KR101638551B1 - 피부미백 및 피부주름 개선용 조성물, 이를 이용한 피부미백 및 피부주름 개선제의 제조방법 및 이를 포함하는 피부 외용제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피부미백 및/또는 피부주름 개선용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 소이펩타이드 발효물을 이용한 피부미백 및/또는 피부주름 개선용 조성물, 이를 이용하여 피부미백 및/또는 피부주름 개선제를 제조하는 방법 및 이를 이용한 피부 외용제에 관한 것이다.

Description

피부미백 및 피부주름 개선용 조성물, 이를 이용한 피부미백 및 피부주름 개선제의 제조방법 및 이를 포함하는 피부 외용제{Improving composition for skin-antiwinkle and skin-whitening, Preparing method thereof, and Skin-externals containing the same}

본 발명은 피부주름 및/또는 피부미백 개선 효과를 갖는 조성물 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로 설명하면, 소이펩타이드 발효물을 이용한 피부주름 및/또는 피부미백 개선 효과를 갖는 조성물, 이를 이용하여 피부주름 및/또는 피부미백 개선제를 제조하는 방법 및 이를 이용한 화장품, 피부연고, 앰플 등의 피부외용제에 관한 것이다.

인간의 피부 노화는 크게 생물학적 과정에 따라 누구에게나 시간이 지나면서 나타나는 내적 노화(Intrinsic aging)와 지속적인 빛 노출, 스트레스, 흡연 등과 같은 환경요인에 노출되어 나타나는 외인성 노화(Besides the aging of the human nature) 로 구분된다.

내인성 노화의 주원인은 신진대사과정에서 만들어진 반응성 활성 산소 라디칼에 의하여 우리 몸의 구성 성분에 생기는 손상이 누적되기 때문이다. 반면에 외인성 노화는 환경오염인자(환경호르몬, 중금속 등)에의 노출, 오존층 파괴에 의한 자외선, 흡연 등과 같은 외부적 스트레스들에 의한 산화적 손상의 결과로 인해 피부의 생리학적 기능이 변화된 것이 주요인이다.

즉, 피부세포의 세포막이 활성산소나 다른 라디칼에 의해 지속적으로 손상을 입게 되면 단백질이나 지질단백질의 가교(cross-linkage)가 증가하거나 또는 분해가 되며, 과산화 지질의 양도 증가하게 된다. 이처럼 세포와 세포막이 손상되면, 세포막의 투과성이 변화하여 세포 내의 이온 균형이 깨지게 되고, 이런 변화는 세포 내 대사물의 배출을 막고, 이 대사물을 제독하는 세포의 기능을 감퇴시킨다. 이와 같은 세포 수준의 변화가 지속되면, 피부 조직의 구조가 규칙성을 잃게 된다. 또한 진피(dermis)에 국소적인 상흔이 나타나며 콜라겐 섬유나 탄력섬유의 감소로 진피 두께가 줄어든다. 콜라겐 섬유끼리의 가교도 증가하며 탄력섬유의 미세한 구조도 손상되어 전체적으로 피부의 탄력 저하와 함께 피부주름이 발생하게 된다.

한편, 피부색이 검게 변하는 것은 피부 내 멜라닌의 발현과 밀접한 관계가 있다. 멜라닌은 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)에 티로시나제(tyrosinase)라는 효소가 작용하여 도파(DOPA), 도파퀴논(dopaquinone)으로 바뀐 후 비효소적인 산화반응을 거쳐 만들어진다. 멜라닌이 만들어지는 경로는 알려져 있지만, 티로시나제가 작용하는 이전 단계인 멜라닌 합성을 유도하는 메커니즘이 무엇인지에 대해서는 아직도 자세히 밝혀지지 않았다. 멜라닌의 합성이 피부 내에서 과도하게 일어나면, 피부 톤을 어둡게 하고, 기미, 주근깨 등을 발생 시키기도 하며, 이러한 멜라닌의 합성을 촉진하는 요인으로는 자외선, 호르몬 및 유전적인 원인 등이 언급되고 있다.

다시 말해, 외부 자극원에 의한 피부 세포의 산화적 손상은 궁극적으로 피부의 노화와 함께 흑화를 촉진하게 된다. 이러한 이유로, 외인성 노화 및 흑화를 예방하기 위한 여러 가지 기능성 화장품들이 활발히 개발되어 왔다. 그러나 기능성 화장품들은 기능적인 측면에서는 효과적이지만, 그 조성물 대부분이 화학적 합성에 의한 합성물로 화학변화에 의해 피부 자극을 유발할 수 있다는 문제점을 지니고 있다.

즉, 현재 유통되고 있는 피부미백 및/또는 피부주름 개선 화장 제품은 다양하고 많으나, 화학적 합성에 의한 합성물일 경우 화학변화에 의해 피부 자극을 유발할 수 있으며, 다양한 부작용, 장기안정성이 떨어지는 등의 문제가 있어 피부 미백과 피부주름을 동시에 개선할 수 있는 천연소재를 찾는 것은 쉽지 않은 실정이다.

이에, 식물추출물 및/또는 생약재 추출물과 같은 천연 추출물을 이용한 미백 및/또는 주름 개선 연구가 활발하게 진행되었는데, 예를 들면, 알로에(일본공개특허 소52-44375호), 반하(한국공개특허 2011-0078412호, 한국공개특허 2008-0094455호), 작약(한국공개특허 2003-0021811호) 등이 개발 되었는데, 이를 화장품화시키는 경우 변색 가능성이 있고 장기안전성이 떨어지는 문제가 있어 이를 방지하기 위해 다른 부수적인 추가 성분을 첨가해야 하고 이로 인한 미백, 주름 개선 감소 또는 피부에 부작용을 일으키는 문제가 있다.

또한, 멜라닌 생성 억제제로서, 지의류 배양물 및/또는 추출물과 함께 밀배아, 대두, 호프 추출물 등의 식물 추출물을 함께 혼합하는 기술이 연구되었으나(일본공개번호 JP 2012-150173호), 이 역시 장기안정성 문제가 있으며, 미백 효과는 있으나, 주름 개선 효과가 거의 없는 단점이 있다.

그리고, 비타민 B1이 함유된 소맥배아, 맥아와 알리신을 함유한 식물을 배양 성분으로 하여 사카로마이에스 세레비지에 균주로 발효시켜서 특정 성분인 알리티아민을 추출하여 이를 피부미백 및 피부주름 등의 노화방지용 화장료 조성물로 사용하는 기술(한국공개번호 2010-0084209호)이 연구가 된 바 있다.

이렇듯 다양한 종류의 피부 주름, 미백에 도움을 주는 다양한 원료가 개발되고 있으나 부작용, 장기안정성이 떨어지는 등의 문제가 있어 안전하고 장기 안정성의 문제점을 해결할 수 있는 천연 소재의 원료 및/또는 제품이 필요하다.

시중에 유통되고 있는 피부미백 및/또는 피부주름 개선 화장 제품은 다양하고 많으나, 부작용, 장기안정성이 떨어지는 등의 문제가 있으며, 수요자들이 기존 기능성 화장 제품에 대한 만족도가 떨어지고 있는 실정이었는 바, 본 발명자들은 새로운 기능성 화장품 등의 피부외용제를 개발하고자 노력한 결과, 피부미백과 동시에 피부주름을 개선시킬 수 있는 피부외용제 소재를 완성하게 되었다.

상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 피부미백 및 피부주름 개선제에 관한 것으로서, 소이펩타이드 발효물을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 피부미백 및/또는 피부주름 개선용 조성물에 있어서, 상기 소이펩타이드 발효물은 중량평균분자량 200 ~ 500의 저분자 소이펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 피부미백 및/또는 피부주름 개선용 조성물은 상기 소이펩타이드 발효물을 50 ~ 50,000 ppm으로, 바람직하게는 100 ~ 10,000 ppm, 더욱 바람직하게는 1,000 ~ 7,000 ppm으로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 그리고, 상기 펩타이드는 디펩타이드, 트리펩타이드 및 테트라펩타이드 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 소이펩타이드 발효물은 펩톤화된 단백분해물을 유산균으로 발효시킨 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 펩톤화된 단백분해물은 대두, 서리태, 서목태, 흑태, 강낭콩, 울타리콩, 푸르대콩, 녹두, 적두, 거두, 콩나물콩, 선비콩 및 풋콩 중에서 선택된 1종 이상을 함유한 콩을 펩신을 이용하여 펩톤화시킨 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 발효에 사용되는 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주를 포함할 수 있다. 그리고, 상기 락토바실러스속 균주는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus Casei), 락토바실러스 플란타넘(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 및 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예로서, 본 발명의 피부미백 및/또는 피부주름 개선용 조성물은 유액 타입, 화장수 타입, 크림 타입, 로션 타입, 에멀젼 타입, 에센스 타입, 팩 타입, 젤 타입, 앰플 타입 또는 미스트(mist) 타입인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예로서, 본 발명의 피부미백 및/또는 피부주름 개선용 조성물은 크림 타입 또는 로션 타입인 경우, 소이펩타이드 발효물, 글리세린, 부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 카르복실비닐폴리머, 폴리솔베이트, 경화피마자 오일, 글리세릴스테아레이트, 세테아릴알코올, 세틸에틸헥사노에이트, 감초추출물 및 레시틴을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 또한, 소이펩타이드 발효물 100 중량부에 대하여, 글리세린 400 ~ 800 중량부, 부틸렌글리콜 700 중량부 ~ 1,200 중량부, 디프로필렌글리콜 800 중량부 ~ 1,500 중량부, 카르복실비닐폴리머 30 ~ 80 중량부, 폴리솔베이트 50 ~ 150 중량부, 경화피마자 오일 600 ~ 1,000 중량부, 글리세릴스테아레이트 80 ~ 150 중량부, 세테아릴알코올 150 ~ 300 중량부, 세틸에틸헥사노에이트 400 ~ 800 중량부, 감초추출물 5 ~ 40 중량부 및 레시틴 2 ~ 50 중량부를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예로서, 본 발명의 피부미백 및/또는 피부주름 개선용 조성물은 유액 타입, 화장수 타입, 에멀젼 타입, 앰플 타입 또는 에센스 타입인 경우, 소이펩타이드 발효물, 디프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 폴리솔베이트, 디포타슘글리시리제이트, 알란토인, 판테놀 및 글리세린을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 또한, 소이펩타이드 발효물 100 중량부에 대하여 디프로필렌글리콜 1,000 ~ 1,700 중량부, 1,3-부틸렌글리콜 800 ~ 1,200 중량부, 폴리솔베이트 450 ~ 700 중량부, 디포타슘글리시리제이트 60 ~ 130 중량부, 알란토인 60 ~ 150 중량부, 판테놀 50 ~ 150 중량부 및 글리세린 400 ~ 800 중량부를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명은 앞서 설명한 다양한 형태의 상기 피부미백 및/또는 피부주름 개선용 조성물을 이용하여, 피부미백 및/또는 피부주름 개선제를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 카르복시비닐폴리머, 정제수, 글리세린, 부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜 및 레시틴을 혼합하여 제1혼합물을 제조하는 단계; 폴리솔베이트, 경화 피마자오일, 글리세릴스테아레이트, 세테아릴알코올, 세틸에틸헥사노에이트를 혼합하여 제2혼합물을 제조하는 단계; 상기 제1혼합물 및 제2 혼합물 각각을 70℃ ~ 90℃까지 가온시킨 후, 가온된 제1혼합물 및 제2 혼합물을 혼합 및 교반하여 제3혼합물을 제조하는 단계; 및 상기 제3혼합물을 교반시키면서 35℃ ~ 50℃까지 온도를 낮춘 후, 소이펩타이드 발효물, 감초추출물 및 첨가제를 혼합하는 단계;를 포함하는 공정을 수행하여 피부미백 및 피부주름 개선제를 제조하는 것을 특징으로 할 수 있다. 그리고, 상기 첨가제는 방부제, 향료 등으로 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 상기 제조방법에 있어서, 상기 소이펩타이드 발효물은 펩톤화된 단백분해물을 포함하는 배지를 제조하는 제1단계; 상기 배지에 유산균을 접종하는 제2단계; 제2단계의 접종된 유산균을 배양하여 펩톤화된 단백분해물을 발효시켜서 저분자 펩타이드 배양물을 제조하는 제3단계; 및 상기 저분자 펩타이드 배양물로부터 균체 및 불용성 성분을 제거하여 저분자 펩타이드 발효물을 얻는 제4단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 소이펩타이드 발효물은 상기 저분자 펩타이드 발효물을 건조시키는 제5단계;를 공정을 더 수행하여 제조할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 펩톤화된 단백분해물은 펩톤화된 콩단백분해물일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 소이펩타이드 발효물 제조시, 제1단계의 상기 배지는 글루코오스, 수크로오스, 말토오스, 프럭토오스, 락토오스, 자일로오스, 갈락토오스 및 아라비노오스 중에서 선택된 1종 이상을 함유한 탄소원; 및 마그네슘 설페이트, 망가닉 설페이트, 징크 설페이트, 쿠퍼 설페이트, 소듐 아세테이트, 포타슘포스페이트 및 칼슘 클로라이드 중에서 선택된 1종 이상의 무기원소 화합물;를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 소이펩타이드 발효물 제조시, 제2단계의 상기 접종은 유산균을 1×10⁴ ~ 1×10⁷ cfu/㎖로 유산균을 배지에 접종시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 소이펩타이드 발효물 제조시, 제3단계의 상기 발효는 25℃ ~ 35℃ 하에서 12 시간 ~ 72 시간 동안 발효를 수행하는 하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명은 앞서 설명한 다양한 형태의 상기 피부미백 및 피부주름 개선용 조성물을 포함하는 피부외용제에 관한 것이다.

본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 피부외용제는 화장품, 앰플 또는 연고 타입의 피부외용제인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 피부주름 방지 및/또는 개선 효과가 우수할 뿐만 아니라, 피부미백 효과가 매우 우수하며, 피부트러블 등의 부작용 또한 최소화된 피부미백 및/또는 피부주름 개선제를 제공할 수 있으며, 피부외용제 제조에 사용되는 다른 조성물들과의 상용성이 우수한 바, 용이하게 화장품, 앰플 또는 연고 등의 다양한 타입 형태로 피부외용제를 제조할 수 있다.

도 1은 본 발명의 피부미백 및 피부주름 개선제 성분인 저분자 소이펩타이드 발효물을 제조하는 공정의 개략도이다.
도 2a ~ 도 2b는 실험예 1에서 수행한 실시예 1에서 제조한 소이펩타이드 발효물에 대한 HLPC 측정 결과로서, 도 2a는 0 ~ 60 분까지, 도 2b는 0 ~ 25분까지의 결과를 나타낸 것이다.
도 3 a ~ 도 3e 각각은 실험예 1에서 수행한 MS 스펙트럼 측정 결과로서, 도 2b에 표시된 부분의 분자량을 확인한 결과이다.
도 4는 실험예 2에서 실시한 소이펩타이드 발효물이 포함된 배지에서 세포독성을 측정한 실험 결과이다.
도 5는 실험예 3에서 실시한 소이펩타이드 발효물이 포함된 배지에서 세포 증식활성을 측정한 실험 결과이다.
도 6은 실험예 4에서 실시한 소이펩타이드 발효물이 포함된 배지에서의 멜라닌 생성 억제 정도를 나타낸 결과로 멜라닌을 용해하기 전 세포 사진을 찍어 나타낸 결과이다.
도 7은 실험예 4에서 실시한 소이펩타이드 발효물이 포함된 배지에서 멜라닌 생성 억제에 관한 실험 결과이다.
도 8 ~ 도 10 각각은 실험예 6 에서 실시한 주름 개선 및 미백 효과 확인을 위한 임상 시험 결과 사진이다.

본 발명에서 사용하는 용어인 [소이펩타이드 발효물]은 펩신에 의해 펩톤화된 콩의 단백분해물을 발효시킨 발효물을 의미하며, [단백분해물]은 특별하게 언급이 없는 한, 콩의 단백분해물을 의미한다. 그리고, 발효 전의 펩톤화된 단백분해물은 다양한 분자량을 갖는 올리고펩타이드와 폴리펩타이드의 혼합체를 의미하며, 이를 발효시킨 소이펩타이드 발효물은 디펩타이드(di-peptide), 트리펩타이드(tri-peptide), 테트라펩타이드(tetra-peptide) 등의 중량평균분자량 200 ~ 500의 저분자량의 펩타이드로 구성된 혼합체를 의미한다.

이하에서는 본 발명을 더욱 구체적으로 설명을 한다.

본 발명은 소이펩타이드 발효물을 포함하는 피부미백 및/또는 피부주름 개선용 조성물에 관한 것으로서, 상기 소이펩타이드 발효물은 중량평균 200 ~ 500의 저분자 소이펩타이드를 포함하며, 상기 저분자 펩타이드는 디펩타이드, 트리펩타이드 및 테트라펩타이드 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

그리고, 본 발명의 피부미백 및/또는 피부주름 개선용 조성물은 상기 소이펩타이드 발효물을 50 ~ 50,000 ppm으로, 바람직하게는 100 ~ 10,000 ppm, 더욱 바람직하게는 1,000 ~ 7,000 ppm을 포함할 수 있다. 이때, 소이펩타이드 발효물의 사용량이 50 ppm 미만이면 그 사용량이 너무 적어서 피부미백 및/또는 피부주름 개선 효과를 볼 수 없을 수 있으며, 50,000 ppm을 초과하여 사용하면 피부세포에 대한 독성 문제가 발생 될 수 있으므로, 상기 범위 내로 사용하는 것이 좋다.

그리고, 상기 소이펩타이드 발효물은 펩톤화된 단백분해물을 유산균으로 발효시킨 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 펩톤화된 단백분해물은 대두, 서리태, 서목태, 흑태, 강낭콩, 울타리콩, 푸르대콩, 녹두, 적두, 거두, 콩나물콩, 선비콩 및 풋콩 중에서 선택된 1종 이상을, 바람직하게는 대두, 서리태, 서목태, 강낭콩 및 녹두 중에서 선택된 1종 이상을 함유한 콩을 펩신을 이용해 펩톤화시킨 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 발효에 사용되는 유산균은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus Casei), 락토바실러스 플란타넘(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 및 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 중에서 선택된 1종 이상의 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 락토바실러스 람노서스 및 락토바실러스 카제이 중에서 선택된 1종 이상의 락토바실러스 속 균주를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 소이펩타이드 발효물은 펩톤화된 단백분해물을 포함하는 배지를 제조하는 제1단계; 상기 배지에 유산균을 접종하는 제2단계; 제2단계의 접종된 유산균을 배양하여 펩톤화된 단백분해물을 발효시켜서 저분자 펩타이드 배양물을 제조하는 제3단계; 및 상기 저분자 펩타이드 배양물로부터 균체 및 불용성 성분을 제거하여 저분자 펩타이드 발효물을 얻는 제4단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조할 수 있으며, 또한, 상기 소이펩타이드 발효물을 건조시키는 제5단계;를 공정을 더 수행하여 제조할 수 있다.

그리고, 상기 소이펩타이드 발효물 제조시, 제1단계의 상기 배지는 글루코오스, 수크로오스, 말토오스, 프럭토오스, 락토오스, 자일로오스, 갈락토오스 및 아라비노오스 중에서 선택된 1종 이상을 함유한 탄소원; 및 마그네슘 설페이트, 망가닉 설페이트, 징크 설페이트, 쿠퍼 설페이트, 소듐 아세테이트, 포타슘포스페이트 및 칼슘 클로라이드 중에서 선택된 1종 이상의 무기원소 화합물;를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 소이펩타이드 발효물 제조시, 제2단계의 상기 접종은 유산균을 1×10⁴ ~ 1×10⁷ cfu/㎖로, 바람직하게는 1×10⁵ ~ 5×10⁶ cfu/㎖으로 유산균을 배지에 접종시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 이때, 유산균 접종 양이 1×10⁴ cfu/㎖ 미만이면 발효시간이 너무 길어질 수 있으며, 유산균 접종 양이 1×10⁷ cfu/㎖을 초과하여 접종시키더라도 소이펩타이드 발효물 내 저분자의 펩타이드 함유량이 더 이상 증가하지 않으므로 비경제적이다.

본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 소이펩타이드 발효물 제조시, 제3단계의 상기 발효는 25℃ ~ 35℃ 하에서 12 시간 ~ 72 시간 동안, 바람직하게는 24 시간 ~ 48 시간 동안 발효를 수행하는 하는 것이 좋다. 이때, 발효시간이 12 시간 미만이면 펩톤화된 콩단백분해물의 분해 시간이 부족해서 저분자량의 펩타이드 함유량이 너무 적을 수 있고, 발효 시간이 72 시간을 초과하면 경제성이 떨어질 수 있으므로 상기 시간 동안 발효를 수행하는 것이 좋다.

본 발명의 피부미백 및/또는 피부주름 개선용 조성물(또는 개선제)는 유액 타입, 화장수 타입, 크림 타입, 로션 타입, 에멀젼 타입, 에센스 타입, 팩 타입, 젤 타입, 앰플 타입 또는 미스트(mist) 타입 등 다양한 타입으로 피부 외용제를 제조할 수 있다.

본 발명이 이에 한정되는 것은 아니나, 이의 구체적인 예를 들면, 본 발명의 피부미백 및 피부주름 개선용 조성물(또는 개선제)를 크림 타입 또는 로션 타입으로 제조할 경우에, 소이펩타이드 발효물, 글리세린, 부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 카르복실비닐폴리머, 폴리솔베이트, 경화피마자 오일, 글리세릴스테아레이트, 세테아릴알코올, 세틸에틸헥사노에이트, 감초추출물 및 레시틴을 혼합하여 제조할 수 있으며, 정제수, 향료, 방부제 등을 더 혼합할 수도 있다.

좀 더 구체적으로 설명하면, 카르복시비닐폴리머, 정제수, 글리세린, 부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜 및 레시틴을 혼합하여 제1혼합물을 제조하는 단계; 폴리솔베이트, 경화 피마자오일, 글리세릴스테아레이트, 세테아릴알코올, 세틸에틸헥사노에이트를 혼합하여 제2혼합물을 제조하는 단계; 상기 제1혼합물 및 제2 혼합물 각각을 70℃ ~ 90℃까지, 바람직하게는 75℃ ~ 85℃까지 가온시킨 후, 가온된 제1혼합물 및 제2 혼합물을 혼합 및 교반하여 제3혼합물을 제조하는 단계; 및 상기 제3혼합물을 교반시키면서 35℃ ~ 50℃까지, 바람직하게는 38℃ ~ 45℃까지 온도를 낮춘 후, 소이펩타이드 발효물, 감초추출물 및 첨가제를 혼합하는 단계;를 포함하는 공정을 수행하여 크림 타입 또는 로션 타입의 피부 외용제를 제조할 수 있다.

이때, 상기 글리세린은 피부보습 역할을 하는 것으로서, 소이펩타이드 발효물 100 중량부에 대하여, 글리세린 400 ~ 800 중량부로, 바람직하게는 500 ~ 700 중량부를 사용할 수 있다. 이때, 글리세린의 사용량이 400 중량부 미만이면 보습감을 떨어지게 하는 문제가 있을 수 있고, 800 중량부를 초과하여 사용하면 끈적임을 유발하는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다.

그리고, 상기 부틸렌글리콜은 피부보습 역할을 하는 것으로서, 소이펩타이드 발효물 100 중량부에 대하여, 부틸렌글리콜 700 ~ 1,200 중량부, 바람직하게는 850 ~ 1,100 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 부틸렌글리콜의 사용량이 700 중량부 미만이면 보습감을 떨어지게 하는 문제가 있을 수 있고, 1,200 중량부를 초과하여 사용하면 제형을 불안정하게 하는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다.

그리고, 상기 디프로필렌글리콜은 피부보습 역할을 하는 것으로서, 소이펩타이드 발효물 100 중량부에 대하여, 디프로필렌글리콜 800 중량부 ~ 1,500 중량부, 바람직하게는 1,000 ~ 1,350 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 디프로필렌글리콜의 사용량이 800 중량부 미만이면 보습감을 떨어지게 하는 문제가 있을 수 있고, 1,500 중량부를 초과하여 사용하면 비경제적인 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다.

그리고, 상기 카르복실비닐폴리머는 점증제 역할을 하는 것으로서, 소이펩타이드 발효물 100 중량부에 대하여, 카르복실비닐폴리머 30 ~ 80 중량부, 바람직하게는 40 ~ 70 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 카르복실비닐폴리머의 사용량이 30 중량부 미만이면 점도를 떨어지게 하는 문제가 있을 수 있고, 80 중량부를 초과하여 사용하면 밀림현상(피부에 흡수되지 않고 겉도는)을 유발하는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다.

그리고, 상기 폴리솔베이트는 가용화제 역할을 하는 것으로서, 소이펩타이드 발효물 100 중량부에 대하여, 폴리솔베이트 50 ~ 150 중량부, 바람직하게는 70 ~ 130 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 폴리솔베이트의 사용량이 50 중량부 미만이면 제형을 분리하게 하는 문제가 있을 수 있고, 150 중량부를 초과하여 사용하면 끈적임과 피부 도포시 거품을 유발하게 하는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다.

그리고, 상기 경화피마자 오일은 가용화제 역할을 하는 것으로서, 소이펩타이드 발효물 100 중량부에 대하여, 경화피마자 오일 600 ~ 1,000 중량부, 바람직하게는 700 ~ 900 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 경화피마자 오일의 사용량이 600 중량부 미만이면 제형을 분리하게 하는 문제가 있을 수 있고, 1,000 중량부를 초과하여 사용하면 도포시 거품을 유발하는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다.

그리고, 상기 글리세릴스테아레이트는 유화제 역할을 하는 것으로서, 소이펩타이드 발효물 100 중량부에 대하여, 글리세릴스테아레이트 80 ~ 150 중량부, 바람직하게는 85 ~ 130 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 글리세릴스테아레이트의 사용량이 80 중량부 미만이면 유화안정도를 떨어지게 하는 문제가 있을 수 있고, 150 중량부를 초과하여 사용하면 유화안정도를 떨어지게 하는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다.

그리고, 상기 세테아릴알코올은 유화제 역할을 하는 것으로서, 소이펩타이드 발효물 100 중량부에 대하여, 세테아릴알코올 150 ~ 300 중량부, 바람직하게는 180 ~ 250 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 세테아릴알코올의 사용량이 150 중량부 미만이면 유화안정도를 떨어지게 하는 문제가 있을 수 있고, 300 중량부를 초과하여 사용하면 유화안정도를 떨어지게 하는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다.

그리고, 상기 세틸에틸헥사노에이트는 오일성분으로 사용감 개선의 역할을 하는 것으로서, 소이펩타이드 발효물 100 중량부에 대하여, 세틸에틸헥사노에이트 400 ~ 800 중량부, 바람직하게는 500 ~ 700 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 세틸에틸헥사노에이트의 사용량이 400 중량부 미만이면 사용감을 떨어지게 하는 문제가 있을 수 있고, 800 중량부를 초과하여 사용하면 변취의 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다.

그리고, 상기 감초추출물은 피부보습 및 항염 역할을 하는 것으로서, 소이펩타이드 발효물 100 중량부에 대하여, 감초추출물 5 ~ 40 중량부, 바람직하게는 10 ~ 30 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 감초추출물의 사용량이 5 중량부 미만이면 피부보습 및 항염의 제역할을 수행하지 못하게 하는 문제가 있을 수 있고, 40 중량부를 초과하여 사용하면 피부자극을 유발하는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다.

그리고, 상기 레시틴은 천연유화제로 사용감 개선, 다중층 리포좀을 통한 피부흡수율을 증가하게 하는 역할을 하는 것으로서, 소이펩타이드 발효물 100 중량부에 대하여, 레시틴 2 ~ 50 중량부를, 바람직하게는 5 ~ 40 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 감초추출물의 사용량이 2 중량부 미만이면 피부흡수율을 떨어지게 하는 문제가 있을 수 있고, 50 중량부를 초과하여 사용하면 제형안정도를 떨어지게 하는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다.

그리고, 상기 정제수는 용매 및 점도 조절 역할을 하며, 피부 외용제 타입에 따라 그 사용량을 조절하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 소이펩타이드 발효물 100 중량부에 대하여 8,000 ~ 20,000 중량부를 사용할 수 있다.

본 발명의 피부미백 및 피부주름 개선용 조성물(또는 개선제)를 이용한 피부 외용제의 또 다른 구체적인 예를 들면, 본 발명의 피부미백 및 피부주름 개선용 조성물(또는 개선제)를 유액 타입, 화장수 타입, 에멀젼 타입, 앰플 타입 또는 에센스 타입 등으로 제조할 경우에는 소이펩타이드 발효물, 디프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 폴리솔베이트, 디포타슘글리시리제이트, 알란토인, 판테놀 및 글리세린을 이용하여 제조할 수 있으며, 정제수, 향료 및 방부제 등을 더 혼합하여 제조할 수도 있다. 그리고, 이러한 타입의 피부 외용제는 소이펩타이드 발효물 100 중량부에 대하여, 디프로필렌글리콜 1,000 ~ 1,700 중량부, 1,3-부틸렌글리콜 800 ~ 1,200 중량부, 폴리솔베이트 450 ~ 700 중량부, 디포타슘글리시리제이트 60 ~ 130 중량부, 알란토인 60 ~ 150 중량부, 판테놀 50 ~ 150 중량부 및 글리세린 400 ~ 800 중량부를 포함할 수 있다.

이때, 상기 디프로필렌글리콜은 피부보습 역할을 하는 것으로서, 소이펩타이드 발효물 100 중량부에 대하여, 디프로필렌글리콜 1,000 ~ 1,700 중량부, 바람직하게는 1,200 ~ 1,500 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 디프로필렌글리콜의 사용량이 1,000 중량부 미만이면 보습감을 떨어지게 하는 문제가 있을 수 있고, 1,700 중량부를 초과하여 사용하면 비경제일 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다.

그리고, 상기 1,3-부틸렌글리콜은 피부보습 역할을 하는 것으로서, 소이펩타이드 발효물 100 중량부에 대하여, 1,3-부틸렌글리콜 800 ~ 1,200 중량부, 바람직하게는 900 ~ 1,100 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 1,3-부틸렌글리콜의 사용량이 800 중량부 미만이면 보습감을 떨어지게 하는 문제가 있을 수 있고, 1,200 중량부를 초과하여 사용하면 제형을 불안정하게 하는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다.

그리고, 상기 폴리솔베이트는 가용화제 역할을 하는 것으로서, 소이펩타이드 발효물 100 중량부에 대하여, 폴리솔베이트 450 ~ 700 중량부, 바람직하게는 550 ~ 650 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 폴리솔베이트의 사용량이 450 중량부 미만이면 제형을 분리하게 하는 문제가 있을 수 있고, 700 중량부를 초과하여 사용하면 끈적임과 피부 도포시 거품을 유발하는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다.

그리고, 상기 디포타슘글리시리제이트는 자극완화 역할을 하는 것으로서, 소이펩타이드 발효물 100 중량부에 대하여, 디포타슘글리시리제이트 60 ~ 130 중량부, 바람직하게는 80 ~ 120 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 디포타슘글리시리제이트의 사용량이 60 중량부 미만이면 자극완화의 제 역할을 못하게 하는 문제가 있을 수 있고, 130 중량부를 초과하여 사용하면 제형의 안정도를 깨는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다.

그리고, 상기 알란토인은 자극완화 역할을 하는 것으로서, 소이펩타이드 발효물 100 중량부에 대하여, 알란토인 60 ~ 150 중량부, 바람직하게는 80 ~ 120 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 알란토인의 사용량이 60 중량부 미만이면 자극완화의 제 역할을 못하게 하는 문제가 있을 수 있고, 150 중량부를 초과하여 사용하면 제형의 안정도를 깨는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다.

그리고, 상기 판테놀은 자극완화제 및 비타민 B5로 피부에 영양분을 공급 하는 역할을 하는 것으로서, 소이펩타이드 발효물 100 중량부에 대하여, 판테놀 50 ~ 150 중량부, 바람직하게는 60 ~ 130 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 알란토인의 사용량이 60 중량부 미만이면 자극완화, 피부영양분 공급의 제 역할을 못하게 하는 문제가 있을 수 있고, 150 중량부를 초과하여 사용하면 제형의 안정도를 깨는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다.

그리고, 상기 글리세린은 피부보습 역할을 하는 것으로서, 소이펩타이드 발효물 100 중량부에 대하여, 글리세린 400 ~ 800 중량부를, 바람직하게는 500 ~ 700 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 알란토인의 사용량이 400 중량부 미만이면 피부보습을 떨어지게 하는 문제가 있을 수 있고, 800 중량부를 초과하여 사용하면 끈적임을 유발하게 하는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.

[ 실시예 ]

실시예 1 : 소이펩타이드 발효물의 제조

펩톤화된 단백분해물은 Fluka (Sigma-Aldrich, St. QuentinFallavier,France)로부터 구입하였다. 상기 펩톤화된 단백분해물인 대두펩톤(soybean peptone) 500g을 하기 표 1의 성분 및 함량의 배지에 가하여 혼합한 다음, 121℃에서, 15분간 가열하여 멸균처리하였다. 다음으로, 이를 냉각 후, 유산균으로서 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)를 초기 균수가 1×10⁶ cfu/㎖ 이 되도록 접종한 후, 50 rpm으로 교반하면서 30℃에서, 48시간 배양 및 발효시켜 소이펩타이드 발효 배양물을 수득하였다.

다음으로, 상기 과정을 통해 수득한 소이펩타이드 발효 배양물을 최종온도가 95℃가 되도록 가열 처리한 후, 원심분리(3,000rpm, 15min)하여 균체 및 불용성 성분을 제거하였다. 그리고, 세포실험시 정확한 농도처리를 위해 소이펩타이드 발효물을 동결 건조하여 사용하였으며, 소이펩타이드 발효물 1L에서 동결건조된 소이펩타이드 발효물 약 45g을 얻었다.

No.	성분명	함량(w/w)
1	대두펩톤(Soybean Peptone)	5.000%
2	글루코오스(Glucose)	0.500%
3	인산칼륨(Potassium phosphate)	0.2500%
4	아세트산나트륨(Sodium acetate)	0.120%
5	시트르산암모늄(Dimmonium citrate)	0.120%
6	황산마그네슘(MgSO4)	0.012%
7	황산망간(MnSO4)	0.003%
8	황산아연(ZnSO4)	0.001%
9	황산구리(CuSO4)	0.001%
10	정제수	93.993%
합계		100.000%

실시예 2 : 기능성 앰플의 제조

상기 실시예 1의 소이펩타이드 발효물을 이용하여 하기 표 2와 같은 성분을 갖는 앰플을 제조하였다. 이를 좀 더 구체적으로 설명하면, 디프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 디포타슘그리시리제이트, 알란토인, 판테놀, 글리세린을 정제수에 넣고 잘 혼합하여 제 1 혼합물을 제조하였다. 여기에 폴리솔베이트 80을 넣고 혼합하여 가용화한 후 방부제를 넣고 혼합하여 제2혼합물을 제조하였다. 다음으로, 제2 혼합물에 방부제, 향료, 소이펩타이드 발효물을 넣고, 잘 교반시켜서 5,000 ppm정도로 소이펩타이드 발효물을 함유한 앰플 타입의 기능성 피부 외용제를 제조하였다. 앰플 제조는 가온조건 없이 실온 조건에서 제조가 가능하므로 26℃에서 제품을 제조하였다.

구분	성분	제조배합비 (중량부)
1	실시예 1의 소이펩타이드 발효물	100
2	디프로필렌글리콜	1,400
3	1,3-부틸렌글리콜	1,000
4	폴리솔베이트 80	600
5	디포타슘글리시리제이트	100
6	알란토인	100
7	판테놀	100
8	글리세린	600
9	정제수	15,800
10	방부제	100
11	향료	100

실시예 3 : 기능성 외용제(크림)의 제조

상기 실시예 1의 소이펩타이드 발효물을 이용하여 하기 표 3과 같은 성분을 갖는 크림타입의 외용제를 제조하였다. 이를 좀 더 구체적으로 설명하면, 카르복시비닐폴리머에 정제수를 넣고 혼합하여 카르복시비닐폴리머를 잘 풀어 준비한 후 여기에 글리세린, 부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 레시틴을 넣어 제 1 혼합물을 제조하였다. 또한, 폴리솔베이트 80, 경화 피마자오일, 글리세릴스테아레이트, 세테아릴알코올, 세틸에칠헥사노에이트를 넣어 제 2 혼합물을 제조하였다. 그리고, 상기 제 1, 2 혼합물 각각을 80℃까지 가온한 후, 이들을 혼합 및 교반하여 제 3혼합물을 제조하였다. 다음으로, 제3혼합물을 고르게 저어가며 온도를 40℃까지 떨어뜨린 후, 방부제, 향료, 소이펩타이드 발효물 및 감초추출물을 넣은 후, 교반 및 혼합시켜서 5,000ppm 정도의 소이펩타이드 발효물을 함유한 크림타입의 기능성 외용제를 제조하였다.

구분	성분	제조배합비 (중량부)
1	실시예 1의 소이펩타이드 발효물	100
2	글리세린	600
3	부틸렌글리콜	1,000
4	디프로필렌글리콜	1,200
5	카르복실비닐폴리머	60
6	폴리솔베이트 80	100
7	경화피마자 오일	800
8	글리세릴스테아레이트	100
9	세테아릴알코올	200
10	세틸에틸헥사노에이트	600
11	감초추출물	20
12	레시틴	20
13	정제수	15,000
14	방부제	100
15	향료	100

비교예 1

펩톤화된 단백분해물로서 대두펩톤(soybean peptone)을 사용하였으며, Fluka (Sigma-Aldrich, St. Quentin Fallavier, France)로부터 구입하여 그대로 용해시켜 사용하였다.

준비예 1: 세포배양

세포 증식 활성 실험을 위한 인간유래 진피 세포와 멜라닌 합성 저해 실험을 위한 B16F10 멜라노마 세포는 한국세포주은행(KCLB,Korean Cell Line Bank) 에서 분양 받아 사용하였다.

각 세포를 75T 플라스크에 분주하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 배지는 10% FBS, 1% 항생제가 포함된 DMEM배지(Dulbecco? modified Eagle? medium)를 사용하였으며 3일마다 배양액을 교체하였다. 플라스크에서 80~90% 정도 성장을 보이면 계대해 주었으며 최소 한번 정도의 계대가 된 후 안정된 상태의 세포를 이용해 실험을 진행하였다.

실험예 1 : 고속액체 크로마토그래피( HPLC ) 및 MS ( Mass spectrometry ) 측정을 통한 분자량 확인 시험

상기 실시예 1 소이펩타이드 발효물의 분자량을 확인하기 위하여, 고속액체 크로마토그래피 및 MS 스펙트럼을 측정하였다.

고속액체 크로마토그래피 측정은 Accela UHPLC(제조사 : Thermo Scientific) 를 이용하였다. 동결건조한 소이펩타이드 발효물을 0.1% 개미산(Formic acid)에 녹였으며, 분석 시 온도는 RT(Room Temperature)로 하였다. 컬럼은 Water BEH C18(2.1×100 ㎖, 1.7 ㎛)을 이용하였고, 유량(Flow rate)은 분당 300 ㎕가 되도록 유지하였다. 시료 분석 시간은 최대 60분까지 진행하였으며, 0분 ~ 60분까지의 측정 결과를 도 2a에 나타내었고, 이 중 0 분 ~ 25분까지의 측정 결과를 도 2b에 나타내었다.

또한, MS 스펙트럼 측정은 LTQ Orbitrap XL mass spectrometer(제조사 : Thermo Scientific)을 이용하여 수행하였다. 액체 크로마토그래피에서 분리한 단일성분 중 면적이 큰 5개의 피크를 임의로 선정한 후, MS 스펙트럼을 통해 분자량을 확인하였고, 그 결과를 도 3a ~ 도 3e에 각각 나타내었다.

도 3a ~ 도 3e각각은 도 2b의 ① ~ ⑤ 표시 부분의 피크의 분자량을 측정한 데이터이며, 도 3의 ① ~ ⑤ 결과를 통하여, 대부분의 피크의 중량평균분자량이 100 ~ 500 이하, 바람직하게는 중량평균분자량 200 ~ 300 사이의 펩타이드로서, 2 ~ 4개의 아미노산으로 구성된 펩타이드임을 추정 및/또는 확인할 수 있었다.

실험예 2 : In - vitro 상에서의 세포독성 확인 시험

96-웰 배양용기에 준비예 1에서 배양된 Human Demal Fibroblast 세포(인간유래 피부 진피 세포)를 1×10⁴cell/㎖이 되도록 각 웰(well)에 200㎕씩 분주하여 안정화를 위해 37℃, 5 부피% CO₂ 조건 하에서 24시간 배양하였다. 24시간 후 배양용기의 각 웰(well)에 실시예 1(100 ppm ~ 20,000 ppm), 비교예 1(500 ppm), EGF(20 ppm, Sigma aldrich사의

Epidermal Growth Factor human, Cat.no E9644)를 농도별로 첨가한 다음 37℃, 5 부피% CO₂ 조건 하에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 MTS 시료(CellTiter 96^® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay kit, Cat no.G5421, Promega사) 20㎕를 넣어주고, 37℃, 5 부피% CO₂ 인큐베이터(Incubator)에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 다음, 492nm에서 흡광도를 측정하였다. 배양용기에 실시예 1에서 제조된 소이펩타이드 발효물이 첨가되지 않은 대조군을 기준으로 Human Demal Fibroblast 세포의 생존비를 계산하였다.

도 4에 세포독성 실험결과를 나타내었다. 결과를 살펴보면, 소이펩타이드 발효물이 5,000 ppm 이하에서는 세포독성을 보이지 않았고, 5,000 ppm을 초과하면서부터 세포독성이 나타나는 결과를 보임을 확인할 수 있었다.

실험예 3 : 진피세포 증식활성 확인 시험

96-웰 배양용기에 준비예 1에서 배양된 Human Demal Fibroblast 세포(인간유래 피부 진피 세포)를 1×10⁴ cell/㎖이 되도록 각 웰(well)에 200㎕씩 분주하여 안정화를 위해 37℃, 5 부피% CO₂ 조건 하에서 24시간 배양하였다. 24시간 후 배양용기의 각 웰(well)에 실시예 1에서 제조된 소이펩타이드 발효물을 100 ~ 1000 ppm 농도와 비교예 1(500 ppm), EGF(20 ppm, Sigma aldrich사의

Epidermal Growth Factor human, Cat.no E9644)를 농도별로 첨가한 다음 37℃, 5 부피% CO₂ 조건 하에서 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후 MTS 시료(CellTiter 96^® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay kit, Cat no.G5421, Promega사) 20㎕를 넣어주고, 37℃, 5 부피% CO₂ 인큐베이터(Incubator)에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료되면 492nm에서 흡광도를 측정하였다. 배양용기에 실시예 1에서 제조된 소이펩타이드 발효물이 첨가되지 않은 대조군을 기준으로 Human Demal Fibroblast 세포의 생존비를 계산하였다.

도 5에 세포 증식활성 실험에 대한 결과를 나타내었다. 결과를 살펴보면, 소이펩타이드 발효물의 경우, 100 ppm ~ 1,000 ppm까지 EGF와 비교할 때, 상대적으로 매우 높은 세포 증식활성을 보였다. 다만, 소이펩타이드 발효물이 500 ppm인 경우 보다 1,000 ppm이 세포에 대한 증식 활성이 다소 감소하는 결과를 보였다. 그러나, 비교예 1의 발효되지 않은 대두펩톤(500 ppm) 보다는 모두 우수한 세포 증식 활성 결과를 보였다.

그리고, 세포독성 및 증식활성 측정실험은 실제 피부 외용제 제품 보다 10배 정도로 희석된 농도의 소이펩타이드 발효물을 사용한 것으로서, 소이펩타이드 발효물을 이용한 피부 외용제 제조시에는 세포 독성 및 세포 활성면 등을 고려할 때, 50,000 ppm 이하, 바람직하게는 10,000 ppm 이하로 사용하는 것이 유리함을 추론할 수 있었다.

실험예 4 : 멜라닌 생성 억제 확인 시험

24 well plate에 상기 준비예 1에서 배양된 B16F10 멜라노마 세포를 1×10⁵ cells/ml로 분주한 후, α-MSH(100 nM)와 실시예 1(500 ppm ~ 1,000 ppm), 비교예 1(500 ppm), 알부틴(arbutin, 500 ppm)을 농도별로 처리하였다. 여기서, α-MSH(100 nM)는 멜라닌세포를 자극하여 멜라닌 생성을 촉진하는 양성대조군(Positive control)로써 작용했으며, 대조군인 control은 1X PBS(Gibco사의 Dulbecco`s Phosphate Buffer Saline, Cat.no 21300-025)를 처리하였다.

37℃, 5 부피% CO₂ 조건 하에서 5일간 배양 후 트립신(Trypsin)처리를 하여 세포 수거한 다음, 이를 PBS로 2회 세척하였다. 여기에 10% DMSO(dimethylsulfoxide)가 첨가된 1 N NaOH 용액을 처리하여 80℃에서 1시간 동안 반응하여 멜라닌을 용해하였고, 475 nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 형성 억제 정도를 측정하였다. 도 6은 트립신으로 세포를 수거한 이후의 세포사진이며, 양성대조군과 알부틴, 소이펩타이드 발효물을 처리한 세포에서 세포 내의 멜라닌 합성이 억제되어 검은색이 옅어졌음을 보여주기 위한 결과 데이터이다. 각 세포를 1N NaOH로 용해하여 세포 내 멜라닌의 양을 측정한 결과는 도7에 나타내었다.

도 7의 멜라닌 생성 억제 실험 결과를 살펴보면, 실시예(100 ppm, 300 ppm, 500 ppm, 1,000 ppm)의 경우, 대표적인 멜라닌 생성 억제 물질인 알부틴 보다는 멜라닌 생성 억제 효과가 다소 부족하나, 양성대조군 보다는 멜라닌 생성 억제 효과가 큰 것을 확인할 수 있다. 또한, 발효시키지 않은 비교예 1 보다는 멜라닌 생성 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.

그러나, 실시예에서 500 ppm과 1,000 ppm과의 멜라닌 생성 억제 효과가 거의 차이가 없는 바, 소이펩타이드 발효물을 1,000 ppm 이하로, 바람직하게는 700 ppm 이하로 사용하는 것이 멜라닌 효과 및 경제성 면에서 적정 사용량임을 확인할 수 있었다.

그리고, 멜라닌 생성 억제 효과 측정실험은 실제 피부 외용제 제품 보다 10배 정도로 희석된 농도의 소이펩타이드 발효물을 사용한 것으로서, 소이펩타이드 발효물을 이용한 피부 외용제 제조시에는 10,000 ppm 이하, 바람직하게는 7,000 ppm 이하로 사용하는 것이 유리함을 추론할 수 있었다.

상기 실험예 2 및 실험예 3의 소이펩타이드 발효물의 세포독성 및 증식활성 측정실험과 실험예 4의 소이펩타이드 발효물의 멜라닌 생성 억제 효과 측정실험을 통해서, 본 발명의 소이펩타이드 발효물이 피부주름과 관련된 진피세포 증식을 활성 시킬 수 있음을 확인할 수 있었으며, 또한, 피부미백과 관련된 멜라닌 생성을 억제시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 세포 독성 및 경제성 등을 고려할 때, 소이펩타이드 발효물을 이용하여 피부 외용제를 제조시에는 세포 실험 적정 농도의 10 배 정도 수치인 50 ppm ~ 50,000 ppm, 바람직하게는 100 ppm ~ 10,000 ppm, 더욱 바람직하게는 1,000 ppm ~ 7,000 ppm이 되도록 소이펩타이드 발효물을 사용하는 것이 피부미백 및/또는 피부주름 개선 면에서 유리함을 확인할 수 있었다.

실험예 5 : In - vivo 상에서의 마우스 C57BL /6을 이용한 독성 확인 시험

시험에 사용한 시료는 실시예 1에 따라 제조된 소이펩타이드 발효물을 5 중량%가 되도록 멸균수에 녹여 사용하였다. 본 시험에 사용된 동물은 C57BL/6 마우스를 이용하여, 난괴법에 의해 28일간(4주간) 1일 1회 시험물질을 100 ㎕씩 경피투여하여 독성 측정 실험을 수행하였다. 군 구성은 음성 대조군(무처리), 시험군(5 중량% 소이펩타이드 발효물) 총 2개의 군으로 수컷, 암컷 모두에서 각각 3마리씩 실시하였다.

실험에 사용된 마우스 C57BL/6는 출생일로부터 3일 이내의 몸무게가 비슷한 개체들로 선별하여 6주령된 마우스 C57BL/6 암컷 및 수컷을 오리엔트로부터 분양 받아, 25℃, 습도 50% 사육조건에서 1주일간의 적응기를 갖은 후, 명암주기 12시간 밤과 낮 단위로 조절되고 온도 습도가 적절하게 유지되는 표준사육 환경에서 사육한 다음, 7주령이 되는 주에 실험을 실시하였다. 그리고, 사육기간 동안 사료와 물의 양은 제한 없이 공급하였으며, 실험의 모든 과정은 아산생명과학 연구원 동물실험 윤리위원회의 허가(승인번호: 2013-04-059)를 얻은 후, 가이드라인에 의거하여 실험을 진행하였다.

그리고, 29일째 되는 날 마우스의 피부 조직을 절취하여, 조직학적 변화를 보기 위해 10% 중성 완충 포르말린 용액에 고정한 다음, 질소로 동결한 후, -70℃에서 냉동 보관하였다.

(1) 장기 무게 확인 시험

4주간 경피투여를 실시한 이후 다음날 부검을 실시하였다. 부검 시 비장, 흉선을 적출하여 생리식염수로 씻어내고 여과지로 수분을 제거한 후 무게를 측정하였다. 피부, 비장 및 흉선, 생식기(수컷-고환, 부고환, 암컷- 난소)를 현미경으로 관찰하고 비장과 흉선의 무게를 측정하여 체중대비 환산 비교한 결과, 하기 표 4와 같이, 대조군과 시험군간의 큰 차이가 없어 생체독성이 없음을 확인하였다.

구분	체중 (g)	비장 무게 (g)	흉선 무게 (g)	비장무게 /체중	흉선무게 /체중	균별평균 (비장무게/체중)	군별평균 (흉선무게/체중)
음성대조군-1(♀)	24.41	0.0518	0.0518	0.0021	0.0022	0.0022	0.0026
음성대조군-2(♀)	25.58	0.066	0.066	0.0026	0.0028
음성대조군-3(♀)	25.47	0.0495	0.0495	0.0019	0.0027
음성대조군-1(♂)	18.93	0.05	0.05	0.0026	0.0033	0.0028	0.0031
음성대조군-2(♂)	18.08	0.0593	0.0593	0.0033	0.0034
음성대조군-3(♂)	19.78	0.0496	0.0496	0.0025	0.0026
시험군-1(♀)	24.32	0.0684	0.0684	0.0028	0.0025	0.0025	0.0023
시험군-2(♀)	24.42	0.0569	0.0569	0.0023	0.0021
시험군-3(♀)	24.48	0.0549	0.0549	0.0022	0.0022
시험군-1(♂)	18.14	0.0696	0.0696	0.0038	0.0035	0.0033	0.0036
시험군-2(♂)	18.25	0.06	0.06	0.0033	0.0037
시험군-3(♂)	18.78	0.0548	0.0548	0.0029	0.0037

(2) 피부조직의 효소활성도 확인 시험 : Alkaline phosphatase( ALP )

상기 냉동보관한 피부조직 중량의 4배 중량에 해당하는 인산완충용액(phosphate buffer solution, PBS)을 첨가하여 조직 마쇄기(Tissue lyser)를 이용하여 균질액으로 만들었다. 이 균질액을 원심분리기를 이용하여 4℃에서12,000rpm으로 20분간 원심 분리하고, 그 상층액을 얻어 자동 생화학 분석기를 이용하여 ALP 효소의 양을 분석하였고, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

생화학 검사 결과, ALT의 수치가 음성대조군에 비해 평균적으로 낮게 나와 간독성이 발생하지 않음을 확인하였다.

구분	ALT	평균
음성대조군-1(♀)	352.5	383.8
음성대조군-2(♀)	336.7
음성대조군-3(♀)	462.2
음성대조군-1(♂)	385.0	301.9
음성대조군-2(♂)	353.1
음성대조군-3(♂)	167.7
시험군-1(♀)	212.4	274.8
시험군-2(♀)	249.1
시험군-3(♀)	362.8
시험군-1(♂)	342.2	264.2
시험군-2(♂)	221.2
시험군-3(♂)	229.3

(3) 피부조직의 효소활성도 확인 시험 : γ ? lutamyl transpeptidase(γ- GT )

상기 냉동보관한 피부조직 중량의 4배 중량에 해당하는 인산완충용액(phosphate buffer solution, PBS)을 첨가하여 조직 마쇄기(Tissue lyser)를 이용하여 균질액으로 만들었다. 이 균질액을 원심분리기를 이용하여 4℃에서12,000rpm으로 20분간 원심 분리하고, 그 상층액을 얻어 자동 생화학 분석기를 이용하여 γ-GT효소의 양을 분석하였고, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

하기 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 생화학 검사 결과, γ-GT 수치가 음성대조군에 비해 평균적으로 낮게 나와 간독성이 발생하지 않음을 확인하였다.

구분	γ-GT	평균
음성대조군-1(♀)	1.57	10.177
음성대조군-2(♀)	24.30
음성대조군-3(♀)	3.05
음성대조군-1(♂)	26.22
음성대조군-2(♂)	3.87
음성대조군-3(♂)	2.05
시험군-1(♀)	0.15	4.037
시험군-2(♀)	1.25
시험군-3(♀)	0.84
시험군-1(♂)	5.11
시험군-2(♂)	14.57
시험군-3(♂)	2.30

(4) 피부조직의 면역조직학적 관찰 시험

대조군과 시험군의 포매된 조직을 두께 3㎛로 절편을 만들어서 전자동 면역 염색기(BenchMark XT, Ventana)를 이용하여 기기의 manual에 맞춰 조직을 면역염색을 수행하였다. 측정을 위해 Ventana Ultraview DAB Kit를 사용하였으며, 면역 조직 염색에 사용된 항체는 Abcam 사의 IGF-1, VEGF, TGF β1, Caspase-3를 사용하였다.

검사 결과, 모든 수치가 군간에 의미있는 차이가 발생하지 않아, 염증 발생에 관여하지 않음을 확인하였다.

실험예 6 : 주름 개선 및 미백 효과 확인을 위한 임상 시험

소이펩타이드 발효물이 포함된 본 발명의 개선제 조성물의 피부주름 및 피부미백 효과를 확인하기 위하여 눈가 및 입가 등에 주름과 피부착색을 동시에 보유하고 있는 피험자를 3인을 선정하였다.

피험자들의 주름 및 피부착색 부위에 실시예 2에서 제조된 앰플과 실시예 3에서 제조된 크림을 도포하였으며, 1일 2회(아침, 저녁) 세안 후 꾸준히 사용하도록 하였다. 실시예 2에서 제조한 앰플을 2 ~ 3방울 정도(약 0.3g) 도포한 후, 그 위에 실시예 3에서 제조한 크림을 콩알크기 정도(약 0.5g)로 덧바르는 형식으로 도포하여 주었다.

28일의 피부주기를 감안하여 35일, 총 5 주간에 걸쳐 실험을 진행하였으며, 화장료 사용 이전의 측정사진과 화장료 사용 이후 동일 부위를 재 촬영한 사진을 비교하는 방법으로 피부의 주름 및 피부착색 변화를 관찰하였다. 그리고, 피험자의 피부 주름 및 미백 측정 결과는 도 8 ~ 도 10에 나타내었다.

도 8 ~ 도 10에서 확인할 수 있듯이, 실시예 2에서 제조된 소이펩타이드 발효물이 포함된 앰플과 실시예 3에서 제조된 소이펩타이드 발효물이 포함된 크림을 5주 동안 꾸준히 발라주었을 때, 5주 전과 비교하여, 피험자들 모두 주름개선 효과를 보였으며, 눈가 주위의 색소 침착이 눈에 띄게 개선되어 미백 효과 또한 있음이 확인되었다.

상기 실시예 및 실험예를 통하여, 본 발명의 소이펩타이드 발효물이 피부미백뿐만 아니라, 피부주름 개선 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었으며, 이를 이용하여, 화장품, 앰플 또는 연고 등의 다양한 타입 형태로 피부외용제로 응용할 수 있다.

Claims (20)

1. 펩톤화된 단백분해물을 유산균으로 발효시킨 소이펩타이드 발효물을 1,000 ppm ~ 10,000 ppm 으로 포함하며,
   상기 소이펩타이드 발효물은 중량평균분자량 200 ~ 500의 저분자 펩타이드를 100 중량%(기타 불가피한 불순물 포함)로 포함하며,
   상기 유산균은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타넘(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 중에서 선택된 1종 이상을 포함하고,
   상기 펩톤화된 단백분해물은 대두, 서리태, 서목태, 강낭콩 및 녹두 중에서 선택된 1종 이상을 함유한 콩을 펩톤화시킨 것을 특징으로 하는 피부미백 및 피부주름 개선용 조성물.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 저분자 펩타이드는 디펩타이드, 트리펩타이드 및 테트라펩타이드 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부미백 및 피부주름 개선용 조성물.
   
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 제1항 또는 제3항에 있어서, 유액 타입, 화장수 타입, 크림 타입, 로션 타입, 에멀젼 타입, 에센스 타입, 팩 타입, 젤 타입, 앰플 타입 또는 미스트(mist) 타입인 것을 특징으로 하는 피부미백 및 피부주름 개선용 조성물.
   
9. 제8항에 있어서, 크림 타입 또는 로션 타입의 조성물로서,
   소이펩타이드 발효물 100 중량부에 대하여, 글리세린 400 ~ 800 중량부, 부틸렌글리콜 700 중량부 ~ 1,200 중량부, 디프로필렌글리콜 800 중량부 ~ 1,500 중량부, 카르복실비닐폴리머 30 ~ 80 중량부, 폴리솔베이트 50 ~ 150 중량부, 경화피마자 오일 600 ~ 1,000 중량부, 글리세릴스테아레이트 80 ~ 150 중량부, 세테아릴알코올 150 ~ 300 중량부, 세틸에틸헥사노에이트 400 ~ 800 중량부, 감초추출물 5 ~ 40 중량부 및 레시틴 2 ~ 50 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부미백 및 피부주름 개선용 조성물.
   
10. 삭제
11. 제8항에 있어서, 유액 타입, 화장수 타입, 에멀젼 타입, 에센스 타입 또는 앰플 타입의 조성물로서,
    소이펩타이드 발효물 100 중량부에 대하여, 디프로필렌글리콜 1,000 ~ 1,700 중량부, 1,3-부틸렌글리콜 800 ~ 1,200 중량부, 폴리솔베이트 450 ~ 700 중량부, 디포타슘글리시리제이트 60 ~ 130 중량부, 알란토인 60 ~ 150 중량부, 판테놀 50 ~ 150 중량부 및 글리세린 400 ~ 800 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부미백 및 피부주름 개선용 조성물.
    
12. 삭제
13. 카르복시비닐폴리머, 정제수, 글리세린, 부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜 및 레시틴을 혼합하여 제1혼합물을 제조하는 단계;
    폴리솔베이트, 경화 피마자오일, 글리세릴스테아레이트, 세테아릴알코올, 세틸에틸헥사노에이트를 혼합하여 제2혼합물을 제조하는 단계;
    상기 제1혼합물 및 제2 혼합물 각각을 70℃ ~ 90℃까지 가온시킨 후, 가온된 제1혼합물 및 제2 혼합물을 혼합 및 교반하여 제3혼합물을 제조하는 단계; 및
    상기 제3혼합물을 교반시키면서 35℃ ~ 50℃까지 온도를 낮춘 후, 소이펩타이드 발효물이 1,000 ppm ~ 10,000 ppm이 되도록, 상기 소이펠타이드 발효물, 감초추출물 및 첨가제를 상기 제3혼합물과 혼합하는 단계;를 포함하며,
    상기 소이펩타이드 발효물은 대두, 서리태, 서목태, 강낭콩 및 녹두 중에서 선택된 1종 이상을 함유한 콩을 펩톤화시킨 단백분해물을 포함하는 배지를 제조하는 제1단계; 상기 배지에 1×10⁴ ~ 1×10⁷ cfu/㎖의 유산균을 접종하는 제2단계; 제2단계의 접종된 유산균을 배양하여 펩톤화된 단백분해물을 25℃ ~ 35℃ 하에서 12 시간 ~ 72 시간 동안 발효시켜서 저분자 펩타이드 배양물을 제조하는 제3단계; 및 상기 저분자 펩타이드 배양물로부터 균체 및 불용성 성분을 제거하여 저분자 펩타이드 발효물을 얻는 제4단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조한 것이고,
    상기 제4단계의 저분자 펩타이드 발효물은 중량평균분자량 200 ~ 500의 저분자 펩타이드를 100 중량%(기타 불가피한 불순물 포함)로 포함하며,
    상기 유산균은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타넘(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부미백 및 피부주름 개선제의 제조방법.
    
14. 삭제
15. 제13항에 있어서,
    상기 저분자 펩타이드발효물을 건조시키는 제5단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 피부미백 및 피부주름 개선제의 제조방법.
    
16. 제13항에 있어서, 제1단계의 상기 배지는
    글루코오스, 수크로오스, 말토오스, 프럭토오스, 락토오스, 자일로오스, 갈락토오스 및 아라비노오스 중에서 선택된 1종 이상을 함유한 탄소원; 및
    마그네슘 설페이트, 망가닉 설페이트, 징크 설페이트, 쿠퍼 설페이트, 소듐 아세테이트, 포타슘포스페이트 및 칼슘 클로라이드 중에서 선택된 1종 이상의 무기원소 화합물;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부미백 및 피부주름 개선제의 제조방법.
    
17. 삭제
18. 삭제
19. 제8항의 상기 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부외용제.
    
20. 제19항에 있어서, 상기 피부외용제는 화장품, 연고 또는 앰플인 것을 특징으로 하는 피부외용제.
    
    

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