KR101662603B1 - 모유두세포 및 모모세포의 활성화능을 갖는 펩톤발효물을 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물, 및 이의 제형 - Google Patents

Abstract

본 발명은 펩톤발효물을 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물 및 이의 제형에 관한 것으로, 보다 상세하게는 펩톤발효물을 포함하는 탈모 방지 또는 육모, 발모 촉진을 위한 화장료 조성물, 또는 모발 건강 증진용 화장료 조성물 및 이의 제형에 관한 것이다.

Description

모유두세포 및 모모세포의 활성화능을 갖는 펩톤발효물을 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물, 및 이의 제형{Cosmetic composition for prevention of depilation and improvement of hair growth having fermented peptone having activator of dermal papilla cell and geminal matrix cell, and formulation having the same}

본 발명은 모유두세포 및 모모세포의 활성화능을 갖는 펩톤발효물을 포함하는 탈모방지 및/또는 발모촉진용 화장료 조성물 및 이의 제형에 관한 것으로, 보다 상세하게는 펩톤발효물을 포함하는 탈모 방지 및/또는 육모, 발모 촉진을 위한 화장료 조성물, 또는 모발 건강 증진용 화장료 조성물, 및 이의 제형에 관한 것이다.

인체의 모발은 약 10만 내지 15만개 정도로, 성장기(anagen), 퇴행기(catagen), 휴지기(telogen)를 거쳐 성장 및 탈락을 반복한다. 정상인의 모발은 하루에 약 50~100개 정도가 자연적으로 탈락하게 되는데, 여러 원인으로 인해 정상적으로 탈락하는 모발수보다 더 많은 모발이 탈락하는 경우를 탈모라 한다. 최근 여러 가지 복잡한 원인으로 인해 남성은 물론, 여성에게도 발생률이 증가하고 있으며 연령대도 점차 낮아지고 있다.

탈모증은 크게 남성형탈모증, 여성형탈모증, 원형탈모증으로 나뉘며, 남성호르몬 작용에 의한 모발주기의 비정상화 및 모근의 약화, 모발 주기 조절과 관련된 모유두세포(dermal papilla cell)와 모모세포(geminal matrix cell)의 기능저하 또는 증식억제, 두피로의 혈류량 저하로 인한 모발주기의 비정상적 변화, 노화현상, 피부질환, 항암제, 정신적 스트레스, 물리적 자극, 영양결핍, 병리학적요인(질병 및 약물)의 작용 및 환경오염 등, 매우 다양한 원인들이 단독 혹은 복합적으로 작용하면서 탈모가 발생한다.

이중, 남성형 탈모증은 남성호르몬인 테스토스테론(Testosterone)이 5 알파-리덕타아제(5 a-reductase)에 의해 디하이드로테스토스테론(Dihydrotestosterone: DHT)으로 변하게 되면서 이 호르몬이 모낭에 작용하여 모유두세포와 모모세포를 약화시키고 모낭을 축소시켜 성장기 단계에서 퇴화기 단계로 유도함으로서 탈모가 일어나게 한다.

여성형 탈모증의 경우에는 주로 폐경기 이후 에스트로겐 양의 감소에 의해 발생하게 되는데, 남성형 탈모증과는 다르게 머리 앞부분은 빠지지 않고 중간 부분의 머리만 탈모된다. 이러한 현상은 남성호르몬의 수치와 5 알파-리덕타아제(5 a-reductase)가 남성의 1/2정도로 적으며, 헤어라인을 중심으로 아로마타제라는 효소가 있어 남성호르몬 및 5 알파-리덕타아제에 대해 길항작용을 일으키기 때문이다.

원형 탈모증은 면역계의 이상이나 정신적 스트레스, 혈류장애, 유전적 요인에 의해 발생한다. 원형 또는 난원형의 탈모가 일어나며, 두부 백선이나 발모벽이 생기는 특징을 갖고 있다. 이러한 원형 탈모증은 안드로겐성 탈모증과는 그 원인이 다르다.

탈모증에 대해 현재까지 알려진 대표적인 치료법은 혈액순환을 돕는 미녹시딜(minoxidil; 6-Amino-1,2-dihydro-1-hydroxy-2-imino-4-phenoxypyrimidine)용액의 도포, 5 알파-리덕타아제를 저해시키는 피나스테라이드(Finasteride, Propecia; MSD) 약물 복용, 자가모발 이식술로 나뉜다. 미녹시딜의 경우, 처음에 고혈압 치료를 위한 혈관확장제로 개발되었으나, 부작용으로 다모증이 보고되면서 발모제로 개발되었다. 미녹시딜의 발모효과에 대한 작용기전은 현재까지 명확히 밝혀지지 않았지만, 혈관확장을 통한 영양공급 증가로 모발성장이 유도되는 것으로 생각되어지고 있다. 또한, 피나스테라이드는 남성호르몬 대사에 작용하는 효소인 5 알파-리덕타아제의 활성을 억제시키는 물질로서 처음에는 전립선 비대증 치료제로 개발되었으나, 이 또한 부작용으로 다모증이 보고되면서 발모제로 개발되었다.

그러나, 둘 다 사용시에만 효과가 있고 사용을 중단하며 효과가 사라지기 때문에 지속적으로 사용해야만 한다는 불편함이 있고, 미녹시딜의 경우 끈적이는 사용감과 피부 자극이라는 부작용이, 피나스테라이드의 경우에는 정력감퇴, 발기 부전 등의 성기능 장애가 있어 보고되고 있어 지속적인 사용에 많은 제한이 따른다.

자기모발 이식술의 경우에도 머리카락을 일일이 이식하는데 많은 비용이 소모될 뿐만 아니라 이식기간이 길고, 자신의 모발만을 이식할 수 있어 이식 모발수의 제한이 있다는 문제점이 있다.

최근 들어 육모 및 탈모 기전에 관여하는 많은 조절 인자들에 대한 연구가 활발히 진행되면서 탈모치료에 대한 전망은 점점 밝아지고 있다. 특히 성장기, 퇴행기 및 휴지기의 모발주기에 관련된 여러 인자들과 그들의 수용체에 의한 신호전달에 의해 육모효과가 조절된다는 사실이 밝혀지면서 보다 근원적인 탈모치료의 길이 모색되고 있다.

모발의 성장은 여러 유전자와 성장인자 및 그 수용체, 전신적 호르몬의 작용 등으로 인한 복잡한 기전에 의해 일어나는데, 특히 상피세포로 이루어진 모낭의 모기질세포(dermal matrix cell)와 간엽세포로 구성된 모유두세포(dermal papilla cell)가 모발의 형성 및 성장에 중추적인 요소로 작용하는 것으로 알려져 있다(도 1 참조).

모유두세포는 모낭의 기저부에 존재하는 세포로, 모낭을 구성하는 세포들에게 산소와 영양을 공급하여 모발의 성장과 모낭 주기 조절을 담당한다. 따라서 모유두세포의 증식이 촉진되면 모발이 건강해지고 모발 성장이 촉진되며 탈모를 막을 수 있다. 모발의 성장은 모유두(dermal papilla)를 둘러싸고 있는 상피세포(epithelial cell)가 분열하여 모간(hair shaft)을 만들면서 진행되기 때문에 모유두세포는 상피세포의 분열을 조절하는 중요한 역할을 한다. 또한 남성형 탈모증에서 남성호르몬이 모낭에 작용하는 부위 역시 모유두로서 모유두세포는 발모에 있어 매우 중요한 역할을 하고 있다.

모모세포(geminal matrix cell)는 모유두에 접하고 있는 부분으로서 모유두로부터 공급받은 영양소와 산소를 이용해 활발한 세포분열을 일으키며 모발을 생성한다. 생성된 모발은 모공 가까이로 밀려 올라가며, 모구부와 피지선 아래부위에 존재하는 각화 이행부를 거치는 과정에서 점차적으로 수분이 빠져나가 타원형의 형태로 변화되고, 시스틴(cystin) 가교가 형성되어 모발이 안정화된다. 이러한 과정을 통하여 두피 밖으로 밀려나온 각화모발은 죽은 세포와 세포 간충물질로 구성되어 있으며 단단한 케라틴 단백질로 이루어지게 된다. 특히, 남성형 탈모증에서 남성호르몬이 모낭에 작용하는 부위는 모유두와 모유두를 둘러싸고 있는 모모세포로서 활발한 세포분열을 통해 모발을 형성하는 모모세포가 발모에 있어 매우 중요한 역할을 한다. 따라서 모모세포의 증식이 촉진되면 모발이 건강해지고 모발 성장이 촉진되며 탈모를 막을 수 있다.

Jahoda(Jahoda CA, et al., Induction of hair growth by implantation of cultured dermal papilla cells., Nature, 311, pp.560-562, 1984) 등이 행한 연구에 따르면 쥐의 콧수염 모낭에서 모유두세포(dermal papilla cell)를 제거하자 모발의 성장이 일시적으로 중지하였다가 진피 근초로부터 세포가 이동하여 다시 모유두세포(dermal papilla cell)를 형성하면서 모발의 성장이 다시 계속되었으며, 모낭의 아랫부분을 1/3 이하로 제거하면 진피 근초로부터 모유두세포(dermal papilla cell)가 형성되고 외피 근초로부터 모기질세포가 형성되어 모발의 성장이 계속되나 모낭의 아랫부분의 1/3 이상을 제거하면 모발의 성장이 중지된다고 보고하고 있다. 또한 모낭의 아랫부분 1/3 이상을 제거한 후, 분리된 모유두세포(dermal papilla cell)를 다시 이식하자 모발의 성장이 계속되었다고 보고하면서, 모근을 형성하고 있는 모유두세포(dermal papilla cell)와 모모세포(germinal matrix cell)는 모발의 생성 및 성장에 매우 중요한 역할을 하고 있다고 밝혔다.

한편, 이러한 연구결과와 함께 모낭 및 모낭을 구성하는 다양한 세포들의 배양법 개발은 탈모기전 연구를 위한 중요한 단서를 제공하는 동시에 유용한 평가모델로 활용되고 있다. 현재 다양한 연구분야에서 시험 물질의 모발 신장 효과를 측정하는 방법으로서 모발 조직 배양이 이루어지고 있으며, 일반적으로 인체 유래의 모유두세포 및 모모세포를 이용하고 있다.

동물모델을 이용한 모발 생장기 유도 효과 평가에는 C57BL/6 마우스가 주로 이용된다. C57BL/6 마우스에는 색소를 합성하는 멜라닌 세포가 모낭에만 특이적으로 존재하며 생장기에만 멜라닌색소 합성이 이루어지기 때문에 마우스 피부색이 생장기에는 검은색을 띠는 반면, 퇴행기 및 휴지기에는 분홍색을 띈다. C57BL/6 마우스의 모발주기를 살펴보면, 생후 6-7주가 지나면 마우스의 피부는 휴지기 상태로 접어들게 된다. 이러한 특성을 이용하여 휴지기 상태인 마우스의 털을 동시에 제거한 후, 시험물질을 수주에 걸쳐 처리하면서 마우스의 피부색변화를 관찰하면, 시험물질에 의한 생장기 유도 효과를 평가할 수 있다.

1. 대한민국 특허번호 10-1049776 (2011. 7. 19 공개: 탈모방지 및 발모촉진용 화장료 조성물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 헤어 케어용 조성물) 2. 대한민국 특허번호 10-1103651 (2012. 1. 11 공개: 탈모 방지 및 발모 촉진 효과를 갖는 한방 추출물을 함유하는 모발화장료 조성물)

한편, 시중에 유통되고 있는 발모 관련 제품들은 다양하고 많으나, 대부분 탈모방지 및 발모 효과가 미비하거나 일시적이어서 사용자의 요구를 충족하지 못하고 있으며 효능이나 안전성에 관한 근거 자료 또한 미흡하다. 효과가 확인된 미녹시딜과 프로페시아의 경우에도, 사용을 중단할 시에는 다시 탈모증이 재발되거나 성기능 장애와 같은 심각한 부작용 등이 보고되면서 사용에 많은 제한을 받고 있다. 따라서 부작용은 적으면서도 객관적이고 재현성 있는 효과가 검증된 천연약물의 개발이 요구되어 지고 있다.

천연물을 이용한 발모에 대한 많은 특허들이 있기는 하나 효과에 대한 객관적이고 재현성 있는 검토가 이뤄진 천연약물이 많지 않아 천연물로부터의 새로운 발모 성분 또는 소재의 발굴 여지가 많고 그에 따른 개발의 필요성 또한 증대되고 있다.

이에 본 발명자들은 다양한 천연물질에 의한 탈모 방지 및 발모 개선 효과에 대해 연구하고 스크리닝한 결과, 펩톤화된 단백분해물을 이용해 이를 발효시킨 펩톤발효물이 모유두세포와 모모세포를 활성화시키고 증식을 촉진시킨다는 사실을 확인하고, 인체 발모능과 생체 안전성을 밝혀냄으로서 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 펩톤발효물을 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 펩톤발효물을 포함하는 모발 건강 증진용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 펩톤발효물은 펩톤화된 단백질을 발효시킨 것을 포함하며, 펩톤화된 단백질은 콩펩톤, 밀펩톤, 감자펩톤, 카제인펩톤, 밀크펩톤, 젤라틴펩톤 및 어류펩톤으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 콩펩톤은 서리태, 서목태, 흑태, 황태, 강낭콩, 얼룩강낭콩, 울타리콩, 푸르대콩, 녹두, 적두, 거두, 콩나물콩, 선비콩, 대두 및 풋콩으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 콩을 펩톤화시킨 단백분해물을 사용할 수 있으며, 특히 바람직하게는 대두펩톤을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 펩톤발효물은 유산균에 의해 발효시킬 수 있으며, 특히 락토바실러스 속 균주의 유산균에 의해 발효시킬 수 있다. 또한 유산균 발효 후, 동결건조 등의 건조처리 후에 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 탈모방지/발모촉진 또는 모발 건강 증진용 화장료 조성물을 제조하기 위한 펩톤발효물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 상기 화장료 조성물을 포함하는 화장료 제형을 제공한다. 특히 제한되지는 않지만, 상기 화장료 제형은 유액, 화장수, 크림, 로션, 에센스, 팩, 젤, 미스트, 샴푸, 린스, 비누 등에서 선택될 수 있다.

본 발명은 또한, 펩톤발효물을 포함하는 헤어 케어용 조성물을 제공한다. 상기 펩톤발효물은 목적하는 용도, 탈모방지/발모촉진 또는 모발 건강 증진을 위해 적량 포함될 수 있으며, 예컨대, 총 헤어 케어용 조성물에 대해 0.01 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 20 중량%을 포함될 수 있다. 상기 헤어 케어용 조성물은 모발 영양화장수, 스칼프트리트먼트, 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트 및 헤어크림으로 구성된 군으로부터 선택된 형태일 수 있다.

본 발명은 또한, 펩톤화된 단백분해물을 포함한 배지를 제조하는 제 1 단계; 상기 제 1 단계에서 제조된 배지에 유산균을 접종하는 제 2 단계; 상기 제 2 단계의 접종된 유산균을 배양하여 펩톤화된 단백질을 발효시켜 펩톤발효물을 제조하는 제 3 단계; 상기 제 3 단계에서 제조된 펩톤발효의 균체 및 불용성 성분을 제거하는 제 4 단계; 및 상기 제 4 단계에서 수득한 균체 및 불용성 성분이 제거된 펩톤발효물을 건조하는 제 5 단계를 포함하는, 탈모방지 또는 발모촉진용 펩톤발효물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 제 1 단계의 펩톤화된 단백분해물은 콩펩톤, 밀펩톤, 감자펩톤, 카제인펩톤, 밀크펩톤, 젤라틴펩톤 및 어류펩톤으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 또한, 제 2 단계에서 사용되는 유산균은 락토바실러스 속 균주일 수 있다. 또한, 제 3 단계에서 펩톤화된 단백분해물의 발효는 25 내지 35 의 온도에서 12 내지 120시간 동안 수행될 수 있다.

본 발명의 조성물은, 또한 상기 제조방법으로 제조된 펩톤발효물을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어, 용어 "펩톤화된 단백질" 또는 "펩톤화된 단백분해물"은 산, 염기, 효소 등으로 단백질을 분해한 산물로서 분자량이 작은 펩타이드들의 혼합물을 말한다. 단백질이 가수분해되면 프로테오스(proteose), 펩톤(peptone), 펩티드(peptide)와 마지막으로 아미노산의 순서로 변해가는데, 펩톤은 프로테오스 보다 저분자로, 수용성이며 수용액은 거의 중성 또는 약한 산성을 나타내고, 열에 의해서 응고되지 않으며 황산암모늄이나 탄닌산을 가해도 침전하지 않는다. 펩톤은 유기영양세균의 배양에 질소원으로 사용되는 원료로서 식용이 가능할 뿐 아니라, 경피 도포가 가능한 안전성이 확보된 소재이다. 여기서 펩톤화된 단백분해물은 식물성 펩톤과 동물성펩톤을 총칭하며, 더욱 구체적으로는 대두펩톤(soybean peptone), 밀펩톤(wheat peptone), 감자펩톤(potatoes peptone), 카제인펩톤(casein peptone), 밀크펩톤(milk peptone), 젤라틴펩톤(gelatin peptone), 어류펩톤(fish peptone)등을 일컫는다.

본 발명에 있어, 용어 "펩톤발효물" 또는 "발효펩톤"은 펩톤화된 단백분해물을 유산균 등을 이용하여 발효시킨 것을 말한다. 상기 펩톤발효물은 추가의 처리, 예컨대, 건조, 동결건조 등을 수행하여 처리된 물질도 펩톤발효물에 포함됨이 의도된다. 또한, 본 발명의 "펩톤발효물"은 이의 약제적 또는 식품학적으로 허용 가능한 유도체를 포함하는 것이 의도된다. "약제적 또는 식품학적으로 허용 가능한 유도체"란 상기 펩톤발효물의 원하는 생물학적 활성을 유지하고 원하지 않는 독성학적 효과를 나타내지 않는 본 발명의 펩톤발효물의 치환체, 부가물 등을 포함하는 것으로 의도된다.

본 발명의 조성물은 예컨대, 모모세포 및/또는 모유두세포의 활성화, 증식 또는 성장을 통해 탈모의 방지 또는 육모/발모 촉진, 또는 모발 건강 증진 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 조성물은 화장품 분야에서 공지의 방법의 의해 제제화될 수 있고, 그 자체 또는 화장품 분야 허용되는 담체, 부형제 등과 혼합하여 화장품 분야에서 통상으로 허용되는 제제 등으로 제제화될 수 있으며, 이들은 피부외용적으로 적합한 양으로 예컨대, 하루 1회에서 5회 도포될 수 있다.

또한 본 발명의 조성물은 그 자체, 또는 이를 리포좀에 담지시킨 상태로, 마이크로니들에 의해 두피에 적용할 수 있다. 상기 마이크로니들은 통상의 아미크로니들 시술법에 적용될 수 있는 의료용 또는 화장품용 회전체에 장착된 롤러장치를 사용하여 적용할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 우수한 탈모방지 및/또는 발모 효과를 갖는다. 또한, 본 발명의 조성물은 우수한 모발 건강 증진 효과를 나타낸다.

도 1은 모발의 구조를 도시한 도면이다.
도 2는 본 발명의 발효펩톤의 제조방법의 일 구체예를 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 실시예 및 비교예들의 모모세포 증식효과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 실시예의 펩톤발효물의 모모세포 증식효과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 다른 실시예의 기타 펩톤발효물의 모모세포 증식효과를 나타낸 도면이다.
도 6 및 도 7은 본 발명의 실시예의 모유두세포 성장효과를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 다른 실시예의 기타 펩톤발효물의 모유두세포 증식효과를 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 실시예의 조성물 투여 후 마우스의 장기 무게를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 본 발명의 실시예의 조성물 투여 후 마우스의 발모상태를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 실시예의 조성물 투여 후 마우스의 주차 별 발모 점수를 나타낸 도면이다.
도 12는 본 발명의 실시예의 조성물 투여 후 마우스의 평균 털 무게를 나타낸 도면이다.
도 13은 본 발명의 실시예의 조성물 투여 후 마우스의 모낭의 깊이를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 본 발명의 실시예의 조성물 투여 후 마우스의 모낭의 깊이를 측정한 이미지이다.
도 15는 본 발명의 실시예의 조성물 투여 후 피부 조직의 효소활성도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 16a ~ 도 16b는 시험예 4에서 수행한 실시예 1에서 제조한 펩톤발효물에 대한 HLPC 측정 결과로서, 도 16a는 0 ~ 60 분까지, 도 16b는 0 ~ 25분까지의 결과를 나타낸 것이다.
도 17a ~ 도 17e 각각은 실험예 1에서 수행한 MS 스펙트럼 측정 결과로서, 도 16b에 표시된 부분의 분자량을 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 바람직한 일 구체예를 예로 들어 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 펩톤발효물을 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 펩톤발효물을 포함하는 모발 건강 증진용 화장료 조성물을 제공한다.

이 때, 상기 펩톤발효물은 펩톤화된 단백질을 발효시킨 것일 수 있다.

상기 펩톤발효물은 중량평균분자량 200 ~ 500의 저분자 펩타이드를 포함할 수 있으며, 상기 저분자 펩타이드는 디펩타이드, 트리펩타이드 및 테트라 펩타이드 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

그리고, 화장료 조성물은 펩톤발효물을 0.25 mg/㎖ ~ 12.5 mg/㎖, 바람직하게는 0.5 mg/㎖ ~ 10.0 mg/㎖ 포함할 수 있다. 이와 같은 농도 범위로 펩톤발효물을 포함하는 화장료 조성물은 탈모방지 및/또는 발모촉진이 더욱 우수할 수 있다.

상기 펩톤화된 단백질은 콩펩톤, 밀펩톤, 감자펩톤, 카제인펩톤, 밀크펩톤, 젤라틴펩톤 및 어류펩톤으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있고, 가장 바람직하게는 콩펩톤을 포함할 수 있다.

상기 콩펩톤은 서리태, 서목태, 흑태, 황태, 강낭콩, 울타리콩, 푸르대콩, 녹두, 적두, 거두, 콩나물콩, 선비콩, 대두 및 풋콩으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 콩으로부터 유래된 것일 수 있고, 가장 바람직하게는 대두에서 유래된 것일 수 있다.

또한, 상기 펩톤발효물은 유산균에 의해 발효된 것일 수 있는데, 상기 유산균은 락토바실러스 속 균주로, 가장 바람직하게는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 또는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus Casei), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus Plantarum) 등이며, 이중 선택된 적어도 어느 하나일 수 있다.

1. 펩톤화된 단백분해물을 이용해 유산균 발효하는 방법

1. 발효펩톤의 제조

펩톤화된 단백분해물을 이용한 유산균 배양물의 제조방법을 도 2를 참고하여 설명하면 다음을 포함한다.

본 발명의 발효펩톤은, 펩톤화된 단백분해물을 포함한 배지를 제조하는 제 1 단계; 상기 제 1 단계에서 제조된 배지에 유산균을 접종하는 제 2 단계; 상기 제 2 단계의 접종된 유산균을 배양하여 펩톤화된 단백분해물이 분해되어 생성되는 펩톤발효 배양물을 제조하는 제 3 단계; 상기 제 3 단계에서 발효된 펩톤발효 배양물의 균체 및 불용성 성분을 제거하는 제 4 단계; 및 상기 4 단계에서 수득한 균체 및 불용성 성분이 제거된 펩톤발효물을 건조하는 제 5 단계를 포함하는 방법으로부터 제조할 수 있다.

상기 제 1단계에서, 배지는 펩톤화된 단백분해물을 포함하는 것을 특징으로 한다. 펩톤화된 단백분해물은 미생물배양을 위해 제조 판매되는 통상의 펩톤화된 단백분해물로서 식물성과 동물성을 모두 포함하며 탈당과 탈염처리를 거친 것이 바람직하다. 또한 본 배지는 펩톤화된 단백분해물 뿐만 아니라 추가적으로 탄소원과 미량원소를 포함한다.

상기 탄소원으로는 글루코오스, 수크로오스, 말토오스, 프럭토오스, 락토오스, 말토오스, 자일로오스, 갈락토오스, 아라비노오스 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이다. 탄소원의 사용량은 바람직하게는, 펩톤화된 단백분해물의 총 중량에 대하여 바람직하게는 2 내지 99.5 중량%이고, 보다 바람직하게는 2 내지 20 중량%이다.

본 발명의 배지에서 상기 미량원소로 이용 가능한 것은, 마그네슘 설페이트, 소듐 아세테이트, 포타슘포스페이트, 망가닉 설페이트, 징크 설페이트, 쿠퍼 설페이트, 칼슘 클로라이드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이다. 미량원소의 사용량은 바람직하게는, 펩톤화된 단백분해물의 중량에 대하여 0.5 내지 98 중량%이고, 보다 바람직하게는 5 내지 50중량%이다.

혼합된 배지는 살균 처리하며, 살균처리 온도는 90 내지 121℃ 의 온도에서 15 내지 30분간 진행하는 것이 바람직하다.

제 2 단계에서는, 상기 제 1 단계에서 살균처리가 종료된 배지에 유산균을 접종한다.

본 발명에 이용되는 유산균은 락토바실러스 속 균주로, 가장 바람직하게는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 또는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus Casei), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus Plantarum) 등이며, 이중 선택된 적어도 어느 하나일 수 있다. 상기 유산균의 접종량은 접종 후의 초기 균수가 10⁵ 내지 10⁶ cfu/㎖이 되게 하는 것이 바람직하며, 이는 그 이하의 균수에서는 배양시간이 길어지며, 그 이상의 균수를 접종하기 위해서는 종균의 생산에 부담이 되기 때문이다.

제 3 단계에서는, 상기 제 2 단계에서 유산균 접종이 끝난 배지를 25 내지 35℃ 에서 발효를 진행시킨다. 이는 그 이하의 온도에서는 발효가 쉽게 일어나지 않으며, 그 이상의 온도에서는 열에 약한 유산균이 사멸하기 때문이다. 상기 유산균의 발효하는 시간은 바람직하게는 12 내지 120시간이며, 보다 바람직하게는 24 내지 72시간이다. 만일, 발효시간이 12시간 미만이면 펩톤화된 단백분해물의 분해 시간이 부족해서 저분자량의 펩타이트 함유량이 너무 적을 수 있고, 발효시간이 72시간을 초과 하면 경제성이 떨어질 수 있으므로 상기 시간동안 발효를 진행하는 것이 좋다.

상기 펩톤발효 배양물로부터 균체 및 불용성 성분을 제거하는 제 4 단계에서, 원심분리하거나 통상의 여과방법(예를 들면, 필터 프레스(filter press), 멤브레인 필터(membrane filter)등)을 이용하여 균체 및 불용성 성분을 제거할 수 있다.

균체 및 불용성분이 제거된 배양물은 제 5 단계에서 건조를 용이하게 하기 위하여 50 내지 70 ℃의 온도에서 진공농축시킨 후, 통상의 건조방법(예를들어, 진공건조(vaccum dry), 분무건조(spray dry), 동결건조(freeze dry) 등)을 이용하여 건조하여 펩톤발효물을 얻는다.

또한, 상기 건조된 펩톤발효물에 부재료를 혼합하는 단계를 포함하여 각 제형으로 포장된 화장료 조성물을 제조할 수 있다. 상기 화장료 조성물은 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

본 발명에 의한 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 유액, 화장수, 크림, 로션, 에센스, 팩, 젤, 미스트와 같은 피부 점착타입의 화장료, 샴푸, 린스, 비누와 같은 세정 화장료의 제형을 가질 수 있다.

각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기의 성분 이외에 다른 성분들은 기타 화장료의 제형 또는 사용 목적에 따라 선정하여 배합할 수 있다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 정제수 등을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합하다.

이하, 실시예 및 비교예, 시험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 다만 하기 실시예 및 비교예는 하나의 예시일 뿐, 이들에 의해서 본 발명의 범위가 한정되는 것은 의도하는 것은 아니다.

실시예 1. 펩톤발효물의 제조

펩톤화된 단백분해물은 Fluka (Sigma-Aldrich, St. Quentin Fallavier,France)로부터 구입하였다. 펩톤화된 단백분해물인 대두펩톤(soybean peptone) 500g을 하기 표 1의 성분 및 함량의 배지에 가하여 혼합한 다음, 121℃에서, 15분간 가열하여 멸균처리하였다. 냉각후, 유산균으로서 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)를 초기 균수가 10⁶ cfu/㎖ 이 되도록 접종한 후, 50 rpm으로 교반하면서 30℃에서, 36시간 배양하여 펩톤발효 배양물을 수득하였다.

N0.	성분명	함량(w/w)
1	Soybean Peptone	5.000%
2	Glucose	0.500%
3	Potassium phosphate	0.100%
4	Sodium acetate	0.050%
5	MgSO4	0.005%
6	MnSO4	0.005%
7	CuSO4	0.002%
8	정제수	94.338%
	합계	100.000%

상기 과정을 통해 수득한 펩톤발효 배양물을 최종온도가 95℃가 되도록 가열 처리한 후, 원심분리(3,000rpm, 15min)하여 균체 및 불용성 성분을 제거하였다. 세포실험시 정확한 농도처리를 위해 펩톤발효 배양액을 동결 건조하여 사용하였으며, 펩톤발효 배양액 100g으로 동결건조된 펩톤발효물 7.5g을 얻었다.

비교예 1. 펩톤화된 단백분해물

펩톤화된 단백분해물로서 대두펩톤(soybean peptone)을 사용하였으며, Fluka (Sigma-Aldrich, St. Quentin Fallavier,France)로 부터 구입하여 그대로 용해시켜 사용하였다.

비교예 2. 대두펩톤을 제외한 유산균 배양액

상기 실시예 1에서 대두펩톤만을 제외하고 동일한 방법과 동일한 과정으로 유산균배양액을 제조하였다.

시험예 1. 인간유래 모모세포 증식효과 시험

[ cell culture ]

세포배양을 위한 인간유래 모모세포는 Innoprot사(스페인)에서 분양받았으며, poly-D-lysine 코팅된 75T 플라스크에 seeding하여 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 배지는 10% FBS, 1% 항생제, 1% growth supplement가 포함된 MSC배지(Mesenchymal stem cell medium-Innoprot)를 사용하였으며 3일마다 배양액을 교체하였다. 플라스크에 80~90% 정도 되면 계대해 주었으며 최소 한번 정도의 계대가 된 후 안정된 상태의 세포를 이용해 실험을 진행하였다.

[ MTS assay ]

24 well plate에 모모세포를 4*10⁴ cells/㎖을 200㎕씩 분주하여 안정화를 위해 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 24시간 배양하였다. 24시간 후 시료를 농도별로 처리한 다음 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 72시간(3일간)동안 배양한 후, MTS 시료(CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay kit, Cat no.G5421, Promega사) 20㎕를 넣어 주고 37℃, 5%-CO₂ Incubator에서 1시간 동안 반응시킨 후 492nm에서 측정하였다. 대조물질로는 시료 대비 동일한 양의 PBS를 처리하였다.

[ Standard Curve 작성 ]

모모세포를 0.5*10⁵cells/㎖ 에서 5*10⁵cells/㎖ 까지 0.5 단위로 세포 수를 count하여 96 well plate에 200㎕ 씩 분주하였고, MTS 시료 20㎕를 처리하여 37℃, 5% CO₂ Incubator에서 1시간 동안 반응시킨 후 492㎚에서 Microplate Reader로 흡광도를 측정하였다.

이를 통해 각각의 세포 수에 해당하는 흡광도 값을 얻었으며 엑셀 수식을 이용하여 y=ax+b 에 해당하는 Standard curve 값을 얻었다. 실험 시 얻은 OD 값은 실제 세포수를 예측하기 위한 실험으로 앞으로의 모든 결과는 OD값을 Standard Curve에 대입하여 얻은 실제 세포수로 환산하여 계산하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

세포수 (*105cell/㎖)	0.5	1.0	1.5	2.0	2.5	3.0	4.0	4.5	5.0
OD value	0.424±0.014	0.579±0.008	0.716±0.001	0.868±0.049	1.064±0.025	1.147±0.040	1.264±0.066	1.371±0.071	1.597 ±0.052

[ 결과통계처리 ]

모든 실험결과는 MTS에서 얻은 흡광도 값(Optical density)을 Standard curve 실험에서 얻은 y=ax+b 수식에 대입하여 얻은 실제 세포 수에 따라 나타내었다. 결과에 대한 오차는 평균±표준오차로 표시하였으며, 각 시료에 대한 검정은 Student's t-test로 분석하여 유의성 정도에 대해 p<0.05 인 경우는 *로 표기하였으며, p<0.01인 경우 **, p<0.001인 경우 ***로 표기하여 나타내었다.

시험예 1-1. 펩톤발효물의 모모세포 증식효과 비교

실시예 1에서 제조한 대두펩톤발효물을 PBS에 농도별로 용해시킨 후 0.2㎛-filtering 처리하여 모모세포의 증식촉진효과를 확인하였다. 비교예 1의 대두펩톤 또한 동일하게 PBS에 농도별로 용해시켜 0.2㎛-filtering 한 후 사용하였으며, 대조군으로는 동일한 양의 PBS로 처리한 것을 사용하였다.

24 well plate에 모모세포를 4*10⁴ cells/㎖을 200㎕씩 분주하여 안정화를 위해 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 24시간 배양한 후, 시료를 0.001~1mg/㎖로 단계적으로 농도를 처리한 다음 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 다시 72시간 동안 배양하였다. 이후 MTS 시료(CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay kit, Cat no.G5421, Promega사) 20㎕를 넣어 주고 37℃, 5%-CO₂ Incubator에서 1시간 동안 반응시킨 후, 492㎚에서 OD값을 측정하였다. OD값은 다시 standard curve에 대입하여 실제 세포수로 환산한 후, 대조군을 기준으로 백분율로 표시하여 대조군 대비 세포증식 촉진효과를 비교하였다. 그 결과를 하기 표 3 및 도 3에 나타내었다.

시료명	처리농도 (mg/㎖)	OD value	세포수 (×105cells/㎖)	백분율환산 (%)
대조군 (무처리군)	-	1.579±0.043	5.105±0.263	100.000±5.142
실시예 1	0.001	1.605±0.021	5.326±0.155	104.328±3.028
	0.010	1.559±0.031	5.494±0.160	107.609±3.136
	0.050	1.666±0.022	5.802±0.206	113.657±4.036
	0.100	1.779±0.027	5.807±0.101	113.752±1.957
	0.500	2.043±0.049	7.256±0.407	142.131±7.965
	1.000	2.070±0.026	7.070±0.298	138.485±5.845
비교예 1	0.001	1.551±0.010	4.982±0.050	97.590±0.971
	0.010	1.509±0.123	5.346±0.175	104.723±3.431
	0.050	1.565±0.049	5.394±0.248	105.653±4.867
	0.100	1.582±0.039	5.233±0.223	102.497±4.362
	0.500	1.693±0.002	5.219±0.139	102.225±2.724
	1.000	1.731±0.030	5.563±0.158	108.978±3.105

표 3 및 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 대두펩톤(비교예 1)은 모모세포 증식에 거의 영향을 주지 못하나, 유산균을 이용해 발효시킨 펩톤발효물(실시예 1)의 경우, 0.001mg/㎖ ~ 1.000mg/㎖의 모든 농도에서 대조군 대비 모모세포를 증식시키는 것이 확인되었다.

나아가, 0.500mg/㎖ ~ 1.000mg/㎖의 농도에서는 대조군 대비 최대 30% 이상 모모세포를 증식시키는 것이 확인되었으며, 0.500mg/㎖의 농도에서는 대조군 대비 최대 40% 이상 모모세포를 증식시키는 것이 확인되었다.

그리고, 펩톤발효물의 모모세포 증식효과 비교 시험은 실제 앰플, 토닉, 샴푸, 린스, 캡슐제 및 액제 등과 같은 다양한 제형의 제품보다 10배 정도로 희석된 농도의 펩톤발효물을 사용한 것으로서, 펩톤발효물을 이용한 다양한 제형의 제품 제조시에는 10.000 mg/㎖ 이하로 사용하는 것이 유리함을 추론할 수 있었다.

시험예 1-2. 펩톤발효물이 갖는 모모세포 증식 효과에 대한 원인 규명

펩톤발효물(실시예 1)이 갖는 모모세포 증식효과가 무엇에 기인한 것인지를 확인하기 위하여 펩톤을 제외하고 발효시킨 유산균배양액(비교예 2)과 비교실험을 하였다. 모든 시료는 0.5mg/㎖로 처리하였다. 처리 결과를 하기 표 4 및 도 4에 나타내었다.

그 결과 펩톤을 제외한 채 발효시킨 유산균 배양액(비교예 2)은 모모세포 증식효과를 나타내지 않아, 펩톤발효물의 모모세포 증식효과는 유산균 또는 유산균배양액에 의한 효과가 아닌, 펩톤이 유산균에 의해 발효되면서 생긴 펩톤이 변화물(예를 들면 분자량이 변화된 펩톤), 즉 펩톤발효물 자체에 의한 효과라는 사실이 밝혀졌다.

시료명	처리농도 (mg/㎖)	OD value	세포수 (×105cells/㎖)	백분율환산 (%)
대조군 (무처리군)	-	1.645±0.027	5.314±0.111	100.000±2.083
비교예 1	0.500	1.749±0.039	5.743±0.161	108.066±3.022
실시예 1	0.500	2.141±0.034	7.364±0.142	138.568±2.680
비교예 2	0.100	1.702±0.018	5.550±0.074	104.430±1.400
	0.500	1.770±0.026	5.829±0.106	109.697±1.998

시험예 1-3. 기타 펩톤발효물에 대한 모모세포 증식 효과 확인

상기 시험예 1에 사용된 대두펩톤발효물 외에 다른 펩톤류도 발효후에 모모세포 증식효과가 나타나는 지를 확인해 보기 위하여 유사한 펩톤류를 구입하여 실시예 1과 동일한 방법으로 발효시켜 각각의 펩톤발효물을 얻었다. 정확한 비교를 위해 실험에 사용한 펩톤류는 발효전과 발효후를 동일한 농도, 0.5mg/㎖로 처리하였다. 처리에 따른 모모세포 증식효과를 하기 표 5 및 도 5에 나타내었다.

그 결과 차이는 있으나, 모두 동일하게 발효후에 모모세포 증식 효과가 나타났음을 확인할 수 있었고, 펩톤 발효물 중 대두펩톤 발효물이 가장 우수한 모모세포 증식효과를 보임을 확인할 수 있었다.

시료명	OD value	세포수 (×105cells/㎖)	백분율환산 (%)
대조군	1.628±0.009	5.170±0.036	100.000±0.695
밀크펩톤(milk peptone)	1.846±0.068	6.080±0.282	117.600±5.452
밀크펩톤발효물	1.926±0.068	6.414±0.282	124.052±5.461
밀펩톤(wheat peptone)	1.851±0.085	6.908±0.354	117.947±6.851
밀펩톤발효물	2.082±0.024	7.062±0.098	136.581±1.901
감자펩톤(photato peptone)	1.694±0.064	5.447±0.265	105.354±5.125
감자펩톤발효물	1.934±0.073	6.447±0.304	124.697±5.870

시험예 2. 인간유래 모유두세포 증식효과 시험

[ cell culture ]

세포배양을 위한 인간유래 모유두세포는 Innoprot사(스페인)에서 분양받았으며, poly-D-lysine 코팅된 75T 플라스크에 seeding하여 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 배지는 10% FBS, 1% 항생제, 1% growth supplement가 포함된 MSC배지(Mesenchymal stem cell medium-Innoprot)를 사용하였으며 3일마다 배양액을 교체하였다. 플라스크에 80~90% 정도 되면 계대해 주었으며 최소 한번 정도의 계대가 된 후 안정된 상태의 세포를 이용해 실험을 진행하였다.

[ MTS assay ]

24 well plate에 모유두세포를 4*10⁴ cells/㎖을 200㎕씩 분주하여 안정화를 위해 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 24시간 배양하였다. 24시간 후 시료를 농도별로 처리한 다음 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 72시간(3일간)동안 배양한 후, MTS 시료(CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay kit, Cat no.G5421, Promega사) 20㎕를 넣어 주고 37℃, 5%-CO₂ Incubator에서 1시간 동안 반응시킨 후 492nm에서 측정하였다. 대조물질로는 시료 대비 동일한 양의 PBS를 처리하였다.

[ Standard Curve 작성 ]

모유두세포를 0.5*10⁵cells/㎖ 에서 5*10⁵cells/㎖ 까지 0.5 단위로 세포 수를 count하여 96 well plate에 200㎕ 씩 분주하였고, MTS 시료 20㎕를 처리하여 37℃, 5% CO₂ Incubator에서 1시간 동안 반응시킨 후 492nm에서 Microplate Reader로 흡광도를 측정하였다.

이를 통해 각각의 세포 수에 해당하는 흡광도 값을 얻었으며 엑셀 수식을 이용하여 y=ax+b 에 해당하는 Standard curve 값을 얻었다. 실험 시 얻은 OD 값은 실제 세포수를 예측하기 위한 실험으로 앞으로의 모든 결과는 OD값을 Standard Curve에 대입하여 얻은 실제 세포수로 환산하여 계산하였고, 그 결과를 표 6에 나타내었다.

세포수 (*105cell/㎖)	0.5	1.0	1.5	2.0	2.5	3.0	3.5	4.0	5.0
OD valule	0.473±0.014	0.616±0.008	0.775±0.004	0.861±0.048	0.993±0.027	1.171±0.032	1.241±0.110	1.361±0.051	1.526 ±0.087

[ 결과통계처리 ]

모든 실험결과는 MTS에서 얻은 흡광도 값(Optical density)을 Standard curve 실험에서 얻은 y=ax+b 수식에 대입하여 얻은 실제 세포 수에 따라 나타내었다. 결과에 대한 오차는 평균±표준오차로 표시하였으며, 각 시료에 대한 검정은 Student's t-test로 분석하여 유의성 정도에 대해 p<0.05 인 경우는 *로 표기하였으며, p<0.01인 경우 **, p<0.001인 경우 ***로 표기하여 나타내었다.

시험예 2-1. 펩톤발효물의 모유두세포 증식효과 비교

실시예 1에서 얻은 대두펩톤발효물을 PBS에 농도별로 용해시킨 후 0.2㎛-filtering 처리하여 모유두세포의 증식촉진효과를 확인하였다. 비교예 1의 대두펩톤 또한 동일하게 PBS에 농도별로 용해시켜 0.2㎛-filtering 한 후 사용하였으며, 대조군으로는 동일한 양의 PBS로 처리한 것을 사용하였다.

24 well plate에 모유두세포를 4*10⁴ cells/㎖을 200㎕씩 분주하여 안정화를 위해 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 24시간 배양한 후, 시료를 0.001~1mg/㎖로 단계적으로 농도를 처리한 다음 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 다시 72시간 동안 배양하였다. 이후 MTS 시료(CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay kit, Cat no.G5421, Promega사) 20㎕를 넣어 주고 37℃, 5%-CO₂ Incubator에서 1시간 동안 반응시킨 후, 492nm에서 OD값을 측정하였다. OD값은 다시 standard curve에 대입하여 실제 세포수로 환산한 후, 대조군을 기준으로 백분율로 표시하여 대조군 대비 세포증식 촉진효과를 비교하였다. 그 결과를 하기 표 7 및 도 6에 나타내었다.

시료명	처리농도 (mg/㎖)	OD value	세포수 (×105cells/㎖)	백분율환산 (%)
대조군 (무처리군)	-	1.612±0.063	5.105±0.263	100.000±5.142
실시예 1	0.001	1.665±0.037	5.326±0.155	104.328±3.028
	0.010	1.705±0.038	5.494±0.160	107.609±3.136
	0.050	1.780±0.049	5.802±0.206	113.657±4.036
	0.100	1.781±0.024	5.807±0.101	113.752±1.957
	0.500	2.128±0.098	7.256±0.407	142.131±7.965
	1.000	2.084±0.072	7.070±0.298	138.485±5.845
비교예 1	0.001	1.583±0.012	4.982±0.050	97.590±0.971
	0.010	1.670±0.042	5.346±0.175	104.723±3.431
	0.050	1.682±0.060	5.394±0.248	105.653±4.867
	0.100	1.643±0.053	5.233±0.223	102.497±4.362
	0.500	1.640±0.033	5.219±0.139	102.225±2.724
	1.000	1.722±0.038	5.563±0.158	108.978±3.105

표 7 및 도 6에서 나타낸 바와 같이, 대두펩톤(비교예 1)은 모유두세포 증식에 거의 영향을 주지 못하나, 유산균을 이용해 발효시킨 펩톤발효물(실시예 1)의 경우, 0.001mg/㎖ ~ 1.000mg/㎖의 모든 농도에서 대조군 대비 모유두세포를 증식시키는 것이 확인되었다.

나아가, 0.500mg/㎖ ~ 1.000mg/㎖의 농도에서는 대조군 대비 최대 30% 이상 모유두세포를 증식시키는 것이 확인되었으며, 0.500mg/㎖의 농도에서는 대조군 대비 최대 40% 이상 모유두세포를 증식시키는 것이 확인되었다.

그리고, 펩톤발효물의 모유두세포 증식효과 비교 시험은 실제 앰플, 토닉, 샴푸, 린스, 캡슐제 및 액제 등과 같은 다양한 제형의 제품보다 10배 정도로 희석된 농도의 펩톤발효물을 사용한 것으로서, 펩톤발효물을 이용한 다양한 제형의 제품 제조시에는 10.000 mg/㎖ 이하로 사용하는 것이 유리함을 추론할 수 있었다.

시험예 2-2. 펩톤발효물이 갖는 모유두세포 증식 효과에 대한 원인 규명

펩톤발효물(실시예 1)이 갖는 모유두세포 증식효과가 무엇에 기인한 것인지를 확인하기 위하여 펩톤을 제외하고 발효시킨 유산균배양액(비교예 2)과 비교실험을 하였다. 모든 시료는 0.5mg/㎖로 처리하였다. 처리결과를 하기 표 8 및 도 7에 나타내었다.

시료명	처리농도 (mg/㎖)	OD value	세포수 (×105cells/㎖)	백분율환산 (%)
대조군(무처리군)	-	1.538±0.037	4.797±0.127	100.000±2.664
실시예 1	0.500	2.023±0.018	6.817±0.061	142.099±1.271
비교예 1	0.500	1.529±0.045	4.756±0.152	99.146±3.172
비교예 2	0.100	1.538±0.033	4.798±0.113	100.006±2.359
	0.500	1.597±0.039	5.043±0.132	105.122±2.751

그 결과 펩톤을 제외한 채 발효시킨 유산균 배양액(비교예 2)은 모유두세포 증식효과를 나타내지 않아, 펩톤발효물의 모유두세포 증식효과는 유산균 또는 유산균배양액에 의한 효과가 아닌, 펩톤이 유산균에 의해 발효되면서 생긴 펩톤이 변화물(예를 들면 분자량이 변화된 펩톤), 즉 펩톤발효물 자체에 의한 효과라는 사실이 밝혀졌다.

시험예 2-3. 기타 펩톤발효물에 대한 모유두세포 증식 효과 확인

상기 시험예 1에 사용된 대두펩톤발효물 외에 다른 펩톤류도 발효후에 모유두세포 증식효과가 나타나는 지를 확인해 보기 위하여 유사한 펩톤류를 구입하여 실시예와 동일한 방법으로 발효시켜 각각의 펩톤발효물을 얻었다. 정확한 비교를 위해 실험에 사용한 펩톤류는 발효전과 발효후를 동일한 농도, 0.5mg/㎖로 처리하였다. 처리에 따른 모유두세포 증식 효과를 하기 표 9 및 도 8에 나타내었다.

그 결과 차이는 있으나, 모두 동일하게 발효후에 모유두세포증식효과가 나타났음을 확인할 수 있었고, 펩톤 발효물 중 대두펩톤 발효물이 가장 우수한 모유두세포 증식효과를 보임을 확인할 수 있었다.

시료명	OD value	세포수 (×105cells/㎖)	백분율환산 (%)
대조군	1.616±0.045	5.120±0.185	100.000±3.623
밀크펩톤(milk peptone)	1.654±0.072	5.279±0.301	103.117±5.872
밀크펩톤발효물	1.730±0.068	5.594±0.283	109.265±5.524
밀펩톤(wheat peptone)	1.720±0.010	5.554±0.043	108.481±0.845
밀펩톤발효물	1.840±0.033	6.053±0.136	118.239±2.660
감자펩톤(photato peptone)	1.665±0.079	5.282±0.327	103.177±6.396
감자펩톤발효물	1.807±0.069	5.916±0.288	115.551±5.633

시험예 3. 마우스 C57BL /6를 이용한 발모력 및 생체독성 시험

시험에 사용한 시료는 실시예 1에 따라 제조된 시료를 5 중량%가 되도록 멸균수에 녹여 사용하였으며, 양성대조군으로는 발모제로 널리 사용되는 의약품인 5 중량%-미녹시딜용액을 사용하였다. 본 시험에 사용된 동물은 C57BL/6 마우스를 이용하여 4주 동안 1일 1회 시험물질을 경피투여하여 발모 정도를 평가하였다. 군 구성은 음성 대조군(무처리), 양성대조군(5 중량%-미녹시딜), 시험군(5 중량%-펩톤발효물), 총 3개의 군으로 수컷, 암컷 모두에서 각각 3마리씩 실시하였다.

시험 기간 4주 동안 주 1회 체중, 사료, 음수 섭취량이 측정되었고, 발모 정도를 사진으로 찍어 평가하였다. 4주간 매일 경피 투여를 실시한 이후 다음날 부검을 실시하였고, 부검 시 발모 정도를 사진으로 촬영하고, 털무게를 측정하였다. 일부 피부조직은 동결하여 이후 생화학 검사를 통해 ALP, γ-GT 효소를 측정하였고, 피부조직, 흉선, 비장, 생식기(수컷-고환 및 부고환, 암컷-난소)를 적출하여 포르말린에 고정한 이후 조직병리 검사를 실시하였다.

이하 구체적으로 기술한다.

출생일로부터 3일 이내의 몸무게가 비슷한 개체들로 선별하여 6주령된 마우스 C57BL/6 암컷 및 수컷을 오리엔트로부터 분양 받아, 25℃, 습도 50% 사육조건에서 1주일간의 적응기를 갖고, 7주령이 되는 주에 실험을 실시하였다. 마우스를 에테르가 들어 있는 데시케이터에 넣고 1분간 마취시킨 후, 마우스의 등 부위를 동물용 전기 제모기(electric clipper)를 이용하여 2cm×4cm로 제모하여 털을 제거하였다. 1일 후 등 부위에 상처가 없는 마우스를 대상으로 하여, 털 주기가 휴지기에 맞춰진 마우스들만 재선별하였다. 난괴법에 의해 군당 3마리씩 3개 군으로 분리하여 시료를 1일 1회 경피투여 하였다. 투여 용량은 100㎕씩 분주하여 경피투여 하였다. 동물은 명암주기 12시간 밤과 낮 단위로 조절되고 온도 습도가 적절하게 유지되는 표준사육 환경에서 사육하였고, 실험기간 동안 사료와 물의 양은 제한 없이 공급하였다. 실험의 모든 과정은 아산생명과학 연구원 동물실험 윤리위원회의 허가(승인번호: 2013-04-059)를 얻은 후, 가이드라인에 의거하여 실험을 진행하였다. 실험동물은 4주간 투여한 이후 다음날 부검하였고, 12시간 전부터 절식시킨 후 에테르(ether) 마취하여 안락사시켰다. 비장, 흉선을 적출하여 무게를 측정한 다음 10% 중성 완충 포르말린 용액에 고정하였고, 수컷 생식기(고환, 부고환)와 암컷 생식기(난소)도 추가적으로 적출하여 10% 중성 완충 포르말린 용액에 고정하였다. 피부조직은 절취하여 조직학적 변화를 보기 위해 10% 중성 완충 포르말린 용액에 고정하였고, 일부는 효소 활성 및 유전자 발현 검사에 사용하기 위해 질소에 동결한 다음 -70℃에서 냉동보관하였다.

시험예 3-1. 장기 무게 측정

4주간 경피투여를 실시한 이후 다음날 부검을 실시하였다. 부검 시 비장, 흉선을 적출하여 생리식염수로 씻어내고 여과지로 수분을 제거한 후 무게를 측정하였다. 피부, 비장 및 흉선, 생식기(수컷-고환, 부고환, 암컷- 난소)를 현미경으로 관찰하고 비장과 흉선의 무게를 측정하여 체중대비 환산 비교한 결과, 하기 표 10 및 도 9와 같이, 대조군과 시험군간의 큰 차이가 없어 시험군에서의 생체독성이 없음이 확인되었다.

시험예 3-2. 육안적 관찰

제모한 등 부위의 발모상태를 보기 위해 실험 1주차, 2주차, 3주차, 4주차, 도살전에 주 1회 에테르 마취 후 사진 촬영하였다. 각 군의 모발성장 효과는 각각의 동물을 육안으로 관찰하여 발모 정도에 따라 0-19% (0), 20-39% (1), 40-59% (2), 60-79% (3), 80-100% (4) 로 판정하였으며, 각 군별로 평균치를 산정하였다. 그 결과를 하기 표 11, 도 10 및 도 11에 나타내었다.

발모 정도를 육안으로 비교한 결과 수컷, 암컷 모두 양성대조군(5 중량%-미녹시딜)이 가장 높았고, 다음으로 시험군(5 중량%-펩톤발효물), 음성대조군 순이었다. 시험군(5 중량%-펩톤발효물)의 경우, 부검일 기준으로 음성대조군에 비해 월등한 육모효과를, 양성대조군 대비 90%에 가까운 발모효과를 보여 주었다.

시험예 3-3. 털 무게 측정

부검 당일 에테르 마취 이후, 전기제모기(electric clipper)로 투여 부위 (2cm x 4cm)의 털을 밀어 미세저울로 털 무게를 측정하였다. 하기 표 12 및 도 12에 나타낸 바와 같이, 털 무게 관찰 결과, 수컷, 암컷 모두 양성대조군(5 중량%-미녹시딜)이 가장 높았고, 다음으로 시험군(5 중량%-펩톤발효물), 음성대조군 순이었다. 시험군(5 중량%-펩톤발효물)의 경우, 양성대조군의 털무게에는 못미치나, 음성대조군과 비교하면, 5배에 이르는 털무게를 보여주었다.

시험예 3-4. 모낭의 깊이 측정

부검 시 피부조직을 2cm x 3cm로 절취하여 피부에 주름이 생기지 않도록 동일 크기의 마분지에 부착하여 10% 중성 포르말린용액에 24시간 고정하였다. 이후 통상적인 방법에 따라 수세, 탈수, 투명, 침투과정을 거쳐 파라핀에 포매하였다. 포매된 조직을 두께 3㎖로 절편을 만들어 hematoxylin and eosin(H&E) 염색한 후 광학현미경 하에서 관찰하였고, 모낭 깊이의 변화는 이미지 분석 프로그램을 이용하여 샘플당 40배 배율에서 무작위로 10곳에서 측정하였다. 측정결과를 하기 표 13, 표 14, 도 13 및 도 14에 나타내었다.

모공깊이에 대한 경우, 개체군간의 차이는 있었으나, 암수 모두 시험군의 모공깊이가 가장 깊은 측정치를 보여주고 있어, 시험군이 모공을 깊이 안착시키고 건강한 모발을 형성시키는데 큰 기여를 하고 있음을 확인할 수 있었다.

시험예 3-5. 피부조직의 효소활성도 측정- Alkaline phosphatase( ALP )

부검 시 피부조직을 절취하여 바로 액체질소에서 냉각한 이후 -70℃에서 보관하였다. 이후 피부조직을 군 당 3마리 씩을 골라, 조직 양의 4배의 인산완충용액(phosphate buffer solution, PBS)을 첨가하여 조직 마쇄기(Tissue lyser)를 이용하여 균질액으로 만들었다. 이 균질액을 원심분리기를 이용하여 4℃에서 12,000rpm으로 20분간 원심 분리하고, 그 상층액을 얻어 자동 생화학 분석기를 이용하여 ALP 효소의 양을 분석하였다.

생화학 검사 결과, ALP의 수치가 음성대조군에 비해 평균적으로 낮게 나와 간독성이 발생하지 않았음을 보여주었다.

시험예 3-6. 피부조직의 효소활성도 측정 - γ- Glutamyl transpeptidase(γ- GT )

부검 시 피부조직을 절취하여 바로 액체질소에서 냉각한 이후 -70℃에서 보관하였다. 이후 피부조직을 군 당 3마리 씩을 골라, 조직 양의 4배의 인산완충용액(phosphate buffer solution, PBS)을 첨가하여 조직 마쇄기(Tissue lyser)를 이용하여 균질액으로 만들었다. 이 균질액을 원심분리기를 이용하여 4℃에서 12,000rpm으로 20분간 원심 분리하고, 그 상층액을 얻어 자동 생화학 분석기를 이용하여 γ-GT 효소의 양을 분석하였다.

하기 표 15, 표 16 및 도 15에서 알 수 있는 바와 같이, 생화학 검사 결과, γ-GT 수치가 음성대조군에 비해 평균적으로 낮게 나와 간독성이 발생하지 않았음을 보여주었다.

시험예 3-7. 피부조직의 면역조직학적 관찰

포매 된 조직을 두께 3㎛로 절편을 만들어서 전자동 면역 염색기 (BenchMark XT, Ventana)를 이용하여 기기의 manual에 맞춰 조직을 면역염색을 시행하였다. 측정을 위해 Ventana Ultraview DAB Kit를 사용하였다. 면역 조직 염색에 사용된 항체는 Abcam 사의 IGF-1, VEGF, TGF β1, Caspase-3를 사용하였다.

검사 결과, 모든 수치가 군간 의미있는 차이가 발생하지 않아, 염증발생에 관여하지 않음이 확인되었다.

시험예 4. 고속액체 크로마토그래피( HPLC ) 및 MS ( Mass spectrometry ) 측정을 통한 분자량 확인 시험

상기 실시예 1의 펩톤발효물의 분자량을 확인하기 위하여, 고속액체 크로마토그래피 및 MS 스펙트럼을 측정하였다.

고속액체 크로마토그래피 측정은 Accela UHPLC(제조사 : Thermo Scientfic)를 이용하였다. 동결건조한 펩톤발효물을 0.1% 개미산(Formic acide)에 녹였으며, 분석 시 온도는 TR(Room Temperature)로 하였다. 컬럼은 Water BEH C18(2.1×100 ㎖, 1.7㎛)을 이용하였고, 유량(Flow rate)은 분당 300㎕가 되도록 유지하였다. 시료 분석시간은 최대 60분까지 진행하였으며, 0분 ~ 60까지의 측정 결과를 도 16a에 나타내었고, 이 중 0분 ~ 25분까지의 측정결과를 도 16b에 나타내었다.

또한, MS 스펙트럼 측정은 LTQ Orbitrap XL mass spectrometer(제조사 : Thermo Scientific)을 이용하여 수행하였다. 액체 크로마토그래피에서 분리한 단일성분 중 면적이 큰 5개의 피크를 임의로 선정한 후, MS 스펙트럼을 통해 분자량을 확인하였고, 그 결과를 도 17a ~ 도 17e에 각각 나타내었다.

도 17a ~ 도 17e 각각은 도 16b의 ① ~ ⑤ 표시 부분의 피크의 분자량을 측정한 데이터이며, 도 17의 ① ~ ⑤ 결과를 통하여, 대부분의 피크의 중량평균분자량이 100 ~ 500 이하, 바람직하게는 중량평균분자량 200 ~ 300 사이의 펩타이드로서, 2 ~ 4개의 아미노산으로 구성된 펩타이드임을 추정 및/또는 확인할 수 있었다.

실시예 2. 펩톤발효물을 이용한 다양한 제형예

이하, 본 발명의 실시예 1에 따라 수득한 펩톤발효물을 함유하는 각종 형태의 모발 및 두피 적용 조성물의 조성을 나타내면 다음과 같다.

실시예 2-1. 앰플

하기 표 17의 성분의 혼합물 100중량부에 실시예 1의 펩톤발효물을 10중량부 혼합하여 모발 및 두피 적용용 앰플을 제조하였다.

실시예 2-2. 토닉

하기 표 18의 성분의 혼합물 100중량부에 실시예 1의 펩톤발효물을 5중량부 혼합하여 모발 및 두피 적용용 토닉을 제조하였다.

실시예 2-3. 샴푸

하기 표 19의 성분의 혼합물 100중량부에 실시예 1의 펩톤발효물을 3중량부 혼합하여 모발 및 두피 적용용 샴푸를 제조하였다.

실시예 2-4. 린스

하기 표 20의 성분의 혼합물 100중량부에 실시예 1의 펩톤발효물을 3중량부 혼합하여 모발 및 두피 적용용 린스를 제조하였다.

시험예 5. 빈모 또는 탈모 환자 대상 임상 시험

탈모방지 및 발모 효과를 알아보기 위하여 빈모증 또는 탈모증이 있는 환자를 대상으로 임상 시험을 실시하였다. 피실험자로서 만 20세 이상의 성인 남성 중, 육안 판정시 상당한 빈모 또는 탈모증이 있는 사람을 1차 선별한 후, 다시 두피진단기(ARAMO-SG, 아람휴비스사)를 이용하여 두피분석(두피상태, 모발밀집도, 모공상태, 모발굵기, 모근상태, 모발상태 등을 확인)을 실시하여, 모발밀집도(1㎠ 면적당 모발갯수)가 정상인(120개 이상/1㎠)의 70% 미만이거나, 모발밀집도는 정상에 가깝더라도, 모발의 두께가 정상인(0.075mm 이상)보다 현저하게 얇아진 연모(0.5mm 미만)가 많아 탈모가 진행중인 경우를 대상으로 하여 8명을 재선별하였다.

임상시험시 시료는 실시예 2-1의 앰플을 이용하였으며, 샴푸 후 탈모 부위에 1일 1 회 도포하는 방식으로 실시하였으며, 도포량은 빈모 또는 탈모 면적에 따라 달라지나 가능한 머리 전체에 도포하는 방식을 채택하여 3~5㎖를 도포하도록 하였다. 전체 시험 기간은 최소 3개월에서 최대 4개월까지 실시하였다. 효과의 판정은 자각 증상 개선 정도를 평가하여 전반적인 발모 및 탈모방지 효과를 확인하였다.

또한 대두 자체를 유산균 락토바실러스 람노서스를 사용하여, 상기 실시예 1과 동일한 발효 과정을 거쳐 대두발효물을 제조하였고, 이를 실시예 2-1의 앰플의 유효성분으로 사용하여 비교예 2-1의 앰플을 제조하여, 비교시험을 실시하였다.

실시예 2-1의 앰플의 자각증상 개선 평가 결과를 하기 표 21에 나타내었고, 실시예 2-1과 비교예 2-1의 자각증상 개선 평가 결과는 표 22(평균 점수만을 기재)에 나타내었으며, 각각의 결과에서 볼 수 있듯이 실시예 2-1에 의한 발모 및 탈모방지 효과는 매우 우수한 것으로 판명되었다. 또한 임상시험에서의 사용기간 동안 대상자 전원에게서 어떠한 부작용도 발견되지 않아 인체에도 안전한 것으로 나타났다.

이상의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 우수한 탈모방지 및/또는 발모 효과를 갖는다. 또한, 본 발명의 조성물은 우수한 모발 건강 증진 효과를 나타낸다.

Claims (15)

1. 대두펩톤발효물을 0.5 mg/ml ~ 1.0 mg/ml 포함하고,
   하기 측정방법 1에 의해 측정한 대두펩톤발효물을 0.5 mg/ml로 처리한 모모세포의 증식률이 134% 이상이며,
   하기 측정방법 2에 의해 측정한 대두펩톤발효물을 0.5 mg/ml로 처리한 모유두세포의 증식률이 134% 이상인 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물.
   [측정방법 1]
   24 well plate에 모모세포를 4*10⁴ cells/㎖을 200㎕씩 분주하여 안정화를 위해 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 24시간 배양한 후, 대두펩톤발효물을 0.5 mg/ml로 처리한 다음 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 다시 72시간 동안 배양한다. 이후 MTS 시료 20㎕를 넣어 주고 37℃, 5% CO2 Incubator에서 1시간 동안 반응시킨 후, 492㎚에서 OD값을 측정하고, OD값을 다시 standard curve에 대입하여 실제 세포수로 환산한 후, 대조군을 기준으로 백분율로 표시하여 대조군 대비 모모세포의 증식률을 측정한다.
   [측정방법 2]
   24 well plate에 모유두세포를 4*10⁴ cells/㎖을 200㎕씩 분주하여 안정화를 위해 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 24시간 배양한 후, 대두펩톤발효물을 0.5 mg/ml로 처리한 다음 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 다시 72시간 동안 배양한다. 이후 MTS 시료 20㎕를 넣어 주고 37℃, 5% CO2 Incubator에서 1시간 동안 반응시킨 후, 492㎚에서 OD값을 측정하고, OD값을 다시 standard curve에 대입하여 실제 세포수로 환산한 후, 대조군을 기준으로 백분율로 표시하여 대조군 대비 모유두세포의 증식률을 측정한다.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 펩톤발효물은 펩톤화된 단백질을 발효시킨 것인 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물.
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 상기 펩톤발효물은 중량평균분자량 200 ~ 500의 저분자 펩타이드를 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물.
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 제1항에 있어서, 펩톤발효물은 유산균에 의해 발효된 것인 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물.
10. 제9항에 있어서, 유산균은 락토바실러스 속 균주인 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물.
11. 제1항에 있어서, 펩톤발효물은 동결건조 처리된 것인 탈모방지 또는 발모촉진용 화장료 조성물.
12. 제1항의 조성물을 포함하는 화장료 제형.
13. 제12항에 있어서, 유액, 크림, 로션, 에센스, 팩, 젤, 미스트, 샴푸, 린스 또는 비누인 화장료 제형.
14. 삭제
15. 삭제

Images