ITMI950442A1 - Frammento di dna codificante d-amminoacido ossidasi - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/0024—D-Amino acid oxidase (1.4.3.3)
Abstract
Si descrive un frammento di DNA codificante una D-amminoacido ossidasi, un metodo per ottenere questo frammento e gli usi dell'enzima da questo espresso.
Description
"FRAMMENTO DI DNA CODIFICANTE D—AMMINOACIDO OSSIDASI·
La presente invenzione riguarda il settore biotecnologico, in particolare un frammento di DNA che codifica un enzima D-amminoacido ossidasi.
Campo dell'invenzione
Da lungo tempo vi è un forte interesse nei riguardi dell'enzima D-amninoacido ossidasi (E.C. 1.4.3.3, DAAO) per le sue possibili applicazioni nel campo farmaceutico e terapeutico.
Questo enzima catalizza la conversione dei D-antninoacidi negli Cerchetoacidi corrispondenti.
Gli o(-chetoacidi sono inportanti principi attivi utili nella cura della uremia cronica (Mackenzie Walser M.D., Am. J. Cl. Nutr. 31, 1756-1760 (1978)).
La D-anninoacido ossidasi (di seguito per brevità DAAO), ottenuta dal lievito Rhodotorula gracilis, è stata usata in modo efficiente per la produzione di cheto-derivati in un sistema a reattore (Buto1, S. e al., Biotech. Bioeng., 44, 1288-1294 (1994)).
Inoltre, lo stesso enzima ha dimostrato elevata attività sulla cefalosporina C (Pilone, M.S. e al., Biotech. Appi. Biochem., 16, 252-262 (1992)) e può essere utilizzato nella produzione di acido 7-airminocefalosporanico, un intermedio chiave nella produzione industriale di cefalosporine semisintetiche. L'attività sul substrato antibiotico cefalosporina C è di molto più elevata di altre attività note della DAAO. (Pilone, ibid.).
La preparazione di acido 7-amminocefalosporanico è condotta secondo lo schema seguente:
Schema
Un'altra applicazione dell'enzima DAAO isolato da Rhodotorula gracilis è il suo uso nella terapia ossidativa ("oxidation therapy") nel trattamento dei tumori, DAAO può essere usata cerne promettente sistema enzimatico per la generazione di specie-ossigeno reattive per il trattamento in situ di timori, principalmente tumori cerebrali (Ben Yoseph,0. e al. British J. Cancer (1995)}. Questa attività ossidasica è più interessante di altre attività ossidasiche a causa del suo substrato non fisiologico (D-amninoacidi).
la genetica del lievito Rhodotorula gracilis è tuttora completamente sconosciuta e, sebbene la DAAO da questo prodotta sia
stata ansiamente caratterizzata nella sua cinetica e nei suoi aspetti funzionali (Pollegioni, L. e al., J. Biol. Chem., 268, 13580-13587 (1993)), non è ancora disponibile alcuna informazicne riguardo il gene che codifica la proteina.
L4avere a disposizione la sequenza codificante la DAAO di cui sopra permuterà di ingegnerizzare la proteina,portando a rese più elevate e caratteristiche migliorate.
Descrizione dell'invenzione
E' stato ora trovato, e costituisce oggetto della presente invenzione,un framnento di acido desossiribonucleico (DNA) che codifica l'enzima D-amminoacido ossidasi (DAAO)del lievito Rhodotorula gracllis.
Il frammento di DNA secondo la presente invenzione ha la seguente sequenza:
La presente invenzione intende conprendere anche gli analoghi funzionali di detta sequenza. Per analoghi funzionali si intendono sequenze degenerate, varianti alleliche e sequenze mutanti.
Un altro oggetto della presente invenzione è un metodo per ottenere detto framnento di DNA.
secondo la presente invenzione detto metodo comprende:
a) coltura di un ceppo di Rhodotorula qracilis in condizioni di induzione della D-amminoacido ossidasi;
b) purificazione della frazione totale di mRNA specifico per detta D~ ariminoacido ossidasi;
c) sintesi di un primo filamento di cDNA;
d) amplificazione di detto filamento di cDNA mediante la tecnica nota come Polymerase Chain Reaction (PCR), nella quale come specifici inneschi (primers) sono utilizzati i seguenti oligonucleotidi sintetici:
(I)
(II)
a dare detto franmento di DNA;
e) clonazione di detto franmento in un opportuno piasmide;
f) isolamento di detto franmento.
In una prima realizzazione dell'invenzione, il lievito Rhodotorula gracilis è il ceppo PAN, ATOC 26217.
L'induzione della DAAO viene condotta con metodi noti, descritti in Pilone, S. e al., J. Gen. Microbìol., 135, 593-600, (1989).
La frazione totale di acido ribonucleico messaggero (mRNA) è purificata secando tecniche convenzionali, vedi Maniatìs et al. , Molecular Cloning: A Laboratory manual, Cold Spring Barbor Laboratory, (1992) .
In una realizzazione preferita della presente invenzione, la sintesi del filamento di acido desossiribonucleico complementare (cDNA) viene condotta utilizzando una trascrittasi inversa da Virus della Leucemia Murina di Molcney e un oligcnucleotide sintetico
avente la seguente sequenza
Sia la trascrittasi, sia l'oligonucleotide sintetico sono
disponibili in commercio. La preparazione di cDNA è descritta in Mianiatis et al. (ibid. ) .
Il metodo secondo la presente invenzione è caratterizzato dal fatto che gli inneschi specifici usati nello stadio della PCR seno gli oligonucleotidi sintetici sopra riportati (I) e (II) . Questi oligonucleotidi sintetici, denominati rispettivamente nòti e DAAOn, sono stati trovati dalla sequenza proteica parziale della DAAO purificata da Rhodotorula gracilis (noti) e il "codon usage" derivato dal gene fenilalanina ammoniaca-liasi di Rhodosporidium toryloides (DAAOn) , quest'ultimo descritto da Gilbert, H.J. e al. , J. Bacteriol . , 161, 314-320, (1985) .
Il plasmi de in cui viene clonato il frammento di DNA ottenuto dalla PCR è un convenzionale vettore utilizzato per questo genere di metodiche, ad esempio il plasmide pCR II, della Invitrogen.
L 'isolamento e il sequenziamento del framnento di DNA della presente invenzione viene condotto secondo metodi convenzionali noti all'esperto del settore, ad esempio come descritto nel sopra citato Maniatis e al.
Il seguente esempio illustra ulteriormente l'invenzione.
ESEMPIO
Un ceppo di Rhodotorula pracilis PAN ATCC 26217, fu cresciuto in condizioni di induzione di DAAO, usando un mezzo di coltura sintetico a pH 5,6 contenente D-alanina 30 mM, come descritto in Pilone, S. e al., J. Gen. Microbiol., 135, 593-600, (1989), al fine di ottenere la massima quantità di mRNA specifico per la DAAO.
La frazione totale di mRNA fu purificata mediante cromatografia per affinità su colonna di oligo-dT cellulosa (vedi Maniatis e al., ibid.).
Questo carpione fu utilizzato per la sintesi di un primo filamento di cDNA, usando una trascrittasi inversa di virus della Leucemia Murina di Molcney e un oliganucleotide sintetico avente la seguente sequenza
come innesco.
Il singolo filamento di cDNA fu utilizzato per la specifica reazione di airplificazione PCR, utilizzando, cane inneschi specifici, gli oligonucleotidi disegnati dalla parziale sequenza della DAAO da Rhodotorula gracilis e il "codon usagè" derivato dal gene fenilalanina anmcniaca-liasi di Rhodosporidium toruloides (Gilbert et al., ibid). Per la airplificazione del framnento totale del gene codificante DAAO, furono usati i seguenti oligcnucleotidi:
Le condizioni di amplificazione furono:
Il prodotto della PCR era un frammento di DNA di 1,1 kb, che fu clancito in un plasmide commerciale per prodotti PCR (pCR II della Invitrogen).
Il frammento amplificato e clonato fu sequenziato e la sua sequenza corrisponde alla sequenza totale del gene che codifica DAAO da Rhodotorula gracilis,
(Questo frammento di DNA fu escisso dal plasmide di clonazione pCR II usando i corrispondenti siti EooRI e inserito in un plasmide commerciale pKK223-3 (Pharmacia Biotech) linearizzato per mezzo dell'enzima di restrizione EcoRI. Il plasmide ricombinante fu usato per trasformare le cellule competenti di E. coli JM105. L'espressione del prodotto proteico del gene D-amminoacido ossidasi fu ottenuto oon una induzione da IPTG (iscpropil-B-D-tiogalattcpiranoside) delle cellule trasformate di E. coli per aggiunta di IPTG 1 mM (concentrazione finale) a una coltura cellulare in condizioni di crescita esponenziale
0,8). Le cellule furano cresciute per altre 6 ore a 37eC prima della raccolta a 7000 x g. La pasta cellulare fu sonicata 4 volte per un minute e l'estratto cellulare parzialmente purificato secondo Pollegicni e Pilone (Prof. Express. Purif. 3, 165-167, (1992)). Il campione proteico fu separato mediante elettroforesi su SOS— PAGE, in condizioni di denaturazione e la banda proteica con peso molecolare di 40 kDa fu elettrotrasferita su membrana di polivinilidene di fluoruro, colorata e usata direttamente per l'analisi sequenziale. La sequenza N-t ermi naie (10 residui determinati) corrisponde alla sequenza primaria della proteina D-amninoacido ossidasi purificata da R. graci li s:
La presente invenzione conprende anche i pi asmi di contenenti il frammento del gene codificante la D AAO di Rhodotorula gracilis.
Claims (7)
- RIVBPICAgICNI 1. Franane nto di DNA acidificante D-amminoacido ossidasi da lievito Rhodotorula gracilis avente la seguente sequenza: e stoi equivalenti funzionali.
- 2. Metodo per ottenere il frammento della rivendicazione 1, che comprende: a) coltura di un ceppo di Rhodotorula qracilis in condizioni di induzione della D-amminoacido ossidasi; b) purificazione della frazione totale di mRNA specifico per detta D— amminoacido ossidasi; c) sintesi di un primo filamento di cDNA; d) anp lificazione di detto filamento di cDNA mediante la tecnica nota cene Polymerase Chain Reaction (PCR), nella quale, come specifici inneschi (primers), seno utilizzati i seguenti oligcnucleotidi sintetici: (I) !{II) a dare detto framnento di DNA; e) elevazione di detto frammento in un opportuno plasmide; f) isolamento di detto frammento.
- 3. Metodo secondo la rivendicazione 2, nel quale detto lievito di Rhodotorula qracilis è il ceppo PAN ATOC 26217.
- 4. Metodo secondo le rivendicazioni 2-3, nel quale detto cDNA è ottenuto mediante la trascrittasi inversa del virus della Leucemia Murina di Molcney e 1•oligonucleotide sintetico avente la seguente sequenza come innesco.
- 5. Metodo secondo le rivendicazioni 2-4, nel quale detto piasmide è pCRII.
- 6. Un plasmide contenente la sequenza della rivendicazione 1.
- 7. Metodo per l'espressione di D-amminoacido ossidasi da lievito Rhodoturula gracilis che comprende: a) l'inserimento della sequenza di DNA della rivendicazione 1 in un plasmide convenzionale; b) trasformazione di un microorganismo conpetente con detto plasmide; c) coltura di detto microorganismo in condizioni di induzione di D-arrminoacido ossidasi; d) isolamento di detta D-anminoacido ossidasi.
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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