JP2001238640A

JP2001238640A - 葉酸及び／又はビタミンｂ１２−ラクトフェリン類複合物

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Publication number: JP2001238640A
Application number: JP2000051807A
Authority: JP
Inventors: Toshiaki Uchida; 俊昭内田; Toshiaki Suguri; 俊朗須栗; Harjinder Singh; シンハージンダー
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 2000-02-28
Filing date: 2000-02-28
Publication date: 2001-09-04
Anticipated expiration: 2020-02-28
Also published as: NZ509954A; JP4339979B2; GB2361703B; US6500472B2; US20010036500A1; GB0104472D0; GB2361703A

Abstract

(57)【要約】【課題】飲食品及び医薬品の素材として有用な、
葉酸及び／又はビタミンＢ₁₂−ラクトフェリン類複合物
の提供。【解決手段】葉酸及び／又はビタミンＢ₁₂とラクトフ
ェリン類とを混合することにより、葉酸及び／又はビタ
ミンＢ₁₂−ラクトフェリン類複合物を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、葉酸及び／又はビ
タミンＢ₁₂をラクトフェリン類に保持させた複合物とそ
の製造方法、及びその利用に関する。本発明の葉酸及び
／又はビタミンＢ ₁₂−ラクトフェリン類複合物は、葉酸
が単独で存在しているときよりも光安定性、耐酸性及び
溶解性が向上するという特徴を有し、また、ビタミンＢ
₁₂が単独で存在しているときよりも耐酸性が向上すると
いう特徴を有するので、飲食品や医薬品の素材として有
用である。

【０００２】

【従来の技術】葉酸は、古く抗貧血性因子として発見さ
れた生体必須ビタミンの一つである。また、葉酸を補酵
素とする酵素としてこれまでに様々なものが知られてお
り、ヌクレオチド、グリシン、ヒスチジン等の代謝、タ
ンパク質の生合成等に葉酸は広く関わっている。葉酸
は、広義には pteroylglutamate や 7,8-dihydropteroy
lglutamate等とそれらのポリグルタミン体として知られ
ており、これらは全て葉酸としての生理活性を有してい
る。そして、葉酸が欠乏すると、造血機能異常（巨赤芽
球性貧血）、神経障害、腸機能不全等を起こすことが知
られている。近年、特に欧米で注目されていることとし
て、母体の妊娠時の栄養欠乏により、神経管異常の新生
児が生まれる確率が増えるが、葉酸の投与によりこれを
予防できることが判ってきた(Czeizel,A.E., J. Pedia
t. Gastroenterol. Nutr., vol.20, pp.4-16, 1995)。
また、心臓病と関わりのあるホモシステインの増加は、
血清中の葉酸が欠乏するのと同時に起こることが報告さ
れており(Jacob.R.A., M.M.Wu, S.M.Henning & M.E.Swe
ndseid, J. Nutr., vol.124, p.1072, 1994)、さらに、
葉酸がガン、特に上皮性のガンに対して防御作用を示す
とする報告もなされており(Glynn.S.A., D.Albanes, Nu
tr. Cancer, vol.22, p.101, 1994)、葉酸の重要性が再
認識されつつある。

【０００３】一方、葉酸は、酸素が存在しない場合には
熱に比較的安定であることが判っている。しかしなが
ら、酸素が存在する場合には熱安定性や保存安定性が低
く、牛乳では加熱殺菌や保存中に約60％が失われたとい
う報告(Renner E., Japanese Journal of Dairy & Food
Science, vol.35, p.A121-A135, 1996)、あるいは粉乳
中で25％の損失が認められたという報告(Oamen E.E., H
ansen,A.P.M. & Swartzel, K.R., J. Dairy Sci., vol.
72, pp.614-619,1989)等がなされている。また、葉酸は
光に対しても非常に敏感で、遮光下での取り扱いが必要
であり、光の存在により速やかに分解されることも知ら
れている(Henderson B.G., Annu. Rev. Nutr., vol.10,
pp.319-335, 1990)。

【０００４】従来より、牛乳中には葉酸結合タンパク質
の存在が明らかになっている(Ford.J.E., D.N.Salter &
K.J.Scott, J. Dairy Res., vol.36, p.435, 1969) 。
この葉酸結合タンパク質の分子量は 25kDa前後であり、
葉酸を１分子結合し、腸管からの吸収を促進することが
示唆されている(Said H.M., F.K.Ghishan & R.Redha,A
m. J. Physiol, vol.252, p.G229, 1987) 。しかしなが
ら、牛乳中における葉酸結合タンパク質の含有量は10mg
/lと少ない(Parodi P.W., Diet & health newsfor New
Zeal and health professionals, vol.27, pp.1-4, 199
8) 。また、この葉酸結合タンパク質の光安定性につい
ては報告がなされていない。以上のように、葉酸には重
要な生理機能があるため、近年注目されつつあり、葉酸
を飲食品や医薬品の素材として利用することが望まれて
いるが、光安定性が低いこと、溶解性が低いこと、場合
によっては沈澱を起こすこと等から、特に飲料への応用
は難しく、包装形態においても遮光する必要があること
等、制限が多くあった。また、葉酸結合タンパク質につ
いては、牛乳中の含量も少なく、未だ工業化の目途は立
っていない現状にある。

【０００５】一方、ビタミンＢ₁₂は、赤血球の形成に必
要なヘムの合成に関わることから、欠乏すると巨赤芽球
が出現し、貧血となることが知られている。また、ビタ
ミンＢ₁₂は、細胞の新生や増殖に必須であることから、
これが不足すると粘膜組織の炎症や下痢等が発生する。
さらに、ビタミンＢ₁₂は、生殖機能や神経系において重
要な働きをすることも知られている（福井透、「ビタミ
ン・ミネラルの摂り方」、丸善、1997）。ビタミンＢ₁₂
欠乏症の原因としては、主に菜食主義、又は胃切除や腸
管からの吸収異常によることが多い。ビタミンＢ₁₂の吸
収には２つの外分泌性タンパク質が関与しているといわ
れ、唾液腺から分泌されるHaptocorrin(Toyoshima S.,
H. Saido, F. Watanabe, K. miyatake and Y. Nakano,
Abstracts of XV International Congress of Nutritio
n, 204, 1993) 及び胃から分泌されるintrinsic factor
(Levine J. S., P. K. Nakane and R. H. Allen, Gast
roenterology 79, 493, 1980) がそれぞれ知られている
が、その吸収メカニズムは複雑である。日本におけるビ
タミンＢ₁₂の成人１日当たりの栄養所要量は2.4 μg と
少ないが、食品からビタミンＢ₁₂を摂取する場合には、
調理による損失等に気をつける必要がある。また、アメ
リカのＯＤＡ(Optimal Dairy Allowance) におけるビタ
ミンＢ₁₂の１日当たりの摂取量は、10〜300 μg と設定
されており、ビタミンＢ₁₂のより積極的な摂取が重要に
なる可能性が大きい。

【０００６】牛乳中にはビタミンＢ₁₂と結合するタンパ
ク質が存在することが示唆されている（Peter W. P., A
ustralian J. Dairy Tech., 53,37-47, 1998) が、牛乳
中のビタミンＢ₁₂と結合するタンパク質については、そ
の全容は未だ解明されていない。この中で唯一、ビタミ
ンＢ₁₂結合ウシ血清アルブミン(BSA) が知られており
（米国特許第4082738 号）、赤血球の定量に利用されて
いる（特表昭57−5005281 号公報）。なお、ビタミンＢ
₁₂は、熱に比較的安定であることが知られているが、酸
に対しては弱いことが判っている（Owen R. Fennema, F
ood Chemistry 3nd ed., Dekker, New York)。従って、
有用な生理機能を有するビタミンＢ₁₂の安定性、特に酸
に対する安定性をより高める方法が望まれている。この
ように、葉酸及びビタミンＢ₁₂は、ともに貧血改善等に
有効な物質であるが、物質の安定性という点で問題があ
り、これまでは、限られた領域でのみ利用されていた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明では、新たに、
ラクトフェリン類が葉酸やビタミンＢ₁₂と相互に作用し
て、葉酸及び／又はビタミンＢ₁₂−ラクトフェリン類複
合物を形成することを見出した。そして、単独の葉酸と
比較して、光に対する安定性が高まり、溶解性が飛躍的
に高まり、酸性においても安定であることを見出し、ま
た、単独のビタミンＢ₁₂と比較して、酸性において安定
であることを見出して、本発明を完成するに至った。し
たがって、本発明は、ラクトフェリン類に葉酸及び／又
はビタミンＢ₁₂を保持させた葉酸及び／又はビタミンＢ
₁₂‐ラクトフェリン類複合物及びその製造方法を提供す
ることを課題とする。また、本発明は、葉酸及び／又は
ビタミンＢ₁₂−ラクトフェリン類複合物を使用して調製
した医薬品又は飲食品を提供することを課題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明で使用するラクト
フェリン類は、乳や血液等に由来するものが使用でき、
特に原料は限定されず、ヒト、ウシ、ブタ等に由来する
ものを使用できる。また、遺伝子組み替えによって得ら
れたラクトフェリン類でも構わない。これらのラクトフ
ェリン類は、精製されたもの、部分精製されたもの、Ｗ
ＰＣや脱脂粉乳のような純度の低い状態の素材等も使用
できる。これらのラクトフェリン類については、加熱殺
菌等による熱処理の有無や、鉄の結合状態に関わりな
く、いずれも使用が可能である。さらに、鉄を２分子以
上保持したラクトフェリン類（特開平6-239900号公報及
び特開平7-304798号公報）も使用可能である。また、ラ
クトフェリン類をペプシンやトリプシン等の酵素、又は
酸やアルカリにより加水分解して得られるペプチドを使
用することも可能である。なお、本発明においては、ラ
クトフェリン類にトランスフェリンやオボトランスフェ
リンをも含んでおり、本発明において使用するラクトフ
ェリン類とは、以上のようなラクトフェリン関連物質を
含んだものを意味する。以下では、まず葉酸−ラクトフ
ェリン類複合物について述べる。

【０００９】本発明で使用する葉酸は、医薬品レベルの
ものから食品添加物として使用されるものまで、特に限
定されない。葉酸−ラクトフェリン類複合物は、葉酸水
溶液とラクトフェリン類水溶液とを混合するか、又は葉
酸とラクトフェリン類とを混合した粉末を溶解すること
で調製できる。また、アルカリ条件下で、ラクトフェリ
ン類により大量の葉酸を保持させることができるので、
水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素アン
モニウム、炭酸ナトリウム等を混合した水溶液を用いる
ことがより有効である。なお、葉酸保持量は、ラクトフ
ェリン類１分子当たり最大200 分子程度である。

【００１０】

【試験例１】ラクトフェリン類を50mM炭酸水素ナトリウ
ム水溶液(pH 8.5)に溶解して調製したラクトフェリン類
溶液１μmol/20mlに、葉酸を10〜300 μmol /20ml とな
るように添加した後、限外濾過（ＵＦ）膜（分画分子量
5kDa、ミリポア社製）処理により、パーミエートとリテ
ンテートとに分離した。さらに、リテンテートの残りに
50mM炭酸水素ナトリウム水溶液(pH 8.5)を添加してパー
ミエートを回収し、これを４回繰り返して16万倍に希釈
し、全ての遊離の葉酸をパーミエート中に回収した。回
収したパーミエート中に含まれる遊離の葉酸を 362nmに
おける吸光度測定の値から、リテンテートに残存した結
合型の葉酸の量を算出した。その結果を表１に示す。な
お、葉酸の吸光度測定においては、パーミエートにタン
パク質が溶出していないことと、タンパク質由来の阻害
物質が存在していないことを確認した。また、タンパク
質を含まない葉酸水溶液を同時にＵＦ膜処理し、対照と
して用いた。これらの操作及び測定は、遮光下で行い、
葉酸の光劣化を抑制し、また、測定期間中に葉酸の劣化
がないことを、吸光度測定から確認した。

【００１１】

【表１】 ──────────────────────────────────── 葉酸添加量（μmol ）ラクトフェリン１μmol 当たりの葉酸の保持量（μmol ） ──────────────────────────────────── 10 9.3 50 40 100 79 200 160 300 210 ────────────────────────────────────

【００１２】葉酸−ラクトフェリン複合物は、ＵＦ膜処
理やゲル濾過、透析等により、低分子画分を除去して濃
縮液とすることができる。また、常法に従って乾燥する
ことで容易に粉末とすることができる。なお、得られた
粉末の溶解性は非常に良好であった。

【００１３】

【試験例２】葉酸−ラクトフェリン複合物の光照射試験
を行った。すなわち、ラクトフェリン類を50mM炭酸水素
ナトリウム水溶液(pＨ8.5) 50ml に溶解して調製した１
μmol の溶液に、100 μmol となるように葉酸を添加し
た後、透析膜（分画分子量10kDa)で５mMリン酸緩衝液(p
Ｈ6.5)に対して透析を行い、凍結乾燥して、葉酸−ラク
トフェリン複合物を得た。そして、この葉酸−ラクトフ
ェリン複合物の粉末を３mg/100mlになるように50mMリン
酸緩衝液(pＨ6.5)に溶解した。一方、葉酸（シグマ社
製）を0.8 mg/100mlとなるように50mMリン酸緩衝液（pH
6.5 ）に溶解した。各試料溶液５mlをポリスチレン製の
透明容器に入れ、水層の厚さが５mmとなるようにし、30
mmの上部から40ワットの蛍光灯を照射した。そして、微
生物を用いた方法により葉酸量を測定した。すなわち、
葉酸−ラクトフェリン複合物の試料については、 pＨを
2.0 とし、試料１ml当たり２mgのペプシン（シグマ社
製) を添加して、37℃で 120分間の反応でタンパク質を
分解した後、さらに pＨを 7.5とし、試料１ml当たり２
mgのトリプシン（シグマ社製) を添加して、37℃で 120
分間の反応でタンパク質を分解し、脱気後、５分間加熱
し、15,000G により遠心分離して上清を回収し、微生物
を用いた方法により葉酸量を測定した(Davis,R.E., D.
J.Nicol & A.Kelly, J. Clin. path., vol.23, pp.47-5
3, 1970) 。また、葉酸（シグマ社製）を用いて検量線
を作成した。これらの操作及び測定は、蛍光灯照射時以
外遮光下で行った。その結果を表２に示す。

【００１４】

【表２】 ────────────────────────────── 葉酸量 (μmol/10ml) 照射時間（分） ───────────────────── 葉酸−ラクトフェリン複合物葉酸 ────────────────────────────── 0 0.17 0.16 0.5 0.16 0.13 7 0.14 0.03 24 0.11 − ──────────────────────────────

【００１５】同モル数の葉酸のみを溶解した水溶液と葉
酸−ラクトフェリン複合物を溶解した水溶液とを比較す
ると、葉酸−ラクトフェリン複合物では光による劣化が
著しく遅くなることが明らかである。

【００１６】

【試験例３】葉酸及び試験例２で用いた葉酸−ラクトフ
ェリン複合物を、それぞれ葉酸のモル換算で 0.1〜10μ
mol/10mlとなるように脱イオン水に添加し、濁度を測定
した。濁度は660nm で測定した。その結果を表３に示
す。

【００１７】

【表３】 ──────────────────────────────────── 葉酸のモル換算葉酸−ラクトフェリン複合物葉酸 ( μmol/10ml) ──────────────────────────────────── 0.1 0.002 （透明黄色） 0.01（やや濁り） 1.0 0.002 （透明黄色） 0.025(不溶) 10 0.003 （透明黄色） 0.034(不溶） ────────────────────────────────────

【００１８】脱イオン水への溶解性は葉酸が 0.1μmol
/10ml 以下であるのに対して、葉酸−ラクトフェリン複
合物では10μmol/10ml以上であった。以上のことから、
葉酸−ラクトフェリン複合物においては、葉酸の光安定
性が著しく向上しており、また、溶解性も優れたものに
なっていることが明らかになった。

【００１９】

【試験例４】葉酸及び試験例２で用いた葉酸−ラクトフ
ェリン複合物を、それぞれ葉酸のモル換算で0.25μmol/
10mlとなるように10mMクエン酸緩衝液(pＨ2.5)に溶解し
た。次に、50mlずつ褐色ビンに詰め、90℃で30分間加熱
殺菌した後、37℃で保存した。そして、試験例２と同様
の方法で葉酸量を測定した。

【００２０】

【表４】 ────────────────────────────────── 葉酸量（μmol/10ml） ───────────────────────── 葉酸−ラクトフェリン複合物葉酸 ────────────────────────────────── 加熱殺菌前 0.28 0.25 加熱殺菌直後 0.26 0.18 ２ケ月保存 0.22 0.05 ４ケ月保存 0.20 0.01 ──────────────────────────────────

【００２１】以上の結果から、葉酸−ラクトフェリン複
合物においては、葉酸の酸性下での安定性が向上してい
ることが明らかになった。次に、ビタミンＢ₁₂−ラクト
フェリン類複合物について述べる。ビタミンＢ₁₂は、医
薬品レベルのものから食品添加物として使用されるもの
まで、特に限定されない。ビタミンＢ₁₂−ラクトフェリ
ン類複合物は、ビタミンＢ₁₂水溶液とラクトフェリン類
水溶液とを混合するか、又はビタミンＢ₁₂とラクトフェ
リン類とを混合した粉末を溶解することで調製できる。
なお、ビタミンＢ₁₂保持量は、ラクトフェリン類１分子
当たり最大100 分子程度である。

【００２２】

【試験例５】ラクトフェリン類を50mMイミダゾール緩衝
液(pH6.5) に溶解して調製したラクトフェリン類溶液0.
1 μmol/20mlにビタミンＢ₁₂を１〜50μmol/20mlとなる
ように添加した後、ＵＦ膜（分画分子量5kDa、ミリポア
社製）処理により、パーミエートとリテンテートとに分
離した。さらに、リテンテートの残りに50mMイミダゾー
ル緩衝液(pH6.5) を添加して、パーミエートを回収し、
これを４回繰り返して、16万倍に希釈し、全ての遊離の
ビタミンＢ₁₂をパーミエート中に回収した。また、リテ
ンテート中のビタミンＢ₁₂−ラクトフェリン複合物の試
料については、pHを2.0 とし、試科1ml 当たり2mg のペ
ブシン（シグマ社製）を添加して、37℃で60分間の反応
でタンパク質を分解し、さらにpHを7.5 とし、試料1ml
当たり2mg のトリプシン（シグマ社製）を添加して、37
℃で120 分間の反応でタンパク質を分解し、加熱後、1
5,000G より遠心分離して上清を回収し、微生物を用い
た方法によりビタミンＢ₁₂量を測定した（ビタミンの事
典、日本ビタミン学会編、朝倉書店、p.501、1996）。
また、シアノコバラミン（シグマ社製）を用いて検量線
を作成した。その結果を表５に示す。

【００２３】

【表５】 ──────────────────────────────────── ビタミンＢ₁₂添加量（μmol ）ラクトフェリン1μmol 当たりのビタミンＢ₁₂保持量（μmol ） ──────────────────────────────────── 10 4.2 100 41 500 130 ────────────────────────────────────

【００２４】ビタミンＢ₁₂−ラクトフェリン複合物は、
ＵＦ膜処理やゲル濾過、透析等により、低分子画分を除
去して濃縮液とすることができる。また、常法に従って
乾燥することで容易に粉末とすることができる。なお、
得られた粉末の溶解性は非常に良好であった。

【００２５】

【試験例６】ラクトフェリン類を50mMイミダゾール緩衝
液(pH6.5)50ml に溶解して調製した0.1 μmol のラクト
フェリン類溶液に20μmol となるようにビタミンＢ₁₂を
添加した後、透析膜（分画分子量5kDa）で脱イオン水に
対して透析を行い、凍結乾燥して、ラクトフェリン類１
分子当たり57分子のビタミンＢ₁₂を保持したビタミンＢ
₁₂−ラクトフェリン複合物を調製した。そして、14μg/
100ml となるようにビタミンＢ₁₂−ラクトフェリン複合
物をそれぞれ50mMイミダゾール緩衝液(pH 6.5)又は50mM
クエン酸緩衝液(pH3.0) に溶解した。一方、対照とし
て、ビタミンＢ₁₂（シグマ社製）を用い、5.6 μg/100m
l となるようにビタミンＢ₁₂を、それぞれ50mMイミダゾ
ール緩衝液(pH6.5) 又は50mMクエン酸緩衝液(pH3.0) に
溶解した。各試料溶液5ml を耐熱性ガラス瓶に密封し、
90℃で30分間加熱殺菌した後、35℃で２ケ月保存して、
ビタミンＢ₁₂の減少量を測定した。なお、ビタミンＢ₁₂
量は、試験例５の方法により測定した。

【００２６】

【表６】 ───────────────────────────────── ビタミンＢ₁₂減少率（％） ─────────────── pH7.5 pH3.0 ───────────────────────────────── ビタミンＢ₁₂−ラクトフェリン複合物 12 ％ 16％ビタミンＢ₁₂ 8 ％ 48％ ─────────────────────────────────

【００２７】以上のことから、ビタミンＢ₁₂−ラクトフ
ェリン複合物においてはビタミンＢ ₁₂の耐酸性が著しく
向上していることが明らかになった。

【００２８】

【発明の実施の形態】本発明では、葉酸及び／又はビタ
ミンＢ₁₂とラクトフェリン類とを混合して、ラクトフェ
リン類が葉酸及び／又はビタミンＢ₁₂を保持した葉酸及
び／又はビタミンＢ₁₂−ラクトフェリン複合物を製造す
る。この葉酸及び／又はビタミンＢ₁₂−ラクトフェリン
複合物は、医薬品や飲食品、あるいは動物飼料等におけ
る栄養強化の目的で使用することができる。また、光安
定性が高いことから、溶液、粉末、ペースト、錠剤等、
特に制限せずに使用することができる。次に実施例を示
し、本発明をさらに詳しく説明する。

【００２９】

【実施例１】葉酸（日本ロシュ社製）6mmol 及びラクト
フェリン(TATUA社製) 1.2mmol を混合し、 100 lの脱イ
オン水に溶解した。一晩10℃で反応させた後、ＵＦ膜
（分画分子量 50kDa）処理により濃縮した。得られた 2
lの溶液を凍結乾燥して、葉酸−ラクトフェリン類複合
物の粉末 81gを得た。この粉末について、試験例２の方
法で葉酸量を測定したところ、ラクトフェリン１分子当
たり葉酸２分子が保持されていることが判った。

【００３０】

【実施例２】葉酸（日本ロシュ社製）870mmol を２％炭
酸水素ナトリウム水溶液 100 lに溶解し、さらにラクト
フェリン(TATUA社製) 2mmol を混合した後、ＵＦ膜（分
画分子量50kDa ）処理により濃縮、脱塩した。得られた
2 lの溶液を試験用噴霧乾燥機で噴霧乾燥して、葉酸−
ラクトフェリン類複合物の粉末240gを得た。この粉末に
ついて、試験例２の方法で葉酸量を測定したところ、ラ
クトフェリン１分子当たり葉酸 210分子が保持されてい
ることが判った。

【００３１】

【実施例３】葉酸（日本ロシュ社製）110mmol を、1N水
酸化ナトリウム水溶液でpH９に調整しながら、水道水80
l中へ溶解し、さらにラクトフェリン(TATUA社製) 0.6m
mol混合した。１時間放置後、ＵＦ膜（分画分子量 50kD
a）処理により濃縮、脱塩した。得られた 2 lの溶液を
−40℃にて凍結し、葉酸−ラクトフェリン類複合物の凍
結濃縮液として保存した。この凍結濃縮液について、試
験例２の方法で葉酸量を測定したところ、ラクトフェリ
ン１分子当たり葉酸 82 分子が保持されていることが判
った。また、常温において凍結濃縮液を融解したとこ
ろ、沈澱等は観察されなかった。

【００３２】

【実施例４】重炭酸ナトリウム1.2 mol とラクトフェリ
ン（ＤＭＶ社製）10μmoｌ及び葉酸0.5 mmolを含む溶液
１l(Ａ液）、及び硫酸第二鉄を鉄イオンとして1.5 mmol
含む溶液1 l(Ｂ溶液）を調製した。Ａ溶液にＢ溶液を加
えて、鉄と葉酸を保持したラクトフェリン複合物を調製
し、ＵＦ膜（分画分子量5kDa）処理により、濃縮、脱塩
した。この複合物について、試験例２の方法で葉酸量を
測定したところ、ラクトフェリン１分子当たり葉酸27分
子が保持されており、また、鉄量を原子吸光分析により
測定したところ、ラクトフェリン１分子当たり鉄148 分
子が保持されていることが判った。

【００３３】

【実施例５】ビタミンＢ₁₂（日本ロッシュ社製）300gを
脱イオン水300 l に溶解し、さらにラクトフェリン(TAT
UA社製) 100gを混合して、20℃で８時間反応させた後、
遊離のビタミンＢ₁₂を除去するため、ＵＦ膜（分画分子
量50kDa ）処理により分画し、さらに濃縮した。得られ
た1 l の溶液を試験用噴霧乾燥機で噴霧乾燥し、ビタミ
ンＢ₁₂−ラクトフェリン類複合物の粉末を220g得た。こ
の粉末について、試験例５の方法でビタミンＢ₁₂量を測
定したところ、ラクトフェリン１分子当たりビタミンＢ
₁₂83分子が保持されていることが判った。また、この粉
末の溶解性は良好であった。

【００３４】

【実施例６】炭酸カルシウム0.05molと重炭酸アンモニ
ウム1.2molを含む溶液1 l を塩酸でpH7.8 に調製し、
（Ａ溶液）硫酸第二鉄を鉄イオンとして1.5mol含む溶液
O.2 l(B1溶液）及びトランスフェリン（アポ型、高純
度、牛血漿由来、和光純薬工業社製）10μmol とビタミ
ンＢ₁₂１mmolを含む溶液0.8 l(B2溶液）を調製した。B1
とB2溶液を混合後、Ａ溶液に加え、鉄とビタミンＢ₁₂を
保持したトランスフェリン複合物を調製し、ＵＦ膜（分
画分子量5kDa）処理により濃縮、脱塩し、複合物の濃縮
液100ml を調製した。この複合物について、試験例５の
方法でビタミンＢ₁₂量を測定したところ、トランスフェ
リン１分子当たりビタミンＢ₁₂32分子が保持されてお
り、また、鉄量を原子吸光分析により測定したところ、
ラクトフェリン１分子当たり鉄139 分子が保持されてい
ることが判った。

【００３５】

【実施例７】葉酸50mmolを２％炭酸水素ナトリウム水溶
液10 lに溶解した。一方、ラクトフェリン（ＤＭＶ社
製）0.38mmol及びビタミンＢ₁₂（日本ロシュ社製）20mm
olを脱イオン水30 lに溶解した。そして、これらの溶液
を混合し、室温下で２時間撹拌した後、ＵＦ膜（分画分
子量5kDa）処理により濃縮、脱塩して葉酸及びビタミン
Ｂ₁₂−ラクトフェリン類複合物を調製し、凍結乾燥して
粉末とした。この粉末について、試験例２及び試験例５
の方法で葉酸量及びビタミンＢ₁₂量を測定したところ、
ラクトフェリン類１分子当たり葉酸79分子及びビタミン
Ｂ₁₂24分子が保持されていることが判った。

【００３６】

【実施例８】重炭酸ナトリウム1.0mol及び葉酸（日本ロ
シュ社製）2mmolを含む溶液1l（Ａ溶液）、塩化第二鉄
を鉄イオンとして1mmol を含む溶液0.2 l(B1溶液）及び
ウシラクトフェリン（ＵＬＮ杜製）10μmol とビタミン
Ｂ₁₂（日本ロシュ社製）400μmol を含む溶液0.8 l(B2
溶液）を調製した。B1溶液とB2溶液を混合後、Ａ溶液に
加え、溶液のpHを8.5 に維持するために、適宜、重炭酸
ナトリウムを添加し、葉酸及びビタミンＢ₁₂−ラクトフ
ェリン類複合物を調製し、ＵＦ膜（分画分子量5kDa）処
理により濃縮、脱塩し、凍結乾燥して粉末とした。この
粉末について、試験例２及び試験例５の方法並びに原子
吸光分析で葉酸量、ビタミンＢ₁₂量及び鉄量を測定した
ところ、ラクトフェリン類１分子当たり葉酸90分子、ビ
タミンＢ ₁₂４分子、及び鉄96分子が保持されていること
が判った。

【００３７】

【実施例９】ラクトフェリン20ｇを脱イオン水100gに溶
解し、塩酸でpHを2.0 とした。これに、ペプシン（シグ
マ社製）100mg を添加し、37℃で２時間反応させ、ラク
トフェリン加水分解物を調製した。反応後、pHを7.0 と
し、凍結乾燥した。葉酸20mmolを10％炭酸ナトリウム水
溶液100 l に溶解した。一方、先に調製したラクトフェ
リン加水分解物10g 及びビタミンＢ₁₂（日本ロシュ社
製）15mmolを脱イオン水30 lに溶解した。そして、これ
らの溶液を混合し、室温下で２時間撹拌した後、ＵＦ膜
（分画分子量5kDa）処理により濃縮、脱塩して、葉酸及
びビタミンＢ₁₂−ラクトフェリン類複合物を調製し、凍
結乾燥して葉酸及びビタミンＢ₁₂−ラクトフェリン類複
合物の粉末23ｇを得た。この粉末について、試験例２及
び試験例５の方法で葉酸量及びビタミンＢ₁₂量を測定し
たところ、ラクトフェリン１分子当たり、葉酸130 分子
及びビタミンＢ₁₂53分子が保持されていることが判っ
た。

【００３８】

【実施例10】実施例２で製造した葉酸−ラクトフェリン
類複合物を用いて、ドリンク剤を製造した。すなわち、
イオン交換水10kgに、葉酸−ラクトフェリン類複合物48
g を溶解し、さらにイオン交換水 2,200kgに加えて撹拌
した後、さらにトレハロース（林原社製）300kg とステ
ビア（丸善製薬社製）1.2kg を加えて撹拌し、溶解し
た。次に、クエン酸（和光純薬工業社製）15kgを加えて
撹拌した後、フレーバー６kgを加え、さらに、全量が
3,000kgとなるように脱イオン水を加えて調整した。こ
れをプレート式加熱殺菌機で加熱殺菌（85℃、15秒）し
た後、透明瓶に充填し、さらに85℃の熱水中に15分間保
持した後、冷却してドリンク剤を製造した。このドリン
ク剤は、冷蔵下、蛍光灯で約１ヶ月間照射テストを行っ
た後においても、色調は変化せず、沈澱等も発生してい
なかった。一方、対照として、複合物の代わりに葉酸
（日本ロシュ社製）2.0gを添加し、同様にしてドリンク
剤を製造した。このドリンク剤は、製造直後でやや濁り
が認められ、さらに、冷蔵下、蛍光灯で約１ヶ月間照射
テストを行った結果、黄色い変色が認められ、沈澱も認
められた。なお、分析の結果、葉酸−ラクトフェリン類
複合物を用いたドリンク剤では葉酸量の減少率が８％で
あったのに対して、葉酸を用いたドリンク剤では葉酸量
の減少率は64％であった。

【００３９】

【実施例11】実施例２で製造した葉酸−ラクトフェリン
類複合物160mg 、マルチトール64.3kg、パラチニット2
5.5kg、アスパルテーム 0.2kg、クエン酸 3.0kg、乳化
剤 3.0kg、フレーバー 4.0kgを混合し、常法に従ってチ
ュアブルタブレットを製造した。得られたチュアブルタ
ブレットについては、風味等、特に問題はなかった。ま
た、透明プラスチック容器内で、50℃、蛍光灯照射条件
において、４週間保存した後、葉酸量を測定したとこ
ろ、製造直後と殆ど変化はなかった。

【００４０】

【実施例12】実施例５で調製したビタミンＢ₁₂−ラクト
フェリン類複合物を用いて、ドリンク剤を製造した。す
なわち、イオン交換水10kgにビタミンＢ₁₂−ラクトフェ
リン類複合物900mg を溶解し、さらにイオン交換水2,20
0kg を加えて撹拌した後、さらにトレハロース（林原社
製）300kg とステビア（丸善製薬社製）1.2kg を加えて
撹拌し、溶解した。次に、クエン酸（和光純薬工業社
製）15kgを加えて撹拌した後、フレーバー6kg を加え、
さらに、全量が3,000kg となるように脱イオン水を加え
て調整した。これをプレート式加熱殺菌機で加熱殺菌
（85℃、15秒）した後、透明瓶に充填し、さらに85℃の
熱水中に15分間保持した後、冷却してドリンク剤を製造
した。一方、対照として、複合物の代わりにビタミンＢ
₁₂（日本ロシュ社製）630mg を添加し、同様にしてドリ
ンク剤を製造した。そして、これらのドリンク剤を37℃
で４ヶ月間保存した後、ビタミンＢ₁₂量を測定したとこ
ろ、ビタミンＢ₁₂−ラクトフェリン類複合物を用いたド
リンク剤ではビタミンＢ₁₂量の減少率が11％であったの
に対して、ビタミンＢ₁₂を用いたドリンク剤ではビタミ
ンＢ₁₂量の減少率は58％であった。

【００４１】

【実施例13】水10kgに実施例７で調製した葉酸及びビタ
ミンＢ₁₂−ラクトフェリン類複合物1.8kg を溶解し、さ
らに水200kg を添加後、安定剤（太陽化学社製）5.8kg
を添加した。さらに水780kg を添加後、砂糖140kg 、梅
果肉100kg 、クエン酸1.6kg、クエン酸３ナトリウム0.4
kg 、香科（長谷川香料社製）0.18kgを添加し、溶解
後、レトルト容器に充填した。これを120 ℃、12分間加
熱し、レトルト殺菌してゼリーを製造した。一方、対照
として、複合物の代わりに葉酸410 μg/l 及びビタミン
Ｂ₁₂320 μg/l を添加し、同様にしてゼリーを製造し
た。そして、これらのゼリーを20℃で３ヶ月間保存した
後、葉酸量及びビタミンＢ₁₂量を測定したところ、葉酸
及びビタミンＢ₁₂−ラクトフェリン類複合物を用いたゼ
リーでは葉酸量の減少率が６％及びビタミンＢ₁₂量の減
少率が７％であったのに対して、葉酸及びビタミンＢ₁₂
を用いたゼリーでは、葉酸量の減少率が28％、ビタミン
Ｂ₁₂量の減少率は35％であった。

【００４２】

【実施例14】水10kgに実施例８で調製した葉酸及びビタ
ミンＢ₁₂−ラクトフェリン類複合物10g を溶解し、さら
に水200kg を添加後、安定剤（太陽化学社製）5.8kg を
添加した。さらに水780kg を添加後、砂糖140kg 、梅果
肉100kg 、クエン酸1.6kg 、クエン酸３ナトリウム0.4k
g 、香料（長谷川香料社製）0.18kgを添加し、溶解後、
レトルト容器に充填した。これを120 ℃、12分間加熱
し、レトルト殺菌してゼリ−を製造した。一方、対照と
して、複合物の代わりに葉酸310 μg/100ml 及びビタミ
ンＢ₁₂25μg/100ml を添加し、同様にしてゼリーを調製
した。そして、これらのゼリーを20℃で３ヶ月間保存し
た後、葉酸量及びビタミンＢ₁₂量を測定したところ、葉
酸及びビタミンＢ₁₂−ラクトフェリン類複合物を用いた
ゼリーでは葉酸量の減少率が５％及びビタミンＢ₁₂量の
減少率が７％であったのに対して、葉酸及びビタミンＢ
₁₂を用いたゼリーでは葉酸量の減少率が24％及びビタミ
ンＢ ₁₂量の減少率が30％であった。

【００４３】

【発明の効果】本発明の葉酸及び／又はビタミンＢ₁₂−
ラクトフェリン類複合物においては、葉酸が単独で存在
しているときよりも光安定性、耐熱性及び溶解性が向上
しているという特徴を有し、また、ビタミンＢ₁₂が単独
で存在しているときよりも耐酸性が向上するという特徴
を有するので、飲食品や医薬品の素材として有用であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 31/714 Ａ６１Ｋ 47/02 ４Ｃ０５７ 47/02 Ａ６１Ｐ 1/00 ４Ｃ０７６Ａ６１Ｐ 1/00 3/02 １０４４Ｃ０８６ 3/02 １０４ 7/06 ４Ｈ０４５ 7/06 25/00 25/00 35/00 35/00 43/00 １０７ 43/00 １０７Ｃ０７Ｄ 487/04 １４７Ｃ０７Ｄ 487/04 １４７Ｃ０７Ｈ 19/23 Ｃ０７Ｈ 19/23 Ｃ０７Ｋ 14/79 Ｃ０７Ｋ 14/79 Ａ２３Ｌ 2/00 Ｆ (72)発明者ハージンダーシンインスティチュートオブフードニュトリィションアンドヒューマンヘルス、マッセイユニバーシティ、ニュージーランド国Ｆターム(参考） 4B014 GB08 GK06 GL03 GL09 GP01 4B017 LC03 LE10 LK15 LK16 4B018 LB01 LB08 MD20 MD23 ME14 MF02 4B041 LC10 LD02 LK14 LK19 4C050 AA01 BB08 CC08 EE04 FF01 GG03 GG04 HH01 4C057 BB02 DD01 NN01 4C076 AA12 BB01 CC24 EE30 EE41Q EE58T 4C086 AA01 CB09 EA14 MA03 MA52 NA03 ZA51 ZA55 ZA66 ZB22 ZB26 ZC24 4H045 AA20 BA54 CA42 CA43 EA01 EA20 GA45

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】葉酸及び／又はビタミンＢ₁₂をラクトフ
ェリン類に保持させることを特徴とする葉酸及び／又は
ビタミンＢ₁₂− ラクトフェリン類複合物。
【請求項２】葉酸及び／又はビタミンＢ₁₂とラクトフ
ェリン類とを混合することを特徴とする請求項１記載の
葉酸及び／又はビタミンＢ₁₂−ラクトフェリン類複合物
の製造方法。
【請求項３】請求項１記載の葉酸及び／又はビタミン
Ｂ₁₂−ラクトフェリン類複合物を使用し調製した飲食品
又は医薬品。