JP2002218971A - 人工皮膚モデル、その作製方法及び用途 - Google Patents
人工皮膚モデル、その作製方法及び用途Info
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- JP2002218971A JP2002218971A JP2001019592A JP2001019592A JP2002218971A JP 2002218971 A JP2002218971 A JP 2002218971A JP 2001019592 A JP2001019592 A JP 2001019592A JP 2001019592 A JP2001019592 A JP 2001019592A JP 2002218971 A JP2002218971 A JP 2002218971A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】医薬品、化粧品等の安全性試験や皮膚生理研究
等に有用な、正常な透過バリア機能を有する人工皮膚モ
デルを提供する。 【解決手段】支持体上に細胞を播種し、インターロイキ
ン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１０（ＩＬ−１
０）、インターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）からなる群よ
り少なくとも一種以上を添加した培地により培養するこ
とを特徴とする人工皮膚モデルの作製方法によって得ら
れる人工皮膚モデル。
等に有用な、正常な透過バリア機能を有する人工皮膚モ
デルを提供する。 【解決手段】支持体上に細胞を播種し、インターロイキ
ン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１０（ＩＬ−１
０）、インターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）からなる群よ
り少なくとも一種以上を添加した培地により培養するこ
とを特徴とする人工皮膚モデルの作製方法によって得ら
れる人工皮膚モデル。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、３次元人工皮膚モ
デル及びその作製方法に関し、更に詳しくは、正常脂質
ラメラ構造及び正常な透過バリア機能を有する３次元人
工皮膚モデルおよびその作製方法に関する。
デル及びその作製方法に関し、更に詳しくは、正常脂質
ラメラ構造及び正常な透過バリア機能を有する３次元人
工皮膚モデルおよびその作製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】皮膚、特に角層と表皮は外来からの抗原
進入、体内からの水分放出防御の点で極めて重要な組織
である。皮膚の物性は、ヒトの皮膚を非侵襲的に測定し
調べることができる。しかし、皮膚の恒常性維持の詳細
なメカニズムや、薬物の皮膚透過性・代謝・薬理・毒性
作用は、主にモデル動物を用いて調べられている。一
方、１９９２年に動物実験代替法としてヒト人工皮膚モ
デルが報告された［International Journal of Cosm
et. Sci，Vol.14，p245-264］。この報告以降、多くの
種類の人工皮膚モデルが開発・市販され、構造や機能
が、より実際の皮膚に近くなるよう改良されている。こ
れらの人工皮膚モデルは、ポリカーボネートフィルター
やコラーゲンスポンジ等の支持体上に表皮細胞を播種し
培養することで、実際の皮膚と同様の４層（基底層、有
棘層、顆粒層、角層）からなる表皮層が形成される。ま
た、これらの人工皮膚モデルの培養には、アミノ酸や無
機塩類から成るＤＭＥＭ培地を基本組成とした培地が用
いられている。
進入、体内からの水分放出防御の点で極めて重要な組織
である。皮膚の物性は、ヒトの皮膚を非侵襲的に測定し
調べることができる。しかし、皮膚の恒常性維持の詳細
なメカニズムや、薬物の皮膚透過性・代謝・薬理・毒性
作用は、主にモデル動物を用いて調べられている。一
方、１９９２年に動物実験代替法としてヒト人工皮膚モ
デルが報告された［International Journal of Cosm
et. Sci，Vol.14，p245-264］。この報告以降、多くの
種類の人工皮膚モデルが開発・市販され、構造や機能
が、より実際の皮膚に近くなるよう改良されている。こ
れらの人工皮膚モデルは、ポリカーボネートフィルター
やコラーゲンスポンジ等の支持体上に表皮細胞を播種し
培養することで、実際の皮膚と同様の４層（基底層、有
棘層、顆粒層、角層）からなる表皮層が形成される。ま
た、これらの人工皮膚モデルの培養には、アミノ酸や無
機塩類から成るＤＭＥＭ培地を基本組成とした培地が用
いられている。
【０００３】皮膚の恒常性維持のメカニズムや、薬物の
皮膚透過性・代謝・薬理・毒性作用を調べる上で、人工
皮膚モデルの透過バリア機能が、実際の皮膚の透過バリ
ア機能に近く、正常であることが最も重要である。皮膚
の透過バリア機能は、角層細胞を構成する蛋白と、細胞
間に存在する脂質ラメラ構造から形成されている。特に
細胞間脂質ラメラ構造は皮膚の透過バリア機能には必須
の要素であり、この脂質ラメラ構造が正常な形態である
ことが望ましい。また皮膚の恒常性維持のメカニズムを
検討するうえで、皮膚に透過バリア崩壊（紫外線照射等
による誘発）や乾燥負荷した場合に、皮膚内部でモデル
動物と同様の反応が惹起されることが望ましい。しかし
従来の培養方法による人工皮膚モデルでは、脂質ラメラ
構造の形態異常や、基底細胞の形態異常、ラメラボディ
分泌の異常等、実際の皮膚とは異なる点が多く認められ
た［International Journal of Pharmaceutics，Vo
l.203，p211-225］。さらに、透過バリア崩壊や乾燥負
荷した場合に、モデル動物とは異なった反応が惹起され
ていた。このため、正常な透過バリア機能を有する人工
皮膚モデルおよびその作製方法が望まれていた。
皮膚透過性・代謝・薬理・毒性作用を調べる上で、人工
皮膚モデルの透過バリア機能が、実際の皮膚の透過バリ
ア機能に近く、正常であることが最も重要である。皮膚
の透過バリア機能は、角層細胞を構成する蛋白と、細胞
間に存在する脂質ラメラ構造から形成されている。特に
細胞間脂質ラメラ構造は皮膚の透過バリア機能には必須
の要素であり、この脂質ラメラ構造が正常な形態である
ことが望ましい。また皮膚の恒常性維持のメカニズムを
検討するうえで、皮膚に透過バリア崩壊（紫外線照射等
による誘発）や乾燥負荷した場合に、皮膚内部でモデル
動物と同様の反応が惹起されることが望ましい。しかし
従来の培養方法による人工皮膚モデルでは、脂質ラメラ
構造の形態異常や、基底細胞の形態異常、ラメラボディ
分泌の異常等、実際の皮膚とは異なる点が多く認められ
た［International Journal of Pharmaceutics，Vo
l.203，p211-225］。さらに、透過バリア崩壊や乾燥負
荷した場合に、モデル動物とは異なった反応が惹起され
ていた。このため、正常な透過バリア機能を有する人工
皮膚モデルおよびその作製方法が望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的とするところは、医薬品、化粧品等の安全性試験や
皮膚生理研究等に有用な、正常な透過バリア機能を有す
る人工皮膚モデルを提供することにある。
目的とするところは、医薬品、化粧品等の安全性試験や
皮膚生理研究等に有用な、正常な透過バリア機能を有す
る人工皮膚モデルを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記の目的は、インター
ロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１０（ＩＬ
−１０）、インターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）のうち１
〜３種を添加した培地により組織培養された人工皮膚モ
デルで達成できる。
ロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１０（ＩＬ
−１０）、インターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）のうち１
〜３種を添加した培地により組織培養された人工皮膚モ
デルで達成できる。
【０００６】即ち、本発明は、インターロイキン４（Ｉ
Ｌ−４）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、イン
ターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）からなる群より少なくと
も一種以上を添加した培地により培養することを特徴と
する組織培養法、支持体上に細胞を播種し、インターロ
イキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１０（ＩＬ−
１０）、インターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）からなる群
より少なくとも一種以上を添加した培地により培養する
ことを特徴とする人工皮膚モデルの作製方法、支持体上
に皮膚線維芽細胞を播種し培養した後、表皮角化細胞を
播種培養することによって得られる人工皮膚を、更に、
インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１
０（ＩＬ−１０）、インターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）
からなる群より少なくとも一種以上を添加した培地によ
り培養することを特徴とする人工皮膚モデルの作製方
法、及びこれらの作製方法によって得られる人工皮膚モ
デル、正常脂質ラメラ構造を有する人工皮膚モデルにあ
る。
Ｌ−４）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、イン
ターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）からなる群より少なくと
も一種以上を添加した培地により培養することを特徴と
する組織培養法、支持体上に細胞を播種し、インターロ
イキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１０（ＩＬ−
１０）、インターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）からなる群
より少なくとも一種以上を添加した培地により培養する
ことを特徴とする人工皮膚モデルの作製方法、支持体上
に皮膚線維芽細胞を播種し培養した後、表皮角化細胞を
播種培養することによって得られる人工皮膚を、更に、
インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１
０（ＩＬ−１０）、インターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）
からなる群より少なくとも一種以上を添加した培地によ
り培養することを特徴とする人工皮膚モデルの作製方
法、及びこれらの作製方法によって得られる人工皮膚モ
デル、正常脂質ラメラ構造を有する人工皮膚モデルにあ
る。
【０００７】
【発明の実施の形態】人工皮膚モデルは、一般に、ポリ
カーボネートフィルター、コラーゲン等からなるスポン
ジ等の支持体上に表皮細胞（皮膚線維芽細胞、表皮角化
細胞）を播種し、必要により浸漬培養、気液培養を組み
合わせて作製されるものであり、作製された人工皮膚モ
デルやその作製キットが市販されている。市販されてい
るものとして、Test Skin (Organogenesis社, US
A)、Skin (Advanced Tissue Science社, USA)、Epi
Derm (MatTek Corporation社, USA) 、Episkin (E
piskin SNC社, France)、 SkinEthic (Laboratoire
SkinEthic社, France)、LSE（東洋紡社、Japan）等
を挙げることができる。支持体としては、播種した表皮
細胞が接着又は固定され、その上で増殖するものであれ
ば特に限定されるものではなく、支持体を基盤として三
次元状に細胞が培養される。
カーボネートフィルター、コラーゲン等からなるスポン
ジ等の支持体上に表皮細胞（皮膚線維芽細胞、表皮角化
細胞）を播種し、必要により浸漬培養、気液培養を組み
合わせて作製されるものであり、作製された人工皮膚モ
デルやその作製キットが市販されている。市販されてい
るものとして、Test Skin (Organogenesis社, US
A)、Skin (Advanced Tissue Science社, USA)、Epi
Derm (MatTek Corporation社, USA) 、Episkin (E
piskin SNC社, France)、 SkinEthic (Laboratoire
SkinEthic社, France)、LSE（東洋紡社、Japan）等
を挙げることができる。支持体としては、播種した表皮
細胞が接着又は固定され、その上で増殖するものであれ
ば特に限定されるものではなく、支持体を基盤として三
次元状に細胞が培養される。
【０００８】本発明においては、これらのいずれも用い
ることができ、上記のキットを用い、培地調製から始め
ても良いし、出来上がった人工皮膚を購入して用いても
良い。また用いる細胞としては、ヒトに限らず、マウ
ス、ラット、ブタ等の表皮細胞でも良い。
ることができ、上記のキットを用い、培地調製から始め
ても良いし、出来上がった人工皮膚を購入して用いても
良い。また用いる細胞としては、ヒトに限らず、マウ
ス、ラット、ブタ等の表皮細胞でも良い。
【０００９】本発明に用いるサイトカインであるＩＬ−
４、ＩＬ−１０、ＩＮＦ−γとしては、通常それぞれの
人工皮膚モデルに応じた種由来の天然型、あるいは組み
換え型サイトカインを用いるが、活性を有すれば改変
型、異種由来、もしくは非精製品を用いることができ
る。ＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＮＦ−γは、水や培地
等に適宜溶解し、培地に添加する。添加量は、一概には
規定できないが１ｐｇ／ｍＬから１ｍｇ／ｍＬ程度の濃
度とすることが望ましい。
４、ＩＬ−１０、ＩＮＦ−γとしては、通常それぞれの
人工皮膚モデルに応じた種由来の天然型、あるいは組み
換え型サイトカインを用いるが、活性を有すれば改変
型、異種由来、もしくは非精製品を用いることができ
る。ＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＮＦ−γは、水や培地
等に適宜溶解し、培地に添加する。添加量は、一概には
規定できないが１ｐｇ／ｍＬから１ｍｇ／ｍＬ程度の濃
度とすることが望ましい。
【００１０】一般に行われる人工皮膚モデルの調製方法
の概略は、皮膚線維芽細胞を播種したコラーゲンゲル等
の支持体を調製し、それに表皮角化細胞を播種し気液培
養するものである。
の概略は、皮膚線維芽細胞を播種したコラーゲンゲル等
の支持体を調製し、それに表皮角化細胞を播種し気液培
養するものである。
【００１１】
【実施例】以下実施例によって本発明を説明する。以下
の実施例に用いたサイトカインは以下のとおりである。 ＩＬ−４；recombinant human IL-4, INTERGEN COM
PANY社, USA ＩＬ−１０；recombinant human IL-10, INTERGEN
COMPANY社, USA ＩＮＦ−γ；recombinant human INF-γ, INTERGEN
COMPANY, USA
の実施例に用いたサイトカインは以下のとおりである。 ＩＬ−４；recombinant human IL-4, INTERGEN COM
PANY社, USA ＩＬ−１０；recombinant human IL-10, INTERGEN
COMPANY社, USA ＩＮＦ−γ；recombinant human INF-γ, INTERGEN
COMPANY, USA
【００１２】実施例１〜３、比較例１（ヒト人工皮膚モ
デルの作製） 既製ヒト人工皮膚モデル（ＬＳＥhigh，東洋紡社）を用
い、ＬＳＥアッセイ培地にＩＬ−４、ＩＬ−１０、ある
いはＩＮＦ−γを１０ｎｇ／ｍＬ添加し、３７℃の５％
ＣＯ2インキュベーター内にて３日間空気暴露培養して
人工皮膚モデルを得た。無添加をコントロールとした。
培養３日後にヒト人工皮膚モデル皮膚を採取し、グルタ
ルアルデヒド・パラホルムアルデヒド含有カコジル酸緩
衝液にて固定した。１％オスミウム酸による前固定後、
０．２％ルテニウム酸染色を施し、電子顕微鏡（JEM100
S, JEL社, Tokyo）により角層の脂質ラメラ構造を観
察した。
デルの作製） 既製ヒト人工皮膚モデル（ＬＳＥhigh，東洋紡社）を用
い、ＬＳＥアッセイ培地にＩＬ−４、ＩＬ−１０、ある
いはＩＮＦ−γを１０ｎｇ／ｍＬ添加し、３７℃の５％
ＣＯ2インキュベーター内にて３日間空気暴露培養して
人工皮膚モデルを得た。無添加をコントロールとした。
培養３日後にヒト人工皮膚モデル皮膚を採取し、グルタ
ルアルデヒド・パラホルムアルデヒド含有カコジル酸緩
衝液にて固定した。１％オスミウム酸による前固定後、
０．２％ルテニウム酸染色を施し、電子顕微鏡（JEM100
S, JEL社, Tokyo）により角層の脂質ラメラ構造を観
察した。
【００１３】（実施例１；図１）ＩＬ−４添加培地によ
って得られたヒト人工皮膚モデルの角層脂質ラメラ構造
電顕写真
って得られたヒト人工皮膚モデルの角層脂質ラメラ構造
電顕写真
【００１４】（実施例２；図２）ＩＬ−１０添加培地に
よって得られたヒト人工皮膚モデルの角層脂質ラメラ構
造電顕写真
よって得られたヒト人工皮膚モデルの角層脂質ラメラ構
造電顕写真
【００１５】（実施例３；図３）ＩＮＦ−γ添加培地に
よって得られたヒト人工皮膚モデルの角層脂質ラメラ構
造電顕写真
よって得られたヒト人工皮膚モデルの角層脂質ラメラ構
造電顕写真
【００１６】（比較例１、図４）コントロール（既製ヒ
ト人工皮膚モデル；ＬＳＥhigh，東洋紡社）の角層脂質
ラメラ構造電顕写真
ト人工皮膚モデル；ＬＳＥhigh，東洋紡社）の角層脂質
ラメラ構造電顕写真
【００１７】比較例１（図４）に示したように、既製ヒ
ト人工皮膚モデルの角層では、正常な脂質ラメラ構造が
ほとんど観察されず、層構造をとらない脂質滴が多く観
察された。一方、実施例１、２及び３に示したように、
ＩＬ−４、ＩＬ−１０あるいはＩＮＦ−γ添加培地によ
る培養により、正常な脂質ラメラ構造が観察された。以
上の結果より、ＩＬ−４、ＩＬ−１０あるいはＩＮＦ-
ｒ添加培地による培養により、正常な脂質ラメラ構造が
形成されることは明白である。
ト人工皮膚モデルの角層では、正常な脂質ラメラ構造が
ほとんど観察されず、層構造をとらない脂質滴が多く観
察された。一方、実施例１、２及び３に示したように、
ＩＬ−４、ＩＬ−１０あるいはＩＮＦ−γ添加培地によ
る培養により、正常な脂質ラメラ構造が観察された。以
上の結果より、ＩＬ−４、ＩＬ−１０あるいはＩＮＦ-
ｒ添加培地による培養により、正常な脂質ラメラ構造が
形成されることは明白である。
【００１８】試験例１（紫外線照射後のＤＮＡ合成能評
価試験） 既製ヒト人工皮膚モデル（ＬＳＥhigh，東洋紡社）にＵ
Ｖ−Ｂ（0．15Ｊ/ｃｍ 2）を１回照射した。その後、Ｉ
Ｌ−４、ＩＬ−１０、あるいはＩＮＦ−γを１０ｎｇ／
ｍＬ添加したＬＳＥアッセイ培地にて、人工皮膚モデル
を３７℃の５％ＣＯ2インキュベーター内にて４８時間
空気暴露培養した。ＤＮＡ合成能の測定のため、培養４
８時間後に、さらに[3Ｈ] Tymidine（1μＣｉ／ｍＬ）
を含有したＰＢＳにて１時間培養した。皮膚モデルはＰ
ＢＳで３回洗浄した後、表皮層を剥離した。表皮はＰＢ
Ｓ中でホモジネート処理および超音波処理にて粉砕し
た。２０％ＴＣＡを同量加え十分に攪拌後、遠心処理
（2000Ｇ、4℃、5分）を行った。沈渣はさらに５％ＴＣ
Ａを適量加えて攪拌後、遠心処理を行った。沈渣に５％
ＴＣＡを加え９０℃で１５分間反応させ、遠心処理（20
00Ｇ、4℃、5分）によりＤＮＡ画分（上清）を得た。Ｄ
ＮＡ画分中の放射活性は、液体シンチレーターにより測
定した。またジフェニルアミン発色液による呈色法によ
りＤＮＡ量を測定し、ＤＮＡ量当たりの[3Ｈ]Tymidine
取り込み活性をＤＮＡ合成能として算出した。サイトカ
イン無添加培地を用い、さらに紫外線未照射の人工皮膚
モデルをコントロールとし、コントロールのＤＮＡ合成
量に対する比率を算出した。
価試験） 既製ヒト人工皮膚モデル（ＬＳＥhigh，東洋紡社）にＵ
Ｖ−Ｂ（0．15Ｊ/ｃｍ 2）を１回照射した。その後、Ｉ
Ｌ−４、ＩＬ−１０、あるいはＩＮＦ−γを１０ｎｇ／
ｍＬ添加したＬＳＥアッセイ培地にて、人工皮膚モデル
を３７℃の５％ＣＯ2インキュベーター内にて４８時間
空気暴露培養した。ＤＮＡ合成能の測定のため、培養４
８時間後に、さらに[3Ｈ] Tymidine（1μＣｉ／ｍＬ）
を含有したＰＢＳにて１時間培養した。皮膚モデルはＰ
ＢＳで３回洗浄した後、表皮層を剥離した。表皮はＰＢ
Ｓ中でホモジネート処理および超音波処理にて粉砕し
た。２０％ＴＣＡを同量加え十分に攪拌後、遠心処理
（2000Ｇ、4℃、5分）を行った。沈渣はさらに５％ＴＣ
Ａを適量加えて攪拌後、遠心処理を行った。沈渣に５％
ＴＣＡを加え９０℃で１５分間反応させ、遠心処理（20
00Ｇ、4℃、5分）によりＤＮＡ画分（上清）を得た。Ｄ
ＮＡ画分中の放射活性は、液体シンチレーターにより測
定した。またジフェニルアミン発色液による呈色法によ
りＤＮＡ量を測定し、ＤＮＡ量当たりの[3Ｈ]Tymidine
取り込み活性をＤＮＡ合成能として算出した。サイトカ
イン無添加培地を用い、さらに紫外線未照射の人工皮膚
モデルをコントロールとし、コントロールのＤＮＡ合成
量に対する比率を算出した。
【００１９】 ＵＶ−Ｂ条件 培地添加物 ＤＮＡ合成量比率 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 実施例４ 照射 ＩＬ−４ １．８０ 実施例５ 照射 ＩＬ−１０ ２．４６ 実施例６ 照射 ＩＮＦ−γ １．４５ 比較例２ 照射 − １．１０ 比較例３ − − １．００ 比較例４ − ＩＬ−４ ０．９０ 比較例５ − ＩＬ−１０ ０．８４ 比較例６ − ＩＮＦ−γ １．１３
【００２０】モデル動物（ヘアレスマウス）では、紫外
線（ＵＶ−Ｂ）照射により細胞内ＤＮＡダメージが起こ
り、これがシグナルとなり種々の反応が惹起され、透過
バリアが崩壊することが報告されている[Photodermatol
Photoimmunol Photimed，Vol.13，p117-128，199
7］。またＤＮＡ合成能亢進は、透過バリア崩壊の重要
な指標であり、へアレスマウスではＵＶ−Ｂ照射４８時
間後に顕著にＤＮＡ合成が亢進する[J Invest Dermat
ol，Vol.108，p769-775,1997］。通常培地（サイトカイ
ン無添加）により培養したヒト人工皮膚モデルでは、Ｕ
ＶＢ照射後にＤＮＡ合成能は変動しなかった。一方、Ｕ
ＶＢ照射後にＩＬ−４、ＩＬ−１０、あるいはＩＮＦ−
γを添加した培地にて培養することで、ＤＮＡ合成が顕
著に亢進した。またＩＬ−４、ＩＬ−１０、あるいはＩ
ＮＦ−γ添加培地による培養だけではＤＮＡ合成は亢進
しなかった。以上の結果から、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、
あるいはＩＮＦ−γ添加培地でヒト人工皮膚モデルを培
養することにより、正常な透過バリア機能が形成され、
透過バリア崩壊誘発刺激に対しても、生体と類似の反応
を惹起させたことは明白である。
線（ＵＶ−Ｂ）照射により細胞内ＤＮＡダメージが起こ
り、これがシグナルとなり種々の反応が惹起され、透過
バリアが崩壊することが報告されている[Photodermatol
Photoimmunol Photimed，Vol.13，p117-128，199
7］。またＤＮＡ合成能亢進は、透過バリア崩壊の重要
な指標であり、へアレスマウスではＵＶ−Ｂ照射４８時
間後に顕著にＤＮＡ合成が亢進する[J Invest Dermat
ol，Vol.108，p769-775,1997］。通常培地（サイトカイ
ン無添加）により培養したヒト人工皮膚モデルでは、Ｕ
ＶＢ照射後にＤＮＡ合成能は変動しなかった。一方、Ｕ
ＶＢ照射後にＩＬ−４、ＩＬ−１０、あるいはＩＮＦ−
γを添加した培地にて培養することで、ＤＮＡ合成が顕
著に亢進した。またＩＬ−４、ＩＬ−１０、あるいはＩ
ＮＦ−γ添加培地による培養だけではＤＮＡ合成は亢進
しなかった。以上の結果から、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、
あるいはＩＮＦ−γ添加培地でヒト人工皮膚モデルを培
養することにより、正常な透過バリア機能が形成され、
透過バリア崩壊誘発刺激に対しても、生体と類似の反応
を惹起させたことは明白である。
【００２１】試験例２（乾燥負荷に対するＤＮＡ合成能
評価試験） 既製ヒト人工皮膚モデル（ＬＳＥhigh，東洋紡社）は、
ＩＬ−４、ＩＬ−１０、もしくはＩＮＦ−γを１０ｎｇ
／ｍＬ添加した、又はＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＮＦ
−γを各々１０ｎｇ／ｍＬ添加した培地に交換し、乾燥
負荷条件（湿度１０％、温度３７℃）にて６時間空気暴
露培養した。通常培地（サイトカイン無添加）により通
常培養条件（湿度９０％、温度３７℃）にて培養したヒ
ト人工皮膚モデルをコントロール（比較例８）とした。
更に、ＩＬ−４、ＩＬ−１０又はＩＮＦ−γを１０ｎｇ
／ｍＬ添加した培地にて通常培養条件にて６時間培養し
た人工皮膚モデル（比較例９〜１１）と比較した。培養
６時間後に、表皮層を剥離し、ＤＮＡ合成能を測定した
（試験例１の方法に準ずる）。ＤＮＡ合成能は、コント
ロールに対する比率で示した。
評価試験） 既製ヒト人工皮膚モデル（ＬＳＥhigh，東洋紡社）は、
ＩＬ−４、ＩＬ−１０、もしくはＩＮＦ−γを１０ｎｇ
／ｍＬ添加した、又はＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＮＦ
−γを各々１０ｎｇ／ｍＬ添加した培地に交換し、乾燥
負荷条件（湿度１０％、温度３７℃）にて６時間空気暴
露培養した。通常培地（サイトカイン無添加）により通
常培養条件（湿度９０％、温度３７℃）にて培養したヒ
ト人工皮膚モデルをコントロール（比較例８）とした。
更に、ＩＬ−４、ＩＬ−１０又はＩＮＦ−γを１０ｎｇ
／ｍＬ添加した培地にて通常培養条件にて６時間培養し
た人工皮膚モデル（比較例９〜１１）と比較した。培養
６時間後に、表皮層を剥離し、ＤＮＡ合成能を測定した
（試験例１の方法に準ずる）。ＤＮＡ合成能は、コント
ロールに対する比率で示した。
【００２２】 湿度条件 培地添加物 ＤＮＡ合成量比率 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 実施例７ １０％ ＩＬ−４ ２．１８ 実施例８ １０％ ＩＬ−１０ １．５９ 実施例９ １０％ ＩＮＦ−γ ２．２３ 実施例１０ １０％ ＩＬ−４，ＩＬ−１０ １．３７ ，ＩＮＦ−γ 比較例７ １０％ − ０．２９ 比較例８ ９０％ − １．００ 比較例９ ９０％ ＩＬ−４ １．１２ 比較例１０ ９０％ ＩＬ−１０ ０．９３ 比較例１１ ９０％ ＩＮＦ−γ １．２８
【００２３】比較例７に示したように、従来のヒト人工
皮膚モデルは、湿度１０％による乾燥負荷条件で、ＤＮ
Ａ合成能が顕著に低下することが示された。なおモデル
動物では乾燥負荷により、ＤＮＡ合成能が顕著に亢進す
ることが報告されている[Arch Dermatol Res，Vol.29
0，p634-637］。実施例７〜１０に示したように、ＩＬ
−４、ＩＬ−１０、もしくはＩＮＦ−γを添加した、又
はＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＮＦ−γを添加した培地
を用い湿度１０％で培養すると、モデル動物と同様に、
ＤＮＡ合成能が顕著に亢進することが示された。なお比
較例９〜１１で示したように、これらの培地を用い、通
常の培養条件（湿度９０％）にて培養した場合、ＤＮＡ
合成能の亢進は認められなかった。以上の結果より、Ｉ
Ｌ−４、ＩＬ−１０、ＩＮＦ−γを添加した培地により
既存のヒト人工皮膚モデルを培養することで、正常な透
過バリア機能応答が惹起され、乾燥負荷に対して、モデ
ル動物と類似した反応を誘発するヒト人工皮膚モデルが
作製されたことは明白である。
皮膚モデルは、湿度１０％による乾燥負荷条件で、ＤＮ
Ａ合成能が顕著に低下することが示された。なおモデル
動物では乾燥負荷により、ＤＮＡ合成能が顕著に亢進す
ることが報告されている[Arch Dermatol Res，Vol.29
0，p634-637］。実施例７〜１０に示したように、ＩＬ
−４、ＩＬ−１０、もしくはＩＮＦ−γを添加した、又
はＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＮＦ−γを添加した培地
を用い湿度１０％で培養すると、モデル動物と同様に、
ＤＮＡ合成能が顕著に亢進することが示された。なお比
較例９〜１１で示したように、これらの培地を用い、通
常の培養条件（湿度９０％）にて培養した場合、ＤＮＡ
合成能の亢進は認められなかった。以上の結果より、Ｉ
Ｌ−４、ＩＬ−１０、ＩＮＦ−γを添加した培地により
既存のヒト人工皮膚モデルを培養することで、正常な透
過バリア機能応答が惹起され、乾燥負荷に対して、モデ
ル動物と類似した反応を誘発するヒト人工皮膚モデルが
作製されたことは明白である。
【００２４】これらの結果より、ＩＬ−４、ＩＬ−１
０、ＩＮＦ−γの１〜３種を添加した培地にて人工皮膚
モデルを培養することにより、正常な角層ラメラ構造を
有し、また種々の負荷に対して生体と類似した反応を誘
発することができる正常な透過バリア機能を有する人工
皮膚モデル作製が可能であることが明らかとなった。
０、ＩＮＦ−γの１〜３種を添加した培地にて人工皮膚
モデルを培養することにより、正常な角層ラメラ構造を
有し、また種々の負荷に対して生体と類似した反応を誘
発することができる正常な透過バリア機能を有する人工
皮膚モデル作製が可能であることが明らかとなった。
【００２５】
【発明の効果】以上のごとく、本発明により、正常な透
過バリア機能を有する人工皮膚モデルの取得が可能とな
り、医薬品、化粧品等に対する有用性評価、安全性評価
等における優れた動物代替試験法が提供できる。
過バリア機能を有する人工皮膚モデルの取得が可能とな
り、医薬品、化粧品等に対する有用性評価、安全性評価
等における優れた動物代替試験法が提供できる。
【図１】ＩＬ−４添加培地によって得られたヒト人工皮
膚モデルの角層脂質ラメラ構造電顕写真を示す図であ
る。
膚モデルの角層脂質ラメラ構造電顕写真を示す図であ
る。
【図２】ＩＬ−１０添加培地によって得られたヒト人工
皮膚モデルの角層脂質ラメラ構造電顕写真を示す図であ
る。
皮膚モデルの角層脂質ラメラ構造電顕写真を示す図であ
る。
【図３】ＩＮＦ−γ添加培地によって得られたヒト人工
皮膚モデルの角層脂質ラメラ構造電顕写真を示す図であ
る。
皮膚モデルの角層脂質ラメラ構造電顕写真を示す図であ
る。
【図４】コントロール（既製ヒト人工皮膚モデル；ＬＳ
Ｅhigh，東洋紡社）の角層脂質ラメラ構造電顕写真を示
す図である。
Ｅhigh，東洋紡社）の角層脂質ラメラ構造電顕写真を示
す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 井上 紳太郎 神奈川県小田原市寿町５丁目３番28号 カ ネボウ株式会社基礎科学研究所内 Ｆターム(参考） 4B065 AA93X BB19 BB34 BC42 BC46 CA44 4C083 AA011 CC02
Claims (9)
- 【請求項１】 正常脂質ラメラ構造を有する人工皮膚モ
デル。 - 【請求項２】 インターロイキン４（ＩＬ−４）、イン
ターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターフェロンγ
（ＩＮＦ−γ）からなる群より少なくとも一種以上を添
加した培地により培養することを特徴とする組織培養
法。 - 【請求項３】 支持体上に細胞を播種し、インターロイ
キン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１０（ＩＬ−１
０）、インターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）からなる群よ
り少なくとも一種以上を添加した培地により培養するこ
とを特徴とする人工皮膚モデルの作製方法。 - 【請求項４】 支持体上に皮膚線維芽細胞を播種し培養
した後、表皮角化細胞を播種培養することによって得ら
れる人工皮膚を、更に、インターロイキン４（ＩＬ−
４）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インター
フェロンγ（ＩＮＦ−γ）からなる群より少なくとも一
種以上を添加した培地により培養することを特徴とする
人工皮膚モデルの作製方法。 - 【請求項５】 皮膚線維芽細胞及び表皮角化細胞がヒト
皮膚由来のものである請求項４記載の人工皮膚モデルの
作製方法。 - 【請求項６】 請求項３、４又は５記載の作製方法によ
って得られる人工皮膚モデル。 - 【請求項７】 請求項６記載の人工皮膚モデルを用いて
スクリーニングされた皮膚化粧料。 - 【請求項８】 請求項６記載の人工皮膚モデルを用いて
皮膚外用剤として有用なる物質をスクリーニングする方
法。 - 【請求項９】 請求項６記載の人工皮膚モデルを用いて
化粧料をスクリーニングする方法。
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|---|---|---|---|
| JP2001019592A JP4520647B2 (ja) | 2001-01-29 | 2001-01-29 | 人工皮膚モデル、その作製方法及び用途 |
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| JP2001019592A JP4520647B2 (ja) | 2001-01-29 | 2001-01-29 | 人工皮膚モデル、その作製方法及び用途 |
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| JP2002218971A true JP2002218971A (ja) | 2002-08-06 |
| JP4520647B2 JP4520647B2 (ja) | 2010-08-11 |
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| JP2001019592A Expired - Fee Related JP4520647B2 (ja) | 2001-01-29 | 2001-01-29 | 人工皮膚モデル、その作製方法及び用途 |
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-
2001
- 2001-01-29 JP JP2001019592A patent/JP4520647B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
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