力であり得、これはランダムペプチドまたはランダムに
もしくは所望して偏ったペプチドを産生するために使用され得る（Ｈｕｓｅ，米
国特許第５，２６４，５６３号，前出，１９９３）。これらまたは他の周知の方
法は、ファージ提示ライブラリーを産生するために使用され得、このファージ提
示ライブラリーは、選択された器官または組織へホーミングするペプチドを同定
するために、本発明のインビボパニング方法に供され得る。
【００６３】 ファージ提示ライブラリーをスクリーニングすることに加えて、インビボパニ
ングは、種々の他のタイプのライブラリーをスクリーニングするために使用され
得る。例えば、細胞表面レセプターに結合する核酸分子が記載されている（Ｏ’
Ｃｏｎｎｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：５
８８３−５８８７（１９９６）；ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４９：５０５−５１０（１９９０）；Ｇｏｌｄら、前出（１９９５）を参照の
こと、これらの各々は、本明細書において参考として援用される）。これらのイ
ンビトロの結果は、核酸分子のライブラリーもまた、インビボパニングによって
試験されて、選択された器官または組織へホーミングする核酸分子を同定し得る
ことを示す。スクリーニングに適したさらなるライブラリーは、例えば、オリゴ
サッカリドライブラリー（Ｙｏｒｋら、Ｃａｒｂ．Ｒｅｓ．２８５：９９−１２
８（１９９６）；Ｌｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：１５２０−１５２２
（１９９６）；およびＤｉｎｇら、Ａｄｖ．Ｅｘｐｔ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３７
６：２６１−２６９（１９９５）、これらの各々は、本明細書において参考とし
て援用される）；リポタンパク質ライブラリー（ｄｅ Ｋｒｕｉｆら、ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ．３９９：２３２−２３６（１９９６）、これは、本明細書において
参考として援用される。）；糖タンパク質または糖脂質のライブラリー（Ｋａｒ
ａｏｇｌｕら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１３０：５６７−５７７（１９９５）
、これは、本明細書において参考として援用される。）；または化学物質ライブ
ラリー（例えば、薬物または他の薬学的因子を含む）（Ｇｏｒｄｏｎら、Ｊ．Ｍ
ｅｄ．Ｃｈｅｍ． ３７：１３８５−１４０１（１９９４）；Ｅｃｋｅｒおよび
Ｃｒｏｏｋ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：３５１−３６０（１９９５
）；これらの各々は、本明細書において参考として援用される。）。そのような
ライブラリーは、所望であれば、タグ化され得、これは、以前に記載したように
器官または組織からのその分子の回収あるいはその同定を容易にし得る。
【００６４】 インビボパニングは、器官または組織へ選択的にホーミングし得る分子を直接
同定する方法を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「ホーミングする
」または「選択的にホーミングする」とは、特定の分子が、被験体への投与後に
その器官または組織（特に、その器官または組織に存在する脈管）に存在する標
的分子に比較的特異的に結合することを意味する。一般に、選択的ホーミングは
、コントロール器官または組織と比較して、器官または組織への分子の少なくと
も２倍（２×）大きな選択的結合を検出することによって、一部特徴づけられる
。
【００６５】 選択された器官または組織への分子の選択的ホーミングは、その器官または組
織における細胞上に存在する細胞表面タンパク質のような、特定の細胞標的分子
の分子による選択的認識に起因し得る。ホーミングの選択性は、１つまたはいく
つかのみの異なる細胞型において発現される特定の標的分子に依存し、そのため
、その分子は、１つまたはいくつかのみの器官または組織へホーミングする。こ
の点に関して、ほとんどの異なる細胞型、特に、器官または組織について独特で
ある細胞型は、独特の標的分子を発現し得る。従って、肝臓、脾臓またはリンパ
節のような、その器官について特異的な細胞によって形成される洞様毛細血管を
通じて血液が循環する器官において、インビボパニングは、その特定の器官また
は組織へホーミングする分子を同定するために有用であり得る。
【００６６】 いくつかの場合には、分子は、器官または組織に非特異的に局在し得ることが
認識されるべきである。例えば、ファージ提示ライブラリーのインビボパニング
は、肝臓および脾臓のような器官において高いバックグラウンドを生じ得、これ
は細網内皮系（ＲＥＳ）の顕著な成分を含む。従って、そのような器官または組
織のＲＥＳによる取り込みに起因する分子の非特異的結合は、器官または組織の
ホーミング分子を同定することをより困難にし得る。しかし、本明細書において
開示したように、潜在的な非特異的結合は、例えば、選択された器官または組織
を収集する前に、心臓を灌流することによって、回避され得る（実施例Ｉ）。
【００６７】 さらに、選択的ホーミングは、異なる個々のファージが器官または組織へホー
ミングする能力における相違を検出することによって、非特異的結合から容易に
識別され得る。例えば、選択的ホーミングは、推定のホーミング分子（例えば、
ファージ上に発現されたペプチド）と、過剰の非感染性のファージまたは選択し
ていないペプチドを発現する約５倍過剰のファージとを組み合せること、この混
合物を、被験体に注射すること、およびその器官または組織のサンプルを収集す
ることによって、同定され得る。後者の場合において、例えば、器官または組織
のホーミングペプチドがその標的分子について満足するようなものではない程度
に十分低い、注射されたファージの部分の場合、器官または組織において約２０
％を超えるファージがその推定のホーミング分子を含むということが決定される
ことは、そのファージによって発現されるペプチドが、選択的な器官または組織
のホーミング分子であるという実証的な証拠である。さらに、非特異的な局在化
は、例えば、推定の器官または組織のホーミングペプチドを発現するファージを
、過剰量の「遊離」ペプチドと組み合せて使用した競合実験を行うことによって
、選択的なホーミングから識別可能であり得る（実施例ＩＩを参照のこと）。
【００６８】 種々の方法が、ＲＥＳの成分を含む器官または組織のような器官または組織へ
の分子の非特異的な局在化を防止するために使用され得る。例えば、本明細書中
に開示されるように、ファージ循環の開始直後に心臓を通した溶液の灌流は、バ
ックグラウンドの結合を減少させ、そして肺および肝臓（これらの両方はＲＥＳ
の成分を含む）に選択的にホーミングするペプチドの同定を可能にした（実施例
ＩＩを参照のこと）。さらに、ファージディスプレイライブラリーと、非複製性
コントロールファージとの同時投与は、肝臓および脾臓のような器官（これらは
また、ＲＥＳの成分を含む）において非特異的ファージ捕捉を減少させた。この
アプローチは、肝臓へ選択的にホーミングする分子の同定を可能にした（実施例
ＩＩ）。従って、支持体に付着した分子のライブラリーは、過剰な支持体ととも
に被験体へ同時投与され、器官または組織における非特異的な結合を阻害し得る
。
【００６９】 ＲＥＳの成分による非特異的取り込みはまた、ＲＥＳによる取り込みを阻害す
るブロッキング剤を投与することによって防止され得る。例えば、ポリスチレン
ラテックス粒子またはデキストラン硫酸は、ライブラリーの投与前に被験体に投
与され得る（Ｋａｌｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２０：１７１〜１７
４（１９９３）；Ｉｌｌｕｍら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．７５：１６〜２２（
１９８６）；Ｔａｋｅｙａら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１００：３７
３〜３７９（１９９７）を参照のこと。これらの各々は、本明細書中で参考とし
て援用される）。デキストラン硫酸５００またはポリスチレンミクロスフェアの
このような前投与（ｐｒｅ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）は、肝臓のＲＥＳ
成分であるクッパー細胞による試験物質の非特異的取り込みをブロックするため
に使用されている（Ｉｌｌｕｍら、前出、１９８６）。同様に、ＲＥＳによる薬
剤の非特異的取り込みは、炭素粒子またはシリカ（Ｔａｋｅｙａら、前出、１９
７７）またはゼラチンコロイド（Ｋａｌｉｎら、前出、１９９３）を使用してブ
ロックされている。従って、ＲＥＳによる非特異的取り込みを阻害するために有
用な多くの方法が当該分野において公知であり、そして慣用的に使用される。
【００７０】 非特異的ファージ捕捉を減少させる方法は、特定の器官または組織への低いバ
ックグラウンド結合を示すファージの使用を含む。例えば、Ｍｅｒｒｉｌｌら（
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ ９３：３１８８−３１９２
（１９９６）、これは本明細書中で参考として援用される）は、ＲＥＳによって
取り込まれず、そして結果として延長された時間にわたり循環中に残存する、λ
型ファージを選択した。例えば、匹敵する糸状ファージ改変体は、類似の方法を
使用して選択され得る。
【００７１】 選択的ホーミングは、選択された器官または組織に対するホーミング分子が比
較的特異的であるか否かを決定することによって実証され得る。例えば、選択さ
れた器官または組織におけるホーミング分子の量は、コントロールの器官または
組織、あるいは異なる器官または組織と比較され得る。選択的ホーミングはまた
、インビボパニングの１ラウンドによって同定されるように、器官または組織へ
ホーミングする分子が、インビボパニングのそれに続くラウンドにおいて富化さ
れることを示すことによって、証明され得る。例えば、ペプチドＣＧＦＥＣＶＲ
ＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）およびＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２）を発現する
ファージを、肺からのインビボパニングの第２ラウンドおよび第３ラウンドのた
めに富化し、そして選択されていないファージと比較した場合、それぞれ３５倍
および９倍の富化を示した（実施例ＩＩ．Ｂを参照のこと）。さらに、腎臓また
は脳に対する選択的なホーミングは、検出されなかった。
【００７２】 本明細書中で使用される場合、用語「選択された器官または組織」は、分子が
選択的にホーミングされ得る、正常器官もしくは組織、または病状を有する器官
もしくは組織（例えば、肺腫瘍を含む肺）を意味するその最も広い意味において
使用される。従って、用語「器官または組織」は、正常な細胞型または癌細胞の
ような病的細胞型を含み、この場合選択された器官または組織は原発性腫瘍また
は転移病巣であり得る、任意の組織または器官を意味するように広く使用される
。
【００７３】 一般に、選択された器官または組織は、細胞（これは、脈管構造細胞であり得
る）を含み、これは、ホーミング分子が結合し得る細胞表面タンパク質のような
、特定の標的分子を発現する。少なくとも２ラウンドのインビボパニングを実施
することによって、選択された器官または組織についての分子のホーミングの選
択性が決定され得る。しかし、以下で議論されるように、いくつかの場合におい
て、ホーミング分子は１つより多くの選択された器官または組織にホーミングし
得、この場合において、この分子は一群の選択された器官または組織に選択的に
ホーミングし得ると考えられる。しかし一般に、本発明のホーミング分子の利点
は特定の器官または組織の標的化を可能にすることであるので、１つより多くの
、またはいくつかの異なる器官または組織にホーミングする分子は、特に有用で
はない。
【００７４】 用語「コントロールの器官または組織」は、選択された器官または組織以外の
器官または組織を意味するために使用される。コントロールの器官または組織は
、器官または組織のホーミング分子がコントロールの器官または組織にホーミン
グできない点で特徴付けられ、従って、コントロールの器官または組織は、選択
された器官または組織への分子の選択的な結合を同定するために有用である（実
施例ＩＩ）。器官または組織のホーミング分子が、器官または組織における病的
病巣にホーミングするその能力に基づいて同定される場合、コントロールの器官
または組織は、病的病巣を示さない、選択された器官または組織の対応する部分
であり得る。
【００７５】 コントロールの器官または組織は、例えば、分子の非特異的結合を同定するた
め、またはこの分子のホーミングの選択性を決定するために収集され得る。さら
に、非特異的結合は、例えば、器官または組織へホーミングしないことが公知で
あるが可能性のあるホーミング分子に化学的に類似するコントロール分子を投与
することによって、同定され得る。あるいは、投与される分子が支持体に連結さ
れる場合、支持体単独の投与もまた、非特異的結合を同定するために使用され得
る。例えば、ペプチド融合タンパク質を含まないファージが被験体に投与され得
、そして選択された器官または組織がファージ支持体の非特異的結合のレベルを
決定するために調べられ得る。
【００７６】 被験体にライブラリーを投与する工程、選択された器官または組織を収集する
工程、およびその器官または組織にホーミングする分子を同定する工程は、イン
ビボパニングの単一のラウンドを構成する。必要ではないが、インビボパニング
の１つ以上の追加のラウンドが、一般的に実施される。インビボパニングの追加
のラウンドが行われる場合、それまでのラウンドにおいて、選択された器官また
は組織から回収された分子が、被験体に投与され、この被験体は、その器官また
は組織の一部のみが収集されたそれまでのラウンドで使用された同じ被験体であ
り得る。
【００７７】 インビボパニングの第２ラウンドを行うことによって、第１ラウンドから回収
された分子の相対的な結合選択性は、同定された分子を被験体に投与する工程、
選択された器官または組織を収集する工程、および第１ラウンド後に回収された
ものと比較して、特定の分子を提示する、より多くのファージが、スクリーニン
グの第２ラウンド後に器官または組織から回収されるかどうかを決定する工程に
よって決定され得る。必要ではないが、コントロールの器官または組織もまた収
集され得、そして選択された器官または組織から回収された分子は、コントロー
ルの器官または組織から回収された分子と比較され得る。理想的には、たとえあ
ったとしても、分子は、インビボパニングの第２ラウンドまたはその後のラウン
ド後にコントロールの器官または組織からほとんど回収されない。しかし、一般
には、一定の割合の分子は、コントロールの器官または組織にも存在する。この
場合には、コントロールの器官と比較した場合の、選択された組織または器官に
おける分子の比（選択された：コントロール）が決定され得る。インビボパニン
グの追加ラウンドは、特定の分子が、選択された器官もしくは組織にのみホーミ
ングするのか、あるいはもともと選択された器官もしくは組織において標的と同
一であるかまたは標的に十分に類似する、１つ以上の他の器官もしくは組織にお
いて発現される標的を認識し得るのかを決定するために使用され得る。
【００７８】 一般に、無作為なまたは選択的に無作為化された目的の分子の多様な集団を含
む、分子のライブラリーが調製され、次いで被験体に投与される。投与のいくら
かの時間の後、選択された器官または組織が収集され、そしてこの選択された器
官または組織中に存在する分子が同定される（実施例Ｉを参照のこと）。所望で
あれば、１つ以上の、コントロールの器官または組織、あるいはコントロールの
器官または組織の一部が同様にサンプリングされる。例えば、ファージペプチド
ディスプレイライブラリーを注射して約１〜５分後のマウスを麻酔し、次いで素
早く凍結するかあるいは心臓を通して灌流するかのいずれかでファージの循環を
終結させた。肺、膵臓もしくは他の器官または組織および１つ以上のコントロー
ルの器官をそれぞれから収集し、そして選択された器官およびコントロールの器
官に存在するファージを収集した。それぞれの器官または組織に選択的にホーミ
ングするペプチドを同定した（実施例ＩＩおよび表１〜１１）。
【００７９】 本明細書中において例示されるように、実験動物を屠殺して、選択された器官
もしくは組織またはコントロールの器官もしくは組織を収集した。しかし、器官
または組織にホーミングする分子を回収するために、その器官または組織の一部
しか収集する必要ないことを理解するべきである。同様に、器官または組織の一
部しかコントロールとして収集する必要がない。従って、例えば、分子のライブ
ラリーの被験体への投与に続いて、選択された器官または組織の一部が生検によ
って収集され得、ホーミング分子が回収され得、所望であれば、インビボパニン
グの第２ラウンドのために、同じ被験体に増幅および再投与され得る。同じ被験
体へ２回目に投与されるべき分子が、タグ化されるかまたは例えば支持体に連結
される場合、そのタグまたは支持体は、スクリーニングのその後のラウンドを妨
害しないように、生物学的に不活性かつ生分解性または排泄性（ｅｘｃｒｅｔａ
ｂｌｅ）であるべきである。
【００８０】 ファージライブラリーのインビトロスクリーニングは、以前に、抗体または細
胞表面レセプターに結合するペプチドを同定するために使用された（Ｓｍｉｔｈ
およびＳｃｏｔｔ、前出、１９９３）。例えば、ファージペプチドディスプレイ
ライブラリーのインビトロスクリーニングは、インテグリン接着レセプター（Ｋ
ｏｉｖｕｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２４：３７３−３８０（１９９
４ａ）、これは参考として本明細書中に援用される）、およびヒトウロキナーゼ
レセプター（Ｇｏｏｄｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ
ＳＡ ９１：７１２９−７１３３（１９９４）、これは参考として本明細書中に
援用される）に特異的に結合した新規ペプチドを同定した。同様に、核酸分子の
インビトロスクリーニングは、抗体、細胞表面レセプターまたは有機分子に特異
的に結合する分子を同定した（Ｇｏｌｄら、前出、１９９３、１９９５、１９９
７）。例えば、ＨＩＶ−１逆転写酵素に特異的に結合するＲＮＡ分子は、精製さ
れたＨＩＶ−１逆転写酵素を標的分子として使用して同定された（Ｇｒｅｅｎら
、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２４７：６０〜６８（１９９５）、これは参考とし
て本明細書中に援用される）。これらのインビトロ方法は、人工の系において、
規定され、十分に特徴付けられた標的分子を使用して実施された。しかし、この
ようなインビトロ研究は、インビトロで結合する分子がまたインビボで標的に結
合し得るか否かについての見識を提供しない。例えば、培養中で増殖させた内皮
細胞は、その組織特異的差異を失う傾向にある（ＰａｕｌｉおよびＬｅｅ、Ｌａ
ｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５８：３７９〜３８７（１９８８）、これは参考として本明
細書中に援用される）。従って、インビトロで細胞上の標的に結合する分子は、
インビボで結合しないかもしれない。なぜなら、この標的はこの細胞上に存在し
ないかもしれないからである。さらに、このようなインビトロ方法は、標的分子
に関する事前の知識を必要とし、そしてインビボでの有用性に関する情報は、あ
るにしてもほとんど得られない点で制限される。例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎら（前
出、１９９４）は、培養された細胞を利用して組換えウロキナーゼレセプターを
発現させ、結合ペプチドを得た。しかし、このウロキナーゼレセプターは多くの
異なる器官および組織の細胞において発現し、従って、ウロキナーゼレセプター
に結合する分子は多くの器官または組織と相互作用し得、そして本発明の範囲内
の器官または組織のホーミング分子とは考えられない。
【００８１】 インビトロパニング法と対照的に、インビボパニングは、事前の知識も、イン
ビボで発現される標的分子に結合する分子を同定するための公知の標的分子の利
用可能性をも必要としない。また、「標的化されていない」器官または組織がス
クリーニングの間に存在するので、ホーミングの選択性を欠失した器官または組
織のホーミング分子を単離する見込みは、非常に減少する。さらに、インビボパ
ニングによって器官または組織のホーミング分子を得る際に、例えば、代謝活性
に起因してインビボでの循環における分解に対して特に感受性であり得る任意の
分子が、選択され、そして回収されない。従って、インビボパニングは、インビ
ボで選択的にホーミングする分子を同定することによって、以前の方法を超えて
有意な利点を提供し、そして所望であれば、標的分子は、選択された器官または
組織上に存在する。
【００８２】 特定の器官または組織において、種々の正常組織および病的病巣に選択的にホ
ーミングする、器官ホーミング分子の同定は、本明細書中で例示されるように、
選択された器官または組織で発現される内皮細胞の特定の標的分子が、この器官
または組織の生理学的状態または病理学的状態を反映することを示す。器官また
は組織において生じる特定の生理学的状態または病理学的状態に基づいてこの器
官または組織に選択的にホーミングする、このような器官ホーミング分子は、イ
ンビボパニング法を使用して同定され得、そしてこの器官または組織の生理学的
状態または病理学的状態に対するホーミング分子の選択性は、免疫組織学的分析
によって確認され得る（実施例ＩＩＩ）。例えば、膵炎に罹患した膵臓にホーミ
ングする分子は、膵炎を有する被験体のインビボパニングによって同定され得、
そしてホーミング分子の選択性は、正常膵臓におけるこの分子のホーミングと、
膵炎を罹患した膵臓におけるホーミングとを比較する免疫組織化学を使用するこ
とによって、確認され得る。
【００８３】 正常器官または組織あるいは病理学的状態を示す器官または組織に選択的であ
るホーミング分子は、病状の存在または非存在を検出するために有用であり得る
。例えば、被験体に対して画像化部分に結合体化された前立腺ホーミング分子の
投与の後に、前立腺が可視化され得る。画像が異常な場合、例えば、前立腺のサ
イズが、大きさおよび年齢が一致する被験体に予測されるサイズとは異なる場合
、この画像化の結果は、前立腺を冒す異常な生理学的状態または病理学的状態を
示し得る。例えば、画像化剤、および正常な前立腺にはホーミングするが異常な
前立腺にはホーミングしない前立腺ホーミング分子を含む結合体が、被験体に投
与され得る。例えば、このホーミング分子を結合しない前立腺の領域の同定は、
前立腺における異常な血流の出現を示し得、そして前立腺腫瘍の存在のような病
理学的状態の診断であり得る。前立腺腫瘍組織にホーミングするが正常な前立腺
にはホーミングしない分子を含む結合体は、前立腺腫瘍を直接的に画像化するた
めに使用され得る。
【００８４】 器官または組織について選択性のホーミング分子は、その器官または組織へ治
療剤を送達するために使用され得る。薬剤のこのような選択的標的化は、その標
的器官または標的組織へ送達される薬剤の有効量を増加し得る一方、その薬剤が
他の器官または組織に対して副作用を有する可能性を低減させる。例えば、嚢胞
性線維症患者の肺に対して、嚢胞性線維症膜貫通レセプター（ＣＦＴＲ）（これ
は、嚢胞性線維症において欠損している）をコードする遺伝子を送達するために
肺ホーミング分子を使用し得る。従って、本発明の器官ホーミング分子は、イン
ビボの遺伝子治療のために特に有用である。なぜなら、それらは遺伝子を所望の
標的器官に対して方向づけるための手段を提供し、それによって標的細胞がその
遺伝子を受容する可能性を増大し、そして正常な非標的である細胞が副作用を受
ける可能性を低減するからである。肺ホーミング分子はまた、治療剤を肺に対し
て方向付けるために使用され得、それによって非標的器官または組織をその薬剤
の毒性作用から免れさせる。例えば、肺胞細菌性肺炎において、肺ホーミング分
子は、肺の罹患した領域へ抗生物質を方向付けるために有用であり得、従って所
望の部位での薬物の有効量を増大させる。
【００８５】 細胞性レセプター、および特定のレセプターに結合するリガンドの保存された
性質に起因して、マウスもしくはラットにおいてインビボパンニングを使用して
同定される器官または組織ホーミング分子がまた、ヒトもしくは他の哺乳動物種
の選択された器官または組織において対応する標的分子に結合し得ることを当業
者は理解する。実験的動物を使用して同定されるそのようなホーミング分子は、
例えば、その分子がまた、ヒト被験体から得られる選択された器官または組織の
サンプルに対してインビトロで選択的に結合し得ることを実証することによって
、ヒト被験体の対応する器官または組織に結合するその能力について容易に試験
され得る。あるいは、ヒト器官または組織由来の初代細胞または確立された細胞
株は、そのホーミング分子のインビトロでの結合について試験するために使用さ
れ得る。同様に、特定のヒト器官もしくは組織の病理を反映する初代細胞または
確立された細胞株は、その病理に対して選択的なホーミング分子の結合を試験す
るために使用され得る。ヒト病理の動物モデル（例えば、霊長類モデル）が公知
であり、そしてインビボでのパンニングを使用する分子のホーミングについて試
験するために使用され得る。従って、実験的動物におけるインビボパンニングを
使用して同定された器官または組織ホーミング分子がまた、ヒト被験体における
器官または組織特異的標的分子を結合し得ることを確認するために、慣用的な方
法が使用され得る。さらに、選択された器官、組織、または病理を含むことが疑
われるサンプルとのホーミング分子のインビトロ接触は、サンプルにおける選択
された器官、組織、または病理の存在を同定し得る。インビボパンニングによっ
て標的分子を同定したので、当業者はその標的分子が器官ホーミング分子につい
ての真の標的であることを知り、従って、その標的分子をインビトロで使用して
、インビボでその標的分子に対して特異的である可能性を有するさらなる器官ホ
ーミング分子を同定し得るということを知る。次いで、そのような潜在能のある
器官ホーミング分子をインビボパンニングによって試験して、器官ホーミング能
力を確認し得る。
【００８６】 インビボパンニングを使用して、肺、皮膚、膵臓、網膜、前立腺、卵巣、リン
パ節、副腎、肝臓または腸、および肺腫瘍を含有する肺、または膵臓腫瘍を含有
する膵臓に対して選択的にホーミングするファージによって発現されるペプチド
を同定した（実施例ＩＩおよびＩＶ；表２〜１１もまた参照のこと）。ファージ
の大きなサイズ（３００ｎｍ）、およびそのファージを循環させる時間の短さに
起因して、実質的に多くのファージが循環系に存在していたことはないようであ
る。実際、種々の器官および組織のホーミング分子の免疫組織化学的研究は、こ
の分子が、血管系の内皮細胞表面マーカーに主にホーミングし、そしてそれに結
合することを実証した。従って、本発明は、選択された器官または組織の血管系
に選択的にホーミングするペプチドのような分子を提供する。
【００８７】 ファージペプチド提示ライブラリーを、本質的に、ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔ
ｔ（前出、１９９３；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３
：２６５−２７０（１９９５）；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．２４５：３４６−３６９（１９９４ｂ）もまた参照のこと。これらの各々は
、本明細書中で参考として援用される）に記載のように構築した。いくつかのラ
イブラリーにおいて、システインをコードする少なくとも１つのコドンもまた各
オリゴヌクレオチド内に含ませた。その結果、ジスルフィド結合を通して環状ペ
プチドを形成し得る（実施例Ｉ）。インビボパンニングの実施に際して、肺、膵
臓、皮膚、網膜、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓もしくは腸、または肺腫
瘍を含有する肺、または膵臓腫瘍を含有する膵臓に対して選択的にホーミングす
るペプチドが得られた。従って、本発明は特定の器官または組織に対して選択的
にホーミングする種々の器官ホーミング分子を提供する。
【００８８】 注目すべきことに、インビボパンニング手順の１回の間に、いくつかの器官ホ
ーミングペプチドは独立して４回以上まで回収された（例として、表１を参照の
こと）。さらに、特定の器官または組織にホーンミングする種々のペプチドは、
保存されたアミノ酸配列モチーフを共有した。例えば、いくつかの肺ホーミング
ペプチドはＧＦＥモチーフを共有し；いくつかの網膜ホーミングペプチドはＲＤ
Ｖモチーフを共有し；そしていくつかの副腎ホーミングペプチドは、ＬＰＲモチ
ーフを共有した（それぞれ、表２、表６、および表１１を参照のこと）。例えば
、トリペプチドＲＧＤモチーフは、インテグリン結合に十分であることが公知で
あるので（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉ
ｏｌ．１２：６９７（１９９６）；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、前出、１９９５；ＷＯ
９５／１４７１４）、本明細書中に開示されるこの結果は、多くのリガンド／
レセプター相互作用は、トリペプチドと同じほど小さい認識モチーフからそれら
の特異性を誘導し得ることを示す。
【００８９】
【表１】 開示された器官ホーミングペプチドの配列はいずれも、内皮細胞レセプターに
ついての既知のリガンドと有意な類似性を示さなかった。多くの器官ホーミング
ペプチドが、より大きなペプチドまたはタンパク質内に含まれ得るが、そのより
大きな分子上でホーミング機能をそれらが提供し得るか否かは公知ではない。し
かし、より大きなペプチドおよびタンパク質内に存在する場合に、ＲＧＤがイン
テグリン結合を媒介するという以前の知見に基づいて、より大きなペプチドまた
はタンパク質内に局在化された場合にそのようなホーミングペプチドおよびモチ
ーフがホーミング機能を提供し得るということを当業者は認識する。しかし、そ
のような天然に存在する内因性のペプチドおよびタンパク質は、本発明内の器官
または組織ホーミング分子であると見なされない。
【００９０】 本明細書中に例示される器官または組織ホーミングペプチド分子は、サイズが
長さ約７〜１３アミノ酸の範囲である。しかし、例えば、それ自体によりまたは
大きなタンパク質内に存在する場合にインテグリン結合を媒介するＲＧＤインテ
グリン結合モチーフの能力に基づいて、本発明の器官ホーミング分子がまた、有
意により長いポリペプチド配列の状況下でそれらの器官ホーミング能力を維持す
ることが予期され得ることが認識される。従って、本発明の器官ホーミングペプ
チドは、少なくとも３アミノ酸、一般的には少なくとも６アミノ酸、または７以
上のアミノ酸であり得、そして有意により長く、例えば、約２０〜５０アミノ酸
または１００以上のアミノ酸であり得る。
【００９１】 本発明は、ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）およびＣＧＦＥＬＥＴ
Ｃ（配列番号２）（これらは、ＧＦＥモチーフを共有する）；ＣＴＬＲＤＲＮＣ
（配列番号１５）；ならびにＣＩＧＥＶＥＶＣ（配列番号１６；表１を参照のこ
と）（これは、ＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２）に存在するＥＬＥモチーフに類
似性であるＥＶＥモチーフを含む）のような肺ホーミングペプチドを提供する。
例示された肺ホーミングペプチドは、ＣＸ3ＣＸ3ＣＸ3Ｃ（配列番号２５）、Ｃ Ｘ7Ｃ（配列番号２４）またはＣＸ6Ｃ（配列番号２６）の環状ライブラリーのマ
ウスへの注射によって同定された（実施例ＩＩ）。肺ホーミングペプチドである
ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）およびＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号
２）は、選択されていないファージと比較した場合に、それぞれ６０倍および９
倍の富化を示し、腎臓または脳においてほとんどファージは検出されなかった（
実施例ＩＩ；図１および２、ならびに表１もまた参照のこと）。さらに、肺ホー
ミングペプチドであるＣＴＬＲＤＲＮＣ（配列番号１５）およびＣＩＧＥＶＥＶ
Ｃ（配列番号１６）は、選択されていないファージよりもそれぞれ８倍および６
倍の富化を示した（表１）。コグネイトＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号
１）ペプチドを発現するファージとのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−
（ＧＳＴ−）ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）融合ペプチドの同時注
射はホーミングを７０％阻害し、そして（配列番号２）を発現するファージとの
ＧＳＴ−ＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２）の同時注射は肺ホーミングを３０％阻
害した（図３）。肺ホーミングペプチドを提示するファージのマウスへの投与後
の肺の免疫組織化学的染色は、肺胞毛細血管内の染色を明らかにした。肺のいず
れの特定領域へのファージのホーミングについても明らかな優先性は観察されな
かった；しかし、細気管支管腔壁またはいくつかのより大きな血管において（実
施例ＩＩＩ）、あるいは分析された多くの他の組織において、染色は全く観察さ
れなかった。これらの結果は、インビボパンニングを使用して、肺内の内皮細胞
特異性を同定および分析し、それによって示差的に肺を標的化するための手段を
提供し得ることを示す。
【００９２】 本発明はまた、ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３；表５）（これは、
ＣＸ3ＣＸ3ＣＸ3Ｃ（配列番号２５）環状ライブラリーのマウスへの注射によっ て同定された（実施例ＩＩ））のような皮膚ホーミングペプチドを提供する。皮
膚ホーミングペプチド配列ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）は、選択
されていないファージよりも、ならびに脳および腎臓におけるバックグランドよ
りも皮膚に対して７倍の選択性を示した（図２；表１もまた参照のこと）。ＣＶ
ＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）を発現するファージとのＧＳＴ−ＣＶＡ
ＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）の同時注射は、皮膚へのホーミングを５５
％阻害したが、ＧＳＴ単独との同時注射は、ホーミングに対して全く効果を有さ
なかった（図３Ｂを参照のこと）。皮膚ホーミングペプチドを提示するファージ
投与後の皮膚の免疫組織化学的染色は、染色が皮下組織に局在化し；真皮には全
く染色が観察されないことを明らかにした（実施例ＩＩＩ）。
【００９３】 本発明はさらに、ＳＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号４；表３）のような膵臓ホー
ミングペプチドを提供する。例示された膵臓ホーミング分子は、ＣＸ7Ｃ（配列 番号２４）またはＸ2ＣＸ4ＣＸ（配列番号２３）の環状ライブラリーのマウスへ
の注射によって同定された（実施例ＩＩ）。膵臓ホーミングペプチドであるＳＷ
ＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号４）は、選択されていないファージおよび脳よりも膵
臓に対して２０倍の選択性を示した（表１；図２）。しかし、ＧＳＴ−ＳＷＣＥ
ＰＧＷＣＲ（配列番号４）の同時注射は、ＳＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号４）の
膵臓ホーミングを阻害しなかった。これはおそらく、膵臓ホーミングペプチドに
対するＧＳＴの立体配座的効果に起因する。膵臓ホーミングペプチドを提示する
ファージの投与後の膵臓の免疫組織化学的染色は、染色が毛細血管および外分泌
膵臓のより大きな血管に局在化し；内分泌血管系において有意な染色が全く観察
されなかったことを明らかにした（実施例ＩＩＩ）。この結果は、特定の器官内
の組織学的および生理学的に識別可能な領域が、本発明の器官ホーミング分子に
対する標的を提供する特有の標的分子を発現し得ることを実証する。従って、本
発明の器官ホーミング分子は、選択された器官または組織の特異的領域を示差的
に標的化するための手段を提供する。
【００９４】 網膜ホーミングペプチド（例えば、ＣＳＣＦＲＤＶＣＣ（配列番号５）および
ＣＲＤＶＶＳＶＩＣ（配列番号６））もまた提供される（表６を参照のこと）。
例示された網膜ホーミング分子は、ＣＸ7Ｃ（配列番号２４）環状ライブラリー のラットへの注射によって同定された（実施例ＩＩ）。網膜ホーミングペプチド
であるＣＳＣＦＲＤＶＣＣ（配列番号５）およびＣＲＤＶＶＳＶＩＣ（配列番号
６）は、コントロールｆｄＡＭＰＬＡＹ８８ファージと別々に注射された場合に
、網膜においてそれぞれ３倍および２倍の富化を示した（実施例ＩＩ）。しかし
、免疫組織化学的染色は、網膜染色の欠如を明らかにした。これはおそらく、標
的組織におけるこの網膜ホーミングファージの比較的多くない蓄積に起因する。
【００９５】 本発明はまた、ＳＭＳＩＡＲＬ（配列番号２１）およびＶＳＦＬＥＹＲ（配列
番号２２）（これらは、Ｘ7（配列番号２９）ライブラリーのマウスへの注射に よって同定された）のような前立腺ホーミングペプチドを提供する（表７）。こ
のペプチドは、正規の方法によってより単離された。前立腺ホーミングペプチド
であるＳＭＳＩＡＲＬ（配列番号２１）およびＶＳＦＬＥＹＲ（配列番号２２）
は、脳と比較した場合に、前立腺へのホーミングにおいてそれぞれ３４倍および
１７倍の富化を示した（表１）。
【００９６】 Ｘ7（配列番号２９）ライブラリーのマウスへの注射によって同定された、Ｒ ＶＧＬＶＡＲ（配列番号１１）およびＥＶＲＳＲＬＳ（配列番号１０）のような
卵巣ホーミングペプチドもまた提供される。このペプチドを、正規の方法によっ
て単離した（表８）。卵巣ホーミングペプチドのＲＶＧＬＶＡＲ（配列番号１１
）およびＥＶＲＳＲＬＳ（配列番号１０）は、各々、配列決定された４０クロー
ンの２２％を含み、そして脳と比較した場合に卵巣においてそれぞれ５倍および
３倍の富化を示した（表１）。
【００９７】 本発明はまた、ＬＰＲモチーフ（表１１を参照のこと）を共有するＬＭＬＰＲ
ＡＤ（配列番号２７）およびＬＰＲＹＬＬＳ（配列番号２８）、またはモチーフ
ＬＡＧＧ（配列番号４３０；表１０を参照のこと）を共有するペプチドＲ（Ｙ／
Ｆ）ＬＬＡＧＧ（配列番号４０４）およびＲＹＰＬＡＧＧ（配列番号３８９）の
ような副腎ホーミングペプチドを提供する。例示された副腎ホーミングペプチド
を、Ｘ7（配列番号２９）ライブラリーのマウスへの注射によって同定した。こ のペプチドを、正規の方法によって単離した。この副腎ホーミングペプチドＬＭ
ＬＰＲＡＤ（配列番号２７）は、脳と比較した場合に副腎において５０倍の富化
を示した（表１）。
【００９８】 肝臓ホーミングペプチドもまた提供される。そのようなペプチドを、Ｘ7（配 列番号２９）ライブラリーのマウスへの注射によって同定した。このペプチドを
、正規の方法によって単離した（以下の実施例ＩＩ、表１、および表１１を参照
のこと）。
【００９９】 さらに、ＡＧＣＳＶＴＶＣＧ（配列番号３１５）のようなリンパ節ホーミング
ペプチドを提供する（以下の表９を参照のこと）。そのようなペプチドを、Ｘ2 ＣＸ4ＣＸ（配列番号２３）ライブラリーのマウスへの注射によって同定した。 このペプチドを、正規の方法によって単離した。
【０１００】 本発明はまた、Ｘ7（配列番号２９）ライブラリーのマウスへの注射によって 同定された、ＹＳＧＫＷＧＫ（配列番号９）およびＹＳＧＫＷＧＷ（配列番号１
５６）（表１および４）（これらは、最後のアミノ酸位置においてのみ異なる）
のような腸ホーミングペプチドを提供する。このペプチドを、正規の方法によっ
て単離した。腸ホーミングペプチドのＹＳＧＫＷＧＫ（配列番号９）は、配列決
定された４０クローンの２２％で存在し、そして脳と比較した場合に腸において
３０倍の富化された（表１）。さらに、ＶＲＲモチーフを共有するＱＶＲＲＶＰ
Ｅ（配列番号１５５）およびＶＲＲＧＳＰＱ（配列番号１６４）のような腸ホー
ミングペプチドを、ＲＧＳモチーフを共有するペプチドＶＲＲＧＳＰＱ（配列番
号１６４）、ＧＧＲＧＳＷＥ（配列番号１６７）、およびＦＲＶＲＧＳＰ（配列
番号１６９）と同様に同定した。
【０１０１】 本発明の器官ホーミング分子は、部分に連結された器官ホーミング分子を含む
結合体として特に有用である。従って、本発明の肺ホーミング分子、皮膚ホーミ
ング分子、膵臓ホーミング分子、網膜ホーミング分子、前立腺ホーミング分子、
卵巣ホーミング分子、リンパ節ホーミング分子、副腎ホーミング分子、肝臓ホー
ミング分子、または腸ホーミング分子は、部分に結合され得、そのような結合体
は、この部分を特定の選択された器官に指向するために有用である。
【０１０２】 本明細書中で使用される用語「部分」は、器官ホーミング分子または組織ホー
ミング分子に連結される物理学的物質、化学的物質、または生物学的物質を意味
するように広く使用される。一般に、器官ホーミング分子に連結される部分は、
ホーミング分子に生物学的に有用な機能を与える。部分は、任意の天然または非
天然の物質、例えば、ペプチドまたはポリペプチド配列、有機分子もしくは無機
分子または有機組成物もしくは無機組成物、核酸分子、炭水化物、脂質、あるい
はそれらの組み合わせからなり得る。
【０１０３】 部分は、物理学的物質、化学的物質または生物学的物質（例えば、ウイルス、
ウイルス遺伝子治療ベクター、細胞、リポソーム、マイクロカプセル、マイクロ
ポンプまたは他の空洞のある（ｃｈａｍｂｅｒｅｄ）マイクロデバイス）であり
得、これは、例えば、薬物送達系として使用され得る。一般に、このようなマイ
クロデバイスは、生物学的に不活性であるべきであり、所望であれば、生分解性
または排出可能であるべきである。マイクロカプセルを含む種々の部分（薬剤を
含み得る）、および部分または空洞のあるマイクロデバイスを本発明の有機分子
に連結させる方法は、当該分野で周知であり、そして市販されている（例えば、
「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
」第１８版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．１９９０）、第８９−９
１章；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８８）を参照のこと、これらはそれぞれ本明細書
において参考として援用される；Ｈｅｒｍａｓｏｎ、前出、１９９６もまた参照
のこと）。部分のさらなる例は、当業者に公知であり、そしてそれらが本発明の
ホーミング分子に連結される場合に、生物学的に有用な機能を有する限り、この
用語の意味に含まれることが意図される。
【０１０４】 選択された器官または組織に部分を指向する目的のために器官ホーミング分子
にこの部分を連結することが、脳ホーミングペプチドの赤血球（ＲＢＣ）への連
結（ここで、このペプチドは、脳へのＲＢＣのホーミングを指向した）によって
実証された（米国特許第５，６２２，６９９号、前出、１９９７）。これらの結
果は、本発明の器官ホーミング分子または組織ホーミング分子が、この部分を選
択された器官または組織に指向するために、別の部分に連結され得ることを示す
。例えば、肝臓ホーミング分子または肺ホーミング分子は、ＣＦＴＲ遺伝子をコ
ードする核酸に連結され得、そして被験体への投与の際に、ＣＦＴＲの発現が、
それぞれ肝臓または肺に標的化される。同様に、肺ホーミング分子は、肺ホーミ
ング分子およびプロテアーゼインヒビターを含む結合体を被験体に投与する際に
、このプロテアーゼインヒビターが肺に標的化されるように、プロテアーゼイン
ヒビターに連結され得る。そのような結合体は、例えば、肺における過剰なプロ
テアーゼ産生および器官の自己消化によって特徴付けられる気腫を罹患する被験
体を処置するために有用であり得る。
【０１０５】 本発明の器官ホーミング分子および組織ホーミング分子は、選択された組織ま
たは器官に、治療剤、診断剤、または画像化剤、タグまたは不溶性支持体、例え
ば透過性もしくは半透過性膜を含むリポソームまたはマイクロカプセル（ここで
、選択された器官または組織に送達されるべき薬物のような薬剤は、リポソーム
またはマイクロカプセル内に含まれる）を指向するために有用であり得る。当該
分野において公知のこれらの部分および他の部分は、本明細書中に開示されるよ
うな本発明の結合体において、および本発明の方法において使用され得る。
【０１０６】 １つの実施態様において、部分は、選択された器官または組織の検出または可
視化を可能にする、放射性核種または画像化剤のような検出可能な薬剤であり得
る。従って、本発明は、検出可能な薬剤に連結された、肺ホーミング分子、皮膚
ホーミング分子、膵臓ホーミング分子、網膜ホーミング分子、前立腺ホーミング
分子、卵巣ホーミング分子、リンパ節ホーミング分子、副腎ホーミング分子、肝
臓ホーミング分子、または腸ホーミング分子を含む結合体を提供する。選択され
る検出可能な薬剤の型は、適用に依存する。例えば、被験体における肺のインビ
ボ診断画像化研究のために、肺ホーミング分子は、被験体への投与の際に被験体
に対して外側で検出可能である薬剤に連結され得る。そのような内部器官または
組織（例えば、前立腺）の検出のために、γ線放出放射性核種（例えば、インジ
ウム−１１３、インジウム−１１５またはテクネチウム−９９）は、前立腺ホー
ミング分子に連結され得、そして被験体への投与後に、固体シンチレーション検
出器を用いて可視化され得る。あるいは、被験体の外部表面またはその近傍の器
官または組織（例えば、網膜）について、フルオレセイン標識した網膜ホーミン
グ分子は、網膜の内皮構造が検眼鏡（ｏｐｔｈａｌａｍｏｓｃｏｐｅ）および適
切な光学システムを使用して可視化され得るように、使用され得る。
【０１０７】 器官または組織中の病理学的病変に選択的にホーミングする分子は、同様に、
その病変のサイズおよび分布が可視化され得るように適切な検出可能な薬剤に連
結され得る。例えば、器官ホーミング分子または組織ホーミング分子が正常な器
官または組織にホーミングするが、器官または組織における病理学的病変にホー
ミングしない場合、病理学的病変の存在は、器官または組織の異常な画像または
異型の画像（例えば、病変領域における検出可能な薬剤の非存在）を同定するこ
とによって検出され得る。
【０１０８】 検出可能な薬剤はまた、インビトロにて検出を容易にする薬剤であり得る。例
えば、適切な基質が存在する場合に可視シグナルを生じる酵素に連結されたホー
ミング分子を含む結合体は、ホーミング分子が指向される器官または組織の存在
を検出し得る。そのような結合体（例えば、アルカリホスファターゼまたはルシ
フェラーゼなどを含み得る）は、免疫組織化学のような方法において有用であり
得る。そのような結合体はまた、例えば標的分子の精製の間に、サンプル中の器
官ホーミング分子が結合する標的分子の存在を検出するために使用され得る。
【０１０９】 別の実施態様において、部分は治療剤であり得る。従って、本発明は、治療剤
に連結された、肺ホーミング分子、皮膚ホーミング分子、膵臓ホーミング分子、
網膜ホーミング分子、前立腺ホーミング分子、卵巣ホーミング分子、リンパ節ホ
ーミング分子、副腎ホーミング分子、肝臓ホーミング分子、または腸ホーミング
分子を含む結合体を提供する。
【０１１０】 治療剤は、本発明の器官ホーミング分子に連結される場合、選択された器官ま
たは組織の部位でその機能を働かせる任意の生物学的に有用な薬剤であり得る。
例えば、治療剤は、連結された器官ホーミング分子に起因して標的細胞に連結さ
れる際に、それがその機能をもたらし得る細胞によってインターナリゼーション
を受ける有機低分子であり得る。治療剤は、所望される場合、選択される器官ま
たは組織における細胞生存、細胞増殖、または細胞死を刺激または阻害すること
に関与するタンパク質をコードする核酸分子であり得る。例えば、アポトーシス
を阻害するＢｃｌ−２のようなタンパク質をコードする核酸分子を使用して、細
胞生存を促進し得るが、アポトーシスを刺激するＢａｘのようなタンパク質をコ
ードする核酸分子を使用して、標的細胞の細胞死を促進し得る。
【０１１１】 細胞死を刺激するのに特に有用な治療剤は、本発明の器官ホーミング分子に連
結される場合に、過剰増殖性障害（例えば、癌）を処置するのに有用であり得る
リシンである。本発明の器官ホーミング分子、および抗生物質（例えば、アンピ
シリン）または抗ウイルス剤（例えば、リバビリン）を含む結合体は、例えば、
選択された器官または組織における細菌感染またはウイルス感染を処置するため
に有用であり得る。
【０１１２】 治療剤はまた、その発現または欠損が病理学に関連する生物学的分子の産生ま
たは活性を阻害または促進し得る。従って、プロテアーゼインヒビターは、器官
ホーミング分子に連結される場合、選択された器官または組織（例えば、膵臓）
でのプロテアーゼ活性を阻害し得る治療剤であり得る。選択された器官または組
織におけるタンパク質の産生を補給または回復させ得るｃＤＮＡのような遺伝子
またはその機能的等価物もまた、病理学の重篤度を改善するために有用な治療剤
であり得る。治療剤はまた、その発現が有害なタンパク質の産生を阻害するアン
チセンス核酸分子であり得るか、または有害なタンパク質の活性を阻害し得るド
ミナントネガティブタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸分子で
あり得る。
【０１１３】 別の実施態様において、本発明は、タグに連結された肺ホーミング分子、皮膚
ホーミング分子、膵臓ホーミング分子、網膜ホーミング分子、前立腺ホーミング
分子、卵巣ホーミング分子、リンパ節ホーミング分子、副腎ホーミング分子、肝
臓ホーミング分子、または腸ホーミング分子を含む結合体を提供する。タグは、
例えば、クロマトグラフィーマトリクスのような不溶性支持体、またはビオチン
、赤血球凝集素抗原、ポリヒスチジン、Ｔ７、もしくは当該分野において公知の
他の分子のような分子であり得る。タグを含むそのような結合体は、器官ホーミ
ング分子が結合する標的分子を単離するために有用であり得る。
【０１１４】 被験体に投与される場合、器官ホーミング分子および部分を含む結合体は、例
えば、結合体および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物として投与
される。薬学的に受容可能なキャリアは、当該分野で周知であり、そして例えば
、水溶液（例えば、水または生理学的緩衝化生理食塩水）、あるいは他の溶媒ま
たはビヒクル（例えば、グリコール、グリセロール、オイル（例えば、オリーブ
オイル）もしくは注射可能な有機エステル）を含む。
【０１１５】 薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、複合体の吸収を安定させるか、また
は増加させるように作用する、生理学的に受容可能な化合物を含み得る。このよ
うな生理学的に受容可能な化合物は、例えば、炭水化物（例えば、グルコース、
スクロースもしくはデキストラン）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸もしく
はグルタチオン）、キレート剤、低分子量タンパク質、または他の安定剤もしく
は賦形剤を含む。当業者には、薬学的に受容可能なキャリア（生理学的に受容可
能な化合物を含む）の選択が、例えば、組成物の投与経路に依存することを理解
する。薬学的組成物はまた、所望される場合、薬剤（例えば、ガン治療剤または
他の治療剤）を含み得る。
【０１１６】 当業者は、器官ホーミング分子を含む薬学的組成物が、種々の経路（例えば、
経口または非経口（例えば、静脈内）を含む）により被験体に投与され得ること
を理解する。組成物は、注射または挿管により投与され得る。薬学的組成物はま
た、例えば細胞死を促進または阻害する薬物を中に取り込み得る部分（例えば、
リポソームまたは他のポリマーマトリクス）に連結された器官ホーミング分子で
あり得る（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
，第１巻（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ １９８４）、こ
れは、本明細書中に参考として援用される）。例えば、リン脂質または他の脂質
からなるリポソームは、作製および投与するのが比較的簡単な、非毒性の、生理
学的に受容可能、かつ代謝可能なキャリアである。
【０１１７】 本明細書中で開示される診断方法または治療方法の実施において、器官ホーミ
ング分子を含む結合体の有効量が、被験体に投与されなければならない。「有効
量」は、所望の効果を生じる結合体の量である。有効量は、例えば、器官ホーミ
ング分子に連結された成分、および意図される用途に依存する。例えば、細胞殺
傷が所望される場合、治療目的のために投与される放射性標識分子の量と比較し
て、より少ない量の放射性標識ホーミング分子が画像化に必要とされ得る。特定
の目的のための特定結合体の有効量は、当業者に周知の方法を用いて決定され得
る。
【０１１８】 器官分子の投与経路は、部分的に、器官ホーミング分子の化学構造に依存する
。例えば、ペプチドは、それらが消化管において分解され得るので、経口的に投
与される場合、特に有用ではない。しかし、ペプチドを内因性プロテアーゼによ
る分解にあまり受けないようにするか、または消化管を通してより吸収可能にす
るように、ペプチドを化学的に改変するための方法は、周知である（例えば、Ｂ
ｌｏｎｄｅｌｌｅら、前出、１９９５；ＥｃｋｅｒおよびＣｒｏｏｋｅ、前出、
１９９５；ＧｏｏｄｍａｎおよびＲｏ、前出、１９９５を参照のこと）。このよ
うな方法は、選択された器官または組織へホーミングするペプチド上で行われ得
る。さらに、Ｄ−アミノ酸；ペプチド構造を模倣する有機分子からなるペプチド
模倣物；またはペプトイド（例えば、ビニロガス（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ペプ
トイド）を含むペプチドのような、ペプチドアナログのライブラリーを調製する
ための方法は、上記に記載され、そして被験体への経口投与に安定なホーミング
分子を同定するために使用され得る。
【０１１９】 本発明は、肺、皮膚、膵臓、網膜、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓また
は腸を含む結合体および検出可能薬剤を被験体に投与することにより、選択され
た器官または組織を同定する方法を提供する。検出可能成分結合体に連結される
本発明の器官ホーミング分子を含む結合体は、被験体に投与され得、そして選択
された器官または組織を同定または可視化するために用いられ得る。器官、特に
内臓器官を可視化する能力は、選択された器官または組織の病状を診断する手段
を提供する。例えば、インジウム−１１３に連結する前立腺ホーミング分子は、
被験体に投与され、前立腺を画像化し得る。このような方法は、特に有益で有り
得る。なぜなら、前立腺を画像化するための方法は限定されているからである。
前立腺の病理症状の存在は、前立腺の領域が結合体を含まず、従って、その領域
への循環における異常を示すことを検出することによるか、または前立腺が異常
に増大されるか、もしくはその正常な境界を欠くことを検出することにより明ら
かにされ得る。網膜のような器官または組織（検眼鏡を用いて直接可視化され得
る）について、フルオレセインに連結する網膜ホーミング分子を含む結合体が、
被験体に投与され得、そして網膜における血管統合性および循環を試験するため
に用いられ得る。網膜画像の正常なまたは代表的なパターンの非存在は、この領
域における網膜病理症状の存在を示し得る。例えば、異常な網膜パターンは、過
剰増殖性病理または変性性病理を示す血管の変化を反映し得る。
【０１２０】 原則として、本発明の器官ホーミング分子は、分子の投与が直接の生物学的効
果を提供するように固有の生物学的特性を有し得る。例えば、器官ホーミング分
子は、器官ホーミング分子が天然のリガンドの活性を模倣する標的分子について
天然に存在するリガンドと十分に類似であり得る。このような器官ホーミング分
子は、天然のリガンドの活性を有する治療剤として有用であり得る。例えば、器
官ホーミング分子が、選択された器官または組織により発現されるレセプターを
結合する成長因子（例えば、上皮増殖因子の活性を模倣する皮膚ホーミング分子
）の活性を模倣する場合、器官ホーミング分子の投与は、器官または組織におい
て細胞増殖を生じ得る。本発明の器官ホーミング分子のこのような固有の生物学
的活性は、選択された器官または組織の細胞をホーミング分子と接触させること
、および生物学的効果（例えば、細胞増殖、または固有の活性が毒性効果である
場合、細胞死）の証明のために細胞を試験することにより同定され得る。
【０１２１】 さらに、本発明の器官ホーミング分子は、対応するリガンドがレセプターに結
合し得ないように特定の標的分子を結合する固有の活性を有し得る。例えば、種
々の型の癌細胞が特定の器官または組織に転移することは、癌細胞がその転移す
る器官内で標的分子に結合するリガンドを発現することを示すことが、公知であ
る。従って、例えば、肺に転移する腫瘍を有する被験体への、肺ホーミング分子
の投与は、潜在的に転移性の癌細胞が肺において樹立されたるのを防ぐ手段を提
供し得る。しかし、一般的に、本発明の器官ホーミング分子は、選択された器官
または組織、特に肺、皮膚、膵臓、網膜、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓
または腸への成分の標的化に特に有用である。従って、本発明は、治療剤に連結
する本発明の器官ホーミング分子を含む結合体を、病状を有する被験体に投与す
ることにより、選択された器官または組織における病状を処置する方法を提供す
る。
【０１２２】 例えば、肺の特異的障害は、治療剤に連結する肺ホーミング分子を含む結合体
を、被験体に投与することにより処置され得る。本発明の肺ホーミング分子は、
肺の毛細血管および肺胞に局在化し得るので、これらの領域に関連する障害は、
特に、肺ホーミング分子を含む結合体で処置することが可能である。例えば、細
菌性肺炎は、しばしば肺の肺胞および毛細血管において始まる（Ｒｕｂｉｎおよ
びＦａｒｂｅｒ、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ 第２版、（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ
．，１９９４））。従って、適切な抗生物質に結合体化された肺ホーミング分子
は、肺炎を処置するために被験体に投与され得る。同様に、嚢胞性線維症は、Ｃ
ＦＴＲの欠損に起因して、肺において病理的損傷を生じる。従って、ＣＦＴＲを
コードする核酸分子に結合体化される肺ホーミング分子の投与は、インビボにお
ける遺伝子治療処置方法として肺へ核酸分子を指向するための手段を提供する。
【０１２３】 本発明はまた、病理症状を有する被験体に、皮膚ホーミング分子および治療剤
を含む結合体を投与することにより皮膚の病状を処置する方法を提供する。例え
ば、火傷の被災者は、上皮性増殖因子に連結した皮膚ホーミング分子を含む結合
体または増殖因子に由来する血小板を投与され得、その結果、増殖因子が上皮性
および深在真皮の再生または修復を促進し得、増殖因子は、皮膚に局在化される
。さらに、本発明の方法は、抗生物質に連結される皮膚ホーミング分子を含む結
合体を被験体に投与することによって、細菌性感染、特に皮下組織および真皮を
通じて伝播する感染、またはそれらの領域に局在化される感染により生じる皮膚
の病状を処置するために有用であり得る。
【０１２４】 本発明はまた、病状を有する被験体に、治療剤に連結する膵臓ホーミング分子
を含む結合体を投与することにより、膵臓の病状を処置する方法を提供する。特
に、本発明の膵臓ホーミング分子は、膵臓外分泌部に局在化し得るので、膵臓外
分泌部に関連する病状は処置され得、そしてある場合には、膵臓内分泌部に有害
に影響し得ない。本発明の方法は、分泌されたプロテアーゼが器官を傷害するこ
とにより生じる膵臓外分泌部の炎症性状態である急性膵炎を処置するために特に
有用であり得る。プロテアーゼインヒビターに連結される膵臓ホーミング分子を
含む結合体は、組織のプロテアーゼ媒介性崩壊を阻害するために用いられ得、従
って、病状の重篤度を軽減する。このような結合体において有用な適切なプロテ
アーゼインヒビターは、膵炎に関連する酵素を阻害するものであり、これには、
例えば、トリプシンのインヒビター、キモトリプシン、エラスターゼ、カルボキ
シペプチダーゼおよび膵臓リパーゼのインヒビターが挙げられる。本発明の方法
はまた、膵臓にホーミングする分子に連結する治療剤を含む結合体を被験体に投
与することにより、膵臓癌（例えば、腺管癌）を有する被験体を処置するために
用いられ得る。
【０１２５】 本発明の方法はまた、病状を有する被験体に、治療剤に連結する網膜ホーミン
グ分子を含む結合体を投与することにより、眼、特に網膜の病理症状を処置する
ために用いられ得る。例えば、増殖性網膜症は、網膜虚血（例えば、糖尿病に起
因する）に対する応答における網膜の新生血管形成と関連する。従って、アポト
ーシスを刺激する遺伝子（例えば、Ｂａｘ）に連結する網膜ホーミング分子を含
む結合体の投与は、増殖性網膜症を処置するために用いられ得る。同様に本発明
の方法は、本明細書において開示される適切な器官または組織のホーミング分子
を、単独かあるいは所望の成分と連結してかのいずれかで用いて、前立腺、卵巣
、リンパ節、副腎、肝臓または腸の病状を診断または処置するために用いられ得
る。
【０１２６】 器官または組織のホーミング分子は、例えば、選択された器官または組織に対
して、治療剤または検出剤を標的化するために有用である。さらに、器官または
組織のホーミング分子は、サンプル中の標的分子の存在を同定するために用いら
れ得る。本明細書中において用いる場合、用語「サンプル」は、身体から単離さ
れる細胞、組織、器官またはその部分を意味する最も広い意味で用いられる。サ
ンプルは、例えば、生検により得られた組織切片もしくは標品もしくは組織培養
に置かれるかまたはそれに適応される細胞であり得る。
【０１２７】 所望される場合、サンプルは、例えば、器官または組織のホーミング分子に結
合する標的分子を単離するための最初の工程であり得るホモジナイズ（ｈｏｍｏ
ｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）により処理され得る。
【０１２８】 本明細書において開示されたように得られる器官ホーミング分子は、ホーミン
グ分子により認識される標的分子（特に細胞表面タンパク質）の存在を同定する
ために、または標的分子を実質的に単離するために有用で有り得る。従って、本
発明は、肺ホーミング分子、皮膚ホーミング分子、膵臓ホーミング分子、網膜ホ
ーミング分子、前立腺ホーミング分子、卵巣ホーミング分子、リンパ節ホーミン
グ分子、副腎ホーミング分子、肝臓ホーミング分子または腸ホーミング分子を選
択的に結合する標的分子の同定の方法を提供する。このような方法は、選択され
た器官または組織（例えば、前立腺）のサンプルを前立腺ホーミング分子に接触
する工程、そしてサンプルの成分の選択的結合を検出する工程を包含する。ここ
で、このような結合は、標的分子の存在を確認する。
【０１２９】 前立腺ホーミングペプチドのような器官または組織のホーミング分子は、タグ
（例えばクロマトグラフィーマトリックスのような固体支持体）に連結され得る
。次いで、固定された器官ホーミング分子は、特定の標的分子に対して前立腺ホ
ーミング分子の特異的結合を可能にする条件下で、マトリックスを含有するカラ
ムに、前立腺組織の適切に処理されたサンプルを通過させることによりアフィニ
ティークロマトグラフィーに用いられ得る（例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅ
ｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，編．Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔ
ｓｃｈｅｒ，１９９０），第１８２巻（これは、参考として本明細書において援
用されている）を参照のこと；例えば、３５７〜３７９頁を参照のこと）。未結
合物質および非特異的結合物質は、取り除かれ得、そして標的分子（前立腺ホー
ミング分子と複合体を形成する）は、カラムから溶出され、そして実質的に単離
された形態で収集される。次いで、実質的に単離された前立腺標的分子は、周知
の方法を用いて特徴付けられ得る。器官または組織のホーミング分子はまた、検
出可能な因子（例えば、放射性核種、蛍光分子、酵素または標識化ビオチンタグ
）に連結され得、そして例えば、標的分子の存在を検出するためにか、またはそ
の単離工程の間に標的分子を追跡するために、サンプルをスクリーニングするた
めに用いられ得る。
【０１３０】 選択された器官または組織の標的分子を同定するために、器官または組織のサ
ンプルを用いることに替えて、選択された器官もしくは組織に由来する培養細胞
の抽出物、または培養された内皮細胞の抽出物が、開始物質として用いられ得る
。標的分子を含有する細胞の選択は、結合アッセイおよび細胞接着アッセイを用
いることにより決定され得る（Ｂａｒｒｙら．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：２
９９〜３０５ １９９６（これは参考として本明細書に援用される）を参照のこ
と）。標的分子を含有するそれらの細胞は、上記のように、標的分子の単離およ
び同定のための抽出物を調製するために用いられ得る。
【０１３１】 標的分子を発現する適切な細胞株を同定する際に、標的分子は、放射性標識さ
れたアミノ酸を含有する培地中において細胞を増殖させることにより標識され得
る。放射性標識化アミノ酸は、標的分子に組み込まれ、従って、これは、精製の
間のその同定を容易にする。次いで、標識化細胞は、オクチルグルコシドで抽出
され得、そしてこの抽出物は、セファロースのようなマトリックスに結合した膵
臓ホーミング分子を用いて、アフィニティークロマトグラフィーにより分画され
得る。例えば、ヒト臍静脈内皮細胞から調製された抽出物が、コントロールとし
て用いられ得る。次いで、精製された標的分子はマイクロ配列決定され得、そし
て抗体が調製され得る。所望の場合、オリゴヌクレオチドプローブが調製され得
、そして標的レセプターをコードするｃＤＮＡクローンを単離するために使用さ
れ得る。あるいは、抗レセプター抗体を使用して、発現ライブラリーからｃＤＮ
Ａクローンを単離し得る（Ａｒｇｒａｖｅｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０
５：１１８３−１１９０（１９８７）（これは、本明細書中で参考として援用さ
れる）を参照のこと）。
【０１３２】 標的分子を生化学的に単離することに加えて、標的分子をコードする核酸が、
例えば、標的分子を発現するクローンについての膵臓ｃＤＮＡ発現ライブラリー
をスクリーニングするための化学的プローブとして膵臓ホーミング分子を用いる
ことにより単離され得る。例えば、膵臓ｃＤＮＡライブラリーを発現する細菌は
、膜に付着され、溶解され、そして例えば、比色シグナルまたは蛍光シグナルを
産生する酵素に結合体化された膵臓ホーミング分子を用いてスクリーニングされ
得る。標的分子を発現している細菌性クローンは、同定され、そして標的分子を
コードするｃＤＮＡが単離され得る。さらに、ＣＯＳ細胞系のような哺乳動物細
胞発現クローニング系が、標的分子を同定するために用いられ得る。例えば、ｃ
ＤＮＡライブラリーは、発現ベクターにクローニングされ得る膵臓初代細胞由来
のｍＲＮＡを用いて調製され得る。次いで、標的分子をコードするｃＤＮＡを発
現している細胞は、例えば、プレートに付着する膵臓ホーミングペプチドに対す
る細胞クローンのパニングにより、プローブとして、膵臓ホーミングペプチドを
用いて、選択され得る。あるいは、ファージは、膵臓ホーミングペプチドを提示
するために用いられ得、そして、例えば、抗Ｍ１３抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
を用いてコートされた磁気ビーズに付着され得る。次いで、膵臓ホーミングペプ
チドに結合する標的分子を発現する細胞が、回収され、そしてレセプターをコー
ドするプラスミドが、単離され得る。回収されたプラスミド調製物はプール中へ
分割され得、そしてＣＯＳ細胞トランスフェクションにおいて試験され得る。こ
の手順は、ＣＯＳ細胞が膵臓ホーミングペプチドを結合するのを可能にする単一
のプラスミドが得られるまで繰り返され得る。
【０１３３】 本発明はまた、肺内皮に選択的にホーミングするＭＤＰ結合ホーミング分子を
同定する方法を提供する。この方法は、膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ）を１つ以上
の分子と接触させる工程；および分子のＭＤＰへの特異的結合を決定する工程を
包含し、ここで特異的結合の存在により、肺内皮に選択的にホーミングするＭＤ
Ｐ結合ホーミング分子として、その分子を同定する。本発明の方法において、膜
ジペプチダーゼは、実質的に精製され得、そして例えば、支持体に固定され得る
。この膜ジペプチダーゼは、任意の哺乳動物ＭＤＰ（例えば、配列番号４４８を
有するヒトＭＤＰ）であり得る。
【０１３４】 本明細書中に記載されるように、このＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号
１）ペプチドは、静脈注射後、マウス肺血管系に選択的に結合し得る（実施例Ｉ
ＩＡ）。さらに、実施例ＩＶＢに記載されるように、ＧＦＥ−１（ＣＧＦＥＣＶ
ＲＱＣＰＥＲＣ；配列番号１）を選択的に結合する５５ｋＤａの肺細胞表面タン
パク質を、アフィニティークロマトグラフィーを用いてラット肺抽出物から単離
した。トリプシン処理による消化および質量分析による配列決定は、５５ｋＤａ
のタンパク質由来の２つのペプチドが、ラット膜ジペプチダーゼ（ＥＣ ３．４
．１３．１９）の一部分に完全に同一であることを明らかにした。さらなる実験
が、ラットの肺細胞抽出物のＧＦＥ−１（配列番号１）アフィニティー精製画分
が、特異的ＭＤＰ基質Ｇｌｙ−Ｄ−ＰｈｅのＤ−Ｐｈｅへの時間依存的な変換に
よって示されるように、膜ジペプチダーゼ活性を有することを示した（実施例Ｉ
ＶＣおよび図５）。さらに、ＧＦＥ−１ファージ（ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ
；配列番号１）の、およびより少ない程度では、ＧＦＥ−２ファージ（ＣＧＦＥ
ＬＥＴＣ；配列番号２）の、膜ジペプチダーゼでトランスフェクトされたＣＯＳ
細胞への結合は、関連しないペプチド配列を有するファージの結合より、有意に
高かった（実施例ＩＶＤおよび図６Ｂ）。このことは、膜ジペプチダーゼがＧＦ
Ｅ−１（配列番号１）レセプターであることを示す。
【０１３５】 従って、本明細書中で開示されるように、肺メタロプロテアーゼ、膜ジペプチ
ダーゼは、肺内皮に対する分子の選択的ホーミングについてのレセプターとして
働く。膜ジペプチダーゼを標的化することによって、肺内皮に選択的にホーミン
グする分子の例証的な分類は、ＧＦＥモチーフ（例えば、ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰ
ＥＲＣ（配列番号１））を保有するペプチドの分類である。
【０１３６】 膜ジペプチダーゼ（腎性ジペプチダーゼ、ミクロソームジペプチダーゼ、デヒ
ドロペプチダーゼ−１、またはＭＤＰとしてもまた知られ、そして近年ＥＣ３．
４．１３．１９（以前は、ＥＣ３．４．１３．１１）として分類された）は、形
質膜グリコシルホスファチジルイノシトール−固定化糖タンパク質である（Ｋｅ
ｙｎａｎら、Ｈｏｏｐｅｒ編、Ｚｉｎｃ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅｓ
ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａ
ｎｃｉｓ，Ｌｏｎｄｏｎ、２８５−３０９頁（１９９６）、これは、本明細書中
に参考として援用される）。このジンクメタロプロテアーゼ（これは主に、肺お
よび腎臓刷子縁において発現される）は、インビボでは、グルタチオンの腎臓代
謝、およびペプチジルロイコトリエンの肺代謝に関与する。さらに、ＭＤＰは、
哺乳動物β−ラクタマーゼの唯一公知の例である。ＭＤＰは、ジスルフィド結合
ホモダイマーを形成し、これは、起源種に依存して約４８〜５９ｋＤａの範囲の
分子量のモノマーを有する（Ｋｅｙｎａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：１２５１
１−１２５１７（１９９６）、これは、本明細書中で参考として援用される；ま
た実施例ＩＶＢを参照のこと）。
【０１３７】 膜ジペプチダーゼの発現は、いくつかの組織において検出されているが、主に
肺および腎臓において発現される。肝臓、膵臓、小腸および脳由来の全抽出物に
おいて低いレベルのＭＤＰ活性の報告が存在しているが、他では、これらの器官
において検出可能な活性は見出されていない。マウスにおいて、４つの異なるＭ
ＤＰ ｍＲＮＡが存在し、そしてそれらは、いくつかの器官において示差的に発
現される（Ｈａｂｉｂら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１６２７３−１６
２８０（１９９６））。ブタＭＤＰ Ｎ結合グリコシル化の性質および程度の器
官特異的差異もまた、報告されている（Ｈｏｏｐｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．
３２４：１５１−１５７（１９９７））。
【０１３８】 腎臓において、ＭＤＰ発現は、近位細管の刷子縁領域における上皮細胞に制限
される。肺において、ＭＤＰ発現は、内皮細胞ならびに誘導気道、肺胞管、毛細
管、ならびに肺胞および終末細気管支の基底膜を含む、多くの細胞型において検
出されている（Ｈａｂｉｂら、前出、１９９６）；Ｉｎａｍｕｒａら、Ｐｒｏｓ
ｔａｇｌａｎｄｉｎｓ Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅｓ ａｎｄ Ｅｓｓｅｎｔｉａ
ｌ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ ５０：８５−９２（１９９４））。ＭＤＰ発現は
また、ヒト気管における粘膜下微細血管の内皮細胞において観察されている（Ｙ
ａｍａｙａら、Ｒｅｓｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１１：１０１−１０９（１９９８
）。ＭＤＰ活性のレベルは、肺において最も高い（Ｈｉｒｏｔａら、Ｅｕｒ．Ｊ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６０：５２１−５２５（１９８６）；Ｈａｂｉｂら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：４８５９−４８６３（１９
９８））。この発現パターンは、ＧＦＥ−１（配列番号１）のような分子の強力
な肺の分子のホーミングと相関する。
【０１３９】 本明細書中で使用される、用語「膜ジペプチダーゼ」とは、「ＭＤＰ」と同義
であり、そして近年ＥＣ ３．４．１３．１９（以前はＥＣ ３．４．１３．１
１）として分類され、そして腎性もしくはミクロソームのジペプチダーゼまたは
デヒドロペプチダーゼ−１としてもまた公知である酵素をいう。この用語、膜ジ
ペプチダーゼは、任意の哺乳動物の膜ジぺプチダーゼ（例えば、ヒト、ブタ、マ
ウス、ラットおよびウサギのホモログを含み、これらは、図９中の配列番号４４
８〜４５２に示されるアミノ酸配列を有する）、ならびにこれらのポリペプチド
の１つに対して実質的なアミノ酸配列類似性を有する関連ポリペプチドを含む。
このような関連ポリペプチドは、他のジンクメタロプロテアーゼまたはペプチダ
ーゼ（例えば、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）に対してよりも、配列番号４４
８、４４９、４５０、４５１、または４５２に対してより大きな配列類似性を示
し、そして、ＭＤＰの代替的にスプライスされた形態および図９に示されるアミ
ノ酸配列のアイソタイプ改変体を含む。従って、用語ＭＤＰは、異なる哺乳動物
種から得られた相同なポリペプチド、ならびに他の改変体および一般に配列番号
４４８、４４９、４５０、４５１または４５２の約６５％より大きな、好ましく
は、約７０％より大きな、およびより好ましくは約８０％または９０％より大き
な、アミノ酸同一性を有する関連ポリペプチドを含む。本発明の方法は、好まし
くは、ヒト膜ジペプチダーゼ（配列番号４４８）を使用する。
【０１４０】 膜ジペプチダーゼポリペプチドに関して本明細書中で使用される、用語「実質
的に精製される」とは、ポリぺプチドが、混入脂質、核酸、非関連ポリペプチド
および細胞中で膜ジペプチダーゼと通常結合しない他の細胞物質を比較的含まな
い形態であることを、意味する。
【０１４１】 ＭＤＰ結合ホーミング分子を同定するための本発明の方法は、インビボまたは
インビトロで実施され得、そして膜ジペプチダーゼは多くの供給源から得られ得
る。膜ジペプチダーゼの供給源としては、細胞全体あるいは内因性ＭＤＰまたは
外因性ＭＤＰを含む細胞抽出物が挙げられる。ＭＤＰのさらなる供給源は、部分
的に精製された細胞抽出物；生化学的に精製された酵素（例えば、アフィニティ
ー精製されたＭＤＰ）；組換えポリペプチド；およびトランスフェクトされた細
胞株を含む。
【０１４２】 アフィニティークロマトグラフィーは、本発明の方法における使用のための膜
ジペプチダーゼを精製または部分的に精製するために特に有用であり得る。例え
ば、膜ジペプチダーゼは、実施例ＩＶＣにおいてマウスおよびラット膜ジペプチ
ダーゼについて記載されるように、固定化ＧＦＥ−１ペプチド（配列番号１）を
使用して、アフィニティークロマトグラフィーによって肺細胞抽出物から精製さ
れ得る。同様に、膜ジペプチダーゼは、他の固定化リガンド（例えば、シラスタ
チン）を使用して、アフィニティークロマトグラフィーによって得られ得る。例
えば、膜ジペプチダーゼは、Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２
５７：３６１−３６７（１９８９）；およびＣａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２５９：１４５８６−１４５９０（１９８４）（これらの各々は、
本明細書中で参考として援用される）に記載されるように、シラスタチン−セフ
ァロースアフィニティークロマトグラフィーに結合した細菌性ホスファチジルイ
ノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）による、ＭＤＰの選択的放
出を通じて、２つの工程で効率的に精製され得る。
【０１４３】 組換え膜ジペプチダーゼもまた、本発明の方法において有用であり得る。種々
のＭＤＰホモログのアミノ酸配列および核酸配列は、当該分野において公知であ
る。図９に示される膜ジペプチダーゼポリペプチドをコードする核酸配列は、例
えば、ＧｅｎＢａｎｋのようなデータベースからかまたは文献（例えば、Ｇｅｎ
ｂａｎｋ登録番号第Ｄ１３１３９号および同第２８５１５０号；Ａｄａｃｈｉら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：３９９２−３９９５（１９９０）；Ｒａｃ
ｈｅｄら、１９９０；Ｋｅｙｎａｎら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．３４９：５０−
５４（１９９４）；Ｓａｔｏｈら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ
１１６３：２３４−２４２（１９９３）；Ａｄａｃｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１３２：３１１−３１４（１９９２）；Ａｎら、
Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２２６：３３７−３４０（１９
４）；ならびにＩｇａｒａｓｈｉおよびＫａｒｎｉｓｋｉ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ
．２８０：７１−７８（１９９１）、これらの各々は、本明細書中に参考として
援用される）から得られ得る。新規な膜ジペプチダーゼｃＤＮＡは、分子生物学
の分野において周知の方法を使用して、ヌクレオチド配列を、プローブまたはプ
ライマーとして用いて、さらなる哺乳動物種から単離され得る（Ｉｎｎｉｓら（
編）、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．（１９９０）；Ｅｒｌｉｃｈ、前出、１９８９；Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら、前出、１９８９、これらの各々は、本明細書中で参考として援用さ
れる）。当業者は、ＭＤＰのコード核酸の発現および、後の組換えＭＤＰポリペ
プチドの単離のための種々の方法を知っている。
【０１４４】 肺内皮へ選択的にホーミングするＭＤＰ結合ホーミング分子を同定するための
本発明の方法において、分子のＭＤＰへの特異的結合は、その分子を、肺内皮に
選択的にホーミングするＭＤＰ結合ホーミング分子として同定する。分子および
ＭＤＰに関して本明細書中で使用される用語「特異的結合」とは、その分子が、
非特異的相互作用とは測定可能に異なるＭＤＰの親和性を有することを意味する
。特異的結合は、例えば、コントロール分子の結合と比較した分子の結合の決定
によって、測定され得る。これは、一般的に、結合活性を有さない類似した構造
の分子、例えば、ＧＦＥモチーフを欠失した類似した大きさのぺプチドである。
この場合、特異的結合は、分子がコントロール分子より、膜ジペプチダーゼに対
して測定可能により高い親和性を有するかどうかが示される。結合の特異性はま
た、例えば、ＭＤＰに結合することが公知であるコントロール分子（例えば、Ｇ
ＦＥモチーフを含むペプチド）との競合によって決定され得る。
【０１４５】 本明細書中で使用される用語、特異的結合とは、低い親和性特異的結合および
高い親和性特異的結合の両方を含む。特異的結合は、例えば、膜ジペプチダーゼ
について約１０-4Ｍ〜約１０-7ＭのＫdを有する低親和性ＭＤＰ結合ホーミング 分子によって提示され得る。特異的結合はまた、高い親和性ＭＤＰ結合ホーミン
グ分子（例えば、膜ジペプチダーゼについて少なくとも約１０-7Ｍ、少なくとも
約１０-8Ｍ、少なくとも約１０-9Ｍ、少なくとも約１０-10Ｍ、または少なくと も約１０-11Ｍもしくは１０-12Ｍまたはそれより大きいＫdを有するＭＤＰ結合 ホーミング分子）によって提示され得る。配列Ｘ1−Ｇ−Ｆ−Ｅ−Ｘ2（配列番号
１７）（ここでＸ1およびＸ2各々が独立して選択された１〜１０のアミノ酸であ
る）を含むＭＤＰ結合ホーミングペプチドは、例えば、膜ジペプチダーゼについ
て約２×１０-5Ｍ〜１０-7ＭのＫd、例えば約１０-6〜１０-7ＭのＫdを有し得る
。肺内皮に選択的にホーミングする、低親和性ＭＤＰ結合ホーミング分子および
高親和性ＭＤＰ結合ホーミング分子の両方が、以下にさらに記載されるように、
被験体において部分を肺内皮に選択的に指向するのに有用であり得る。
【０１４６】 種々の当該分野で公知の技術を用いて、本発明の方法に従う膜ジペプチダーゼ
への分子の特異的結合を決定し得る。特異的結合に適切な条件が、例えば実施例
ＩＶＢにおいて記載される。特異的結合はまた、ＭＤＰ発現欠損細胞を、例えば
、実施例ＩＶＤに記載されるように、ＭＤＰを用いてトランスフェクトすること
によって決定され得る。この場合、特異的結合は、一部には、分子の非トランス
フェクト細胞への結合よりもＭＤＰトランスフェクト細胞への結合が有意に高い
ことによって、決定される。
【０１４７】 本発明は、ＭＤＰ結合分子が他の組織（例えば、腎臓）におけるＭＤＰ発現に
も関わらず、肺血管系に特異的にホーミングするという、驚くべき発見に関する
。本明細書中に開示されるように、ＭＤＰ結合ＧＦＥ−１（配列番号１）保有フ
ァージのマウスの循環への注射によって、隣接細胞上でいくらかの拡散染色を伴
って、ファージの肺微小血管系への迅速な結合を生じた。同じ結果が、ＧＦＥ−
１（配列番号１）保有ファージのラット循環への注射によって得られた。特に、
例えば、ＭＤＰ結合ＧＦＥ−１ファージは、腎近位細管の刷子縁（高いレベルの
ＭＤＰを発現する）に結合しなかった。これらの結果は、肺内皮細胞の管腔表面
上のＭＤＰの発現が、ＭＤＰ結合ファージが循環から肺内皮へホーミングするの
を媒介し得、一方、ＭＤＰ結合ファージは、腎臓ＭＤＰに接近し得ずかつホーミ
ングし得ないことを示す。従って、ＭＤＰは、分子が他の内皮細胞に優先して、
肺内皮に選択的ホーミングすることを媒介する。
【０１４８】 ＧＥＦ−１（配列番号１）保有ファージの肺血管系への選択的ホーミングは、
ファージのような部分が、ＭＤＰ結合ホーミング分子に結合され得、それによっ
て肺内皮へ選択的に指向され得ることをさらに示す。従って、本発明は、肺の障
害の処置のために肺内皮に対して、部分（例えば、ファージ、遺伝子治療ベクタ
ー、または抗生物質）を選択的に標的化する方法を提供する。
【０１４９】 被験体における部分を肺内皮に選択的に指向させるための本発明の方法は、肺
内皮へ選択的にホーミングするＭＤＰ結合ホーミング分子に連結された部分を含
む結合体を被験体に投与し、それによって、その部分が被験体中の肺内皮に選択
的に指向される工程を含む。ＭＤＰ結合ホーミング分子は、膜ジペプチダーゼ（
ＭＤＰ）を１つ以上の分子と接触させること；および分子のＭＤＰとの特異的結
合を決定することによって同定され、ここで、特異的結合の存在が、その分子を
肺内皮へ選択的にホーミングするＭＤＰ結合ホーミング分子として同定する。本
発明の方法は、例えば、肺炎；ぜん息；気腫；呼吸器感染；慢性気管支炎；慢性
間質性肺疾患；肺癌；胸膜炎または嚢胞性線維症に罹患している被験体の肺への
遺伝子または薬物を標的化することのために有用であり得る。所望される場合、
本発明の方法は、予防的に、例えば部分を、肺障害の家族歴を有する個体、また
は例えば、肺感染に感受性の個体の肺内皮に選択的に指向させるように、使用さ
れ得る。
【０１５０】 肺内皮に選択的に指向されるべき部分は、物理的、化学的または生物学的材料
（例えば、ウイルス、ウイルス遺伝子治療ベクター、細胞、リポソーム、マイク
ロカプセル、マイクロポンプまたは他のチャンバー化マイクロデバイス）であり
得、これらは、例えば薬物送達システムとして使用され得る。このようなマイク
ロデバイスは、一般に、生物学的に不活性であり、そして所望される場合、これ
らは生分解性または排出可能であり得る。薬剤を含み得る種々の部分（マイクロ
カプセルを含む）、および部分またはチャンバー化マイクロデバイスを有機分子
に連結させるための方法は、当該分野において周知であり、そして本明細書上記
に記載のように市販されている。治療用結合体を生成するために、肺内皮に選択
的にホーミングするＭＤＰ結合ホーミング分子に連結され得る例示的な部分は、
治療的抗菌性バクテリオファージ；アンピシリンのような抗生物質；およびリバ
ビリンのような抗ウイルス剤を含む（上記を参照のこと）。
【０１５１】 本発明の方法に従って肺内皮に選択的に指向される部分は、例えば、治療的バ
クテリオファージ（「ファージ」）であり得る。ファージは、無毒であることが
示されており（Ｏｃｈｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５０：２５５９−２
５６８（１９７１）、これは本明細書中に参考として援用される）、そしてファ
ージ療法の使用は、細菌感染（例えば、抗生物質耐性感染）の処置について当該
分野で公知である（ＢａｒｒｏｗおよびＳｏｏｔｈｉｌｌ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：２６８−２７１（１９９７）；Ｓｌｏｐｅｋ
ら、Ａｒｃｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｅｘｐ．３５：５５３−５６１（１
９８７）；およびＭｅｒｒｉｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
、ＵＳＡ ９３：３１８８−３１９２（１９９６）、これらの各々は本明細書中
に参考として援用される；Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏ
ｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏ
ｎ、Ｆｌｏｒｉｄａもまた参照のこと）。例えば、抗生物質療法で首尾よく処置
されなかった大部分である一連の５５０人の患者において、ファージ療法は、種
々の感染（気道化膿性感染および気管支肺炎（ｂｒｏｎｃｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ
）（Ｓｌｏｐｅｋら、前出、１９８７）を含む）を軽減するにおいて７５〜１０
０％の成功を生じた。ファージ療法は、院内感染および多剤耐性感染を処置する
において特に有用であり得る。
【０１５２】 研究は、予防および処置の両方ともが、細菌に接種するよりも少ないファージ
を使用して可能であることを示した。この研究は、ファージがインビボで増殖す
ることを示す。従って、ファージ療法は、ファージがインビボで複製する能力の
ために、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、アンピシ
リン、およびスルファフラゾール）による従来の処置より有効であり得る。所望
であれば、ＭＤＰ結合ホーミング分子を含有するファージ結合体での処置が、抗
生物質薬物療法と組み合わせられ得る。
【０１５３】 好ましくは、肺内皮に選択的に指向されるファージ部分は、溶解性ファージで
ある。このようなファージは、肺内皮に選択的に指向される結合体を生成するた
めにＭＤＰ結合ホーミングペプチド（例えば、ＧＦＥ−１（配列番号１））をコ
ードするように、標準的な遺伝子技術によって容易に改変され得る。本発明の方
法において有用なファージは、例えば、Ｔ４関連ファージ（これはまた、「Ｔ偶
数ファージファミリー」のメンバーとして公知である）を含む。当業者は、処置
される感染に特徴的な細菌に対するレセプター特異性を有するファージ部分（例
えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ
、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、また
はＳａｌｍｏｎｅｌｌａに対するレセプター特異性を有するファージ）が、選択
されることを理解する。所望であれば、病原性細菌は、分類化され得、そしてフ
ァージ感受性についてモニタリングされ得る。耐性細菌の処置のために、ファー
ジ結合体は、所望であれば、種々のタイプの細菌に対する異なるレセプター特異
性を有するファージの混合物を含み得る。
【０１５４】 ファージ／ＭＤＰ結合ホーミング結合体は、被験体に、例えば、静脈内で投与
され得る。このような結合体はまた、例えば、各食事の一時間半前に、１０ｍｌ
滅菌ファージ溶解物として経口投与され得る。胃液が、Ｖｉｃｈｙ水、重曹、ま
たはゼラチンによって中和される。経口投与後、ファージ／ＭＤＰ結合ホーミン
グ結合体は、血液に接近し、続いて肺内皮に選択的に指向される。必要であれば
、投与は、数週間または数ヶ月の期間にわたって毎日繰り返され得る。ファージ
結合体の適当な用量は、当業者によって容易に決定され得、そして一般に、約１
００〜約１０10プラーク形成単位（ｐｆｕ）、通常、約１００〜１０6ｐｆｕの 範囲内である。
【０１５５】 遺伝子治療のために肺内皮に選択的に指向される部分は、遺伝子治療ベクター
であり得る。本明細書中で使用される用語「遺伝子治療ベクター」は、宿主細胞
に送達されたとき、インビボでその宿主細胞においてコードされる遺伝子産物を
一過的または永続的に発現する核酸成分を含有するベクターを意味する。
【０１５６】 ＭＤＰ結合ホーミング分子を用いて肺内皮に選択的に指向され得る種々の遺伝
子治療ベクターもまた、当該分野で公知である。このようなベクターには、ウイ
ルスおよび非ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイ
ルスベクター、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルスベクター、お
よびリポソームプラスミドベクターが挙げられる（Ｃｈａｎｇ、Ｓｏｍａｔｉｃ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆ
ｌｏｒｉｄａ （１９９５）、その各々は、本明細書中に参考として援用される
）。レトロウイルスベクターおよびＡＡＶベクターは、例えば、永続的な発現の
ために有用であり得、一方、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクタ
ー、およびリポソーム−プラスミドベクターは、一般に、一過性発現を与える。
例えば、アデノウイルスベクターは、肺において、嚢胞性線維芽症膜貫通レセプ
ター（ＣＦＴＲ）および組換えα１−アンチトリプシンを発現させるために使用
されている（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８：１４３ （１９９２）；
Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１ （１９９１）、これ
らの各々は、本明細書中に参考として援用されている）。リポソームＤＮＡ複合
体もまた、肺への遺伝子移入を生じさせるために使用されている（例えば、Ｚｈ
ｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：２０９（１９９３）（これは、本明細書中に参
考として援用されている）を参照のこと）。ファージベクターもまた、所望の核
酸をインビボで発現させるために有用であり得る（例えば、Ｉｖａｎｅｎｋｏｖ
ら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １４４８
：４５０−４６２（１９９９）；Ｉｖａｎｅｋｏｖら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ
ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １４４８：４６３−４７２（１９９９
）（これらの各々は、本明細書中に参考として援用されている）を参照のこと）
。
【０１５７】 ＭＤＰ結合ホーミング分子（例えばＧＦＥ−１（配列番号１））を含有する結
合体を用いて肺内皮に部分を選択的に指向させるための、本発明の方法は、種々
の肺障害の治療的取り扱いにおいて有用であり得る。例えば、サイトカインをコ
ードする遺伝子治療ベクターを肺内皮に選択的に指向させることにより、本発明
の方法は、免疫療法のために有用であり得る。種々のサイトカインまたはケモカ
インは、本発明の方法に従って投与された場合、免疫応答（例えば、抗癌免疫応
答もしくは抗ウイルス免疫応答）の刺激において有用であり得る。このようなサ
イトカインまたはケモカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＦ
Ｎ−α、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、
ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、リンホタクチン（ｌｙｍｐｈｏ
ｔａｃｔｉｎ）、またはＤＣ−ＣＫ１（Ｐａｒｄｏｌｌ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１３：３９９−４１５（１９９５）；Ｈｕｎｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｔｈｅｒａｐｙ １４：３１４−３２１（１９９３）；Ｃｈａｎｇ、前出、
１９９５、これらの各々は、本明細書中に参考として援用されている）を含む。
本発明の方法は、循環中のサイトカインの半減期が短いことおよびそれらの肺へ
の標的化がないことに起因して、組換えサイトカインの投与よりも有効であり得
る。
【０１５８】 上記で考察したように、本発明の方法は、ファージ部分もしくは抗生物質薬物
（例えば、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、もしくはス
ルファフラゾール）を肺内皮へ選択的に指向させることにより肺感染を治療する
ために有用であり得る。例えば、本発明の方法は、後天性免疫不全症候群（ＡＩ
ＤＳ）または嚢胞性線維症に続発性の感染を処置するために有用であり得る。
【０１５９】 肺内皮に部分を選択的に指向させるための、本発明の方法はまた、肺障害（例
えば、α１−アンチトリプシン欠損および嚢胞性線維症）の置換遺伝子治療のた
めに使用され得る（ＡｌｔｏｎおよびＧｅｄｄｅｓ、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈｏｓｐ．
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５８：３８−４０（１９９７）；Ｗｏｏｄ、Ｒａｄｉｏｌｏ
ｇｙ ２０４：１−１０（１９９７）、これらの各々は、本明細書中に参考とし
て援用されている）。野生型α１−アンチトリプシン（α１−ＡＴ）および嚢胞
性線維症膜貫通レセプター（ＣＦＴＲ）をコードする遺伝子が、単離されており
（Ｒｉｏｒｄａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：１０６６−１０７３（１９８９
）；Ｒｉｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ ３４７：３５８：６３（１９９０）；Ｒｏｓｅ
ｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９９１）、これら
の各々は、本明細書中に参考として援用されている）、そしてＭＤＰ結合ホーミ
ング分子（例えば、ＧＦＥ−１（配列番号１））に連結された遺伝子治療ベクタ
ーにおいて肺に選択的に移入され得る。
【０１６０】 １つの実施態様では、本発明は、部分を肺内皮に選択的に指向させる方法であ
って、ここでＭＤＰ結合ホーミング分子が配列Ｘ1−Ｇ−Ｆ−Ｅ−Ｘ2（配列番号
１７）（ここで、Ｘ1およびＸ2の各々は、１〜１０の独立して選択されたアミノ
酸である）を含むペプチドである、方法を提供する。このようなＭＤＰ結合ホー
ミングペプチドは、例えば、配列ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）ま
たはＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２）を含み得る。
【０１６１】 別の実施態様では、本発明は、部分を肺内皮に選択的に指向するための方法で
あって、ここでＭＤＰ結合ホーミング分子が以下の構造１を含む、方法を提供す
る：
【０１６２】
【化４】 ここでＲ2およびＲ3はそれぞれ、３〜１０炭素原子および１〜１５炭素原子の範
囲の炭化水素ラジカルであり；これらＲ2またはＲ3炭化水素鎖のいずれか一方で
、１〜６の水素が、ハロゲンで置換され得るか、または非末端メチレンが、酸素
または硫黄（後者の酸化型を含む）で置換され得；さらに、Ｒ3中の末端水素も また、ヒドロキシルまたはチオール（これはアシル化またはカルバモイル化され
得る）で置換され得；あるいは、水素が、アミノ（これは、アシルアミノ、ウレ
イド、アミジノ、グアニジノ、もしくはアルキルにおけるように誘導体化され得
る）または置換アミノ基（第４級窒素基（ｇｒｏｕｐｉｎｇ）を含む）で置換さ
れ得る；あるいは、酸基（例えば、カルボン酸基、ホスホン酸基、またはスルホ
ン酸基）またはそれらのエステルもしくはアミド、またはシアノによる置換が存
在し得る；あるいは、それらの組み合わせ（例えば、末端アミノ酸基を含む）；
そしてＲ1は、水素もしくは低級アルキル（Ｃ1-6）もしくはジアルキルアミノア
ルキル、または薬学的に受容可能なカチオンである。このようなＭＤＰ結合ホー
ミング分子は、例えば、７−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−
２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−ヘプテン酸（ｈ
ｅｐｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）（シラスタチンとしても公知であ る）であり得る。
【０１６３】 ＭＤＰ結合ホーミング分子は、例えば、Ｒ2が、カルボニルに隣接した炭素が 第三級であり得ないという限定を伴う、分枝アルキルまたはシクロアルキルであ
る、構造１を有する化合物であり得る。
【０１６４】 ＭＤＰ結合ホーミング分子はまた、例えば、Ｒ2が、カルボニルに隣接した炭 素が第三級であり得ないという限定を伴う、分枝アルキルまたはシクロアルキル
であり、そしてＲ3が、ｎ−アルキル（１〜９炭素）、または第４級窒素、アミ ン誘導体、もしくはアミノ酸誘導基である末端置換基を有するｎ−アルキル（１
〜９炭素）である、構造１を有する化合物であり得る。ＭＤＰ結合ホーミング分
子は、例えば、例えば、Ｒ2が、２，２−ジメチルシクロプロピルまたは２，２ −ジクロロシクロプロピルであり、そしてＲ3が、末端置換基を有さない３〜７ 炭素原子の炭化水素鎖であるか、またはトリメチルアンモニウム、アミジノ、グ
アニジノもしくは２−アミノ２−カルボエチルチオである末端置換基を有する３
〜７炭素原子の炭化水素鎖である、構造１を有する化合物であり得る。
【０１６５】 本発明において有用である、構造１を有する例示のＭＤＰ−結合ホーミング分
子には、以下が含まれる：Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキ
サミド）−８−トリメチルアンモニウムヒドロキシド−２−オクテン酸内部塩；
Ｚ−２−（２，２−ジクロロシクロプロパンカルボキサミド）−８−トリメチル
アンモニウムヒドロキシド−２−オクテン酸内部塩；Ｚ−２−（２，２−ジメチ
ルシクロプロパンカルボキサミド）−８−グアニジノ−２−オクテン酸；Ｚ−２
−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−グアニジノ−２−
オクテン酸；Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８
−ウレイド−２−オクテン酸；Ｚ−８−（１−２−アミノ−２−カルボキシエチ
ルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−オク
テン酸；Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−オ
クテン酸（ラセミ型および右旋性型）；Ｚ−２−（２，２−ジクロロシクロプロ
パンカルボキサミド）−２−オクテン酸；７−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキ
シエチルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２
−ヘプテン酸；および６−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２
−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−ヘキセン酸。
【０１６６】 上述のように、肺に処置を標的化するための、本発明の方法は、ＭＤＰ結合ホ
ーミング分子を用いて実施され得、このＭＤＰ結合ホーミング分子は、以下の構
造１を有する、Ｚ−２−アシルアミノ−３−モノ置換プロペネートである：
【０１６７】
【化５】 ここでＲ2およびＲ3はそれぞれ、３〜１０炭素原子および１〜１５炭素原子の
範囲の炭化水素ラジカルである。これら炭化水素ラジカルＲ2およびＲ3のいずれ
か一方で、６までの水素が、ハロゲンで置換され得るか、または非末端メチレン
が、酸素または硫黄（後者の酸化型を含む）で置換され得る。
【０１６８】 Ｒ3中の末端水素もまた、ヒドロキシル基またはチオール基（これはアシル化 （例えば、１〜８炭素原子のアルカノイル酸を有するように）またはカルバモイ
ル化（アルキルおよびジアルキルカルバメート誘導体を含む）され得る）で置換
され得；あるいは、水素が、アミノ基（これは、アシルアミノ、ウレイド、アミ
ジノ、グアニジノ、またはアルキルもしくは置換アルキルアミノ基（第４級窒素
基を含む）におけるように誘導体化され得る）で置換され得る；あるいは、酸基
（例えば、カルボン酸基、ホスホン酸基、またはスルホン酸基）またはそれらの
エステルもしくはアミド、ならびにシアノによる置換が存在し得る；あるいは、
それらの組み合わせ（例えば、末端アミノ酸基を含む）。
【０１６９】 構造１を有するＭＤＰ結合ホーミング分子において、Ｒ2は、好ましくは、カ ルボニルに隣接した炭素が第三級であり得ないという限定を伴う、分枝アルキル
またはシクロアルキルラジカル（Ｃ3-10）である。Ｒ3が、１〜４炭素原子の直 鎖低級アルキルである場合、Ｒ2は、フェニルまたは１〜４炭素原子の直鎖低級 アルキルではあり得ない。Ｒ1は、水素、低級アルキル（Ｃ1−Ｃ6）またはジア ルキルアミノアルキル（例えば、−ＣＨ2ＣＨ2Ｎ（Ｃ2Ｈ5）2、−ＣＨ2ＣＨ（Ｃ
Ｈ3）Ｎ（ＣＨ3）2）である。
【０１７０】 上記構造１を有するＭＤＰ結合ホーミング分子は、不斉型を有し得る。ラセミ
Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸
が、分離されている。活性は、右旋性異性体に存在する。これはＳ−配置を有す
る。
【０１７１】 構造１を有する化合物のＲ2の定義において、以下の部分基が含まれる： −Ｒ4 ここで、Ｒ4は、３〜１０炭素原子の直鎖、分枝、または環状の炭化水素ラジカ ルであり、これは、Ｒ2の定義において上述したように置換され得る； −Ｒ5Ｒ6 ここで、Ｒ5は、３〜６炭素原子のシクロアルキルであり、そしてＲ6は、結合し
てシクロアルキル基上に別の環を形成し得る１または２のいずれかのアルキル置
換基であるか、あるいは、Ｒ5およびＲ6は、Ｒ2の定義において上述したように 置換され得る；そして −Ｒ7Ｒ8 ここで、Ｒ7は、１〜３炭素原子のアルキレン基であり、そしてＲ8は、３〜６炭
素原子のシクロアルキルであり、この炭素原子は、Ｒ2およびＲ3の定義において
上述したように置換され得る。
【０１７２】 構造１におけるＲ2の定義内で特に好ましい置換基は、２，２−ジメチルシク ロプロピル基および２，２−ジクロロシクロプロピル基を含む。
【０１７３】 構造１におけるＲ3の定義内で、化合物の特に好ましい群は、ｎ−アルキル（ １〜９炭素）、および４級窒素、アミン誘導体、またはアミノ酸由来基である、
末端置換基を有するｎ−アルキル（１〜９炭素）を含む。
【０１７４】 用語「４級窒素」は、構造１に関して、正に帯電した４置換型（ｔｅｔｒａｓ
ｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）窒素または複素環式芳香族の窒素を意味するために本明
細書中で使用される。これは１〜７個の炭素原子を有する炭化水素基（それらは
同じまたは異なり得る）で置換された、アンモニウム部分を意味する。
【０１７５】 構造１に関して本明細書中で使用されるように、用語「アミノ誘導体」とは、
そのアミノ誘導体、アシルアミノ誘導体、ウレイド誘導体、アミジノ誘導体、グ
アニジノ誘導体およびアルキル（１〜７個の炭素原子）誘導体のような基を意味
する。
【０１７６】 構造１に関して本明細書中で使用されるように、用語「アミノ酸由来基」とは
、システイニル（−ＳＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨ）またはサルコシル（−Ｎ（
ＣＨ3）ＣＨ2ＣＯＯＨ）のような部分を意味し、ここで、公知のアミノ酸Ｏ、Ｎ
またはＳに結合する水素は置換される。
【０１７７】 構造１を有する特に好ましいＭＤＰ−結合ホーミング分子は、Ｒ2が２，２− ジメチルシクロプロピルまたはジクロロシクロプロピルであり、かつＲ3が末端 置換基を有さない３〜７個の炭素原子の炭化水素鎖であるか、あるいはトリメチ
ルアンモニウム、アミジノ、グアニジノ、または２−アミノ−２−カルボキシエ
チルチオである末端置換基を有する３〜７個の炭素原子の炭化水素鎖である、ホ
ーミング分子である。
【０１７８】 本発明において有用な模範的なＭＤＰ−結合ホーミング分子は、以下を含む；
Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキシアミド）−８−トリメチ
ルアンモニウムヒドロキシド−２−オクテン酸内部塩；Ｚ−２−（２，２−ジク
ロロシクロプロパンカルボキサミド）−８−トリメチルアンモニウムヒドロキシ
ド−２−オクテン酸内部塩；Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボ
キサミド）−８−ホルムアミジノ−２−オクテン酸；Ｚ−２−（２，２−ジメチ
ルシクロプロパンカルボキサミド）−８−グアニジノ−２−オクテン酸；Ｚ−２
−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−ウレイド−２−オ
クテン酸；Ｚ−８−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２
，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸；Ｚ−２−（
２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸（ラセミ型
および右旋回型）；Ｚ−２−（２，２−ジクロロシクロプロパンカルボキサミド
）−２−オクテン酸；７−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２
−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−ヘプテン酸；およ
び６−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチ
ルシクロプロパンカルボキサミド）−２−ヘキセン酸。
【０１７９】 構造１を有するＭＤＰ−結合ホーミング分子を調製するための方法は、本明細
書中に開示され、そして当該分野で公知である。このようなＭＤＰ−結合ホーミ
ング分子を調製するためのいくつかの方法は、実施例ＶＩに示される（また、Ｋ
ａｈａｎらに対する米国特許第４，６１６，０３８号（本明細書中で参考として
援用される）も参照のこと）。
【０１８０】 当該分野で公知のさらなるＭＤＰ−結合ホーミング分子もまた、本発明の方法
に従って、肺内皮に対して選択的に遺伝子または医薬を標的にするために使用さ
れ得る。このようなＭＤＰ−結合ホーミング分子は、以下の構造２：
【０１８１】
【化６】 を含む、置換型２−アルケン酸（ここで、ｎは３〜５までの整数であり、かつＹ
は複素環式基またはフェニル基であり、これは置換されてもよく、置換されなく
てもよい）、ならびに低級アルキル（Ｃ1〜Ｃ6）エステルおよびその薬学的に受
容可能な塩を含む。
【０１８２】 構造２に関して本明細書中で使用されるように、用語「複素環式」とは、ピリ
ジル、ピリミジニル、テトラゾリル、イミダゾリル、チアゾリニルなどを意味す
る。このような複素環式環およびフェニル環は、置換されなくてもよく、あるい
はヒドロキシル、オキソ、カルボニル、またはメチルで置換されてもよい。構造
２におけるＹ基としては、例えば、２−ピリジニル；４−ピリジニル；３−ヒド
ロキシ−２−ピリジニル；３−カルボキシ−２−ピリジニル；５−カルボキシ−
２−ピリジニル；２−カルボキシフェニル；１−メチル−１，２，３，４−テト
ラゾール−５−イル；および４−カルボキシ−６−ヒドロキシ−２−ピリミジニ
ルが挙げられる。
【０１８３】 構造２を有する置換型２−アルケン酸ＭＤＰ−結合ホーミング分子のシクロプ
ロピル中心の立体配置は、好ましくは、Ｓ（＋）であるが、化合物のＲ，Ｓ（＋
／−）ラセミ混合物もまた、本発明の方法において使用され得る。
【０１８４】 このクラスの特に活性なＭＤＰ−結合ホーミング分子は、ｎが４であり、かつ
Ｙが３−カルボキシ−２−ピリジルまたは３−ヒドロキシ−２−ピリジル（各々
Ｓ形態の）である、ホーミング分子である。構造２を有する模範的なＭＤＰ−結
合ホーミング分子は、以下を含む：Ｚ−７−（３−ヒドロキシ−２−ピリジルチ
オ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキシアミド）−２−ヘプテ
ン酸およびＺ−（５−カルボキシ−２−ピリジルチオ）−２−（２，２−ジメチ
ルシクロプロパンカルボキシアミド）−２−ヘプテン酸。
【０１８５】 構造２を有するＭＤＰ結合ホーミング分子、ならびに種々の薬学的に受容可能
な誘導体（例えば、アルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩
またはアミン塩など（これらもまた本発明において有用である））は、慣用的な
方法を使用して当業者により調製され得る。構造２を有するＭＤＰ−結合ホーミ
ング分子は、例えば、Ａｓｈｔｏｎらに対する米国特許第４，４０６，９０２号
（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載のように、例えば、ブロ
モアルケン酸を適切なメルカプタンであるＹＳＨと、周囲温度で炭酸水素ナトリ
ウム存在下の水中で縮合することにより調製され得る。
【０１８６】 本発明において有用であるＭＤＰ−結合ホーミング分子はまた、以下の構造３
：
【０１８７】
【化７】 または以下の構造４：
【０１８８】
【化８】 を有するホスフィン酸であり得、 ここで： Ｒ1は、 （ａ）Ｃ2〜Ｃ12の直鎖または分枝の非置換型アルキル； （ｂ）Ｃ2〜Ｃ12の直鎖または分枝の置換型アルキル； （ｃ）Ｃ2〜Ｃ12の直鎖または分枝のモノアルケニル； （ｄ）Ｃ2〜Ｃ12の直鎖または分枝のアルキニル； （ｅ）Ｃ7〜Ｃ20のアラルキルであって、ここで、そのアルキル鎖が直鎖または 分枝のＣ1〜Ｃ8であり、かつそのアリール部分がＣ6〜Ｃ12である、アラルキル ； （ｆ）Ｃ3〜Ｃ7のシクロアルキル； （ｇ）Ｃ4〜Ｃ10シクロアルキルアルキル（構造４に対してのみ）； であって、ここで、（ａ）を除いて、Ｒ1についての上記の価が、以下：Ｃ1〜Ｃ 4 のアルコキシ、Ｃ6〜Ｃ12のアリールオキシ、Ｃ1〜Ｃ4のアルキルチオ、Ｃ6〜 Ｃ12のアリールチオ、Ｃ3〜Ｃ6のシクロアルキルオキシ、Ｃ3〜Ｃ6のシクロアル
キルチオ、Ｃ7〜Ｃ10のアラルキルオキシ、Ｃ7〜Ｃ16のアラルキルチオの１以上
のものにより置換され得； Ｒ2は、 （ａ）ＨまたはＣ1〜Ｃ12の直鎖または分枝のアルキル； （ｂ）Ｃ2〜Ｃ12の直鎖または分枝のモノアルケニル； （ｃ）Ｃ7〜Ｃ20のアラルキルであって、ここで、そのアルキル鎖が直鎖または 分枝のＣ1〜Ｃ8であり、かつそのアリール部分がＣ6〜Ｃ12である、アラルキル ； （ｄ）複素環式アルキルであって、ここで、そのアルキル鎖が直鎖または分枝の
Ｃ1〜Ｃ8であり、かつその複素環部分は５〜６員の、必要に応じて、ベンゼン環
と融合される完全芳香族であり、以下：Ｏ、ＮまたはＳのヘテロ原子の１〜２個
を含む、複素環式アルキル； （ｅ）Ｃ3〜Ｃ7のシクロアルキル； （ｆ）Ｃ4〜Ｃ10シクロアルキルアルキル； であって、ここで、Ｒ2についての上記の価が、以下：ハロ、ヒドロキシ、カル ボキシ、Ｃ1〜Ｃ4のアルコキシカルボニル、Ｃ7〜Ｃ16のアリールアルコキシカ ルボニル、Ｃ3〜Ｃ7のシクロアルキル、Ｃ1〜Ｃ4のアルコキシ、Ｃ6〜Ｃ12のア リールオキシ、Ｃ3〜Ｃ6のシクロアルキルオキシ、Ｃ3〜Ｃ6のシクロアルキルチ
オ、アミノ、Ｃ1〜Ｃ8のモノ−またはジ−アルキルアミノ、チオ、Ｃ1〜Ｃ4のア
ルキルチオ、Ｃ6〜Ｃ12のアリールチオ、Ｃ7〜Ｃ16のアラルキルチオ、またはラ
ジカル−Ｓ−（ＣＨ2）n−ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨに示す１以上のものにより置 換され得； Ｒ5は、 （ａ）ＨまたはＣ1〜Ｃ12の直鎖または分枝のアルキル； （ｂ）Ｃ2〜Ｃ12の直鎖または分枝のモノアルケニル； （ｃ）Ｃ7〜Ｃ20のアラルキルであって、ここで、そのアルキル鎖が直鎖または 分枝のＣ1〜Ｃ8であり、かつそのアリール部分がＣ6〜Ｃ12である、アラルキル ； （ｄ）複素環式アルキルであって、ここで、そのアルキル鎖が直鎖または分枝の
Ｃ1〜Ｃ8であり、かつその複素環部分は５〜６員の、必要に応じて、ベンゼン環
と融合される完全芳香族であり、以下：Ｏ、ＮまたはＳのヘテロ原子の１〜２個
を含む、複素環式アルキル； （ｅ）Ｃ4〜Ｃ10シクロアルキルアルキル； （ｆ）Ｃ3〜Ｃ7のシクロアルキル； であって、ここで、Ｒ5についての上記の価が、以下：ハロ、ヒドロキシ、カル ボキシ、Ｃ1〜Ｃ4のアルコキシカルボニル、Ｃ7〜Ｃ16のアリールアルコキシカ ルボニル、Ｃ3〜Ｃ7のシクロアルキル、Ｃ1〜Ｃ4のアルコキシ、Ｃ6〜Ｃ12のア リールオキシ、Ｃ3〜Ｃ6のシクロアルキルオキシ、Ｃ3〜Ｃ6のシクロアルキルチ
オ、アミノ、Ｃ1〜Ｃ8のモノ−またはジ−アルキルアミノ、チオ、Ｃ1〜Ｃ4のア
ルキルチオ、Ｃ6〜Ｃ12のアリールチオ、Ｃ7〜Ｃ16のアラルキルチオ、またはラ
ジカル−Ｓ−（ＣＨ2）n−ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨに示す１以上のものにより置 換され得る； そして、その構造３および４のＭＤＰ−結合立体異性体ならびにラセミ化合物を
含む、ホスフィン酸であり得る。
【０１８９】 構造３または４を有するＭＤＰ−結合ホーミング分子において、（ａ）Ｃ2〜 Ｃ12の直鎖または分枝の非置換型アルキルについてのＲ1の価は、エチル、プロ ピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、
ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、イ
ソ−オクチル、ｎ−デシル、ｎ−ウンデシル、ｎ−ドデシルなどを含む。この系
列においては、ｎ−ブチル、イソブチル、ｎ−ペンチルおよびｎ−ヘキシルが好
ましい。
【０１９０】 構造３または４を有するＭＤＰ−結合ホーミング分子において、（ｂ）Ｃ1〜 Ｃ12の直鎖または分枝の置換型アルキルについてのＲ1の価は、上記に定義され た置換基により置換された、Ｒ1（ａ）についての上記の価を含み、これは以下 の好ましい置換基を含む：メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、メチル
チオ、エチルチオ、プロピルチオ、ブチルチオ、シクロペンチルオキシ、シクロ
ペンチルチオ、シクロプロピルチオ、ベンジルチオ、２−フェネチルチオ、２−
フェネチルチオなど。
【０１９１】 構造３または４を有するＭＤＰ−結合ホーミング分子において、（ｅ）Ｃ2〜 Ｃ2の直鎖または分枝のモノアルキルについてのＲ1の価は、エテニル、プロペニ
ル、１−ブテニル、２−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、２−メチ
ル−２−ブテニルなどを含む。
【０１９２】 構造３または４を有するＭＤＰ−結合ホーミング分子において、（ｄ）Ｃ2〜 Ｃ12の直鎖または分枝のアルキニルについてのＲ1の価は、エチニル、プロピニ ル、１−ブチニル、２−ブチニル、２−メチル−３−ペンチニルなどを含む。
【０１９３】 （ｄ）Ｃ2〜Ｃ12の直鎖または分枝のアルキニルについてのＲ1の価は、エチニ
ル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、２−メチル−３−ペンチニルな
どを含む。
【０１９４】 （ｅ）Ｃ7〜Ｃ20のアラルキルについてのＲ1の価は、ベンジル、２−フェニル
エチル、１−フェニルエチル、４−メチルフェニル−メチルなどを含む。この系
列においては、ベンジルが好ましい。
【０１９５】 （ｆ）Ｃ4〜Ｃ10のシクロアルキルアルキルについてのＲ1の価は、以下を含む
：シクロヘキシルメチル、シクロペンチルメチル、２−シクロヘキシルエチル、
２−シクロオクチルエチルなど。この系列においては、シクロペンチルメチルお
よびシクロヘキシルメチルが好ましい。
【０１９６】 （ｇ）Ｃ3〜Ｃ7のシクロアルキルについてのＲ1の価は、以下を含む：シクロ プロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなど。この系列にお
いては、シクロペンチルおよびシクロヘキシルが好ましい。
【０１９７】 好ましいＲ1の置換基の価は、以下を含む：メトキシ、エトキシ、フェノキシ 、メチルチオ、エチルチオ、フェニルチオ、ベンジルオキシ、２−フェニルエチ
ルオキシ、ベンジルチオ、２−フェニルエチルチオなど。
【０１９８】 任意の変数により示される、Ｒ2およびＲ5についてのアルキル、アルケニル基
の価は、他で示される場合を除いて、直鎖または分枝の、２〜１２炭素原子から
のアルキルおよびモノアルケニルおよび鎖状炭化水素ラジカル（例えば、エチル
、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ
−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘプチル、ｎ−ノニル、４，４−
ジメチルペンチル、またはビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、５−
ヘキセニルなど）を含む。イソプロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘプ
チルまたは１−ブテニルが好ましい。
【０１９９】 Ｃ3〜Ｃ7のシクロアルキルおよびＣ4〜Ｃ10のシクロアルキルアルキルの価は 、以下を含む：シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロペンチル−メチル、シ
クロペンチルエチル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、シクロプ
ロピルなど。
【０２００】 上記の変数により表されるアラルキル基は、アルキル部分に１〜８の炭素原子
を有し、そしてここで示される「アリール」は、フェニル、ナフチル、またはビ
フェニルを表す。代表的な例としては、ベンジル、フェネチル、４−フェニル−
ｎ−ブチル、１−フェニル−ｎ−オクチルなどが挙げられる。
【０２０１】 構造３または４を有する本発明のＭＤＰ−結合ホーミング分子において、芳香
族複素環、すなわち「ヘテロアリール」置換基は、同義であり、そして上記に引
用されるものは、１〜３個のＯ、ＮまたはＳヘテロ原子、好ましくは、１個のＯ
またはＳあるいは１〜３個のＮヘテロ原子を含む、５員または６員の芳香環、例
えば、ピリジル、チエニル、フリル、イミダゾリル、およびチアゾリルならびに
これらの任意の二環式基誘導体（ここで、上記の任意の複素環式環は、ベンゼン
環（例えば、インドリル、キノリニル、イソキノリニル、ベンジミダゾリル、ベ
ンゾチアゾリル、ベンゾフリル、およびベンゾチエニルのような）に融合される
）を表す。
【０２０２】 名前を挙げたＲ2およびＲ5のアルキル鎖ならびにアルケニル鎖上の置換基は、
アラルキル基、複素環アルキル基およびヘテロアリール基における芳香環上にも
同様に存在し得る。置換部位は、任意の利用可能な部位であり得、そして置換は
、１以上の同じかまたは異なる基を含み得る。
【０２０３】 置換基は、以下のものである：ハロ（フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード
を意味する）；ヒドロキシ；カルボキシ；Ｃ1〜Ｃ4の直鎖または分枝のアルコキ
シカルボキシ（例えば、メトキシカルボニルおよびエトキシカルボニル）；Ｃ7 〜Ｃ16のアリールアルコキシカルボニル（例えば、ベンジルオキシカルボニル、
ｎ−ブチルオキシカルボニル）；Ｃ3〜Ｃ7のシクロアルキル（例えば、シクロペ
ンチルおよびシクロヘキシル）；Ｃ1〜Ｃ4のアルコキシ（例えば、ｔ−ブトキシ
およびエトキシ）；Ｃ6〜Ｃ12のアリールオキシ（例えば、ビフェニルオキシ、 ベンジルオキシ）；アミノ；モノ−またはジ−Ｃ1〜Ｃ8のジアルキルアミノ（例
えば、メチルアミノ、イソプロピルアミノ、ｎ−ブチルアミノ、イソへキシルア
ミノ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ、メチルエチルアミノ、メチル−ｔ−ブチルアミ
ノ、ジ−ｎ−オクチルアミノ；チオ；Ｃ1〜Ｃ4のアルキルチオ（例えば、メチル
チオ、エチルチオ）；Ｃ6〜Ｃ12のアリールチオ（例えば、フェニルチオ）；Ｃ7 〜Ｃ16のアラルキルチオ（例えば、ベンジルチオ、ナフチル−メチルチオ）；ラ
ジカル−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨおよび−Ｓ−（ＣＨ2）2−ＣＨ（Ｎ
Ｈ2）ＣＯＯＨ（両方とも、好ましくはＬ立体配置）；そしてチオ置換基が存在 する場合、Ｒ2またはＲ5は、少なくとも１つのＣ2のアルキル基でなければなら ない。アリールまたはヘテロアリール基が、置換基に存在する場合、環上の炭素
は、以下の１以上のものによりさらに置換され得る：直鎖または分枝のＣ1−Ｃ4 アルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、ｔ−ブチル）；トリハロメ
チル（「ハロ」は、上記と同じ意味を有する）（例えば、トリクロロメチル、ト
リフルオロメチル）；ニトロ、シアノまたはスルホンアミド。
【０２０４】 好ましいのは、Ｒ1がシクロヘキシルメチル、シクロペンチルメチル（ｃｙｃ ｌｏｐｅｎｔｙｈｎｅｔｈｙｌ）、ｎ−ペンチル、ｎ−ブチル、ｎ−ヘキシル、
イソブチルであり、Ｒ2およびＲ3は：Ｃ3−Ｃ7シクロアルキル；置換しているか
または置換していない、Ｃ1−Ｃ10直鎖または分枝アルキル；置換しているかま たは置換していない、Ｃ7−Ｃ14アラルキルである化合物である。ここで、これ らの基は、ハロ、アミノ、モノ−もしくはジ−Ｃ1−Ｃ4直鎖または分枝アルキル
アミノ、カルボキシル、Ｃ1−Ｃ4アルコキシカルボニル、ヒドロキシ、Ｃ1−Ｃ4 アルコキシ、Ｃ5−Ｃ6シクロアルキル、Ｃ6−Ｃ10アリロキシ（ａｒｙｒｏｘｙ ）、チオ、Ｃ1−Ｃ4直鎖または分枝アルキルチオ、Ｃ6−Ｃ10アリールチオ、Ｃ7 −Ｃ14アラルキルチオ、−Ｓ−（ＣＨ2−）n−ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯ2Ｈで置換され
得；ここで、このアリール基環炭素はさらに、直鎖または分枝Ｃ1−Ｃ4アルキル
によって置換され得；Ｒ3およびＲ4は、水素、Ｃ1−Ｃ4直鎖または分枝アルキル
、例えば、メチル、エチル、またはＣ7−Ｃ14アラルキル（例えば、ベンジル） である。
【０２０５】 構造３または４を有するＭＤＰ−結合ホーミング分子において、炭素は、好ま
しくは（Ｒ）または（ＲＳ）立体配置のＲ1に、より好ましくは（Ｒ）に結合さ れ、そしてＲ2に結合した炭素は、（Ｒ）、（ＲＳ）または（Ｓ）立体配置、好 ましくは（ＲＳ）または（Ｓ）であり、そしてＲ5が存在する場合、その二重結 合は好ましくはＺ立体配置にある。当業者は、構造３に基づくＭＤＰ−結合ホー
ミング分子が、無機または有機の酸および塩基に由来する塩の形態において使用
され得ることを理解する。
【０２０６】 構造３または構造４を有するＭＤＰ−結合ホーミング分子を調製する方法は、
当該分野において周知である。例えば、Ｐａｒｓｏｎｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ２３：１１０７〜１１１５（１１９１）
；および米国特許第５，１４５，９９０号を参照のこと。これらのそれぞれは、
本明細書中において参考として援用される。
【０２０７】 当該分野で公知の他の種々のＭＤＰ−結合ホーミング分子はまた、本発明の方
法に従って、遺伝子または薬剤を選択的に肺内皮に指向させるために有用であり
得る。このようなＭＤＰ−結合ホーミング分子は、Ｋａｈａｎら、米国特許第４
，６１６，０３８；Ａｓｈｔｏｎら、米国特許第４，４０６，９０２号；Ｐａｒ
ｓｏｎｓら、米国特許第５．１４５，９９０号；Ｐａｒｓｏｎｓら、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ２３：１１０７〜１１１５（１９９１）；
Ｕｃｈｉｄａら、米国特許第５，０６１，７３０号；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、Ｊ
．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ＸＬＩＩＩ：２８１〜２８５（１９９０）；および
Ｔａｋａｓｅら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ＸＬＩＩＩ：３８〜４２（１９
９０）に記載される分子を含み、これらの各々は本明細書中で参考として援用さ
れる。
【０２０８】 転移性の細胞は、細胞接着分子のレパートリーの変更を示し、これは、原発性
腫瘍からの逸脱、細胞外マトリックスの接着および突出、ならびに微小血管系へ
の侵入を可能にする。大部分のこのような細胞は、通常肺中で、狭い毛細管の網
とのそれらの細胞の最初の衝突に際して、幾何学的および血流力学的な力によっ
て破壊される。肺への転移の頻度は単に腫瘍細胞塞栓の機械的な捕捉に起因して
いるが、特定の腫瘍細胞型は、特定の標的器官に転移することを好むことが長期
にわたって観察されてきた。
【０２０９】 いくつかの系統の証拠は、転移の標的器官の選択が、血液に由来する癌細胞と
その標的器官の内皮との間の特異的な相互作用によって媒介されることを示す（
Ａｌｂｅｌｄａ，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６８：４〜１７（１９９３）；Ａｕｅ
ｒｂａｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：１４９２〜１４９６（１９８７）
；Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：３９４〜３９９（１９９１
）、これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）。肺においては、２
つの血管のレセプターが転移細胞の接着を媒介することが見出されている。Ｌｕ
ＥＣＡＭ−１は、塩素チャネルと相同な配列を有する内皮表面タンパク質であり
、悪性のメラノーマ細胞の肺内皮への接着を媒介する（Ｅｌｂｌｅら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２７８５３〜２７８６１（１９９７）、これは、本明
細書中で参考として援用される）。さらに、プロテアーゼである、肺内皮ジペプ
チジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ ＩＶ／ＣＤ ２６）は、転移性の乳癌細胞お
よび前立腺癌細胞の肺へのホーミングを促進する（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２１：１４２３〜１４３２（１９９３）、これは、本明細書
中で参考として援用される）。転移細胞の表面に存在するフィブロネクチンは、
乳癌細胞の肺血管へのＤＰＰ ＩＶ依存性ホーミングのためのリガンドであるこ
とが示された（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２４２０７〜２
４２１５（１９９８）、これは、本明細書中で参考として援用される）。これら
の結果は、器官選択的ホーミングが、古典的な細胞接着分子および他の分子によ
って媒介され得ることを示す。
【０２１０】 本明細書中で開示されるように、インビボでのＧＦＥ−１（配列番号１）の肺
内皮への選択的ホーミングは、細胞表面プロテアーゼであるＭＤＰによって媒介
される。本明細書中でさらに開示されるように、ＧＦＥ−１（配列番号１）の投
与は、マウスにおける２つのメラノーマ細胞系統（ヒトＣ８１６１およびマウス
Ｂ１６）の実験的肺転移を阻害し得る。これは、ＧＦＥ−１（配列番号１）が、
同じレセプターに結合することについて腫瘍細胞を転移させることと競合し得る
ことを実証する（図８を参照のこと）。これらの結果は、ＭＤＰが肺血管におい
て腫瘍細胞を転移させるためのレセプターをして働くこと、およびＭＤＰ−結合
ホーミング分子が、肺転移の固着を減少させ得るか、または妨害し得ることを示
す。
【０２１１】 従って、本発明は、癌を有する患者に膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ）−結合ホー
ミング分子を投与することによって、その患者における肺転移を減少させるか、
または妨害する方法を提供する。一般に肺に拡散した原発性腫瘍は、乳癌、結腸
直腸癌、肺癌、精巣癌、膵臓癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、腎細胞癌、および前立
腺癌、骨原性肉腫、軟部組織肉腫およびメラノーマを含む（Ｓｍｉｔｈ、Ｓｅｍ
ｉｎａｒｓ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｎｕｒｓ、１４：１７８〜１８６（１９８８）
、これは、本明細書中で参考として援用される）。本発明の方法は、例えば、乳
癌、腎臓癌、メラノーマ、膀胱癌、子宮頸部癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌
、または肺癌の肺転移を減少または妨害するために使用され得る。
【０２１２】 本明細書中で使用される場合、用語「転移」は、細胞が増殖性の病巣を形成後
、１つの部位から、直接的にその部位と連絡していない別の部位への悪性細胞の
移動を意味する。従って、転移細胞は、原発性腫瘍から剥離するようになり、身
体の他の部分に移動し、そして別個の腫瘍の塊として増殖する。当業者は、悪性
細胞が、器官内の第１の部位から同じ器官内の第２の部位に局所的に移動し得る
か、または身体内の異なる器官に離れて移動し得ることを理解する。さらに、転
移の悪性細胞は、それ自体がさらなる転移を生じ得る。
【０２１３】 用語「肺転移」は、本明細書中で使用される場合、細胞が肺の中で増殖性の病
巣を形成後、第１の部位とは直接的には連絡していない肺の中の１つ以上の部位
への悪性細胞の移動をいう。肺の中で生じる癌細胞の剥離した塊は、肺「転移」
または二次腫瘍と呼ばれる。肺転移は、種々の原発性腫瘍から生じ得、これは、
それらが一般的に組織学的に類似するものである。例えば、乳癌、腎臓癌、およ
びメラノーマは、しばしば肺に転移する。さらに、膀胱癌、子宮頸部癌、卵巣癌
、および前立腺癌は肺に転移し、より少ない頻度では、結腸直腸癌、または原発
性肺癌は、肺における１つ以上の第２の部位に転移する。
【０２１４】 用語「減少するかまたは妨害する」は、肺転移に関連して本明細書中で使用さ
れる場合、肺転移の速度または程度が減少されることを意味する。従って、肺転
移は、肺転移の発生が完全に防止されるか、もしくは顕著に遅延された場合に減
少または妨害されるか；または肺転移の大きさもしくは数が顕著に減少した場合
に、減少または妨害される。当業者は、肺転移の発生の遅延または肺転移の大き
さもしくは数の減少が、本発明の方法に従って、ＭＤＰ−結合ホーミング分子を
用いて処置していない１以上のコントロール被験体における肺転移の速度または
程度と比較して、測定されることを理解する。
【０２１５】 さらに、検出可能な癌を有さない被験体は、将来肺転移が起こることを減少ま
たは防止するために、ＭＤＰ−結合ホーミング分子を用いて予防的に処置され得
る。このようは被験体は、例えば、癌を有することが疑われ得るか、または家族
が癌の病歴を有し得る。
【０２１６】 上記に示したように、ＭＤＰ−結合ホーミング分子は、肺内皮に選択的なホー
ミングを示し、そして部分的には、膜ジペプチダーゼに対して特異的結合を示す
ことによって特徴付けられる。肺転移を減少または妨害するうえで有用なＭＤＰ
−結合ホーミング分子は、本明細書中上記に記載したように、ＭＤＰへの特異的
結合によって容易に同定され得る。所望の場合、さらなるＭＤＰ−結合ホーミン
グ分子はまた、公知のＭＤＰ−結合ペプチド（例えば、ＧＦＥ−１（配列番号１
））または細胞（例えば、Ｃ８１６１細胞）の膜ジペプチダーゼへの結合を競合
的に阻害する能力によって同定され得る。
【０２１７】 １つの実施態様において、肺転移を減少または妨害するうえで有用なＭＤＰ−
結合ホーミング分子は、配列Ｘ1−Ｇ−Ｆ−Ｅ−Ｘ2（配列番号１７）を含む肺ホ
ーミングペプチドである。ここで、Ｘ1およびＸ2のそれぞれは、１〜１０の独立
して選択されるアミノ酸であり、例えば、配列ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配
列番号１）またはＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２）を含むペプチドである。この
ようなＭＤＰ−結合ホーミング分子は、例えば、ペプチドＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰ
ＥＲＣ（配列番号１）またはＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２）であり得る。配列
Ｘ1−Ｇ−Ｆ−Ｅ−Ｘ2（配列番号１７）を含むさらなるＭＤＰ−結合ホーミング
分子（ここで、Ｘ1およびＸ2のそれぞれは、１〜１０の独立して選択されるアミ
ノ酸である）は、以下に記載するように、例えば、不変の残基としてモチーフＧ
ＦＥを含むコンビナトリアルペプチドライブラリーをスクリーニングすることに
よって同定され得る。
【０２１８】 別の実施態様において、ＭＤＰ−結合ホーミング分子は、膜ジペプチダーゼイ
ンヒビターである。本明細書中で使用される場合、用語「膜ジペプチダーゼイン
ヒビター」は、「ＭＤＰインヒビター」と同義語であり、そして膜ジペプチダー
ゼの酵素活性を選択的に減少させる有機分子を意味する。一般的に、ＭＤＰイン
ヒビターは、ＭＤＰの活性部位に結合する分子である。ＭＤＰインヒビターは、
薬物；ペプチド；修飾ペプチドもしくはペプチド模倣物；タンパク質またはタン
パク質フラグメント；核酸分子（例えばリボ核酸もしくはデオキシリボ核酸）；
オリゴサッカリド；脂質；糖脂質；またはリポタンパク質のような有機分子であ
り得る。本明細書中に開示される例示的なＭＤＰインヒビターは、ＣＧＦＥＣＶ
ＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）およびシラスタチンである。
【０２１９】 用語「選択的なインヒビター」は、ＭＤＰインヒビターに関連して本明細書中
で使用される場合、インヒビターが、他のプロテアーゼのような関連するが異な
る酵素と比較した場合、ＭＤＰ酵素に対して選択的な様式でＭＤＰ活性を減少さ
せることを意味する。従って、ＭＤＰインヒビターは、例えば、亜鉛メタロプロ
テアーゼの非特異的インヒビターとは異なる。従って、ＭＤＰインヒビターは、
ＭＤＰ活性を選択的に減少させ得るが、例えば、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ
の活性にはほとんど効果を有さないか、または全く効果を有さない。
【０２２０】 ＭＤＰ酵素活性を測定するためのアッセイは、当該分野で公知である。ＭＤＰ
は、Ｎ−末端アミノ酸がＬ−立体配置にあり、かつブロックされていないジペプ
チド基質を切断する。Ｃ−末端アミノ酸は、Ｌ−またはＤ−立体配置のいずれか
にあり、この酵素は、Ｄ−立体配置のＣ−末端残基を有する基質をより迅速に加
水分解する。ＭＤＰ活性は、例えば、グリシル−Ｄ−フェニルアラニン（Ｇｌｙ
−Ｄ−Ｐｈｅ）を基質として使用してアッセイされ得る（Ｋｅｙｎａｎら、前出
、１９９６；Ｐａｒｓｏｎｓら、前出、１９９１）。ＭＤＰ酵素活性のための便
利な特異的蛍光測定アッセイは、基質としてＧｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅを使用し、そし
て遊離したＤ−ＰｈｅとのＤ−アミノ酸オキシダーゼの引き続く反応を使用する
（例えば、実施例ＩＶＥを参照のこと；また、ＨｅｙｗｏｏｄおよびＨｏｏｐｅ
ｒ、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２６：１０〜１４（１９９５）を参照の
こと、これは、本明細書中で参考として援用される）。
【０２２１】 膜ジペプチダーゼインヒビターは、天然のＭＤＰ基質に対する構造的な相同性
を示す分子であり得る。例えば、γ−グルタミルトランスペプチダーゼによって
、トリペプチドグルタチオンを切断して、グルタメートおよびシステイニルグリ
シン（Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）を形成した後、ジペプチドＣｙｓ−Ｇｌｙは、ジペプチ
ドのみを切断するＭＤＰにより認識され、そして切断される。グルタチオンのア
ミノ酸配列は、ＧＦＥ−１（配列暗号１）のＮ−末端部分と類似しており、ここ
で最初の２つのアミノ酸は、Ｃｙｓ−Ｇｌｙである。図７に示すように、ＧＦＥ
−１（配列番号１）は、用量依存性の様式でＧｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ基質の加水分解
を阻害し、これは、ＧＦＥを含むペプチド（例えば、ＧＦＥ−１（配列番号１）
）が、ＭＤＰインヒビターであり得ることを示す。これらの結果はさらに、ＭＤ
Ｐインヒビターは、天然に存在するＭＤＰ基質に構造的に類似し得ることを示す
。
【０２２２】 種々のＭＤＰインヒビターは、当該分野で公知である。例えば、ＭＤＰインヒ
ビターは、本明細書中上記にＭＤＰ−結合ホーミング分子（例えば、構造１、構
造２、構造３、または構造４を有するＭＤＰ−結合分子）であり得る。
【０２２３】 本発明において有用なＭＤＰインヒビターは、例えば、膜ジペプチダーゼに対
して、約１０-4Ｍ〜約１０-12ＭのＫｉを有し得る。例えば、配列Ｘ1−Ｇ−Ｆ−
Ｅ−Ｘ2（配列暗号１７）を含むＭＤＰインヒビター（ここで、Ｘ1およびＸ2の 各々は、１〜１０の独立して選択されるアミノ酸である）は、例えば、膜ジペプ
チダーゼに対して、約２×１０-5Ｍ〜１０-7Ｍ、例えば、約１０-6〜１０-7Ｍの
Ｋｉを有し得る。
【０２２４】 本発明において有用なＭＤＰインヒビターは、例えば、ＭＤＰに対して１００
０ｎＭ以下のＫｉを示し得る。肺転移を減少するかまたは妨害する際に有用なＭ
ＤＰインヒビターはまた、例えば、ＭＤＰに対して１００ｎＭ以下のＫｉ、また
は１ｎＭ以下のＫｉを示し得る。例えば、構造３または構造４を有するＭＤＰイ
ンヒビターは、例えば、約０．５ｎＭ〜１０ｎＭのＫｉを有する強固に結合する
インヒビターであり得る。従って、構造３または構造４を有するＭＤＰインヒビ
ターは、癌を有する被験体にＭＤＰインヒビターを投与することによって肺転移
を減少するかまたは妨害するための本発明の方法において特に有用であり得る。
【０２２５】 別の好ましい実施態様において、ＭＤＰインヒビターは、構造１を含み、ここ
でＲ2およびＲ3は、それぞれ３〜１０および１〜１５の炭素原子の範囲の炭化水
素ラジカルである；これらのＲ2またはＲ3炭化水素鎖のいずれの１つにおいても
、１〜６の水素が、ハロゲンによって置換され得るか、または非末端メチレンが
、酸素もしくはイオウで置換され得、これらには後者の酸化型が含まれる；さら
に、Ｒ3における末端水素はまた、ヒドロキシルまたはチオールによって置換さ れ得、これは、アシル化され得るか、またはカルバモイル化され得る；あるいは
、水素は、アミノで置換され得、これは、アシルアミノ、ウレイド、アミジノ、
グアニジノ（ｑｕａｎｉｄｉｎｏ）、またはアルキル、あるいは置換されたアミ
ノ基（４級窒素基を含む）において誘導体化され得；あるいはこれらはカルボキ
シル基、ホスホン酸基、またはスルホン酸基のような酸性基、またはそのエステ
ルもしくはそのアミド、またはシアノ；あるいはその組み合わせ（例えば、末端
アミノ基）によって置換され得；そしてＲ1は、水素または低級アルキル（Ｃ1-6 ）またはジアルキルアミノアルキル、あるいは薬学的に受容可能なカチオンであ
る。肺転移を減少するかまたは妨害するためのこのようなＭＤＰインヒビターは
、例えば、７−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２
−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−ヘプテン酸（シラスタチンと
してもまた公知）であり得る。
【０２２６】 ＭＤＰインヒビターは、例えば、構造１を有する化合物であり得、ここでＲ2 は、カルボニルに隣接する炭素が３級ではあり得ないという限定を有する、分枝
アルキルまたはシクロアルキルである。
【０２２７】 例えば、ＭＤＰインヒビターはまた、Ｒ2が、カルボニルに隣接する炭素が三 級ではありえないという制限を有する分枝アルキルまたはシクロアルキルであり
、そしてＲ3が、ｎ−アルキル（１−９炭素）または４級の窒素、アミン誘導体 またはアミノ酸誘導基である末端置換基を有するｎ−アルキル（１−９炭素）で
ある構造１を有する化合物であり得る。例えば、ＭＤＰインヒビターは、Ｒ2が ２，２−ジメチルシクロプロピルまたは２，２−ジクロロシクロプロピルであり
、そしてＲ3は、末端置換基を有さないかまたはトリメチルアンモニウム、アミ ジノ、グアニジノもしくは２−アミノ−２−カルボエチルチオである末端置換基
を有する３〜７の炭素原子の炭化水素鎖である構造１を有する化合物であり得る
。
【０２２８】 本発明において有用な構造１を有する模範的なＭＤＰインヒビターとしては、
以下が挙げられる：Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド
）−８−トリメチル水酸化アンモニウム−２−オクテン酸内部塩；Ｚ−２−（２
，２−ジクロロシクロプロパンカルボキサミド）−８−トリメチル水酸化アンモ
ニウム−２−オクテン酸内部塩；Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカ
ルボキサミド）−８−グアニジノ−２−オクテン酸；Ｚ−２−（２，２−ジメチ
ルシクロプロパンカルボキサミド）−８−グアニジノ−２−オクテン酸；Ｚ−２
−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−ウレイド−２−オ
クテン酸；Ｚ−８−（１−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２
，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸；Ｚ−２−（
２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸（ラセミ形
態および右旋性形態）；Ｚ−２−（２，２−ジクロロシクロプロパンカルボキサ
ミド）−２−オクテン酸；７−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）
−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−ヘプテン酸；
および６−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジ
メチルシクロプロパンカルボキシアミド）−２−ヘキセン酸。
【０２２９】 本発明はまた、ＭＤＰの負の調節薬剤を被験体に投与することによって、癌を
有する被験体において肺転移を減少するかまたは予防する方法を提供する。本発
明に役立つＭＤＰの負の調節薬剤は、例えば、可溶性ＭＤＰポリペプチドまたは
ＭＤＰと選択的に反応する抗体であり得る。
【０２３０】 さらに本明細書中で提供されるものは、ＭＤＰの負の調節薬剤を被験体に投与
することによって被験体内の肺内皮への細胞ホーミングを減少するかまたは予防
する方法である。肺内皮への細胞ホーミングを減少するか予防するのに有用なＭ
ＤＰの負の調節薬剤は、例えば、可溶性ＭＤＰポリペプチドか、またはＭＤＰと
選択的に反応する抗体であり得る。
【０２３１】 本明細書中で用いられる場合、用語「ＭＤＰの負の調節薬剤」とは、直接的ま
たは間接的にＭＤＰの発現または活性を選択的に減少する有機分子を意味する。
例えば、このようなＭＤＰの負の調節薬剤は以下であり得る：薬物；リボ核酸分
子およびデオキシリボ核酸分子を含む核酸分子；ペプチド；改変体または改変化
ペプチドもしくはペプチド模倣物；タンパク質またはそれらのフラグメント；抗
体またはそれらのフラグメント；オリゴ糖類；脂質；糖脂質；またはリポタンパ
ク質。
【０２３２】 ＭＤＰの負の調節薬剤が、ＭＤＰの発現または活性を選択的に減少するために
種々の機構によって作用し得ることを当業者は理解する。ＭＤＰの負の調節薬剤
は、例えば、肺内皮において発現された機能的ＭＤＰの量を減少するように作用
する有機分子であり得る。このような薬剤は、ＭＤＰの転写または翻訳を選択的
に減少し得て、そして、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＭＤＰの発
現を負に調節する転写因子、またはこのような転写因子をコードする核酸であり
得る。
【０２３３】 ＭＤＰの負の調節薬剤はまた、例えば、野生型の膜ジペプチダーゼと効率的に
競合し、転移細胞もしくは他の細胞が肺内皮におけるＭＤＰへ選択的にホーミン
グすることを減少するかまたは予防するＭＤＰのフラグメントであり得る。可溶
性の細胞外で発現される形態のＭＤＰ、またはＭＤＰの他の優性な負のフラグメ
ントは、本発明において有用なＭＤＰの負の調節薬剤であり得る。ＭＤＰ調節薬
剤はまた、ＭＤＰ模倣物であり得る。ＭＤＰ模倣物は、ＭＤＰまたはその下位区
分（ｓｕｂｐａｒｔ）と三次構造的相同性を共有するタンパク質または他の有機
分子であり、そしてＭＤＰ模倣物は、発現される場合、転移細胞またはリンパ球
のような他のホーミング細胞へ結合するために、内因性ＭＤＰと競合する。ＭＤ
Ｐ模倣物は、転移細胞と接触するＭＤＰの領域に構造的に共通点があり得；ＭＤ
Ｐ模倣物は、例えば、ＭＤＰの活性部位に構造的に共通点があり得る。
【０２３４】 １つの実施態様において、ＭＤＰの負の調節薬剤は、ＭＤＰと選択的に反応す
る抗体である。本明細書中で使用される場合、「ＭＤＰと選択的に反応する」抗
体とは、別の亜鉛金属プロテアーゼのような無関係のポリペプチドに対してより
も、膜ジペプチダーゼに対して実質的により高い親和性で結合する。用語「抗体
」は、その最も広範な意味では、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体
、ならびに少なくとも約１×１０5Ｍ-1の膜ジペプチダーゼに対する選択的親和 性を保持する抗体のポリペプチドフラグメントを含むように本明細書中で使用さ
れる。Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2およびＦｖフラグメントのような抗体フラグメン トは、膜ジペプチダーゼと選択的に反応し得、それ故に、本明細書中で定義され
る場合、用語抗体の意味の範囲内に含まれる。用語抗体は、本明細書中で使用さ
れる場合、膜ジペプチダーゼと選択的に反応する天然に存在する抗体、ならびに
キメラ抗体およびヒト化抗体のような天然に存在しない抗体ならびにフラグメン
トを含む。
【０２３５】 抗体を産生するための方法は、当該分野で慣用的である。上記のような天然の
供給源から調製され得るかまたは組換え的に産生され得る膜ジペプチダーゼある
いはそのフラグメント（例えば合成ペプチド）は、免疫原として用いられ得る。
非免疫原性フラグメントまたは合成ペプチドは、ハプテンをウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）のようなキャリ
ア分子と結合することによって、免疫原性にされ得る。さらに、種々の他のキャ
リア分子およびキャリア分子とハプテンを結合する方法は、例えば、本明細書中
で参考として援用されるＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８）に記載されるように当該
分野において周知である。キメラ抗体およびヒト化抗体のような天然に存在しな
い抗体を含む抗体はまた、固相ペプチド合成を用いて構築され得るか、組換え的
に生成され得るか、または例えば、本明細書中で参考として援用されるＢｏｒｒ
ｅｂａｅｃｋ（編）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（第２版）Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５
）によって記載されるような可変性の重鎖および可変性の軽鎖からなるコンビナ
トリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る。
【０２３６】 別の実施態様において、ＭＤＰの負の調節薬剤は、可溶性ＭＤＰポリペプチド
である。本明細書中で使用される場合、用語「可溶性ポリペプチド」とは、膜に
結合しないポリペプチドを意味する。本発明において有用な可溶性ＭＤＰポリペ
プチドは分泌され、したがって細胞外で発現される。
【０２３７】 本発明において有用な可溶性ＭＤＰポリペプチドは、例えば、ＧＰＩアンカー
の付加のために必要とされる１つ以上のＣ末端残基を欠失する短縮型または変異
型ＭＤＰポリペプチドであり得る（図９を参照のこと）。特定の短縮型または変
異型ＭＤＰ誘導体は可溶性であるかどうか決定するために、その誘導体は、例え
ば、ＣＯＳ細胞において発現され得、そしてトランスフェクトした細胞および上
清はその後、ＭＤＰ活性についてアッセイされ、ＭＤＰが膜に結合されるか、ま
たは可溶性であるかを決定され得る。
【０２３８】 本発明はまた、膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ）を１つ以上の分子と接触する工程
；およびこの分子の存在下でＭＤＰ活性を、コントロール値と比較して決定する
工程によって、肺転移を減少するかまたは予防する分子を同定する方法を提供す
る。ここで、この分子の存在下で減少したＭＤＰ活性は、この分子を肺転移を減
少するかまたは予防する分子と同定する。膜ジペプチダーゼは、例えば、実質的
に精製され得る。ＭＤＰ活性が、例えば、Ｇｌｙ−Ｄ−ＰｈｅからのＤ−Ｐｈｅ
の放出によって決定され得る。
【０２３９】 本発明の１つの実施態様において、肺転移を減少するかまたは予防する分子は
、膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ）を１つ以上の分子と接触する工程；この分子の存
在下でのＭＤＰ活性を、コントロール値と比較して決定する工程；この分子を、
癌を有する被験体に投与する工程；およびこの被験体における肺転移を、転移の
コントロールレベルと比較してアッセイする工程によって同定され得る。ここで
この分子の存在下で減少したＭＤＰ活性は、この分子を肺転移を減少するかまた
は予防する分子と同定する。
【０２４０】 以下の実施例は、本発明を例示することが意図されるが、本発明を限定するよ
うには意図されない。
【０２４１】 （実施例Ｉ インビボパニング） 本実施例は、ファージディスプレイライブラリーを調製し、そしてインビボパ
ニングを使用してライブラリーをスクリーニングし、選択された器官または組織
へホーミングするペプチドを発現するファージを同定する方法を示す。
【０２４２】 （Ａ．ファージライブラリーの調製） ファージディスプレイライブラリーを、Ｋｏｉｖｕｎｅｎら（前出、１９９５
；またＫｏｉｖｕｎｅｎら、前出、１９９４ｂを参照のこと）によって記載され
るように融合５ベクターを使用して構築した。ＣＸ6Ｃ（配列番号２６）、ＣＸ7 Ｃ（配列番号２４）、ＣＸ10Ｃ（配列番号３０）、およびＣＸ3ＣＸ3ＣＸ3Ｃ（ 配列番号２５）、Ｘ2ＣＸ4ＣＸ（配列番号２３）、およびＸ7（配列番号２９） と命名したペプチドをコードするライブラリーを調製した。ここで「Ｃ」はシス
テインを示し、そして「ＸN」は別々に選択したアミノ酸の所定の数を示す。こ れらのライブラリーは、少なくとも２つのシステイン残基がペプチド内に存在す
る場合、環状ペプチドを表し得る。
【０２４３】 規定したシステイン残基を含むライブリーを、「Ｃ」がコドンＴＧＴによって
コードされ、そして「ＸN」がＮＮＫによってコードされるように（ここで、「 Ｎ」はＡ、Ｃ、Ｇ，およびＴの等モル混合物であり、そしてここで「Ｋ」はＧお
よびＴの等モル混合物である）構築したオリゴヌクレオチドを使用して作製した
。従って、ＣＸ6Ｃ（配列番号２６）によって表されるペプチドを、配列ＴＧＴ （ＮＮＫ）6ＴＧＴ（配列番号３１）を有するオリゴヌクレオチドによって表し 得る。オリゴヌクレオチドを３サイクルのＰＣＲ増幅によって２本鎖にし、精製
し、そして、発現に際して、ペプチドが遺伝子ＩＩＩタンパク質のＮ末端に融合
タンパク質として存在するように融合５ベクター中に遺伝子ＩＩＩタンパク質を
コードする核酸に連結した。
【０２４４】 ベクターをＭＣ１０６１細胞へエレクトロポレーションによってトランスフェ
クトした。細菌を２０μｇ／ｍｌテトラサイクリンの存在下で２４時間培養し、
次いでファージをポリエチレングリコールを使用して２回沈澱させることによっ
て上清から回収した。各ライブラリーは、約１０12形質導入単位／ｍｌ（ＴＵ；
個々の組換えファージ）を含んだ。
【０２４５】 （Ｂ．ファージのインビボパニング） 肺および膵臓について、１０10 ＴＵを含むファージライブラリーの混合物を
、２００μｌ ＤＭＥＭで希釈し、そして麻酔したＢＡＬＢ／ｃマウス（２ヶ月
齢；Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ
）の尾静脈に注射した；ＡＶＥＲＴＩＮ （０．０１７ｍｌ／ｇ）を麻酔薬とし
て使用した（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、前出、１９９６
）。１〜４分後、マウスを液体窒素中で急速凍結した。あるいはファージの循環
の約５分後、このマウスを５〜１０ｍｌのＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ；Ｓｔ．Ｌｏｕ
ｉｓ ＭＯ）で心臓を通して灌流した。ファージを回収するために、灌流したマ
ウスからの器官、または急速凍結したマウスから部分的に解凍した器官を、回収
しそして重量を測定し、次いで１ｍｌ ＤＭＥＭ−ＰＩ（プロテアーゼインヒビ
ター（ＰＩ）；フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ；１ｍＭ）、ア
プロチニン（２０μｇ／ｍｌ）、ロイペプチン（１μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ
）中でホモジナイズした。
【０２４６】 器官サンプルを、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む氷冷ＤＭＥＭ−Ｐ
Ｉで３回洗浄し、次いで１ｍｌ Ｋ９１−ｋａｎ細菌とともに１時間直接的にイ
ンキュベートした。０．２μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む１０ｍｌのＮＺＹ
培地（ＮＺＹ／ｔｅｔ）を、細菌培養物に添加し、混合物を３７℃振盪機中で１
時間インキュベートし、次いで２００μｌアリコートを、４０μｇ／ｍｌテトラ
サイクリンを含む寒天プレート（ｔｅｔ／寒天）にプレートした。
【０２４７】 皮膚のインビボパニングのために、２ヶ月齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを、
毛による汚染を回避するために用いた。このマウスに、上に記載されるようにフ
ァージを静脈注射し、心臓を通した灌流後、皮膚を大きな切片で切り出し、そし
て皮下組織を上に向けて氷冷プレート上に置いた。この皮膚をメスでかき出し、
大部分の皮下組織を除去した。次いで皮膚を、以下に記載されるようにファージ
を回収するためにプロセス化した。
【０２４８】 網膜のインビボパニングのために、２ヶ月齢の雌のＳｉｍｏｎｓｏｎ Ａｌｂ
ｉｎｏ ラットを、マウスよりも大きな組織サンプルを提供するために用いた。
このラットを、フェノバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ体重）で麻酔し、そして深
い麻酔下の間に、ラットの腹腔を開腹し、そして１０10ＴＵのファージライブラ
リーを横隔膜を通じて心臓の左心室へ注射した。ファージの循環の２〜５分後、
目をとり出し、次いで７０％ＥｔＯＨで一回およびＰＢＳで一回洗浄した。角膜
および水晶体と共に前眼房をとり出し、そして網膜を残りの後眼房から剥がした
。組織を秤量し、プロテアーゼインヒビター（１ｍＭのＰＭＳＦ、２０μｇ／ｍ
ｌのアプロチニンおよび１μｇ／ｍｌのロイペプチン；全てＳＩＧＭＡ；Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ ＭＯから）を含む１ｍｌの氷冷ＤＭＥＭ中でシリンジバルブ（ｂｕ
ｌｂ）を用いてホモジナイズした。組織を１ｍｌのＤＭＥＭで３回洗浄し、そし
てファージを以下に記載されるように回収した。
【０２４９】 種々の器官または組織から回収したファージを含む約２５０〜３００の個々の
細菌コロニーを、５ｍｌのＮＺＹ／ｔｅｔ中にて１６時間増殖した。いくつかの
実験において、ファージを含む約１０００の個々の細菌を精選し、そしてファー
ジを２ｍｌのＮＺＹ／ｔｅｔ中で増幅するか、またはファージを含むプレート全
体をかき出し、プールし、大量に増殖し、そして注射のためにプロセシングした
。ファージを別々に培養した場合、この培養物をプールし、そしてファージを、
２回目のインビボパニングについて上に記載されるように、マウスまたはラット
へ注射した。いくつかの実験において、３回目または４回目のパニングを行った
。ファージＤＮＡを、得られた個々の細菌コロニーから精製し、そして選択され
たファージによって発現されたペプチドをコードするＤＮＡ配列を決定した（Ｋ
ｏｉｖｕｎｅｎら、前出、１９９４ｂを参照のこと）。
【０２５０】 （実施例２：選択された器官にホーミングするペプチドの特徴付け） この実施例は、器官または組織にホーミングする本発明のペプチドが、選択さ
れた器官または組織（ＲＥＳの成分を含む器官を含む）に選択的にホーミングす
ることを実証する。
【０２５１】 （Ａ．肺は、選択された器官である） ２回または３回、環状ＣＸ3ＣＸ3ＣＸ3Ｃ（配列番号２５）ファージディスプ レイライブラリーまたは環状ＣＸ6Ｃ（配列番号２６）ファージディスプレイラ イブラリーを注射したマウスのインビボパニングの後に、肺にホーミングする４
つのペプチドを同定した。ペプチド配列ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号
１；ＧＦＥ−１）およびＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２；ＧＦＥ−２）は、肺に
繰り返し出現し、そしてＣＸ6Ｃ（配列番号２６）ライブラリー由来の２つのペ プチド配列ＣＴＬＲＤＲＮＣ（配列番号１５）およびＣＩＧＥＶＥＶＣ（配列番
号１６）もまた、肺にホーミングすることが見出された（以下の表２を参照のこ
と）。
【０２５２】 同定された個々のペプチドの肺ホーミングの特異性を決定するために、ペプチ
ドをディスプレイするファージを個々に増幅し、同じ投入力価に希釈し、そして
マウスに投与した。投与後、コントロールの腎臓器官および脳器官を取り出し、
そして肺、腎臓および脳におけるファージのＴＵ数を決定した。図２に示された
結果は、ペプチド配列ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１；ＧＦＥ−１）
を有する１０×および３５×を超えるファージが、それぞれ、腎臓および脳より
、肺に結合したことを示す。図２はまた、ＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２；ＧＦ
Ｅ−２）が、１２×および２０×より高いレベルで、それぞれ、腎臓および脳よ
り、肺において見出されたことを示す。肺ホーミングペプチド、ＣＧＦＥＣＶＲ
ＱＣＰＥＲＣ（配列番号１；ＧＦＥ−１）、ＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２；Ｇ
ＦＥ−２）、ＣＴＬＲＤＲＮＣ（配列番号１５）およびＣＩＧＥＶＥＶＣ（配列
番号１６）は、非選択ファージに対して、肺において、それぞれ３５×、９×、
６×、および５×に富化される（図２を参照のこと）。従って、コントロールの
脳および腎臓と比較して、そして非選択ファージと比較して、肺に結合するファ
ージの実質的な富化が観察された。
【０２５３】 肺ホーミングペプチドに対する特異性もまた、ＧＳＴ融合ペプチドを用いた競
合実験によって決定した。ＧＦＥ−１（配列番号１）を同時投与したＧＳＴ−Ｇ
ＦＥ−１（配列番号１）融合ペプチドは、肺にホーミングするＧＦＥ−１（配列
番号１）を阻害した一方で、ＧＳＴは、ホーミングに対する効果を有さなかった
（図３Ａ）。さらに、ＧＳＴ−ＧＦＥ−１（配列番号１）のホーミングに対する
阻害効果は、用量依存性であり；５００μｇのＧＳＴ−ＧＦＥ−１（配列番号１
）融合タンパク質を注射した場合、７０％のホーミング阻害が生じた（図３Ｂ）
。ＧＳＴ−ＧＦＥ−２（配列番号２）のＧＦＥ−２（配列番号２）との同時注射
は、より少ない程度にホーミングを阻害し；５００μｇのＧＳＴ−ＧＦＥ−２（
配列番号２）融合タンパク質を注射した場合、３０％のホーミング阻害が生じた
（図３Ｂ）。興味深いことに、ＧＳＴ−ＧＦＥ−１（配列番号１）融合物は、肺
にホーミングするＧＦＥ−２（配列番号２）の阻害においてより有効であった；
５００μｇのＧＳＴ−ＧＦＥ−１（配列番号１）融合タンパク質を注射した場合
、６０％のＧＦＥ−２（配列番号２）ホーミング阻害が生じた（図３Ｂ）。しか
し、ＧＳＴ−ＧＦＥ−２（配列番号２）を同時注射した場合、ＧＦＥ−１（配列
番号１）ホーミングの阻害効果は全く観察されなかった。このことは、ＧＦＥ−
２（配列番号２）より、共有標的分子に対してより高い親和性を有するＧＦＥ−
１（配列番号１）によって説明され得る。
【０２５４】 さらなる肺ホーミングペプチドを獲得し、そしてそのアミノ酸配列を挿入のた
めに決定した（表２を参照のこと）。ＧＦＥモチーフを含むペプチドが優勢であ
った（表１を参照のこと；配列番号１および２）。肺に１回を超えて存在した他
のペプチドを、表２（以下）中でアスタリスクをつけて示し、そして残りのペプ
チドは、各々１回同定された。
【０２５５】 これらの結果は、ＧＦＥモチーフを含むペプチドの選択が、ＧＦＥ配列を有す
るペプチドをディスプレイするいくつかの独立したファージの選択的な結合を示
し、そして例えば、ファージ増幅に起因する人為的結果ではないことを示す。さ
らに、いくつかの場合、同じアミノ酸配列を有するペプチドを発現するファージ
は、異なる配列を有するオリゴヌクレオチドによってコードされ、従って、肺に
特定のファージがホーミングすることが、このファージで発現された特定のペプ
チドに起因することを確認した。
【０２５６】 これらの結果は、肺にホーミングするペプチド（ＲＥＳの成分を含む）を発現
するファージを同定するために、インビボパニングを使用して、ファージディス
プレイライブラリーをスクリーニングし得ることを実証する。
【０２５７】 （Ｂ．皮膚は選択された組織である） ２回または３回、環状ＣＸ3ＣＸ3ＣＸ3Ｃ（配列番号２５）ファージディスプ レイライブラリーを注射したマウスのインビボパニング後に、ペプチド配列ＣＶ
ＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）（これは、皮膚に繰り返し出現した）を
同定した（表１）。配列ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）の皮膚ホー
ミングの特異性を決定するために、ペプチドをディスプレイするファージを個々
に増幅し、同じ投入力価に希釈し、そしてマウスに投与した。投与後、コントロ
ールの腎臓器官および脳器官を取り出し、そして皮膚、腎臓および脳におけるフ
ァージのＴＵ数を決定した。
【０２５８】 結果は、ペプチド配列ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）をディスプ
レイする７×を超えるファージが、腎臓および脳より、皮膚に結合したことを示
す（図２；表１を参照のこと）。配列ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３
）は、非選択ファージに対して、皮膚において、７×に富化された（図２）。従
って、コントロールの脳および腎臓と比較して、そして非選択ファージと比較し
て、皮膚に結合するファージの実質的な富化が観察された。
【０２５９】 さらなる皮膚ホーミングペプチドを、環状ＣＸ3ＣＸ3ＣＸ3Ｃ（配列番号２５ ）ファージディスプレイライブラリーまたは環状ＣＸ10Ｃ（配列番号３０）ファ
ージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって得た；アミノ
酸配列を、以下の表５に示すように、挿入のために決定した。スクリーニングの
間に１回を超えて同定されたペプチドを、アスタリスクをつけて示す。例えば、
頭皮にホーミングした、回収したＣＸ3ＣＸ3ＣＸ3Ｃ（配列番号２５）ファージ の１４％は、配列ＣＶＤＶＣＣＤＧＣＰＶＣＣ（配列番号４３７）を有した。配
列ＲＶＰＬＳＧＤＶＥＨ（配列番号４３８）、ＬＲＶＭＳＦＴＳＧＱ（配列番号
４３９）、またはＲＦＳＶＧＳＬＦＧＳ（配列番号４４０）を有するファージは
、各々、頭皮にホーミングする、回収したＣＸ10Ｃ（配列番号３０）ファージの
１４％を構成した。尾部皮膚にホーミングすることに対するスクリーニングは、
回収したＣＸ3ＣＸ3ＣＸ3Ｃ（配列番号２５）ファージの１２％が、配列ＣＧＡ ＴＣＥＭＱＣＰＳＧＣ（配列番号４４１）を有したことを示した。
【０２６０】 皮膚ホーミングペプチドに対する特異性もまた、ＧＳＴ融合ペプチドを用いた
競合実験によって決定した。図３Ｂは、ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号
３）を同時投与したＧＳＴ−ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）融合ペ
プチドが、皮膚へのホーミングを阻害した一方で、ＧＳＴは、ホーミングに対す
る効果を全く有さなかったことを示す。５００μｇのＧＳＴ−ＣＶＡＬＣＲＥＡ
ＣＧＥＧＣ（配列番号３）融合タンパク質を注射した場合、ホーミングに対する
ＧＳＴ−ＧＦＥ−１の阻害効果は、約５５％であった（図３）。
【０２６１】 これらの結果は、皮膚にホーミングし、そしてこのようなホーミングが特異的
であるペプチドを発現するファージを同定するために、インビボパニングを使用
して、ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングし得ることを実証す
る。
【０２６２】 （Ｃ．膵臓は、選択された器官である） ２回または３回、環状ＣＸ7Ｃ（配列番号２４）ファージディスプレイライブ ラリーを注射したマウスのインビボパニングの後に、種々の膵臓ホーミングペプ
チドを同定した（表３）。特に、ペプチド配列ＳＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号４
）は、膵臓に繰り返し出現した。ＳＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号４）の特異性を
決定するために、この配列をディスプレイするファージを、個々に増幅し、同じ
投入力価に希釈し、そしてマウスに投与した。投与後、コントロールの脳器官を
取り出し、そして各膵臓におけるファージのＴＵ数を決定した。図２に示された
結果は、ペプチド配列ＳＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号４）をディスプレイする１
０×を超えるファージが、脳より膵臓に結合したことを示し、そしてさらなる実
験は、脳と比較して、膵臓において２０×まで富化されたことを示した（表１）
。さらに、ＳＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号４）は、非選択ファージと比較した場
合、膵臓への２２×のファージの富化を示した（図２を参照のこと）。従って、
コントロール組織（脳）と比較して、そして非選択ファージと比較して、膵臓に
結合するファージの実質的な富化が観察された。
【０２６３】 これらの結果は、インビボパニングを使用して、膵臓に選択的にホーミングす
る分子を同定し得ることを実証する。さらに、これらの結果は、インビボパニン
グが、同じペプチドをコードする独立したファージを同定することを示す。
【０２６４】 （Ｄ．網膜は、選択された組織である） 環状ＣＸ7Ｃ（配列番号２４）ファージディスプレイライブラリーを注射した ラットをインビボパニングに供し、３回行った後に、ペプチド配列ＣＳＣＦＲＤ
ＶＣＣ（配列番号５）およびＣＲＤＶＶＳＶＩＣ（配列番号６）を網膜において
同定した。組織サンプルのサイズが小さいため、単離したファージを正確に定量
できなかった。従って、これらのペプチドをディスプレイするファージの選択性
を、これらの配列をディスプレイするファージを個々に増幅し、そしてこのファ
ージを、コントロールファージｆｄＡＭＰＬＡＹ８８とともに、ラットに投与す
ることにより決定した。このｆｄ−アンピシリンファージは、同じ感染性を有す
るという点で、ｆｄ−テトラサイクリン（融合５型（ｆｕｓｅ ５−ｂａｓｅｄ
））に類似である。
【０２６５】 等量のＣＳＣＦＲＤＶＣＣ（配列番号５）またはＣＲＤＶＶＳＶＩＣ（配列番
号６）およびｆｄＡＭＰＬＡＹ８８ファージをラットに注射した。投与後、網膜
へのホーミングを、網膜から回収したテトラサイクリンプレート上で選択したフ
ァージのＴＵ数、およびアンピシリンプレート上でのｆｄＡＭＰＬＡＹ８８のＴ
Ｕ数を比較することによって評価した。
【０２６６】 結果は、コントロールのｆｄＡＭＰＬＡＹ８８ファージと比較して、網膜にお
いてＣＳＣＦＲＤＶＣＣ（配列番号５）が３×の富化を示し、そしてＣＲＤＶＶ
ＳＶＩＣ（配列番号６）が２×の富化を示したことを示した。従って、コントロ
ールファージと比較して、網膜に結合するファージの実質的な富化が観察された
。
【０２６７】 さらなる網膜ホーミングペプチドを獲得し、そしてそのアミノ酸配列を挿入の
ために決定した（以下の表６）。１回を超えて出現したペプチドを示す。特に、
ＲＤＶトリペプチドモチーフは、いくつかの異なる配列状況において存在し、こ
のことは、このペプチドをコードする核酸が、多くの独立したファージに由来す
ることを示した。
【０２６８】 これらの結果は、ＲＤＶモチーフを含むペプチドの選択が、ＲＤＶ配列を有す
るペプチドをディスプレイするいくつかの独立したファージの選択的な結合を示
し、そして例えば、ファージ増幅に起因する人為的結果ではないことを示す。さ
らに、いくつかの場合で、同じアミノ酸配列を有するペプチドを発現するファー
ジは、異なる配列を有するオリゴヌクレオチドによってコードされ、従って、網
膜に特定のファージがホーミングすることが、このファージで発現された特定の
ペプチドに起因することを確認した。
【０２６９】 これらの結果は、インビボパニング方法が、同定するライブラリー（例えば、
選択された器官または組織（ＲＥＳの成分を含む器官および組織を含む）にホー
ミングするペプチドを発現するファージ）をスクリーニングするために、一般に
適用可能な方法であることをさらに実証する。データベース検索は、内皮細胞レ
セプターについての公知のリガンドに対する、膵臓、肺、皮膚または網膜にホー
ミングするペプチドの有意な相同性を全く示さなかった。
【０２７０】 （実施例３：肺、膵臓および皮膚のホーミングペプチドの免疫組織学的分析） この実施例は、肺、膵臓および皮膚のホーミング分子の所在を免疫組織学的試
験を用いて実証する。
【０２７１】 ホーミングペプチドをディスプレイするファージを、肺、膵臓または皮膚のホ
ーミングペプチドを発現するファージ（「ペプチドファージ」）をマウスに投与
して５分後に得た組織切片を免疫染色することによって、肺、膵臓および皮膚に
おいて検出した。ペプチド−ファージの投与後、マウスを上記のように取り扱い
、そして種々の器官（肺、膵臓および皮膚を含む）を取り出し、そしてブワン（
Ｂｏｕｉｎ’ｓ）溶液（Ｓｉｇｍａ）中で固定した。組織切片を調製し、そして
抗Ｍ１３（ファージ）抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ；米国特許第
５，６２２，６９９号、前出、１９９７；ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓ
ｌａｈｔｉ、前出、１９９６を参照のこと）と反応させた。製造業者の指示に従
って、ペルオキシダーゼ結合体化２次抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて、結合した抗
Ｍ１３抗体の可視化を行った。
【０２７２】 肺ホーミングペプチドであるＧＦＥ−１（配列番号１）をディスプレイするフ
ァージをマウスに静脈投与し、そして循環させて５分後に肺を単離し、そして上
記のように処理した。肺胞毛細管の免疫組織化学的染色を観察し、そしていずれ
の解剖部分に対する優勢も検出されなかった。しかし、気管壁およびいくつかの
大きな血管の染色では、存在しなかった。非選択ファージを注射したマウスは、
肺染色を示さず、そしてＧＦＥ−１（配列番号１）の注射後の膵臓および皮膚に
おいては、染色が観察されなかった。
【０２７３】 同様の実験を、膵臓ホーミングペプチドであるＳＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号
４）をディスプレイするファージを使用して、膵臓において行った。これらの実
験において、膵臓ならびにコントロール器官および組織の組織学的サンプル（肺
および皮膚を含む）を調製し、そして上記のように、免疫染色によって試験した
。結果は、外分泌膵臓の毛細管およびより大きな血管において染色が検出された
一方で、内分泌膵臓の染色は、（あるとしても）ほとんど検出されないことを示
した。再び、非選択ファージは膵臓を染色せず、ＳＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号
４）をディスプレイするファージを注射したマウスの肺および皮膚も染色が全く
観察されなかった。興味深いことに、子宮内の血管のいくらかの染色がＳＷＣＥ
ＰＧＷＣＲ（配列番号４）ペプチドについて観察された。さらに、ＳＷＣＥＰＧ
ＷＣＲ（配列番号４）をディスプレイするファージの静脈内注射後に、非選択フ
ァージと比較して、６×高いレベルでファージを子宮から回収した。従って、Ｓ
ＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号４）は、膵臓および子宮の両方にホーミングする。
【０２７４】 皮膚ホーミングペプチドＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）をディス
プレイするファージを用いて、皮膚において実験を行った。これらの実験におい
て、皮膚ならびにコントロールの器官および組織（肺および膵臓を含む）由来の
組織学的サンプルを調製し、そして上記のように免疫染色によって試験した。結
果は、皮下組織の血管において染色が示された一方で、真皮の染色は（あったと
しても）ほとんど検出されないことを示した。再び、非選択ファージは、これら
の血管を染色せず、そしてＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）をディス
プレイするファージを注射したマウスのコントロールの肺および膵臓において染
色は全く観察されなかった。
【０２７５】 全てのファージ（非選択ファージを含む）は、肝臓および脾臓の染色を引き起
こした。この結果は、以前記載されたＲＥＳの成分によるファージの捕捉と一致
する。
【０２７６】 これらの結果は、肺、膵臓および皮膚のホーミングペプチドは、肺、膵臓およ
び皮膚（特に血管系）に選択的にホーミングすることを実証する。さらに、これ
らの結果は、器官および組織は、特定の領域（おそらく、器官または組織内の標
的分子の異なる発現を反映する）内での染色パターンの差異を示し得ることを示
す。免疫組織化学的分析は、肺、膵臓および皮膚のホーミングペプチドを発現す
るファージの所在および分布を同定するための簡便なアッセイを提供する。
【０２７７】 （実施例ＩＶ：ＧＦＥ−１肺ホーミングペプチドについてのレセプターは、膜
ジペプチダーゼである） 本実施例は、ＧＦＥ−１（配列番号１）のようなペプチドを含む「ＧＦＥ」に
ついてのレセプターが、膜ジペプチダーゼであることを実証する。本実施例は、
さらにＧＦＥ−１（配列番号１）が結合し、そして膜ジペプチダーゼの活性を阻
害することを実証する。
【０２７８】 （Ａ．ＧＦＥ−１ファージは、肺始原細胞に選択的に結合する） 上述のように、ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１；ＧＦＥ−１）ファ
ージは、インビボで注射した場合、マウスの肺血管系に結合する。肺始原細胞に
対するファージ結合アッセイを行ない、インビボで、肺組織に結合するＣＧＦＥ
ＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１；ＧＦＥ−１）ファージの特異性が、インビト
ロにおいて再構成され得るかどうかを決定した。
【０２７９】 始原細胞へのファージの結合は、以下のように行なった。簡潔には、Ｂａｌｂ
／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）を、Ｇａｒｄｎｅ
ｒら、Ｌａｂ．Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉ．４５：１９９−２０４（１９９５）（こ
れは、本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、０．０１７ｍ
ｌ／ｇのアベルチンを用いて麻酔した。深い麻酔の下で、マウスは、心臓を通し
て１０ｍｌのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ；Ｓａｎｔａ Ａｎａ、ＣＡ）で灌流した。次いで、肺、腎臓およ
び脳を採取し、細かく刻み、０．５％ＢＳＡ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ；Ｐｕｒｃｈａ
ｓｅ、ＮＹ）および０．５μｇ／ｍｌのコラゲナーゼＶ（ＳＩＧＭＡ）を含む２
ｍｌのＤＭＥＭ中に置き、そして３７℃で２５分間インキュベートした。コラゲ
ナーゼでの処理に続いて、組織を７０μＭの細孔の細胞濾過機（Ｂｅｃｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅ、ＮＪ）を強制的に通した。
濾過した細胞を、１０％の血清を補給した１０ｍｌのＤＭＥＭを用いて１回洗浄
した。結合アッセイに使用したファージ粒子を、増幅および精製し、そしてファ
ージディスプレイされたインサートを、ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ、前出、１
９９３に記載されるように配列決定した。試験されるべき異なるファージの等し
い投入量を保証するために、ファージを、数回Ｋ９１Ｋａｎ細菌を使用して力価
決定した（ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ、前出、１９９３）。
【０２８０】 結合反応のために、１０9形質導入単位（ＴＵ）のファージを、１０％血清を 補給した１ｍｌのＤＭＥＭ中に５×１０6細胞でインキュベートした。結合を４ ℃で２時間やさしく攪拌しながら行なった。結合反応の後、細胞を１０％の血清
を補給した１ｍｌのＤＭＥＭで、室温にて４回、各回につき５〜１０分間洗浄し
た。細胞を遠心分離し、そして細胞ペレットを１００μｌのＤＭＥＭに再懸濁し
、そして新しいチューブに移した。細胞に結合したファージを、１ｍｌのＫ９１
Ｋａｎ細菌培養液（ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ、前出、１９９３）の添加によ
り採取し、続いて３０分間室温でインキュベートした。次いで、細菌を、０．２
μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを補給した１０ｍｌのＬＢ培養培地で希釈し、そ
してさらに３０分間室温でインキュベートした。細菌培養の段階希釈物を４０μ
ｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢプレートにプレートした。プレートを、
一晩３７℃でインキュベートした後、コロニーを計数した（形質導入単位、ＴＵ
）。
【０２８１】 インビトロにおける肺始原細胞に対するファージの結合アッセイの結果は、肺
始原細胞が、インサートを欠くｆｄ−ｔｅｔファージよりも約６０倍多くのＣＧ
ＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１；ＧＦＥ−１）ファージを結合することを
示した。腎臓細胞へのＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１；ＧＦＥ−１）
ファージの結合もまた、ｆｄ−ｔｅｔ結合よりも高かった（ｔ検定、ｐ＜０．０
２）が、この結合は、肺細胞に対するＧＦＥ−１（配列番号１）の結合よりもず
っと低かった。インビボ研究において、ＧＦＥ−１（配列番号１）のファージを
静脈内に注射した場合、腎臓に対する特異的なファージのホーミングは検出され
なかった。ＧＦＥ−１（配列番号１）ファージは、インビトロにおいて始原脳細
胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌ）に対して特異的な結合を示さなか
った。
【０２８２】 肺細胞に対するＧＦＥ−１（配列番号１）ファージの結合は、１５０μＭのＧ
ＦＥ−１（配列番号１）ペプチドの存在下でおよそ７０％阻害されたが、一方同
じ濃度のコントロールペプチドであるＧＲＧＥＳＰ（配列番号４４２）は、効果
を有さなかった。インサートを欠くｆｄ−ｔｅｔファージの非特異的結合は、Ｇ
ＦＥ−１（配列番号１）ペプチドまたはコントロールペプチドの存在により影響
されなかった。これらの結果は、肺内皮に対するＧＦＥ−１（配列番号１）ペプ
チド配列の選択的なインビボでの結合を全肺始原細胞に対するインビトロアッセ
イにおいて再構成し得ること、および全肺細胞抽出物が単離のために十分な量の
ＧＦＥ−１レセプターを含むことを実証する。
【０２８３】 （Ｂ．ＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチドは、５５ｋＤａの表面タンパク質と
結合する） ＧＦＥ−１（配列番号１）に結合する細胞表面分子のみを検出するために、マ
ウスの肺内皮表面タンパク質を、インビボでビオチン化し、そして全肺抽出物を
調製した。標識した抽出物を、最初にＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチドに対す
るアフィニティーカラムで分画し；続いて、カラムを洗浄し、そして結合タンパ
ク質を、ＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチド溶液で溶出した。
【０２８４】 インビボでの内皮細胞表面タンパク質のビオチン化を、以前にＤｅ Ｌａ Ｆ
ｕｅｎｔｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７２：Ｌ４６１−Ｌ４７０（１９
９７）（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、い
くつかの変更を伴って行なった。簡潔には、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、アベルチン
で麻酔し、そして０．５ｍｇ／ｍｌのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｒ
ｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を含む約１５ｍｌのＰＢＳで１０〜１５分間心
臓を通してゆっくりと灌流した。次いで、よく灌流した肺または脳のような制御
組織を、採取し、そして氷上で２０分間インキュベートした。次いで、この組織
をさらに以下に記載されるように抽出物を調製するためにホモジナイズした。
【０２８５】 抽出物の調製のために、マウスまたはラットの肺を、最初に細かく刻み、次い
で、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、２０μｇ／
ｍｌのアプロチニンおよび１μｇ／ｍｌのロイペプチンを含む１００ｍＭのＮ−
オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；Ｌａ Ｊｏｌｌ
ａ、ＣＡ）を含む最小溶容量（２．５ｍｌ／ｇの組織）の冷ＰＢＳ（ＰＢＳ／オ
クチルグルコシド）中で、Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｈｏｍｏｇｅｉｚｅｒ（Ｂｒｉｎ
ｋｍａｎ；Ｗｅｓｂｕｒｙ、ＮＹ）を用いてホモジナイズした。ホモジナイズし
た組織を、氷上で２時間インキュベートし、次いで、細胞の細片を取り除くため
に１２，０００×ｇで３０分間遠心分離した。プールした上清を、アフィニティ
ークロマトグラフィーの前にあらゆる細片を取り除いた。
【０２８６】 ＧＦＥ−１（配列番号１）アフィニティークロマトグラフィーを、ＲＧＤペプ
チドクロマトグラフィーによるインテグリンの単離のためにＰｙｔｅｌａらによ
り確立された一般的な原則に従って、行なった（Ｐｙｔｅｌａら、Ｃｅｌｌ ４
０：１９１−１９８（１９８５）；Ｐｙｔｅｌａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙ
ｍ．１４４：４７５−４８９（１９８７）、これらの各々は、本明細書中に参考
として援用される）。全ての工程を、４℃で行なった。簡潔には、ＧＦＥ−１（
配列番号１）またはコントロールペプチド（ＡｎａＳｐｅｃ；Ｓａｎ Ｊｏｓｅ
、ＣＡ）を、製造者の手引書（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｕｐｐｓ
ａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に従って、ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂに
結合させた。このマトリックスは、およそ２ｍｇ／ｍｌのペプチドを含有した。
２匹のマウス肺からのビオチン標識化抽出物を、カラム緩衝液（５０ｍＭのオク
チルグリコシドおよび１ｍＭＰＭＳＦを含むＰＢＳ）中で平衡化した５００μｌ
のアフィニティーマトリックスに添加した。この抽出物をカラムに添加し、そし
て素通りした画分を、９０分間の期間にわたって再添加した。次いで、このカラ
ムを２０容量のカラム緩衝液で洗浄した。合成ＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチ
ドでの溶出を、１ｍｇ／ｍｌのＧＦＥ−１ペプチド（配列番号１）を補充した２
倍量のカラム緩衝液を用いて、１時間以上カラムをゆっくりと洗浄することによ
り行なった。このカラムに結合した残りのタンパク質を、８Ｍの尿素で溶出した
。
【０２８７】 溶出物を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ １０，０００ ＭＷＣＯカラム（Ａｍｉｃｏ
ｎ；Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を用いて５倍に濃縮した。次いで、各溶出物のアリ
コートを、成形済みのポリアクリルアミド４〜１２％ゲル（Ｎｏｖｅｘ；Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ビオチン標識
化抽出物を用いて行なう実験のために、このタンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌ
ｉｐｏｒｅ；Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に転写し、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（
Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いてブロットし、そしてＥＣＬ化
学発光システム（ＮＥＮ；Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いて発色させた。
【０２８８】 図４に示したように（左のパネル）、５５ｋＤａのビオチン化タンパク質は、
ＧＦＥ−１（配列番号１）により選択的に溶出された。溶出の前に、カラムから
の洗浄物は、検出可能なビオチン化タンパク質を示さなかった；続いて、８Ｍの
尿素の添加が、カラム中に非特異的に保持されている多くのビオチン化タンパク
質を溶出した。コントロールペプチド（ＧＲＧＥＳＰ；配列番号４４２）カラム
に対して同じ手順で行なった後では、５５ｋＤａの範囲のタンパク質は、検出さ
れなかった（図４；右のパネル）。さらなるコントロールとして、インビボビオ
チン化脳細胞抽出物を、同じ条件下で、ＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチドカラ
ムを通して分画した；ＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチドカラムに特異的に結合
する、脳抽出物からのビオチン化タンパク質はなかった（データは示さず）。
【０２８９】 これらの結果は、ＧＦＥ−１ペプチド（配列番号１）が、５５ｋＤａの肺血管
表面タンパク質に特異的に結合することを示す。非還元条件下では、５５ｋＤａ
のタンパク質を１１０ｋＤａのバンドとして移動した（データ示さず）。従って
、これらの結果は、ＧＦＥレセプターが、ジスフィルド結合ホモ二量体であるこ
とをさらに示す。
【０２９０】 （Ｃ．５５ｋＤａのＧＦＥ−１（配列番号１）レセプターは、膜ジペプチダー
ゼである） ＧＦＥ−１（配列番号１）ファージは、循環中に注射した場合、ラットの肺血
管を選択的に標的し得る。マウス組織から入手し得るよりも大量の５５ｋＤａタ
ンパク質を精製するために、非ビオチン化抽出物を１００個の凍結ラット肺から
調製した（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ；Ｒｏｇｅｒｓ、ＡＲ
）。大規模な抽出物を、ＰＢＳ／オクチルグリコシドの最小量を有するペレット
の第２の抽出物の添加と共に、基本的には上記のように調製した。
【０２９１】 大規模な抽出物を、３ｍｌのアフィニティーマトリックスを用いて、上述のよ
うにＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチドアフィニティーカラム上で分画した。ク
マシーブルー染色により検出可能な５５ｋＤａのタンパク質を、配列番号１のＧ
ＦＥ−１ペプチドによりカラムから抽出した（データは示さず）。マウスの肺か
ら単離された５５ｋＤａの表面タンパク質と共に移動したこのタンパク質を、ト
リプシン消化に供し、そしてＦｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱ 四重極（ｑｕａｄｒｕ
ｐｏｌｅ）イオントラップ質量分析計上でマイクロキャピラリー逆相ＨＰＬＣ直
列質量分析（μＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）による、Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ
）での質量分析により、配列決定した。
【０２９２】 ５５ｋＤａタンパク質由来の２つのトリプシンペプチドである、ＹＰＤＬＩＡ
ＥＬＬＲ（配列番号４４４）およびＴＴＰＶＩＤＧＨＮＤＬＰＷＱＭＬＴＬＦＮ
ＮＱＬＲ（配列番号４４５）は、ミクロソームジペプチダーゼ、デヒドロペプチ
ダーゼ−１またはＭＤＰとしてもまた公知のラット膜ジペプチダーゼ（ＥＣ ３
．４．１３．１９）と完全な同一性を示した。いくつかの他のペプチド配列は、
サンプル中でラットＩｇＧの存在を示した。ＩｇＧでのサンプルの汚染は、この
分子量範囲で予期され、非灌流肺からの抽出物中に大量のＩｇＧを生じた。
【０２９３】 膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ）が、ＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチド結合タン
パク質であることを確認するために、５５ｋＤａタンパク質を膜ジペプチダーゼ
活性についてアッセイした。アフィニティークロマトグラフィー洗浄画分および
ＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチド溶出物（図４）からのサンプルを、特定のＭ
ＤＰ基質Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅの存在下でインキュベートし、そしてＤ−Ｐｈｅを
、ＨｅｙｗｏｏｄおよびＨｏｏｐｅｒ、前出、１９９５（Ｋｅｙｎａｎら、前出
、１９９６もまた参照のこと）に記載されるように正確に蛍光的に検出した。簡
潔には、サンプルを、まずＭＤＰ基質、Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ（１ｍＭ；ＳＩＧＭ
Ａ）とともに３７℃で３時間インキュベートした。次いで、放出されたＤ−Ｐｈ
ｅを、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（Ｉ型；ＳＩＧＭＡ）およびペルオキシダーゼ
（ＶＩ型；ＳＩＧＭＡ；ＨｅｙｗｏｏｄおよびＨｏｏｐｅｒ、前出、１９９５）
の存在下で、６，６’−ジヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３，３’−
二酢酸に変換した。蛍光を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙ
ｖａｌｅ、ＣＡ）からのｆｍａｘ蛍光マイクロプレートリーダーを使用して測定
した。
【０２９４】 図５は、上記（図４）のアフィニティークロマトグラフィー洗浄画分およびＧ
ＦＥ−１ペプチド溶出物からのサンプル中での蛍光化合物へのＤ−Ｐｈｅの変換
の時間経過を示す。洗浄画分は、蛍光の基準線レベルのみを示したが、ＧＦＥ−
１（配列番号１）ペプチド溶出物は、Ｄ−Ｐｈｅの時間依存的変換によって例示
したように高い膜ジペプチダーゼ活性を含んだ（図５参照のこと）。さらに、ラ
ットの肺抽出物から単離したＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチド溶出物もまた、
強いＭＤＰ活性を示した（データは示さず）。ＭＤＰ活性をまた、全肺抽出物に
おいても検出したが、ＧＦＥ−１ペプチド（配列番号１）溶出物（２００ｎｍｏ
ｌ Ｄ−Ｐｈｅ／ｍｉｎ／ｍｇ）についての比活性は、ラットの全肺抽出物（０
．３４ｎｍｏｌ Ｄ−Ｐｈｅ／ｍｉｎ／ｍｇ）についての比活性よりも約６００
倍高かった。
【０２９５】 （Ｄ．ＧＦＥ−１（配列番号１）およびＧＦＥ−２（配列番号２）ファージは
、ＭＤＰでトランスフェクトした細胞に結合する） 低レベルまたは検出できないレベルのＭＤＰ活性を有することが公知の、ＣＯ
Ｓ−１細胞株を広範に使用して、ＭＤＰの構造および機能を研究した（Ｋｅｙｎ
ａｎら、前出、１９９６；Ｋｅｙｎａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２６：４７
−５１（１９９７））。ＣＯＳ−１細胞をマウスＭＤＰでトランスフェクトし、
そして以下に記載するように、配列番号１および２への結合をアッセイするため
に使用した。
【０２９６】 ＣＯＳ−１細胞へのトランスフェクションのために、マウスＭＤＰ発現ベクタ
ーを以下のように調製した。全マウス肺ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡ精製カ
ラム（Ｑｉａｇｅｎ；Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ、ＣＡ）を使用して単離し、
そして逆転写酵素ならびにランダムヘキサマーおよびポリｄＴオリゴヌクレオチ
ドの混合物（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ；Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を用いる
第一鎖ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして使用した。マウスＭＤＰ ｃＤ
ＮＡ（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３０：１１８９−
１１９６（１９９５））を、以下のオリゴヌクレオチド対を使用してＰＣＲによ
り、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬからのＴａｑポリメラーゼを使用して、ｃＤＮＡプール
から増幅した：ＫｐｎＩアダプターを含む、ＣＣＧＣＴＧＧＴＡＣＣＧＣＡＧＡ
ＴＣＣＣＴＧＧＧＧＡＣＣＴＴＧ（配列番号４４６）ＸｂａＩアダプターを含む
、ＴＣＴＴＴＣＴＡＧＡＧＣＴＣＡＧＡＧＡＧＣＡＣＴＧＧＡＧＧＡＧ（配列番
号４４７）。増幅した１．３ｋｂのマウスＭＤＰ ｃＤＮＡを、ＫｐｎＩおよび
ＸｂａＩで消化し、そしてＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅ
ｒｌｙ、ＭＡ）からのＤＮＡ制限酵素およびＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、
ｐｃＤＮＡ３発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）
の同じ部位に挿入した。マウスＭＤＰｃＤＮＡの首尾よいクローニングを、ＤＮ
Ａ配列決定により確認した。ＣＯＳ−１細胞のトランスフェクションを、Ｑｉａ
ｇｅｎからのＳｕｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて、製造者により推奨
されるように行なった。
【０２９７】 ＭＤＰでトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞へのファージの結合を、以下の
ように決定した。簡潔には、１０7のＣＯＳ−１細胞を、１０μｇのＭＤＰ発現 ベクターか、またはベクターのみのいずれかでトランスフェクトした。４８時間
後、細胞をディッシュから穏やかにはがし、１回洗浄し、そして上述のファージ
結合アッセイまたは膜ジペプチダーゼ活性アッセイに供した。ファージ結合アッ
セイのために、ファージインプットの５×１０6細胞および１０10形質導入単位 （ＴＵ）を使用した。膜ジペプチダーゼ活性の測定のために、１０6細胞を、プ ロテアーゼインヒビターを含まない１００μｌのＰＢＳ／オクチルグリコシド中
に溶解した。抽出物の１０μｌのアリコートを使用して、ＭＤＰ活性を測定した
。
【０２９８】 図６Ａに示すように、マウスＭＤＰでトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞は
、偽トランスフェクト細胞よりも少なくとも１５倍高いＭＤＰ活性を示した。さ
らに、ＧＦＥ−１（配列番号１）ファージは、ＭＤＰでトランスフェクトしたＣ
ＯＳ−１細胞に結合した。図６Ｂに示すように、ＧＦＥ−１（配列番号１）ファ
ージは、偽トランスフェクト細胞よりも、ＭＤＰトランスフェクト細胞に４倍よ
り多く結合した。ＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチドの構造特性に類似した構造
特性を有するペプチドを提示する、ネガティブコントロールファージである、ｆ
ｄ−ｔｅｔファージおよび皮膚ホーミングファージ（ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧ
Ｃ；配列番号３）は、偽トランスフェクト細胞と比較した場合、ＭＤＰ発現細胞
への特異的な結合を示さなかった。さらに、図６Ｂは、ＧＦＥ−２（配列番号２
）ファージもまた、ＭＤＰトランスフェクト細胞に結合し；この結合は、上述の
インビボ肺ホーミングデータと同様に、ＧＦＥ−１（配列番号１）の結合よりも
弱かったことを示す。ＧＦＥ−１（配列番号１）ファージおよびＧＦＥ−２（配
列番号２）ファージの両方のＭＤＰトランスフェクト細胞への結合は、ＧＦＥ−
１ペプチドにより完全に阻害された（配列番号１；データ示さず）。これらの結
果は、ＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチドおよびＧＦＥ−２（配列番号２）ペプ
チドが、同じレセプターに結合することを示す。
【０２９９】 （Ｅ．ＧＦＥ−１（配列番号１）は、ＭＤＰ活性を阻害し得る） トリペプチドグルタチオンの代謝は、グルタミン酸およびシステニルグリシン
（Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）を形成するためのγ−グルタミルトランスペプチダーゼによ
るトリペプチドの切断を含む。ジペプチドＣｙｓ−Ｇｌｙは、実質的に認識され
、そしてＭＤＰによって切断され、これは、ジペプチドのみを切断する。グルタ
チオンのアミノ酸配列は、ＧＦＥ−１ペプチドのＮ末端部分、ＣＧＦＥＣＶＲＱ
ＣＰＥＲＣ（配列番号１）と類似しており、これは、Ｃｙｓ−Ｇｌｙである最初
の２つのＧＦＥ−１の第一のアミノ酸を有する。
【０３００】 ＧＦＥ−１（配列番号１）をＭＤＰによるＧｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅの加水分解を阻
害する能力についてアッセイした。Ｄ−Ｐｈｅの蛍光定量的検出を上記のように
実施した。図７は、ＧＦＥ−１（配列番号１）が用量依存的な様式でＧｌｙ−Ｄ
−Ｐｈｅ基質（０．５ｍＭ）の加水分解を阻害したことを示す。コントロールの
環状ペプチド（ＣＡＲＡＣ；配列番号４４３）は、この酵素を阻害しなかった。
【０３０１】 これらの結果は、ＧＦＥ−１（配列番号１）がＭＤＰ活性の拮抗阻害剤として
作用し得ることを示す。
【０３０２】 （実施例Ｖ：ＧＦＥ−１（配列番号１）は、肺転移を阻害する） この実施例は、ＧＦＥ−１ペプチド（配列番号１）がマウスにおける実験的な
肺転移を阻害し得ることを実証する。
【０３０３】 実験的な肺転移を、Ａｒａｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：３７７−３８０（
１９９８）およびＰａｓｑｕａｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１１：１１
９７−１２０３（これらの各々は、参考として本明細書中に援用される）に本質
的に記載されるように、Ｃ８１６１ヒト黒色腫細胞を使用して、マウスにおいて
誘導した。簡潔には、Ｃ８１６１細胞を７５％のコンフルエンスまで培養し、次
いで、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳで収集する。Ｃ８１６１癌細胞を雌ヌード
ＢＡＬＢ／ｃマウス（２ヶ月齢）の尾静脈中に、動物当たり１０5細胞の濃度で 注射した。２組の５匹のマウスをこの細胞のみ；２５０μｇのコントロールＣＡ
ＲＡＣペプチド（配列番号４４３）を有する細胞、または２５０μｇのＧＦＥ−
１ペプチド（配列番号１）を有する細胞で注射した。各注射は、２００μｌの総
容量であった。
【０３０４】 黒色腫細胞およびペプチド混合物のアリコートを一晩培養し、このペプチドが
腫瘍細胞の生存度に影響しないことを確認した。ＧＦＥ−１（配列番号１）ペプ
チドまたはＣＡＲＡＣ（配列番号４４３）ペプチドは、黒色腫細胞に対する毒性
を両方とも示さなかった（データを示さず）。
【０３０５】 マウスを注射後、５週間で屠殺し、そして肺を収集し、秤量した。図８に示す
ように、ＧＦＥ−１（配列番号１）ペプチドを投与されたマウスの肺重量は、黒
色腫細胞単独（「ビヒクル」）またはコントロールペプチドＣＡＲＡＣ（配列番
号４４３、（「コントロールペプチド」））を有する黒色腫細胞を投与されたマ
ウスにおいて認められる肺重量より有意に少なかった。これらの結果は、ＧＦＥ
−１が、ヒト癌細胞の肺転移を阻害し得ることを示す。
【０３０６】 同様の肺転移実験を、Ｒａｊｏｔｔｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓ
ｔ．１０２：４３０−４３７（１９９８）（これは、本明細書中で参考として援
用される）に記載されるように調製した、ＧＦＥ−１（配列番号１）グルタチオ
ン Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を使用して、実施した。ＧＦＥ−１
（配列番号１）グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質は、肺重
量の増加を阻害し、この増加は、図８に示したように配列番号１のペプチドで観
察された結果と類似の様式で、Ｃ８１６１ヒト黒色腫細胞の注射から得られる。
【０３０７】 これらの結果は、ＧＦＥ−１（配列番号１）が肺転移を阻害し得、そしてＭＤ
Ｐが肺血管系における腫瘍細胞の転移のためのレセプターとして作用することを
示す。
【０３０８】 （実施例ＶＩ：Ｚ−２アシルアミノ−３−モノ置換プロペン酸ＭＤＰ結合ホー
ミング分子の調製） この実施例は、構造１を有するＭＤＰ結合分子の調製のいくつかの方法を実証
する。
【０３０９】 （Ａ．構造１を有するＭＤＰ結合ホーミング分子の調製方法） 構造１を有するＭＤＰ結合ホーミング分子を、以下の適切な２−ケト酸および
アミドを直接縮合することによって作製する。
【０３１０】
【化９】 ここで、Ｒ2およびＲ3は、規定された通りである。一般的な反応条件は、不活性
溶媒（例えば、トルエンまたはメチルイソ吉草酸）中で約１４：１の割合の酸対
アミドを混合する工程、および３〜４８時間、好ましくは５〜２４時間、水の共
沸除去を伴った還流加熱する工程を包含する。通常、冷却された場合、この溶液
は、結晶形態の産物を生じる。所望の場合、この産物を、塩基抽出プロセスを使
用して単離する。この産物を一般に公知の技術を使用して再結晶化する。
【０３１１】 この手順の必要に応じた改変は、反応中に触媒として、さらなる少量のｐ−ト
ルエンスルホン酸を必要とする。
【０３１２】 （Ｂ．構造１を有するＭＤＰ結合ホーミング分子の調製方法） 構造１を有するＭＤＰ結合ホーミング分子を、以下の酸塩化物を伴う反応にお
いてα−アミノ酸、ｔ−ブチルエステルを使用して調製する：
【０３１３】
【化１０】 この反応は、塩基（例えば、トリエチルアミン）の存在下、塩化メチレンのよう
な溶媒中で生じる。次いで、生じたＮ−アセチル化産物をｔ−ブチル次亜塩素酸
塩での処理、続いてナトリウムメトキシドの添加によって酸化する。これは、α
，β−不飽和エステルである、２−メトキシ誘導体またはその脱離産物を生じる
。無水塩酸でのさらなる処理は、この２−メトキシ誘導体か、またはこの不飽和
エステルのいずれか（または両方の混合物）を、所望のα，β不飽和遊離酸に変
換する。
【０３１４】
【化１１】 Ｒ3がアミノ、４級の窒素、チオールまたはカルボキシルである末端置換を有す る、いくつかの化合物、誘導体を、末端の臭素を有する中間体から最も都合良く
作製し得る。この場合、この中間体は、以下の構造を有し：
【０３１５】
【化１２】 ここで、ｎは、所望の炭化水素鎖（例えば、３〜７）の炭素数である。
【０３１６】 末端のトリメチルアンモニウム置換基を有するＲ3を調製するために、臭素中 間体をトリメチルアミンと反応させる；アミノを得るために、この臭素中間体を
アンモニアと反応させる；グアニジノ反応をグアニジンで行う；２−アミノ−２
−カルボキシエチルチオを含むチオ誘導体を調製するために、この臭素化合物を
システイン塩酸塩または適切なメルカプタンと反応させる。誘導体化したアミノ
（例えば、ホルムアミジノ、ウレイドおよびアシルアミド（アセトアミド））を
ｏ−ベンジルホルムイミデート塩酸塩、シアン酸カリウムおよび適切なアシル無
水物（無水酢酸）とそれぞれ反応させることによって、アミノ基を有する化合物
から作製する。
【０３１７】 （Ｃ．構造１を有するＭＤＰ結合ホーミング分子の調製方法） Ｒ3が末端に置換されたチオ誘導体である場合、化合物を調製するための別の 経路は、触媒量のｐ−トルエンスルホン酸の存在下での還流におけるトルエン中
で以下：
【０３１８】
【化１３】 の所望のアミドでの反応において以下：
【０３１９】
【化１４】 のようなクロロケトエステル中間体を利用する。生じた中間体を酸で加水分解す
る；次いで、塩素基を適切なメルカプタンとの反応で置換する。この反応は、キ
ラルアミドの使用を許容し、それによって、官能化された側鎖を調製するので価
値があり。あるいは、メルカプタン縮合後に調製された、ＺおよびＥアイソマー
の混合物を、約３のｐＨまで酸を添加し、そして約９０℃まで、３０分間加熱す
ることによって、Ｚ型に直接異性化する。Ｚ型のみが残存し、そして回収は、単
純かつ複雑でない。
【０３２０】 （Ｄ．Ｚ−７−（Ｌ−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−
ジメチルシクロプロパンカルボキシアミド）−２−へプテン酸ナトリウムの調製
） （１．エチル−７−クロロ−２−オキソヘプタン酸のグリニャール調製） 等モル量（各８モル）の１−ブロモ−５−クロロペンタンおよびマグネシウム
を２５℃でテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（９６０ｍｌ）中で反応させる。この
フラスコをＴＨＦ中でマグネシウムと共に装填し、そして臭化ブロモペンタンを
１時間にわたって添加し、次いで２時間熟成した。反応が終了したと判断した後
、この反応溶液を添加する（−１５℃で冷却し、１８５６ｍｌのＴＨＦ中で１６
モルのジエチルシュウ酸となるまで、１０℃で温度を維持しながら）。３Ｎ 塩
酸を、２５℃未満の温度を保ちながら、添加し、反応をクエンチする。溶媒をス
トリッピングした後、計算された収量は、４８．８％のエチル−１−クロロ−６
−オキソペプタン酸であった。
【０３２１】 （２．縮合および加水分解） Ｓ−２、２−ジメチルシクロプロピルカルボキシアミド（１０１７ｇ）、２１
４３．６ｇのエチル−７−クロロ−２−ケトヘプタン酸、９リットルのトルエン
および１２ｇのｐ−トルエンスルホン酸を２２Ｌのフラスコに装填し、そして攪
拌しながら、加熱して還流する。２３時間後、液体クロマトグラフィーは、予期
した産物の割合を示し、そして４Ｌのトルエンをわずかな減圧下で除去する。こ
のポットを水で装填し、２ＮのＮａＯＨでｐＨ７に中性化し、そして約５リット
ルの最終ポット容量を残して、減圧蒸留する。これを１７６０ｇの５０％ Ｎａ
ＯＨ水溶液（水、４リットル）を加え、そして一晩攪拌することによって加水分
解する。このフラスコを４Ｌの塩化メチレンで装填し、そしてｐＨをＨＣｌを用
いて８．８に調整する。未反応のアミドを結晶化する。有機層を水から分離し、
次いで蒸発させる。粘着性の残査を７２０ｇの５０％ ＮａＯＨを含む８Ｌの水
中で溶解し、そしてこの溶液に１８１８ｇのＬ−システイン塩酸塩、水、２ｋｇ
の氷、２４８４ｇの５０％ ＮａＯＨおよび１Ｌの水を装填する。室温で一晩熟
成後、この溶液のｐＨは、濃縮した塩酸で３．０に調整し、そして生じた粘着性
の懸濁液を９５℃に加熱し、透明な溶液を生じる。３０分後、１ｃによって検出
されたＥアイソマーはなかった。混合および精製の後、産物は全体で２０６０ｇ
であり、８７％の収量であった。この物質をアセトニトリルから再結晶させる。
１５００ｇの再結晶物質を６Ｌの水および９１０ｍｌの３．８８Ｎ ＮａＯＨ中
で溶解し、次いで、ｐＨ７に中性化し、そして凍結乾燥し、１５６９ｇ（９８．
６％）の標記の化合物を生じる。
【０３２２】
【化１５】 括弧中、または別の方法で上記に提供される全ての学術文献、参考文献および
特許の引用は、以前に述べられようとなかろうと、本明細書中で参考として援用
される。
【０３２３】 本発明は、上記で提供される実施例に対する参考と共に記載されるが、種々の
改変が本発明の精神から逸脱することなく行われ得ることが理解されるべきであ
る。従って、本発明は、特許請求の範囲によってのみ制限される。
【０３２４】
【表２】
【０３２５】
【表３】
【０３２６】
【表４】
【０３２７】
【表５】
【０３２８】
【表６】
【０３２９】
【表７】
【０３３０】
【表８】
【０３３１】
【表９】
【０３３２】
【表１０】
【０３３３】
【表１１】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、肺にホーミングする分子を同定するためのＣＸ6Ｃ（配列番号２６） ライブラリーの３回のインビボパンニングの結果を示す。マウスの尾静脈への１
０10形質導入単位の注射の５分後に肺から回収したファージを増幅し、そして２
回継続して再注射した。１グラムの肺、腎臓または脳当たりの回収したファージ
の数を、３連のプレーティングからの平均の標準誤差を示すバーとともに、各回
について示す。
【図２】 図２Ａ〜２Ｄは、肺（図２Ａおよび２Ｂ）、皮膚（図２Ｃ）または膵臓（図２
Ｄ）ホーミングペプチドを提示するファージの選択性を示す。肺（図２Ａ、ＣＧ
ＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ、配列番号１、「ＧＦＥ−１」；図２Ｂ，ＣＧＦＥＬＥ
ＴＣ、配列番号２、「ＧＦＥ−２」）；皮膚（図２Ｃ、ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥ
ＧＣ、配列番号３）または膵臓（図２Ｄ、ＳＷＣＥＰＧＷＣＲ、配列番号４）に
ホーミングするペプチドを発現する選択したファージを個々に増幅し、マウスに
注射し、そして回収した（実施例Ｉ）。１グラムの肺、皮膚または膵臓あるいは
コントロール腎臓または脳当たりの回収された、選択したペプチドを提示するフ
ァージの量を決定した。肺、皮膚、膵臓、腎臓または脳から回収した非選択（コ
ントロール）ファージの量もまた決定した。バーは、３連のプレーティングから
の平均の標準誤差を示す。
【図３】 図３Ａおよび３Ｂは、肺または皮膚ホーミングペプチドを提示するファージの
ホーミングにおける、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−（ＧＳＴ）−融合
タンパク質の同時投与の効果を示す。 図３Ａにおいて、１００μｇもしくは５００μｇのＧＳＴ−ＣＧＦＥＣＶＲＱ
ＣＰＥＲＣ（配列番号１、「ＧＦＥ−１」）または５００μｇのＧＳＴを、肺ホ
ーミング配列ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）を提示する個々に増幅
したファージの１０9形質導入単位で、マウスに同時注射した。循環の５分後に 肺および腎臓からのファージ回収を、３連のプレーティングからの平均の標準誤
差を示すバーとともに、決定した。 図３Ｂにおいて、肺ホーミングペプチドＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番
号１、「ＧＦＥ−１」）もしくはＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２、「ＧＦＥ−２
」）または皮膚ホーミングペプチドＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）
のいずれかを提示する個々に増幅したファージの１０9形質導入単位を、５００ μｇの同族ＧＳＴ融合ペプチドとともにマウスに同時注射した。コントロールマ
ウス（示さず）に、選択したファージおよび５００μｇのＧＳＴを注射した。Ｇ
ＳＴに比較して、同族ＧＳＴ融合ペプチドの存在下で肺または皮膚にホーミング
する選択されたファージの阻害の割合を示す。
【図４】 図４は、肺抽出物からの５５ｋＤａ細胞表面タンパク質が、ＧＦＥ−１ペプチ
ドアフィニティーカラムに特異的に結合することを示す。インビボでビオチン化
した肺抽出物を、ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１；ＧＦＥ−１）ペプ
チドカラムまたはコントロールペプチドカラム（ＧＲＧＥＳＰ；配列番号４４２
）上に分画し、洗浄し、そしてＧＦＥ−１ペプチドで溶出した。洗浄画分（「−
」）、ＧＦＥ−１ペプチド溶出物、および８Ｍ尿素溶出物からのアリコート（３
０μｌ）を、還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。分子量マーカ
ー（ｋＤａ）を、各パネルの右側に示す。
【図５】 図５は、Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅの加水分解により生じたＤ−フェニルアラニン（
Ｄ−Ｐｈｅ）の蛍光検出の経時変化を示す。ＧＦＥ−１ペプチドアフィニティー
カラムからの洗浄画分（白丸）およびＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１
；ＧＦＥ−１）ペプチド溶出物（黒丸）からのサンプルを、Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅ
基質とのＭＤＰ活性についてアッセイした。Ｄ−Ｐｈｅの蛍光化合物への時間依
存性変換を示す。
【図６】 図６は、ファージ保有ペプチドＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１；Ｇ
ＦＥ−１）またはＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２；ＧＦＥ−２）のＣＯＳ−１細
胞発現膜ジペプチド（ＭＤＰ）への結合を示す。 図６Ａにおいて、ＣＯＳ−１細胞を、ＭＤＰ発現ベクターまたはベクター単独
でトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞抽出物を調製し
、そしてＭＤＰ活性について分析した。 図６Ｂにおいて、ＭＤＰ発現ベクターまたはコントロール空ベクターのいずれ
かでトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞を、コントロールファージ（ｆｄ−ｔ
ｅｔ）または皮膚ホーミングペプチドＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３
；「ｓｈｐ−１」）、ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１、ＧＦＥ−１）
ペプチド、もしくはＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２；ＧＦＥ−２）ペプチドを保
有するファージのいずれかの等量の存在下で結合アッセイに供した。各場合にお
いて、これらの細胞からレスキューしたファージ形質導入単位の総数を示す。エ
ラーバーは、３連のプレーティングからの平均の標準偏差を示す。
【図７】 図７は、ＧＦＥ−１ペプチドＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）によ
るＭＤＰ活性の阻害を示す。ＭＤＰを発現するＣＯＳ−１細胞からの抽出物を、
漸増濃度のＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１；ＧＦＥ−１）（黒丸）ま
たはＣＡＲＡＣコントロールペプチド（配列番号４４３）（（白丸）として示す
）の存在下でＭＤＰ活性についてアッセイした。
【図８】 図８は、ＧＦＥ−１（配列番号１）が、ヒト黒色腫細胞の肺転移を阻害するこ
とを示す。肺重量は、１０5のＣ８１６１ヒト黒色腫細胞単独（「ビヒクル」） ；２５０μｇのＧＦＥ−１ペプチド配列番号１（「ＧＦＥ−１ペプチド」）と同
時投与した１０5のＣ８１６１細胞；または２５０μｇのＣＡＲＡＣペプチド配 列番号４４３（「コントロールペプチド」）と同時投与した１０5のＣ８１６１ 細胞を注射した５週間後のマウスについて示される。
【図９】 図９は、５つの種由来の膜ジペプチダーゼの推定アミノ酸配列のアラインメン
トを示す。ヒト（「ＨＵＭ」；配列番号４４８）；ブタ（「ＰＩＧ」；配列番号
４４９）；ラット（「ＲＡＴ」；配列番号４５０）；およびマウス（「ＭＯＵ」
；配列晩胞４５１）ＭＤＰのアミノ酸配列を、ウサギＭＤＰ（「ＲＡＢ」；配列
番号４５２）の配列とともに整列する。アステリスクは、ヒトＭＤＰにおけるＮ
結合型グリコシル化部位を示す。囲まれた残基Ｇｌｕ125およびＨｉｓ219は、活
性に必須である（Ａｄａｃｈｉら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ
１１６３：４２−４８（１９９３）；Ｋｅｙｎａｎら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅ
ｒｓ ３４９：５０−５４（１９９４））。下線を付した残基は（−１〜−１６
）はシグナルペプチドを示す。Ｃ末端において囲まれた残基は、成熟タンパク質
においてグリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーによって
置換される疎水性シグナルを示す。ＧＰＩアンカー付加の部位を、矢印によって
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/04 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｃ 233/46 Ｃ０７Ｃ 233/46 Ｃ０７Ｋ 7/08 Ｃ０７Ｋ 7/08 14/705 14/705 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，Ｊ Ｐ (72)発明者 ルオスラーチ， アーキ アイ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 92067， ランチョ サンタ フェ， ピー．オ ー． ボックス 1054 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA05 DA02 EA03 GA14 HA01 HA11 4C084 AA02 AA07 AA13 AA17 BA18 CA53 CA56 NA06 ZA591 ZA811 ZA891 ZC781 4H006 AA01 AA03 AB20 BM10 BS10 BT12 4H045 AA10 AA30 BA10 BA50 DA55 EA28 FA74

Claims (123)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 前立腺の血管系に選択的にホーミングするペプチド。
  2. 【請求項２】 ＳＭＳＩＡＲＬ（配列番号２１）、ＶＳＦＬＥＹＲ（配列番
    号２２）およびＲＧＲＷＬＡＬ（配列番号２７９）からなる群から選択される、
    請求項１に記載のペプチド。
  3. 【請求項３】 部分に連結された請求項１に記載のペプチドを含む、結合体
    。
  4. 【請求項４】 前記部分が、治療的薬剤、検出可能な薬剤およびタグからな
    る群から選択される、請求項３に記載の結合体。
  5. 【請求項５】 前立腺を同定する方法であって、該方法が以下の工程： ａ）組織または器官を、請求項１に記載のペプチドと接触する工程；および ｂ）該ペプチドの該器官または該組織への結合を検出する工程であって、それ
    により、該器官または該組織を前立腺として同定する、工程、 を包含する、方法。
  6. 【請求項６】 前立腺により発現される標的分子を同定する方法であって、
    該方法が、請求項５に記載の方法を包含し、さらに、以下の工程： ｃ）前記前立腺のサンプルを得る工程；および ｄ）前記ペプチドにより結合される該標的分子を同定する工程、 を包含する、方法。
  7. 【請求項７】 被験体における前立腺病理を処置する方法であって、該方法
    が、請求項１に記載のペプチドを該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該
    ペプチドが前立腺に選択的にホーミングし、それによって、該前立腺病理を処置
    する、方法。
  8. 【請求項８】 以下のアミノ酸配列を有する肺ホーミングペプチドであって
    ： Ｘ1−Ｇ−Ｆ−Ｅ−Ｘ2（配列番号１７） ここで、Ｘ1およびＸ2の各々は、独立的して選択される１〜１０個のアミノ酸
    である、肺ホーミングペプチド。
  9. 【請求項９】 ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）およびＣＧＦＥ
    ＬＥＴＣ（配列番号２）からなる群から選択される、請求項８に記載の肺ホーミ
    ングペプチド。
  10. 【請求項１０】 ＣＴＬＲＤＲＮＣ（配列番号１５）およびＣＩＧＥＶＥＶ
    Ｃ（配列番号１６）からなる群から選択される、肺ホーミングペプチド。
  11. 【請求項１１】 ＣＬＡＫＥＮＶＶＣ（配列番号１３）、ＣＶＧＮＬＳＭＣ
    （配列番号３７）、ＣＫＧＱＲＤＦＣ（配列番号３９）、ＣＮＭＧＬＴＲＣ（配
    列番号４１）、ＣＨＥＧＹＬＴＣ（配列番号４２）、ＣＬＲＰＹＬＮＣ（配列番
    号４５）、ＣＭＥＬＳＫＱＣ（配列番号４７）、ＣＬＦＳＤＥＮＣ（配列番号５
    ２）、ＣＷＲＧＤＲＫＩＣ（配列番号５６）、ＣＭＳＷＤＡＶＳＣ（配列番号６
    ４）、ＣＫＷＳＲＬＨＳＣ（配列番号６５）、ＣＴＶＮＥＡＹＫＴＲＭＣ（配列
    番号７５）、ＣＲＬＲＳＹＧＴＬＳＬＣ（配列番号７６）、ＣＲＰＷＨＮＱＡＨ
    ＴＥＣ（配列番号８２）、ＣＳＥＡＡＳＲＭＩＧＶＣ（配列番号８４）、ＣＷＥ
    ＥＨＰＳＩＫＷＷＣ（配列番号８５）、ＣＧＶＧＣＰＧＬＣＧＧＡＣ（配列番号
    １０４）およびＣＧＧＡＣＧＧＶＣＴＧＧＣ（配列番号１１４）からなる群から
    選択される、肺ホーミングペプチド。
  12. 【請求項１２】 部分に連結された請求項８、請求項９、請求項１０または
    請求項１１に記載の肺ホーミング分子を含む、結合体。
  13. 【請求項１３】 前記部分が、治療的薬剤、検出可能な薬剤およびタグから
    なる群から選択される、請求項１２に記載の結合体。
  14. 【請求項１４】 肺を同定する方法であって、該方法が以下の工程： ａ）組織または器官を、請求項８、請求項９、請求項１０または請求項１１に
    記載の肺ホーミングペプチドと接触する工程；および ｂ）該肺ホーミングペプチドの該器官または該組織への結合を検出する工程で
    あって、それにより、該器官または該組織を肺として同定する、工程、 を包含する、方法。
  15. 【請求項１５】 肺により発現される標的分子を同定する方法であって、該
    方法が、請求項１４に記載の方法を包含し、さらに、以下の工程： ｃ）該肺のサンプルを得る工程；および ｄ）前記肺ホーミングペプチドにより結合される該標的分子を同定する工程、 を包含する、方法。
  16. 【請求項１６】 被験体における肺病理を処置する方法であって、該方法が
    、請求項８、請求項９、請求項１０または請求項１１に記載の肺ホーミングペプ
    チドを該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該肺ホーミングペプチドが肺
    に選択的にホーミングし、それによって、該肺病理を処置する、方法。
  17. 【請求項１７】 皮膚の血管系に選択的にホーミングするペプチド。
  18. 【請求項１８】 アミノ酸配列ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ（配列番号３）
    を有する、請求項１７に記載のペプチド。
  19. 【請求項１９】 ＣＷＮＩＣＰＧＧＣＲＡＬＣ（配列番号１７５）、ＣＫＧ
    ＴＣＶＬＧＣＳＥＥＣ（配列番号１７７）、ＣＳＳＧＣＳＫＮＣＬＥＭＣ（配列
    番号１８１）、ＣＡＶＲＣＤＧＳＣＶＰＥＣ（配列番号１８４）およびＣＧＧＧ
    ＣＱＷＧＣＡＧＥＣ（配列番号１９１）からなる群から選択される、請求項１７
    に記載のペプチド。
  20. 【請求項２０】 部分に連結された請求項１７に記載のペプチドを含む、結
    合体。
  21. 【請求項２１】 前記部分が、治療的薬剤、検出可能な薬剤およびタグから
    なる群から選択される、請求項２０に記載の結合体。
  22. 【請求項２２】 皮膚を同定する方法であって、該方法が以下の工程： ａ）組織または器官を、請求項１７に記載のペプチドと接触させる工程；およ
    び ｂ）該ペプチドの該器官または該組織への結合を検出する工程であって、それ
    により、該器官または該組織を皮膚として同定する、工程、 を包含する、方法。
  23. 【請求項２３】 皮膚により発現される標的分子を同定する方法であって、
    該方法が、請求項２２に記載の方法を包含し、さらに、以下の工程： ｃ）該皮膚のサンプルを得る工程；および ｄ）前記ペプチドにより結合される該標的分子を同定する工程、 を包含する、方法。
  24. 【請求項２４】 被験体における皮膚病理を処置する方法であって、該方法
    が、請求項１７に記載のペプチドを該被験体に投与する工程を包含し、ここで、
    該ペプチドが皮膚に選択的にホーミングし、それによって、該皮膚病理を処置す
    る、方法。
  25. 【請求項２５】 網膜の血管系に選択的にホーミングするペプチド。
  26. 【請求項２６】 以下のアミノ酸配列を有する、請求項２５に記載のペプチ
    ドであって： Ｘ1−Ｒ−Ｄ−Ｖ−Ｘ2（配列番号３２） ここで、Ｘ1およびＸ2の各々は、独立的して選択される１〜１０個のアミノ酸
    である、ペプチド。
  27. 【請求項２７】 ＣＳＣＦＲＤＶＣＣ（配列番号５）およびＣＲＤＶＶＳＶ
    ＩＣ（配列番号６）からなる群から選択される、請求項２６に記載のペプチド。
  28. 【請求項２８】 ＣＧＥＦＫＶＧＣ（配列番号１４）、ＣＭＤＳＱＳＳＣ（
    配列番号２２８）、ＣＮＱＲＴＮＲＥＳＧＮＣ（配列番号２３１）、ＣＬＬＮＹ
    ＴＹＣ（配列番号２３８）、ＣＱＡＳＡＳＤＨＣ（配列番号２４２）、ＣＶＴＳ
    ＮＬＲＶＣ（配列番号２５０）およびＣＲＡＲＩＲＡＥＤＩＳＣ（配列番号２６
    ３）からなる群から選択される、請求項２５に記載のペプチド。
  29. 【請求項２９】 部分に連結された請求項２５に記載のペプチドを含む、結
    合体。
  30. 【請求項３０】 前記部分が、治療的薬剤、検出可能な薬剤およびタグから
    なる群から選択される、請求項２９に記載の結合体。
  31. 【請求項３１】 網膜を同定する方法であって、該方法が以下の工程： ａ）組織または器官を、請求項２５に記載のペプチドと接触する工程；および ｂ）該ペプチドの該器官または該組織への結合を検出する工程であって、それ
    により、該器官または該組織を網膜として同定する、工程、 を包含する、方法。
  32. 【請求項３２】 網膜により発現される標的分子を同定する方法であって、
    該方法が、請求項３１に記載の方法を包含し、さらに、以下の工程： ｃ）前記網膜のサンプルを得る工程；および ｄ）前記ペプチドにより結合される該標的分子を同定する工程、 を包含する、方法。
  33. 【請求項３３】 被験体における網膜病理を処置する方法であって、該方法
    が、請求項２５に記載のペプチドを該被験体に投与する工程を包含し、ここで、
    該ペプチドが網膜に選択的にホーミングし、それによって、該網膜病理を処置す
    る、方法。
  34. 【請求項３４】 膵臓の血管系に選択的にホーミングするペプチド。
  35. 【請求項３５】 アミノ酸配列ＳＷＣＥＰＧＷＣＲ（配列番号４）を有する
    、請求項３４に記載のペプチド。
  36. 【請求項３６】 アミノ酸配列ＧＬＣＮＧＡＴＣＭ（配列番号１２３）を有
    する、請求項３４に記載のペプチド。
  37. 【請求項３７】 部分に連結された請求項３４に記載のペプチドを含む、結
    合体。
  38. 【請求項３８】 前記部分が、治療的薬剤、検出可能な薬剤およびタグから
    なる群から選択される、請求項３７に記載の結合体。
  39. 【請求項３９】 膵臓を同定する方法であって、該方法が以下の工程： ａ）組織または器官を、請求項３４に記載のペプチドと接触させる工程；およ
    び ｂ）該ペプチドの該器官または該組織への結合を検出する工程であって、それ
    により、該器官または該組織を膵臓として同定する、工程、 を包含する、方法。
  40. 【請求項４０】 膵臓により発現される標的分子を同定する方法であって、
    該方法が、請求項３９に記載の方法を包含し、さらに、以下の工程： ｃ）前記膵臓のサンプルを得る工程；および ｄ）前記ペプチドにより結合される該標的分子を同定する工程、 を包含する、方法。
  41. 【請求項４１】 被験体における膵臓病理を処置する方法であって、該方法
    が、請求項３４に記載のペプチドを該被験体に投与する工程を包含し、ここで、
    該ペプチドが膵臓に選択的にホーミングし、それによって、該膵臓病理を処置す
    る、方法。
  42. 【請求項４２】 腸の血管系に選択的にホーミングするペプチド。
  43. 【請求項４３】 以下のアミノ酸配列を有する、請求項４２に記載のペプチ
    ドであって： Ｙ−Ｓ−Ｇ−Ｋ−Ｗ−Ｘ1（配列番号４３３） ここで、Ｘ1は、独立して選択される１〜１０個のアミノ酸である、ペプチド 。
  44. 【請求項４４】 ＹＳＧＫＷＧＧ（配列番号９）およびＹＳＧＫＷＧＷ（配
    列番号１５６）からなる群から選択される、請求項４３に記載のペプチド。
  45. 【請求項４５】 以下のアミノ酸配列を有する、請求項４２に記載のペプチ
    ドであって： Ｘ1−Ｒ−Ｇ−Ｓ−Ｘ2（配列番号４３４） ここで、Ｘ1およびＸ2の各々は、独立して選択される１〜１０個のアミノ酸で
    ある、ペプチド。
  46. 【請求項４６】 ＶＲＲＧＳＰＧ（配列番号１６４）、ＧＧＲＧＳＷＥ（配
    列番号１６７）およびＦＲＶＲＧＳＰ（配列番号１６９）からなる群から選択さ
    れる、請求項４５に記載のペプチド。
  47. 【請求項４７】 ＹＡＧＦＦＬＶ（配列番号１５０）、ＳＲＲＱＰＬＳ（配
    列番号１５３）、ＭＳＰＱＬＡＴ（配列番号１５９）、ＷＩＥＥＡＥＲ（配列番
    号１６１）およびＧＩＳＡＶＬＳ（配列番号１６６）からなる群から選択される
    アミノ酸配列を有する、請求項４２に記載のペプチド。
  48. 【請求項４８】 部分に連結された請求項４２に記載のペプチドを含む、結
    合体。
  49. 【請求項４９】 前記部分が、治療的薬剤、検出可能な薬剤およびタグから
    なる群から選択される、請求項４８に記載の結合体。
  50. 【請求項５０】 腸を同定する方法であって、該方法が以下の工程： ａ）組織または器官を、請求項４２に記載のペプチドと接触させる工程；およ
    び ｂ）該ペプチドの該器官または該組織への結合を検出する工程であって、それ
    により、該器官または該組織を腸として同定する、工程、 を包含する、方法。
  51. 【請求項５１】 腸により発現される標的分子を同定する方法であって、該
    方法が、請求項５０に記載の方法を包含し、さらに、以下の工程： ｃ）該腸のサンプルを得る工程；および ｄ）前記ペプチドにより結合される該標的分子を同定する工程、 を包含する、方法。
  52. 【請求項５２】 被験体における腸病理を処置する方法であって、該方法が
    、請求項４２に記載のペプチドを該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該
    ペプチドが腸に選択的にホーミングし、それによって、該腸病理を処置する、方
    法。
  53. 【請求項５３】 卵巣の血管系に選択的にホーミングするペプチド。
  54. 【請求項５４】 ＥＶＲＳＲＬＳ（配列番号１０）およびＲＶＧＬＶＡＲ（
    配列番号１１）からなる群から選択される、請求項５３に記載のペプチド。
  55. 【請求項５５】 部分に連結された請求項５３に記載のペプチドを含む、結
    合体。
  56. 【請求項５６】 前記部分が、治療的薬剤、検出可能な薬剤およびタグから
    なる群から選択される、請求項５５に記載の結合体。
  57. 【請求項５７】 卵巣を同定する方法であって、該方法が以下の工程： ａ）組織または器官を、請求項５３に記載のペプチドと接触させる工程；およ
    び ｂ）該ペプチドの該器官または該組織への結合を検出する工程であって、それ
    により、該器官または該組織を卵巣として同定する、工程、 を包含する、方法。
  58. 【請求項５８】 卵巣により発現される標的分子を同定する方法であって、
    該方法が、請求項５７に記載の方法を包含し、さらに、以下の工程： ｃ）該卵巣のサンプルを得る工程；および ｄ）前記ペプチドにより結合される該標的分子を同定する工程、 を包含する、方法。
  59. 【請求項５９】 被験体における卵巣病理を処置する方法であって、該方法
    が、請求項５３に記載のペプチドを該被験体に投与する工程を包含し、ここで、
    該ペプチドが卵巣に選択的にホーミングし、それによって、該卵巣病理を処置す
    る、方法。
  60. 【請求項６０】 副腎の血管系に選択的にホーミングするペプチド。
  61. 【請求項６１】 以下のアミノ酸配列を有する、請求項６０に記載のペプチ
    ドであって： Ｘ1−Ｌ−Ｐ−Ｒ−Ｘ2（配列番号４３１） ここで、Ｘ1およびＸ2の各々は、独立して選択される１〜１０個のアミノ酸で
    ある、ペプチド。
  62. 【請求項６２】 ＬＭＬＰＲＡＤ（配列番号２７）およびＬＰＲＹＬＬＳ（
    配列番号２８）からなる群から選択される、請求項６１に記載のペプチド。
  63. 【請求項６３】 以下のアミノ酸配列を有する、請求項６０に記載のペプチ
    ドであって： Ｘ1−Ｌ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｘ2（配列番号４３２） ここで、Ｘ1は、独立して選択される１〜１０個のアミノ酸であり、ここで、 Ｘ2は、独立して選択される０〜１０個のアミノ酸である、ペプチド。
  64. 【請求項６４】 Ｒ（Ｙ／Ｆ）ＬＬＡＧＧ（配列番号４０４）およびＲＹＰ
    ＬＡＧＧ（配列番号３８９）からなる群から選択される、請求項６３に記載のペ
    プチド。
  65. 【請求項６５】 ＦＳＤＶＨＦＷ（配列番号３８１）およびＧＹＶＡＶＭＴ
    （配列番号４００）からなる群から選択される、請求項６０に記載のペプチド。
  66. 【請求項６６】 部分に連結された請求項６０に記載のペプチドを含む、結
    合体。
  67. 【請求項６７】 前記部分が、治療的薬剤、検出可能な薬剤およびタグから
    なる群から選択される、請求項６６に記載の結合体。
  68. 【請求項６８】 副腎を同定する方法であって、該方法が以下の工程： ａ）組織または器官を、請求項６０に記載のペプチドと接触させる工程；およ
    び ｂ）該ペプチドの該器官または該組織への結合を検出する工程であって、それ
    により、該器官または該組織を副腎として同定する、工程、 を包含する、方法。
  69. 【請求項６９】 副腎により発現される標的分子を同定する方法であって、
    該方法が、請求項６８に記載の方法を包含し、さらに、以下の工程： ｃ）該副腎のサンプルを得る工程；および ｄ）前記ペプチドにより結合される該標的分子を同定する工程、 を包含する、方法。
  70. 【請求項７０】 被験体における副腎病理を処置する方法であって、該方法
    が、請求項６０に記載のペプチドを該被験体に投与する工程を包含し、ここで、
    該ペプチドが副腎に選択的にホーミングし、それによって、該副腎病理を処置す
    る、方法。
  71. 【請求項７１】 肝臓の血管系に選択的にホーミングするペプチド。
  72. 【請求項７２】 ＶＫＳＶＣＲＴ（配列番号１２）、ＳＲＲＦＶＧＧ（配列
    番号４０６）、ＶＧＳＦＩＹＳ（配列番号４１１）およびＷＲＱＮＭＰＬ（配列
    番号４１８）からなる群から選択される、請求項７１に記載のペプチド。
  73. 【請求項７３】 部分に連結された請求項７０に記載のペプチドを含む、結
    合体。
  74. 【請求項７４】 前記部分が、治療的薬剤、検出可能な薬剤およびタグから
    なる群から選択される、請求項７３に記載の結合体。
  75. 【請求項７５】 肝臓を同定する方法であって、該方法が以下の工程： ａ）組織または器官を、請求項７０に記載のペプチドと接触させる工程；およ
    び ｂ）該ペプチドの該器官または該組織への結合を検出する工程であって、それ
    により、該器官または該組織を肝臓として同定する、工程、 を包含する、方法。
  76. 【請求項７６】 肝臓により発現される標的分子を同定する方法であって、
    該方法が、請求項７５に記載の方法を包含し、さらに、以下の工程： ｃ）該肝臓のサンプルを得る工程；および ｄ）前記ペプチドにより結合される該標的分子を同定する工程、 を包含する、方法。
  77. 【請求項７７】 被験体における肝臓病理を処置する方法であって、該方法
    が、請求項７０に記載のペプチドを該被験体に投与する工程を包含し、ここで、
    該ペプチドが肝臓に選択的にホーミングし、それによって、該肝臓病理を処置す
    る、方法。
  78. 【請求項７８】 ＡＧＣＳＶＴＶＣＧ（配列番号３１５）、ＧＳＣＳＭＦＰ
    ＣＳ（配列番号３１７）、ＳＥＣＡＹＲＡＣＳ（配列番号３１９）、ＷＳＣＡＲ
    ＰＬＣＧ（配列番号３２０）、ＧＬＣＱＩＤＥＣＲ（配列番号３２９）、ＤＲＣ
    ＬＤＩＷＣＬ（配列番号３３１）、ＰＬＣＭＡＴＲＣＡ（配列番号３３３）、Ｒ
    ＤＣＳＨＲＳＣＥ（配列番号３３４）、ＮＰＣＬＲＡＡＣＩ（配列番号３３５）
    、ＰＴＣＡＹＧＷＣＡ（配列番号３３６）、ＬＥＣＶＡＮＬＣＴ（配列番号３３
    ７）、ＲＫＣＧＥＥＶＣＴ（配列番号３３８）、ＥＰＣＴＷＮＡＣＬ（配列番号
    ３３９）およびＱＱＣＱＤＰＹＣＬ（配列番号３４４）からなる群から選択され
    る、リンパ節ホーミングペプチド。
  79. 【請求項７９】 部分に連結された請求項７８に記載のペプチドを含む、結
    合体。
  80. 【請求項８０】 前記部分が、治療的薬剤、検出可能な薬剤およびタグから
    なる群から選択される、請求項７９に記載の結合体。
  81. 【請求項８１】 リンパ節を同定する方法であって、該方法が以下の工程： ａ）組織または器官を、請求項７８に記載のペプチドと接触させる工程；およ
    び ｂ）該ペプチドの該器官または該組織への結合を検出する工程であって、それ
    により、該器官または該組織をリンパ節として同定する、工程、 を包含する、方法。
  82. 【請求項８２】 リンパ節により発現される標的分子を同定する方法であっ
    て、該方法が、請求項８１に記載の方法を包含し、さらに、以下の工程： ｃ）該リンパ節のサンプルを得る工程；および ｄ）前記ペプチドにより結合される該標的分子を同定する工程、 を包含する、方法。
  83. 【請求項８３】 被験体におけるリンパ節病理を処置する方法であって、該
    方法が、請求項７８に記載のペプチドを該被験体に投与する工程を包含し、ここ
    で、該ペプチドがリンパ節に選択的にホーミングし、それによって、該リンパ節
    病理を処置する、方法。
  84. 【請求項８４】 肺内皮細胞に選択的にホーミングする、ＭＤＰ−結合ホー
    ミング分子を同定する方法であって、該方法が以下の工程： ａ）膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ）を１以上の分子に接触させる工程；および ｂ）分子の該ＭＤＰへの特異的な結合を決定する工程、 を包含し、 ここで、特異的結合の存在が、肺内皮細胞に選択的にホーミングするＭＤＰ−
    結合ホーミング分子として、該分子を同定する、方法。
  85. 【請求項８５】 前記ＭＤＰが、実質的に精製されている、請求項８４に記
    載の方法。
  86. 【請求項８６】 前記実質的に精製されたＭＤＰが、支持体に固定されてい
    る、請求項８５に記載の方法。
  87. 【請求項８７】 前記ＭＤＰが、配列番号４４８を有するヒトＭＤＰである
    請求項８４に記載の方法。
  88. 【請求項８８】 被験体において、部分を肺内皮細胞に選択的に指向する方
    法であって、該被験体に、請求項８４の方法によって同定されたＭＤＰ−結合ホ
    ーミング分子に連結された部分を有する結合体を投与する工程、を包含し、 それにより、該被験体において、該部分が肺内皮細胞に選択的に指向される、
    方法。
  89. 【請求項８９】 前記ＭＤＰ−結合ホーミング分子が、以下の配列： Ｘ1−Ｇ−Ｆ−Ｅ−Ｘ2（配列番号１７） ここで、Ｘ1およびＸ2の各々は、独立的に選択される１〜１０個のアミノ酸を
    含むペプチドである、請求項８８に記載の方法。
  90. 【請求項９０】 前記ＭＤＰ−結合ホーミングペプチドが、ＣＧＦＥＣＶＲ
    ＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）およびＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２）からなる群
    から選択される配列を含む、請求項８９に記載の方法。
  91. 【請求項９１】 前記ＭＤＰ−結合ホーミング分子が、以下の構造１： 【化１】 、または薬学的に受容可能な陽イオンを包含し、ここで、Ｒ2およびＲ3は、それ
    ぞれ、３〜１０個の炭素原子および１〜１５個の炭素原子の範囲の炭化水素ラジ
    カルであり；これらのＲ2炭化水素鎖もしくはＲ3炭化水素鎖のいずれか１つにお
    ける１〜６個の水素が、ハロゲンによって置換されていてもよいか、または非末
    端メチレンが酸素もしくは酸化型形態を含む硫黄によって置換されてもよく；さ
    らに、Ｒ3の末端水素もまたヒドロキシル基もしくはチオール基によって置換さ れていてもよく、そのヒドロキシル基もしくはチオール基は、アシル化もしくは
    カルバモイル化されていてもよく；あるいは、該水素はアミノ基によって置換さ
    れていてもよく、このアミノ基はアシルアミノ基、ウレイド基、アミジノ基、ク
    アニジノ基もしくはアルキル基、または置換されたアミノ基におけるように誘導
    体化されていてもよく、四級窒素基を含み；あるいは、カルボン酸基、ホスホン
    酸基もしくはスルホン酸基のような酸性基、またはそれらのエステルもしくはア
    ミドまたはシアノ；あるいは末端アミノ酸基のようなそれらの組み合わせにより
    置換されていてもよく；そしてＲ1は、水素もしくは低級アルキル（Ｃ1-6）もし
    くはジアルキルアミノアルキルである、請求項８８に記載の方法。
  92. 【請求項９２】 前記ＭＤＰ−結合ホーミング分子が、７−（Ｌ−２−アミ
    ノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカル
    ボキサミド）−２−ヘプテン酸である、請求項９１に記載の方法。
  93. 【請求項９３】 前記Ｒ2が、カルボニルに隣接した炭素が第三級ではない というように限定された、分枝したアルキルまたはシクロアルキルである、請求
    項９１に記載の方法。
  94. 【請求項９４】 前記Ｒ3が、第四級窒素、アミノ誘導体もしくはアミノ酸 誘導基である末端置換基を有する、ｎ−アルキル（１〜９個の炭素）もしくはｎ
    −アルキル（１〜９個の炭素）である、請求項９３に記載の方法。
  95. 【請求項９５】 前記Ｒ2が、２，２−ジメチルシクロプロピルもしくは２ ，２−ジクロロシクロプロピルであり、そして前記Ｒ3が、末端置換基を有さな いか、またはトリメチルアンモニウム、アミジノ、グアニジノ、もしくは２−ア
    ミノ−２−カルボエチルチオである末端置換基を有する、３〜７個の炭素原子の
    炭化水素鎖である、請求項９４に記載の方法。
  96. 【請求項９６】 前記ＭＤＰ−結合ホーミング分子が、以下： Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−トリメチル
    アンモニウムヒドロキシド−２−オクテン酸内部塩； Ｚ−２−（２，２−ジクロロシクロプロパンカルボキサミド）−８−トリメチル
    アンモニウムヒドロキシド−２−オクテン酸内部塩； Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−グアニジノ
    −２−オクテン酸； Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−グアニジノ
    −２−オクテン酸； Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−ウレイド−
    ２−オクテン酸； Ｚ−８−（１−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２（２，２−ジメチ
    ルシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸； Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸
    （ラセミ形および右旋性形）； Ｚ−２−（２，２−ジクロロシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸
    ； ７−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチル
    シクロプロパンカルボキサミド）−２−へプテン酸；および ６−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチル
    クロロプロパンカルボキサミド）−２−ヘキセン酸、 からなる群から選択される、請求項９５に記載の方法。
  97. 【請求項９７】 前記部分が遺伝子治療ベクターである、請求項８８に記載
    の方法。
  98. 【請求項９８】 前記部分が薬物である、請求項８８に記載の方法。
  99. 【請求項９９】 癌を有する被験体において、肺転移を減少または防止する
    方法であって、該被験体に膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ）−結合ホーミング分子を
    投与する工程を包含する、方法。
  100. 【請求項１００】 前記ＭＤＰ−結合ホーミング分子が、以下の配列： Ｘ1−Ｇ−Ｆ−Ｅ−Ｘ2（配列番号１７） を含む肺ホーミングペプチドであり、ここで、Ｘ1およびＸ2の各々は、独立し
    て選択される１〜１０個のアミノ酸である、請求項９９に記載の方法。
  101. 【請求項１０１】 前記ＭＤＰ−結合ホーミングペプチドが、ＣＧＦＥＣＶ
    ＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）およびＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２）からなる
    群から選択される配列を含む、請求項１００に記載の方法。
  102. 【請求項１０２】 前記ＭＤＰ−結合ホーミングペプチドが、ＣＧＦＥＣＶ
    ＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号１）およびＣＧＦＥＬＥＴＣ（配列番号２）からなる
    群から選択されるペプチドである、請求項１０１に記載の方法。
  103. 【請求項１０３】 前記ＭＤＰ−結合ホーミング分子が、以下の構造１： 【化２】 、または薬学的に受容可能な陽イオンを包含し、ここで、Ｒ2およびＲ3は、それ
    ぞれ、３〜１０個の炭素原子および１〜１５個の炭素原子の範囲の炭化水素ラジ
    カルであり；これらのＲ2炭化水素鎖もしくはＲ3炭化水素鎖のいずれか１つにお
    ける１〜６個の水素がハロゲンによって置換されていてもよい、または非末端メ
    チレンが酸素もしくは酸化型形態を含む硫黄によって置換されていてもよく；さ
    らに、Ｒ3の末端水素もまたヒドロキシル基もしくはチオール基によって置換さ れていてもよく、これらのヒドロキシル基もしくはチオール基は、アシル化もし
    くはカルバモイル化されていてもよく；あるいは、該水素はアミノ基によって置
    換されていてもよく、このアミノ基はアシルアミノ基、ウレイド基、アミジノ基
    、クアニジノ基、もしくはアルキル基、または置換されたアミノ基におけるよう
    に誘導体化されていてもよく、第四級窒素基を含み；あるいは、カルボン酸基、
    ホスホン酸基もしくはスルホン酸基のような酸性基、またはそれらのエステルも
    しくはアミド、またはシアノ；あるいは末端アミノ酸基のようなそれらの組み合
    わせにより置換されていてもよく；そしてＲ1は、水素もしくは低級アルキル（ Ｃ1-6）もしくはジアルキルアミノアルキルである、請求項９９に記載の方法。
  104. 【請求項１０４】 前記ＭＤＰ−結合ホーミング分子が、７−（Ｌ−２−ア
    ミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカ
    ルボキサミド）−２−ヘプテン酸である、請求項１０３に記載の方法。
  105. 【請求項１０５】 前記Ｒ2が、カルボニルに隣接した炭素が第三級ではな いというように限定された、分枝したアルキルまたはシクロアルキルである、請
    求項１０３に記載の方法。
  106. 【請求項１０６】 前記Ｒ3が、第四級窒素、アミノ誘導体もしくはアミノ 酸誘導基である末端置換基を有する、ｎ−アルキル（１〜９個の炭素）もしくは
    ｎ−アルキル（１〜９個の炭素）である、請求項１０５に記載の方法。
  107. 【請求項１０７】 前記Ｒ2が、２，２−ジメチルシクロプロピルもしくは ２，２−ジクロロシクロプロピルであり、前記Ｒ3が、末端置換基を有さないか 、またはトリメチルアンモニウム、アミジノ、グアニジノもしくは２−アミノ−
    ２−カルボエチルチオである末端置換基を有する、３〜７個の炭素原子の炭化水
    素鎖である、請求項１０６に記載の方法。
  108. 【請求項１０８】 前記ＭＤＰ−結合ホーミング分子が、以下： Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−トリメチル
    アンモニウムヒドロキシド−２−オクテン酸内部塩； Ｚ−２−（２，２−ジクロロシクロプロパンカルボキサミド）−８−トリメチル
    アンモニウムヒドロキシド−２−オクテン酸内部塩； Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−グアニジノ
    −２−オクテン酸； Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−グアニジノ
    −２−オクテン酸； Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−８−ウレイド−
    ２−オクテン酸； Ｚ−８−（１−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２（２，２−ジメチ
    ルシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸； Ｚ−２−（２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸
    （ラセミ形および右旋性形）； Ｚ−２−（２，２−ジクロロシクロプロパンカルボキサミド）−２−オクテン酸
    ； ７−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチル
    シクロプロパンカルボキサミド）−２−へプテン酸；および ６−（Ｌ−２−アミノ−２−カルボキシエチルチオ）−２−（２，２−ジメチル
    クロロプロパンカルボキサミド）−２−ヘキセン酸、 からなる群から選択される、請求項１０７に記載の方法。
  109. 【請求項１０９】 前記ＭＤＰ−結合ホーミング分子が、ＭＤＰインヒビタ
    ーである、請求項９９に記載の方法。
  110. 【請求項１１０】 前記ＭＤＰインヒビターが、高くとも１０００ｎＭのＭ
    ＤＰに対するＫｉを示す、請求項１０９に記載の方法。
  111. 【請求項１１１】 前記ＭＤＰインヒビターが、高くとも１００ｎＭのＭＤ
    Ｐに対するＫｉを示す、請求項１１０に記載の方法。
  112. 【請求項１１２】 前記ＭＤＰインヒビターが、高くとも１ｎＭのＭＤＰに
    対するＫｉを示す、請求項１１１に記載の方法。
  113. 【請求項１１３】 前記癌が黒色腫である、請求項９９に記載の方法。
  114. 【請求項１１４】 癌を有する被験体において、肺転移を減少または防止す
    る方法であって、該被験体に膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ）陰性調節因子を投与す
    る工程を包含する、方法。
  115. 【請求項１１５】 前記ＭＤＰ陰性調節因子が可溶性ＭＤＰポリぺプチドで
    ある、請求項１１４に記載の方法。
  116. 【請求項１１６】 前記ＭＤＰ陰性調節因子がＭＤＰと選択的に反応する抗
    体である、請求項１１４に記載の方法。
  117. 【請求項１１７】 被験体において、肺内皮細胞への細胞ホーミングを減少
    または防止する方法であって、該被験体に膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ）陰性調節
    因子を投与する工程を包含する、方法。
  118. 【請求項１１８】 前記ＭＤＰ陰性調節因子が可溶性ＭＤＰポリぺプチドで
    ある、請求項１１７に記載の方法。
  119. 【請求項１１９】 前記ＭＤＰ陰性調節因子がＭＤＰと選択的に反応する抗
    体である、請求項１１７に記載の方法。
  120. 【請求項１２０】 肺転移を減少または防止する分子を同定する方法であっ
    て、該方法が以下の工程： ａ）膜ジペプチダーゼ（ＭＤＰ）を１以上の分子と接触させる工程；および ｂ）該分子の存在下でのＭＤＰ活性をコントロール値と比較して決定する工程
    、 を包含し、 ここで、該分子の存在下での減少したＭＤＰ活性は、該分子を肺転移を減少ま
    たは防止する分子として同定する、方法。
  121. 【請求項１２１】 前記ＭＤＰが実質的に精製されている、請求項１２０に
    記載の方法。
  122. 【請求項１２２】 ＭＤＰ活性が、Ｇｌｙ−Ｄ−ＰｈｅからのＤ−Ｐｈｅの
    放出により決定される、請求項１２０に記載の方法。
  123. 【請求項１２３】 請求項１２０に記載の方法であって、該方法が、さらに
    、以下： ｃ）前記分子を癌を有する被検体に投与する工程；および ｄ）該被験体における肺転移を、コントロールレベルの転移と比較してアッセ
    イする工程、 を包含する、方法。
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