HU230244B1 - Diagnosztikai esszék a B19 parvovírushoz - Google Patents

Diagnosztikai esszék a B19 parvovírushoz Download PDF

Info

Publication number
HU230244B1
HU230244B1 HU0600779A HUP0600779A HU230244B1 HU 230244 B1 HU230244 B1 HU 230244B1 HU 0600779 A HU0600779 A HU 0600779A HU P0600779 A HUP0600779 A HU P0600779A HU 230244 B1 HU230244 B1 HU 230244B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
sequence
dna
seq
primer
parvovirus
Prior art date
Application number
HU0600779A
Other languages
English (en)
Inventor
Sergio Pichuantes
Venkatakrishna Shyamala
Original Assignee
Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. filed Critical Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc.
Publication of HUP0600779A2 publication Critical patent/HUP0600779A2/hu
Publication of HUP0600779A3 publication Critical patent/HUP0600779A3/hu
Publication of HU230244B1 publication Critical patent/HU230244B1/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Díamiosziikai esszék a Β19 narvovirushoz
A jelen találmány tárgyat általában a virális diagnosztika, képezi, Pontosabban, a jelen találmány tárgyát nukleinsav-alapú esszék képezik, a BI9 parvovfrus fertőzés pontos diagnosztizálásához, valamint az ezekben az esszékben használható príÁ- humán B19 parvovirus a Parvoviridae család, Brythmvirus nemzetség tagja, és egy kisméretű, 22 nm~es, ikozabedrális, burok nélküli vírus, lineáris, egyszáin DNS molekulával rendelkeznek, aminek mérete körülbelül 5600 nukieotid- A virális genom három fő fehérjét kódol, a VP1, VP2 és N81 fehérjét [lásd például: Shade és mtsai: X Virology 58, 921.-936 (1985|; és az 1. ábra ebben a leírásban]. A VP1 (83 kDa] és a VP2 (58 kDa] a. kapszíd strukturális fehérjéi. A két fehérjét átlapoló leolvasási eretek kódolják, körülbelül a 2404-4789 és körülbelül 3125-es nukleötidok között- A VP2 képezi a kápszid 958e~át, és a nagyobb VP1 fehérje a kapzsidnak csak körülbelül 5%-át képezi. A VPl-re a vírus éreti konformációjához. van szükség. Az NS1 (77 kDa) egy nem-strukturális fehérje, és a fertőzött sejteknek csak a nukleáris frakciójában van jelen, a cítoplazmátaól és a szérumban levő érintetlen virionokból hiányzik.
A B19 parvovírust először normál véradók szérumában fedezték fel, és a Parvoviridae családnak, amiről ismert hogy emberekben patogén, az egyetlen tagja. A vírus· a számos különböző betegség megjelenési formához kapcsolódik. A humán B19 parvovfrus normális körülmények közön tünetmentes, vagy η· «* «*»χ χ* « X * * * ♦
#. ♦
X .♦ * φ
Χ«« X ♦ ** * ΦΧ*Μ enyhe, önkorlátozó fertőzést okoz gyermekekben. Felnőttekben a B19 parvovirus okozhat kiütést, tranziens szimmetrikus sokizületi fájdalmat, és arthritist, A B19 parvovírust kapcsolatba hozták a tranziens aplasztíás krízissel (TAC), mögöttes hemolitikus rendellenességekkel A krónikus B19 fertőzést és a perzisztálő anémiát leírták immunkömpromitíált akut. leukémiás, veleszületett irnmundeficíenciás. AlDS-es betegekben, és csontvelő transzplantáció után, A. B19 parvovírust kapcsolatba hozták a méhben való elhalással terhes asszonyokban,
A legtöbb országban a B19 vírusfertőzés általában gyerekkorban fordul elő, és a gyerekeknek körülbelül 51%-ában vannak magas anti-B19 ellenanyagok 15 éves korukra. A B19 ellenanyag elterjedtsége1 tovább növekedhet az élet további részében, és idős emberekben nagyobb mint 90%- os au elterjedtsége.
A humán B19 parvovirus fertőzésben az elképzelések szerint a kiindulási vírus replikáéi© a légutakban történik, A vírus azután a csont velőben levő sejteket célozza meg. Ez nagymértékű viráiis reglikáeióhoz vezet, a virémla mértékét a fertőzés után 7-10 nappal, de a tünetek fellépte előtt 1<F - 1014 részeeske/ml értékűnek Írják le, A viréraia megszakadása egybeesik a specifikus IgM ellenanyagok kim utalásával, amiknek 2-3 hónapig :! a szintje. Anti-SlO ígG ellenanyaga azután, hogy az IgM ellenanyagok feltűnnek, és az elet végéig megmaradnak.
Egy lipidburok hiánya, és a korlátozott DNS-tartalom a B19 parvovírust rendkívül rezísztenssé teszi a fizikai-kémiai inaktiválással szemben. A B19 paoovírus* különösen magas koncentrációban, eh un o vértermekek hagyományos hőkezelését, és do kumentálták a a B19 parvovirus átadását oldószer-detergenssd .* »Μ<» *·* ♦: * * kezeit Vll-es faktor és gőzzel vagy száraz hővel kezeli Vlll-as faktor és J.k-es faktor készkményekkel,
A humán B19 parvovírust nem lehet hagyományos sejttenyészetekben szaporítani, ami a vírus laboratóriumi kimutatását és izolálását rendkívül nehézzé teszi. Tehát hosszú évekig az kizárólag a virémiás betegek széruma antigén ©lÖx 3.
való felhasználás céljára, ezzel próbálták megkerülni ezeket a problémákat ÍSisk és Berman: Bíotechnology 5, 1Ö77-1Ö8Ö (1987); 6,204,044 számú Amerikai Egyesült Államok-belí szabadalmi leírás]. ImmunenzimatikUvS IgM befogási esszéket használtak az ann-B19 IgM kimutatására, valamint a friss 1319 fertőzés diagnosztizálására. Számos kereskedelmi forgalomban. levő teszt diagnosztikai teljesítőképessége azonban nem homogén. Emellett, az IgM alapú diagnosztikai tesztek nem képesek kimutatni a vírust a fertőzés virémiás stádiumában, és ha az IgM ellenanyagok már megszíntetizálódtak, akkor a virémia vége után főbb hónapig a keringésben maradnak,
A B19 ellenanyagok nagy elterjedtsége a normál, populációban, azzal a ténnyel együtt, hogy a magas virémia általában csak egy hétig tart. a szerolőgiai alapú tesztek használatát kivihe tétlenné teszi. Emellett az immunkompromittált betegekben a szerolőgiai diagnózis nem megbízható.
A nukleinsav-alapú hibridizációs esszéket, azaz: például a dót blöfföl: és az in adu hibridizációt használták a B19 kimutatására. Ezeknek az esszéknek a kimutatása határa általában lö, 1 pg virális DNS (körülbelül 1 ö4·· 105 virális részecske). A pohíneráz láncreakciónak nagyobb az érzékenysége (körülbelül 100 genom k a
rókák időigénye4 ** ««*< Μ* ♦ « Κ « > ♦
-♦ *♦· sek, felhasználásuk korlátozott, és a poíimeráz láncreakció használata nem praktikus nagyszámú minta átvizsgálásához.
Ennek következtében megmarad az igény meghízható diagnosztikai tesztek kidolgozására, amikkel a B19 pa.rvovirnsí virémiás mintákban ki lehet mutatni, azzal a céllal, hogy megakadályozzuk a virus átadását a vér és a plazma-származékok útján, vagy szoros személyes kontaktus útján.
A jelen találmány alapját egyedi primerek és lemsavhasználni, valamint a jelen találmány tárgyát képezi egy érzékeny, megbízható, nukiein sav-alap ú diagnosztikai teszt kidolgozása a B19 parvovírus DNS kimutatására poteneláhsan fertőzött egyedek biológiai mintáiból. Az itt ismertetett technikákban mintából extrahált DNS-t használunk templátként a .819 székvencía konzerválódott genomiáíis régióinak amplifíkálására, transzkripcióval végzett axnplífikálást (TMAj használva, valamint egy 5' nukk-áz esszében, azaz például a TaqMan™ technikában. A módszer lehetővé teszi a 819 DNS kimutatását virémiás mintákban, amikben a virus titere alacsony, okár csak 1CB vírasFÓszeeske/ml. Ennek megfelelően a. fertőzőit: minták azonosíthatók, és kizárhatók a transzíúzióhó! valamint o. vérkészítmények előállításából. Az itt ismertetett próbák és primerek jól használhatók még például a standard hibridizációs módszerekben, valamint a poíimeráz láncreakció alapú technikákban, a nukleinsav szekvencia-alapú amplifíkálásban (HASBA) és olyan esszékben.
amikben elágazó láncú DNS molekulákat alkalmaznak.
jelen
Ennek megfelelően, az egyik megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás humán B19 parvovírus fertőzés ki« xx « .♦ * *
κ mutatására egy biológiai mintában. Az eljárás a következő lépésekből áll:
a) egy biológiai mintából, amiről feltételezzük, hogy humán B19 parvovirus DNS-t tartalmaz, nuklein savat izolálunk, amiben a uukleinsav tartalmaz egy RNS célszekvenciát;
bj az izolált B19 parvovirus nuklein savat egy első nukleotiddal reagálhatjuk, ami tartalmaz egy első prímért, ami egy olyan komplexképző szekvenciát tartalmaz, ami eléggé komplementer az RNS célszekvencia 3*~ terminális részével, althoz, hogy komplexet képezzen vele, és az első primer S'tartalmaz még egy promotert egy DNS -dependens RNS polimerázhoz, és működés szempontjából a komplexképző szekvenciához kapcsolódik, és a reakciót olyan körülmények között hajtjuk végre, amik biztosítják egy oligonukleotid/eélszekvencía komplex létrejöttét, és & DNS szintézis az első primer egy extenziös reakcióben meghosszabbítjuk, az RNS cél-szekvenciát használva templátként, így kapjuk az első DNS primer extenziös terméket, ami komplementer az RNS cél-szekvenciával; az első DNS primer extenziös terméket elválasztjuk az RNS célszekveneíátöl, olyan enzimet használva, ami szelektive elbontja az RNS eélszekveneíát' a DNS primer extenziös terméket egy második olígonukleotiddal kezeljük, ami tartalmaz egy második prímért, ami eléggé komplementer a DNS primer extenziös termék 3'-terminális részével, ahhoz, hogy komplexet képezzen vele. olyan körülmények között hajtjuk végre, amik biztosítják egy oiigonukíeotíd/ cél szekvencia komplex létrejöttét, és a DNS szintézis iniciálását;
a második primer 3' terminálisát meghosszabbítjuk egy DNS extenzíós reakcióban, így kapunk egy második. DNS primer extenzíös terméket, ezzel előállítva a DNS számára;
a templátot használjuk, hogy a eelszekveneíáböl RNS kópiát állítsunk, elő, olyan DNS-d polimerázt használva, ami fölismeri a véneiét;
es
j) ve a. u| — g a célszekvenciát..
Néhány megvalósítási mód szerint a jelen találmány zik továbbá a következő lépések is: a íi ?át r a eélszekvencía egy- részével, olyan körülmények között, amik lehetővé teszik, hogy’ a próba hibrídízálódjon a a próba: cél szekvencia komplexben levő célszekvenkim utaljuk a jelölés jelenlétét vagy hiányát, ami jelzi a eélszekveoeia meglétét vz további megvalósítási módokban jelölés akridínium jszter.
”7 ***x »«χ«
A még további megvalósítási módok szerint az eljárásokban basznál első és második primer, valamint a próba a humán B19 parvovírus VP1 régiójából származik, azaz például a 2A-2U, vagy 11A-11Z ábrák bármelyikén ismertetett poünukleotid szekvenciábók
Egy másik megvalósítási mód szerint a jelen találmány targya eljárás humán 819 parvovírus fertőzés kimutatására egy biológiai mintából. Az eljárás a kővetkező lépésekből áll:
al egy biológiai mintából, amiről feltételezzük, hogy humán B19 parvovírus DNSt tartalmaz, nukleinsavat izolálunk, amiben a nukleinsav tartalmaz egy RNS eélszekvenciát;
b) az izolált B19 parvovírus nukleinsavat egy első nukleotiddal reagáltatjuk, ami tartalmaz egy első prímért, ami egy olyan komplexképző szekvenciát tartalmaz, ami eléggé komplementer az EN'S célszekveneía 3'termínáüs részével, ahhoz, hogy komplexet képezzen vele, és az első primer 5' tartalmaz még egy promotert egy DNS-dependens RNS poümerázhoz, és működés szempontjából a konipiexkepzo szekvenciához kapcsolódik, amely első primer tartalmaz egy olyan szekvenciát, ami &. 2A-2U ábrák vagy a 11A-I1Z ábrák bármelyikén bemutatott poünukleotid szekvenciából származik, és a reakciót olyan körülmények között hajtjuk végre, amik biztosítják egy oiigonukieotid/célszekveneía. komplex létrejöttét, és a DNS szintézis iniciálását;
ej az első prímért egy extenziós reakcióban meghosszabbitjük, az RNS cél-szekvenciát használva templátként, ·*χ **** **** χ* ,χ Φ* X φ » ♦ ♦ X * * χ * #* fc így kapjuk az első DNS primer extenziós terméket, ami komplementer az RNS cél··szekvenciával;
dj az első DNS primer extenziós terméket elválasztjuk az RNS célszekvenciától, olyan enzimet használva, ami ej szelektíve elbontja az RNS célszekvenciát;
a DNS primer extenziós terméket egy második oligonnkleotiddal kezeljük, ami tartalmaz egv második prímért, ami eléggé komplementer a DNS primer extenziós termék 3'-terminális részével, ahhoz, hogy' komplexet képezzen vele, és a második primer tartalmaz egy olyan szekvenciát, ami a 2 A--2U ábrák vagy a
A-112 ábrák szekvenciából ί
menyek között hajtjuk végre, amik biztosítják egy·' oiigonukleotid/célszekvencia komplex létrejöttét, és a DNS szintézis iniciálását;
fi a második primer 3' terminálisát meghosszabbítjuk egy' DNS extenziós reakcióban, igy kapunk egy második DNS primer extenziós terméket, ezzel előállítva egy templátot a DNS-dependeos RNS poíimeráz számára;
gj a templátot használjuk^ hogy a cél szekvenciából több RNS kópiát állítsunk elő, olyan DNS -dependens RNS poümerázt használva, ami felismeri a promoterszekvenciát;
és hj a gj lépésben kapott RNS kópiákat használjuk, autökatalítíkusan megismételve a hj -~ gj lépeseket, ezzel ampljfíkálva a eélszekvencíát;
*:♦ 4 < ♦ Μ * A 4* ♦ * * * * * * ' ♦ « * »>^4*»* ιί « μΑ « a h) lépésben kapott termékhez egy akridiniumészterre! jelzett oligonukleotid próbát adunk, amely oligonukleotid próba komplementer a célszekvencia. egy részével, és a próba a 2A-2U ábrák vagy a II Á~ 112 ábrák bármelyikén bemutatott polinukleotid szekvenciából származik, és a próbát olyan körülmények között adjuk hozzá, amik lehetővé teszik, hogy a próba hibridizálödjon a próba: célszekvencia komplexben levő célszekvenciával; és kimutatjuk a jelölés meglétét vagy hiányát, ez mutatja.
ísO van~e vagy nincs _ megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgya eljárás humán B19 parvovírus fertőzés kimutatására egy biológiai mintából. Az eljárás a kővetkező lépésekből áll:
aj egy biológiai mintából, amiről feltételezzük, hogy humán B19 parvovírus DNS-t tartalmaz, nukleinsavat izolálunk, amiben a nukleinsav tartalmaz egy RNS eélszekvenclát' bj egy vagy több olyan prímért adunk hozzá, amik képesek hibrídizální az RNS célszekvenciával, és az «X vagy több primer a 2A-2U ábrák vagy a 11 A-112 ábrák bármelyiken bemutatott polinukleotid szekvenciából származik;
ej olyan oligonukleotid próbát adunk hozzá, ami képes hibrídizálódní at RNS eélszekveneiáhox, ami az egy vagy több primerhez viszonyítva 3' helyezkedik ek az egy vágy több prímért égy poümerázzal meghosszabbítjuk.
dl ** «««« XX' * ' * V
Φ * « * ** * φΦ' ,φ
Η) * ’ *· *
«**»
Néhány megvalósítási mód szerint az a)
RNS célszekveneiát reverz transzkripcióban cDNS-sé írjuk át, és az eljárás tartalmazhatja még a cDNS amplifikálását, polimeráz láncreakeiós amplifikálását (RT-RCR), vagy aszimmetrikus rés lí~ góiásí láncreakciót ÍRT-AGLCR). Másik megvalósítási módok szerint a polimeráz egy hostabii polimeráz, azaz például, anélkül, ezekre korlátoznánk magunkat, Taq polimeráz vagy Vént áz. További megvalósítási módok szerint; a polimeráz
Sseberiehia coli DNS polimeráz l, az Eseheriohm eoá DNS pobmeráz 1 Klenow fragmense, vagy T4 DNS polimeráz.
Az előzőkben ismertetett különböző módszerek néhány megvalósítási módja szerint egy belső kontrollt biztosítunk. Á belső kontroll származhat a 12. ábra (92. számú szekvencia) szekvenciájából· További megvalósítási módok szerint a belső kontroll a 90. számú szekvencia.
További megvalósítási módok szerint a jelen találmány tárgya eljárás humán B19 parvovirus fertőzés kimutatására egy biológiai mintából· Az eljárás a kővetkező lépésekből áll;
aj egy biológiai mintából· amiről feltételezzük, hogy humán B19 parvovírus DNS-t tartalmaz, nukleinsavst izolálunk, amiben a nukieinsav tartalmaz egy RNS cél sze kven ciá t;
b) az izolált B19 parvovírus nukleínsavat egy kimutathatóan jelzett próbával reagáltatjuk, ami eléggé komplementer ahhoz, hogy komplexet képezzen a eélszekvenciával, és a próba a 2 A · 2 U ábrák vagy all A11Z ábrák bármelyikén bemutatott polinukleotM szekvenciából származik, és a reakciót olyan kórulX : ρ « . * * :* \· > ·χ * ♦ V.
.* e 4 Ν· *^ > ·Χ χ. β·Χ· χ ~ Λ* ·.
métiyék között hajijuk végre, amik biztosítják egy prőha/célszekveneia komplex létrejöttét, és;
ej kimutatjuk a jelölés meglétét vagy hiányát, ami arra. utal, hogy a eélszekvencía megvan-e vagy nincs.
További megvalósítási módok szerint a jelen találmány tárgya egy polinukleotid, ami olyan polinukleotid szekvenciát tartalmaz, ami tartalmaz egyet vagy többet a 2A-2Ü ábrákon vagy a
További megvalósítási módok szerint a len találmány tárgya egy polinukleotid, mint az előzőkben, és a. nukleotid szekvencia a 2A, 20, 20, 20, 20, 2F, 2GS 2H, 21, 2d, 2K, 2t, 2¾ :2N, 20, 2P, 2Q, 2R, 2S, 2T, 20, HA, 1 IB, 1 IC, 11D, HE, 11F, I1G, UH, 11.1, 11,1, llk Tik, 11M, UN, 11(1 IIP, 11Q, 1 ÍR, US, TIT, HU, ÜV, IIW, 11X, ITT vagy 112
További megvalősításí módok szerint a jelen találmány tárgya egy pölmukleotid, ami olyan nukleotid szekvenciát tartalmaz, ami a 3.A--3C vagy 4A-4C ábrákon bemutatod, nukleotid szekvenciák közül bármelyiket tartalmazza.
A még további megvalósítási módok szerint a találmány tárgya egy előzőkben említett polinukleotid, amiben a nukleotid szekvencia olyan nukleotid szekvenciát, tartalmaz, amit a 3A -3C vágy 4Á-4C ábrákon mutatunk be.
Egy további megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgya olyan oligonukleotid primer, ami tartalmaz egy olyan promoter régiót, amit egy DNS-dependens RNS polimeráz felismer, amely DNS-dependens RNS polimeráz működés szempontjából egy körülbelül 10-75 nukleotidhól álló humán Blü parvovírus-
ϊ •pri.
χ ν *' lóskásí mód szerint a promoter régió a T7 promoter, és a szóban forgó polimeráz a T7 RNS polimeráz. Emellett, a humán 819 párvovírus-specifikus szekvencia származhat a humán B19 parvovirus genom VP1 régiójából, azaz például lehet a 2A-2U ábrák vagy a 11A-I ÍZ ábrák bármelyikén ismertetett polinukleotid szekvencia.
Még további megvalósítási tárgya egy tért, szerint a jelen találmány ami tartalmaz egy 17 promo-
álló humán 819 parvovirus specifikus komplexképző szekvenciához kötve, és a humán B19 parvovirus·:
ÍZ ábrák bárme képző szekvencia a zA~z u abrak vagy a lyikén ismertetett polínnkieotid szekvenciából származhat.
kgy további megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgya egy oligonukleofid próba, ami tartalmaz egy körülbelül 1050 nukleotidbót álló B19 parvovirus-specifíkus hibridizálö szekvenciái, egy akridinium-észter jelöléshez kapcsolva. Néhány megvalósítási mód szerint a B19 parvovirus-specifikus hihrídízáló szekvencia a humán B19 panovirus genom VP1 régiójából származik, azaz például a 2Á-2U ábrák vagy a 11A-112 ábrák bármelyikén ismertetett polinukleotid szekvenciából.
Egy még további megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgya egy diagnosztikai tesztkit, ami tartalmaz egy vagy több Itt ismertetett öl teszt vegx ómért, valamint a diagnoszNéhány megvalósítási mód szerint a teszt kit tartalmaz még egy oiigonukleotid próbát, ami egy körülbelüli0-50 nukleotid méretű 819 parvovirusspecifikus hibridizációs szekvenciát tartalmaz, egy akrídínium
|««« »♦ jb
Φ * :♦♦ φ «φφκ Φ:ΐ* φ * φ Α Φ* Φ
A jelen találmánynak. ezen és más aspektusai nyilvánvalókká válnak az alábbi részletes leírás és a csatolt ábrák alapján,
Az alábbiakban részletesen Ismertetjük a mellékelt ábrákat.
Az I, ábra a. humán 019 parvovírus genom diagrammszerú ábrázolása, amin láthatók a vírus különböző kódoló régiói. Három poíimeráz láncreakció fragmenst ábrázolunk, az egyik. körülbelül 700 bázispár méretű, ami a BI9 parvawus genom jShade és mtsai: d. Virology' 58, 921-936 (1986)] 2936-3635-ös nukleotíd pozícióinak felel meg, a másik körülbelül 370 házispár a 700 bázispáros fragmenseo belül, ez a B19 parvovírus genom jSha.de és mtsai: 3, Virologv 58. 921-936 (198611 3073-3442-es pozícióinak, felel meg; a harmadik körülbelül 214 bázispár méretű, ami a 019 parvovírus genom (Sbade és mtsai: J. Virology 58, 921-936 (1986)) 4798-4941-es nukleotíd pozícióinak felel
A 2A. - 2ü, ábrákon (.1-21. számú szekvenciák) a különböző B19 parvovírus izolátumok szekvenciáit mutáljuk be, amik közé tartoznak a 019 parvovírus genom jShade és mtsai: d. Virology 58, 921-936 (1986)] 2936-3635-ös nukleotid pozícióiban levő szekvenciák (a 700 bázispáros fragmens az 1, ábráról). A 2A. ábra (1. számú szekvencia) a 0-147-26 izolátumból származó szekvenciát mutatja; a 2R. ábra (2, számú szekvencia.) a. CH4829 ízolátumbői származó szekvenciát mutatja; a 2C. ábra (3, számú szekvencia) a CH33-2 izoíátumböi származó szekvenciát mutatja; a 20. ábra (4. számú szekvencia) a CH33 -3 izolátumból származó szekvenciát mutatja; a 20. ábra (5, számú szekvencia) a CH33-4 izolátumból származó szekvenciát mutatja; a 2F ábra (6, számú szekvencia) a CH42-7 izolátumból származó szekvenciát. mutatja; a 2G. ábra (7. számú szekvencia.) a. CH42-18 χ:
*
Φ*«
X < *. * Λ ο ♦ · ♦ X ♦ ♦ * *' ♦ **♦ * ♦ * * * χ ♦ :*-* tótomból származó szekvenciát mutatja; a 2H, ábra (8. számú szekvencia) a €H42 -19 izolátumból származó szekvenciát mutatja; a 21. ábra. (9. számú szekvencia) a CH46-23 izolátumból származó szekvenciát mutatja; a 2J. ábra (10. számú szekvencia) a CH1-1 izolátumból származó szekvenciát mutatja; a 2K. ábra (11. számú szekvencia) a CH1-6 izolátumból származó szekvenciát mutatja; a 2L. ábra (12. számú szekvencia) a CR2--8 izolátumból származó szekvenciát mutatja; a 2M. ábra (13. számú szekvencia) a CH2-1Ö izolátumból származó szekvenciát mutatja; a :2N, ábra (14. számú szekvencia.) a CH2-11C izolátumból származó szekvenciát mutatja; a 2Ö, ábra (1,5. számú szekvencia) a CHS-13 izolátumból származó szekvenciát, mutatja; a 2P. ábra (16, számú szekvencia) a OH 13-27 izolátumból származó szekvenciát mutatja; a 2R. ábra (18. számú szekvencia) GB14-33 izolátumból származó szekvenciát mutatja; a 2S. ábra (19, számú szekvencia) a €1162-2 izolátumból származó szekvenciát mutatja; a 2T. ábra (20, számú szekvencia) a CHŐ4--2 izolátumból származó szekvenciát mutatja; és a 2U. ábra (21, számú szekvencia) a. €H67~2 izolátumból származó szekvenciái m utalja.
A 3A, - 3C. ábrák (22, számú szekvencia) egv körülbelül 4/7 kiiobázispár méretű polímeráz láncreakció fragmens szekvenciáját mutatják, amit az 1. ábrán ís bemutatunk, a B19 parvovírus 2-B1 klánból A szekvencia egy kőrúlbelúl 4677 nukleoiid méretú fragmens, ami a 217-4893-as nukleotid pozícióknak lelet meg [Shade és mtsai: J. Vírology 58, 921-936 (1986)]. Az ismertetett szekvencia tartalmazza a B19 parvovírus teljes hosszúságú nyitott leolvasási keretét, ami kódolja az N81 -et, a VPl-et és a VP2 -L plusz további 5' és 3' nem-iranszlalődö szekvenciákat.
«.
* * > * ♦
β *♦ * ♦ *χ * *:
X ♦ ♦:
♦ ** ♦ «* 4 »:
A 4A. - 4C. áfarák (23. számú szekvencia) egy körülbelül
4,7 kilobázispár méretű polímeráz láncreakció fragmens szekvenciáját mutatják, amit az .1. ábrán is bemutatunk, a 819 parvovírus 2B6 kiónból. A szekvencia egy körülbelül 4677 nukleotld méretű fragmens, ami a 217-4893-as nukleotld pozícióknak felel meg (Shade ős rntsai: J. Vrrology 58, 921-936 (1986)(. Az ismerteteti szekvencia tartalmazza a B19 parvovirus teljes bosszúságú nyitott leolvasási keretet, ami kódolja az NSl-et, a VF1-et és a VP2-t, plusz további 5' és 3 nem-transzlálődö szekvenciákat.
Az 5A. ábra (24. számú szekvencia) és az 5B. ábra (25. számú szekvencia) mutatja az HB1 nukleotld- és febérjeszékvenciáját, a B19 parvovírus 2- B1 klónből.
A 6A. ábra (26. számú szekvencia) és a 6B. ábra (27. számú szekvencia) mutatja a VP1 nukleotld- és fehér|eszekvenciáját, a 81.9 parvovírus 2-81 klánból
A 7A, ábra (28. számú szekvencia) és a 78. ábra (29. számú szekvencia) mutatja a ¥82 nukleotid - és fehérjeszekvencíájái, a B19 parvovírus 2-B1 klönhöl,
A 8A. ábra (30. számú szekvencia) és a 88. ábra (31. számú szekvencia) mutatja az NS1 nukleotld- és fehérjeszekvenciáját, a B19 parvovírus 2-B6 klónből.
A 9A. ábra (32. számú szekvencia) és a 98. ábra (33. számú szekvencia) mutatja a VP1 nukleotid- és fehérjeszekvencíájái, a B19 parvovírus 2-B6 klónből.
A 1ÖA. ábra. (34. számú szekvencia) es a 108. ábra (35. számú szekvencia) mutatja a VP2 nukleotid- és feliéijeszekvencíáját, a B19 parvovírus 2-86 kiőnbok
A 11 A, --1122 ábrák (62-87. számú szekvenciák) a különböző parvovírus tzoláíumokbol származó szekvenciákat mutatják >* *♦** **♦» * ♦ * * * « ♦ ♦ * « φ « ♦X* * be, amik közé tartoznak a B19 parvovírus genom fBhade és mtsai: d, Vírology 58, 921 -936 (1986)1 2936 -3635-os nukieotid pozícióinak megfelelő szekvenciák. A 11 A. ábra (62. számú szekvencia a CB8Ö~Í izolátumnak megfelelő szekvencia; a IÍB. ábra (63. számú szekvencia) a CHS 1-3 izolátumnak megfelelő szekvencia; a 1 IC. ábra (64. számú szekvencia) a B19SCL1-4 izolácia) a B19SCL2- .1 izolátumnak megfelelő szekvencia; a 11E (66. számú szekvencia) a. B19SCL3-1 izolátumnak megfelelő szekvencia; a 1 IF. ábra (67. számú szekvencia) a. B19SCL4-3 ízolatomnak megfelelő szekvencia; a 11G. ábra (68. számú szekvencia) a B!9SCL5-2 izolátumnak megfelelő szekvencia; a UH. ábra (69. számú szekvencia) a B19SCL6-2 izolátumnak megfelelő szekvencia; a 1.11. ábra (70. számú szekvencia) a B19BCb7-3 izolátumnak megfeleld szekvencia; a 1 kk ábra (71. számú szekvencia) a B19SCL-2 izolátumnak megtelelő szekvencia; a OK. ábra (72. számú szekvencia) a B19SCL9-1 izolátumnak megfelelő szekvencia' a. 11L. ábra (73. számú szekvencia) a B19SCL9-9 izolátumnak megfelelő szekvencia; a 1IM. ábra (74. számú szekvencia) a B198CL10-2 izolátumnak megfelelő szekvencia; a 1 IN.
a BI9SGL1 l-l izolátumnak megfele/3. számú szenvei lő szekvencia; a .11.0. ábra (76. számú szekvencia) a B19SCL12 -1 izolátumnak megfelelő szekvencia; a IIP. ábra (77. számú szekvencia) a B19BCL13-3 izolátumnak megfelelő szekvencia; a 1 IQ. ábra (78. számú szekvencia) a B19SC.L14-1 izolátumnak megfelelő szekvencia; a Ilii ábra (79. számú szekvencia) a B19SCbl5~3 izolátumnak megfelelő szekvencia; a 11S. ábra (80. számú szekvencia) a B19SCL16-2 izolátumnak megfelelő szekvencia; a OT. ábra (81. számú szekvencia) a B19SCL17-1 izolátumnak megfele•ί -η·
X < « * ♦ * * #** *
*......» * va»** Χ»< Α
V** * lő szekvencia; a ί HL ábra (82. számú szekvencia) a B19SCblS-l izolátnmnak megfelelő szekvencia; a 1IV. ábra (83. számú szekvencia) a B19SCL19-1 ízolátumnak megfelelő szekvencia; a 11W. ábra (84. száméi szekvencia) a B19SCL2G--3 izolátornak megfelelő szekvencia; a 1IX. ábra (85. számú szekvencia) a B19SCL21-3 ízolátumnak megfelelő szekvencia; a 11Y. ábra (6. számú szekvencia) a BT9SCL22--11 ízolátumnak megfelelő szekvencia; a 1 ÍZ,
87, számú szekvencia! a I
A 12. ábra (92. számú szekvencia) egy példa-szekvenciát mutat be, amiből egy belső kontroll (IC) származhat, a célpont és
A jelen találmány gyakorlatában, hacsak az eltérést külön nem. jelezzük, a. kémia, biokémia, rekombináns DNS technika és virológia hagyományos módszereit használjuk, ami a szakterületen jártas szakember Ismereteihez tartozik. Az ilyen technikákat részletesen ismertetik a szakirodalomban [Fundamental Virology, 2. kiadás, b és 11, kötet, szerk.: B.N. Fiekls és D.M. Knipe; A.b. Lehninger: Biochemistry (Worth Puhhshers, Inc. friss hozzáadás); Sambrook és mtsai: Molecular Öörűng; A Laboratory Manttal; 2. kiadás, Cold Spring Harbor Bross, Cöld Bpring Bárkor, N.Y. (1989); Methods in Enzymologyg szerk,* 3. Colowick és N. Káplán, Academic Press, Inc; Olígonucleotíde Synthesis, szerk.: N. Gált (1984); A Praeúeal Guide to Molecular Cloning (1984)),
Meg kell jegyeznünk, hogy a leírásban és a csatolt igénypontokban a kifejezések egyesszámú formái helyett használhatjuk a tobhesszámut is, hacsak a tartalom máskeni nem diktálja. Tehát például az „antigén” szakkifejezés vonatkozik például két ♦ * »«♦* ♦»** :«* » « * * * „ ' χ *«* * * fi * * '* ♦ < «** vagy több antigén keverékére és hasonlókra is, A szövegben az alábbi aminosav rövidítéseket használjuk:
Alanín: Alá (A)
Ciszteim Cys (C) Cduiaminsav: Glu
Árglnin: Arg (Aj Aszpa.ra.gin sav: As Glutamín: Gin. (Qj
Leucin: Leu (Lj Metionin; Met (M) .Prolin: .Pro (P) Treonin.: Thr (Tj 'Iferozin: Tvr (Yi
Izoleueín: He Lízín: Lys (Kj Fenilalanin: Szerín:
Valin: Va.l (V)
A jelen találmány ismertetése során az alábbi szakkifejezéseket használjuk, és az alábbiakban definiált módon haszA „polipeptid* és „fehérje” szakkifejezés jelentése aminosav csoportok polimere, és nem korlátozódik a tennék egy minimális hosszára. Azaz a deímíei© vonatkozik a peptidekre, oligopeptidekre, dimerekre, muJtimerekre és hasonlókra is. A dehmeio vonatkozik teljes hosszúságú fehérjékre és azok. fragmenseire is. A szakkifejezés vonatkozik a polipeptid poszt-expresszíós módosításaira. is, azaz például glíkozilezésre, acetilezésre, foszforilezésre és hasonlókra. Emellett a jelen találmány esetében a „polipeptid’’ iíéiezés egy olyan ίο re v ami a nanv szezveneiákhoz viszonyítva módosításokat tartalmaz, azaz például deléeió.ka.1, addíciókat és helyettesítéseket (általában konzervatív természetoekj, mindaddig, amíg a fehérje megtartja a ♦♦ «#♦* * ♦. * « ♦·
«. * * * * φ ♦ φ * *« + * 944 Λ X*
tivkású Ezek a: módosítások lehetnek szándékoltak, azaz például hely specifikus mutagenezis útján előállítottak, vagy lehet véletlenszerű, azaz például a fehérjéket termelő gazdaszervezetben olyan mutációkon keresztül, vagy lehetnek a poíimeráz: láncreakciós amplifikálás hibái.
A parvovírus B19 polipeptid egy olyan polipeptid, az előzőkben definiált módon, ami a B19 genom által kódolt fehérjéből származik, azaz például nem szerkezeti fehérjékből, az NSl-hö! és az NS2-böl, valamint olyan fehérjékből, amikből a virális fcapszíd, a VP1 (körülbelül 781 amínosav hosszúságid vagy a. VP2 (körülbelül 554 aminosav hosszúságú). A reprezentatív NS1, VP1 és VP2 szekvenciákat ebben a leírásban, az 5-10.
be. A poli pepiidnek nem keli dzíkailag a 819 származnia, hanem előállíthatok szintetikusan, ™ ~ ' á a polipeptid származhat nátrium-klorid különböző 819 parvovírus törzsből és izolá, tumbök .Ezekben: az ízolátumok.ban számos különböző konzervált és variábilis régió ismert, és általában az ezekből a régiókból származó epitopok amínosav szekvenciái például magasabb szekvencia bomolőgiát mutatnak, azaz például több mint 30%-os, előnyösen több mint 40%-os aminosav szekvencia homológiát., ha a két szekvenciát egymáshoz illesztjük. így például a „VP1” polipeptid szakkifejezés jelentése a természetes VP1, ami származhat bármelyik különböző B19 parvovírus törzsből és izolátumbói, A számos különböző B19 parvovírus törzs és izolátnm előzőkben említett fehérjéinek teljes genotípusa és szekvenciája ismert (lásd például Shade és mtsai; J, Virology 58 921-936 (1986); Gallinella és mtsai; J. Virol. Meth. 41, 203-211 (1993)]. Emellett az ezekből a régiókból származó B.19 parvovírus epitopok is <♦ «*** ** « « < » * * « * *♦ * * (5,436,127 számú Amerikai Egyesült Államok-helí szabadalmi leírás; WO 91/12269 számú nemzetközi szabadalmi leírás].
Az „analóg* és „mnteirrt szakkifejezések a referencia molekula biológiailag, aktív származékaira, 'vagy az ilyen származékok fragmenseire vonatkoznak, amik megtartják a kívánt aktivitást, azaz például az immunreaktivitást a diagnosztikai esszékben. Az „analóg* szakkifejezés általában olyan vegyületre vonatkozik, ami natív polipeptid szekvenciával és struktúrával rendelkezik, a. natív molekulához viszonyítva egy vagy több aminosav hozzáadásával, helyettesítésével (általában konzervatív természetű), es/vagy deléoíójával, mindaddig, amíg a módosítások ném roncsolják el az immunogén aktivitást. A „muteín* szakkifejezés jelentése olvan peptid, ami egy vagy több peptid mimetíkumot társz
például olyan peptid, amit a WO 91/04282 számú nemzetközi szabadalmi leírásban ismertetnek. Az analóg műtőmnek előnyösen legalább akkora az immunreaklivítása, mint a natív molekulának. A polipeptid analógok és muteinek előállítási b lakban ismertetjük.*****
Az analógok közé tartoznak előnyösen azok a helyettesítések, amik konzervatív természetűek, azaz például azok a helyettesítések, amik olyan aminosavak családján belül játszódnak le, amiknek az oldallánca rokon szerkezetű. Pontosabban, az amínosavakat általában négy családba osztjuk: (1) savas aszpartát es glutamát; (2| bázikus — lizín, arginín, híszddin; (3| apöláros ~ alanin, valin, leuein, izoleucin, prolin, íenilaianín, metionin, triptofán; és (4) töltetlen poláros ~ glicin, aszparagin, glutsmín, cisztein, szerín, treonin, tirozin. A fenilaláninf, a fctiptofant és a tirozint gyakran aromás aminosavként osztályozzák. Az pél21 χ* »«« X ♦ * ♦ ♦ X * ♦ ♦ λ * ♦ * ♦ * φ « *·*·* > ♦ *** dául ésszerűen megjósolható, hogy a bucin izolált helyettesítése izoleucinnal vagy valinnal, az aszpartát izolált helyettesítése giutamáttal, a treonín izolált helyettesítése szerinnel, vagy egy aminosav hasonló konzervatív helyettesítése egy strukturálisan rokon a.mínosa.vvai nincs nagy hatással a biológiai aktivitásra. Például a számunkra érdekes polipeptid tartalmazhat maximum körülbelül 5-10 konzervatív vagy nem-konzervatív aminosav helyettesítést, vagy· éppen maximum 15-25 konzervatív vagy’' nemkonzervatív aminosav helyettesítést, vagy’ egy 5-25 közötti egész számú konzervativ aminosav helyettesítést, mindaddig, amíg a molekula kívánt funkciója intakt marad. A szakterületen jártas szakember könnyen meg tudja határozni a számunkra érdekes molekulának azokat a régióit, amik képesek tolerálni a változtatást, a Hopp/Woods és Kyte-Doolíttle ábrázolásoknak megfelelően, amik jól ismertek a ?s jeieuiese, na egy pokpepbdre vonatkozik, akkor azt jelenti , hogy a szobán forgó molekula a teljes szervezettől, amivel a molekula található a természetben, elvá lasztott és diszkrét, vagy az azonos típusú más makromolekulák
lentése, ha egy poimumeonura vonatKoztatfnx, akkor egy olyan π öklein sav molekula, ami mentes, részben vagy teljes egészében azoktól a szekvenciáktól, amik normális körülmények között kapcsolatban állnak vele a természetben; vagy egy szekvencia, amint az a természetben létezik, de heterológ szekvenciákkal rendelkezik, vele összekapcsolódva; vagy a kromoszómától disszociált
Egy pölínukieotid „származik vagy „specifikus” egy szóban •gó szekvenciából vagy szekvenciára, ami tartalmaz egy egybefüggő* szekvenciái, ami legalább körülbelül ö nyosen legalább körülbelül 8 nükleoüdfeél, még előnyösebben legalább körülbelül 1012 nukleotídhöl, es még ennél is előnyösebben legalább körülbelül 15-20 nukleotldból áll, azaz például azonos vagy komplementer a szobán forgó nukleotid szekvencia egv régiójával. A polinukleotid származék nem szükségszerűen származik fizikailag a számunkra érdekes nukleotid szekvenciából, hanem bármilyen módon előállítható, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a kémiai szintézist, a replikádét, a reverz transzkripciót, ami azon az információn alapul, ami azokban a régiókban levő bázis szekvenciában van, amikből a polinukleotid származik. Mint olyan, ez reprezentálhatja az eredeti pofenkleotid értelmes vagy antiszensz orientációját.
A „homológia” szakkifejezés jelentése két polinukleotid vagy két polipeptid egység közötti százalékos hasonlóság. Két DNS, vagy két polipeptid „lényegében homológ” egymással, ha a két szekvencia legalább 50%-os, előnyösen legalább körülbelül 7S%~ os, még előnyösebben legalább körülbelül 80-85%-os, előnyösen legalább körülbelül 90%-os, és legelőnyösebben legalább körülbelül 95-98%-os szekvencia hasonlóságot mutat a molekula egy meghatározott hosszán. A továbbiakban a lényegében homológ szakkifejezéfcS olyan szekvenciákra vonatkozik, amik a specifikált DNS-hez vagy polipeptid szekvenciához teljes azonosságot mutat.Az „azonosság” szakkifejezés jelentése egy pontos nukleotid-nukleotíd vagy aminosav-aminosav megfelelés. A százalékos azonosság úgy határozható meg, hogy közvetlenül összohasonik a két molekula^ közötti szekvencia információt, a szekvensgymáshoz illesztésével, megszámláljuk a két egymáshoz ilφ V φ * * * **φ ♦ *
Χ· 4. * *
Φ'*#’* *Φ> t **** fesztett szekvencia között a pontos illeszkedéseket, ezt a számot elosztjuk a rövidebb szekvencia teljes hosszával, majd az eredményt megszorozzuk 100-zal.
Könnyen hozzáférhető számítógépes programok használha tók arra, hogy elősegítsük a homológja és az azonosság elemzését, ilyen például az ALI G R [Dayhoíí, M.O., ín Ádús pf űriem Segaence und Stnmhou, 5. Suppl. 3, 353-358 szerk.: M.O. Dayhoff, National bíomedical Research Foundation, Washington DC), ami adaptálja Smíth és Waterman lokális homológja algoritmusát [Smíth és Waterman; Ádvances in Appl. Math. 2, 482-489 (19811), a peptid analizálásához. Á nukleotid szekvencia meghatározására szolgáló programok hozzáférhetők; Wiseonsin Sequence Analysis Paekage-bői (Version 8) (beszerezhető a ven i
Genetics Computer Group-töl, Madison, W BESTFIT, a FÁSTA és a GAP program, amik szintén a Smíth és Waterman algoritmuson alapulnak. Ezeket a programokat x a gyártó terekkel, amiknek a leírása az előzőkben említett Wiseonsin Sequence Analysis Package-ben található. Például egy7 adott nukleotid szekvencia százalékos homológiája egy referencia szekvenciához meghatározható, Smith és Waterman homológja algoritmusával, egy alap értékelési táblázattal, és hat nukleotid pozíció rés - bün tetősével.
A jelen találmány szövegösszefüggésében a százalékos homológia megállapításának, egy másik módja az MPS.RCH programcsomag használata, ami az üniversity of Edinburgh szellemi tulajdona, John F. Collina és Shane 8. Túrok fejlesztette ki, beszerezhető az infelliöenetfes, Inc.-tol (Mountain View, CA). Ebből a csomagból a Smíth-Waterman algoritmus használható, az alap paramétereket használva az értékelő táblázathoz (például résnyílási büntetés 12, résnővekedésí büntetés egy, és hatos rés). Áz így generált adatok közül a „Match érték tükrözi a „szekvencia homoiőgiát’’. A szakterületen ismertek más programok: is, amikkel a szekvenciák közötti százalékos azonosság vagy hasonlóság kiszámítható, ilyen mésík illesztési: program a BLSAT, amit alap paraméterekkel használnak. Például a BLÁSTN és BLASTP az alábbi alap paraméterekkel használható: genetikai köd ~ standard; szűrő ::: nincs; szál ~ mindkettő; vágási érték = 60; várt 10; Mátrix ::: Biosurn62; Leírás = 50 szekvencia; Osztályozás = MAGAS ÉRTÉK; Adatbázis nem-redundáns, GenBank + EMBL iss
Spupdate r PIR. Ezeknek a programoknak a részletei megtalálhatók az alábbi internet címen: http:/ /www.ncbi.nlm.gov/égibin/BLAST.
Egy másik változat szerint a hibrídizálta.tásával, olyan körülmények menyek között stabil duplexek keletke: között, ezt követi egy egyláncra emésztés, és az emésztet t
A lényegében homológ DNS szekvenciák .a a között, amely körül· a
reg
kének meghatározása, t Southern biot hibridizációs kísérletekben azonosíthatók, például szigorú körülmények között, amit egy adott rendszerre meg lehet határozni. A megfelelő hibridizációs körülmények definiálása a szakterületen jártas szakember ismeretei hét tartozik, leírása xuegtaiálható a szakirodalomban [Bamhroök és mtsai: Molecuíar Gloning: A Laboratory Maimai; 2. kiadás, Cold Spring Harbor Press, Goid Spring Harbor, N.X (1989): Nucleic Aeid Hyhridiza.tion, süpraj.
;* Φ’»*'· > * X *
S v ·> \ # φ ♦ .<·» ΧχΦ S ν· χ
A „működés szempontjából kapcsolt” szakkifejezés jelentése az elemek olyan elrendeződése, amiben az így leírt komponensek úgy vannak konfigurálva, hogy elvégezzék a kívánt funkciójukat. Tehát egy adott promoter, ami működés szempontjából egy uukleinsav szekvenciához kapcsolódik, képes a transzkripció végrehajtására, és a kódoló szekvencia esetében a kódoló szekvencia expresszálására., ha a megfelelő transzkripciós faktorok, stb. jelen vannak. A promoternek nem kell a nukleinsav szekvenciával egybe föggönek lennie, mindaddig, amíg úgy működik, hogy vezérli a transzkripciót és/vagy annak expresszióját. Tehát például közbeékelödö, nem-transzlálódó, de átírod© szekvenciák lehetnek jelen a promoterszekvencia és a kódoló szekvencia, között, ugyanúgy, mint átírt intronok, és a promoterszekvencia még ekkor is úgy tekinthető, hogy „működés szempontjából kapcsolva” van a kódoló szekvenciához.
A „rekombináns” szakkifejezés jelentése ehhen a leírásban egy nukleinsav molekula leírására egy genomiális, cDNS, virális, felszintetikus vagy szintetikus eredetű polinukleoíid, ami eredete, vagy a manipulációk következtében nem kapcsolódik ahhoz a polinukleotidhoz, vagy annak egy részéhez, amihez a természetben kapcsolódik. A „rekombináns” szakkifejezés jelentése egy fehérjével vág)'· polípeptiddel kapcsolatban az. hogy egy polipepíidet egy- rckombiná polinukleoiíd expresszáltatásával állítunk elő. A számunkra érdekes gént általában klónozzuk, majd egy transzformált szervezetben expresszáitaíjufc, az alábbiakban ismertetett módon. A gazdaszervezet expressxálja az idegen gént, ezzel előállítja a fehérjét expressziős korúim ények között.
A „kontroll elem” szakkifejezés jelentése egy olyan pöfinukleotid szekvencia, ami segíti a nuk.leotíd szekvenciának, amihez ♦·* Jt « » x »κ χ « «·» < * * * * χ ♦ * * * ' * * ♦ * * ♦ #Χ « * *> *' *-:**·♦
kapcsolva van, a transzkripcióját és/vagy transzlációját. A szakkifejezés vonatkozik prornoterekre, transzkripciós terminációs szekvenciákra, szignálokra, nem-tránszlálódő régiókra, beleértve az 5'-üTR-eket és a 3' -Ü'TR-eket, és ha így helyes, akkor a vezérszekveneíákat és egy kódoló szt
A „promoter* szakkifejezés jelentése a továbbiakban egy szabályozó régió, ami képes egy poiimeráz megkötésére, és egy hozzá működés szempontjából kapcsolt downstream Í3' irányú) nukleotid szekvencia transzkripciójának iniciálására, A jelen ta lálmány szempontjából egy promoterszekvencia minimális számú mgy egy vagy elemet tartalmaz, amur a számunkra érdekes szekvencia transzkripciója? miciálják, a háttérnél magasabb szinten. A promoierszekvencíán belül van egy transzkripciós iniciácíós hely, valamint fehérjekötó domének (konszenzus szekvenciák), amik felelősek az RNS vagy DNS poiimeráz kötődéséért, A promoter lehet például egy olyan nnkieinsa.v szekvencia, amit felismer egv DNS-dependens RNS poiimeráz („transzkriptáz”):, olyan jelként, ami a nukleínsavhöx való kötődést jelzi, és egy· specifikus ponton megkezdi az RNS transzkripcióját. A kötődéshez az ilyen tránszkriptáZOknák általában DNSre van szükségük, ami kétszálű azon a részen, ami a promoterszekvenciát és annak komplementerét tartalmazza; a templát résznek (az átírandó szekvencia) nem kell fcétsxáiúnak lennie. Az ens RNS polimerázok számos moterszekvenciát ismernek fel, amik jelentősen eltérőek lehetnek a transzkripció végrehajtásának hatékonyságában. Ha egy RNS poiimeráz kötődik egy prornoterszekvencíához, hogy inicíálja. a * ♦ X
Λ»* ·<
**«* ♦♦♦ transzkripciót, akkor az a promoterszekvencia nem része az átírt szekvenciának. Tehát az így előállított RNS átiratok nem tartalEgy kontroll szekvencia „vezérli” egy nukleinsav „transzkrípcíóját”, ha RNS vagy DNS polímeráz kötődik a promo tér szekvenciához, és átírja a szomszédos szekvenciát.
Egy „DNS-dependens DNS polímeráz” egy olyan enzim, ami egy DNS terápiáiról komplementer DNS kópiát szintetizál. Ilyen például a DNS polímeráz 1 Eschenchia coá-ból és a bakteriofág T7 DNS polímeráz. Az összes ismert DNS-dependens DNS polimeráznak szüksége van egy komplementer primőrre a szintézis iniciálásához. Megfelelő körülmények között, egy DNS-dependens DNS polímeráz képes komplementer DNS kópiát szintetizálni egy RNS templátróL
Egy „DNS - dependens RNS polímeráz*, vagy „transzkriptáz” egy olyan enzim, ami több RNS kópiát szintetizál egy kétszálú, vagy részlegesen kétszálú DNS molekuláról, ami rendelkezik egy (általában kétszálú! promoterszekveneiával, Az RNS molekulák („transzkripturnok” vagy „átiratok”) 5' - 3' irányban szinte tizálődutáni s zen transzkriptáz például az Eschenchia coh-ből származó DNS-dependens RNS polímeráz és a T7, T3 valamint SP6 bakteriofágból származó DNSEgy „RNS-dependens DNS polímeráz”, vagy „reverz transzkriptáz” egy olyan enzim, ami komplementer DNS kópiát szintetizál egy RNS templátróL Az összes ismert transzkriptáz rendelkezik azzal a képességgel, hogy komplementer DNS kópiát készít egy DNS templátróL, ezek tehát mind RNS-, mind DNS-depenfc* ** φ x*fc * * **♦« ·♦* dens DNS polímerázok. Mind az RNS, mind a DNS templátról való szintézis iniciálásához egy primőrre van szükség.
Áz „RNáz tí* egy olyan enzim, ami egy DNStDNS duplex RNS részét elbontja. Ezek az enzimek endonukleázok vagy exonukleázok. A legtöbb reverz transzkriptáz enzim normális körülmények között rendelkez RNáz H aktivitással, a poíimeráz aktivitása mellett. Azonban más RNaz H források is hozza ferbelek, hozzájuk kapcsolódó poíimeráz aktivitás nélkül. A lebomlás ered másik változat szerint, az RN'áz H egyszerűen különböző pontokon belevág az RNS-be, oly módon, hogy az RNS részei beolvadnak*, vagy lehetővé teszik, hogy enzimek kitekerjek. az RNS egyes részeit.
A „poiínukleotid”, „oligonukleotid*, „nukleinsav” és „nukleinsav molekula” szakkifejezések a továbbiakban nukleotidok bármilyen hosszúságú polimer formáit jelentik, legyenek azok ríbonukleoíidok vagy dezoxiribonukleotidok. Ez a szakkifejezés a molekuláknak csalt a primer struktúrájára vonatkozik. Tehát a szakkifejezés vonatkozik tripla-, dupla- és egyszálú DNS-re, valómmt tripla-, dupla- es pgyszálu RNS-re is.
sitások is. azaz például a metüezés és/vagy sapkázás, 'valamint a poiínukleotid módosítatlan formái is. Pontosabban, a „polinukleotíd*, „oligonukleotid’k „nukleinsav” és „nukleinsav molekula” poiínukleotid jelentése lehet polidezoxiríbonukleotid (ami 2dezom~D~riházt tartalmaz), poliribonukleotid (ami D-ribozt tartalmaz), a poiínukleotid bármilyen más típusa, ami egy purin vagy pirimidin bázis N- vagy C-glikozidja, valamint más polimerek, amik nem-nukleotidos gerincet tartalmaznak, ilyen például a poharaid (azaz például a pepiid nuklelnsavak (PNA) és a polimor<ί Φ XX «Φ Φ*
Φ φ φ Φ * X φ »*♦ * * φ φ φ *
XX ΦΦ Φ** ♦ Φ*** íhlino polimerek (kereskedelmi forgalomba hozza az Aotí-Virais, Inc., Corvallis, Oregon, Neugene márkanéven), és más szintetikus szekvencia-specifikus nukieinsav polimerek, azzal a feltétellel, hogy a polimerek a nukleobázisokat olyan konfigurációban tartalmazzák, ami lehetővé teszi a bázispárosodást és a bázisok egymás mellé kerülését, amint az a DNS-ben és az RNS -ben található. Szándékaink szerint a „polinukleotíd”, „olígonukleotid”, ,,nukieinsav* és „nukieinsav molekula” szakkifejezések kozott hossz alapján nem teszünk különbséget, és ezek a szakkifejezések egymás helyett használhatók. Ezek a szakkifejezések csak a molekula printer struktúrájára vonatkoznak, l ehat ez a szakkifejezés vonatkozik például a 3-dezoxí-2',5'-DNB-re, az olígodezoxiribonukleotid N3'P5 ‘ foszforamid átokra, a vette sí tett RN S-re , a két szálú és egy szálú DNS~re, valamint a kétszálü és egy szálú RNS-re, a DNS «RNS hibridekre, és peptidnukleinsavak valamint a DNS és RNS közötti hibridekre, és ide tartoznak a módosítások ismert típusai, azaz például az olyan jelölések, amik a szakterületen ismertek, & metílezés, a „sapkák”, egy vagy több természetes körülmények között előforduló nukleotíd helyettesítése egy-· analóggal, az internukleotid módosítások, azaz például a töltés nélküli kötésekkel (például metii foszfonátok, foszfötríészterek, foszforamídítek, karbamátok, stb.), negatív töltésű kötésekkel (azaz például foszforotíoáiok, foszforoditíoáfok, stb.) és a pozitív töltésű kötésekkel (azaz például aminoalkilfoszforamídátok, aminoalkílíbszfotríészterek), a függelék egységek, azaz például a föhétjék (beleértve a nukleázokaf, toxinokat, ellenanyagokat, szignálpeptideket, poli-L-lízint, stb.), az ínterkaiátorok (azaz például akrídin, pszoraién, stb.), a kelátorokat tartalmazók (azaz például férnek, radioaktív femek, bár, osddativ
X ** * fémek, stb,), az alkilatornkát tartalmazók, a módosított kötéseket tartalmazó (azaz például alfa anonier nukleinsavak, stb.), valamint a poünukleotid vagy oiigonukícotid módosítatlan formái. Pontosabban, a DNS dezoxiríbonukleínsav.
a „megcélzott nukleinsav régió vagy pont nukleinsav” szakkifejezés egy olyan nukleinsav molekulát jelent, amiben van egy ampiifíkálandó „célpont, szekvencia”, A célpont nukleinsav lehet egy szálú vagy két szálú, és a célpont szekvencia mellett tartalmazhat más szekvenciákat is, amik nem araplifikálódnak. A „célpont szekvencia” szakkifejezés a megcélzott nukleínsavnak az amplíbkálandó nukleotid szekvenciájára vonatkozik. A célpont szekvencia tartalmazhat egy próbával hihridizálódó régiót a megcélzott molekulában, amivel egy próba a kívánt körülmények között stabil hibridet képez, A „célpont szekvencia” tartalmazhatja még azokat a komplexképző szekvenciákat is, amikkel az oligonukleotid primerek komplexet képeznek.
es annk meghosszabbodnak, a cei használva. Ahol a célpont nukleinsav eredetileg egy szálú, ott a „célpont szekvencia;5' szakkifejezés vonatkozik azzal a. célpont nuklemsavban jelen levő „célpont, szekvencia vari komplementer szekvenciára is. Ha a „célpont nukleinsav” eredetileg kétszálú, akkor a „célpont, szekvencia'’ szakkifejezés vonatkozik mind a.
sz (v), mind a mínusz (·) szálakra.
A „primer” vagy „oiígonukteotid primer” szakkifejezés jel tése a továbbiakban egy olyan oligonukleotid, ami úgy hat, hogy iniciálja a komplementer DNS szál szintézisét, ba olyan körülmények közé helyezzük, amikben egy er extenziós te szintézise indukálódik, azaz nukleoUdok ős polimerizálást índueR. azaz például DNS vagy RNS polímeráz tt ♦ X X *« » ♦♦* * X * ν ΐ ♦ X χ <χ «»χ ♦ * » ' ' Κ X * χφ«. * »**♦ ben, megfelelő hőmérsékleten, pH-η, fémion koncentráció és sókoncentrácíő mellett. A primer előnyösen egyszálú, az amplífi·kálás maximális hatékonysága érdekében, de egy másik változat szerint lehet kétszálú is. Ha kél szálú, akkor a primer! először kezeljük, hogy szálait szétválasszuk, mielőtt az extenziös termékek előállítására használ nk. Ezt a denaturálásd lépést tipikus esetben bővel hajtjuk végre, de egy másik változat szerint lúggal is elvégezhetjük, majd semlegesítjük. Tehát egy „primer* komplementer egy templáttal, és hidrogénkötéssel vagy hibridizációval a templáttal, ezzel létrehozva egy prímer/ tempt a szintézis polímerázzal való iniciálására, és a komplex kovalens kötéssel kapcsolódó bázisokkal hosszabbodik, a 3' végén, és komplementer a templáttal, a DNS szintézis eljá-
A továbbiakban a „próba' vagy „obgc kifejezés egy olyan struktúrára vonatkozik, ami tartalmaz egy előzőkben defmiáltt. polmukleotidot, ami olyan, nukleínsav szekvenciát tartalmaz, ami komplementer a megcélzott, analizálandó nukleinsavban levő szekvenciával. A próbák polinukleotid régiói lehetnek DNS-höl, és/vagy RNS-böb és/vagy szintetikus nukieotid analógokból. Ha egy „oligonukleotid próbát* kell használni egv 5'nukleáz esszében, azaz például a TaqMan™ technikát, a próba tartalmaz legalább egy fíuoreszcert és legalább egy kioltót, amit a reakcióban használt polimeráz 5' endonukleáz aktivitással emésztünk, azzal a céllal, hogy kimutassunk bármilyen arnplifíkált, megcélzott oligonukleotid szekvenciát. Ebben a szővegősszefügaz számú kötést tartalmaz az B végéhez közel, így a használt S'-3' nukleáz aktivitás hatékonyan lebontja a megkötött próbát, ezzel elválasztva *♦ #*** *·'<· » » ♦' ♦ * ♦ κ* ***» / ♦* «♦>.# «♦* ' ♦ *;*»» a fiuoreszeereket és a Máitokat Ha egy oligonukleotid próbát használunk a TMA technikában, akkor az megfelelő módon jelezve van, amint azt az alábbiakban ismertetjük.
nyilvánvaló.
híbrídízálódó szekvenciáknak nem kell tökéletesen komplementereknek lenni ahhoz, hogy stabil hibrideket kapjunk. Számos esetben stabil hibridek képződnek akkor is, ha a bázisok körülbelül 1 (5%-a helytelenül illeszkedik, elbánvaa négy vagy tana megfelelően, a továbbiakban a „komplementer” szakkifejezés egy olyan oiigom.ikleotid.oi jelent, ami stabil duplexet képez a. „kompiémenterével”, a vizsgálat körülményei között, általában akkor, ha a homológía 90%-os, vág}/ nagyobb,
Á „híbrídizáP és „hibridizáció” szakkifejezés olyan nukieotid szekvenciák közötti komplexek kialakulására utal, amik elég komplementerek ahhoz, hogy a Watson-Criek bázispárosodással komplexeket képezzenek. Ha. egy1' primer „hibridizáF a célponttal ftempláí), akkor az ilyen komplexek (vagy hibridek) elég stabilak ahhoz, hogy biztosítsák a szükséges priming funkciót, például azt, jgy a DNS polimeráz imciáija a DNS szintézist.
A továbbiakban a „kötő pár” szakkifejezés jelentése első és második molekula, amik specifikusan kötődnek egymáshoz, azaz komplementer polinnkfeötíd párok, amik képesek nukleínsav duplexeket képezni. Á kötő pár első tagjának „specifikus kötődését” a kötő pár második tágjához egy mintában az első tagnak a második taghoz való kötődése, vagy fordítva, igazolja, nagyobb affinitással és spéciit fással, mint a .minta többi komponenséhez, A kötő pár tagjai közötti kötődés tipikus esetben nem-kovalens. Hacsak a szövegösszefüggés néni jelöli Világosán másképpen, akkor az „affinitás molekula”, és „megcélzott: analizálandó anyag”
Χ*Φ V Φ * » * *:
«·♦ Φ XX ♦ *· * ♦
Α «*Φ κ « ** AH
ϊ. «te szakkifejezéseké a továbbiakban egy kötő pár első, illetve 2. tagjára vonatkoztatva használjuk.
Á „specifikus kőtő molekula* és „affinitás molekula’’ szakkifejezéseket a továbbiakban egymás helyettesítésére is használjuk, és olyan molekulát értünk alatta, ami szelektive kötődik, kémiai vagy fizikai erőkkel, és ezzel a mintába levő anyagot ki lehet mutatni. A „szelektív kötődés” szakkifejezés azt jelenti, hogy a molekula inkább kötődik a számunkra érdekes célponthoz, vagy
eiaa affinitással kötődik a célponthoz, mint más moleku^ JS molekula például kötődik egy lényegében kompszekvenoiához, és nem kötődik a nem-rokon
Bgy kétszálú DNS „olvadási hőmérséklete”, vagy „Tm” értékét úgy definiáljuk, mint azt a hőmérsékletet, aminél a DNS helikális struktúrájának fele elvész, a melegítés, vagy a párok között a hídrogénkotés más disszociációja következtében, azaz például savas vagy lúgos kezelés, vagy hasonlók hatására. Bgy DNS molekula
Tm értéke függ a hosszától és a bázis-összetételétők A GC bázispárokban gazdag DNS molekuláknak magasabba Tm értékük, mint azoknak, amik bőven tartalmaznak AT bázis-párokat. A DNS elválasztott száljai spontán módon reasszoeiálődnak, vagy' egymáshoz illeszkednek, duplex DNS-t képezve, ha a hőmérséklet a Tm érték alá csökken. A nukleínsav ifihridlzáeiős legnagyobb sebességét a Wn alatt körülbelül 25 '’C- szal kapjuk. A Tm értékét az alábbi egyenlettel lehet megbecsülni: ΊΤη^ύΟ,Β+Ο,ΑΙ (Marmur és mísai: Journal of Molecuiar Biology 5, 109-118
A továbbiakban a „biológiai minta” szakkifejezés jelentése egy olyan alanyból vett szövetminta vagy folyadékminta, ami álra♦ *»* «*** «* ♦ Φ * * *♦ «· í * ♦ Φ ♦ ♦ >***
Iában tartalmaz az alany áltál termelt ellenanyagokat. A tipikus minták, amik ilyen ellenanyagokat tartalmaznak:, a szakterületen ismertek, és ide tartozik, anélkül hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a vér, a plazma, a szérum, a székletanyag., a vizelet, a csontvelő, az epe, a germdnlyabék, a nyirok, a borminták a légúti, bél- és genítourinális traktusok szekréciói, könny, vérsejtek, szemek, biopsziák és in nitro sejttenyészet összetevői, dícionákt közeget, amik a sejteknek és szöveteknek a tenyésztő közegben valő szaporításából származnak:, azaz például a rekombínáns sejtek és sejtkomponensek szaporításából
A továbbiakban a ^jelölés* és „kimutatható jelölés* szakkifejezés jelentése egy kimutatható molekula, ideértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a radioaktív izotópokat., a lluoreszcereket, a kemítumineszeereket, a kromofórokat, az enzimeket, az enzim-szufoszhátokat, az enzim ko-faktorokat, az enziminhibitorokat, a festékeket, a fémionokat', a fémoldatokat, a ligándumokat (azaz például a biotínt, avídínt, sztreptavidint vagy hapténeket) és hasonlókat. A „finoreszcer” szakkifejezés jelentése egy olyan anyag, vagy annak egy része, ami képes fluoreszcenciára a kimutatható tartományban.
Mielőtt a jelen találmányt részletesen ismertetnénk, az nyilvánvaló, hogy a jelen találmány nem korlaíozöcák kiválasztott kiszerelési formákra vagy eljárási paraméterekre, mivel ezek. természetesen változhatnak. Az is nyilvánvaló, hogy az itt használt terminológia csak azt a célt szolgálja, hogy le írj uk á jelen találmány különböző megvalósítási módjait, és nem szándékunk ezzel korlátozni a jelen találmány oltalmi körét.
Bár számos készítmény és módszer, ami hasonlít, vagy ekvivalens az itt ismertetettekkel, használható a jelen találmány gyakorlatában, az előnyben részesített anyagokat: és módszereket az alábbiakban ismertetjük.
Amint azt az előzőkben megjegyeztük, a jelen találmány HÍ pnmerek, próbák es diagnosztikai módszerek íelleöezesen alapul, amikkel egy biológiai mintában pontosan ki lehet mutatni a B19 parvovírus fertőzést. A módszerek érzékeny, nukleinsavalapú kimutatási technikákon alapulnak, amik lehetővé teszik a Rí9 parvovírus célpont nukleinsav szekvenciák azonosítását, kísmennyíségű vírust tartalmazó mintákban.
Pontosabban, a jelen találmány szerzői a B19 parvovírus genomban olyan jellemzőket azonosítottak, amik kívánatos célpontjai a. diagnosztikai teszteknek. Az ezekből a régiókból származó primerek és próbák rendkívül jől használhatók a B19 parvovirus tertözcs kimatatasara biológiai mintákban.
Az előzőkben ismertetett BÍ9 parvovírus primerek és próbák nukleínsav-alápú esszében használhatók a, humán B19 parvovírus fertőzés kimutatására biológiai mintákból.
Pontosabban, az ezekben az esszékben használt primerek és próbák előnyösen a B19 parvovírus genomnak egy körülbelül
4,7 kilobázis méretű fragmenséből száimazoák, ami megfelel a 218-4678-as pozíciónak IShade és mtsai: d. VIrology 58, 921-936 (1986)]. Ennek a régiónak két különböző B19 parvovírus izolálómból származó nukleotid szekvenciáját mutatjuk be az alábbiakban, a 3Á -C. ás 4A-C. ábrákon, Amint azt az előzpkben elmagyaráztuk, ez a fragmens tartalmazza az NS1, VP1 és VP2 kódoló régiókat.
Φ* φ Φ« Φ * Φ:
X φ..........X -* ♦
Λ ' ♦** # ' » $ X « * * ΦΦ -* */·*>:
A jelen taíáteány szerinti esszében különösen előnyben részesített prímeteket és próbákat a B19 parvovírus genom erősen konzerválódott régióiból terveztük, ami lehetővé teszi a. különböző izolátumok által okozott B19 parvovírus
Amint azt. az alábbiakban ismertetjük, a B19 parvovírus genomnak egy erősen konzerválódott régiója található abban a 709 házispár méretű régióban, ami a 2936-3635-ös pozíciókat fedi le. a számozás a Shade és munkatársai cikké ben megadott számozásnak felel meg [Shade és mtsai: J. Virology 58, 923-936 (1986)5 Ez a régió a genom VPi régiójában található. Ennek a ré giónak ri 21 különböző B19 parvovírus izolátumból származó szekvenciáját a 2A-U. ábrákon mutatjuk be. Tov;
tűmből származó szekvenciákat a 11A 1 ÍZ. ábrákon mutatjuk
SZ' a azt mutatta, ez a körülbelül 98 -99,565-os szekvencia homológját mutat izolátumröl ízölátümra, és ezért ez egy nagyon kívánatos célpont szekvencia. A primerek és próbák tervezéséhez még kívánatos régió az a 379 bázispár méretű régió, ami a VP 1-ben található, ami a 30733442-es pozíciókat fedi le, a számozás a Shade és munkatársai cikkében megadott számozásnak felel meg (Shade és mtsai: d. Virologv' 58. 923-936 (1986)), valamint: az 1. ábrán ismertetett 214 bázispár méretű fragmens, ami a 4,7 kilobázís méretű .fragmens 3’ részében fordul elő, és 4728-4941-es pozíciókat fedi le, a számozás a Sha.de és munkatársai cikkében megadott számozásnak felel meg [Shade és mtsai: J. Virology 58, 923-936 (1986)].
A 4,7 kilobázís, 790 bázispár és 379 bázispár méretű régiók könnyen előállíthatok további izolátumokból is, a poíimeráz láncreakciókban az ezekben a szóban forgó régiókban talált B19 parvovírus szekvenciák részeit használjuk primerként, példa to*. m* to *** .*· *«·* azokat, amiket itt ismertetünk, valamint a 4,683,195, 4,683,202 és 4,889,818 számú Amerikai. Sgyesult AUamők-foelí szabadalmi leírásban, ismertetnek, és a jelen, találmányban biztosított szekvenciák alapján. A kívánt szekvenciákkal rendelkező nukleotid szekvenciák előállításának egy másik módszere az, ha egy-máshoz illesztjük átlapoló szintetikus olígonukleotidok komplementer szettjét, amit hagyományos, automatizált pohnukleotid szintetíáí.orral állítunk elő, majd egy megfelelő ligázzai lígáljuk, és a ligáit nukleotid szekvenciát poíimeráz láncreakcióval amplifethe Natíona Miután a szék
Jayaraman és mtsai; Proceedings of the Hationa
Sciences, _______ veneiákat előállítottuk, vagy izoláltuk, a megfelelő vektorban vagy replikonhan .klónozhatjuk. A szakterületen jártas szakember számára számos klónozó vektor ismert, és egy megfelelő klónozó vektor kiválasztása ízlés dolga. A megfelelő vektorok közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a plazmidok, a tagok, a transzpozonok, a kozmídok, a kromoszómák vagy vírusok, amik replikáciöra képesek, ha a megfelelő szabályozó elemekhez kapcsolódnak.
A rekombináns kiónokat könnyen azonosíthatjuk restrikció ős enzimes elemzéssel és poliakrilamid. vagy agarőz gél elektrofe-rézissel, a szakterületen jól ismert technikákat használva, amiket az alábbi példákban ismertetünk.
Az ebben az eljárásban használt primerek és próbák ezekből a szekvenciákból származnak, és standard technikákkal könnyen megszíntetizáihatök, azaz például szilárd fázisú szintézissel, foszíoramidít kémiát használva [4,458,066 és 4,41.5,732 számú Amerikai Egyesült Államok-heti szabadalmi leírás; Beaueage és mtsai; Tetraheírou 48, 2223-2311 (1992j; Applied * ««♦« ** φ « χ * Φ Χ· λ *·«♦ X Φ.
Biosystems User Bulletin No, 13 (1987. április 1.)]. Más kémiát szintetikus módszer lásd például a Narang és munkatársai által ismertetett fcszíotriészíer módszer [Narang és mtsai: Methods in Enzymology 68, 90 (1979)], valamint a Brown és munkatársai által ismertetett íoszfodiészter módszer
Brown és mtsai:
Methods in Enzymology 68, 109 (1979)]. Poli(A) vagy poli{Cl, vagy más, nem-komplementer nukleotid extenziőkat építiietünk be a próbákba, ugyanezeket a módszereket alkalmazva. Hexaeliién oxid kiterjesztéseket is kapcsolhatunk a próbákhoz, a szakterületen ismert módszerek alkalmazásával ÍCload és mtsai: Journal of the American Chemical Society 113, 6324-6326 (1991); 4,914,210 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás (Levenson és munkatársai); Durand és mtsai: Nueléic
Aeíds Research 18, 6353-6359 (1990); Horn és mtsai:
Tetrahetron Letters 27, 4705-4708 (1986)]. A primer szekvenciák hossza általában 10-75 nukleotid, azaz például 15-60, 20-40, és így tovább, pontosabban körülbelül 18-40 nukleotídből állnak, illetve a megadott tartományon belül bármilyen hosszúak lehetnek. Egy tipikus próba hossza 10-50 nukleotid, azaz 15-40, 1830 és így tovább, illetve a megadott tartományon belül bármilyen hosszúak lehetnek.
Emellett a próbák a kimutatáshoz jelölésekhez kapcsolhatók. Számos módszer ismert arra, hogy oligonukleotid származékokat állítsunk elő, reakciöképes funkcionalitásokkal, amik lehetővé teszik egy jelölés hozzáadását. Például, számos megközelítési mód ismert próbák bíotinilezésére, oly módon, hogy radioaktív, fluoreszcens, kemílumíneszeens, enzimatíkus vagy elektronsűrű jelöléseket kapcsolhatunk hozzá avídinen keresztül ÍBroken és mtsai: Nyeleié Acids Research 5, 363-384 (1978)1, amiben ? *. < * *: ' » * Λ *
V * * * :♦»*·* ·*·*·♦' * *«** leírják ferrttín-avidin-foioön jelölések használatát, és Ghollet és munkatársai módszerét. [Ch.ol.lei: és mtsai: Nucleic Aeids Research 13, 1529-1541 (1985)], amiben öligonuRleotídoR 5' términáíísának bionnilezését írják le, egy aminoaikiifoszforamid li kér karon keresztül Számos módszer ismert olyan amínmszár mazék oligonukleotidok megszintetizálására, amik könnyen jelölhetők fluoreszcens vágj más típusú vegyüleíekkel, amik amínreaktív csoportok származékai, azaz például ízotiocianát, N~bíd~ roxiszukcinímid vagy hasonló [Connolly: Nucleic Aeids Research 15, 3131-3139 (1987); Gibson és mtsai; Nucleic Aeids Research
15, 6455-6467 számú Amerikai
Államok-beli szabadalmi leírás (Miyoshi és munkatársai)). Léteznek módszerek oligonukleotidok szulfliídríl származékainak szintetizálására is, amik reagálhatnak tiol-specifikus jelölésekkel (4,757,141 számú Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírás {Fung és munkatársai); Connolly és mtsai: Nucleic Aeids Research 13, 4485-4502 (1985); Spöat és mtsai: Nucleic Aeids Research 15, 4837-4848 (1987)). A szakirodalomban közöltek a DNS Íragmensek jelölésének alapos összefoglalóját [Máttkews és mtsai: Analytical Bíochemistry 169, 1-25 (1988)].
A próbák lehetnek például fluoreszcensen jelöltek, egy fluoreszcens molekulát kapcsolva, a próba nem-ligáló terminálisához kapcsolva. A megfelelő fluoreszcens jelölés kiválasztásához iránymutatás található a szakirodalomban [Smith és mtsai: Methods in Enzymology 155, 26Ö-301 (1987); Karger és mtsai; Nucleic Aeids Research 19, 4955-4962 (1991); Baugland: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecnlar Probes, Inc. , Eugene, OR) (1989)]. Az előnyben részesített fluoreszcens jelölések köze tartozik a fluoreszceín és annak származékéi ♦ * »«♦ « *.·*** «*· * * Λ » X »
(4,318,846 számú Amerikai Egyesült Áüamok-befi szabadalmi leírás; Lee és mtsai: Cytometry lö, 151-164 (1989); a ó-FAM, JOE, 1 vagy NAN-2 és lók}.
Emellett a. próbákat jelölhetjük akridinium észterrel (AE), az alábbiakban ismerteteti technikák használatával. A jelenleg használt technológiák lehetővé teszik azt, hogy' az ÁE jelölést a próbán belül bárhová tegyük [Nelson és mtsai: „Detection of
Esters by Chemiluminescence”, lm Nonisotopic Probirtg,
and Sequencing, szerte: Ericka, 3, L. és mtsai': Academic Press, San Diego, CA (1995); Nelson és mtsai; „Application of the Hvbridizaüon Protection Ássay (ΗΡΑ) to PCR” ih: The Polymerase Chain Reaction, szerkó Mullis és munkatársai, Birkhauser, Boston. MA (1994); Weeks és mtsai: Cím. Chem. 29, 1474-1479 (1983); Bem és mtsai: Clín. Chem. 34, 2087-2090 (1988)( Egy AB molekulát' közvetlenül kapcsolhatunk a próbához, erre a célra nem--nukleotíd-alapú línker kar kémiát használva, ami lehetővé teszi azt, hogy a jelölést a próbán belül bárhová tegyük (5,585,481 és 5,185,439 számú Amenkaí Egyesült Allamok-heb szabadalmi leírást
Néhány megvalósítási mód szerint egy’ belső kontrollt (IC) vagyz belső standardot adunk hozzá, hogy kontrollként szolgáljon a cél befogásához és amplífikálásához. Az IC előnyösen tartalmaz egy olyan szekvenciái:, ami eltér a megcélzott szekvenciától., és képes a próba szekvenciákkal híhrídizáiódni, amit arra használunk, hogy a szervezetre specíöfcus oligonnkleotíddf elválasszuk a mintától, és amplifikáfhatő. Az IC használata, lehetővé teszi az elválasztási eljárás, az amplifikálási eljárás és a kimutatási rendszer szabályozását, és lehetővé teszi az esszé teljesítőképességének í
V ··» « '**»· követését, valamint a minták mennyiségi meghatározását, Egy reprezentatív szekvenciát, amiből az IC előállítható, a 12. ábrán mutatjuk be. .Az IC-t bármilyen ponton bevihetjük, például a lizáló pufferhen. Az egyik megvalósítási mód szerint az IC tartalmaz M13 egyszálú DNS-t, ami egy B19 parvovtrus szekvenciát, tartalmaz,, és tartalmaz egy egyedi szekvenciát, arni hihridizálőáik a próbával, például tartalmaz szekvenciákat a V.P1 régióból, ahol a megcélzott szekvenciát, módosítjuk, oly módon, hogy 5-20 bázist, vagy többet, előnyösen 5 15 bázist, azaz például 5, 10 vagy 15 bázist, vagy ezen a tartományon belül bármennyi bázist helyettesítünk vagy kivágunk. A helyettesített vagy kivágott bázisok előnyösen a megcélzott. szekvencia teljes hosszában előfordulnak, azaz csak két vagy három egymást követő szekvenciái helyettesítünk. Tehát péla megcélzott szekvencia vin
ACCT (91. számú szekvencia), akkor a szekvenciát helyettesíthetjük például az AGCTAGACCTGCATGTCACTG szekvenciával í, számú szekvenciái az IC-ben.
A szilárd hordozó tartalmazhat még a belső standardra (IC) specifikus próbákat is, ami megkönnyíti a befogást, amikor az IC próbát használjuk. Az IC próba adott esetben kapcsolható egy kimutatható jelöléshez, ami eltér a eel-szekvencia kimutatható jelölésé tök Áz egyik megvalósítási mód szennt, amikor a kimutatható jelölés egy fiuorofór, akkor az IC-t spektrofotometriásán határozhatjuk meg, valamint a kimutatási vizsgálatok korlátozásával. Tipikus esetben az IC kopiaszáma, ami nem zavarja a célpont kimutatását, ügy határozzuk meg, hogy az IC-t a. célpont rögzített MEjével titráljuk, előnyösen az alsó végen, és egy' standard görbét generálunk, a nemzetközileg elfogadott NE mintát hígítva. A B19 .# Λ· jtV&V
Ά. ·* *......
♦Λ parvovírus mennyiségi meghatározásához nyolctagú panelt használunk, 8000 NE - 125 NE között
Egy másik megvalósítási mód szerint egy IC-t, az alábbiakban ismertetett módon, a mintából izolált. RNS-sel kombinálunk, a szakterületen jártas szakember számára ismert, és az alábbiakban ismertetett standard technikákat használva. Az RNS~t azután reverz transzkripcióba visszük, reverz transzkriptáz használatával, így kapunk egy DNS kópiát. A cDNS szekvenciát adott esetben amplífikálhatök (azaz például polímeráz láncreakcióval), jelzett primerek használatával, Az amplifíkáciös termékeket elválaszt] úk, tipikus esetben elektroforézissel, és a radioaktivitás mennyiségét (az amplifikált mennyiséghez viszonyítva) meghatározzuk. A. mintában levő mRNS mennyiségét azután úgy határozzuk meg, hogy összehasonlítjuk az ismert standardok, által adott
Az előzőkben ismertetett printereket és a polímeráz láncreakció (PCR)· alapú technikákban, ezzel a ©19 parvovírus fertőzést a biológiai mintákban. A polímeráz láncreakció az egy nukleinsav molekulában, vagy molekulák elegyében levő, megcélzott nukleinsav szekvencia ampbhhálásának egy technikája. A polímeráz láncreakcióban egy primer -párt használunk, fölöslegben, hogy hibridizálódjon a megcélzott nukleinsav komplementer szálaihoz. Mindegyik prímért, egy polímerázzal hosszabbítunk meg, a megcélzott nukleinsavat használva templátként. Az extenziós termékek maguk is célpont szekvenciák lesznek, az eredeti célpont szálról való disszociáció után. Az új prím ereket azután híbridizáltatjuk és egv polimerázzal meghosszábbítjuk, és a ciklust megismételjük, ezzel geometrikusán növeljük a célpont szekvencia molekuláinak számát. A ♦ ·*.
'ΐ Κ <!· Λ * « megcélzott öukfems&v szekvenciák anrplinkalasára használt polimcráz láncreakció módszer a szakterületen jól ismert, és publikált [Innis és munkatársai, szerka PCR Protocols (Academic Press, NY, 19901; Taylor; Polym éra se chain reaction: basa; prínciples and áutómátión, fe: PCR: A Practical Approach, szerka McPherson és munkatársai, 1R.L Press, Oxford (1991); Saiki és mtsai: Natúré 524, Í63 (1986); valamint a 4,683,195, 4,683,202 és 4,889,818 számú Amerikai Egyesült Államok-belí szabadalmi viszonylag ;az az n, a oligonukleotid primerekt megcélzott nukleotid szekvenciát közreveszik, olyan orientációban, hogy 3' végük egymással szemben áll, és az egyes primerek egymás irányában hosszabbodnak- A polinukleotíd mintát extraháljuk és denaturáljuk, előnyösen bővel, és az első és második primerrel hibrídizáltatjuk, amik móifolöslegben vannak jelen. A polimerizációt a négy dezoxiribonukíeotid trifoszfát (dNTP dATP, dGTP, dCTP és d'TTP) jelenléte katalizálja, egy' pniner és templát-dependens polínukleotid-polimerizáló ágens használatával, azaz például bármilyen enzimmel, ami képes primer extenzíós termékek előállítására, ilyen például az Rschetichfe cná DNS poiimeráz I, a DNS pollmeráz 1 Elenow íragmense, a T4 DNS pofimeráz, a böstabíl DNS polimerázok, amiket Thermus aguaticiísfedi (Táp), ez külön bűző forrásokból szerezhető be (például Perkin Elmer), a Thermtts tbennppfefes-ből (United States Biocbemícals), a fcsfc símra£henhöpfefes~höl (Bio-Rád j, vagy a Tharmococetm híorahs-böl („Vént* pohmerás, New Englánd Biölábs) lehet beszerezni, Ez két „bosszú terméket” eredményez, amik a megfelelő printereket az 5' végükön tartalmazzák, kovalens kötéssel az * * *«* * ν «
X X Λ* χχ * * **< & :>
'>'* * * <ν-Λ »: λ·' eredeti .szálak újonnan szintetizált komplementjeihez kapcsolva. A reakciőelegyben azután újra beállítjuk a. polímerizálásí körülményeket, azaz példává csökkentjük a hőmérsékletet, ínaktiválunk egy denaturáló ágenst, vagy több pokmerázt adunk hozzá, és beindítunk egy második ciklust. A második ciklusban megkapjuk a két eredeti szálat, a két hosszú terméket az első ciklus1, két hosszú terméket, ami az· eredeti szálakról replíkálödik, és ,rövid terméket^, amik a hosszú termékről replikákklnak, A rövid termékek szekvenciája a megcélzott: szekvencia, az egyes végeken egy primőrrel. Minden ű ciklusban további két bosszú termék keletkezik, és számos rövid termék. amiknek a száma egyenlő az előző ciklus végén megmaradt bosszú és rövid termékek számával. Tehát a megcélzott szekvenciát tartalmazó rövid termékek száma az egyes ciklusokban exponenciálisan nő. A polímeráz láncreakciót előnyösen egy kereskedelmi forgalomban levő hőciklus berendezéssel hajtjuk végre, azaz például egy
Az RNS-ek úgy ampákkal hatók, hogy a mRNS-t cDNS-sé írjuk át,majd polímeráz láncreakciót hajtunk végre (RT-PCR), az előzőkben ismertetett módon. Egy másik változat szerint egyetlen enzimet használunk mindkét lépésben, az 5,322,770 számú Amerikai Egyesült Allamok-belí szabadalmi kiírásban ismertetett módon, A mRNS-t is reverz transzkripcióba vihetjük, cDNS-sé átírva, maid aszimmetrikus rés ilgáz láncreakciót (RT-AGLCR) használhatunk, Marshall és munkatársai leírása szerint [Marsball és mtsai: PCR Mefh. App. 4, 80-84 (1904)|.
A fluorigén 5' nukleáz esszé, ami TaqManÍV5 esszé néven is ismert (Perkin Elmer) egy erőteljes és verzatilis polímeráz láncreakció alapú kimutatási rendszer nuklelnsav célpontokra. Tehát az itt. ismertetett BÍR parvovirus genom régióiból származó primerek és próbák használhatók a TaqMarr M elemzésekben, hogy a fertőzés jelenlétét kimutassuk egy biológiai mintában. Az elemzést hőciklussal összefüggésben hajtjuk végre, követve a fluoreszcencia szignál keletkezését. Az esszé rendszer kihagyhatővá teszi a gélelektroforézis elemzés használatát, és képes mennyiségi adatokat generálni, ami lehetővé teszi, a célpont kőA fluort gén 5' nukleáz esszét egyszerűen végre lehet hajtani, például az AmplTaq Goid™ DNS poíimeráz használatával, aminek endogén 5' nukleáz aktivitása van, ezzel emésztve egy belső oligonukfeotid próbát, ami mind fluoreszcencia riporter festékkel, mind egy kioltőval jelezve van. (Holland és mtsai; Proceedmgs of the National Aeademy of Seienees, HSA 88, 72767280 (1991); Lee és mtsai; Nucleie Acids Research 21, 37613766 (1993)]. Az esszé eredményeit úgy mutatjuk ki, hogy mérjük. a fluoreszcencia változását, ami az ampliflkáiási ciklusban fordul elő, ahogy a fluoreszcens próbát emésztjük, szétkapcsolva a festék és kioltó jelöléseket, ezzel növelve a fluoreszcencia szignál erősségét, ami arányos a megcélzott DNS amplifíkálásávaí.
Az amplifikáció termékeit kimutathatjuk oldatban vagy szilárd hordozók használatával. Ebben a módszerben a
TaqMan™ próbát úgy tervezzük meg, hogy' ftibrtdizálödjon egy megcélzott szekvenciához a kívánt poíimeráz láncreakció terméken belük A TaqMan™ próba 5' vége tartalmaz egy fluoreszcens riporter festéket, A próba 3' vége blokkolva van, ezzel megakadályozva, a próba extenzióját, és tartalmaz egy festéket, ami kioltja az S' ftuorofőr fluoreszcenciát. Az ezt követő amplifíkálás során az 5 fluoreszcens jelölés lehasad, ha egy 5' exonuk• χ ♦ «Φ*« **♦* * * > Φ Φ * -♦ «ΦΦ Φ *
Φ Φ * ♦ * «*· leáz aktivitással rendelkező polimeráz jelen van a róakeióeleavben. Az 5' fluorofór kivágása a fluoreszcencia növekedését eredményezi, ami kimutatható.
Pontosabban, az oligonukleotid próbát úgy állítjuk a oróba legalább egv egvszálű konformációban létezik, ha nincs gy bibridízálődva, amiben a kioltó molekula elég közel van a riporter molekulához, hogy ki tudja oltani a riporter molekula fluoreszcenciáját Az oligonukleotid próba szintén legalább egy konformációban létezik, ha egy megcélzott poknukleotidhaz van hibridizálödva, oly módon, hogy a kioltó molekula nincs elég közel a. riporter molekulához, hogy kioltsa a riporter molekula fluoreszcenciáját Ezeknek a hibridizált és nem-hibridizálf konformációknak az adoptálásával a próbán levő riporter molekula és kioltó molekula eltérő fluoreszoeneiás jel- erősségeket mutat, ha a próba Inbridizáiva van, illetve nincs hibridfoalva. Ennek eredményeképpen lehetséges annak meghatározása, hogy a próbán hlbridizáite vagy nem, a riporter molekula, a kioltó molekula, vágy ezek kombinációja fluoreszcencia-intenzitásának változása alapján. Emellett, mivel a próba úgy tervezhető meg, hogy a kioltó molekula oltsa ki a riporter molekulát, ha a próba nem hibridizált, a próba úgy tervezhető meg, hogy a riporter molekul köriátozott fluoreszcenciát mutasson, hacsak a próba nincs híbridizálva. vagy emésztve.
Ennek megfelelően a jelen találmány tárgya eljárások egy megcélzott B19 parvovírus nukieotid szekvencia ampliflkálására, 5'--3' nukleáz aktivitással rendelkező nukieinsav polimeráz használatával, vagy egy vagy több olyan prixnerrel, amik képesek a megcélzott B19 parvovírus szekvenciához hibridizálódni és egy van oligonukleotid próbával, ami képes a B19 parvovírus szék47
Vandához a primerhez viszonyítva 3' irányban bíbridizálödní. Az amplifíkálás során a polimeráz megemészti az oligonukleotid próbát, ha a megcélzott szekvenciához van híhridizálódva, ezzel elválasztva a riporter molekulát a kioltó molekulától. Az amplifíkáiás végrehajtása során a riporter molekula, fluoreszcenciáját követjük, és a fluoreszcencia összhangban van a nukleínsav amplifikalással A riporter molekula előnyösen egy fluoreszcetn festék, és a kioltó molekula előnyösen egy rhodamin lesték..
Miközben a primerek és próbák hossza változhat, a próba szekvenciákat űgv választjuk meg, hogy olvadáspontjuk, alacsonyabb legyen, mint a primer szekvenciáké. Tehát a primer szekvenciák általában hosszabbak', mint a próba-szekvenciák. Tipikus esetben a. primer szekvenciák mérete lÜ-75 nukieotid, tipikusabb esetben 20-45 nukieotid. A tipikus próba mérete 10-50 nukieotid, még tipikusabb esetben 1.5-40 nukieotid.
Ha. egy szilárd hordozót használunk, akkor az oligonukleotid próba számos különböző módon lehet hozzákapcsolva a szilárd hordozóhoz. Például a próba úgy kapcsolódhat: a szilárd hordozóhoz, hogy1' a. próba 3’ vagy 5' termnalís nukleotidja kötődik a hordozóhoz. Még előnyösebb, ha a próba a szilárd hordozóhoz egy íinkereo keresztül kapcsolódhat, ami azt a célt szolgálja, ba bizonyos távolságra legyen a szilárd hordozótól. A linker általában 15-30 atom hosszúságig előnyösebben legalább 15-30 atom hosszúságú. A linker szükséges fiossza az éppen használt szilárd hordozótól függ. Például egy' hat atomos üti kér általában elég, ha sok keresztkötést tartalmazó polisztirolt használunk szilárd hordozóként.
A szakterületen számos különböző linker ismert, amik arra. használhatók, hogy az oligonukleotid próbát a szilái
A» ΦΦ** *»*
Φ * « *
·* <·* .♦
kapcsolják. A linker lehet bármilyen vegyület, -ami nem zavarja szignifikánsan a cél· szekvenciának a szilárd hordozóhoz kapcsol próbához való bihridizáeióját. A linket lehet egy homopolimer öli·· gonukieotid, amit automatizált, szintézissel könnyen hozzá lehet adni a Iinkerhez. Egy másik változat szerint polimerek, azaz például funkcionalizált polietilénglikol használható linkerként. Ezeket a polimereket előnyben részesítik a homopolimer oligonukleotídokkal szemben, mivel nem zavarják szignifikánsan a próbának a megcélzott oligonukleotidboz való hibridizációját. A poiietilénglíkölt különösen előnyben részesítjük.
A szilárd hordozó, a linket és a próba közötti kapcsolatok előnyösen nem hasadnak el a bázis védöcsoportjainak bázikus körülmények között, magas hőmérsékleten való eltávolítása során. Az előnyben részesített kötések közé tartoznak a karbamát és amid kötések.
Az olígonukleotíd próba immobiiizálásához használt szilárd hordozók előnyben részesített típusai közé tartozik a szabályozott pórnsméretü üveg, az üveglemezek, a poliszáról, az avidinnal borított polisztirol gyöngy, a cellulóz, a nylon, az akrilamid. gél és az aktivált dextrán.
A TaqMan™ esszé, a reagensek és itt használt körülmények részletes leírása megtalálható a szakirodalomban ÍHoband és mtsak Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 7276-7280 (1991); 5,538,848, 5,723,591 és 5,876,930 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi teírásj.
Az itt ismertetett B19 parvovirus szekvenciák is használhatók alapként a transzkripcióval végzett amplifikációs (TMA) esszékhez. A TMA egy olyan módszer, amivel egy biológiai mintában nagyon kisrnennyiséghen jelen levő megcélzott nukleínsav szék**»♦ Χ*« ♦ <
♦ «
Α *
4' venciát lehet kimutatni. Pontosabban a TMA egy izotermikus, autokatalítikus nukleinsav célpont anrplnlkaaos rendszer, ami több mint egymilliárd RNS kópiát képes készíteni egy megcélzott szekvenciáról.. Az esszé végrehajtható kvali tatíve, hogy pontosan kimutassuk a megcélzott szekvencia jelenlétét vagy távoliétét egy biológiai mintában. Az esszé mennyiségi információt is adhat a megcélzott szekvencia mennyiségéről, több nagyságrendre kiterjedő koncentráció- tartomány bán, A TMA eljárást biztosit ahhoz, hogy autokatalitíkusan szintetizáljuk meg egy megcélzott nukleinsav szekvencia több kópiáját, a reakciókörülmények, azaz a hőmérséklet, ionerősség és pH ismétlődő
A TMA általában a kővetkező beleértve az RNS-t. is, izolálása, a. számunkra érdekes biológiai mintából, amiről feltételezzük, hogy B19 parvovírussal van fertőzve; es bj a reakeíőeiegybe betesszük i) az izolált nukleínsavat, ii) az első és második oligonukleotid prímért, az első primer olyan komplexképző szekvenciával rendelkezik, ami eléggé komplementer egy megcélzott RNS szekvencia 3 ' végével, ha jelen van (például a Nj szál), hogy komplexet képezzen vele, és a második primer an komplexképzö szekvenciával r ami elesve lementer a megcélzott szekvenciával vagy komplementjével (például a (-) szál), hogy komplexet képezzen vele, és az első oligonukleotid tartalmaz még egy szekvenciát a komplexképző szekvenciához viszonyítva 5' irányban, ami tartalmaz egy promotert, ííij egy reverz transzkriptázt, vagy RNS- vagy DNS-dependens DNS polimerázt, ívj egy enzimaktivítást,, ami szelektive lebontja egy DNSDNS komplex RNS szálát (azaz például egy RNáz H. és vi egy· RNS polimerázt, ami felismeri a promotert.
«« » « * **
A reakciöelegy komponenseit lépésekben kombinálhatjuk, vagy egyszerre, A reakcióelegyet olyan körülmények között inkubáljuk, amely körülmények: között egy oligonukleotid/cél-székvetieia képződik, beleértve a DNS primmg és ammosav-szintetizáló körülményeket (beleértve a ribonnkleotid trifoszfátokat és dezoxirihonukleobd trifoszlátokat), annyi ideig, ami elég ahhoz, hogy a sélszekveneiáről több kópia keletkezzen. A reakció előnyösen olyan körülmények között j átszódik le, amik alkalmasak a reakciókomponensek, azaz például a komponens enzimek stabilitásának fenntartásához, és anélkül hogy a reakciókörülmények módosítására vagy manipulálására szükség lenne az amplifikáciős reakció során, Ennek megfelelően, a reakció olyan körülmények között játszódhat, le, amik lényegében izotermikusok, és lényegében állandó az íonerősség és a pH, A reakcióhoz kényelmes módon nincs szükség denatnrálási lépésre, hogy elválasszuk az első DNS extenzios reakcióben termelt RNS-DNS komplexen
A megfelelő DNS polimerázok közé tartoznak a reverz transzkriptázok, azaz például a. madár mieloblasztázis vírus (AMVj reverz írauszkriptáz (ami beszerezhető például a Seikagaku America Inc, · tői) és a Moloney rágcsáló leukémia vírus (MMLVj reverz transzknpfáz (ami beszerezhető például a Bethesda Research Laboratories tói).
A primőrbe való beépítésre alkalmas promoterek vagy provan dk (akar természetben előforduló, akár szintetikusan előállított vagy restrikciós emésztés termékei) amiket felismer egy olyan RNS polimeráz, ami felismeri, az adott szekvenciához, és kötődik hozzá, és inieíálja. a transzkripciós folyamatot, aminek következtében RNS transzkrtptumok keletkeznek, A szekvencia adott, esetben tartalmazhat ·, χ, »» K f **« * » *
Ο «. V · * ♦
ί. *** φ ♦ * * χ « « * ♦ ** * * ** * olyan nukieotid bázisokat, amik az RNS· polimeráz aktuális felismerési helyén, túl terjednek, ami további stabilitást vagy érzékenységet biztosíthat a degradációs folyamatokkal szemben, vagy jobb trmszkrípcíos hatékonyságot biztosíthat. A használható pro~ moterek közé tartoznak azok, amiket felismernek bizonyos bakteriofág polimerázok, azaz például a T3, T7 vagy SP6 baktenofagből származók, vagy egy, az Bschehehm cofeből származó promoter.
forgalomban, azaz példánl a New England Biolabs-től és az Epiceníre-től.
Az itt ismertetett módszerekben használható néhány reverz transaknptaa RNáz H aktivitással rendelkezik, ilyen például az AMV reverz transzkriptáz. Az azonban előnyös lehet, ha exogén RNáz H-t, azaz például físchenchia coli RNáz H-t adunk a rend szerhez, még akkor is, ha AMV reverz transzkríptázt használunk. Az RNáz H könnyen beszerezhető például a Bethesda Research
Az ezekkel a módszerekkel előállított RNS transzkriptumok tempiátként szolgálhatnak a megcélzott szekvencia további kópiáinak előállítására, az előzőkben említett mechanizmusokkal. A rendszer autókataütíkus, és az ampüfikáció autokatalitikusan lép fel, anélkül hogy ismétlődően módosítani kellene vagy meg kellene változtatni a reakciókörülményeket, azaz például a hőmérsékletet.
a pH- f , az ionerősséget vagy hasonlókat
A kimutatást számos különböző módszerrel elvégezhetjük., beleértve a direkt szekvenálásf, a szekvencia-specifikus oligonukleotidokkal végzett hibridizációval, géleleküoforézissel és tömegspektrometríával Ezekben a módszerekben használhatók hetero8
5:
gén vagy vak én Íonnaínrnok, izotópos vagy nem-izotópos jelölőikül is végrehajthatök.
A kimutatás egy előnyben részesített, módszere a célpontspecifikus olígonukleotíd próbák használata, amik az előzőkben ismertetett 4,7 kiloházis, 7ÖÖ bázispár, 370 bázispár és 214 bázispár mérető fragmensekből származnak. A próbák használhatók a hibridizációs protekciós esszékben (ΗΡΑ). Ebben a megvalósítási módban a próbákat kényelmesen jelöljük akridiníum észterrel (AB), egy erősen kemilumíneszcens molekulával (Nelson és mtsai; „Beteetíon of Acridinium Esters by Chemilum.íneseenee’’, Ar: Nonísotopic Pt
Sepuenoing, szerk.; Kricka L. d. Academíc Press, San Díego, CA (1995); Nelson és mtsai; „Application of tbe Bybribízation Protection Assay (BEA) to PC1C Ar: The Polyroetase Chain Heaetion, szerk.; MulHs és munkatársai, Bírkbauser, Boston, MA (1994); Weeks és mtsai: Clin. Chem. 29, 1474-1479 (1983): Berry és mtsai: Clin, Chem. 34, 2087-2090 (1988)). Egy AE molekulát közvetlenül kapcsolhatunk a próbához, erre a célra nem-unkleotid-alapü linken kar kémiát használva, ami lehetővé teszi azt, hogy a jelölést, a. próbán belül bárhová tegyük (5,585,481 és 5,185,489 számú Amerikai Egyesült ÁMamnk-belí szabadalmi leírás). A kemOumíneszceneiát lúgos hidrogénperozáddal végzett reakcióval indítjuk be, aminek eredménye egy gerjesztett N-metil akrldon, ami ezután alap-állapotba zuhan vissza, egy foton kibocsátásával. Emellett at EA észter-hidrolízist okoz, ami nem-kemílumineszcens metil akridiniuíu karbonsavat eredményez.
Ha ím AE molekulát: kovalens kötéssel kapcsoljuk egy nukleinsav próbához, akkor a hidrolízis enyhén lúgos körülmények között gyors, Ha az AE-jelzett próba pontosan komplementer a :r *
megcélzott cukiéin savval, akkor az AE hidrolízis sebessége erősen fen. így a hibridizált és nem hibridizált AE-jelzett próba ki’etlenül az oldatban. a tásra lenne szükség.
A. HP.A általában az alábbi lépésekből áll: a) az AE-jelzett próbát a megcélzott nukleinsavval oldatban hibridizá|uk körülbelül 15-30 percig. Ezután enyhe lúgos oldatot adunk hozzá, és a nem-hibrídízált próbához kapcsolt AE-t bidrolízá|uk, Ez a reakció jelül 5-lö percet vesz igénybe. A visszamaradt, a hibridhez AE-t mint a jelenlevő célpont mennyiségének mértékét mutatjuk ki. Ehhez a lépéshez körülbelül 2-5 másodpercre van szükség. A dtílérencíál-hidrolízis lépést előnyösen ugyanazon a hőmérsékleten hajtjuk végre, mint a hibridizációs lépést, általában 50-70 °C-on. Egy másik változat szerint egv· második differenciál-hidrolízis lépést hajtunk végre szobahőmérsékleten. Ez lehetővé teszi, hogy magasabb pH-t használjunk, például a 10-11-es tartómányba esőt, ami a hibridizált és nem-hibrídizálf AE-jelzett próba hidrolízis-sebességé ben nagyobb különbségei eredményez. A HPA részleteit a szakirodalomban ismertetik (6,004,745; 5,948,899 és 5,283,174 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás).
A TMA-t részletesen ismertetik plazmid az 5.399,491 számú
Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban. Egy- tipikus esszé egyik példájában egy izolált nukieinsav mintát, amiről feltételezzük, hogy B19 parvovírus eélszekveneiát tartalmaz, egy puffer koncentratummal keverjük össze, ami tartalmaz pufiért, sokat, magnéziumon nukleotid trí foszfátokat, primereket ditiotreítolt és spermidmü A reakció adott esetben körülbelül 2 percig körülbelül 100 °C-on tartjuk, hogy minden szekunder struktúrát de54 «·*.«· *·
Λ *♦ naturáljunk. Szobahőmérsékletre való hűtés után reverz transzkriptázt, RNS polimerazt és RNáz H-t. adunk hozzá, és az eiegyet két óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk. A reakciót azután úgy elemezzük, hogy denaturáljuk a terméket:, próba oldatot adunk hozzá, majd 20 percig 60 °C-on inkubáljuk, hozzáadunk egy oldatot, amivel szelektív© hidrolizáini lehet a nem-hibndizált próbát, a reakcióelegyet hat: percig 60 R3~on et a vtsszaman
A jelen találmány szerinti oligonukieotid molekulák használhatók még nukíeinsav szekvencia-alapú ampliíikálásban (HASBA), Ez a módszer egy promoter-vezérelt, enzimatikus eljárás, ami egy spec m t-’kro ízoterm ampkfíkálásáí indukálja, ezzel előállítva a nukíeinsav RNS kópiáit, A NSBA végzéséhez használt reagensek közé tartozik egy első DNS primer, egy 5' farokkal, ami tartalmaz egy promotert, egy második DNS prímért, egy reverz transzkríptázt, R.Náz-B-t, T7 RNS polímeráz, NTF-k és dNTP-k. A HASBA használatával nagymennyiséül, egyszálú RNS keletkezik egv szálú RNS-ról vagy DNS-rőí, vagy kétszálű DNSről. Ha RNS-t kell amplifíkálni, akkor az ssRNS szolgál templátkéni egy első DNS szál szintéziséhez, egy első primer, ami egy RNS polimeráz felismerési helyet tartalmaz meghosszabbításával, Ez a DNS szál szolgál templátkéni egy második, komplementer DNS szál szintéziséhez, egy második primer meghosszabbításával, ami egy kétszálú aktív RNS polimeráz promoter helyet eredményez, és a második DNS szál szolgál az első templát, az ssRNS nagy mennyiségének szintéziséhez, egy' RNS polimeráz segítségével, A HASBA technika a szakterületen ismert, és a szakirodalomban publikálták (329,822 számú európai szabadalom, WO 91/028:14 számú nemzetközi szabadalmi leírás, és 6,063,603, φ Φ
Φ * «
♦
ΧφΑ- φ
XX Φ Χ
SS ♦ ♦ ****
Λ' * ♦ χ ***
Φ ♦ **Φ» Φ**
5,664,517 valamint 6,409,818 számú Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi leírás.
Az itt ismertetett B19 parvovírus szekvenciák jól használhatok még a nukleinsav bibridizálási és ampliíikálási technikákban, amik elágazó DNS molekulákat használnak. Bgy alap nukleinsav hibridizációs esszében az egyszálú, elemzendő nukleinsav hibrid!zálódik egy jelzett, egvszáiú nukleinsav próbához, és a kapott jelzett duplexeket mutatjuk ki. Ennek az alap sémának különböző variációit fejlesztették ki, hogy megkönnyítsék a kimutatandó duplexeknek az elválasztását a többi anyagtól, és/vagy amplifikálják a kim.utalandó jelet. A szignál egyik ampliíikálási módszere ampiifikációs múltimereket alkalmaz, amik pofinukieotidok, amiknek az első szegmense specifikusan hihridizáiödik a vizsgálandó vagy egy, a vizsgaianao anyag )CSOl leinsav szálhoz, és egy második szegmens iterációi, amely szegmens specifikusan hihridizáiödik a jelzett próbához. Az amplifikálás elvileg arányos a második szegmens iterációinak számával Á multimerek lehetnek lineárisak vagy elágazónk. Az elágazó multimerek két általános típusa használható jól ezekben a technikákban: villás és fésűs. Az elágyzo nukleinsav molekulák készítése és használata a szakterületen jól ismert [lásd például az 5,849,481 számú Amerikai Egyesült Államok heh szabadalmi ástt
A jelen találmány egy megvalósítasz módja szerint az előzőkben ismertetett, két vagy több teszny hajtunk végre, hogy igazoljuk a szervezet jelenlétét. Ha például a használt teszt a transzkripcióval végzett amplifikalás (TMA) a nukleinsavak detektálás céljából váló kimutatására, akkor egy alternatív nukleinsav tesztet (NATl is vegrehajnmk, például pufiméra;: lanereakciós amp
X * Φ*
:*·' ♦χ
Φφφφ ' *. ,χ
Φ *· * Φ ítfikálási:, RT-PCR-t és feásonidt használva, az itt ismertetett módon. így a SÍ9 parvovírus specifikusan és szelektíve kimutatható, még akkor is, ha a minta más szervezeteket is tartalmaz, azaz például HÍV vírust vagy Hepatitisz B vírust.
Amint az nyilvánvaló, az itt ismertetett esszé tervezésében sok variáció tehető, és a szakterületen számos formátum ismert. A fenti leírásokat csak üt.m utalóul szántuk, és a szakterületen jártas szakember könnyen módosíthatja az ismertetett protokoéokat, a
Az előzőkben ismertet esszé reagensek, beleértve a primereket, próbákat, a szilárd hordozót a megkötött próbával, vala mint más kimutatási reagenseket biztosíthatók egy kiíben, a megfelelő instrukciókkal és más szükséges reagensekkel, azzal a céllal, hogy az előzőkben ismertet esszéket végrehajtsuk. A kit normális körülmények között külön tartókban tartalmazza a merek és próbák kombinációját (akár más egy kötve, vagy külön, a mátrixhoz való kötődéshez szükséges reagensekkel), a kontroli készítményeket (pozitív és/vagy negatív), a jelölt reagenseket (azaz például az enzim szubsztrátot), ha a jelölés nem generál jelet közvetlenül. A kit általában tartalmaz az esszé végrehajtásához instrukciókat (azaz például írás, magnófelvétel, videofelvétel, CD-ROM formájában). z\ kit tartalmaz még, az éppen alkalmazott esszétől függően, más pakolt reagenseket és anyagokat (azaz például mosöpuííereket és hasonlókat). A standard esszé, mint amilyenek például az előzőkben ismertetett esszék, ezekkel a kittekkel végrehajthatók.
Az alábbiakban a specifikus megvalósítási módokra, adunk meg példákat, a jelen találmány végrehajtásához. A példákat csak .« * Φ:χ*:« ««** *♦ ·>· X ♦ .....♦ ♦ ' * Λ χ * ♦ * ♦ « *»«·χ «*♦ * * ·* <
illusztrálás céljával adjuk meg, és nem szándékunk, hogy a jelen találmány oltalmi korét bármilyen módon korlátozzuk.
Erőfeszítéseket tettünk, hogy biztosítsuk a számszerű pontosságot (azaz például mennyiségek, hőmérsékletek, stb. esetében), de természetesen előfordulhatnak kísérleti hibák és eltérések.
Az alábbi példákban az enzimeket kereskedelmi forrásokból vásároljuk, és a gyártó utasításai szerint használjuk, A nítroeebulóz szűröket és hasonlókat szintén szerezzük be.
sgmcuscK izolálása során, hacsak az eltérést külön nem említjük, minden DNS manipulációt a standard eljárások szerint hajtunk végre (Sambrook és mtsai: Molecular Cloning; A
Laboratory' Manual; 2. kiadás, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor. N.Y. (1989)1. A restrikciós enzimeket, a T4 DNS li~ gázt, az Esehericbtn coli polimeráx bet, a Klenow fragmenst és más biológiai reagenseket különböző szállítóktól vásároltuk, és a gyártó utasításai szerint használjuk. A kétszálú DNS fragmenseket agaréz gélen választjuk szét.
Hl9 parvovírus nukleinsav extrábáiása polímeráz láncreakcióhoz
A humán szérum mintákat, amik korábban IgM vagy polimoráz láncreakció vizsgálatok alapján a. humán 819 parvovírusra pozitívnak bizonyultak, kereskedelmi forgalomban szerezzük bem és arra használjuk, hogy a későbbi polímeráz láncreakció alkalmazásokhoz DNS-t izoláljunk belőlük. A mintákat felhasználásig-80 ;'C-on tároljuk.
' »
ΧΦ ****
- ♦ * ♦ * *
Μ:*·* -«♦·* *
A DNS-t 0,2 ml szérumból extraháljuk, a QIAamp DNA Blood Mini Kit (Quiagen, Valencia, CA) használatával, a gyártó utasításai szerint, az alábbi megfon tolásokat figyelembe véve. Hordezió DNSt adunk a lízálő puíferhez, hogy javítsuk a nukleinsav kötődését és hozamát. Pontosabban, 5,6 ug per minta poliadenilsav 5-t (Sígma, St. Louis, MO) vagy polí-dA-t (Roche, Indianapolis, IN) adunk hozzá. Emellett a B1.9 parvovírus DNS-t víz helyett 200 μΐ AE pulferrel (Qulagen) eluáljuk
A B19 parvovírus nukieinsav-pozitív minták kimutatása poíimeráz ancreakcióval
Két különböző poíimeráz láncreakció eljárási alkalmazunk a B19 parvovírus fragmensek ampliílkáíásóra. Az egyik módszert, amit az alábbiakban részletesen ismertetünk, arra használjuk, hogy a körülbelül '700 bázispár, 370 bázispár és 214 bázispár méretű fragmenseket amplífikáljuk (1. ábra). High Pidelity Expand PCR-t [Rochej használunk a körülbelül 4,7 kilobázis méretű ffagy mens megfelel a. B19 parvovírus 2936 -3635-ös nukleotid pozícióinak [Shade és mtsai: d. Virology 58, 921-936 (1.986)0 A körülbelül 370 bázispár méretű fragmens a 700 bázispár méretű fragmensben fordul elő, a 3073-3442-es pozíciókban. A körülbelül
4,7 kilobázis méretű fragmens egy 4677 nnkleötídből álló hagy mens, ami megfelel a 217-4893-as nukleotid pozícióknak (Shade és mtsai: d. Virology 58, 921-936 (1986)).
Ahhoz, hogy a körülbelül 700 bázispár, 370 bázispár és 214 bázispár méretű fragmenseket, az I. táblázatban bemutatott prímereket használjuk.
4:
*«·»* * ·* **** ' φ· ** *
Κ· » ***·* < * *
1, Táblázat
Primer régió
VP-5
Szekvencia
AGGAAGTTTGCCGGAAGTTG (36. számú szekvencia) G'rGCTGAAACTCTAAAGGTG (37, számú szekvencia)
GACATGGATATGAAAAGCCTGAAG
VPl /VP2 (38. számú szekvencia)
VP2-3 GTTGTTCATATCTGGTTAAGTACT
VPI/VP2 (39, számú szekvencia)
ATAAATCCATATACTCATT (40. számú szekvencia)
CTAAÁGTATCCTGACCTTG
VPl /VP2 (4I. számú szekvencia):
Ebben a kísérletben a pobmeráz láncreakciót 100 μ) végtérfogatban bajijuk végre. 2 μί tisztított B19 parvovírus DNS-t (a tisztítását az előzőkben említett módon hajtjuk végre), az egyes dezoxmuklecstid trifoszfátokból 0,2-0,2 mM t és 1,25 egység Pfu DNS polimerázt (Stratagene, La Jól la, CA) használva. Az ampliííkálási profil a kővetkező: dennturálás 94 *0, 2 perc, primer illesztés 37 °C 3 perc, extenzió 72 °C 3 perc, 35 ciklusban, 94 °C~on végzünk egy háromperces előínkubáiásh hogy biztosítsuk a kiindulási denaturáclőt, es a 35 polímeráz láncreakció ciklus után 72 °€~on végrehajtunk egy végső, hétperces inkuhálást, hogy biztosítsuk a. fragmeusek teljes extenzicját, a pobmeráz láncreak♦ *·. χ* » ♦ '* :* ♦ * X * * « ♦ «# * * « * * * .
6Θ eió termékeit 7%-os agaróz gélen elektroforetizáljuk, etídiumbromíddál festjük, majd ultraibolya fényforrás alatt vizsgáljuk. Az amplifikált fragmensek tisztítását a QíaQuiek PCR puríflcation
-tel (Quiagenj hajtjuk végre Hálós polimeráz láncreakciót a 370 bázispár méretű méretű fraa át hajtunk végre, parvovirus fragmenst, ha a géleken. A. 700 bázispár r meráz láncreakcióhoz, az
Hígh Fidelity Expand PCR-t (Roche) használunk a 4,7 kílöházis méretű B19 parvovirus fragmens amplifikáJására, az alábbiak szerint. A. Hígh Fidelity Expand PCR kittet (Roche), és a Hicks-S' CCCGCCTTATGCAAATGGGCAG (42. számú szekvencia), valamint a Hicks-3' TrGTG'n'AGGCTGTCTOVTAGG (43. számú szekvencia) prímért használjuk, a gyártó utasításai szerint. Az amplifikálás körülményei: 94 °C 1 pere, 50 °G 2 pere, és 68 ÖG 4 perc, 35 vagy 45 ciklusban. Az eljárásban alkalmazunk .egy kétperces, 94 öG-ös eloinkubálást, és egy hétperces, 75 C os utöinkubálást. A polimeráz láncreakció termékeit 1%-os agaróz gélen választjuk szét, és a PCR Purifícation kit használatával (Promega, Madíson, Wí) tisztítjuk.
3. Példa
A 81.9 parvovirus DNS fragmensek klónozása
A pofimeraz lánereakcios fragmenseket a TOPÖ-TA vektorokba klónozzuk (Invítrogen, Carisbad, CA). Az ezekbe a vektorokba történő klónozást nagyon megkönnyíti, ha az amplifikált DNS a 3' vegén tartalmaz egyetlen dezoxiadenozint (A). Ennek « φ ^ χ·:« :ψ: * *
χ. Α 9........* ♦ *
χ. < ♦ *· . ·*· * * * * ίΛ «ύ»«* «*♦ X X **« megfelelően, egy katalitikus reakciót alkalmazunk a 3'(A) katalitikus overhead hozzáadásához. A reakciöelegy tartalmaz 1,25 mmol/l dATP-t, 0,5 egység Taq poíimeráz! (Perkin Elmer, Boston, MA), és a reakciót 15 percig hajtjuk végre 72 CÍC~on,
A poíimeráz lánereakeios fragmenseket a pC.R2,;l~TOPÖ vektorba az Invitrogen TA klónozó kitjével klónozzuk (TOPD™ TA ClonínA kit, One Shot TOP 10 Electrocompetent Cella·szel), a gyártó utasításai szerint, A baktérium sejteket 37 °C-on Luria Broth lemezeken inkubáíjuk, amik 100 pg/ml ampicillint., 0,66 mmol/l izopropil-β-tiogalaktopíranozidot és 0,033% X-Gal-ΐ tartalmaznak. A. kapott több fehér telepet 4 ml Luria Broth-ba oltjuk, ami löö ml ampicillint tartalmaz, majd éjszakán át 37 ÜCon razat rom használunk arra, hogy a QlAprep Miniprep kittel (Quiagen) plazmád DNS 5 állítsunk elő. A rekombináns telepeket EeoRl restnkpoiiakrilatnid vagy 1% agaróz géielektroforézissel, az előzőkben ismertetett módom
Ahhoz, hogy meghatározzuk a klónak DNS szekvenciáját, a rekombináns kiónokból származó nagymennyiségű plazmidot az előzőkben ismertetett módon állítjuk elő, és a DNS-t TE pufferben (10 mol/1 TRIS-HCI, pH:::8,ö, 1 mol/1 EDTA) szuszpendáljuk. A B19 parvovírus fragmensek nukleotid szekvenciájának mégha távozását egy
373
3771
DNS-szekvenálő rendszerben határozzuk meg.
A 2A-2Ü. ábrákon.(1-21. számú szekvencia) 21 B19 parvovírus izolátum DNS szekvenciája látható, ezeket tisztítjuk, amplifikáljuk és szék vonaljuk az előzőkben ismertetett módon, ez megfelel a B19 parvovírus genom 2636 3635 ős nukleotid pozíciói »·$*.♦ nak [Shade és mtsai: J. Virology 58, 921-936 (1986)) (a 700 bázispár méretű az 1. ábráról, amit az előzőkben ismertettünk). A 2 A. ábra (1. számú szekvencia) a CB47-26 izoiátumból származó szekvencia; a 2B, ábra (2. számú szekvencia) a CH48-29 izoiátumból származó szekvencia; a 2C, ábra (3, számú szekvencia) a CH33-2 izolátumből származó szekvencia; a 2D. ábra (4. számú szekvencia) a CH33-3 izolátumből származó szekvencia; a. 2E. ábra. (5. számú szekvencia) a CH33-4 izoiátumból származó szekvencia; a 2F. ábra (6. számú szekvencia) a CH42-7 izolátumből származó szekvencia; a 2G. ábra (7. számú szekvencia) a CM42-18 izolátumből. származó szekvencia; a 20, ábra (&, számú szekvencia) a CH42-19 izolátumből származó szekvencia; a 21, ábra (9, számú szekvencia) a CB46-23 izoiátumból származó szekvencia; a 2d. ábra (10. számú szekvencia) aCHl-1. izoiátumból származó szekvencia; a 2K. ábra (11. számú szekvencia) a CM 1-6 izoiátumból származó szekvencia; a 2 b, ábra (12, számú szekvencia) a CH2-8 izolátumből származó szekvencia; a 2M. ábra (13. számú szekvencia) a CH2-10 izoiátumból származó szekvencia; a 2N. ábra (14. számú szekvencia) a CH2-1IC izoiátumból származó szekvencia; a 20, ábra (15. számú szekvencia.) a CH15-13 izoiátumból származó szekvencia; a 2P. ábra (16. számú szekvencia) a CH7-22 izoiátumból származó szekvencia; a 2Q. ábra (17. számú szekvencia) a GB 13-27 izolátumből származó szekvencia; a 2R, ábra (18, számú szekvencia) a GM 14-33 izolátumből származó szekvencia; a 2S. ábra (19. számú szekvencia) a CM62-2 izolátumből származó szekvencia; a 2T. ábra (20, számú szekvencia) a CH64-2 izoiátumból származó szekvencia; ős a 2U. ábra (21. számú szekvencia) a CH67-2 izoiátumból származó szekvencia.
ív «Η*' * Φ * * *
χ
A ÍÍA--112L ábrák további 2b 819 parvovfrus izolátumböl származó szekvenciát mutatnak be, amiket az előzőkben ismertetett módon tisztítottunk, amplífíkáltunk és szekven altunk, és ezek a B19 parvovfrus genomja 2936-3635-ős nukieotid pozícióinak felelnek meg (Shade és mtsai: J. Virology 58, 921-936 (1986)]. A 11 A. ábra (62. számú szekvencia) a CH80-.1 ízolatmnből származó szekvencia; a 11B. ábra (63. számú szekvencia) a CBS 1-3 izolátorából származó szekvencia; a 11 €2 ábra (64, számú szekvencia) a B19SCL1-4 izolátumböl származó szekvencia; a 11D. ábra (65. számú szekvencia.) a. .819SCL2--1 izolátumböl származó szekvencia; A 118, ábra (66. számú szekvencia) a B19SCL3-1 izolátumböl származó szekvencia; a IIP. ábra (67. számú szekvencia) a B19SCL4-3 izolátumböl származó szekvencia; a 1.1G. ábra (68. számú szekvencia) a B19SCL5-2 ízolátumbol származó szekvencia; a Ilii. ábra (69, számú szekvencia) a B19SCL6-2 izolátumböl származó szekvencia; a 1 lb ábra (70, számú szekvencia) a, B198CL7-3 izolátumböl származó szekvencia; a Hd. ábra (71, számú szekvencia.) a B19SCL8-2 izőlátumböl származó szekvencia; a UK. ábra (72. számú szekvencia) a B19SCL9-1. izolátumböl származó szekvencia; a HL. ábra (73. számú szekvencia) a B198CL9-9 izolátumböl származó szekvencia; a 11M. ábra (74, számú szekvencia) a B19SCL10-2 izolátumböl származó szekvencia; a UN, ábra (75. számú szekvencia) a B19SCL11-1 izölátumból származó szekvencia; a 11O, ábra (76, számú szekvencia) a B19SCL12-1 izolátumböl származó szekvencia; a IIP. ábra (77. számú szekvencia) a B19SCL13-3 izolátumböl származó szekvencia; a 11Q. ábra. (78. számú szekvencia) a. B198CL14-1 izölátumból származó szekvencia: a Γ1Κ. ábra (79. számú szekvencia) a. B19SCL15 -3 izolátumböl. származó szekvencla; a 1 IS. ábra. (80. számú .szekvencia) a B19SCL16-2 ízolátumból származó szekvencia; a I IT. ábra (81. számú szekvencia) a
B19SCL17-1 izolátumból származó szekvencia; a. ÍRJ. ábra. (82.
számú szekvencia) a B19SCL18-1 izolátumból származó szekvencia; a 11V. ábra (83. számú szekvencia) a B19SCL19-1 ízolátumhól származó szekvencia; a 11W, ábra (84. számú szekvencia) a B19SCL20-3 izolátumból származó szekvencia; a. 1IX. ábra (85. számú szekvencia) a B.19SCL21-3 izolátumból származó szekvencia; a 11Y, ábra (86, számú szekvencia) a B19SCL22-11 ízolá ·· tűmből származó szekvencia; a 11 Z. ábra (87, számú szekvencia) a B19BC12-14 izolátumból származó szekvencia.,
A szekvencia-összebasonbtásokböl kiderült, hogy a különböző izolátumok között ez a 700 bázispár méretű szekvencia körülbelül 98-99,5%-os homológiát mutat.
A 3A-3C. ábrák (22. számú szekvencia) mutatják az 1, ábrán bemutatott, és az előzőkben ismertetett, a B19 parvovirus 2B1 klónjáböl származó, körülbelül 4,7 kilobázispár méretű polímeráz isnereakeíös fragmens szekvenciáját. Az ábrákon bemutatott szekvencia egy 4677 nukleotid méretű fragmens, ami megfelel Shade és munkatársai 217-4893-as nukleotid pozícióinak (Shade és mtsai: J. Virology 58, 921-936 (1.936)]. .Az ismertetett szekvencia tartalmazza a B19 parvovirus teljes hosszúságú nyitott leolvasási keretét, ami az NSl-et, VPl-et és VP2-t kódolja, plusz további 5' és 3' nem-transzlálódö szekvenciákat, A szekvenált fragmens tartalmaz egy további nukleotidot a ΒΓ9 parvovirus SHade és munkatársai által publikált szekvenciája
Shade és mtsai
J, Virology 58, 921-936
-es un pozíciói kozott.
»5»Λ· * ·* τ „ *
Λ. ♦ «Μ fc-K χ*-*:
A 4A-4C. ábrák (23. számú szekvencia) a Β19 parvovirus 2-B6 klánjából származó, körülbelül 4,7 káobázis méretű, az 1, ábrán bemutatott polimeráz láncreakciós fragmens szekvenciáját mutatják be. A szekvencia egy 4677 nukleotid méretű fragmens. ami megfelel Shade és munkatársai 2.17-4893 as nukleotid pozícióinak (Shade és mtsai: J. Virology 58, 921-936 (1986)]. Az ismertetett szekvencia tartalmazza a B19 parvovirus teljes hosszúságú nyitott leolvasási keretét, ami az NSlet, VPl-et és V.P2-t kódolja, plusz további 5' és 3X nem-transzlálódó szekvenciákat. A szekvenált fragmens tartalmaz egy további nukleotidot a B19 parvovirus SHade és mimkatársaí álta (Shade és mtsai: J, Virology 58, 921nukleotid pozíciói között.
4. Példa
Á B19parvovirus NS1, VP1 és VP2 rekombináns fehérjék klónozása és expresszálása
Az MSI -et, VPl-et és VP2~i kódoló fragmenseket (lásd 1. ábra) a B19 parvovirus pCR2.1-TOPO vektorban (ezt az előzők ben ismertettük) klónozott 4,7 kílobázis méretű fragmenséről am piszkáljuk. Pontosabban, polimeráz láncreakció primereket terveztünk (lásd az alábbiakban), hogy a B19 parvo vírusból polimeráz láncreakcióval kiv :V2 az NS1, VP1 és VP2 régióit.
Abhoz, hogy megkönnyítsük ezeknek a régióknak élesztő expresszíós vektorokba való klónozását. Xbal, Hindii! és Sáli restrikciós hasítási helyeket vittünk be a prím erekbe, igény szerint.
A primerek, amiket arra használunk, hogy a B19 parvovirus fragmenseit klónozzuk és amplifikaljuk az NS1, VP1 és VP2 rekombináns ten éj expressziojanoz, az fc « 'jt***· * Χ Λ* előzőkben kapott szekvenciákon alapulnak, vetkező:
és összetételük a ko~
NS1-5 (értelmes primer)
5' ATACTCTCTA GACAAAACAA AATGGAGCTA TGCTTCAAGT TTCT 3 '
TTTAGAGGGG (44, számú szekvencia)
5' GAGTATGTCG ACTTACTCAT AATCTACAAA CCAGACAG 3' (45, számú sz méla)
VP1-5SN (értelmes primer)
5' ATACTCAAGC TTACAAAAGA AAATGAGTAA AGAAAGTGGG AAATGGTGGG AAAGT 3' (46. számú szekvencia)
VPALL-3 (antiszensz primer)
5' GAGTATGTCG ACTTACAATG GTCCACAATT C 3' (47. számú szekvencia)
GGTG CACACG GCTTTTG G CT
VP2-5SN (értelmes primer)
5' ATACTCAAGC TTACAAAAGA AAATGACTTC AGTTAATTCT GCAGAAGCCA GCACT 3' (48, számú szekvencia)
6?
.·», Γ '* ***s θ’» Ν - * w
A polimeráz lánereakdős pnmereket megszintetizáljuk, tisztítjuk, magi 300 μ! desztillált vízben szuszpendálfuk, optikai sűrűségűket 260 nm-en meghatározzuk. .A reakcíóelegy tartalma 0,25 ng terápiát, 100-100 pmol primer, .10-10 μΐ az egyes dNTPkhól és 1 egység Taq polimeráz (Perkin Elmer, Boston, MA), 50 pl végtérfogatban. Az amplifikálás körülményei: 94 öC 1 perc, 50 ÖC iáójának, biztosítására hétperces, 75 ®C-on végzett utóinkubálást végzünk, Körülbelül o μΐ-es alíkvot részeket használunk, hogy % agaroz géleleklroiorézíssei ellenőrizzük a PCR szintézist. Ezután a teljes polimeráz láncreakció terméket elektroforehzáljufc, és a várt méretet mutató fragmenseket a gélből tiszutasításai szerint. Körülbelül 0,8 gg tisztított pölimeráz láncreakeiős DNS-t. emésztünk a megfelelő restrikciós enzimekkel (Roche), 3 óra hosszat, 37 :C-on. és a terméket tovább tisztájuk a Promega. PCR Purííication Kit tel.
A pBS24.1 plazmidot használjuk a B1.9 parvovírus rekombínáns fehérjék expresszálására. Ez az élesztő expressziös vektor tartalmaz 2 mikronos szekvenciákat és fordított ismétlődéseket (IR) at élesztőben való autonóm replikádéhoz, tartalmazza az aíaktor terminátort a transzkripció terminációjának biztosítására, és a szelekcióhoz tartalmazza az élesztő és BRA3 géneket.
A Col E l replikációs origó és a béta-laktamáz gén szintén jelen van az .Escferichio eok-han való szaporításhoz és szelekcióhoz í Piehuantes és mtsai; „Expression of Heterologous Gene Products ín Yeasts”, fo: Protein Engineering: A Guide to Design and Production, 5. fejezet, 120-161. oldal, szerk.: J. b. Cleland és G, Crmk, WileyOLiss, Inc., New York, N.Y. (100ü)j. A pBS24 , l <« χ ** φ φ * * ♦ * Λ ΦΦΦ X *
Φ* ..χ. φ β«Φ« »»* · ***Φ mídot BamHI/Sáli restrikciós enzimekkel emésztjük, majd 10 egység borjúbél alkalikus íoszfatázzal (Boehrínger Mannheim, Indianapoiis, IN) delbszforilezzük, a gyártó által javasolt körülmények kozott. Az emésztett és tisztított polimeráz láncreakeiós fragmenseket BamHI/Sall restrikciós enzimekkel emésztett pBS24.1 plazmáddal, valamint egy olyan DNS fragmenssel keverjük Össze, ami tartalmazza az élesztő b rét (Cousens és mtsai: Gene 61, 265-275 (1987)), ez vs
BamHI/Síül vagy BamHI/ Hindii! restrikciós enzimekkel emésztett, a. klónozandó polimeráz láncreakeiós fragmensekben levő restrikciós hasítási helyektől függően
hígadon kittel és protököH szerint hajtjuk végre, elegyet használjuk, hogy kompetens Bscbenehiu col?
g és a transzforrnánsokat 100 pg/ml ampíeillint tartalmazó huria-Brotb lemezeken szelektáljuk, éjszakán át, 37 °C-on végzett szaporítás után. Az egyes transzfbrmánsokból több telepet izolálunk, és 3 ml, 100 gg/ml ampíeillint tartalmazó Luria Broth-ba oltunk, majd éjszakán 37 °C-on
1,5 ml-es tenyészetekből plazmid DNS-t izolálunk, a Miniprep kit (Quiagen) alkalmazásával. A rekomb.ináns kiónokat BamHl-Sall analitikai restrikciós enzimes emésztéssel azonosítjuk. A rekombínáns plazmidből nagymennyiségű készítményt állítunk elő, hogy végrehajtsuk a szekvenáiást, és igazoljuk a klónozott B19 parvovírus tragmensek nukieotid szekvenciáját.
Az élesztők transzformálásához a várt NS1, VP1 és VP2 szekvenciával rendelkező különböző élesztő expressziős vektorokat használjuk, az alábbiak szerint. Kompetens Sueeímrompoes
X *» * ** *«
X *
ccrcsrae AD3 sejteket (Mú a, trpΐρ imád-5.2, prfel I/22, pep4-3? prcl-407y fdr^pípDMlS (pGAP7ú.OB2::0423¾ <áu20MDf transzformálunk az NSl-et, VPl-et vagy VP2 -t kódoló plazmid DNS-sel, amit az előzőek szerint klónoztunk. Az élesztő rekombixiánsokat ügy kapjuk meg, hogy két menetben használunk uracil-mentes lemezefcekmajd egy menetben leuein-mentes lemezeket használunk, 48-72 óra hosszat végzett 30 °C-on végzett inkubálás után. A tenyészeteket leuein-mentes táptalajon szaporipuk, majd 48 óra hosszat 2% glükózzal kiegészített YEP-ben [Pichuaotes és mtsaí: Pretems: Btruct., Punci. Génét 6, 324-337 (1.989)j, mielőtt ellenőrizzük a. rekombináns fehérjék expressziöját.
A két különböző izolátumből származó szekvenciákat az 510. ábrán mutatjuk be, Pontosabban, az 5A. (24. számú szekvencia) és az 5B, (25. számú szekvencia} ábra mutatja az NS1 nukleotid- és febérjeszekveneíáját a B19 parvovírus 2-.B1 klőnból. A 6A. (26. számú szekvencia) és a 68. (27. számú szekvencia) ábra mutatja a VP1 nukleotid- és febétjeszekvenciáját a B19 parvovn rus 2-B1 klőnból. A 7A. (28. számú szekvencia) és a 7B. (29. számú szekvencia) ábra mutatja a YP2 nukleotid-· és fehérje szekvenciáját a B19 parvovírus 2-B1 klőnból. A 8A. (30. számú szekvencia) és a SEk (31. számú szekvencia) ábra mutatja az NS1 nukleotid- és fehérjeszekvenciáját a B19 parvovírus 2-B6 klőnból. A 9A. (32. számú szekvencia) és a 9B. (33. számú szekvencia) ábra mutatja a V.P1 nukleotid- és febérjeszekveneíáját a BI9 parvovírus 2-86 klőnból. A 10A. (34. számú szekvencia) és a 10B, (35. számú szekvencia) ábra mutatja a VP2 nukleotid- és fehérjeszekvenoiáját a B19 parvovírus 2-Bő klőnból.
9, ábra
A B19 parvovirus DNS kimutatása és mennyiségi meghatározása
TaqMahÍM~nal
A Β19 parvovirus fertőzés kimutatására érzékeny diagnosztikai módszer terveztünk, az alábbiak szerint. Pontosabban, a
TaqMan® poiimeráz láncreakció technológiát használjuk a B19 parvovirus DNS kimutatására és mennyiségi meghatározására. A mennyiségi poiimeráz láncreakcióhoz a. nukleinsav hatékony ara van ma/ szérum térfogata is befolyásolja a kimutatás érzékenységét. Két megközelítési módot használunk a nukleinsav izolálására 0,5 ml plmmia/szérumból, Pontosabban, extraháljuk: a.) szílíkagélhez kötve; és
a. DNS a következőképpen b) a célpont··specifikus öligonukleotidokhoz való illeszkedéssél.
koncentrációjú kaotróp sók, azaz például guanidíum. izotíocian át jelenlétében a nukleinsavak a szílíkagélhez kötődnek. A kisméretű nukleinsavak nagyobb hatékonysággal kötődnek a szílíkagélhez savas píT-n, A. megkötött nukleinsavak hatékonyan eiúálődnak alacsony sókoncenlrácionál, lúgos pB-n és magas hőmérsékleten.. A normális szílikagéi magnetizált szilikagéllel való helyettesítése nagyon megkönnyíti a nukleinsav izolálás mosási és elúcíós lépéseit.Egy mágneses alapot, használunk a megkötött nukleínsavat tartalmazó szílikagéi részecskék befogására, ezzel elimmáha a szabályos szílikagéi részecskék üle pité séhez szükséges eentrifugálást.
A használt lizís puffer az Organon-Teknika-tól (Durham, WC) származik. Ez a lízm pufíer guanidíum izotíocianátot tartalmaz a fehérjék szolubilizálására, valamint az RN-ázok és DN«»χ » X** ?i ázok inaktiválására. A Triton-X detergens tovább könnyíti a szolubüízálást és a sejt struktúrájának, valamint a se)tmag-febéíjéknek a dezínfegrálását, ezzel fölszabadítva a nukleinsavat. A lízis reagenst savanyítjuk, hogy erősítsük a nukleinsav kötődésiéti,. és SÖ pl lúgos élúeíós puffért használunk a megkötött nuklein sav eluálására, A nukleinsav Izolálása után a parvovírus DNS jelenlétét az előzőkben ismertetett TaqMaut) polímeráz láncreakcióval határozzuk meg.
A nukleinsav izolálása
tidi^ozvalőntatéssel
Bár a magnetízált szilíkagé! nagyon megkönnyíti a gyors és könnyű kezelést a mosási és elücíős lépésben, a nukleinsav izolálása még mindig munka- és íöőígényas. Ezért a specifikus nukleinsav célpontnak a plazmából vagy szérumból való befogására egylépéses befogást alkalmazunk, mágneses gyöngyöket használva. Ahhoz, hogy ezt számos különböző virális nukleinsav befogási tesztre használhatóvá tegyük, oligo dT-vel kapcsolt generikus mágneses gyöngyöket használunk. Sera-Mag mágneses oligo (dT) gyöngyöket használunk (Seradyn, indianapolis, IN), 14 nukleotídhól álló oligo dT-vel, a 3' végükön 20 poii A-t tartalmazó Capture oligonukleotidokkal, amik egybeíúggenek a használt parvovírus- specifikus szekvenciával (az alábbiakban specifikált szekvencia végén jelezzük).
Az antiszensz befogó ohgonukleotidok a 7ÖÖ bázispár méretű fragmensből származnak, az alábbiak szerint;
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA ATCCTTAACA
GCAATTTCTG ATA (3492-3514-es nukleotidok) (*)
X Φ Φ X
X ......* ♦ ·* * (49. számú szekvencia)
VSPC2 ·« AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA TGGTGTCAG (3639-3660-as nukleotídok) (SO. számú szekvencia)
VSPC3
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA TATACCCAAA
TAGGAAGTTC TG (3639 -3660 - as rmkleotidok (51. számú szekvencia)
VSPC4 - AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA ATTCTTCACT TGC (3737 - 3759- es nnkleotidok)
TAAAATGCTG
VSPC5 - AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA CCTGTACCTA (3789-3308-as nnkleotidok) (53. számú szekvencia)
ΛΑΛΑΛ4ΛΑΑΛ &&A&A&AÁAÁ V ΟΓνν ~ Απ.ηΑΠ.ηΛπη.η
ATTrrGTGGG (3833--3857-es nnkleotidok) (54. számú szekvencia)
AGCCCTCTAA
YSPC7
AAAAAAAAAA
CTCCT.AATGT
GTCAGGAACC (3910-3929-es nnkleotidok) (55. számú szekvencia)
*) A nukleotídok számozása Shade és munkatársai szerint (Shade és mtsai: J.
Vírology
58, 921-936 (1986)]
Ί/ » ♦
A mágneses gyöngyöket Novagen. lizis pufferben. szuszpendáljnk (Madison, Wb. és hét befogó ohgonukJeotídből álló sorozatot (VSPC1 - VSPC7, lásd az előzőkben) vizsgálunk egyenként vagy kombinációban, hogy befogjuk a B19 parvovírus DNS-t egy panelből, amit a következő helyről, kaptunk: EDA
Center fór Bíologic Bvaluation and Research, U.S, Health and Humán Services (ED.&--CBER),
A gyöngyök mosása n Á befogást követően a gyöngyöket egy olyan pufferrel mossuk, aminek összetétele: 10 mmol/1 HEPES, p.H~7,5 re pnfferelve 0,3 rnol/l nátrium-klorídhan és 0,5% NP-40. A szérum Hzís pufferrel való kezelése, hibridizáció, a gyöngyök mágneses adszorpciója és a lizis puffer eltávolítása után 1,5 ml mosópuffert adunk a gyöngyökhöz. A szokásos vortexelés, mágneses adszorpció és a rnosópuffer eltávolítása után a gyöngyöket másodszor is mossuk 0,5 ml azonos összetételű pufferrel, így a mágneses gyöngyök tömörithetök, hogy könnyen szuszpendálhatök legyenek 100 ml Uníversal poiimeráz láncreakció pufferben, ami a TaqMan® esszéhez szükséges összes reagenst tartalmazza. A befogott DNS-t tartalmazó gyöngyöket egv TaqMamk lemezre visszük át, hogy az alábbiakban ismertetett módon, TaqMank poiimeráz láncreakcióval kimutassuk. Számos olígonukleotíd kombináció volt hatékony a B19 parvovírus befogásában, amint az a TaqManE esszével kimutatható.
Pontosabban, a TaqMan® technológia DNS ampiikonként amplífikálja a befogott nukleínsavat, Ennek egy alternatívája a befolyásol célpont ENS-ként való amplifíkálása. Ehhez az ampliftkáeíö-specifikus oligonukleotíd tartalmaz egy B19 parvovirusspecifikus printert egy T7 prömoterszekveneiával, azzal a céllal, hogy a '77 RNS polímerázzal RNS axnplíkonokat generáljunk. Három ampiifikációs prímért (VSA1-A3, ezeket az alábbiakban mutatjuk be), amik a .B.1.9 parvovírus Sba.de és munkatársai által ismertetett genomja 2936-3635-ös nukleotídjainak felelnek meg [Shade és mtsai: J. Virology 58, 921-936 (1.986)] vizsgálunk, hogy alkalmasak -e az amplífikáeíóra. A primerek az alábbiak:
Értelmes szál ampiifikációs primer:
VSAI - AATTCTAATA CGACTCACTA
GCCATATACT CATTGGACTG T (2942-2961 -es oligonukleotídok) (56. számú szekvencia)
VSA2 - AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGAAG GCCAGAGCAC CATTATAA (3272 -3288-as nukleotidok) (57. számú szekvencia)
CÖACTCACTA TAGGCACAf 7--3333-as nukleotidok) zenei.
V8P2 - GTGCTGAAAC TCTAAAGGT (andszemsz primer ~ 34243442~es nukleotidok) (59. számú szekvencia)
ENamphfire kit (Quiagen) reagenseket használunk az amplifikáeió hatékonyságának vizsgálatára, célpontként 50 parvovírus DNS kópiát használva 20 pl végtérihgatham Az ampiifikációs prímeteket egyenként, vágy kombinációban vizsgáljuk, második
X ** » * * *» primerként VSP2~t használva, A gyártó által javasolt egyórás 42 ®C-os irtkubálás után az amplifikáit anyag egy alikvot részét 100szorosra hígítjuk, hogy TaqManfó-nal kimutathassuk, hogy ezzel megbecsüljük az amplifikácios primerek hatékonyságát, két aniplifikációs primer, a VSA2 és a VSA3 a VSP2~vel nagyon hatékony az RNS amplikonok generálásában.
A TaqManS esszé érzékenységét, a polimeráz es az
ismertetett. 4,7 kiloházis méretű iragmenst tartalmazó meg..
VPl régiót, valamint, az NS1 és VP2 régiókat (lásd az 1. ábrát), A polimeráz láncreakció amplifikácíős prímért használunk:, amik a VPl régióból származnak, az alábbiakban ismertetett módón, A számozás Shade és munkatársai szerinti l'Shade és mtsai: J. Vüology 53, 921-936 (1986)1. X jelentése 5'~0nöreszeein íoszíor, es a x· lse DABCYLT dT, mindkettőt a Gien Research szerezzük he (Sterling, VA). A szekvencia j< oldalán látható számok a BT9 parvovírus szekvenciából szármázó primerek rsukleotidjainak feleinek meg.
VSP1 - GGAGGCAAAG GTTTGCA (Értelmes primer -- 3334-3350es nukleotídok)
0, számú
VSP2 - GTGCTGAAAC TCTAAAGGT (Anbszensz primer - 3424 344 2 · es hukleotidok) (59, számú szekvencia) ♦ .* X
♦.+.VSPRL - XCCCATGGAGA TATTTAGATT (Próba 3379-3389-es nukleotídok) (61, számú szekvencia)
L számú szekvencia.)
Vpa.ra9: TTTCCACTGG CATTGTÜGC (Antiszensz primer 33153333 es nukleotídok) (89, számú szekvencia)
VparalO: X T,AAGGTGTTTTCTCCCGCAGCGAGT Z, amiben X jelentése Fám és Z jelentése Tamra (3286-3310-es nukleotídok) (93. számú szekvencia) í η ί κ } trr i wt ) ··>«*í**k s ? í n« ,η ϊ m í m*. t ϊμηη 3 s esülfuk meg, és sorozathigitást végzünk, hogy 5000-lö kópiát, kapjunk /20 μΐ, A reakciöeiegy 50 pl végtérfogatban tartalmaz 20 pl mintát, lx Gold Taq amphfíkációs puffért (Perkín Elmer), 3,2 mol/l MgCb, 30Ö-3ÖÖ grnoi/l dNTP-k, 1 pmol az egyes amplifl· kációs primerekböl, 0,4 pmol a próbából, és 1 egység AmplíTaq enzim aktiválására, majd 45 ciklusban 30 másodpere 95 °Co.n, váltakozva 60 °C-szal, egy ABI 7700 Sequenee Detector-ban.
A VSP1 és VSP2 printer-pár használatával, amivel egy 109 bázispár méretű polímeráz lá.nereakeiös terméket generálunk, és a VSPR1. próba használatával akár még 1.0 kópia/esszé is kimutatható, Mivel a minta térfogata 20 ul SÖ pl végtérfogatban, ezért *♦**-»* ?7
olyan plazma-minták is extrahálhafók és kimutathatók TaqMank technológiával;, amik maximum 50 kópia/ml Bl 9 parvovims DNS-t tartalmaz. Mivel a parvovírus egy magas titerű vírus, az elemzéshez 50 μΐ plazma/szérum térfogat extrahálható.
Az FDA-CBER B19 parvovírus DNS-pozít.iv minta (K)6 kopia/ml) használatával a TaqManS technológia esszénként maximum 50 kópiát tartalmaz. Egy olyan kísérletben, amiben a nukleinsavat és az immnntitcrt próbáljuk összhangba hozni, a virális DNS literét mennyiségileg meghatározzuk számos ellenanyag-pozitiv mintában.
Ennek megfelelően űj humán B19 parvovírus szekvenciákat és az ezeket a szekvenciákat alkalmazó kimutatási esszéket nyuvanvaio, hogy oar a mányiak különböző specifikus megvalósítási módjait ismertet] az alábbiakban, illusztrálás céljából, ezekben számos módosítás a ieler
Az alábbiakban részletesen ismertetjük a leírásban említett szekvenciákat., amiket számítógéppel olvasható formában is megadunk.
SZERVEN G1AL1STA <110> CH1RON CORPORATION <12Ö> Diagnosztikai esszék a B19 parvovírushoz
Χ*ΦΦ
φ.
**·* * χ· **« <
Φ * φ* ♦*·*
141>
<2W> 1 <211 > 700 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása: CH47--26 izolátum <400> 1
C Sást.e - at-aercattq gagtgtagea gstgaagage CtttBSBaaa tgfcgsasai&S gO
gaa-aetgggt: tt asagesca: ag rag·.· aaas gastgettta gtttBBBBgg: reeagergce tzs
efcrgtqqeee re: r fceaeqg λ ·;·:.; ii ii t ge cg gaagtrereg e t i: aessego eteagaaaaa 2.29
ΐ gaer r eagi. iggUitetgaa gaageesgea ct gg tgc agg •:;«;;.:;eggqgc 2:7:7
agafofiCEÖ ttaaaggeat gtggagtgag ggggecastt ttagfcggcga gtritgtgsgfc Síit
t gesaa t t tt eeagacagfc.fc tttaattcea fcaí.greeeog ageaesaita fcasggtgtfct: 260
tcííeffiíaseísíj e r .··:.;· egei::; iieracsatgec egr :? gs-age aggeaiaággí. ttígiiaíiíegitt 720
<ΐί^ΐ:ς>θ00.ΐ:.;Ξΐ-0 tgggB-taete BgestigaOigg :ágat:áiit::fca:g airtiiitaistga tatasst ii: é g 729
ettttetsaí et.fc:fea:g:a:gfct: teeeeai t re ;n.tgaas3::i~é. atgggagtat sgetcstgst: 279
get ttsBetg tegeea'tgte: agaastéget gttasggsfcg ttagsgaaaa: asgfcggaggg: 600
ac ·ag gt.aet::gae.ag eactseeggg egectaégea tgttagtága ccgfcgast:
aagt 3<:s:-í3stt aOrgtfcittagg geaaggt cag gatgegttag:
<211> 700 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia
<220
<223> Ar lestersége; s szekvenc ia leírása: CH48-29 1 zelátum
<400>2
afc.= A e aafc. •:::: a í::q gát ·: ::::s ;·.: x gafcgaaggga t.t.ö:33őa.afci fc::·: aaaa·;· a i: 60
.;s ::6 ·: fc t qaaggat:: agfc.agAaíaaa gaqta gfc fc tg. etifcaaaagg fc>g<;.:jgc;tgí:;<;. 120
<act emerre attttgaagg AAgAtAqggg gaagttgggg tttataaege gA<gagaataa A80:
Aácctaggca· Agat A tcaq·: AagtAcAgaa gag.gggggga cAggAggagg tgggggtggc 270
agfcaa: Atafcg C :'2 2; éi -u d Q Cet t. Q'.ggagtqAg gqqqggggfct C. 3 dCtAtúkCi; D AAttgfcaact 300
fcgAaíiafc fc.AA aaagsqggfcfc: fc.fc:. aafc fc gq Aafc gaíxjcag agqqggafc.fc.A fcaaggtgA tfc 360
Aa;:a;.:cq aag cAag AAggAq gaggtaAggA: agAggaAagg aggaagaggt. fctgagaga'Afc: 420
ag Aggta tat. AgqqsA a a.tg «se taxa Agg 3gataAfcAtg atAAtaaAgg D W «vstt. ti 0.(7<2 280
AAttiagaag gAttagggAA teaggageta atAgaaaagA atggaagAat ggcAsctgaA 540
ejar t taagfc g fcaceaafc.afc.q agaaíítfcggfc 'gt-A.aaggstg· tot-g:;:-? aacAggaggg 000
DB C ;:$<< <} i: tactígacaa ggafc.Aqaqgg gxggaaAqci·; Astí: fcagt:sq:a afc:afc. gáttá;:: 6t0
aagtaggaat atgtgttagg ggaaggtaag gSAAAtttfcsEJ ISO
<210>3 <2!1> 700 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia
A mesterséges szekvencia leírása: CH33-2 molaturn
a taxa A caíaA ataqfc.gafc fc. g gacA.gfc.agca gatgasgagA: ttt Aaaaaaa ::afc aaaaaaq SS
qaa,ggg;. ::fc gaaggaga £ C fc:»:?? fc.A A AA gsgAaqA A A a at: A fcaaaagg: fcgcsgetgcA 120
ggfcgfc. ggatc AttAfc'fcfcfcágg aagAAA gacg gaagtAgagg gt fc-asíggiSga qfc. aagaatga 158
taggaaagga AgagtAtagt AaattgAgga gaaggasgga g A qgfcgqsgg aggggq fc gg··;: 240
sgtastAAÁg Acaaaagcsfc gtggagAgag ggggoaaí'fct: AtasagcsAA. sAAtfcgta.stA 800:
tgtgtoatrtA agaggtagtto AAAgaAtggs fcatggAwag •gggAAíífcgA tg fcAsggÁgfc.ta toe
aaaagggtag cAag-tagcAg Aű-saa-atgAA •sgAggaAagg aqqqqaagqfc AAgeafc:taAfc' 478
agtggtatgg tgggaAattg aactAtsfcgg aggtaatAgg atA'Attg'Agt SAagagfcaafcÍ 8 80
AttttfcAtaa· gtA.tagagt A Οααααααα'Οα «tAgsagat A stggssgfcat aggfctgAgaA yií
gezaaggatg? Ztaaagaaaa a a ct ggag gg eaz sa?c:a£:aZgcZ. Zgá ZagZ a g a aaat gaaZza tCC gaZaat/t tag £SS
8Ö
X ν X * *·**·'* * * * «
«. Κ ♦ * ♦ ♦ ·* X * te taaatí; ZaaacaZ a Va agaaa t Ζ gat? ggZsgayg ZtaaZgaaag aasZacsggg y taeaaz £ sί/j í <3 £ £ agg: qa íí a gg Z aaa <210>4 <211 > 700 <213> Mesterséges szekvencia <220 <223> A mesterséges szekvencia leírása: CH33-3 izolátum <400>4
ataaateaat ?gtaat??©gZtq gaaZatagaa ga tgaayaga tfctfcaaaaaa Za Zaaaaaat O
yaaaat agy·: i:?taa?agcaaa ag ?? a ??: Za a a a qaatacZ Z Za cttzZaaaagíj? ZgaagcZgca ize
cáZgáygaac aaz??zze?a?a?gg ggqZáZgcag gaagttcccg cZZacaaziga? ;a caqaaaca ISO
tacccaayca ZgaaZZasgt Z aaZt a t gaa gaagccagca etggtgcagg agggggZgac ;n
agtaatactg aznaa'anaaz gZ:gqagZg?sy ygyqccaatt ZZacfegacaa: ?'ZcZy: aaat. sva
zatacszzzt caag?aa?®a S?V ZZCaaveí'e» t: a:Z g ?a.:cca y agcacca:? t a táággZgzZZ vsa
acz.cca y aZ-aígZ-agí-Zg· cc?aaaa?Zgc?c agZgyaaagg aqgaaaaggZ ttqcgccatt azé
C Z CC.?:.·.l·. ·.; ·:: £ qy?<ís?z?ác?z?z;? aacZ azat gg agatatz zay att: tetaatge ttt.aaa?z?z?z?a •vsa
V tz tee é«W cavaagagta ZasgcaagV® azzgaaaacz atggaagtat agaZazZgat sva
gaáttaactg taaeestata agaast tqct gttaaggatg t!;a;??agacaa aact y y a y ??a bZO
íViggfcanagq z??tya;t:?g:áaag? cac táts® gg cg::cZ:-;:ycc tg/Z Zagtags szatgzaáaa esz
íitagtaosGafe styZqttagy gz-ááqgZaaa ggZaaZttag? ’ b’ >.·
<210>5 <211 > 700 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása: CH33-4 izoiátum <400>5 afcaaatecat atactísattg gaeegfcagcs ^atgaagagc tfcogaaaáaa tafcaaaaaat SS gaaacfcgggt rtcaagcaca agtagtaaaa gacfcacttta ctfctaaaagg: tgcagctgcc 12ö cctgtggccc stfcfcfccssgg: ssgfcttgccg gaagtfccccg cfcfcacaacgc ctcagaaaaa 18S éacecaagca ű.gact:;:ea«t t:aa::::;?i:gca gaagccagcs. ctggtgc&gg agggggtgge 24 0 agtaafceetg ccaáaagcafc g-ggag::gag ggggaoactt scsctgceaa ctcrgtasc ISO fcgfcacatfcfcfc -ccagacagtt tfc'fcaatteca tatgacccag ageacaatt-s. caággtgttfc 3SS tctcccgcag ofcagtagcüg ccacaa-gcc agfcggaaágg aggcaaaggt ttgcaocatt 420 agtaccataa tggga;:.»ctc aact.ccatgg agatatttag attataategc t.táaaafctfca 4 80: tattfettcac Gfcttagagtt be&gc&cefca a&fcgaasat:· atggaagfcaa agefeeetgat 548 gatMaacfcg taaccstate agaaaSfegeS gataaggafcg tüacayacaa aactggaggg SOS ggggtacagg tfeacbgacag aaebacaggg Ggcctatgsc fcgtfcagtaga c«afcgaat.a:c £50 aagtaeccat atgtgtsagg gcaagg;:cag gaa~-;:ttag y 700 <2l()> 6 <211>7 <213> Mesterséges szekvencia <223» Á mesterséges szekvencia leírása: CK.42--7 izolátum <400»6 ataaafcccat: ataetaattg gactgtagca gatgaagagc tttcaaaaaa tataaaa.aat g'@gaaacfcgggt ttcaagcsca agfcagtaaaa gactacttts cfcfctaaaagg fcgcagcfcgcc 12S: cctgtggccc atfcttcaagg aagtttgccg gaagcccccg cttacaacgc ctcagaaaaa ISO tacccaagca cgacttcagfc taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240 agta.at.cctg tcaaaagcat gtggagtgag ggggccactt fctagtgccaa ctctgtaact 300 tgtacatfctt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta fcaaggtgttt 3SQ tctcccgcag c&sgfcagci-g ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420 agtcccataa tgggafcacec aaccccatgg agatatttag afctttaatgc tttaaat·:fca 480 fcttttttcac ettfcag&gfct tcagcactta afcfcgaaaatt atggaagtafc agctcctgat 540 gctttaactg caaccatafcc agaaafctgcfc gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg cáö ggggtacagg ttact-gac&g cactacaggg cgcctatgca tgfctagtaga ccatgaatac 440 aagtacccat afcgfcgt:l:agg gcaaggtcag gatacctfcag 700 <210»7 «*♦* :* ·* ** # <2 χ 1>
<2Γ2>
<213> Mesterséges
Μ2 <223> A mesterséges szekvencia leírása: ΒΗ42-18 xzoWuw.
<400>7 afcaaatccat· atacteatty gactgtagca gatgaagagc tt-fcfcaaaaaa fcat&aasaax 60 gaaactg-ggt tfccaagcaca. agtagfcaaaa gaccacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120 ccfcgtggccc afcfcefcxsagg aagttfcgccg gaagfcfccccg efcfcacaacgc cfcoagaasaa ISö tacccaagca. fcgacfcfccagfc fcaacfcctgca gaagccagca ctggfcgca'gg ®CaS9'3’3SSr 240 agtaafccctg tesasageafc gtggag;:gag qgggccactfc esagtgecaa cecfcgfcaaét 300 fcgéacafc í; fc: ccaga ~agtt fcfctaafctcca tatg-acceag sgqac-safcfca fcaaggfcgfcfcfc 360 fcefcsrcgcag casgfeagefcg ccacsatgcc agfcggaaagg ággcaagggfc ttgcaScatt 4Sö: agtcecataa fcgggafcaefcc aaKcscafcgg agatatttag atfcfcfcaáfcgg fcfctaaafcfcfcs 4 60 fcfcfcfc.ttfccac ctfcfcagagfcfc fccsgc act.t:a atfc.gaaaafcX stggssgr. ?J:. «gr : Ccfcgat S4 8 gefcfctaactg fcaa.qcafcafcc agsaafcfcget gttaaggatg ttacagagaa a&efcggaggg 600 gs^srgcagg trac-gacag ö:ae.fcaca.ggg égccfcaWea fcgfcfcagfcaga ccsfcgaatac SSS aagfcscccafc. afcgfcg.fcfcagg gcaággfc.cag gafcactfcfcag 700 <210>8 <211 > 700 <212> DNS <213 > Mesterséges szekvencia <220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása: CH42M.9 izelátmn <400>8 sfc&aafcccafc afcasfcűsfctg gactgfcagea gatgaagage fctttaaaaaa taeasaaa&t SÖ gaaa-tgggfc fctcaagcaoa agtágfcáaaa gsc;:acfc.tí:a gfcfcfca&sagg fc.g;::agct:gcc 120 ccfcgtggcxc sctctcaagg aagt.ttgccg gaagttcccg rttacs.&cge cfc.cagaaaaa .ISO taaöcaagca fcgactfccagfc fcaattcfcgca gaagccagca cfcggfcgcagg a^g^gggg'c 240 * * V-í *♦·* Φ 9f 4 * «· ♦ * ♦ Φ «·♦♦· Φ ♦· * * » 4 ** ** * » ♦ «· »«>$ $3 sgtasCcctg teaaaageat gtggagtgag ggggeesett tfcagtgceaa ctéfcgtaact 3 00 tgéacattfct eeagatagtt fcfcfcaafceeca fcíatgaetcag ageaccacca teaaggtgttt 360 teteeegeag eaagtagteg ceácaatgcc agtggtáagg aggcaaaggt. t.fegeaeeaCt <20 agfceccaeaa tgggatacec aaceeeafcgg agatatfctag attttaaege ttoaaattt·:; 480 tfcfctfctteac cfctta^agtt -tcageactta afctg.aaaatt atggaagtafc agetctsgat 340 getttaaetg fcaaecatatc agsaattget gétaaggatg tt&cagacaá aactggaggg 600 ggggtaeagg ttacegacag eaetaeaggg egeetatgcs t:gs:cagtaga ccacgaatac SSö aag.tacceafc atgtgttagg geaaggfccag gataetttag 7 00 <2 10>9 <211> 700 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása; CH46-23 izolátum ataaafcccat atacfccattg gactgtagca gafcgaagage tttfcaaaasa tafeassaast 60 gaaactgggfc fctcaagcaca agcagtaaaa gacfeacr,.fct.a ctttaaaagg tgcagefcgcc 120 ccfcgrggccc afcfcfcteaagg aagttcgccg ga.agfcfceeeg cfctacaacgc cteagaaaaa ISO tacccaagca tgacttcagt ta&ttetgca gasgeeagca ctggtgcagg ag.gggggg^c 240 agraatcctg fccaaaagcat gtggagfcgag ggggc-eactfc cfcagtgccaa eC.ckgtaaet 300 tgtacafcfctt eeagaeagtt tttaátteeá tatgattcag agcaccatta taaggtgt.&t 360 fccfcceegeag cásgtagötg ceaeaafegéo: agtggaaagg aggcaaaggt ttgtaccafcfc 420 sgeaccatta fcgggataete aseeeeafcgg agafcafcfctag acfcctaatge fctfcaaafcfcfca <80 bbfcfcfetteae ettfcagagtc ééagcaeKba afctgaaaacfe atggaageat agebeetgst 340 gefcttaaetg taactatafcc agsaafcbget gfcfcaaggatg etaeagaeas aactggaggg 600 ggggfcacagg fetastgacag cactacaggg cgccfcatgca bgfctsgtaga éeatgaatac 660 ssgtaecc&t afcgtgfctagg gcaaggtcag gatactttag 7 00 <210> 10 <21!> 70 0 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia φ♦*. ·«·*♦«· ·«.*.
ÍR κ * * «
>· Λ **·«·* ♦:**:* ί χ$*χ $ > * £-4 <220>
<223> A mesterséges, szekvencia leírása: CKl-1. izelátum <4ÖÖ> 10 ataaatccafc afcactcafcty: gacrtgtsgca gatgaagagc fe.t.téaasaaa tataaaaaat 60 gasaccgggt xfccaagcaca agtagfcaaaa gacíactfcta ctttaaaagg tgcagctgee 120 cctgtggccc atttCöaagg a.a-gtttgccg gaagtfccccg cfctacaacgc ctzcagaaaaa ISO tacccaagca bgacttcagt taafcfccfcgga. gaagccagca ctggfcgcagg aggggggggc 24 ö agtaatcctg tcaaaagcac gt^^agtgtay ggucu .«tct tt. istec-n ctc-'gt'act ^<0 fcgfcaca.fcfcfct ccagacagtt ttrastceca tatgacccag agcaccafcta gt.tt 560 tctcccgeag caagtagctg ccacaatgec sgfcggaaagg' sggeaaaggt fcfcgcaecafcfc 420 agcaccafcfca ogggatacüc aaccccatgg agatatttag xafcfcfc.taafcgc ttfcaaattta 4 80 tfctfctttc&c ct.t.fcagagtx fó&gcaefcfea ategsásatt atggaagtafc agcfccctgat S<0 gctfcfcaactg taaccststc sgoos.ttge·: gttaaggatg tfcacagaeaa aactggaggg 600
SSSgracagg tt.acfcgac.ag cactacaggg cgccfcafcgca· -fcgfcfcag'fcaga ccafcgaatac sso a&gtacccat atgtgfcfeagg gcaaggtcág gatacfefctag 000 <210> 11 <211> 700 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <223> A mesterséges szekvencia leírása: CH1-6 izolátum <400> 11 ataaatccai: atactcafetg gaccgtagca gafcgaagagc t'fctfca&aaaa. rafcaaaaaat 60 gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120 •octgtggocc attttsaagg asgfcttgccg gaagttcccg cttacaacgc cfccagaaaaa ISO tacccaagca cgactfccagt taatfcctgca gaagccagca ctggfcgcagg aggggggggc 240 agtsatcctg tcaaaagcac gtggagtgag ggggccactt ccagt^ccaa ctcfcgtaact 500 tgfcacatttfc ccagacagtt tfccaattcca tatgacccag agcaecatta. fcaaggtgfccx 360 fcfctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggasagg agge&aaggfc tfcgcaccafcfc 42$ agtcccataa tgggafcacfcc aaccccatgg agatatttag sttttaatgc tfctaaattfca. 400 ttttfcfcfccac ccfcfcagagtfc tcagcacfcta attgaaaatt. afcggaagtafc agctccfcgafc 54$ * »»♦ * χ* »»«* χ»»* * »5«» •S5 gctttaactg taaccatátc ag333Ctgct gttaaggatg ttacagacaa áaótggaggg SCO ggggtgcagg ttagtgacag saetscaggg cgcGtatgcs rgttagtaga ccafcgaatac SSO sagfcacccst sfcgtgttagg .gcaaggtoag gataettrag SOS <210> 12 <211 > 700 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása: CH2-8 izolatum <400> 12 afc&aaeeeafc atactöattg gactegtagea gatgaaaagc ctfctaaaaaa fcatsaaaaat 50 gaaactgggt. ttcaagcaca agfeagta-aas. -gacfcsetxfca ctttaaaagg tgeagctgcc 120 7?ctgtggtcc afctttcaagg sagvctgceg -gaagttcccg ettacaacgc cteagaaa&a 2 SS fcacccaagca tgactscagfe caattctgca gaagccagca ctggügcagg aggggggggc 2.40 agcaatcctg tgaaa.3gc3. gtggagtgag ggggccactt tragtgccaa ctctgfcaact 3öö tgtacarrtt ccagacaste fcttaattcca 'tatgaccoag agcaccatta caaggtgttc 360 tcfccccgcag casgtagctg ceacaatgcc agfcggaaagg aggcaaaggfc ttgcaccatt 420 agccccafcaa tgggatacfcc aaccccatgg agatatfctag aíztttaatgc fcttaaatfcfca 4Sö Ettttfcfccac ctcrsgagtt tcagcactfca attgaaaafcfc atggaagtat agctcctgat 54.0 gctttaacfcg -taaccatatc agaaattgct gfcfcaaggatg ttacagacaa aactggaggg 60C SSggtgeagg tfcactgacag cactacaggg .egcctatgea tgttagtaga. ccafcgaatat SZÓ aagfescccat atgtgtfcagg gcaaggtcag gafcacfcfctag ?ö2 <2K)> 13 <211> 700 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása: CH2-10 izolátum ·» ΦΜ*Φ φφχ« * * * φ * φ *»·«»:#»·«* ί φ£»„ <400> 13 araaatcea;: ataeteattg gsctgtage® gstgaagagc tfcttaaasaa tafcsaaaaat 60:
gasactgggfc ctcaagcaca agfcagfcaci&a gacto-ccrra cttfcaaaágg tgcagcogcc 1.2 0 cctgtggccc attttcaagg aagtfcfcgöcg gsagctcccg: cttacaaegc fcttagaaa.aa ISO tacccasgca tg&cfcfccagt. íoaattctgea gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 24Ö:
agtaatcctg agaasagcat gtggagtgsg ggggccse·:.::. ttagfcgccaa cfccfcgtascr. 300:
tgtacafcfc:tt eesgacaafc:fc tttaafetcea tsfc-gseseag agcacca.fcta taaggtgttt 360 tcceccgeag casgtagctg ccacaatgcc agfcggaaagg aggoaaaggt fctgeaccafct 420 agtcccataa fcaggatsete aaeeeeatgg agafcatttag attttsargé tfctaaattfea 0 40 cttttttcac ettfcagagtt ccagcact:::a attgaaaatt afcggaagtafc agcteefcgat 04 0 gctfc.taaefcg fcsaccafcatc agaaattget gttaaggstg ttscagacsg aaetggaggg GÓÖ ggggtgeagg ttaetgacag c&etaeaggg cgcefcatgcs rgfctagtaga ceafcgast&t SSö aagtacccat aégfcgtfcagg gcaaggtcag gatactctag- W <210> 14 <211> 700 es szekvencia <220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása:
C.H2-1 IC izolátum <400 14 ataaatccafc gaaaetgggt cctgtggccc vacceaagca ata.aat.ccag tgtacatttt tetcccgeag agfccccataa tttfct.fct.cac get.ttoísetg gSCgogcagg aagtaccca·:
atsefccattg c tcaagcaca a t fc fcte a agg tgset t.eagt fctaaaagcafc ceagacagtt caagfcagetg tgggatacfcc efcfctagagtfc taacestate teactgacag atgtgfcfcagg gaeegtagca agtagfcaaaa aagfcttgccg fcaattctgca gfcgg.agt.gag tttaatteta ccacaatgce aaccceaíogg fceageaefcfca agsaattget cactacággg gcseggfccag gafcgaagagc gscfcaefcfcta gaagttcecg gaagccsges ggggeeaett tatgaeccag agfcggaaagg agatarttag attgasaafcfc gtfcaaggátg cgcctsfcges gstacfcttág fctttaaasaa ctfctaaaagg c1tac aaege -tggtgeagg ttagtgccss agcaceatts agge&ssggt afcfcfcfcaafcge atggaagfcat fcfcaeagoscss tgttsgtaga tafcaaaaaat 6C: tgeagctgec 120 ctcagaaaaa 1.80: «gSVSZSW: 24 0 ecetetasefc 4 00 tsaggtgttt 362 fc tg c acca tt 4 0ö fcttaaatfcfca 480 sgefccctgat 00s aacíggsggg· 0.0 ecatgaacat 060
790 <2.10> 15
S7 <211 >699 <2 12> DNS <223» A mesterséges szekvencia leírása.: CHS-13 ízolátum <400» 15 cfcasafccsat afcactáiáfcfcg gaccgragca gafegaagagc ttetaaaaaa t.a't.aaaaaafc SO gasactgggt tccsagcaca agtagoaaaa gKceacfctta cct.feasasgg tgcagctgec 120 cccgtggccc afcfctfccaagg aagtttgecg gaagtetcccg ettácaacgc etcagaaaaa. 1SÖ Saeccsagca tg a·:::!:: te cg:: fcaafctcfcgca gaagccagcs. ctggtgeagg aggggggggc 240 afcaaafcccag fcfcaaaagcat gtggagtgag ggggcescct ttagcgccsa efcctgfcaact 300 tgtacatttt ccagacagfcfc tttaafctcca tacgacccag agcaccafcfca taaggtgttC 3S0 fcct;ccegeag caagtagctg ceacaafcgce; ggtggaaagg aggcaaaggt fcfcgcaccaet 430 agtcccataa fcgggaeactc saccccatgg agatatttag attttaafcgc tttaaattts. 4OV tttettfccse cfcfcfcagagtt fccagcacfcfca sttgaaaatfc afcggaagtafc; agctcetgat 540 gcr.fcfcaacfcg fcaaccafc.&fc.c sgaaafctget gfctaaggatg ttsesgacae aaefcggaggg 000 ggggOacagg fcfcactgaeag c&ctacaggg cgccrafcgca -gttagtaga ccstgaatat 000 a-agtacccaa tgfcgfctaggg cfcggtgcagg áfcacfcfctag OSO <210» 16 <211» 700 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>
<223» Á mesterséges szekvencia leírása: Cí-17-22 izeláturn <400» 16 ataaafccca:: gtactcattg gactgfcagca gaOgaagagc fcétfcaaaaaa Safcaaáaáat. 00 gaasetgggt ttcaagcscs agtagtaasa gactáctota cfc;fctaaaagg tgcagctgcc 120 eefc.gtggecc afcfc.fctc.aagg aagtfefcgsűg gccgttcccg .cfcfcacaaogc. efccagasaaa is® fc.a~ccaagca tgscfcfc.cagt fcaafctcfcgca gaagccagcs cfcggtgcagg aggggggggc .24 0
Í6 stsaafcccag tfcaaaagcat gfcgg&gfcgag· gggqccact.fc tta.gtgccaa ctctgtaact 300 tgtacattfct ccagacagtt ttraatecGá 'taegacccag agssceafcfea taaggtgttt 360 tcfccccgcag caagtagctg öcacaáOgGc agtggaaagg aggca&aggt fc.tgcacca.t.t· 42.0 agtcccataa fcgggatactc aaceceatgg agatatttag attífcaatge tt&aaatttg 480 totttttcac ctttagagtt tcagcacfcta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat £40 gctttaactg taaccatatc agaaattgcfc gttaaggatg ttacagacaa •aaotggaggg· SOö ggagtacaag ttactgacag cactacaggg cgocfcatgca tgttagtaga ccacgaatat 660 aagfcacccat atgtgtfcagg geaaggcoag ö«taö:Otfcag 700 <210> 17 <211 > 700 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>
<223> A. mesterséges szekvencia leírása: CH 13-27 izoláíum <400> 17 ataaatccat «tactcsttg gactgtagca. gatgaagagc ttfctaaaaaa tataaaaaat 60 gaaactgggt ttcaagcaca sgtagtaaaa gacfc.scttta cttfcaaaagg tgcagctgcc 12® cctgtggccc atttfccaagg aagtttgccg gaagtfccscog ct&acaacgc ctcagaaaaa 380 tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagecsgca cfcggtgcagg «ggggggggc 240 .agatatttag Ccaassgcat gfeggagsgag .ggggccactt t'tagtgctaa •ctctgfcaáCt 300 fcgfescaí.ttt ccagacagtt tfctaattcca tstqscccág agcaccatta tasggtgttt 360 fcc'tecégéag cgagt-agcfcg .coacaatgcc agtgg&aagg aggc.aaaggt ttgcaccatc 420 agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag atfcttaatgc tttaaattta 480 sxctttt:cac ctttagagtt Seagc&ctta atfcgaaaatt atggaagtafe agctcctgat 340 gcttt&actg taaccatatc agaaafctgct gttaaggatg ttaeagacaa aactggaggg 600. SSggta-::agg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgxtagtaga cc.atgaat.ac 660 aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag· gatactttag 700 <2l0> 13 <211 > 699 <212> DNS <213» Mesterséges szekvencia « * $9 «fc.
<220>
<223» A mesterséges szekvencia leírása; CH 14-33 ízólátum <400> 18 araaatccat. ata-ctöattg ga-cfcgtggea gatgaagagc ttofcaaaaaa ta.t.aasaaat. 60 gas3cc.gggt ttcaageaca agtagtaaaa gacfcacttta ctt:ta.aaagg tgcagcfcgcc 12 0 crmtqgccc áfctcűcaagg aagfettgeóg gaagttcccg ct&acaacgc ctcagaaaaa. 180 tacccaagca fcgacttcagt taat.tct-gca gaagccagca ctggtgcagg agggggggga. 24 ö gtaatcctgt -taasagcatg tggsgtgagg gggccacttt tagtgccaac tctgtaactt 300 gtaeafcttr® cagaCagfcfet: efcaattccafe atgaeccaga gcaccat.fcat a&ggtgtfctt 360 ctcccgcagc aagtagcrg·:: cecaatgcca gtggaaaaga ggcaaaggtt Lgeacestéa 420 gtcccsxaat. gggatactca accccafcgga gatactttaa fefcttaatgct Otsaatttat 480 'fettttttcac •.ttaaatttt cagcactfcsa tttaaa&tfca tgctagtaga gctcctgatg 540 cttfeagagtt a a •'atafcca gsaatfcgctg ttaaagatgt fcacagaeaaa actggagggg: SOÖ gggfcaeaggt taetgacagc: actacagggc gcceafcgcat gttagtggac caegáafcaéa »60 agtacccata tgtgctaggg ctggtgcagg atacttcag SS9
<2lö> 19
<211> 700
<212> DNS
<213> <220> Mestersl iges szekvend
<223> A mesterséges szekvencia leírása' CH62-2 isolátum <400> 19 ataaanccat atactcattg gactgfcagca' gafegaagagc éfcfctaaaaaá tafeáaaáaat áö gaaactgggt tteaagcsca agfcagtaaaa gactacccta ctttaaaagg tgcagctg-cc .120 cctgtggccc atfctteaagg aagfcttgccg gaagttcccg cttacaacgc c.tcagaaa.aa ISO tacccaagca cgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggg.gggggc 240 ataaatccag tcaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300 tgtacakttt ccagacagct tttaatfecca t&fegacccag agcaccatfca taaggtattt 300 tctcccgcag ccagtagctg ccacaatgce agtggsaagg aggcaaaggt ctgc&ccatt 420 agtcccataa tgggatactc aacoccatgg agatstttag attttaatgc tfctaasttta 480 ttttttccac ctttagagtt tcagcae'.fcfca .attgaaaatt at-ggaagtat agetcctgat' 540 gcttta&ctg ta&Gea£:«fcc agaaattg.st gfctaaggatg i:.t,sc.:;ga~;aa aactggaggg -600 gaggtscagg fctacfcgácag cactacaggc cgeefcafcgea cgfctagtaga ccaagaatac ás 9 aag&aofecafe afcgrgfcfcagg gcsaggtcag gatsctrt&g TÖO <210> 20 <211 > 700 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia.
<220» <223» A mesterséges szekvencia leírása: CB.64-2 izoláinm <400» 20 ataaatccat; afcactcsátg gactgcagca gafegaagagc táttaáaáaa festaaaaa&fc SO ga&aCfeggg'fc ttcaageaca agfcagtaaaa gactacrfcfca etttaaaagg fcgcagctgcö· 120 ecfegfc®cc.c afcfc.tfcca.agg aagfcfcfcgccg gaag.tfcccsg cfetacsaegc fetcágáááas. X&Q fcaGCcaagca tgaGttcagt taattctgca gaagecagca crggtgc-sgg aggggggggc 240 aátaatcceg ttaaaagoáfc gtggagtgag ggggcc.acfct tfeagtgceaa cfccfcgfcaacfc 300 tgf.aeat.ttt ccagacagfcfc tttaatüeca tatgacccag ágcaccatfca fcaaggtgfcfcfc 360 fccgcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420 agtcccataa tgggatacfcs· aaccccatgg agaraettag .afctttaatgc tttaaaütfca 48fö ttfcttctcac ctfccagagtt fceagcactts .afcfegaaaart atggaagtat: agctcctgat 54& gctttaactg taaccatato agaaatfcgct gttaaggatg fcfcagfcgceaa aactggaggg 600 SSSStgcagg ttasfcgaeag cactacaggg cgc.ct.afcgm fegttagt-aga: ecatgaatae 000 aagtscecat atglg·:agg gcasggtcag cacacttfag 00 <21O> 21 <21 1» 700 <212» DNS <213» Mesterséges szekvencia <220» <223» A mesterséges szekvencia leírása: C.H67-2 izolátum <400 21 atsaatccat: ataotcattg: gaetgóggoa gafcgaagsgc ttfctaeaaaa fcíUaaaóa: 60 gaaactgggt ttcaagcata agtagbaaaa gaefcaettt-a ctttaaaagg. tgcagttgcc 12ö CCtgtggocc áttfctcaagg aagtttgesg gaagttecég- ctfcagaacgc ócsgaaaaa '18® tacccaagca fcgacttcagí: fcaat.t:cfegca gaagccagca ctggtgeagg sggggggggg 2« aghaatcetg tfcaaaageafc gtggogtgag ggggácactt ttagtgceaa ctotgtaact 388' fegbaea.tbtt ecágacagtt tttaattcea fc&tgaocöag ageaccabta taa-ggtgtfct 86®; fcs-tccogcag saagtagotg csacaabgtc agtgg.aaa.ag aggcaaaggt ttgeascatt 4.20: agtcctataa tgggatsctc aseceeatgg agatatttag attttaatgt tttaaattta 4 8® fettttttca© cttt&gagfet tcagcactta at'tgaaaatt atggaagtat. agctcctgat SÓ gctfetaactg ta-accatatc agaaattgtrfc. gttaaagatg' ttacagaeaa asqSggaggg 688 ggggtaeagg ttaéfcgacag cactacaggg: cgectatgca tgstagtgga ccatgáata·- 6S®: aagtáoccat atgfcgttagg geaaggteag gatactt.tag TO-Ö <210> 22 <211.> 4673 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása; 4,7 kbp POR fragmens a parvovirus Bt 9 2~B1 klókból <400> 22
cecgcettáfc gaaacfcgggc agcaccatta agfcgttttac t staaattta •ttggtcagst 60
ttgtaacggt taaaafegggo ggagcgtagg caaggacfcac agtagcaaaa gcacagcact 12 0
•gccgcagctc cctctttctg ggct.gct £ ·: t ttcctggacfc tactt gc.fcgt ttttsgtgag 1 8 0
ctaactaaca ggtac a tata etscttgtta acatactaac •atggaagtat ttsgagggg-t 20
gcttcaagüi: tcttctaatg tts'ctgacag tgctaacgat aacxggsggc gctctttsct 3 08
ggatttagac acfctctgacc gggaaccact aactca cacs aacagactaa tggcaafcata 3 SS
cttaagcagt gtggcttcta ago ttgact£ tactgggggg ccactagcag ggtgcfctgta 420
cfctfetttcaa gtagaasgta acaaatttga agaaggctat casattcatg; sggttattgg 480
ggggccaggg txaaacccca gaaacctcac agtgtgcgca g&ggggttat ttaataatgt 64 8
actttactao cttgtaactg saaafeafegsa gctaaaattt ·: cgtcaggaa fcgactacaaa 600
aggcaaatac cttagagatg gagagcsg-rc fcataaaaaac tatt caatga aaaaaatacc 668
tttaaafcfcfcfc gtscggtgtg £ tactaata£ tgatggacat ataaatccat gtatttctgc 720
tactfcttaga aagggagctt gecatgccaa. gaaacccegc aSeatescág ccatgaat.aa 080
Α9 y « «« ► , » < «»β * ¢:
<·,* ♦ » * « ο:
eactsgeact gaagggaact «g:: gfctts :?a tagfccacagt teatttagfcg tseeaacsst gtageabgtg tgggtcgcca a t a tggeetg ettggtggfcc ttfcaggeggg agtaectgtg .aacasctgta «tgcagcceá taatgcataa tggsst taat cagfcatcagc cctcafccacc gaeesgttea gtgggaagaa. tgáttá tgtg tagfcggggga stggaasttt reattccttt tgtagafctst efcgfcgtatea tteaaatatfc efcttgtfcfcgs gfccatcsfcet gcagtc&tgc ctgggéaagt aegctgggcc gccaactggc ..11fc a aa a s cfcfctaaaagg cfcfcas'.a ícge ctggfcgcagg ttsgtgeesa agcaeestta aggeaaaggfc afct fc caatgc átggsagtat gafcgcfcgggg aaggctagca gaggataagt ggaagtfctcc ccfeactagea assafcfcgtta t taaagtgga agtacaggga gttaaetgga 9S9Satgaag csatecetes gctatáaeca eargctsaag gscatggggfc agctgggacc geagatgcce agcagtggtg ccaggcgcct ggagaatcafc gccttctaca tgggacggtg ggctfcgggac cgagaafcfcfca tctgtgetaa gagtaaagaa geaaettgfcg aaaagateat ccc&gttgct teaaagt.cst agaaeetaga tagcgtacaa ccegcaasgi: taagttggga taeaaaaaat tgcagctgcc tttsgsaaas 333393333^ etctgfcaset fcaaggtgfctt ttgcac'C’stt ttfcaaafcfcta agetectgat sgcefcsgegg eacaggggca gaggttgtge eCfcfcsasagg 84 0 taaagtttca aactatggta aactggttgt gtgsa.aaeag 900 ggassctagfc tgaetttaaö ecagseagtt tactaagcag 960 «aaítcaaag fcgcaceaaaa ccegcsatfct ataasgcaae 1020 cattctt&tt gcatacagac tttgagcaag tfcatgtgtat 108Ö aafctgttaefc ttgfccaaaac tatgsceccc tafctagtggg 114 0 ttgataáaaa etgtggcaag aasaacseac tgtggfcttta 120 6 aaacaaaefct ggcaatggcc áttgetasaa gfcgtteeagfc 1260 afcaatgaaaa ettteeattt aafcgatgfcag caggaasaag .1320 gtattaocaa gtetacaate gtagaagctg caaaagecat 1380 gggtág&teá aaaaatgegfc ggaagtgtag cfcgtgcefcgg 1440 geaatggtga catfcactttt g·: tgtssgeg ggsseactac 1SÖ0 tcttasaaga gegcatggta aagfctaaaet fcfcaetgtaag 1160 fcaetsacaga ggetgatgta cáacagfcggc fcfcaeatggfcg .162 0 aefcatgaaaa etgggeaáfca; aactaca^tt ttgefcfctccc 268 0 tcc&eee&ga cefcccaaaee accccaattg· tcacagacacf Ί74Ό gfcgassgetc tgaegsactc: agtgasagcs gcfcaetttaa 1660 ggsscaetga éaeceegegc tccagtacgc ccatecccg.g 1160 ctgteggaag ceeagtttee fcccgaagttg t&gctgcafce 1920 caectttggc agaeeagttt cgtgaactgfc tagttggggt 1280 taaggggttt aeetgtetgt tgtgfcgcaac atattaacaa 2040 tstgtcccea ttgcafcfca&fc gfcaggggctfc ggtasaatgg 210 S ccccagattfc. ggfcgcgatgt agetgccatg tgggagcfctt: 2160 öctgcaáaaa atgegcttsc efcgtetggat tge.aaagctt 2220 agt^caaat ggtgggaaag tgacgatsaa tttgcfcaaag 2280 gsattatatg aaaaggttac eggastagae ttagagttfca 2240 tataststtfe etttagataa tcccttagaa aaeceeetct 2400 tata e:aa:;s5 a t estet t aa aa &c tettes gaett at a aa 2460 ggacagfcfcat etgaceacce ccatgccfcta tcetecagta 2220 ggagaagstg eagtsttatt feagtgaagaö tbaeacaegt 2180 ctacccggta etaactatgfc tgggcctggc eatgagetae 2640 gctgttgaea gtgetatasg gattestgac tteeggtsta 2700 afcaaatccat atactcattg; gactgtagea gatgasgage 2760 gsaaetgggt tfcc&agcaca agfcagtaaas getts.ettta 2820 cctgtggccc sttttcasgg aagtttgceg gsagttcceg 2SS0 tecctaagea tgacttcagt taattctgca g&ageeagta 2940 sgfcaatcetg tgassageat gtggagtgsg ggggceaefct 3960 fcceacs ·:·::!. tesgacaatt fcfct&afctece tstgacccsg 3060 tctcccgcsg eaagtagetg ceseaatgee sgfcggssagg 3120 agettea tea tgggotaetc aaecccáfegg acsfcseetsg 3180 ttttfcfctcac crttagagtt fcesgcacfcts attgasaatt 3340 getttasebg taaccafcatc agaaattget gttaaggatg 3330 fcfcaeggacaa tgfctagtsga ceccagaact afcgtfcaaeac tfcfcatgttfcfc ectafcaagfct aastgfcaeas ea&áafcfefcag ggceactsgt aagcct táát ygccagtgtc eeatfcfccfcea •rgggtagatt ccfcac'tttcc tgggttctgt eaaafcfcfcaga agccacctcc aatcaafcggg cat.fcfcsaatfc ccccgcacgc aaeaaeacca fcgcacccafcfc. eeagfcaceac aacfcggaggg ccstgaátsfc tcefcafctfcgg aeaaggaatfc ggaacacsgfc fccefcccagfcg cetettatát áfccfcfcfcaaca aaaetesete aggcettagé tesgeegtae fcggfcesga.ee tccaasfcgaa csata aaggs afcggaacaga tgaesgtttt tCSSS líáfcfet aafcfc&sta.cc ggggceecgt agc aggfccafc· eagacatgga gfcsasésete ccag.se fcg.ta
3335mca33 aagtseeeafc gfcafc&cfcfcfcc tctggagaca fcetttteage cececagsaa ggateeeget catgsacaee tctaeaaagg aeaggfcaeefc eseeaefcggg acfctafcggta aaagascsge acccagcaafc aqsgeeefctc aaaactca.gt fccaaaaafcac fcfcsgfctcagt aaagetsegg fctacsat&tg fcatgáaaage eceaecgtge cetgecetet * « » · , í «<♦ . , ♦ « κ ' .
»♦·» .»» , ttactgscsg esetacagqg egeetstgea 33 SÖ stgtgtcsgg gcaaggfccaa gafcacfcfctág 2426cecctcaafca cgrfctaccta acagtaggag 3480 gcaaaaastfc ggcsagfcgss. gaatcsgcat 3340 ttttaggfcac aggaggtaca gcaacfcafcgt 3500 atttsgaggg ctgeagteaa esefctfcfcáfcg· 3>SSÖ fcaggggttcc fcgacacafcts ggaggtgaee 3730 stgcaatt.es geeecaa&ae ttcatgccsg 3700 agggsgacag ctetagcact ggagctggaa 3@4S etcaa&aeac tsgsstafcec ttaegcectg 3300 aeseagataa statgteaea ggsstaastg 33S0 aegetgsaga csaagagtat cageaaggag 4020 taaaaeagtt ac&qggt.tfcs saeatgcsca 4 0 3 0 ataesgatca asttgaqcgc eeectaafcgg 4140 actacgaaag ccagcfcgtgg agtaasstte 4200 ttqeagestt ággaggatgg ggfcfctge&fce 4200 fcaceacaaag tgggceasfct ggaggfcafcta 4320 atgecgtggg aattatgaea gtaaesafcga W gscggtggaa tcetc&acefc ggsgtgtafce 4440 fcacfcat« fcga ecccacagefc acag&fcgcaa · 50 0 etgaagaatt gfcggaeagee ssaagöegfcg 4SSö eetcsgceag gatgfegfcáse taasegeees 4520: ccfcataccfca fcaagacagee taacaess 4S7S <:210> 23 <211> 4Ő78 <212> DNS <213» Mesterséges szekvencia <223> A mesterséges szekvencia leírása: 4,7 khp PCR fragmens a parvovírus B19 :2~3B6Ménból <400> 23 eecgcettst gesastggge agecatcfcts sgtgfcfcfcfcae tatásttcta ttggtcagtt 00 fcfcgfcaseggfc fcsaaafcggge: ggagegtagg casggaetac agtstafcafca geaeageaet 320 geegcag-tc ttttettető egetgc· · i - ttectegaet taci< tetet cctttyieag ;so etaactaac® ggta::.t.tata étsct.tgí: t a acaoactsae atggager.at ttsgaggggt 24C gcttcaagtfc t.cttctaatg ttctggacfcg fcgctaacgat aactggtggá gct.exfcfcsct. 3Gö ggstfctagac acttctgact gggaaccacc aactcacact aaeagactaé eggtaAtátá 360 cttaageagt gtggcttcta agcttgactt tsetgggggg ccacfcagcag ggfcgcttgta 420 ctttfcttcaa gtagaafcgta acaaatttga agaaggctafc cafcatfccafcgr tggttactgg 480 ggggccaggg fctaaacccca gsaacctcsc agfcgtgtgta gaggggttat fcfcaataatgt 540 actttatcac cttgt&actg aaaatctgaa gctaaaattt ttgccaggaa tgactacaaa SöO «ggcaaatac fcttagagatg gagagcagtt tatagaaaac ta·:rtaatga asasaatacc 6'6C>
tttaaatgtt gcatggtgtg ttaeraatst fcgatggacat atagatacct gtatttctge 720 tactt.ttaga .aagggsgett gceatgccsa saaaccscgc atecaecacag ccataaaegA 180 tacÉagtact gatgctgggg: agfectagUgg eacaggggea gaggtfcgtgx catsttaatgg: 84 0 gaaggga&st aaggctagea taaagfcttca aacfcatggta aaetggfctgfc gfcgaaa.ac-ag 900 agtgtttaca gaggataagt ggaaactagt tgactttaae eagtacaett taotaagcag SőO tagtcacagt ggaagrtttc aaactcaaag tgcactaaaa ctagcaattt ataaagcaac 1020 táatttagtg cctactsgca eattttfeatt gcatacagac tttgagcaag ttatgtgta·: 10.80 taaagacaafe aaaattgtta aattgttact ttgtcaaaac tatgaccccc tattagtggg: 1140 qcagcatgtg ttaaagtgga ttgataaaaa atgtggcaag aaaaacacac tgtggtttta 1200 cggaccgcca sgtacaggga aascaaactt ggcaatggcc attgctaaaa gtgttccagt 1260 atatggcatg· gttaactgga araatgaaaa ctttceafctt -aatgatgtag caggaaaaag' 1320 cttggtggtc tgggatgaag gtateáttaa gtetaosst.t gtagaagctg caaaagccat X38ö: :~>:aggeggg caacccacca gggtagatca aa«aa:;:.gcgfc ggaagtgtsg ctgtgcctgg- 1440 agtacccgtg gttataacca gcaatggtga tsfctaetttfc gttgtaagcg ggaacactac 1500 aacaaetgta catgcfcaaag ccttaaaaga gcgcatggta .aagttaaacfc; ttactgtssg 1520 atgcagccet gaCatggggt tactaacaga ggctgatgta caacagtgge tfcacatggtg }«>0;
taatgcacaa agctgggasc actatgaaaa ctgggcaata aactacaett. ttgstteteec isse tggaatfcaat gcsgatgccc fcceaeceaga cctccaaacc acccca.;A:::g tcacagac&c 1740cagtatcagc agcagtggfcg gtgaaagctc tgaagaactc agtgaaagea gc'fc'ttt.t'.taa· 1800 cetcatsatc ccaggcgcet ggascactga aaceecgcgc tctágfcacgő ccatceccgg ISSO gaccagttea ggagastcst ctgtcggaag cccagtttcc teegaagttg fcagctgcatc .1920 gtgggaagaa gccttctaca cacctttggc agaccagttt cgtgaacfcgt tagfcfcggggt ISSO tgattatgtg tgggacggtg taaggggttt acccgtctgt tgtgtgcaac atatcaacaa 2040 tagtggggga ggcfcfcgggac cfctgtcccca ttgcattaat gtaggggctt ggtataatgg 2100 atggaaattc cgagaafctta ccccagattt ggtgcgasgt agctgccatg fcgggagcttc 23.60 taatcccttt fcctgtgcfcaa cctgcaaaas atgfcgcttac cfcgtcCggafc tgcaaagctt 2220 fcgfcagattat gagfcaaagaa agtgqcaaat. ggtgggaaag tgatgataaa fcxtgctáaag 2280 ctgtgtatca gcsatfcfc.gfcg gasfcfettatg aaaaggttac feggaacágac fctagagetta 2140 ttgaaa'tatt. aaaagatcat tataafc&ttt cttfcag'ataa tcceetagas ascceatcct 2400 •efcttgtttga ettagttget cgfcafcfcsaaa axaaccttaa aaactcfccca. gaettatata 2468 gtcatcatt:: vc&ss.gteafe ggacagfcfca't cfc.gaccáccc ecstgeetCá tcáfccesgta 2520 gcagtcatge: agaacctags ggagaagatg cagtactsfcS: tagfcgasgsc ttacacaagc 2 580 ctgggcaagfc tagcgtacaa ctacccggta ctaactatgc tgggcctggc aatgagetae 2S40 aagctgggcc eecgcaaagt gcfegttgaCa gtgctgcaag gattcatgac fcfcfcaggtata 2700 gccaactggc taagfctggga aSaaatccat ataGbcattg gacfcgfcagca gatgaagagc 2700 teefeáaaáá-a fcataaaaaat gsaactg-ggtt ttcaagca-ca agfcagtaaaa gacfcactfcta 2820 cfcttasaagg tgcagctgcc cctgtggccc attttcsagg aagctfcöGeg gaagtteccg 2830 cftacaacgc ctcagaaaaa tacccaagca tgaccccagt caattctgca gaagccagca 2S40 Cfcgg'fcgsagg aggggggggc agfcsatccfcg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccacfct 3000 fcfcagtgcca& cGcrgtasct fcgtacafcfett Gcagacaafct tttaattcca tafcgacccag 3060 agcaccatta taaggtgttt fccfccecgcag caagtagctg- Gcaeaatgcc agtggaaagg 3120 aggcaaaggt cfcgcaccafct agtcccataa fcggg.afcacfcc aaccccafgg· agatafc.fc.tag 3180 afctttssűgc fct:t:aaattfca .fcttfcfc'ttcat ctttagagfcfe -fccagcacfcfca afctgaaaatfc 3240 afc'ggaagfcat agcfccc&gafc gcfctt&acfcg fcaaccatefct agaaafctgct gfcfcaaggafeg 3300 fcfcacaaaöa® aacfcggaggg 3SSStgc&gg t'táLcfcgacag •öacfcaeaggg cgccfcafcgca 33SS tg-tagtaga «’afcgaatafc aagtacccat. atgfcgfcxagg gcaaggtcaa gatactfctag 3420 CCC73J25C tccfca.t.fctgg gt&fc&ctttc caccOGsara cge*:.o.»etta ácagtaggag 34 80 atgtfcaacac acaaggaatt -tct-ggagaca gcaaaaaatt ggcaagtgaa gaafccagcat '3540 tttatgttfcfc ggaacacagt rcfctttcagc ttttaggfcac sggaggtsca gcaatfcatgt 3300 ct cataagtr. ccctccagtg cccccagaas. attfcagaggg cfcgcagttaa csctfcttafcg 2000 aaat:gbacaa ccccfcfcatae ggatcccgot taggggfctcc tgacacafcfca ggaggcgatc- 3720 c.aaaatfctag afcctfcüaac® catgaagacc atgcaafcfcca gccccaaaac tfccafcgccag 3?80 ggccactagt aaacfccagfcg tctacaaagg sgggagse&g ctctagtaet ggagcfcggaa 3840 aagcctfcaac aggcctcagc acaggtacct cfccaaaatac tagaacatcc ttacgccctg 3300 gg'esagfcgtc ccagccgtac caccacfcgág acacagafcaa afcatsfecaes ggastaaatg 3 960 cc&fcfcfeűfcca tggccagacc acttatggfca acgctgaaga caaagagfcát cagcaaggag 4 020 fcgggtagafct tccaaafcgaa aaagaacagc fcaaaaeagtf: scagggtfc'fca aacatgcaca 4080 cctacü·:ixc caafcaaagga acccagcaafc atacagatca aaücgagcgc cccctaafcgg 4140 tgggtfcctgfc atggaacaga agagoccfcfcc acfcatgaaag ccagcfcgtgg agcaaaattc 4200 caaatfctaga tgacagttcc ^-“sctcagt ttgeagsotfc aggaggatgg ggttogcatc 2200 agccacctcc tcaaafc.atfc.fc f attsafcafc fcaceacsaag tgggccaafcfc: gg&ggtafcfca 432© aafccaafcggg aattscts-c ttagfctcagfc atgccgtggg aafctatgaca gtaagcatga 438© cattcaaafcfc ggggcc-ccgfc. aaagctacgg gacggcggaa. 'fcccfccaacct gg.agfcgfc.atc .4440 ccccgcácgc agcaggtcat fcfcaöcatatg fcacfc&fcatga ccccacagcfc acagafcgcaá 4 500 aacsacacc-a :caga.ca.fc'gga tafcgaaaagc ctgaagaatt gfcggacagcö' aaa.agccgfcg 4560 tgcacccafct gtaascacte ectaccgtgc: ccfccsgecag gafegfcgfcasé taaacgccea· 4620 ccagtaccác ccaciGccgta ccfcgcccceo GGi.at.accta fcaagacagce fcaacaeaá 4678 <2W> 24 <211> 2049 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia ._** XXXί» * * * χ' <223> A mesterséges szekvencia leírása: NS1 a parvovírus
SÍ klónkéi <40Ö> 24
atsctetfceg aacaaaacsa aafeggagcta tttisc =iscgg fcgcttcaagt ttcttctaat SÖ
gteotggacfc gtgceaacga esactggrgg égttetetae tggatttaga cacttctgac 120
tgggaaccsc tsactcaeac tsacsgacta acggcaatac acttsagcag tgtggcttct 130
sagcttgsct ttsccggggg gecactagea gggtgcttgt settttttea agtagaatgt 240
sacaaatttg aagaaggcfca testattese gfcggttaétg 99999ecagg gfcfc&aacceé. 0 00
agassőetca cagfcgtgCge agaggggtta tteaat.aa.eg tac í. í: latsa cctfcgtaact 360
gaaaatcega agceaaaatc ·: >: t gccagga .stgaetacaa aaggcaaafca etttagagat 420
ggagagcsgt etatagassa etaétfcsatg aaaaaaa:tac ctttaaatgt tgtatggtgt 4 50
gttscCaafca tegafc:gg.aca tatagaCact tgestttctg cfcacttCfc.ag saagggsgct 540
egccatgcca agaáaccccg cafc. caccaea gttataaatg •stsctagtác tgatgctggg 600
gagectagcg gcae.agggge agsggtt.gtg c.cafcttsa.t.g ggaaggga&c taaggetage 5S0
afcaasgefcfcc saactatgge aaattggetg tgtgaaaacs gagtgtttac agaggataag 720
cggaasctag ttgaccttaa ccagtatset ttactaagca gtagfccacsg tggaagttet S0
caasttcaaa gtgcacfcaaa actagcasfcfe tataaagcaa ctaa +►agfc gcctactagc 84 0
•acatttffca-fc. tgcaeacaga ccctgagcáa gttstgtgta ttaaas^ $ taaaattgté SOS
aaattgttse Ettgtcaaaa ctaegacttc ccafctagtgg ggcagcacgt gteaaagtgg 060
attgacaa&a asegeggcsa gaaaaacaca ctgtggcrfct stgggccgce aagtacsggg 102 0
aaaacaaace tggcaacggc: est egetaaa agtgttccag tatstggcat ggtfcaactgg 108 0
aatsatgass <iettt teste ta&tgacgta gcaggsaaaa gcccggtggt ctgggstgaa .114 0
ggtattaeta aatt&acaat tgtagaager. gcaaaagcca tttts.ggcgg gcaaceeaec 1200
&339t agatc aaaa'&a tgcg tggaagtgca gcCgtgcctg gagtacctgt ggfctstaaeö 128 0
agcastggeg acaecacttt :gfc.tgt-aa.ge ggg.aacacfca CS.-iC33.Ctgt scatgetssa 1320
gecttaasag agcgcaeggt aaagttaaac e cfcsctgtaa gátgcsgccc tgacafcgggg 1300
ttactaacag «.ggctgatgc aca.acagc.gg etta catggt gtaatgfcaca sagctgggsc 144 0
cactatgaaa sctgggcaat aaactacscr •fcfetg-atttc-c ctggaafcta.s tgcagatgcc 16 00
ceccacccag acctcc&aac caeeccaatt gfccacags.cs. ccagtafccag csgcagtggt IS S0
ggCgaaagct cegaagaafce cagfcgaaagc sgetttttta acctcattat cccaggcgcc 18 2 0
tggaacactg aaaccccgcg cfcctagtacg cccstcctcg ggaccagttc aggagastca 16SC
fccfcgtcggaa gcccagfcttc ctccgaag-fct. gfcagctgeac s-'gtgggaaga agccfctc'tsc 174 0
acaccfcttgg cagaccagrfc tcgtgaaccg tCsgtt.gggg ttgattatg ·: gtgggacggt 1800
gfcasggggtt taccegtetg tegtgtgeaa c&fcattsaca atagtggggg sggctfcggga 1860
et:i: tgfccc.c-c sttgestcaa tgtaggggct Cggtataatg gatggaaafcfc tcgagaatfcfc 1020
•accccagatt tggegegacg tagetgecat gtgggagctc ctsstccctt ttcfcgtgcta 1980
acctgcasaa aatgtgceea cctg tctgga ttgcaaagct ·: tat agatta fcgagtaagfcc 204 0
gacataccc
04 0 *♦ * * « *· *»x * «r **♦ ·* «*«· «♦*«
<21u> 2o <21I» 671 <212> Fehérje <213» Mesterséges szekvencia <220» <223> A mesterséges szekvencia leírása: NS1 aminosav a parvovírus BI9 2-B1 klón feni <460» 25
Mse mű 0 Leu Phe Arg Oly 5 Val Leu Glo Val 10 Ser Ser Asp Val LSV 13 Asp
Cys; Alá Asp Asp Asa Trp Trp Cys: Sár Leu Leu Asp Lav Asp Thr Ser
20 25 3ö
Asp Trp Glu Pro Cár: Tár Kis Thr Asu Arg Lee Met Alá He Tyr Les.
35 4 ;2 45
Ser Ser Val Alá Ser Lys Lee Asp i'Le Thr Oly Gly H Lep Alá Oly
SS SS 60
Cys Let Tyr rhs: The Cin Vei Glu Cys Afen Lys Phe gip. Hu Gly 'Tyr
SS 22 75 Só
Kis He Kis Val Val He Gly Oly Pro Oly Les As;:· Pro Arg Asa Hu
83 SO 55
Thr Val Cyí; Val. Cl a Oly ipa He Asn Asn Val Leu Tyr Kis Leu Val
303 105 1T8
Thr Hu 5 n L<5U Lys Lev Lys ?he Leu Pro Oly Met Thr Thr Lys Gly
115 12 0
Lys Tyr Khe Arg Asp Oly Cl a 0.1:0 The Tie Qiu A se Tyr Lee Met. Lys
130 135 110
Lys He Pró Kés. Asn Val. Val Trp Cys Val Thr A.so. He Asp elv hs
14 5 150 155 S. <50
He Asp Thr Cys íle Ser Alá TOr He Arg Lys oly A.k3 Cys Kis Al a
1SS 17 Ö 175
fip Cys Kro Arg Ue Thr Thr A.X3. 21« As:; Aap Thr Ser Thr Asp Alá
180 165 iw
Oly cl a Sa.:· Ser Oly Tar Oly Alá Giv Val Val Pro He Asn Gly Ays
19S 200 205
* ♦
Gl y Thl·· 220 Sys Aia Ser I'Ie l<ys Phe Gin Thr Ke- Vai 220 Asa Trp Sea Cyb
Glu Aea Arg Vél The Thr G.k· Asp Sys Trp Sys: Ser Val Asp Phe As:h
225 23 0 235 24.0
G Ír- Tyr Thr SSU Ser Ser Ser Ser Kis Ser Giy Ser Phe Gir· Tle Gir
245 250 255
Ser Al ·:! Ser .Syr Ser Aia Ss Tyr Sys Als Thr Asxi Seu Val Pro Thr
2 50 265 270
Ser Thr Pha Ser Seu Hl· 8 Thr Asp The Gir Gla Vai Vet Cys n.« Sys:
275 2 SÓ 285
Ase Aon Sva ne Vai Sva Ser Seh Ser Gya Glh Asa Tyr Asp Pro hsa
290 2:35 3 00
Ser Val Oly Gin Kis Vai. Ser Sys Trp lle Asp Sya Sys Cys Giy Gye
305 no 315 32 ö
Sys ÁSS Thr Ser 2; r Síié Tyr Giy Pro Pro Ser Thr Giy Sys Thr A:sn
325 3 3 0 335
Lati Aia Vet Air U.e Aia Sys Ser Vai Pro Ta- Tyr Giy Kér. Val Asn
34 0: 315 322
Trp Asn Asp Gin Arr The Pro The Asn Áss vai Alá Giy Oyr Ser Geo
3 SS 3 60 3 65
Val Vai Trp Asp Glu Giy iie TÍV: Sys Ser Thr Tle Val Glu Alá. Alá
370 375 300
lys Alá n© Ser Giy Giy Gin Pro Thr Arg Vai Asp Gin Sys Ver Arg
3 SS 3 20 395 3 no
Giy Ser Vai Aia Vai Pro Giy Vai Pro Vai Vai Tle Thr Ser Ash Giy
405 410 415
Asp Tle Tar Phe Vai Vai Sár Giy Asn Thr Thr Thr Thl·· Vai Kis Alá
42 i) 42:5 430
Sys Alá Ser Sys Glu Arg ?4ét vei Sys Séa. Apu Phe Thr Vai Arg Cys
4 35 440 445
Ser Pro Asp Vei: Giy Ser Ser: Thr Gir Alá Áss? Va , Gir· Gin Trp Ser
450 155 no
Ti;r Trp Cys Asr Alá Gin Ser Trp Asp Kis Ty< G! u Asn Trp Alá Tle
4 SS 470 475 4 80
ÁSÓ Tyr Thr The Asp The Pro Giy Tle Asrt Alá. Asp ALL s. Ser K.í .? Pro
4.83 499 4 SS
Aap Ser Gin Thr' Thr Pro ne Vai Thr Asp Thr Ser lle Ser Ser Ser
SOC SOS STO
Giy Giy Glu Ser Ser Gla Glu Ser: Ser Gir Ser Sér Phe The As;r Se·.:
515 :S2Ö 52 5
n« Thr Pro Giy Air Trp Asa Thr Gin Thr Pro Arg Ser Ser Thr Pro
530 535 540
lie Prc Oly lh£ Ser Ser Oly Glu Ser Ser Val Oly Ser Pro Val Ser
545 550 5 SS > 60
Sár Giu Val Val Alá Alá Sor Trp Glu Glu AÍA Phe Tyr Thr Pro Leu
265 578 575
Alá Asp Cin Phs Arg Siti .leu Heti Val Gly Val Asp Tyr Val Trp Asp
580 SÓS j 3 90
Gly Váj. Arg Gly len Pro Val Cys Cys Val Gin His .Ara Asa Asn Ser
595 60 5
Oly Gly Oly leu Gly leu Cys Pro His Gye The Asn Vei Gly Alá Trp
610 6.15 620
Tyr Asn Gly Trp lys Phe Arg Glu Phe Thr Pro Asp leu Val. Arg Cys
625 536 625 Ö
Ser Cys; His Váj. Oly Alá Ser Asp Pro Pha Ser Val leu Thr Cys lys
64 5 650 .· S55
lys Cys Alá Tyr leu Ser Gly leu. Glu Ser PÁS: Val Asp Tyr Glu
660 665 620
<2.10> 26 <2Π> 2380 <2i2> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220?
<223> A mesterséges sz ?neí& leírása.: VP1 a parvövirns 819 2 <400> 26 afcacteaago ttacaaaac? aaatyagtaa agaaagtggc· aaatggtggg aaagtgatga 57 taaatttegcr aasgctgtgfc atcagcaatt tgEggaafctt tatgaaaagg ttactggaac 120 agacttagag cütafctcsaa tafctaaaaga tcsttataafc atttefcfc.feag ataatcccct 160 ag&a'aaccca tcctcfcfctgt ttgacttagt tgefccgtst·: á&aaataaeö Ctyaaaaetc 240 töcagactta tatagtcatc atttfccaaag tcatggacag cratstgacc acccccatge 300 úfcteteafccc agtagcagte afc.gcagaaec tagaggagaa •gatgcagtat tatctagtga 36 7 agacfetaeae aagcctgggc aagtfcagcgt acaactaccc ggtacta&ct afcgttgggco 420 rggcaatgag ctacaagctg ggccccegea aagtacrgrt gacagfcgctg maggattca 466 tgactttagg fcatagccaac tggcsaagt,t· gggaataaat ccatatactc attggactgfc 540 agcagatgaa gagctfcttaa aaaatataaa aaat.gaaac·: gggttfccaag cacaagtagt 608 aaaagaetac •gccggaagtt: tgcagaogcc tgagggggcc tceatafcgac tgcxagtgga atggagatat ettaatfcgaa tgatgttsag agggcgtxta fccaa.gatact cfctaacagta tgaagaatcá tacsgeaáct tcaacacttfc: attággáagt assctteatg taeiggaget at.ccí:t acgc cacaggaata gtatcagcaa tttaascafcg gegcccccta. S^ggagfcaaa afcggggtttg aatfcggaggt· gacagtaacc a ce tggagfcg agalatagat agtxsaaágc tttáöfcttaa cccgcttaca agcatlggtg actfcttagtg ccagagcacc aaggaggcaa ttagat ttta aafctatggaa gatgtt&cgg tgcatgttag ttagtcceag ggagafcgtta géafetfctafcg atgicttata t&fcgaaafcgt gaarca a aat ccagggccat ggaaaagcct cctgggccag aatgccattt ggagtgggr a cacacctact -arggfcgggtt afctctaaact catcagacat afcfc.ass?tCss atgaöáfcfcts tattceacgc gcaa&acaae agtgtgaace aaggtgcage aegcctaaga caggaggggg ccaactctgt attatsaggt aggtttgcac a rgatttsaa gtatagctac acaaaactgg tagaccatga aacti: cet at. acacacaagg ttfctggaaca agtttactcc s.caacccctfc. ttagatcttt aagtaaact c taacaggcct tgtftcsgcc otsatggtca gatttecaaa tt cccaataa ctgfcatggaa fcagatgacag ctc-ctcaast tgggaatfcác aafciggggce átgcagtagg aocacagaca cattgtaagt
X;* »**♦ »*** * * ♦ X ♦ χ * *·♦·* < ♦ * * ·* X· iOO tgcaacfcgfcg: gccc&ttttc aaggaagttt S00 aa-aataccea agcaagáctt tagttaatfec 20 gggcagtaafc cctgtga&aa gcatgtggsg Sö aacttgt&cs ttfctccagac aatttttaat 34 8 gfcttfcetcee gcagcaagta gcfcgccacaa. 800 cattagtccc ataafcgggat actcaacccc 360 tttstttfcfet tcacctttag agtttcagca 1820 tgatgcttta actgtaacca tatcagaaat 1880 agggggggtg caggttactg acageactac 2140 atatsagtat ccatargtgfc : aggqc3<s.gg 1200 tfcgggt.afcse fcfeteccecfcc aafcacgetfca 2260 aafcfcfccfcgga gacágcaaaa a&ttggűaag 1121 cagttetfctt c&gét&tfcag gtacaggagg 130 0 ágtgecccca. gaaaatfctag agggctgtag 14 4 0 atacggatc-:: egcttagggg ttcxfcgscai' 150 0 aaöaeatgaa .gaccatgcaa ttcageccca 1500 agtgtcfeaca aaggagggag acagetcfiag 16:2 S tagcacsggfc. acctcfccaaa acacfcagaat isso gtaccaccac tgggacatag ataasLatgt .174'0 gaccactfcat ggt.aacgctg asgaeaaaga 1800 tgaaa-aagaa cag-fess aat agttacaggg 1060 aggaacccag taatatacag atcaaattga 1820 cagaagagcc cttcactatg aaag.ccagct. I8S8 ttttaaaaot cagtttgcag tottaggagg 2010 atttttaaaá afeattaccac aaagtgggcc S2Ö0 taecttagtfc cagtatgccg fcgggaattat 2160 eagí:aaaget acgggacggt: ggaatcctca 2220 tcattfcacca tafcgtactat ataactccac 2:200 tggatatgaa aagcctgaag aattgtggac 2340 aga tat sete 23:08 <211> 781 ínene <213> Mesterséges szekvencia <220>
* * «* ♦
101 *»* <>
X** :223» Á mesterséges szekvencia leírása: VP1 aminosav a cinné 2-B1 <400> 27
Seb 4 S« b Cys Gte Ser c Gly Lys T::'P Trp- Glu ’ί Λ Ser Asp Asp Lys Phe 15 Thr Alá
£ Lys Al a Val Tyr o Gin Glu Phe Wí Glu Pss Tvr Glu Lys Wí Gly
Thr Asn .Leu 20 Glu Leu ris Glu He 25 Leu Lys Asp Mis Tyr 3 9 Asn He Ser
Len Aap 35 Asn Pro Leu Glu Asa 4 0 Pro Ser Ser Leu Phe 4.5 As p Leu Tál Alá
Arg· 50 He Cys ft£X: Asn Leu SS Lys Asn Ser Pro Aap 50 Leu Tyr Se?: Mis Mis
•55 Phe Gi·'. Ser Mis Gly 70 Glu Leu Ser Asp Mis 7.5 Prö Mis A is Leu Ser 50 Ser
Ser Ser Se:?: Mis 85 Al·:: Glu Pro Arg Gly 90 Glu Asp Alá H Leu 95 Ser Ser
Glu ASp Leu 10 0 Kis Cys Pro Gly Gin 105 Vél Ser H Gin Leu 110 Pro Gly Thr
ÁSD. Tyr 115 vei Hy Pro Gly Asn 120 Glu: Leu Gin Alá Gly L25 Pro Pro Glu
139 135 14 0
AIs Val Asp Ser Alá Als Arg He Mis Asp. Phs Arg Tyr Ser Gin Len
14:5 ISO: IS 5 - 16 9
Alá Cys Len Hy He .9:5:3 Pro Tyr Thr Mis Trp Thr· Vai. .4 is. Aap Glu
1SS 170 175
Glu Leu Leu cys Asn He ny s Asn Hu Tnr Hy The Hn. Alá Gin. Val
180 18.5 1:99
Tel Lys Asp Tyr Phe Thr Leu Lys öiy Ala Als Al a Pro Val Alá. Mis
105 200 3 OS
Phe Glu Oly Ser Leu Pro Glu :r· Pro Als Tyr Asn. Alá Ser Hu Lys
210 215 2:29
Tyr Pro Ser Met Th?: Ser Tál. í·. —. Ser Alá Glu Alá Ser Thr Gly A.: a
225 239 235 >4 8
Gly Gly Gly Gly Ser Asn Pro Tál Cya Ser Mer Trp Ser Hu Gly Alá
245 2S0 2 55
Thr Phe Ser Als Asn Ser Val Thr Cys Thr Phe Ser Arg Gin. Phe Leu.
260 265 HL
He Pro Tyr Asp Pro Glu Mis H.ls Tyr Cys Val Phs Ser Pro Aia Ale
275.· 289 2 SS
1Ö2
Ser Ser '390 Cys Kis Asn Alá Ser Gly Lys öl® Alá Lys Val Cys Thr Tle
293 30 0
Ser Pro TIe Met Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Arg Tyr Lee Asp Phe Asn
SOS 310 315 3.20
Alá L-S® Aett Len Phe Phe Ser Pro Le® Gin Phe Gin Hts Leu He öl®
325 330 335
Asr. Tyr öly Ser He Alá Pro Asp .Alá Le® Thr Val Thr Tle Ser Gi®
34 0 345 350
He 3 la Val Lys Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Gly Gly Val GI® Val
355 3 60 355
Thr Asp Ser Thr Thr Gly Arg Lee Cys Met Le® Val Asp Kis GI® Tyr
37 0 37 £ 38®
Lys Tyr Pro Tyr Val Les Gly öt.;:· Gly Gin Asp Thr Le® Alá Pro öl®
385 390 395 löö
űs;í Pro He Trp Val Tyr Pne Pro pro Gin Tyr Alá Tyr Le·,; Thr Val
4 05 410: 415
Gly Asp Val Asn The Gin Gly He Ser Gly Asp Ser Lys Lys Le® Alá
42 0 4 25 4 3 S
Ser Gin Gi.® Ser A la Phe Tyr Val. Len Gin HÍS Ser Ser Phe GIí; Le®
4 35 440 443
Le® Gly Thr Gly Gly Thr Alá Thr Met Ser Tyr Lys Phe Pre Pro Val
450 455 4 Só
Pro Pro Gin As;;· Le® 01 r Gly Cys Ser GI® Kis Phe Tyr öl® Met. Tyr
4 SS 9 7 0: 475 480
AS® Pr® heu Tyr Gly •Ser Arg Les Gly Val Pro Asp Thr Le® Gly Gly
4.86: 4.90 4 95
X r< ·ν> Pro Lys Phe Arg Ser Le® 500 Thr Kis GI® Asp Kis Alá He Gin Pro
SOS 5.10
Gin Asn Phe Met Pro Gly Pro Len Val Asn Ser Val Ser Thr Lys öl®
515 52® >; 525
öly Asp Se·; Ser Ser: Thr Gly Alá Gly Lys Alá •jen Ti··: Gly Le® Ser
530 53 S 540
Thr Gly Thr Ser öl® As® Thr Aro He •Ser Len Arg· Pro Gly Pro Val.
545 55® 565 550
Ser Cl.® Pro Tyr Kis Kis Trp Asp Thr Asp Lys Tyr Val Thr Öly Tle
555 57 ő 5.75
Asn Alá .i.le Ser Kis Gly Gin Thr Thr Tyr Gly As® Ai a Öl® Asp Lys
580 555 590
Cl® Tyr Gin Öl® Gly Val Gly Arg Phe Pro Asn Öl®: Lys öl® Gin Le®
59.5 soo SOS
id/S Gin Le® Gin Gly Le® Asn Met Kis Thr Tyr Pite Pro Asn :Lys öly
610 615 620 **♦* *.♦·♦·« * * * ♦ * φ * ♦»» ♦ «r *' *- ♦ X **♦ * « '•03
Thr elv Sin, Tyr vér Asp Gin l'le Glo Arg Pro l.aa Mer Val Gly Ser
625 630 S35 64 0·
Val Trp Asr Ary Arg Alá Leó Sir Tyr G’.o Ser Sin Len Trp Ser Lys
SÍ 5 8S0 655
Tle Pro Asn Leó Asp Asp Ser Pb® Lys Tbr Sin Pbe Alá Alá l.«o Gly
660 555 670
Gly Trp Gly Leó Í-.L:s Gin Pro Pro Pr<5 Gin ΐ le Phe Leó Lys '.le Len
675 600 635
Pro Sin S«r Gly Pro n.e Gly Gly Tie Lys Ser Vet Gly 11« Tor Tár
660 6 SS 7 06
.Ser: Val Gin Tyr Alá Val Gly Lie Met Tfar Val Thr Pfefc Tbr Phe Lys
703 71Ö 715 720
Len Gly Pro Arg Lys Alá Tár Gly Arg Trp Asn Pro Gin Pro Gly Val
723 730 733
Tyr Pro Pro Hls Alá Alá Gly Mis Len Pro Tyr Val Len Tyr Asp Pro
7 4 0 765 73 0
Tbr Alá Thr Asp Alá Lys Gin Kis Via Arg Pia Gly Tyr Gin Lys Pro
755 760 765
Giu SÍa Leó Trp Thr Alá Lys Ser Arg Val Via Pro Len
779 775 7Sö
<210> 28 <211> 1699 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <223> A mesterséges szekvencia leírása: VP2 a. parvovirus B19 281 kiönből <400> 28 ataGtraagc tfcacsasaoa aaatgactto sgrra.ettct geagaagooa gcacrggtno 60 aggaggesss ggcagtaaco ófcgtgaaaag rafcgtggogt geggogoooa efcfettagtge 12 0 caactctgta acttgfcacat tctccagaca attcttaatt ccatatgacc cagagcacca ISO fcfcataaggtg tfctfcettccg eagcaagtag ctgrcaoaat. gcragfcggaa &gga®gcaa.a 246 ggtttgcacc att-agrccca taatgggats ctcaacccca rggagatatr tagatfcttaa 300 tg c t fcfcaa a t le a 1111 ο ο o cs c c o tt aga gitt c agc a c tt ti <3 <5-1- t-O'siCiCÍ S3-:fc· U-zCt 1LC[\Í cí £4 bD ” * ' ♦ 4 ' v » *** V Λ
U,» tafcagctxcfc gatgctétaa cfcgfcaaeeaé atcagaaatt got.gtteagg stgttscgga 420 caaaacfcgga gggggggtgc aggtfcactga cagcactaca gggcgcctafc gcatgtcagfc <80 agaccatgaa tataagtacc catatgtgtfc agggea&ggt. ca&gatactt tagccceaga SO actfccctatfc fcgggtafcact fcfccccccfcca atacgsfcí.ác etaacagcag' gagatgtfcáa 600 cacacaagga a&fctctggag acagcaaaaa afcfcggc.aa.gfc gaagaatcag cafcfctrraKgfc 660 tttggaacac agttcfctttc agcttttagg tacaggaggt acagcaacfca tgtcfctataa 720 gttfccctcca gtgcccccag aaaatttaga -gggctgcagfc caacacttct afcgaaafcgfca 730 caacccctta tacggatccc gcttaggggt fcccfcgacaca ttaggaggtg acccaaaatfc 8<Q •ragatcttta acseatgsag aeeatgeaafc tcagccccaa aacttcacgc eagggecact 20 0 agfcaaactca gfcgtetacaa aggagggaga. cagctctagfc actggagctg gaaaagcctt 260 aae&ggectt agcacaggta eotetoasaa c&cfcajsa.ta t'-cttsegec ctgggccagt 1220 gfectcagccg taccaecset gggaeaeaga. taaatafcgte ac&ggaaóáa atgc-ca-fcttc: 3080 fccatggtrcag aec&etífcstg gtaaegctga agacaaagag tatcagcaag gagtgggfcag: 1140 s.&ttccaaat gaaaa&gaac agceaaaaaa. gfcfcaöagggt. ttaaacatgc acacetaetfc 3.2-00 tcccaataaa ggaacccáge aáfcatácagá t.caaá:fefcgá.g ögccccctaa fcggtgggfc-tc 1260 tgtafcggaáe agaagagccc itcactatga aagccagcfcg tggagfcaaaa tfcccaaattfc .1220 aegatgacagt tt-taaaactc agtttgcagc cfcfcaggagga tggggttfcgc atcagccacc 1380 tcct.caa.afca fcfctttaaaaa tactaccaca aagtgggcca attggaggta fcfcaaatcaat 144δ gggaa-tact accttagttc agtatgccgt gggaattatg acagtaacca fcgaoatttaa 1500 atfeg.g.ggc.cc cgfcaaagcta cgggacggtg gaaccctcaa ccfcggagtgfc atcccccgca 1560 cgcagcaggt catttaccat atgtactata tgaccccaca gctacagatg caaaacaaca 3620 ccacagacat ggacatgaaa agcctgaaga attgtggaca gccaaaagcc gtgfcgcaccc 1680 afcfcgtaagOe gacatactc 2.682 <210» 29 <211» 554 <2.12» Fehérje <213» Mesterséges szekvencia <220» <223» A mesterséges szekvencia leírása: VP2 amínosav a parvövirns B.19 2--.81 klánból <400» 29
Met Thr Ser Vat Asc. Ser Alá Glu Alá Ser Thr; STy Alá hh.y Oly sly
5 10 15
Gly Ser Asn Pro Val Lyv Ser- Sat Tfcp Ser Gtü Gly Alá Thr The Ser
ΙΟί *♦
-* ♦ **** ** *. * X * **** * « >♦<· í t«<
0 25 30
Alá Assti Ser 33 Val Thr Cys Thr Phe 40 Sex· Arg Sin Phe heti 45 1 le Pro Tyr
Asp Pro 0!» Hls Sís Tyr Lys val Phe Ser Pro Alá Alá Ser Ser 5y®
Sö 55 50
Mis As» Alá Ser öly Lys ölő Alá Lys val Cys Thr 11 e Ser Pro 11«
65 70 75 85
Met 5:·; Tyr Sex- Thr Pro Top Arg Tyr Asp Phe Asn Alá: Len Asn
85 50 SS
Ts» 2-hs Phe Ser Tre Le» öl» Phe £!» öle he» ne 51» Áss. Tyr öly
133 105 T1S
Ser 11« Alá Pro Aap Alá La» Thr Vei Thr 1 le Ser Ci u He Alá Tál
115 12:0 s
Lys Asp Val Thr Asp Lys Thr öly öly Gly Val Sin val Thr Asp Ser
130 135 240
Thr Thr öly Arg Le» Cys Mer Te» Val Alp Bxs 51» Tyi- Lys Tyr Pro
145 ISO 155 7.50
Tyr val Len öly Gin öly Sin Asp Thr .Len. Alá Pro 51» Leh Pro •le
155 170 173
Trp Val Tyr The: Pro Pro 51» Tyx- Alá Tyr Te» Thr Val öiy Asp Val
13 Q 185 ISO
Arr. Thr öl» siy Ser öly Asp Ser Lys Lys Len Alá sex- öl» Gin
135 20 0 2 35
Ser Alá 210 Phe Tyr Val Te» ölti 215 Hls Ser Sex: ’-b * C V 220 Leu Le·» Ccty Thr
öly öly Thr Alá Thr Met Ser Tyr· Lys Phe Pro Pro Var. Pro Pro 51»
225 2:3 0 235 •4 0
Asn Le» öl:» öly öys Ser Sin öl© Phe Tyr Öl» Met Tyr Asn Pro Len
24 5 2:50 255
Tyr öly Ser Arg Te» Öly Val Pro Asp Thr Te» öly öly Asp Pro Lys
250 255 27 0
Phe Arg Ser Te» Thr S3.Ö Ölh Asp Hls Alá He 51» Pro öl»: Asn Phe
2 75 :2S5 285
5et Pro öly Pro Le» Val &SX5 Ser Val •Ser Thr Lys 51» öly Ahp Ser
2 00 2 IS 3 00
Se r Sér Thr öly A1 a öly Lys Alá Len Thr öly La» Sex· Thr öly Thr
SOS 310 315 .2 IC
Ser Öl» Asn Thr Arg II e Ser Le» Arg P:t:o öly Pro Val 5er 51» Pro
125 330 335
Tyr Hl© hl s Trp Asp Thr Asp Lys Tyr Val Thr Öly He Áss. Alá He:
340 345 350
Ser Hl© öly Öli! Thr Thr Tyr öly Asn Alá 51» Assp Lys Öle Tyr 51»
'* * Sut φ χ χ-φ jw* * * * *
A **♦ φ * ♦ *χ» ♦«*·* ϊ
106
355 167 3:65
Cl·:; Giy Va! Giy Arg fhe: Pro Asn Glu Lys Glu Cin Leu Lys Sin Leu
5 W 375 3 SÓ
Gin Giy Lét Asn Met Kis Thr Tyr Phe Pro Asn Lyg: Giy Thr Gin Gin
385 3 90 333 49Ö
Tyr Thr Asp Cin íle Glu Arg Pro le;; Let Va i Giy Ser rat Trp Is·:
40 5 4 10 415
A:S Arg Alá Tea H:is Tyr Glu Ser Glri Len Trp Ser Lys Tle Pro Asn
420 425 4 30
Leu Asp Asp Ser éhe Lys Thr Cin Phe Alá Ara Leu Cly Giy Trp Giy
435 440 445
Leu •Is Gin Pro Pro Pro Gin 11» Phe Leu Lys Tle Leu Pro Cin Ser
456 455 460
Giy Pro T ie «y Giy Lie Cys Sor Met Giy Tle Thr Thr Leu Vai Gin
465 ATS: 4 75 LL5
Tyr Alá Val Oly ne Lei: Thr Vai Thr Met Thr Phe: Lys Len Glv Pro
485 490 4 55
Arg Lys Aia Thr- Giy 500 Arg Trp Asn: Pro Cin Pro Giy Vai Tyr Pro Pro
505 S k 0
Mis Alá Ali; Giy Mis IkSU Pro Tyr Vat Leu Tyr Asp Pro Thr Alá Thr
54.5 52:0 32 5
Alá Lys Gin Kis Hl. a Arg Sin Giy Tyr Glu Lys Pro Glu Glu Leu
53 0 535 540
Trp Thr Alá Lys Ser Aro VAI Mis Pro Leu
545 3 50
<210> 30 <2Π> 2049 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <ι <223> A mesterséges szekvencia leírása: NS1 a parvovírus kiönből ő
w?
,» »»» ».· » - »· ? »«#><.
ataefcefcfcsg aaaaaáacea· aatggagcts tttagagggg tgcttcsagt fctcttotast 60 gfefcctggaet gtgcfca&cgs taacfcggfcgg fcgctc·:::r.ac tggatettaga esettcfcgac 120 fcgggaatcsc fcaactcatac fcaseag&cfca afcggcaatafc aetfcaagcag cgfcggcttct 180 a&ge&tgact éfcaefcggggg gccactagra gggcgcttgt actttfcfcfcea· agfcagaatgt 240:
aacaaatttg aagaaggeta fceatattcafc gtggfcfcattg gggggeeagg gttaaacccc 300 agaaacctca cagtgtgtgfc agaggggtt-a fcttaafcaatg tacfcttatóa cccfcgtaaefc 260 aaaastccga «getaaaatt fcttgccagga atgactacaa saggcassta etttagagat 420 ggagagcagt ttatagaaaa ccatttaatg aaasaaatac cttfcaaatgt. tgfcstggtgt 480 gttacfcaafca ttgatggaca tatsgatacc fcgtatttetg etaettütag a.aagggagcfc 540 tgccstgcca sgaaarcccg cafccaccaea gecatáastg -afcactagfcae tgatgctggg: 600 gagtetageg gcacaggggc agaggttgtg ccatttaafcg ggaagggaae fcaaggetage 660 ataaagttte aáactstggt ssaefcggttg tgtgaaases g.ag&gtttac agaggataag 720 tggaasetag ttgacfc.ttaa .ecagtaeacfc ttaefcaagca gtagtcacsg tggasgfcttt 780 caasttcaaa gtgcaefcaaa aetagcaatt fcstasagéaa ctsatttagt geet.aefcage 8:40 acsfcttttst: rgcatscsga etttgagcas gttatgfcgfcs. ttaasgacaa taaaattgtt: 9:00 aaattgfcfcae tttgtcaaaa efcatgsceec: etattagtgg ggcagcatgt gfcfcaaagtgg SSö attgataaaa aatgtggcsa gaaaaacaca ctgtggtttt atggaccgec aagtacaggg 1:020 aasaeasscfc tggcaatggc eattgctsaa agtg-:-e~ag tatatggesfc ggttaactgg 1080 astaatgsaa actfctecatt taafcgatgts gc&ggaa.a.aa gcttggfcggt ctgggatgaa 114.0 ggfc.afct.att a agfcctacaat tgfcagaagcfc gcaaaagcca tfctfcaggcgg gcaacccacc 12:00 «SSStagate aaaaaatgcg tggaagtgta getgtgcctg gagtaecegt ggttataacc 1230 agcaatggtg acattacfcfct tgtfcgtaagc gggaacacta caacaacfcgt aeatgcfcaaa 1320 ecetfcaaaag agegeatggfc aaagttaaac tfcfcsetgfcaa gatgcageec tgacatgggg 1380 ttactaacag sggefcgatgfc aeaacagtgg cttacatggfc gtaatgeses aágcfcgggac 1440 cactatgass aetgggcaafc aaacfcaeaet fcttgsfctfccc ctggaattss -.geagacgcc 1500 ctccscccag acctsesasc caccccaatt gttóacsgaea ceagestcag cagcagfcggt ISOO ggfcgaasgct. ctgaagaact cagtgaaagc ageettttts aeetcstese cccaggcgcc 1620 tggaacactg aaaccccgcg ctctagtacg cccstceecg ggaccagtte aggagaatca 1-5S0 tctgtcggaa geceagtttc ctccgaagtt gtagctgcafc cgtgggaaga agccttctac 2740 acacctfctgg cagaccagfct tegtgaacfcg ttagfcfcgggg t&gattatgfc gfcgggacggt 1800 gtaaggggtt taccfcgtctg fcfcgtgtgeaa catattaaea afcagtggggg aggcfcfcggga 1860 ctttgtcccc attgcactaa tgtaggggct tggfcatastg gatggaasfcfc tcgagaafcfct 1920 accccagatt tggtgcgatg tagetgccafc gtgggagctt ctaafcccctt fcfcctgtgcta .1.980 accfcgcaaaa aafcgtgctta cctgtctgga fctgcaaagcfc ttgtagatfca tgagfcasgtc 2040 gacatacfce 2048 <21O> 31 <211> 671 <212> Fehérje <2 Í3> Mesterséges szekvencia ***··«.
**** ,* **'**·*ί· <220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása: MSI amínosav a parvoviims B19 2-Bó klónből.
<40Ö> 31
Két Vlf I-bt Lei Phe Arg Oly Vei Lei Óin Val Ser Ser osn Val Lei Asp
I 5 20: 1.5
Oys Ala Asn Asp As a Trp Trp Cys ser Lou Len Asp Lei .Asp Thr Sex-
20 2 5: 38
Asp Trp Slu -vs· Pxo Len Thr Kis Thr Λ Λ hsa Arg Lei Mez. Ala. He Tyr Lei
Ser Ser 1 Val Ala Ser w® Lei *£ \i Asp Phe Thr Oly Oly ·>. Pro Len Ala Oly
50 OS <58
Cvs Leu Tyr Phe Phe Glr; Val Glu Cys Asn liVS Phe Oly Glh Oly Tyr
SS 7L Ή 8 0
Kis He Kis Val Val 11« Oly oly Pro Oly Len AS 11: Pro Arc Asn Lei
SS Sö: 35
Thr Val cys Val Óla Oly Len Phe Aöi Asr; Lh Lee Tyr Óla: Len Val
10 ö löS 110
Thr Gin Asn Les.: lys Lei Lys Phe Lei Pro Oly :<r Thr Thr Lys Oly
115 120: 125
Lys Tyr Phe Arg Asp Oly 31 Gin Phe He Hí Áss. Tyr Lep. Kefe Lys
130: m no
Lys US pro Len Asn Val Val Tq> cys Val Thr Ami He Asp Oly Kis
145 ISO 155 hSV
He Asp Thr Gys He ser Alá Thr Phe Ars: Lys Oly Ala CVS Kis Ala
ISS 170 175
Lys Lys Pro Ary He Thr Thr Al % He Asn Asp Thr Ser Thr ASp Ala
ISO 185 120
Oly Óla Se··: Ser oly Thr Oly All Cin Val m Pro Phe A.SX: oly Lys
ns 200 sós
Oly Thr Lys Ala Ser Ha Lys Phe Gin 215 Thr Kar Val 220 Asn Trp Len Cys
210
GI a Aga Ara Val Phe Thr Gin Asp Lyg: Trp Lys Les Val Asp Phe Asn
225 230 235 no
Gin Tyr Thr Leu Les. Ser Ser Ser Kis Ser Oly Ser Phe Gin Ha Gin
sas zso sss
Ser Ala Les Lyg L< H Ala He Tyr LYS: Aha Thr Asn Len Val Pro Thr
ISO 2©S 278
Ser Thr Phe len ta Kis Thr Asp: Phe öl ® Gin Val Met Gye lle t'VS
2 75 2 80 285
Asg· Ae® Lys Lie Val Lys 1,8® ?.:·?.; 1,8® Cys Öl® Asn Tyr Asp Pro Len
2 90 2 95 3 00
Le® Val Gly Gin Sís Val le® Lys Trp lle Asp lys Lys Cys: Gly Lys:
305 310 315 320:
Lys ASY? Thr Len Trp Pbe TV® Gly Pro Pro Ser Thr Gly Lys Thr Asn
325 33 0 :·. 555
ÁS® Alá Get .Alá lle Alá Lys Ser Val Pro Val Tyr Gly Vet Val Asn
34 0 345 350
Trp ÁS® As® Cl® As® Ρ®« Pro Phe As® Asp Val Alá Gly Lys: Ser Len
355 360 365
Vei Val Trp Asp Gl® Gly lle lle iys Ser Thr öle Val Gl® Alá Alá
3 70 575 380
Lys Alá Ha Les. Gly Gly Gin Pro Thr Arg Val Asp cm Lys Met Arg
385 5 90 395 10©
Gly Ser Val Alá Val Pro G ip- Val Pro val Val .·!·. £· Thr Ser A®:; Gly
405 410 » 219
Asp lle Thr Phe Val Val se® Gly As·-? Thr Thr w Thr Val hls Alá
4 20 42 5 4.3 0
Lys Alá Le® Lys GI® Arg Let Val lys len As® Phe Thr Val Ara Cys
43:5 440 445
Ser Pro Asp Met Gly le® LS® Thr GX® Ál a AS® Val Gin Gin Trp Len
450 455 46®
Thr Trp Cys As® .4.1« Cl® Ser Trp As.p Kis Tyr GI®. Asn Trp Alá 11«
4 65 4 7 ö 47 S 4.80
Asn Tyr Thr Phe Asp ?he Pro Gly lle ÁS® Alá As® Alá ®e ® Kis Pro
485 490 195
As® Le® Cl:?, Thr Tor Pre lle Val Thr Asp Thr Ser lle Ser Ser Ser
50® 505 53®
w Gly GI® Ser Ser Glu öl® Le® Ser 31® Ser Ser Phe Phe AS® Le®
515 52:0 525
öle Thr Gr® Gly Alá W Am TPr Gl® Thr Pro Arg Sár -Ser Thy Pro
530 53 5 54®:
lle Pro Gly Thr Ser Ser öiy Gl® Ser Ser Val Gly Ser Pro Val Ser
545 ISO 555 5 60
Sár Gia Val Val Ale Al a Ser Trp Gin Gl® Ar a Phe Tyr Var Pro Le®
565 570 575
Alá Asp Gin Phe Arg Glu LA®, Len Val. Gly val Αερ Tyr Val Trp Asy
s se 525 590
Gly V®,1 Arg Gly Lati Pro Val cys r.ys. Val öl® Kis 118 Asn Áaa Ser
555: SOS 6 5 5 .<*·., f*******.^» **«í 2 «fenő
Gly Oly öly Les oly X-eú Gy® Pro His vys He Asn Vai Oly Alá τ»ρ
610 615 680
~yv Asc Giy Ttp Lys: Pbe Arg Glu Phe τ;η- Pro As» Let Vs! Arg' cys
625 618 sas í 540
Ser Cy® Hís Val Oly Alá Ser Asn tro Pbs Ser Val Lst Gbr Gye Gye
64 & 558 655
tvs Cys Alá Vyr Lee Ser Giy Lee Gin Ser P.t;e Vál Asp Tyr élt
558 665 678
<210> 32 <21.1> 2330 <2.1.2> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása; ¥Ρ1 a parvovírus B19 286 klónböl <400> 32 afcactcaagc vsaatttgc·: agacttagag agaaáőccca tccagacfcta cttatcsfcce agacttacac fcggcaatgag tgactfcfcagg aacagatgaa aaaagacfcac gccggaagtt fcgeagaagcc tgvgggsgec tccatátgac tgccagtgga stgg&gstav cttaattgaa.
ttaeaaa&cs aaagctgtgt cttavt caaa testet t vgt tatagtcatc agtagcagtc aagcctgggc ctaeaagctg tatagccaac gagcttttas tctaetttsw cccgcctaca agcactggtg acv t fc.tagtg ccagtgcaec asggaggctt ttagatttta eattatggaa aaatgagtaa atcagcastt fcattaaaaga ttgacfctagt attttcaaag atgca.ga.acc a&gttagcgv ggcccccgca tggctaagtt aaaatataaa aaggtgcagc acgcctcaga caggaggggg ccaactctgt attataaggt aggtttgcac atgcttfcaaa gvatagctcc agaaagtggc tgtggsavct ccattataat tgctcgtatt t.catgga.c.a.g tagaggagaa acaactaccc aagfcgctgtt gggaacaaat aa&tgaaact vgcccctgtg aaaataceea gggcagtaafc sacttgtacs gttttctccc cavfcagtccc tttstttttt tgevgcttta aaatggtggg tatgaaaagg av.ttctttag aaaaataacc ttatctgacc gatgcagtat ggtsctas.cc gacagtgctg ccavacactc gggtttca.ag gcccattttc agcatgactt ccfcgrgaaaa ttttccagac gcag.caag.ta atáatgggat, toaocttxag actgtááccs saagtgatga ttactggaac ataafcccccfc tvsasasete acccccatgc tatcfcagtga atgttgggcc caaggattca atfcggactgt cacaagtagt aaggaagttt cagtfcaattc gcatgtggag aafcttttast gctgccscaa acvcaacccc agttvcagca tatcagaaat:
Í.20
188
8 388
160
428
4:3:8
648
688
568 72 V 783 868 808 ö
132 0
1080 ’<π égst.gfcfcaag gatgfcfcacaa: acaaaacfcgg &SS3SS33-3 eaggttasrtg acagcsrcfeáe. 1X40: agggcgecáa fcgcatgttag: tagaecístga atafcsagfcae ccacatgtgfc tagggeaagg 12:00' tcaagsfcact fcfcagccceag aaefetcefcafc togggfcataá tttccccctc safcacgcfcfcs 1260 cataacagra ggssgafcgtta. aeaescaagg aatttccgga gacagcaaaa aattggcasg 1320 tgaagaatca gcattfcfcatg tfctfcggaa.es. eagttcrttt cagcttttag gtacaggagg 13 80 tscagcaact sfcgtcttafca agttfccctcc agrgccccca gaaaattfcag agggctgcag 1440 tcaacacttfc tafcgaaafcgt asaaccccfrfc ataeggatce cgcütagggg fctcccgacac 1500 attaggaggt gacccaaaat tfcagafccttt aacacatgaa gaccacgcaa fctcagcccca 1550 aaacttcatg ccagggccac tagtssaetó agtgtctaca aaggagggag acagccctag 1620 tacfcggagct ggaaaagcct taacaggcct ragcacaggt acctcfccaaa acactagaafc .1080 afccctfcacgc eetgggeeag fc-gtctcagcc gtaccaccaq tgggacacag ataaafcatgfe 1740 cacagg'sa.fca aa.tgcea'fct't qfcCafcgg'fcCa gaccacxcat ggcaacgctg aa-gacaaaga 1800 gtafccsgcaa ggagtgggta gsóttccaaa: fcgss.aaa.gss cagcfcaaaac: agttaeaggg 1800 tttsaacatg eacaccfcact fctcccaataa aggaaceesg' eaafcataeag atsaaaxtga 1920 gegfrácccts atggrgggfct ctgfcatggaa: eaga&gagec ct: ccactatg sssgccagct 108:8 gtggagtssa attccaaa&t tagargacag trfcfcaaaaefc cagttfcgeag; ccfctaggagg 2040 atggggcfctg catcagccac ctcctcaaat attctfcaaaa atattaccac aaagfcgggsc 2100 aaccggaggc attaaatcaa fcgggasttae fcaccttagtc. c&gtatgccg tgggaattat 2100 gacagcaacc aíigacai-fcs-a aatfcggggcc ccgfcaaagct acgggscggfc ggaatcáfcea :2220 acctggagrg tatcccccgc acgcagcagg fccafcttacca tatgfcactat afcgaccccae 2280 sgcfcacagat gcaaaacaac accacagaca fcggatatgaa aagcctgaag aatfcgfcggac 2340 ageeaaaagc cg::g;:ge«cc eafctgfcasgt cgacsiiaatc 23 8 0 <210» 33 <211» 781 <212» Fehérje <213» Mesterséges szekvencia <220» <223» A mesterséges szekvencia leírása: VF1 aminosav a parvovírus 819 2436 klánból <400» 33
X Ser Lys Glu Ser 5 Oly Lys; Trp ϊ.·-ρ Ctu 10 Ss® Asp Asp Lys; Pás Alá 1:5
Lys; Alá Val: TVr Sin SÍ a Phe Val SÍ a ??he Tyr Olu Lys Val Tár Gly
20 ΎΕ. 30:
* X ΦΦφφ φ* ♦ X X Φ ' « · * *φφ * χ * « Φ X «>*»Χ φ*« φ «4>Φ«
Thr Asp Le® α«ρ 50 Lee 3S λ® > Ο Lys Se r el® Pro ,®®:® Kis Lee Ss OH lle Lee Lya 40 Asp Kis Tyr As® He 45 Lee He Asp Lee Val Ser AI® Kis 80 Ser
l.e® As® öly öle Le® 70 Gin
As® Pro 55 Lys AA® Ser Ser Ser Pro
60 Asp Le® Tyr Alá Ser Lse Mis Ser
Arg 85 Phe Ee ei®
75 Pro Kis
Len Ser Asp in Of.
Ser Ser Ser Kis SS Alá Öle Pro Arg Gly .£· Ή öle Asp Alá Val Le® Ser Ser
öl® Asp ee® iee Misa Lys Pro Π Gin 1Ö5 Val Ser Val öl® Lee 110 Pro öly Thr
US Aan Tyr Val Gly Pro öly As®. 120 öl® Lee el® Alá ely 125 Pro P:ro öl® Ser
Alá no Val Asp Ser ®la Al a 135 Arg He His ASp: The 14 0: Arg Tyr Ser Gin La®
AS Alá Lys Le® öly Ha lse As® Pro Tyr Thr Kis 153 Tvp Thr Val Alá Asp H öle
öl® Lee 1:0® SYS 155 As® He Lys: As® H® 170 Thr öly Phe el® Alá 175 el® 'Va'!
Val. Lyá Asp ISO Tyr Phe Thr Lee Lys 18r öly Alá Alá Alá Pro ISA Val Alá Kis
Pho el® 1SS öly Ser Le® Pro öle 200 val Pro Alá Tyr As® 205 Alá Ser öle Lys
Tyr M Pro Ser Hét Thr Sor 2 15 Vei As® Ser Alá öle 220 Alá Se·: Thr öly Alá
22 5 öly e ΐ γ eiy elv Ser 230 As® Pro Val Lys: Ser 235 Met. Trp Ser eis öly >40 Alá
Thr Phe Ser Alá 24 S As®. Ser Val Thr ÖV 3 250 Thr Phe Ser Arg öl® 255 Phe Le®
Xl-e Pro Tyr 2:60 Asp Pro ei® Kis Kis 265 Tyr Lys Val Phe Ser 2 7® Pro Ara Alá
Ser Ser 275 Cy-s Kis As® Alá Ser 280 Gly Lys ei® Alá Lys -> au ώ C Π Val Cys Thr He
Sár 250 Pro He őst öly Tyr 2 SS Ser Thr Pro Trp: Arg 3 00 Tyr Lee Asp Phe Aa®
305 Alá La® Asn Le® Phe 310 Öl® Ser Pro Lee öle. 515 Phe öle Kis Lee 32 0 He Öle
As® Tyr ely Ser 3 2S He Alá Pro .Asp Alá 330 Lee Thr Val Thr 335 He Ser Öle
Es Alá Val 313 ®ys Asp Val Thr ..As® H5 Lys Thr Gly öly öly 350 Val Öl® Val
35S 360 3 65 :13
Thr Asp 3 Ή Ser Thr Thr Gly Arg 375 Leu Cys Get Leu Val 280 Asp Kis Glu Tyr
Lys TVl Pro Tyr Val Leu Gly Gin Gly Gin Asm Thr Leu Alá Pro Oiu
385 330 3 05 4 00
Leu Pro He Trp Val Tyr Phé Pro Pro Glu Tyr Alá Tyr Leu Thr Val
405 410 ns
Oly Asp Val Asn Thr Gin Oly He Ser Gly Asp Ser Lys ÍQ-S Leu Alá
420 425 4:30
Ser Glu Glu Ser Alá The: Tyr Val Leu Glu Kis Ser Ser Phe Gin Leu
435 44 0 HS
Lea Oly :Thr Oly Gly Thr A.la Thr Vet Ser Tyr Lys Phe Pro Pro Val
450 4SS 460
Pro Pro Glu Asm Leu Glu Gly Cys Sor Oiu Kín phe Tyr Glu Met Tyr
4 SS 470 475 4:8 0
Asm Pro Lee Tyr Oly Ser Arg Leu Oly val Pro As?p Thr Leu Gly Gly
4 SS 450 455
Asp Pro Lys Phe Arg Ser Leu Thr Kiss Glu Asp Kis Alá Tle Gin Pro
500 SOS SIS
SL. AíU5 Phe Met Pro Gly Pro Leu Val Apa Ser Val Ser Thr Lys Glu
SIS 820 525
Gly Asp Ser Ser Sex- Thr Gly Alá Gly Lys Alá Leu Thr Gly Len Ser
530 535 54 0
Thr oly Thr Ser Gin Ae n Túr Arg He Ser Leu Arg Pro oly Pro Val
SAS SSL 3S5 560
Ser Gin Pro Tyr Kis; Hí ::· Trp: Asp Túr ASp Lys Tyr Val Thr Gly He
SOS 370 S75
Asn Alá He Ser HÍ a Gly Gin Thr Thr Tyr Gly Asn Alá Glu Aaó Lya
585 585 500
Glu Tyr G.iU Π Gly Val Gly Arg The Pro Asn Glu Lys Glu Glu Leu
SAS 60 0 685
Lys Gin Lep Gic? Gly Leu Asn Mer Kis Thr Tyr Phe Pro Asm Lys Oly
610 615: 620
Thr Gin Glu Tyr Thr Asp Gin Ha Glu Arg Pro Leu Kefe Val Gly Ser
625 630 635 64 0
Val Trp Aon Arg Arg Alá Leu Kis; Tyr Glu Ser Glu Leu Trg Ser Lys;
64:5 655 ;ss
Tle Pro Asn Leu Asp Asp Ser The Ly® Thr Glu Phe Alá Alá Leu Gly
666 565 670
Oly Trp Gly Leu Hí s; Glu ere Pro Pro Gin Tle Phe Leu Lys He Leu
67 5 680 685
;h:> Gin Ser oly Pro He Oly oly Ha Lys; Ser Met Gly He Thr Thr
51, 6 SS 706
» e '
Leó Val Gin Tyr Alá Val Gly He Met Thr Val Thr Hat Thr Phe Tyh
7 05 710 715 ?20
LéU Gly Pro Arg Lys Alá Thr siy Arg Trp A.SU Pro 51.0 Pro Gly Val
72 5 73 0 735
Tyr Pro Pro His Alá Alá Gly HlS Tea Pro Tyr Val heh Tyr Asp Pro
74 0 74 5 750
Tilt; Alá Thr Asp Alá Tyr Gin His HÚS Arg HÚS Gly Tyr Glu íya P;:o
755 760 7 SS
Glu Glu leu Trp Thr Alá Hys Ser Arg Val His Pro Tea
770 775 780
<210> 34 <211> 1699 <2] 2> DNS <213> Mesterséges szekvencia <22Ü>
<223 > A mesterséges szekvencia leírása: B6 klánból '2 a. parvovirus B19 2 <400> 34 afcaot.oaagc sggagsgggy caactctgta fctaraaggtg ggttfcgcacc tgctttaaat tafcagctcct caaaactgga agaccatgaa actfceetafcfc cacacs.agg® fcfcfcggaacac gtttcctcca caacccctta. tagafcrttta agtauarcra ttscaasacs ggeagtaahh actfegíiacat ttttcteccg attagtccca ttatfc.fcfct.tt gatgctttaa ggssssstgc fcstaagfcacc fcgggtacact afcfctctggag agfctcfcttfcc gtgcccccag taeggatgco aeacaCgaag gtgfcct&cas aaafcgacfcfcc -fcgtgsaasg agara cageaagtag fcaatgggafca cacctttaga ctgfcaaccat aggttactga cstatgtgtfc ttccesctca seggesássá agcttttagg aaastcfcaga ghfctaqgggt; acoarghaafc aggagggsga agfct.au ttot cgtgfcggsgt afcttttasfcfc ctgccacaafc ctcaacecca gtttcagcac atcagaaatfc cagcactaca sgggcaaggt afcacgcttac sfcfcggcaagt tscaggsggt. gggc&gcagt tcctgacacs tcagscccaa csgctcfcsgt gcsgaagcös guosucqcca Cv«tl a -gaec gccagtggaa tggagatatt ttaafctgaaa gctgttaagg gggcgccfcat caagatacfct ·: taacagfcag gasgaatcág· aeagcascts oas;;:ucfctfc ttaggaggtg aactt.cafcgc sctggsgctg gcserggtge otttfcagfcge cagagcacca aggaggcaaa fcagatttfcaa a11 atggaag atgfcfcacaaa gcatgtfcagt tagccccaga gagafcgfctsu catt fcfca.cgt fcgfcc.tfc.atsa atgaaafcgta aűccaaa&fcfc cagggecact gaaaagcc·: fc
120
180
240
300
ISO
430
480
340
Söfí 660 72 0
80
0
0
SSO
115 * * ««» ♦; <· .* ♦*<
·} aacaggcchfc agcaeaggta cctcLoaaaa .eentagaats reothaogcc ctgggocng;: 1020: gtofcesgöóg fcaceacoscfc gggacasaga teaaPatgte acaggaataa afcgccatttc 1080: tqatggfccag accacttatg gtaacgctga agacssagag tatcag-csag: gagtgggeag 1140: atttooaaai: gaaaeagaaή agcEaááaca gc tacegggt' ttaaaoatgo Acacctactt 12 Ö0 fcceoaa.fcaaa ggaacecagc aatatacagá tcaaatfcgag egccccctaa tggtgggttc 1280 fegtafeggaac agaagagccc ttcacfcatgs aagocagctg tggagtaaaa ctccaaattc. 232 0: aghtgaeagt crtaaaactc agtttgcagc etfcaggagga cggggtfctg«: atcagccacc 1380 fe.ccfcesaata ttttcaaaaa tafe-feaccaea aagtgggcca attggaggta ttaaa.t.caat 1440gggaattact aecttagttc agtatgoogt; gggaattatg acagtaacca tgaeatttss 1500 attggggccc cgtaaagcta cgggscggcg gaatcctcas cetggsgtgt étceseegcs X5S0 cgcagcaggt catttaccat atgtactata fcg&eeccaca gctacagatg caaaacaaca 1620 ceacagacat ggafcatgaaa agcctgaaga attgtggaca gccaaaagcc gtgZgcaccc 1S80 afctgtaagtö gacafeact-c- 1699 <210» 35 <211» 554 <212» Fehérje <213» Mesterséges szekvencia <220» <223» A mesterséges szekvencia leírásai VP2 aminosav a parvovírus B19 .2-36 klónkéi <400> 35
Met 1 ΤΜΡ Ser Val Asn 5 Ser Alá Gi® Alá Ser Thr öly 10 Ál a Gly Gly IS öly
öly Ser Asn Pro Val Lys Ser Met Trp Ser öl® Gly Alá Thr Phe Ser
20 .25 30:
As® Ser Vei Thr Cys Thr Phe Ser Arg Gin Phe len He Pro Tyr
3 5 40 4.5
Asp pro öl® ahs Hl s Tyr Lys Val Phe Ser Pro Alá Alá Ser Ser Cys
50 SS 60
Kis Asn Alá Ser öly Lys Öl® Lys Val Cys Thr He Ser Pro He
63 20 15 80
Met öly Tyr Ser Thr H:o Trn Arg Tyr Len Asp Phe Á3 3. A1 a Le® Asn
85 :90 95
le® Phe: Phe Ser Pro Le® Cl ® Phe χζΙ,Π Kis ;Í3Í5Ú Tle GI Asn Tyr Gly
** > « * * 4 λ »** * ♦ ♦ V Λ * ♦*«* »♦> ♦ >#»«, δ
10© 105 •10
Ser j .·. s 11 a Pro Asp Alá Leu Thr Val Thr Jle Ser Glu Ha Als Val
115· 120 115
•Cys Asp vei Thr Asa Cys Thr Gly Gly Gly Val Gin Val Thr ÁSp Ser
130 135 140
Thr Thr Hy· Arg Lap Cys Mel heti. Va.: Asp H:Ls Hu Tyr lys Tyr Pro
14.5 ISO 155 1 .0 0
Tyr Vei leu Hy 11: Hy H.n Asp Thr Leu Ál.δ Pro Gin Leó Pro n%
'165 HÖ 17.5
Trp Val Tyr Phe Pro Pro Gin Tyr Alá Tyr Leu Tar Vei Sry ASp Val.
ISO ÁSS 190
Áss The Gin Hu lie Ser ily Asp Ser Cys Cys Len Aia Ser Ha Gin
195 2Ö0 .205
Ser Alá Phe Tyr Val leu Hu Mis Ser Ser Phe Gin Len len Gly Thr
210 2 IS 22©
Hy Gly Thr Aia Thr Met Ser Tyr Lys Phe Pro Pro Var Pro Pro Ha
225 23 0 235 240
Asn leu Hu: Hy cys Ser Gin His Phe Tyr Glu Met Tyr Asn Pro Leu
24 5 2 60 2:55
Tyr- Hy Ser Arg leu Gly Val Pro Asp Thr Tea Hy Hy Asp Pro Lys
2 60 253 270
Phe Arg Ser Leu· Tar Mis Hu Asp Mis Aia ii e Gin Pro Gin. Asn Phe
275 280: 2 85
Met Pro Hy Pro Leu Val Asn Ser Val Ser Thr Cys Hu Gly ÁSt Ser
290 255 300
Ser Ser Thr Hy Ale Hy Lys; Aia ueu Thr Gly Leu Ser Thr Hy Thr
305 310 .3 15 í:2©
Se:·: Oh Asn Thr Arg He Ser leu Arg Pro Gly Pro Val, Ser Hn Pro
3 25 330 335
Tyr Kis Hs Trp Asp Thr Asp Lys Tyr Val Thr Hy Tié Ásr: Alá He
340 34 5 55©
Ser Kis Hy Gin Thr Thr Tyr Gly Asn Alá Ha Asp Cys Glu Tyr Hu
355 360 305
Gin Hy Val Gly Arg Phe Pro Asn Gin lys Glu Ha Leu Cys Gin Leu
379 375 3 80
Gin Gly lea Asn. Mer ;hs Thr Tyr: Phe Pro Asn Lys Gly Tar Gin. Hn
3 SS 3 90 395 181
Tyr Thr Asp Ha He Glu Arg Pro: Leu Met Var Gly Ser Val Trp Asn
405 <10 A15
Arg Arg Alá: leu hl sí Tyr Hu Ser Ha leu Trp Ser Lys The Pro Asín:
<20 425 <30
Leu Asp Asp Ser Phe lys Thr Ha Phe Aia Ara Len Hy Gly Trp Gly
X ·Χ * χ V Φ *· **Φ φ φ > ♦ * ♦ «φφ* **:* χ «φ««
17
435 44 0 445
Leu Kis Gin Pro Pro Pro Sin Tle Phe Leu Lys llé Lee Pro Gin Ser
4 50 4:SS A 450
Giy Pro 11« Öl y Giy llé Lyss Ser Get Giy Tle Thr Thr Leu v&l Gin
4 SS 4 70: 4 75 4 80
Tyr Alá Vai Giy Tle Mer Thr Vai Thr Mer Thr Phe Lys Leu Giy Pro
431 4 90 4 95
Arg Lyn Alá Th·: Giy Arg Trp Ássa Pro Gin Pro Giy Var Tyr Pro Pro
SOO 5 05 310
Hús Alá. Pia Giy Kis Leu Pro Tyr Vai Leu Tyr Asp Pro Thr Aia Thr
51.3 52 0 1 575
Asp Aia. Lys Gin Eís Kis Arg Mis Giy Ty.r Glu Lys Pro Gin Glu Leu
53 0 535 546
T?:p Thr Aia Lys Ser Arg Vai Kis Pro Leu
545 550 <2 1Ο> 36 <211> 20 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása: V.P-5 primer <400> 36 aggaagtt tg uoousagtt: c <216> 37 <2il> 20 <212> DNS <223> A mesterséges szekvencia leírása: VP-3 primer ;2:
* ♦ «*·* * «**.* * + fc ♦ * X * # ♦ ' * * « * » ** « « 4 «» »· í IS <40ö> 37 <21ö> 38 <211> 24 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása: VP2-5 primer <400> 33 gaeafcggata tgaassgcct qaag <210> 39 <211> 24 <212>t encia <220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása: MP2-3 primer <400> 39 gttgttcata tcfcggttaag t&ct 24 <210> 40 <212> DNS <21.3> Mesterséges szekvencia ** *«.«+: « « « « φ * * * * « * χ « * * ·* * χ »»»« *»,* ϊ »», π ο <400» 40 ataaafcccat afcacteafcfc :ώ·
Λ. -Λ <210» 41 <211» 19 <213» Mesterséges szekvencia <220» <223» A mesterséges szekvencia leírása: R-2sp primer <400» 4 cfeaaagtstc crgacctfcg 19 <211 >22 <212» DNS <213» Mesterséges szekvencia <220» <223> A mesterséges szekvencia
5-0 <400» 42 cscgccttat gcaaatggcc sg Ζ2 <21ö> 43 **«» «« ♦ * Φ ·»«. Μ««* * * » « *♦ * •t ♦
<212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <223> Λ mesterséges szekvencia leírása: Hieks--3 primer <400> 43 ttgagttaca cagtcAfcaaa qq <210> 44 <21 i> 34 <212> DNS «213» Mesterséges szekvencia <22ö>
<223> A mesterséges szekvencia leírása:
-•5 primer· «400» 44 ataGtefccta g&eaaáacaa aatagagcta eefe4g»QgSS tgcttcaagt Cfc-Cfc. 54 <210> 45 <211> 48 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>
<223> A mestersvges szekvencia leírása- ASi 3 primer
121 <400» gugrs.r.gtcg aettaercar. aatcfeacaaa. gafettgcaae ceíigacag 4S <210» 46 <211» 55 <212» DNS <213» Mesterséges szekvencia <220» <223» A mesterséges szekvencia leírása: VP1-5SN primer <400» 46 ataoscaagc teacaáaaca a&afcgagtaa aguaaguggc aasfeggtggg saagv 55 <210» 47 <211» 51 <212» DNS <213» Mesterséges szekvencia <220» <223» A mesterséges szekvencia leírása: VPALL-3 primer <400» 47 gagfcatgtcg acfctscaafcg ggtgcaescg gefcrttggct gfcccscaafcfc c 51 <210» 48 <211» 55 <212» DNS <213» Mesterséges szekvencia '* «· *♦** «β,*· * * ♦ * X «* Λ »**» :«**· ♦ *$*♦ <220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása; VP2-5SN primer <4Ö0> 4β ataofecaagö ttacsaaaca aaatgacttc agttaafctct gcagaagcca gcac·:
<2 1U> 49 seges cveneia es szekvencia <40Ö> 49 aaaaasaaaa asaaa&asaa atceteaaea gcasfcfctctg afca <210> 50 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <22Ö>
<223»· A mesterséges szekvencia leírása; VSPC’2 aaaaaaaa.aa cgceeEgfc&g <210> 51 <24.1» 42
123 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>
<223» A mesterséges szekvencia leírása; YSPC3 <400> 51
S^a^aaaw aaa®a-aaa-aa fcata.«ocaaa fcaggaagfctc fcg <2I0> 52 <211> 43 <212> DNS <213» Mesterséges szekvencia <220» <223> A mesterséges szekvencia leírása; VSPC4 <400» 52 aáaasaaaaa aaaaaaaaaa CaaaafegcTg attttrcact fcg<?
<210 53 <211> 40 <212> DNS <213» Mesterséges szekvencia <223» A mesterséges s®e .'encia leírása: VSPC5 <400 53 aaaaa&aaaa aaaaaaasaa tgstgfcaoefc crtgeasicta «S»124 <210> 54 <211» 40 <212» DNS <213» Mesterséges szekvencia <220» <223» A mesterséges szekvencia leírása: V5PC6 <400» 54 saaaasaáaa aaaaáscaaa agccctcfcaa afcfcfcfcefcggg
4ö:
<210» 55 <211» 40 <212» DNS <213» Mesterséges szekvencia <223» A mesterséges szekvencia leírása: VSPC7 <400» 55 aaaaa&aaaá aáaa áaaáaá ct ch fcaátg t gtcsogaacc <210» 56 <211» 51 <212» DNS <213» Mesterséges szekvencia <223» A mesterséges szekvencia leírása: VSAI prímet <400> 56 aattctaatg cgacfceacVa fcagggagaag gccatátact catcggsccg t 52 <210> 57 <211> 48 <212> DNS <213» Mesterséges szekvencia <220» <223> A mesterséges szekvencia leírása: VSA2 primer <400> 57 aafcfcctaata. cgact.cagfca tagggagaag gccagagcac -cafc.tataa 4S <210> 58 <2U> 48 <212» DNS <213» Mesterséges szekvencia <220» <223> A mesterséges szekvencia leírása: VSA3 primer <400> 58 aafctctaaea cgactcaafea tsgggagaag gcacasfcgcc ageggaaa 48 <2I0> 59 <211> .19 <212> DNS <213» Mesterséges szekvencia
12ö «Φ .♦♦.*·* **** * > φ φ ♦ *
Α * * * * ♦ ♦ * * φ«ψ χ φ < * * :*;♦* <220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása; VSP2 primer <400> 59 q t gctgaaac tc t a aagg t <210> 60 <2!1> 17 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása; VSP1 primer <400> 60 ggsggcqqag gfcfc&gssa <210> 61 <211> 20 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <22Ö>
<221 > ve gyes...tulajdonság <222> (1) <223> amiben c'mödosított 5' fehér íluoreszcein foszforamidit <220>
<22 !> vegyesjtulajdonság <222> (20)
ΧΦΦ» «» * * « » Φ ΚΙ,. »«X « * * ;*
MXÍ X** « * * . ♦
i.*·»: x <223» amiben t 3' DABCYL-lal módosított <223» A mesterséges szekvencia leírása: VSPPR1 primer <400» 61 cccafcggaga fcafcttagaéx
<212» D N S <213» Mesterséges szekvencia <220» <223» Á mesterséges szekvencia leírása: CH80·· 1 izolátum ataaatccafc afcaetcattg gaxtgtagca: gatg&ag'age tttxaaaaaa fcafeaaaaaae 60 gaaactgggt tfccaagcáöa agtagtáááa ga<jí:.asttfca. efettaaaagg tgcagctgcc 12S cctgtggcec atfcfctcaagg sag£ttgc.og gaagfcfcccag .etEacaacgc ^tcagaaaaa 180: tacccaagca xgact.ccagt taaxxetgca: gaagccagca cfcggfcgoagg aggggggggc 248 ataaat-öoag ttaaaagcafc gtggagrgag ggggccactt tfcagtgccaa ctctgtaact .1-00 fcgfcacatttfc ccagaxagfct t.fcfcaattcca ratgacccag agcaecatfca taaggtgtfcc 368 fcctccegcag caagtagcfcg ccacaafcgcc agcggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420 agtcccafcaa tgggatactc aaccccafcgg agatatfctag afcfcttaafcgc tttaaacttg 408 fcfcttttfccac ctfcfcagagtfc teagcattfca attgaaaact atggaagtat agctcccgafc S48 gctfctaactg Xaaccafcátx agaaattgcfc gtfcaaggafcg ttacagacaa aaccggaggg 688 ggagcacaag ínactgacag cactaccggg cgccfcatgca cgfctagfcaga ccargaatsc 6S0 aagfcacccafc atgfcgttagg gcaaggccag gafcaccctag 708 <210» ől :211» 7 <212» DNS
12S * Φ 99 9*9* φ χ....... .♦
Φ « * Φ φ ♦
Φ ν >* ♦ sze <223>Α ncia. leírása:
-3 ízölátum <400> (53 áfcaaafceeat. ataetcattg gacfcgfcsgea gatgaagage tfccta.aaaaa tataaaaaat 80 gaaaefcgggt ttcaagcaca agtagfcaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 12® cctgtggccc attttcaagg aagt:ttgccg gaagttcecg ctcacaacgc ctcagaaaaa 1.8:0 tacccaagca fcgacttcagt taafctctgca gaagccagca ctggtgcagg agggggggS'-' 24$ agtaacectg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccacfct tragtgccaa ctctgfcaset 302 fcgfcacattt·: ccagaeaatt tttaattcca tafcgacccag agcaccatta taaggtgttfc 3 60 tcfccccgcag caagfcagetg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccafet 430 agtcceataa tgggatactc aaccccafcgg agatacctag atttfcaatge fcfct&aatfcfca 480 tfccfctttcao ctttagagfct tcagcactta afctgaaaafcfc atggaagcat agcfccctgafc 548 gctttaactg taaccatafcc agaaateget gttaaggatg fcfcacggacaa. aactggaggg S90 ggggtgcagg ttaccgacag cactacaggg cgcctafcgca tgtfcagtaga ccatgaatafc 580 aagtacccat: afcgtgttagg gcaaggtcag gataetttag 700 <210> 64 <2 U> 700 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220 <223 > A mesterséges szekvencia leírása: B19SCL1-4 izolátnm <4ÖÖ> 64 staisatccat: afcactcafcfcg gactgtag'Ca gatgaagagc fcfctfcaaaaaa tafcaaaaaa'fc 5® gaaactgggt tfcca&geacá agfcagtaaaa gactacttta cfcttaaa.a.gg tgcagctgcc 120: cetgfcggCcC attttcaagg aagttfcgccg gaagfcfccccg cttacaáegc ctcagaaáaö 3.87 tacccaagca tgacttcagt taafcfccfcgea gaagccagca cfcggtgcagg «sgggggggc 240 a-gtaatcetg tgaaaagca.fc gfcggagfcgag ggggccaetfe tt.agfcgccaa ctefcgta:s:efc 388 rgfcacattfct ccagscaatt ttfcsstfccca tacgaeccag agcáccafcfca taagg::gfctt 3S0 fcefccccgcsg: caagtagefcg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt. fcfcgesccafcfc 42 0 >:«
X * ί ♦ ♦ » <ί *
129 agfccecatss. fcgggafcacfcc saccccatgg agatatttag atttfcaafcgc fcfcfcaaatfcfca 480 fctfctctfecac cfcfcfcagagfcfc tcagcaetta aoogaaaafcfc afcggsagfcat agcfccctgct SCO gcfetfcaacfcg tsaccatatc agaaatfcgcfc gttaaggafcg: ttacggaeaa a&ctggaggg őoö ggggtgcagg tfcacfcgacag cactacaggg cgcctatgca fcgfcfcagfcaga ccatgaatat 660 acgtacccat «fcgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700 <211» 700 <212» DNS <213» Mesterséges szekvencia <220» <223» A mesterséges szekvencia leírása; B19SCL2-1 izolátum <40Ö> 65 afcaaatccafc atactcattg gactgtagca gstgaagagc ttfcfcaaaaaa cafcaaa«aaü SO gaaactgggfc tfccsagcaca agfca.gt.aaas gaofcacfctta cfcttaaaagg tgcagctgcc 12 & cctgfcggccc atfcttcsagg aagtfcfcgccg gaagtfccccg cfcfcacaasgo ctcagsaaaa 430 tacccaagca fcgacttcagfc raatfccfcgca gaagccagca ctggcgcagg aggggggggc 240 agtaafccctg fcgaaaagcafc gtggagtgag ggggccactfc fctagtgccaa ctcfcgcaact 300 tgtacafcfctt ccagacaafcfc fcttaafcfccca fcatgacccag- sgeaccatta fcaaggtgfcfcfc 360 fccccccgcag caagfcagctg ccacaatgcc agtggaaagg -aggcaaaggt tcgcaccatt 4.20; agtcccafcaa fcgggatactc aaccccafcgg agacafcfcfcag -atcttastge ttt&aatfcfca 430 fcfctttttcac ctttagagtt tcagcactta afcfcgaaaatfc afcggaagfcafc agctcctgat S40 gcttfcaactg taaccatafcc acaaaccgct. gtts&ggatg fctacggacaa aactggaggg 600 SSSStgcagg ttactgacag cactacaggg cgccfcatgca tgctagtaga ccatgaafcafc SSö aáge^tfceet atgtgfcfcagg· goaaggfccag gatacttxtag 00 <210» 66 <211» 700 <212» DNS <213» Mesterséges szekvencia <220»
130 **»* »«<
:223» A mesterséges szekvencia leírása: B19SCL3-1 izolátum <40ö> 66 ataaatcc&fc stacteattg gaetgcagca gatgaagsga fcfcttsaaaaa tataaaaaat 50 gaasetgggfc ttcsagcaca agtagcaaaa gactacfccta cí: fe ·: áss agg fcgcagctgcc 120 cci.gtggcöc attórcaagg: aagfcfcfcgeeg gaagttcccg cttscaacge ctcagaasaa. 180 tacccsagca -gacttcsgc taattctgcs gaagcésgca cfc.ggtgcagg sggggggggc 240 agtaatecfcg tgaaasgcat gtggagtgag g>3ggc<:;a:cfcí:. ftagtgccaa cfcctgtaacfc 300 tgtacatttt cca;gac;aatfe tttaafcfccca. catgacceag agcscca::;:.s taaggtgttt 350 tctcccgcag casgtagctg ccacöai:gc·:: sgtggaaagg aggcaaaggc ttgcaccatt 420 agfccccatsa tgggatactc aaccccatgg agátátfeCag. atttcaafcgc tttasattta 480 ttt: ;:·:!:. te se ctfctagagfc-fc tcag.caccfca .at.fc.gaaaafet acggaagtat ágctccfcgát 540 •gctfctaacfcg' fcsaccsfcstc agaaattget. gttaaggacg ttacggscss aacfcggaggg SCO ggggtgcsgg ttactgatag csc-uicaggc cgcctatgca tgttagtaga cet::gaatst 650 aágfcaccsst atgfcgttagg gcasgctcag gstsctfctag 700 <210» 67 <211» 700 <212» DNS
3» fenséges szekvencia <220» <223» A mesterséges szekvencia leírása; B19SCL4--3 izolátum <400» 67 ataaatccat atactcattg gsctgtagta gatgaagagc ttttaaaaaa cafcaaaaaat 60 gaaacfcgggt ttcsagcaca agcagtaasa gactacttta ctttaaaaggtgcagc'fcgcc 124 cctgtggccc attttcaagg aagtrtgccg gaagttcccg cttac&acgc -etcagaaaaa 180 tacccaagca ::gact::c;»gt taattcfccca gsagccagca etgyfcgcayy ággggggggc 2 40 actaatcctg fecaaaagcat: gtggagtgag ggggceacit fcfcsgtgcs&a ctcr.gtssct .300 tgtacatttt ccsgacsstt ttfcsafctcca cstgacccag agcacca;:;:a taaggtgttt 300 tö:teccgcag caagtsycfcg ccacaatgcö sgtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt: 420 sgfecccacaa tgggacactc aaccccatgg agatatttag afctttaatgc tttaaacfcfca 480 ttCEtttcac ctctagagcc tcagcaecta attgaaaatt. atggaagtat agcfccctgst 540: gctttaactg taaccatatc sgaaattgc;: gfcfeaaggafeg ;:.;:aeggacaa aacfcggaggg «00 *
*< »·♦♦·*
Φ ♦ X .* ♦ <* φ X
ΦΧ** *
φ $
SSSStgcagg ttacfcgatsg cactacaggg cgcctafcgca tgfcfcagtBga ccatgaafcat 660 sagt&cceat atgt:g·: tagg gcasggtcag gatactttsg 706 <210> 68 <21l> 700 <213> Mesterséges szekvencia <220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása: B19SGL5-2 izolátum <400> 68 ataaatccat atactcstcg gactgtagca gatgaagagc tfcttaaaaaa tataaaaaat $0 gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaááa gactacttfca cttfcaaaagg fegeagctgcc 3.20 cctgtggccc attfctcaagg aagtctgccg ga.agfc.tcccg cfctacaacgc ctcagaaaaa 180 tacccaagca fcgacttcagt taattctgca gaagcosaua ctggfcgcagg aggggggggc 240 agfcaatncfcg tgaaaagcat gtggagtgag ggggceaefcfc ctagfcgccaa ctctgtaact 300 tgracatttt ccag&eaafcc tttaac-cca tacgacccag agcaccatfca fcaaggtgctfc 360 tctcccgcag caagtagctg c-c-acaa-tgcc agtggaaagg. a-ggcaaaggt ttgcaccatt 420 agtcccataa tgggatactc aa-ccccatgg agacatttag actttaatgc ttt.aaattea 4.S0;
ttttrttcsc cctfcagagtt tcagcactca attgaaaatt atggaagtat agctcctgat S46 getti:««ctg taaccafcatc agaaattget gtcaaggatg tfcacggacaa aactggaggg 600
3999*9·~«·35 fctactgacag caetaeaggg cgcccatgca tgfcfcagtaga ccatgaatat S66 aagtacccat atgfcgttagg geasggtcag gs.tactttag 706 <210> 69 <2U> 700 <2J 2> DNS <2 13> Mesterséges szekvencia <223> A mesterséges szekvencia leírása: B19SCL6-2 izolátum « * * ' * * * « * * * * * * « * * ♦ *«**' <400 > 69 acaaafeccat at:ac:tcatfcg gacfcgtagca -gat^aagagc: fcfctt&aaaaa tata.a&aaafc. Sö gaaactgggt fcfccaagcaca agfc-ag.taaa-« gací:acfc:tfca ctttaaaagg fc-gcagctgcc: 120 c.c fc. gt ggccc a t tt t c & agg aagt fctgccg g a aga fc c c cg a fc fc a c a a ege c:: c- aga s a aa .'· 80 tacccaagca tg&cfcfccagt taafctctgca. gaagccagca ctggcgcagg aggggggggc 240' sgtasfcccfey Cgsaasgcafc gtgga.gt.gag ggggccactt ttagtgccaa cfccfcgtaact 300 fcgfc&cafcttfc ctagacaatt cfcfc.a.sfcfceca tatgacccag agcaccafcta- taaggtgttfc 3S0 tcfccctgcag caagtagctg ccacaatgcc agfcgg«®agg: aggca&aggt tfcgcaccatt 420 agtcccataa fcgggat.sctc aaccccatgg agafcafcttag attttaatgc fcfctaaattfca 480 tfcfett-.t-t.ca-c ctfccagagtfc fc-oag-cacfeta attgaaaatt atggaagtafc agctcctgat 548 getetaactg taaecatafec: sgaaáfctgcfc gtfcaaggafcg ttacggacaa aacfcggaggg 660: ggggtgcagg tfcíicfcgacag cactacaggg cgscfcatgca fcgtfcagtaga ccafcgaáfcat 660 asgfcacccat atgegttagg gcaaggfccag gátserttag 700 <210» <211» 700 >>
<213» Mesterséges /encia <220» <223» A mesterséges szekvencia leírása; B19SCL7-3 ízolá <400» 70 aicasatccat ataefccatfcg gactgtagca gatgaagagc ttfctaaaaaa fcataaaáaafc 60 gaaactgggt tfccaagcaca agtagfcaaaa gacfcaetfcta ctttaaaagg tgcagctgcc: 12:0 cctgtggccc at·:cfccaagg aagtccg-ccg: gaagfcfccccg ctt.acaacg-c cfccagaaaaa 180 tacccaagca fcgacttcagfc taattcfcgca gaagccagca ctggfcgcagg aggggggggc 240 agtaafcccfcg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt fctagtgccas cfcetgfcaacfc 300 tgfcacatttfc ceagaeaatt tttaafctcca. tatgacccag agcaccafcta taaggtgttt 360 fcctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agfcggaaagg aggcaaaggt tfcgcaccatt 420: agtcccataa tgggatactc aaccccatgg- agatatttag atfctfcaatgc fctfc&satfcta. 480 ttttttfccac etttagagtt tcagcacfcta attgaaaatt: afcggaagfcafc agctcctgat 54/ gefcttasefcg taaceatatc agaaattgcfc gctsaggafcg cfcaeggaaaa aactggaggg 800: ggggfcgcagg ttactgaeag cactacaggg cgcctatgca tgfcfcagfcaga ceafcgaatafc 550 áagfcacccat atgtgttagg gsaaggtcag gatacfcfcfcag 700 <210» 71 *:...... *
A * # « * *
A-** >
4w»í# w«* * <211> 700 <212» DNS <213» Mesterséges szekvencia <220>
<223> <4 mesterséges szekvencia leírása: B19SCL8-2 izolátum <400» 71 afeaaatccat gaasctgggt cx-fcgfcggscc tánccáagca cgtaatcctg atactcattg ttc&agcaca a·: ts: tea agg tgact&cagt fcgaaaagcat gactgtagca ag tag t a aagtttgceg taattcfcgea gtggagtgag gatgaagagc gactactfcra gaagfctcccg gaagccagca ggggccac s: ·:
tcfcta&aaaa ctttaaaagg cttaeaacyc ctggtgcagg tt agtgetaa tataaaaaat tgcagetgcc cteagaaa&s aggggggggc ctctgtaact
120
ISO
240
300 tg ta© a tett ccagacaatf tttaattcca tatgacccag agcaccstta taaggtgttt 369 tefccccgesg eaagtagetg ccáöaatgc© agtggaaagg· aggcaaaggt: - · g ~ seeatt: 420 agtcccataa: tggg&fcacfc© aaccccatgg agatatttag gttttaatgc t'ttaaafctta 4SŐ cctttttcac etttagagtt tcagcactfca sttgsaastt atggaagtat agctcctgaf. 540 get.ecs.actg eaaccatslc agaaafetgct gfcfcaaggatg ttaeggaosa aact.gg.aggg 600 STSS^gcagg ttactgacag cactacaggg cgccfcatgea tgt&agtaga ccatgaatat: 550 aagf-acccat: aígtgfccagg gcaaggtcag: gataetttag 7 00 <2.12» DNS <213» Mesterséges szekvencia <223» A mesterséges szekvencia leírása: B19SCL9-1 izolátum <400 » / 2 ataaatccst atactcat:tg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaac cacssaaaaC Sö gaaacfgggfc ttcaagcacu sgtagéaaaa gactacttta ctttaaasgy tgcagctgcc 120 c^crgcccc aetfetcaagg aagtttgceg gáagfcfepcssg cttscaacgc etcagaasaa ISO taeceacgca cgactfccagt taactccgca gaagccagca cfcggcgeagg sggggggggc 240 $ Λ.
134 *♦ os* ·*χ
Λ * « * * * e ΛΦ* * * ♦ * * * » Φ«*Χ agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtsacr 300 tgtacstctt ccagacaatt tttaattcca tatgsctcag agcaecatta taaggtgttt 860 tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agfcggsaagg aggcaaaggt: ttgeacestt 42Ü agtcccat-^á cgggatsctc aaccccatgg agatatttag atctteatgc cttaaattca -4.8-0 fccfctttfccae ctthagagtc tcageactta sttgaaaatt atggaagtar sgctccfcgat 540 gertfca&ctg fcaaccatatc agaaattgct gttsaggatg ttacggacaa aactggaggg 600 ggsgtgcagg ttactgacag cactacaggg .cgcctatgcs. t/gittagtaga ccatgastat SSö: aagtacccat. stgtgttagg geaaggteag gataetttag 200 <210> 73 <211 > 700 <2n> DNS <213> Mesterséges s <220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása: B19SCL9-9 izolátum <400> 73 ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaasaaa tatsaaaaat 60 gaaactgggt, ttcaagcacs agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagy tgcagctgcc 120 cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 160 tacccaagca tgactfccagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg agggggggge 248 agtaatcctg Cg&aaágcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300 tgtácötttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta. t.aaggtgttt 360 tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 428 agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag artttaatgc tttasattta 480 tt.tttttcac ctttagagtt tcagcactta attgsaaatt atggaagtat agctcctgat S-Sö gccttaactg tasccatatc agaasttgct gttaaggaag ttacggacaa aactggaggg 000
SQSStgcagg ttactgacag cactacaggg cgccfcatgcs cgttagcaga ccatgaatst. 660 aagtacccat atgtgttagg geaaggteag gatacattag 100 <2ÍO> 74 <211> 700 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia ji ***x > ♦: « ♦ * * Λ X** * * φ ' ♦ * ♦' ♦*·>. >' ♦:·«*·*
SE <220» <223» A mesterséges szekvencia leírása; B19SCL10-2 izolátum < 4Ö0 » / 4 st,;iaatccat acactcattg gactgfcagca gatga agagc tttCaaaaas tataa&aaat 60 gaaactgggfc ttcaagcaca agt&gtaaaa gactacctta ccctaasagg fcgcagcfcgcc 120 cccgtggccc attttcaagg aagfcttgccg gaagttcccg cfctacaacgc ctcagaaaaa .180 feacecaagca tgacttcagfc taattcfcgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 040 agtaatcefcg tgaaaagcat gfcggagtgag ggggccactt ttagtgccaa. cfcetgtaacfc 300 tgfcaesoccc ccagacaatt tttaattcca catgacccag agcaccatta t.aaggtgttc 360 fcctcccgcag caagtagcfcg ccacaargcc agtggaaagg aggcaaaggfc ttgcaccatt: 400 jsgfccccataa tgggat.&ctc aaccccatgg agatafcttag stttfcaatgc fcfcfcaaatfcfca 480 ttfcttc.tcac: cfcfctsgagfcfc tcagcactta: afcfcgaaaatfc afcggsaagfcac. agctcctgat S40 gctttaactg fcaaccatatc agaaattgct gttaaggafcg ttacggacaa. aactggaggg 000 ggggtgcagg: fctactgacsg cactacaggg cgcctstgca tgttagtaga ccatgaafcst: 000 0 aagtacccat: atgtgttagg gcaaggfcc&g gafeaofcttsg 00 <210» 73 <211» 700 <212» DNS <213» Mesterséges Szekvencia <223» A mesterséges szekvencia asm ,11-1 ízoláturn <400» 73 ataaafcccafc atacces.ttg gactgtagca gatgaagagc fctttaaaaaa festaaaaaat 60 gaaactgggt ttcaagcaca agtagcaaaa gactactfcfca cttfcaaaagg cgcagctgcc 0.3 0 ecfcgtggccc stttfccaagg aagfcttgccg gaagttcccg cfctacaacgc etöagaaaaa 180 tacccaagca tgacfctcagt taatfcctgea gaagccagca ctggtgcagg .aggggggg-gc Z4 0 agtaat.ccfcg tgaaaagcat gfcggagtgag ggggccactt ttagtgccaa efccfcgfcaact 300 tgtaca t: t r t ccagacaatt ttüaafct.cca oacgacccag agcaccarta fcaaggfcgttt 360 tctctcgcag caagtagccg ccaeaafcgcs sgtggáaagg aggcaaaggfc ttgcaceafcá 420 agtcccacaa tgggacactc aatcecátgg agafcatfcfcag attfclaatgc fcttaaattta 480 tttttttcac ccrfcagagtt tcagcactta attgaaaatt acggaagtat agctcctgat S?48
136
9 * $ * * « * * « « * * · *' *
9 9 * * ** * gctttaactg taaccafcatc agaaattgct gttaaggstgj fcfcacggaeaa as«cggaggg 600 ggggtgcagg tCaetgacag eact&csggg cgcctatgca tgttagtaga ccstgaatat SSO .aagfca.cc.éá.fe Mgtgttagg gcssggtcag gstactttafc 700 <210> 76 <211 >700 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása: B19SCL12-1 ízölátom <400> 76 ataaatccat ataetsattg gactgtsgüsi gstgsagagc tttt&aasaa tatassaaat Cö gaaactgggr ttcaagcaca agfcagtaaas gactacttéa ctttaaaagg tgcagctgcc 120 tfctgfcggccc acfcfetcsagg: aagtttgceg gsagcccccg cttacaacgc cfccaga^aa ISO fcacccaagca rgscfcccagt taattctgca gaagecagea ecggogcagg aggggggggc 246 agfc.aatcccg tgaaaageat gtggagtgag ggggccactt tcagtgccaa etefcgtaact 300 tgtacatttt ctagaca-stt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttfc 3<50 tefccccgeag cstagtagetg ceacaatgce sgtggaaagg aggcaaaggfc CCgcaccatt 420 agtcccataa tgggstacfcc aaccccatgg agatafcbtag atfc.ttaafcgc tacaaattta 480 atttttteac etttagagtt tcagcactta atfcgaaaatfc atggaagtat agetcctg&t 540 gctfcbaactg taaccatatc agaaab&gst: gttsaggatg ttaegguesa sactggagxgg 080 ggggtgcagg t.tactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagcaga ccatgaatat SSO aagfcacecat atgtgfctagg geaaggteag gseaetttag 7öö <210> 77 <21 i> 700 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása: B19SCL13-3 izoiátum
- *** <400> 77 szaástccst rummá gsetgfcágca gátgaagsgc t.t.ttaaaass; tataasáaat 60 gaaactgggt fcfccaagcaca agcagtsaaa gactacctta ezttaaaagg cgcagefcgcc 120 cctgfeggecc attttcaagg aagfcttgccg gaagttcccg .cfc.fcaoaac.gc otcsgaaasa ISO tacccaagca tgacttcagt tssttczgca gaagtcagca. ctggtgcagg aggggggggc 240 ágtsstccfcg tgaaasgcat gtggsgfcgag ggggccactfc Ltagfcgccaa ctctgtasct 300· tgtgcstfcLt eaagacsstt tttsattecs tatgscccag sgcaccatta tsaggfcghat 368: tctcoogcsg caagtagotg ccacastgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccafcfc 420 ágfccccafcaa fcgggatactc aaccccatgg aga tat·:, tag atzi:.taat:ge tttsaatfcta 460 í:ttttfeí:cac ctttagagtt fc.cagcact.fca acfcgaaaatc. afcggaagfcafc agcfcccfcgat 540 gctttaactg taaccafcatc agaaattgafc gttaaggatg tfcacggacaa aactggaggg 600 ggggtgcagg ttaefcgac&g cacfcacaggg cgcctetgca tgttagt&ga ccafcgaatat 660 «agxacccat atgtgctagg gcaaggtcsg gafcactfctag 700 <210> 78 <211> 700 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <22ö>
<223> A mesterséges szekvencia leírása: B19SCL14-1 izolátum <40í)> 78 atssstccat stacccattg gactgtagca gatg.aag.agc fcfcfcfcaaaaaa zafcaasssac Sö gaaagtgggt fc.tcaagcaca agtagtsssa gacfcacttfca cfcttsaaagg tgcagefcgcc 120 cctgCggtcc áttétes agg asgtttgccg gaagttoccg cttaeaacge cfccagaaaaa .ISO fcsect'áagca. tgacfctcagt taatfcctgca gaagccagca cfcggfcgcagg aggggggggc 24 0 agtastcétg tgsssagcat gtggagtgsg ggggccactt ttagtgccas ctcc.gt.ssct 3 00 tgtacatttt ceagaeaafct tfc'fcaa.fctcca. tacgacccag agűaccatta taaggtgttt 360 tetcocgcag casgt&getg ccscsatgcc sgfcggaasgg agge&aaggc fctgcsccatfc <120 sgtcccatas tgggafcsctc aaccccafcgg agstatteag sttttaatgc ttfcaartt* 430 ttfcttttcae etttagagtt Ccagcaetts stfcgssaafct afcggaagfcafc sgetcccg&t S40 gctttaactg taaecststc agassttget. gttaaggatg fctacggacaa aactggaggg 600
WSStSc&W tractgatag. cactsesggg cgtctatgca fcgttagtays ccsrgsatat 660 aagtacccst atgtgttagg gesaggteag gstsetetag 700 <2!0> 79 *
ns * «♦ *· *X » * *
Μ '*· * λΦΦ * *-*#:♦ <211> 700 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220:
<223> A mesterséges szekvencia éSCl
LI5-3 izoláturn <400> 79 ataaatccafc atacscartg gac-gtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat SS 4i> qact :r~aageaea agtagtaaac gac_a,t * ' fc 3»ga t g,.« 3 Tgcc cctgtggccc atfcfctcaagg aagtttgccg gaag&fccccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180 fcacecssgea tg&cttc'agt: taarectgca gaagccagca etggvgcagg aggggggggc 248 agfeaatcefcg egaaaagcafc gtggagfcgag gggg-ecacfc.t fcsagtgccaa ctctgtaact 308 fcgtacattfcfc cgsga.csafet tfcfcsatteea fc&tgaeccag agcaccatta. iaaggtgfct-χ 360 tctcccgcag caagí.agcrg ccacaaí.gce ag-ggaaagg aggggaaggt tcgaaccstt; 42 0 agtcccafcaa tgggatacec aaccccafcgg agatarfctag attfctaatgc tttaaafcáta 438 t:ttí:.ttecac ccttagagtt tcagcactta attgasaatt atggáagtat agefccxtg&t S4 0 getcraactg taaccataec agaaartgct g·: csaggatg utacggaeaa aacfcggaagg 680
SSSStgcagg ttacfcg&cag cactacaggg cgcctatgca tgfcfcagtaga, ccst.gaatat 660 :aagi:accqa.fc afcgtgteagg geasggfceag gatactttag 788 <2 10> 80 <213>
,ges sze 'énem t223> A mesterséges szekvencia leírása: B19SCL16-2 izoláturn <400> SO aeaaatccst atactcattg gactgOagca gatgaagagc fcfcfcfcaassaa tafcsaasaafc 68 gaaacSgggfc. tScaagcaca sgfc.agtaaaa gacfeagtefca cttoaaaagg tgcagctgcc 120 cctgcggccc afcfcetcaagg aagtttgcag gaágfctcccg c-fcaaaacgo ofcxagaaaaa 188 taeccaagea egacetcagt caaltafegca gaagccagca cfcggtgcagg aggggggggc 24 8 agtaátcctg tgaaaagcát gtggagtgag ggggccactt. ttagcgccas cHfcgtaact 330 fcgtacatttt ecagacaatt Ittasttargacccag agcaccáttá ta-sggtgttt 360 tetcccgeag caagtagctg Gcacáatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 42 0 agtcccataa tgggatacfcc saccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 430 tttttttcac ettcagagtt Lcagcsctta attgaaaatt: atggaagtat agctcctgat 540 gctttaactg taaccafcatc agaaattgcfc gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600 SSSStgcagg tfcactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagfcaga ccatgaatat SSÓ aagtacccat atgfcgttagg gcaaggtcag gatactttat. 700 <210» 81 <211» 700 <212» DNS <213» Mesterséges szekvencia <220» <223» A mesterséges szekvencia leírása: BI9SCLI7-1 izolátum <400» 81 ataaatccat gaaactgggt cctgtggccc tacccaagcs agtsatccfcg tgcacatttε tctcccgeag agcaccafcfcá ttcctttcac getccaactg ggggtgcagg aagtacccat acacttactg ttcaagcaca attttcaagg tgacttcagfc tgaaaagcat ccagacaatt caagtagcEg tgggatactc cfefctagagtt taaccatatc ttactgacag atctgttagg gactgtagca agtagtaasa aagfc.fctg.scg tasttctgca gtggagtcag tttaattcca ccacastgcc aaccccatgg tcagcactta agasatfc.get cactaesggg gcaaggtcag gatgaagagc gaccacttta gaagfctcccg gaagccsgcs ggggccactt tatgacccag agtggaaagg agatatttag attgaasafct gttaaggatg cgcctatgca gatactttag ttttaaaaaa ctttaaaagg cttacaacgc ctggtgcagg ttagtgccsá agcaccatta aggcaaaggt atthcsatge at.gga.3.gtat fctacggacaa tgttagtags tataaaaaat 55 tgcagctgcc 120 etcagaaaaa 444 &9S9'S'3Sggc 245 ctctgtaact 300 taaggtgttt 355 ttgcaccatt 420 tttaaactta ISO agctcctgat 540 aac t ggaggg 63 0 ccátgaa tát. 55 0
700 . ··>
-211» 700 <213» Mesterséges szekvencia
140 ;«♦#« *·**» ·**: χ * « * * * . . » .» ♦»»> .»* » »«*« <220>
<223> A mesterséges szekvencia, leírása
B195CL18-1 izolátum <400» 82 ataaatccat atacttattg gactgtagca gatgaagagc ttfcfcaaaaaa tstaaaaaat SO •gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaáa- gaet&cttta etfctaaaagg; tgcagctgcc 120 cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagtfccccg cfcfcacaacgc ctcagaasaa 180 tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240 agtaatcctg tgaaaagcac gtggagtgag ggggccactt ttagtgccna ctctgtaact 300 tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tátgacecag sgcsceatta taaggfegttt 360 •cctcccgcsg caagtagccg ccsca&tgcc agtggaaagg aggcaaaggt. ttgcaccatt 420 agc&eeatta tgggat.ac::;? aaccccatgg agatatttag attttaatgc Lttasshtta 480 ttttfcttcac: ctttagagtt tcagcáctta attgaaaatt afcggaagtat agctcctgat SAQ getttasctg taaccatatc sgaaaítgct gctaaggatg ttacggacaa aactggaggg 800 ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660 aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 730 <21i>700 <212» DNS <213» Mesterséges szekvencia <220» <223» .A mesterséges szekvencia leírása: B19SCL19-1 izolátum <400» 83 ataaacccat atacttattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 63 gaa«ctgggt ttcaagcaca agtagt.aa.aa gactacttta ctttaaaagg tgcsgctgoc 120 cctgtggccc. attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacge ctcagaasaa 180 tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg SÖSggggggc 2:40 agtaatectg tgaasagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa. ctctgtaact 300 tgtacstttt ccsgacaatt tttaattcca tatgacccag ageaccatta taaggtgctt 3Sö tctcccgcag caagtagctg ccscaatgcc agtggaaagg aggcsaaggt ttgcaccatt 42.0 agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag atttfcaatgc fcttaaatfcfea «SO ttítí-i -cc ctttagagtt tcaqeaetrs attgaaaatt atq^ucgi ír rgctcctgat r-0 gctcfcaactg taaccaíatc agaaattgct g\ t aagg r, g '?a-qgacaa aacfcggaggg 600 ggggcgcagg fctactgacag cacfcacsggg cgcctafcgca tgfc-agtaga ccatgaatat 660 aagtacccat afcgfcgttagg gcaaggfccag gafca.ctt:fcag- ?0V <210> 84 <211> 7ÖÖ <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <22 <223> A mesterséges szekvencia leírása: B19SCL20-3 izolátum
o.fcaaateeat at acfccatt g gae-fcgfeagcá gatgaagagc fcfcfcfcanaaáa fcatassaaat 68 gsaácfcgggt. txcaagcaca agfcagtaaas gactactfcfca cttfca&aagg xgcagcfcgae 120 cctgtggccc atttfccaagg aagtfcfcgccg gaagtfccccg ctt&caacgc ctcagaaaaa ISO tacccaagca tgact'-cagt taattctgca gaagccagca cfcggtgcagg aggggggggc 24 8 •«gtaatecfc-g tgaaaagcat gtggagfcgag ggggecactfö fcfcagtgccaa etefcgfcaacfc 300 bgfcacatfcfcfc cg.agacaatt fcfctaafctcca tatgacccag agcaccafcca taaggtgttt 366 fcctcccgcag caagtagcfcg ccacaatgcc agfcggaaagg aggcaaaggt fcfcgcaccafct 420 agtcccataa fcggga'fcacfcts aaccctafcgg agafcatttag attt.taatgc tttaaattta 4S0 fcfcfct.ttt.cac ctttagagtt: fccagcacfcfcá afcfcgaaasfcfc afcggaagfcsfc agctcctgafc S40 gcttfcaactg taacc&tafcc aga.a.a.fcfcg:ct gi:.fcaaggatg ctacggácaá mc::ggaggg 6 00 ggggt-gcagg fctacfcgacsg cac'tacaggg xgfcctatgca fcgt.t.agtaga •ccafc.ga.afcafc S6Ö aagtacccat afcgtgtfcagg gcaaggfccag gafcactttag 78S <210> 85 <211> 700 <212> DNS <213> Mesterséges· szekvencia.
<220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása:
; 9 SCL21-3 izolál um .**. **Φ·* ΦΦοί* ** ♦ ♦ 4· * * *
-.· Φ * * 9 ' * ' ϊ:' .·«,
2« * X** <400» 85 afcaaafcecat .afcactcafcfeg: gsctgfcagct gafcgaagagí: ttfctsaaaaa tafcaaaaaa.fc <50 gaaaefcgggfc fctcasgcacs agfcagtaaaa gacfacfctta ctfcfcaaasgg tgeagcfcgee 12.0 cetgfcggeec atttfeeaagg aagfcfcfcgccg gaagttcecg: cttacaacgc cfceagaaaaa ISO feacccaagca tgacfctcagA taatfccfcgca gáagcfccagqa cfcggtgcagg aggggggggc 240 agcaatcctg fcgsaaagcat S&ggagtg«g ggggccactt ttagégeesa. ctcfcqtasct 3öo tgtacatttt ccagacaafct fcfctaaffccca fcafcgacccag agcaccafcta taaggtgttt 380 tctcccgcag csagtagetg tcacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggfc ttgcaccatt 420 ag-.cccataa fcgggatac.ee aaccccatgg ag&tatfctag «tfcctaatgc fc.tta«at tfca 460 tttctttcac cfctfcagagüc fccagcaetta .a&fcgasaatt atggaagtat agcccctgafc S4C gcttfcaaetg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg :fcacggacaa aaetggaggg SOO ggggfcgcagg ttactgaeag eacfcac&ggg egcctatgea tgttagtaga ceafcgaafcat 880.
sagfcsoeegfc argtgttagg gcsaggfccag gafcacfcttag 700 <2 10» 86 <211» 700 <212» DNS <213» Mesterséges szekvencia <220» <223» A mesterséges szekvencia leírása: B19SCL22-11 izolátum <400» 86 ataaafcccaí: atactca.fc&g gactgtagca gafcgaagagc ttttaaaaaa. tataaaaaat SO gaaactgggt ttcaagcacc agfcagtsaaa gactacfccfca cfcfcfcaaaagg tgcagctgcc 170 cöCgfcggccc actttcaagg aagttfegccg gaagttcccg cttacaacgc· ctcagaaaaa ISO tacccaagca tgacttcsgfc taattvtgca gaagcc&gca ctggtgcagg aggggggggc 24ö agfca,trrrg tcaaaaste^t Omg^tgag ggvgcca —r ί*·Λ-^.νοο ctcrgtaa-'r -«00 fcgfcacatttfc ccagaca&tt tfctaáfctcca tatgacccs.g agcaceatta taaggtgttt 360 fccfccccgcag caagtagcfcg ccacaafcgcc agfcggaasgg aggcaaaggfc tfcgcaccafct 420 agtcccafcaa fcgggsfcactc aaccccafcgg - aga-tat fc tag attfctastgc fcttaaatfcfca 4 20: ttttttccae ctfcfcagagtt fccagcacfcfca attgaaaafc.K atggaagtat agcfccctgafc 666 gcttfcaaetg fcaaccatatc agaagfefcgefc gttaaggatg fcfcacggacaa aacfcggaggg 600 ggggtgcagg ttaesgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatar 800 aagfcacccafc atgtgtragg gcaaggfccag gatactttag 700 <210» 87 i
143 ♦* -** ** * ' :<· v ' > * <
•V,« ..n » ♦S*'» <2 Π >700 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>
<223> A mesterséges szekvencia
-14 izolál um <400> 87 agfcasfcccfct afcacfceafcfcg gactgtagca gatgaagagc fctttaaaaa® tafcaa&aaát 60 gaaacfcggct ttcaagcaca ágtagtaass gaetacttts ccttaaaagg tgcagcfcgcc 12$ cctgfcggcfcG afctllaatgg aagtttgccg gaagtfccccg cttacsacgc ctcagaaaaa ISO taacGaagua cgacttcagt t«ar.r.ctgc« gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 24 0 agtaatcctg tgsaasgeafc. gtggagtgag ggggccactt tfcacggacaa ctctgtaacfc 3 80 fcgfcacafcfctfc ccngacaatí: ·:::. c&atfccca tatgacccag agcaccattn taaggtgttt 3SC tétcscgcag caagtagcfcg ccucsslgce agtggaaagg uggcaasgyl fctgcaccafcfc 430 agfccccafcaa tgggafcactc aaccccatgg agtsKtcefcg stfcfctastgc fct:fcaaattt.a 4 80 fctfcttfcfccac ctfcfcagagfct fccagcactta afcfcgsaaafcfc .aCggaagfea-t ágcfcfcfcfcgat 340 gűfccfesacfcg; taaccatafcc agassfcfcgcfc gtfcaaggatg ttacggacaa. aactggaggg 600 SSSSVgcagg ttactgacsg cactacagqg egcctatgea tgtfcagfcaga ccacgaatst SSO •a&gtacccsfc atgtgtfcagg gcaaggtcag gataetttag 780 <210> 88 <211> 21 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása;
<400> 88 tceafeatgac ccagayeaQC a <210> 89 >ara primer
144 • Φ ·**
Λ ' * χ. ν *' * *'* * .
'* * * · Sa.
*Α·>* ·* >·**'·· <2Π> 19 <2Ι2> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása; Vpara 9 primer <40ö> 89 tttccacegg ca££gtggs 19 <210> 90 <211> 21 <212> DNS <213> Metó írséges szekvencia <220>
<221 > vegyes...tulajdonság <222> (1) <223> amiben a: 5: Fám- mai van módosítva <220>
<221 > vegyes._talajdönság <222> (21) <223> amiben 'g! 3' Tamra-val van módosítva <220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása; VparalO primer <400> 90 áSctagacct gcatyí:g ** £ Η * ·χ·* • Ί,. /*·.· «« - >*» *
Η5
V <210>91 <211> 26 <2Ι2> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>
<223> Λ mesterséges szekvencia leírása: célszekvencia <400> 91 ctactfcgctg: cgggaga.aaa seacefc 26 <210> 92 <21 !> 681 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220>
<223> A mesterséges szekvencia leírása: belső kontroll szekvencia <400> 92 gaattcsctt gtacatfcttc cagacaafcfct: ttaafctecat .afcgacceags gcaccattafc SS acagtgacat gcaggtcfcag ctotgccaca atgccagtgg aaaggaggca aaggtttgca 1.2S ccattagfccc cafcaatggga tactceaccc cstggagafca tttagatttt aatgc&tfcaa 180 afcttattttt ttcaccttta gagtttcagc acttasfcfcga aaa·:-.atgga agtatagctc 240 ctgatgcttfc aactgta.ace atafccagaaa tfcgcfegttaa ggatgctacg gacaaaáctg 3SS ö®gggggggi: geaggttact gacagcacta cagggögcöt argcatgtta gtagáoe&feg 360 aatataagfca cceafcafcgtg t’cagggtaag gtcaágatác tttagcccca gaacttcsta 428 t.fet.gggtata: otttccocct cá-atacgctt acttaacagt aggagafcgtfc aa.caca-eaag 486 gaatttcügg agacagcaas .a-aattggcaa gtgaagaatc agcactttat gttttggaac 540 acagttcttt tcagctttfca ggtacaggag gcacagcaae tatgtcfctafc aagortcctc SOö cagtgccccc. «gaaaattta gagggctgoa gtcaacactt ttatgaaatg cacaacccct- 668 tatasggate ccgctgtcga c 681

Claims (10)

  1. í. Eljárás Sí9 humán parvovírus fertőzés kimutatására egy biológiai mintában, azzal jellemezve, hogy az alábbi lepáeeket atelraazzuk:
    > m..» ,\ < '0' m cy > ---,,-,- - a i, η „\
    DNS-t tartalmaz, és: a szóban forgó nukleinsav tartalmaz -agy celszekveneíéé (tó a célszakvenoíát ampimkáijuk egy $' -3’ nukleáz aktivitással rendelkező nukiainsav pollmemzzal egy olyan prtmer-párraf, amely képes a célszekysnoíához: blöridlzálódnl, valamW egy oilgonukleofíd próbával, amelyet égy terveztünk meg, hogy az ampilfikélt szekvenciában leve primerek közűi az egyikhez viszonyítva 3' irányban hlbncizáiőójon, ahol (?) a szóban forgó prlmer-pár közét az egyik egy értelmes primer (SS, számé szekvencia), a másik egy entiazensz primer (Só. számé szekvenciától) a próba 6! vége egy fluoreszcens riporter festőket tartalmaz, és a próba 3* vége blokkolva mm, begy megakadályozzuk a próba exfenziéjau és tartalmaz agy festéket, amely ksoitja ez F flueroíor flonreszoonoiájat;
    (ifi) ez ampllflkálás során a poíimeráz megemészti az oilgonukleofíd próbát, amikor hibrtóizáfödik e céíszekvenolához, ezzel elválasztva a riporter molekulát a kioltó moiekuátol' és (ív) ahogy az ampílilkáíást végezzük, a riporter molekula fluoreszcenciáját eiienörizzék, ahol a fluoreszcencia meglétei e nukleinsav amplifikáció létrejöttének,
  2. 2. Az i, igénypont szerinti eljárás, azzal jeilernezve, hogy a riporter egy ftuoreszcene
  3. 3. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kioltó egy rodamin festék
  4. 4, Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárna, azzal jellemezve,: begy a. szóban forgó nukleinsav poíimeráz: egy Thatmoe sguaácps (Tag)- poíimeráz,
  5. 5, Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az izolálás!
    lépésben a nukieinsavat egy oéípont-speoifíkus befogó ollgonukleotióhoz Illesztjük, ahol a befogó oilgonukieotió polinukieötld szekvenciáját a 49-55, számé szekvenciák közül választjuk ki.
    5. Eljárás Bt 9 humán parvovírus fertőzés kimutatására egy biológiai mintában, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépeseket alkalmazzuk:
    (a) nukieinsavat Izolálunk egy biológiai miniéből, amelyről feltételezzük, hogy humán parvovírus Bt3 DNS-t tartalmaz, és a szóban forgó nukleinsav tartalmaz egy celszekvenclát;:
    tb) az izoíait 810 pafvovsrus nukiemsavat agy aDö oiigonnkieotiddai reagákatjuk, amely tartalmaz agy első prímért, amely egy olyan komplexképxö szekvenciát tartalmaz, amely megfelelő mértékben komplementer a célszekvencia 3’ terminális részévei ehhez, hegy komplexet képezzen vele. ahol az éne primer tartalmaz még egy pmmofert egy DNSviepenpens RNS poümemz S'-hex, os muxődés szempontjából a komplexképzö szekvenciához, kapcsolódik, és a reakciót olyan körülmények között hajtják végre, amely biztosítja egy elsgormkieet-d/célszekvanolá komplex képződését és a DNSszlntáxis iniciálását;
    te) az alsó prímért egy extenzlés reakcióban meghosszabbítjuk, iemplátkónt a célszekvenciát használva, Igy kapunk egy első DNS primer exíenxlös terméket amely komplementer a célszekvenciévet (dj a DNS primer extenzlés terméket egy második eilgonukieotiddál kezeljük, amely tartalmaz egy második prímért, amely egy olyan komplexképzö szekvenciát tartalmaz, amely megfelelő mértékben komplementer a DNS primer extenzlős termék 3! terminális részével ahhoz, hogy komplexet képezzen vele olyan körülmények között, amely biztosítja egy öilgonokleokd/céiszekvene-a komplex képződésé és a DNS-sxlniexlS tnleiálésái;
    (e) a másoösk primer 3' terminálisát egy DNS exrenziös reakcióban meghosszabbítjuk, igy kapunk egy második DNS primer extenzlés terméket, ezzel előállítva egy templátot a DNS-dependens RNS pollmerézhoz;
    (f) a templátot használjuk több RNS kópia előállítására a ceiszek véneiéről, egy olyan DNS-dependens RNS polimeréé használatával, amely felismeri a premoter szekvenciát; es (g) autokatalltlkusan megismételjük e (bj-(fj lépéseket, az (f j lépesben kapott RNS köpik használatával, hogy a céisxákvenciát ampilfíkáljuk, ahol a szóban forgó első és második primer szekvenciája a SS. Illetve a 89, számú szekvencia.
  6. 7, A 6, Igénypont szerinti eljárás, ezzel jellemezve, begy tartalmazza még az alábbi lépésekéi is;
    (I) az (f) lépésben kapod termékhez egy jelzett ellgonukleotldot adunk, amely komplementer a oészekvenela egy részével, olyan körülmények között, amely biztossá á próba mbodixáclöjái a célszekvenciával. azáltal agy próba -célszekvéneié komplexet képezve; és (l) kimutatjuk a címke jelenlétét vagy hiányát, amely a célszekvenola jelenlétét vagy hiányát mutatja.
  7. 8, A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hegy a jelölés akndinlum eezter,
  8. 9, Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tartalmaz még egy belső kontrollt is.
  9. 10, A 9, Igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a belső kontroli a 90. számú
  10. 11, Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy lehetővé teszi a 819 DNS kimutatását csupán esek 18- yírusrészecske/ml tlterü vlrémlás mintákban is.
HU0600779A 2001-06-28 2002-06-28 Diagnosztikai esszék a B19 parvovírushoz HU230244B1 (hu)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30207701P 2001-06-28 2001-06-28
US60/302,077 2001-06-28
US36595602P 2002-03-19 2002-03-19
US60/365,956 2002-03-19
US36922402P 2002-03-29 2002-03-29
US60/369,224 2002-03-29
PCT/US2002/020684 WO2003002753A2 (en) 2001-06-28 2002-06-28 Diagnostic assays for parvovirus b19

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0600779A2 HUP0600779A2 (en) 2007-01-29
HUP0600779A3 HUP0600779A3 (en) 2010-03-29
HU230244B1 true HU230244B1 (hu) 2015-11-30

Family

ID=28794978

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0600779A HU230244B1 (hu) 2001-06-28 2002-06-28 Diagnosztikai esszék a B19 parvovírushoz

Country Status (20)

Country Link
US (2) US6936442B2 (hu)
EP (1) EP1537235B1 (hu)
JP (5) JP2005511004A (hu)
KR (2) KR100888377B1 (hu)
CN (1) CN1324147C (hu)
AU (2) AU2002318450B2 (hu)
BG (1) BG66283B1 (hu)
BR (1) BRPI0211191B8 (hu)
CA (2) CA2451756A1 (hu)
CZ (1) CZ308201B6 (hu)
ES (1) ES2537549T3 (hu)
HK (1) HK1080516B (hu)
HU (1) HU230244B1 (hu)
MX (1) MXPA03011802A (hu)
NO (1) NO337901B1 (hu)
NZ (1) NZ530602A (hu)
PL (1) PL210849B1 (hu)
RU (1) RU2301263C2 (hu)
SK (1) SK15752003A3 (hu)
WO (1) WO2003002753A2 (hu)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1421095B1 (en) * 2001-08-31 2013-10-09 Gen-Probe Incorporated Assay for detection of human parvovirus b19 nucleic acid
US8242254B2 (en) 2003-09-11 2012-08-14 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of bacteria
WO2005071401A2 (en) * 2004-01-15 2005-08-04 Chiron Corporation Homogeneous multiplex assay for nucleic acid targets
EP1799856A4 (en) * 2004-09-10 2009-03-04 Focus Diagnostics Inc METHOD AND COMPOSITIONS FOR DETECTING ERYTHROVIRUS GENOTYPES
EP1809772B1 (en) * 2004-11-09 2013-06-05 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting group a streptococci
US8058000B2 (en) * 2005-06-02 2011-11-15 The United States Of America As Represented By The U.S. Environmental Protection Agency Species-specific primer sets and identification of species-specific DNA sequences using genome fragment enrichment
US7572584B2 (en) * 2005-06-02 2009-08-11 The United States Of America As Represented By The U.S. Environmental Protection Agency Species-specific primer sets and identification of species-specific DNA sequences using genome fragment enrichment
DE102006034844B3 (de) * 2006-07-27 2007-12-06 DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg-Hessen gGmbH Zusammensetzungen und Verfahren zur Amplifikation von Hepatitis A-Viren (HAV) und/oder Parvoviren B19 (PB19) mittels Multiplex-PCR
WO2008089193A2 (en) * 2007-01-16 2008-07-24 Talecris Biotherapeutics Human erythrovirus
NZ582019A (en) * 2007-06-14 2012-07-27 Univ Oklahoma State Vaccines containing canine parvovirus genetic variants
US20110045456A1 (en) * 2007-06-14 2011-02-24 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of adventitious contaminant viruses
US8227583B2 (en) * 2007-06-14 2012-07-24 The Board Of Regents For Oklahoma State University Vaccines containing canine parvovirus genetic variants
KR101061009B1 (ko) * 2008-07-23 2011-09-01 경상대학교산학협력단 바이러스 진단 방법 및 시스템
US8921039B2 (en) 2009-02-26 2014-12-30 Gen-Probe Incorporated Assay for detection of human parvovirus nucleic acid
US9598739B1 (en) 2009-03-13 2017-03-21 Grifols Therapeutics Inc. Human erythrovirus
JP2013529894A (ja) * 2010-04-07 2013-07-25 ノバルティス アーゲー パルボウイルスｂ１９のウイルス様粒子を生成するための方法
CN113215308A (zh) * 2011-07-15 2021-08-06 简.探针公司 检测人细小病毒核酸和甲型肝炎病毒核酸的组合物和方法
CN103451320B (zh) * 2013-08-09 2015-05-06 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 人细小病毒B19三种基因型的实时荧光定量PCR检测方法及其通用检测引物、TaqMan探针与试剂盒
US9410172B2 (en) * 2013-09-16 2016-08-09 General Electric Company Isothermal amplification using oligocation-conjugated primer sequences
CN106456742B (zh) 2014-03-10 2020-02-04 路易斯维尔大学研究基金会有限公司 用于治疗(包括预防)细小病毒感染及相关疾病的组合物和方法
CN103820581B (zh) * 2014-03-17 2016-01-13 成都蓉生药业有限责任公司 一种检测人细小病毒b19的试剂盒和方法
JP6414409B2 (ja) * 2014-07-29 2018-10-31 株式会社微生物化学研究所 弱毒化パルボウイルスおよび弱毒化パルボウイルスを用いたワクチン
WO2016071926A1 (en) * 2014-11-05 2016-05-12 Indian Council Of Medical Research In-vitro detection of human parvovirus 4
TWI735433B (zh) * 2015-03-27 2021-08-11 美商再生元醫藥公司 偵測生物污染物之組成物及方法
CN105158471A (zh) * 2015-08-24 2015-12-16 北京中检安泰诊断科技有限公司 人细小病毒B19型IgM抗体检测试剂盒及其制备方法
CN114410836B (zh) * 2021-12-17 2024-03-01 上海交通大学医学院附属仁济医院 一种集样本处理、核酸提取及多重恒温扩增一体化的检测人细小病毒b19的试剂盒和方法

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5516630A (en) 1983-09-30 1996-05-14 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods of detecting hepatitis A virus
US5283174A (en) 1987-09-21 1994-02-01 Gen-Probe, Incorporated Homogenous protection assay
CA2020958C (en) * 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
US6204044B1 (en) 1989-09-14 2001-03-20 Caroline Sarah Brown Human parvovirus B19 proteins and virus-like particles, their production and their use in diagnostic assays and vaccines
US6287815B1 (en) 1989-09-14 2001-09-11 Rijksuniversiteit Te Leiden Human parvovirus B19 proteins and virus-like particles, their production and their use in diagnostic assays and vaccines
NL8902301A (nl) 1989-09-14 1991-04-02 Rijksuniversiteit Humaan parvovirus b19 eiwitten, hun produktie en hun gebruik in diagnostische assays en vaccins.
DE4003826C2 (de) 1990-02-08 1995-11-23 Mikrogen Molekularbiol Entw Peptide der Kapsidproteine VP1 oder VP2 des Parvovirus B19
WO1994010294A1 (en) 1992-10-23 1994-05-11 New York University Human monoclonal antibodies to human parvovirus and methods of making and using thereof
US5449608A (en) 1993-03-22 1995-09-12 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Parvovirus B19 receptor and parvovirus B19 detection
JPH06293798A (ja) 1993-04-06 1994-10-21 Shin Etsu Chem Co Ltd ヒトパルボウイルスｂ１９のエピトープ関連ペプチド
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
AU3698595A (en) 1994-09-22 1996-04-09 Hans Wolf Dna sequence and protein of the non-structural reading frame i of the human parvovirus b19
US6004044A (en) * 1995-05-03 1999-12-21 Itt Cannon, Inc. Optoelectric connector
JPH0910000A (ja) 1995-06-26 1997-01-14 Nippon Sekijiyuujishiya ヒトパルボウイルスの検出方法及びそのための試薬
WO1997018327A1 (en) * 1995-11-13 1997-05-22 Shionogi & Co., Ltd. Diagnosis of diseases associated with coronary twitching
WO1997021346A1 (en) 1995-12-14 1997-06-19 Cerus Corporation Inactivation of non-enveloped virus
US6094338A (en) * 1997-07-09 2000-07-25 Mitsubishi Chemical Corporation Electric double-layer capacitor
AU1269699A (en) 1997-10-08 1999-04-27 Advanced Research And Technology Institute, Inc. Chimeric parvovirus-based recombinant vector system that specifically targets the erythroid lineage
DE19752898A1 (de) 1997-11-28 1999-08-05 Centeon Pharma Gmbh Verfahren zum Nachweis hoher Vierenkonzentrationen im Blutplasma und/oder Blutserum mittels der Polymerasekettenreaktion
WO1999040226A2 (en) 1998-02-04 1999-08-12 Perkin-Elmer Corporation Determination of a genotype of an amplification product at multiple allelic sites
RU2146372C1 (ru) * 1998-04-16 2000-03-10 Гематологический научный центр РАМН Способ определения парвовируса б19
US6238860B1 (en) 1998-11-05 2001-05-29 Dyax Corp. Binding moieties for human parvovirus B19
US6642033B1 (en) 1999-07-20 2003-11-04 V.I. Technologies, Inc. Nucleic acids for detecting parvovirus and methods of using same
ATE304061T1 (de) * 1999-07-23 2005-09-15 Gen Probe Inc Polynukleotid amplifizierungsverfahren

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0600779A3 (en) 2010-03-29
US20050221300A1 (en) 2005-10-06
NO20035732L (no) 2004-02-27
HK1080516B (zh) 2008-01-25
CZ20033516A3 (cs) 2005-02-16
KR100944674B1 (ko) 2010-03-04
AU2007231822B2 (en) 2011-01-27
BG108526A (bg) 2004-09-30
AU2007231822A1 (en) 2007-11-29
NO20035732D0 (no) 2003-12-19
BRPI0211191B1 (pt) 2015-09-15
RU2301263C2 (ru) 2007-06-20
PL368049A1 (en) 2005-03-21
EP1537235A4 (en) 2007-10-03
US20030170612A1 (en) 2003-09-11
BR0211191A (pt) 2006-05-23
AU2002318450B2 (en) 2007-11-22
KR20050119220A (ko) 2005-12-21
CA2779653C (en) 2014-08-19
HK1080516A1 (en) 2006-04-28
NO337901B1 (no) 2016-07-04
WO2003002753A2 (en) 2003-01-09
RU2004102205A (ru) 2005-06-10
BRPI0211191B8 (pt) 2021-07-27
JP2016182149A (ja) 2016-10-20
KR20090003370A (ko) 2009-01-09
ES2537549T3 (es) 2015-06-09
JP2014061007A (ja) 2014-04-10
WO2003002753A3 (en) 2005-04-14
CN1636071A (zh) 2005-07-06
PL210849B1 (pl) 2012-03-30
CA2451756A1 (en) 2003-01-09
MXPA03011802A (es) 2004-04-02
SK15752003A3 (sk) 2005-01-03
HUP0600779A2 (en) 2007-01-29
JP2005511004A (ja) 2005-04-28
JP2012075440A (ja) 2012-04-19
EP1537235B1 (en) 2015-04-01
EP1537235A2 (en) 2005-06-08
CZ308201B6 (cs) 2020-02-26
JP6026401B2 (ja) 2016-11-16
NZ530602A (en) 2006-02-24
CA2779653A1 (en) 2003-01-09
KR100888377B1 (ko) 2009-03-13
JP2009011324A (ja) 2009-01-22
CN1324147C (zh) 2007-07-04
BG66283B1 (bg) 2013-01-31
US6936442B2 (en) 2005-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU230244B1 (hu) Diagnosztikai esszék a B19 parvovírushoz
CN110423844B (zh) 检测bk病毒的方法和组合物
WO2021222304A1 (en) Sars-cov-2 rna vaccines
JP2018527948A (ja) ウイルス由来の治療剤を解析する方法
WO2009098789A1 (ja) Lamp法による甲殻類病原性ウイルスの検出方法及び検出試薬キット
CN106434982A (zh) 缺血性脑卒中相关的分子标记物及其应用
CA2311297C (fr) Erythrovirus et ses applications
US8465960B2 (en) Influenza B viruses with reduced sensitivity to neuraminidase inhibitors
KR102555330B1 (ko) SARS-CoV-2 진단용 조성물, 키트 및 이를 이용한 SARS-CoV-2의 진단방법
JP6153515B2 (ja) Ｈｌａ−ａ＊２４：０２を検出する方法、及び検出キット
US20060057643A1 (en) Methods and compositions for detecting erythrovirus genotypes
WO1991014779A1 (en) Diagnostic for hepatitis virus
US20230167511A1 (en) An ultrasensitive rapid and portable case13d-based diagnostic assay
Gouandjika‐Vasilache et al. Cocirculation of measles virus genotype B2 and B3. 1 in Central African Republic during the 2000 measles epidemic
JP7417985B2 (ja) プライマーセット
RU2812859C1 (ru) Способ дифференциации генома генетически модифицированного штамма &#34;ВНИИЗЖ-G333&#34; от вакцинного штамма &#34;PB-97&#34; вируса бешенства методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков высокого разрешения
Wright et al. Molecular characterization of rabies virus isolates from Trinidad
JP2007222092A (ja) Ｅ型肝炎ウイルスゲノムの高感度検出法
CN115175922A (zh) 用于检测小双核糖核酸病毒的组合物和方法
JP2007282512A (ja) セルフアニーリング形成を阻害する方法およびその用途
WO2021042004A1 (en) Reagents and methods for detecting aav shedding
CN117441029A (zh) 用于检测具有刺突蛋白突变的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)变体的组合物和方法
AU2012261529B2 (en) Methods and compositions for detecting BK virus
JP2004254578A (ja) ヒトアデノウイルス塩基配列解析及び変異株の検出方法

Legal Events

Date Code Title Description
GB9A Succession in title

Owner name: NOVARTIS VACCINES AND DIAGNOSTICS, INC., US

Free format text: FORMER OWNER(S): CHIRON CORPORATION, US

GB9A Succession in title

Owner name: GRIFOLS WORLDWIDE OPERATIONS LIMITED, IR

Free format text: FORMER OWNER(S): CHIRON CORPORATION, US; NOVARTIS VACCINES AND DIAGNOSTICS, INC., US

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees