JP2018527948A - ウイルス由来の治療剤を解析する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2015年7月31日に出願された米国仮出願第62/199,663号(これは、参考として本明細書に援用される)への優先権を主張する。
PVの神経弱毒化におけるそれらの顕著な役割のために、潜在的なポリオワクチンの神経毒性について評価するための、文献において記載されている方法の大半は、IRES内の十分に規定された部位に焦点を絞っている(Martinら、(2011年)、WHO working group discussion on revision of the WHO recommendation for the production and control of poliomyelitis vaccines (oral): TRS Nos. 904 and 910. Report on Meeting held on 20−22 July 2010, Geneva, Switzerland、Vaccine、29巻:6432〜6436頁;Rezapkinら、(1998年)、Virology、245巻:183〜187頁;Chumakovら、(1994年)、J Med Virol、42巻:79〜85頁;Laassriら、(2006年)、J Infect Diseases、193巻:1344〜1349頁)。PVSRIPO内の、ポリオIRESの、HRV2 IRESによる完全な置き換えは、キメラウイルスの毒性プロファイルを、どのようにして特徴付けるのかという問題を提示している。ポリオワクチンの製造元により用いられているin vitro法(すなわち、MAPREC)は、HRV2 IRES配列に対しては適当でないので、この問題は、製品の安全性の裁定者としての、ウイルスの遺伝子安定性についてのin vivoの試験法および特徴付けへと委ねられる。投与後組織学を含む、in vivoにおける霊長類神経毒力試験は、WHOガイドラインに従い、カニクイザルを使用して実施された(Dobrikovaら、(2012年)、J Virol、86巻:2750〜2759頁)。かつての、HTB−15細胞異種移植(Balb/cマウスにおける)/プラークシーケンシング研究は、PVSRIPOゲノムが、継代培養およびin vivoにおけるウイルスの拡大の後で、安定的かつ非病原性であることを裏付けた。HTB−15異種移植研究では、サンガーシーケンシングを使用して、2つの多型部位だけが、97および1824位として言及された(Dobrikovaら、(2008年)、Mol Ther、16巻:1865〜1872頁;Cello Jら、(2008年)、J Med Virol、80巻:352〜359頁)。興味深いことに、PVSRIPOについてのIlluminaディープシーケンシングでは、これらの2つの部位のうちのいずれも、多型と同定されなかったことから、これらが、HTB−15細胞内の継代培養後における、デノボの塩基変異の結果であったことが指し示される。まとめると、かつての2つの研究の結果は、PVSRIPOの毒性の、野生型PVと比べた欠如を裏付けた。これらの2つの一般的な手法を使用して、PVSRIPOは、霊長類において、神経障害性表現型を呈しないことが確立されており、直接的サンガーシーケンシング法およびプラークベースのサンガーシーケンシング法のいずれを使用しても、PVSRIPOが呈する配列不均一性は低レベルである。また、温度感受性試験(すなわち、RCT40)および一般的な安全性試験(例えば、in vivoにおける付随作用因子試験およびRT−qPCR)など、ウイルスの遺伝子安定性および均質性についての粗評価を行う、他の高感度ではない方法も利用された。シーケンシング技術が進歩しているので、サンガーシーケンシングに内在的な感度限界(塩基1つ当たり約15〜20%変動のLoD)は、塩基改変体に対する1%未満の理論感度が可能な「次世代シーケンシング」(NGS)法により克服されている(Cabannesら、(2014年)、PDA J Pharm Sci and Tech、68巻:631〜638頁;Liuら、(2012年)、Comparison of next−generation sequencing systems、J Biomed Biotech、2012年、2012:251364;NeverovおよびChumakov(2010年)、PNAS USA、107巻:20063〜20068頁)。大半のNGSディープシーケンシング法の感度は、それらの内在的な誤組込みまたはミスコールエラー率だけにより限定されており、これらは、根底をなす塩基検出技術の感度限界より大きい。
核酸配列およびアミノ酸配列は、37 C.F.R.§1.822において規定されている通り、ヌクレオチド塩基のための標準的な略号文字、およびアミノ酸のための三文字コードを使用して示す。各核酸配列について、1つの鎖だけを示すが、表示された鎖への任意の言及により、相補的な鎖も組入れられるものと理解される。2016年7月29日に作成され(24.3kb)、本明細書と共に提出される配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。
そうでないことに言及されない限りにおいて、技術用語は、従来の使用法に従い使用する。分子生物学における共通の用語の定義は、Benjamin Lewin、Genes VII、Oxford University Press刊、1999年;Kendrewら(編)、The Encyclopedia of Molecular Biology、Blackwell Science Ltd.刊、1994年;およびRobert A. Meyers (編)、Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference、VCH Publishers, Inc.刊、1995年;ならびに他の同様の参考文献において見出すことができる。
ウイルス由来の治療剤業界では、現在使用されている、サル神経毒力安全性試験(monkey neurovirulence safety test)(MNVT)手順、およびプラークベースのシーケンシング法(PCRおよび制限酵素切断による変異体解析(mutant analysis by PCR and restriction enzyme cleavage)(MAPREC)など)に置きかわりうる方法の同定が、長年にわたり必要とされている。例えば、2010年に、スイス、ジュネーブで開催された、灰白髄炎ワクチン(経口)の作製および制御についてのWHOによる推奨の改定版についての、WHO Working Groupによる討論(Vaccine、29巻(2011年)、6432〜6436頁を参照されたい)では、動物モデルにおける特定の変異の弱毒化効果は、種、遺伝子バックグラウンド、および接種経路に依存する場合があり、したがって、ヒトへの外挿を不確実なものとしていることについて言及された。加えて、MAPRECアッセイは、極めて煩瑣な試験であり、放射性同位元素の使用の要求が、その技術的困難に加わり、異なる実験室が、アッセイの多様な側面についての問題を有する。ウイルス由来の治療剤について調べるかまたは検証するのに現在使用されている神経毒力試験アッセイは、高価であり、かつ、時間がかかる。加えて、本分野において現在使用されているアッセイが、ヒトに対する神経毒力の潜在的可能性についての評価において妥当性を有するのかどうかも明らかでない。WHO Working Groupは、ポリオワクチンの品質管理のための新たな技術の開発を推奨した。本明細書で記載される方法は、RNAウイルス由来の治療剤、特にワクチンのための、改善された検証/安全性試験法を提供し、これにより、本業界における長年にわたる必要に対する解決策をもたらす。開示される方法は現在、米国FDAによる承認のための検討下にある。この承認が得られれば、本方法の商業的成功が達成されるであろう。
本明細書では、完全なウイルスゲノムにわたり、実質的に全ての潜在的な遺伝子変異の存在および頻度を決定するように、次世代シーケンシング法(例えば、大規模並列シーケンシング)を、in vitroにおいて使用して、ウイルス由来の治療剤(例えば、ポリオウイルスワクチン製品および他のウイルスワクチン製品)のロット(例えば、マスターのウイルスシードバンクロットおよびワーキングセルバンクロットなど、ウイルスシードバンク、収集物、および精製医薬品ロット)を、迅速かつ直接的にスクリーニングする方法が記載される。この方法は、配列改変体に対する、現行のプラークベースのシーケンシング法より数桁大きな(典型的に4 log以上である)感度を慣例的に裏付けており、完了に数カ月間を要求することが典型的な、霊長類の神経毒性試験と異なり、1〜2週間以内で実施することができる。加えて、サンガー法は、使用されるプライマー配列に対する特異性が限定され、検出感度も、全シグナルのうちの約10〜20%までに限定されているので、本明細書で報告される結果は、従来のサンガーシーケンシング法を使用しては得ることができない。言い換えれば、サンガーシーケンシング法を使用して、信頼できる形で検出しえたのは、全試料のうちの約10〜20%を超える試料からなった遺伝子改変体だけであり、一般に、シーケンシング部位またはPCRプライミング部位では生じなかった高頻度改変体だけである。
1または複数の配列改変体(例えば、基準配列と比べた、ヌクレオチドの挿入、欠失、もしくは置換、またはこれらの組合せなどの変異)の存在を同定するように、本明細書で提示される方法を使用して解析されるウイルス由来の治療剤は、ウイルス、ウイルスのプラスミド鋳型(ベクターの一部であり、ウイルスの鋳型配列を含むプラスミド鋳型など)、またはウイルスを含有するワクチンでありうる。例えば、ウイルス由来の治療剤は、シーケンシングされるウイルスの鋳型配列を含有するプラスミドDNA(例えば、細菌プラスミド)を含みうる。このようなウイルスのプラスミドDNA鋳型は、宿主細胞内の、天然ウイルスまたは組換えウイルスの産生のために使用することができる。開示される方法を使用して解析しうるウイルスの例は、天然に存在しないRNAベースのウイルス、天然に存在するRNAベースのウイルス、天然に存在しないDNAベースのウイルス、または天然に存在するDNAベースのウイルスのほか、このようなウイルスをコードするウイルスのプラスミド鋳型、またはこのようなウイルスを含有するワクチンを含む。
いくつもの次世代シーケンシング技術が公知である。本開示は、特定のNGS法に制約されない。1つの例は、ジデオキシヌクレオチドによる鎖終結ではなく、ヌクレオチド組込み時のピロホスフェート放出の検出に依拠する合成技法によるシーケンシングである、パイロシーケンシングである。Biotageにより市販されているパイロシーケンシング法(ロースループットシーケンシングのための)、および454(登録商標)Life Sciencesにより市販されているパイロシーケンシング法(ハイスループットシーケンシングのための)などのパイロシーケンシング法を使用することができる。
精製されたウイルス試料のシーケンシングおよび解析
RNAの抽出および逆転写:Qiagenプロトコールの改定バージョンに準拠して、Qiagen製のQIAamp(登録商標)Viral RNA Mini Kitを使用して、ゲノムRNAを、全ての被験試料から単離する。略述すると、キャリアRNAを伴わない、560μlのAVL緩衝液(ウイルス溶解緩衝液「A」:カオトロピック洗浄剤溶液)を、140μlの試料へと添加する。試料をボルテックスし、室温(23°±2℃)で、10分間にわたりインキュベートする。100%のエタノール560μlを、試料へと添加し、ボルテックスし、次いで、試料の半分(約630μl)を、QIAamp(登録商標)Miniカラムへと添加し、6000×gで1分間にわたり遠心分離する。試料の残りをカラムへと添加し、スピンステップを反復する。次いで、カラムを、2つの緩衝液で洗浄する。各々40μlずつの溶出緩衝液による二重溶出を、約80μlの総最終容量について実施する。全RNAを、NanoDrop(商標)8000分光光度計を使用する分光光度法により定量化する。次いで、Life Technologies製のThermoScript(商標)RT−PCR Systemを使用してcDNAを作製するのに、RNAを使用する。略述すると、9μlのRNA、1μlのオリゴ(dT)20プライマー、およびdNTPを、65℃で5分間にわたりインキュベートする。インキュベーション後、cDNA合成緩衝液、DTT、RNaseOUT(商標)、およびThermoScript(商標)RTを、試料へと添加し、試料を、50℃で45分間にわたりインキュベートし、次いで、85℃で5分間にわたりインキュベートして、反応を停止させる。RNアーゼHを、試料へと添加し、37℃で20分間にわたりインキュベートする。cDNAを、NanoDrop(商標)8000分光光度計を使用する分光光度法により定量化する。次いで、5μlのcDNA産物を使用する、New England BioLabs製のNEBNext(商標)Second Strand Synthesis Kitを使用して、第2鎖反応を実施する。cDNAを、第2鎖合成緩衝液および第2鎖合成酵素ミックスと組み合わせ、16℃で2.5時間にわたりインキュベートする。Qiagen製のQIAquick(登録商標)PCR精製キットを使用して、産物を精製し、30μlのヌクレアーゼ非含有水中に溶出させる。dscDNAを、NanoDrop(商標)8000分光光度計を使用する分光光度法により定量化し、短期保管のために、−20±4℃で保管する。
粗ウイルス試料および非精製ウイルス試料のシーケンシングおよび解析
RNAの抽出および逆転写:キャリアRNAを添加せずに、Qiagen QIAamp(登録商標)Viral RNA mini抽出キットを使用して、ウイルスRNAを、被験試料の各々から抽出する。抽出には、各試料のアリコートを使用する。非精製ウイルス試料中の核酸の大半(コピー数および質量による)は、宿主細胞のゲノムDNAおよびミトコンドリアDNAであるので、これらの干渉分子を除去するには、さらなる精製ステップが必要である。試料中の遊離DNAの、DNアーゼによる消化であって、ウイルスRNAに影響を及ぼさずに可能となる消化を使用する。その後、Life Technologies製のTurbo DNase−free(商標)キットを使用して、マスターウイルスバンク試料から抽出されたRNAのアリコートを、DNアーゼ処理する。
サンガーシーケンシング
Illumina(登録商標)法を使用する、基準配列の任意の塩基対のカバレッジが4シーケンシングリード未満である場合は、サンガーシーケンシングを利用する。適切なカバレッジを欠くゲノムの部分が、ゲノムの5’末端近傍にある場合、Roche/454 FLXなどの、代替的なNGS法、および/またはプライマーによる5’側配列の変異性のマスキングを防止するように、リバースプライマーだけを使用する、PVS−RIPO cDNAの「線形増幅」などの、代替的な前増幅法を含む、いくつかのギャップフィリング法を使用することができる。高サイクル数の線形(非指数関数的)PCRを利用して、とりわけ、PVS−RIPOウイルスの、過少に表われる(低コピーdscDNA)超可変性の5’末端における、プライマー配列による、天然PVS−RIPOウイルス配列の上書きを防止する。最後に、これらの手法のいずれも、残りの配列ギャップを首尾よく網羅しない場合は、従来型のPCRに続いて、サンガー蛍光シーケンシングを実施することができる。これらのギャップフィリング法から得られる配列データであって、PVSRIPO基準配列とのコンセンサス配列の相同性と、観察される任意の不均一塩基とを含む配列データを、最終的な報告に組み入れる。
妥当性試験についての基準
実施例1および2では、妥当性試験についての基準は、
1.抽出されたRNAが、試料1例当たりの合計が最小で5ナノグラムでなければならないこと;
2.結果として得られるcDNAが、第2鎖反応における使用のために、試料1例当たりの合計が最小で2ナノグラムでなければならないこと;
3.ライブラリーが、Agilent 2100 High Sensitivity DNAチップを使用して検出可能でなければならず、シーケンシングに適切なサイズ(約300bp)であること;
4.所望の領域について、複数回の線形増幅(可変性5’末端の場合)から最小で4回のカバレッジをもたらすように要求される場合、またはウイルスゲノム内の他の箇所の場合、複数のプライマーセットから、最小で4回のカバレッジをもたらすように要求される場合は、サンガーシーケンシングを用いること
を含む。
1.1つのIllumina(登録商標)フローセルについての総リードが、4500万以上でなければならないこと;
2.基準へとアラインメントされたリードの百分率が、75%を超えるものとすること;
3.基準ウイルス配列の平均カバレッジが、18,000回以上であること;
4.各塩基が、4回またはこれを超えて網羅されなければならないこと。これは、Illumina(登録商標)単独の場合もあり、Illumina(登録商標)と、サンガーシーケンシングとの組合せの場合もあること
を含む。
精製ウイルス試料および粗ウイルス試料に対するRT−PCRおよびサンガーダイターミネーターシーケンシング
RNAの抽出および逆転写:承認された手順に従い、250μlの被験試料を、1120μlのQiagen AVL緩衝液/キャリアRNAへと添加し、ボルテックスし、室温で10分間にわたりインキュベートした。試料+AVL緩衝液の半分(685μl)を、第2のマイクロ遠心チューブへと移し、560μlのエタノール(96〜100%)を、各チューブへと添加し、間欠的にボルテックスすることにより、15秒間にわたり混合し、短時間にわたり遠心分離する。次いで、溶液を、QIAampスピンカラムへと添加し、適切な洗浄緩衝液で洗浄し、60μLのAVE緩衝液中に溶出させる。承認された手順に準拠して、分光光度計を使用して、ウイルスRNAを定量化する。次いで、ウイルスRNAを、使用まで≦−65℃で保管する。
PVS−RIPOロットのシーケンシング
DNAの抽出および逆転写:AIB SOP MOLBIO00050の改定バージョンに準拠して、Qiagen製のQIAamp(登録商標)Viral RNA Mini Kitを使用して、ゲノムRNAを、全ての被験試料から単離した。略述すると、キャリアRNAを伴わない、560μlのAVL緩衝液を、140μlの試料へと添加した。試料をボルテックスし、室温(23°±2℃)で、10分間にわたりインキュベートした。100%のエタノール560μlを、試料へと添加し、ボルテックスし、次いで、試料の半分(約630μl)を、QIAamp(登録商標)Miniカラムへと添加し、6000×gで1分間にわたり遠心分離した。試料の残りをカラムへと添加し、スピンステップを反復した。次いで、カラムを、2つの緩衝液で洗浄した。各々40μlずつの溶出緩衝液による二重溶出を、約80μlの総最終容量について実施した。RNAを、AIB SOP MOLBIO00077に準拠して、NanoDrop(商標)8000分光光度計を使用する分光光度法により定量化した。次いで、Life Technologies製のThermoScript(商標)RT−PCR Systemを使用してcDNAを作製するのに、RNAを使用した。略述すると、7μl中に1μgのRNA、1μlのオリゴdTプライマー、dNTP、および水を、65℃で5分間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、cDNA合成緩衝液、DTT、RNaseOUT、およびThermoScript(商標)RTを、試料へと添加し、試料を、50℃で45分間にわたりインキュベートし、次いで、85℃で5分間にわたりインキュベートして、反応を停止させた。RNアーゼHを、試料へと添加し、37℃で20分間にわたりインキュベートした。cDNAを、AIB SOP MOLBIO00077に準拠して、NanoDrop(商標)8000分光光度計を使用する分光光度法により定量化した。次いで、合計100ナノグラムのcDNA産物を使用する、New England BioLabs製のNEBNext(商標)Second Strand Synthesis Kitを使用して、第2鎖反応を実施した。cDNAを、第2鎖合成緩衝液および第2鎖合成酵素ミックスと組み合わせ、16℃で2.5時間にわたりインキュベートした。Qiagen製のQIAquick(登録商標)PCR精製キットを使用して、産物を精製し、30μlのヌクレアーゼ非含有水中に溶出させた。dscDNAを、AIB SOP MOLBIO00077に準拠して、NanoDrop(商標)8000分光光度計を使用する分光光度法により定量化し、短期保管のために、−20±4℃で保管した。
希釈系列:Illumina(登録商標)HiSeq(登録商標)ソフトウェアを使用して、リードをデマルチプレックス化した。バーコードを分離した後で、Bowtie(短いリードの基準アライナ−)を使用して、リードを、基準配列へとアラインメントした。アラインメント統計を、表3および図2に示す。1000pgのインプットでは、リードのうちの、約87%が、基準配列へとアラインメントされる。インプット量を減少させたところ、アラインメントされるリードの比率は減少した。1000pgの試料を使用して、潜在的な夾雑配列を同定するように、さらなる解析を実施した。少数のマッピングされていないリードを、非冗長データベースと比較したところ、多くのヒットは、宿主細胞Chlorocebus(Vero)のDNAへと帰着した。
Illuminaディープシーケンシングを使用して、PVSRIPOの7つのロットについて解析したが、これらのうちの3つについては、RT−PCRを使用して、既にシーケンシングした(ウイルスゲノムの約1200塩基の区画について)後、ABI 3130xlシーケンサーによるABI BigDye(登録商標)Terminator化学を使用する、サンガー蛍光シーケンシングを施した。初期のNGS開発の試みは、どの方法が、シーケンシングの前における、逆転写および前増幅に起因する、内在的なエラー率を最小化しながら、最大のカバレッジ深度をもたらすのかを同定することに焦点を絞った。鍵となる基準は、PCRと、ウイルスゲノムの一部ではない配列をターゲティングするシーケンシングプライマーとを用いることであった。これは、ウイルスcDNAの断片化に従い選択される、任意のNGS法のためのアダプタマー(adaptamer)を使用することを意味した。
結果
PVSRIPO内の塩基の不均一性の場所および程度を解明するために、ディープシーケンシング法を使用した。既に、プラスミド材料およびマスターウイルスバンク材料を含むPVSRIPOロットについては、サンガーシーケンシングにより解析した(2003〜2009年)。代替法として、HTB−15グリオーマ細胞の継代培養およびプラークサンガーシーケンシング法を、2007〜2008年に、6つのPVSRIPO単離物により行った(Dobrikovaら(2008年)、Mol Ther、16巻:1865〜1872頁)。これは、PVSRIPOゲノム内の2つの場所(97および1824位)であって、サンガーシーケンシングによる多型塩基を呈する場所だけを同定した(すなわち、全ウイルス集団のうちの約15%超からなった)。継代後のプラークシーケンシングを含むサンガーシーケンシングにより、PVSRIPO内で観察される、限定的なウイルス配列変動は、PVSRIPOが、Vero(およびHTB−15グリオーマ細胞)内の繁殖時に、ポリオ野生型またはワクチン株について予測されるより安定的であることを指し示した(Sanjuanら(2010年)、J Virol、84巻:9733〜48頁)。しかし、PVSRIPOの遺伝子安定性を明確に裏付けるためには、所与のロット内の、個々の(すなわち、低コピーの)ビリオン配列について報告することが可能なディープシーケンシング法が要求されるであろう。市販のディープシーケンシング法の総説については、表7(Liuら(2012年)、J Biomed Biotech、2012:251364頁)において詳述されている。
Illuminaディープシーケンシングにより調べられた、PVSRIPOウイルスの7つのロットは、驚くべきことに、塩基1つ当たりの平均リード深度が2×105を超えるキメラウイルスゲノムにわたり限定的な配列の微小不均一性を呈した。観察された配列変動は、5’側最末端を例外として、カノニカルの基準配列と比べて、1%未満の総不均一塩基コールからなることが示され、5つの多型位置だけが、PVSRIPOの1つを超えるロット内で、反復的に観察された。これらの5つの反復性の不均一位置は全て、HRV2 IRES(35、60、80、340、および618位)内に位置し、それらの関連する塩基置換パターンは、被験ロットの全てにわたり一貫することが観察された。これは、PVSRIPOの臨床ロット内に存在する限定的な変動が、親MVBロット内に元来存在する変動(すなわち、35および60位)に由来するか、またはウイルスの複製時またはcDNAシーケンシング時における、ポリメラーゼによる誤組込みの優先的な方式を表しうることを指し示す。in vitroにおける転写およびトランスフェクションを介してMVBを生成するのに使用されるプラスミドDNAは、7つのPVSRIPOロット内で観察される塩基変動パターンの第3の源でありうる。
Claims (23)
- ウイルス由来の治療剤を、ウイルス配列改変体についてアッセイする方法であって、
核酸分子を、マスターウイルスバンクまたはワーキングセルバンクから抽出するステップであって、前記マスターウイルスバンクまたは前記ワーキングセルバンクが、前記ウイルス由来の治療剤を含有する宿主細胞を含む、ステップと;
前記抽出された核酸分子を、宿主細胞ゲノムDNAおよび宿主細胞ミトコンドリアDNAは実質的に消化するが、ウイルス核酸分子は実質的に消化しない条件下で、DNアーゼと接触させ、これにより、濃縮されたウイルス核酸分子を生成するステップと;
前記濃縮されたウイルス核酸分子がRNAである場合、二本鎖cDNAを、濃縮されたウイルス核酸分子から作製し、これにより、ウイルス二本鎖DNAを生成するステップと;
前記ウイルス二本鎖DNAを増幅するステップと;
前記ウイルス二本鎖DNAを定量化するステップと;
シーケンシングライブラリーを、少なくとも500pgの前記ウイルス二本鎖DNAから作製するステップであって、前記シーケンシングライブラリーが、前記ウイルス二本鎖DNAへと接合させた5’アダプターおよび3’アダプターを含む、ステップと;
複数の配列リードを含む、生の配列データセットを作製するように、次世代シーケンシングを使用して、前記シーケンシングライブラリーをシーケンシングするステップと;
前記複数の配列リードを、前記ウイルス由来の治療剤の基準配列とアラインメントして、複数のアラインメントされた配列リードを含有する、アラインメントされた配列を作製するステップと;
前記ウイルス配列改変体を、前記アラインメントされた配列から決定するステップと
を含む、方法。 - 前記ウイルス由来の治療剤を、哺乳動物の宿主細胞へと導入するステップと;
前記ウイルス由来の治療剤の繁殖を可能とする条件下で、前記哺乳動物の宿主細胞を増殖させるステップと;
ウイルス核酸分子を、前記哺乳動物の宿主細胞から抽出するステップと;
任意選択で、前記抽出された核酸分子を、哺乳動物の宿主細胞ゲノムDNAおよび哺乳動物の宿主細胞ミトコンドリアDNAは実質的に消化するが、ウイルス核酸分子は実質的に消化しない条件下で、DNアーゼと接触させるステップと;
前記抽出されたウイルス核酸分子がRNAである場合、前記抽出されたウイルス核酸分子を逆転写し、第2のウイルス核酸鎖を生成し、これにより、ウイルス二本鎖DNAを生成するステップと;
前記ウイルス二本鎖cDNAを増幅するステップと;
前記ウイルス二本鎖cDNAを定量化するステップと;
シーケンシングライブラリーを、少なくとも500pgの前記ウイルス二本鎖DNAから作製するステップであって、前記シーケンシングライブラリーが、前記ウイルス二本鎖DNAへと接合させた5’アダプターおよび3’アダプターを含む、ステップと;
複数の配列リードを含む、生の配列データセットを作製するように、次世代シーケンシングを使用して、前記シーケンシングライブラリーをシーケンシングするステップと;
前記複数の配列リードを、前記ウイルス由来の治療剤の基準配列とアラインメントして、複数のアラインメントされた配列リードを含有する、アラインメントされた配列を作製するステップと;
前記ウイルス配列改変体を、前記アラインメントされた配列から決定するステップと
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 少なくとも2つの異なるウイルス由来の治療剤についてアッセイし、
前記シーケンシングライブラリーを作製するステップが、各ウイルス由来の治療剤について、1または複数のシーケンシングライブラリーを作製し、前記1または複数のシーケンシングライブラリーをプールすることを含み、前記1または複数のシーケンシングライブラリーが、5’アダプターおよび3’アダプターを含み、前記1または複数のシーケンシングライブラリーの各々が、同定のためのバーコードを含み;
前記シーケンシングライブラリーをシーケンシングするステップが、前記プールされたシーケンシングライブラリーをシーケンシングすることを含み;
前記方法が、各シーケンシングライブラリーについて、デマルチプレックス化された生の配列データセットを作製するように、前記バーコードを使用して、プールされた生の配列データセットをデマルチプレックス化するステップをさらに含み;
前記複数の配列リードをアラインメントするステップが、前記デマルチプレックス化された生の配列データセットの各々を、前記ウイルス由来の治療剤の適切な基準配列とアラインメントすることを含む、請求項1または2に記載の方法。 - ポリオウイルス由来の治療剤を、ポリオウイルス配列改変体についてアッセイする方法であって、
RNAを、マスターウイルスバンクまたはワーキングセルバンクから抽出するステップであって、前記マスターウイルスバンクまたは前記ワーキングセルバンクが、前記ポリオウイルス由来の治療剤を含有する宿主細胞を含む、ステップと;
前記抽出されたRNAを、宿主細胞ゲノムDNAおよび宿主細胞ミトコンドリアDNAは実質的に消化するが、ウイルスRNA分子は実質的に消化しない条件下、2U/μlで4UのDNアーゼと、37℃で20〜40分間にわたり接触させ、これにより、濃縮されたウイルスRNAを生成するステップと;
二本鎖cDNAを、前記濃縮されたウイルスRNAから作製し、これにより、ウイルス二本鎖cDNAを生成するステップと;
前記ウイルス二本鎖cDNAを増幅するステップと;
前記ウイルス二本鎖cDNAを定量化するステップと;
前記二本鎖cDNAをランダムに断片化して、cDNA断片を作製し、5’アダプターおよび3’アダプターを、前記cDNA断片へとライゲーションして、アダプターをライゲーションされたcDNA断片を作製し、前記アダプターをライゲーションされたcDNA断片を増幅して、シーケンシングライブラリーを作製することにより、前記シーケンシングライブラリーを、500pg〜1ngの前記ウイルス二本鎖cDNAから作製するステップと;
クローン増幅されたシーケンシングライブラリーを作製するように、前記5’アダプターおよび前記3’アダプターと相補的な表面結合オリゴヌクレオチドを使用して、前記シーケンシングライブラリーをクローン増幅するステップと;
複数の配列リードを含む、生の配列データセットを作製するように、パラレルシングルエンドまたはペアドエンドシーケンシングを使用して、前記クローン増幅されたシーケンシングライブラリーをシーケンシングするステップと;
前記複数の配列リードを、前記ポリオウイルス由来の治療剤の基準ポリオ配列とアラインメントして、複数のアラインメントされた配列リードを含有する、アラインメントされた配列を作製するステップと;
ポリオウイルス配列改変体を、前記アラインメントされた配列から決定するステップと
を含む、方法。 - 前記ポリオウイルス由来の治療剤を、Vero宿主細胞へと導入するステップと;
前記ポリオウイルス由来の治療剤の繁殖を可能とする条件下で、前記Vero宿主細胞を増殖させるステップと;
ポリオRNA分子を、前記Vero宿主細胞から抽出するステップと;
任意選択で、前記抽出されたポリオRNAを、Vero宿主細胞ゲノムDNAおよびVero宿主細胞ミトコンドリアDNAは実質的に消化するが、ポリオRNAは実質的に消化しない条件下で、DNアーゼと接触させるステップと;
抽出されたウイルス性ポリオRNAを逆転写し、これにより、ポリオ二本鎖DNAを生成するステップと;
前記ポリオ二本鎖cDNAを増幅するステップと;
前記ポリオ二本鎖cDNAを定量化するステップと;
前記ポリオ二本鎖cDNAをランダムに断片化して、ポリオcDNA断片を作製し、5’アダプターおよび3’アダプターを、前記ポリオcDNA断片へとライゲーションして、アダプターをライゲーションされたポリオcDNA断片を作製し、前記アダプターをライゲーションされたポリオcDNA断片を増幅して、シーケンシングライブラリーを作製することにより、前記シーケンシングライブラリーを、500pg〜1ngの前記ポリオ二本鎖cDNAから作製するステップと;
クローン増幅されたシーケンシングライブラリーを作製するように、前記5’アダプターおよび前記3’アダプターと相補的な表面結合オリゴヌクレオチドを使用して、前記シーケンシングライブラリーをクローン増幅するステップと;
複数の配列リードを含む、生の配列データセットを作製するように、パラレルシングルエンドまたはペアドエンドシーケンシングを使用して、前記クローン増幅されたシーケンシングライブラリーをシーケンシングするステップと;
前記複数の配列リードを、前記ポリオウイルス由来の治療剤の基準ポリオ配列とアラインメントして、複数のアラインメントされた配列リードを含有する、アラインメントされた配列を作製するステップと;
ポリオウイルス配列改変体を、前記アラインメントされた配列から決定するステップと
をさらに含む、請求項4に記載の方法。 - 前記アラインメントされた配列リードについて、平均リード長、アラインメントされたリードの百分率、カバレッジ、SNP、またはこれらの組合せを決定するステップをさらに含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- アラインメントされていない配列リードを作製する場合、前記アラインメントされていない配列リードを、同定のために、アラインメントされていない配列リードのプールに加える、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルス由来の治療剤の、前記ウイルス由来の治療剤の前記基準配列とのコンセンサスの相同性、位置1カ所当たり、塩基1つ当たりのカバレッジ、リードに対して0.1%を超える不均一塩基、またはこれらの組合せについて報告するステップをさらに含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記シーケンシングライブラリーを、前記二本鎖DNAから作製するステップが、
前記二本鎖DNAをランダムに断片化して、DNA断片を作製し、5’アダプターおよび3’アダプターを、前記DNA断片へとライゲーションして、アダプターをライゲーションされたDNA断片を作製し、前記アダプターをライゲーションされたDNA断片を増幅して、前記シーケンシングライブラリーを作製することと;
クローン増幅されたシーケンシングライブラリーを作製するように、前記5’アダプターおよび前記3’アダプターと相補的な表面結合オリゴヌクレオチドまたは粒子結合オリゴヌクレオチドを使用して、前記シーケンシングライブラリーをクローン増幅することと
を含み;
複数の配列リードを含む、前記生の配列データセットを作製するように、前記クローン増幅されたシーケンシングライブラリーをシーケンシングする、請求項1から3または6から8のいずれかに記載の方法。 - 前記決定されたウイルス配列改変体が、禁忌でない場合、シーケンシングされたウイルス由来の治療剤を、被験体へと投与するステップ
をさらに含む、請求項1から9のいずれかに記載の方法。 - 前記宿主細胞が、E.coli細胞またはVero細胞である、請求項1から4または6から10のいずれかに記載の方法。
- 前記抽出された核酸分子を、DNアーゼと接触させるステップが、前記抽出された核酸分子を、前記DNアーゼと、37℃で30分間にわたりインキュベートすることを含む、請求項1から11のいずれかに記載の方法。
- 前記シーケンシングライブラリーを、前記5’アダプターおよび前記3’アダプターと相補的なプライマーを使用してクローン増幅する、請求項1から12のいずれかに記載の方法。
- 前記シーケンシングライブラリーを増幅することが、増幅時に、前記アダプターをライゲーションされたcDNA断片へと、バーコードを付加することをさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 前記シーケンシングライブラリーをクローン増幅するステップが、ブリッジ増幅を含み、前記表面が、フローセルの表面を含む、請求項11または14に記載の方法。
- シーケンシングが、パラレルペアドエンドシーケンシングである、請求項1から15のいずれかに記載の方法。
- 報告するステップが、位置1カ所当たり、塩基1つ当たりのカバレッジを含む、請求項8に記載の方法。
- 前記アラインメントされた配列中の各塩基の前記カバレッジが、4回またはこれを超える場合、前記アラインメントされた配列は、前記ウイルス由来の治療剤のスクリーニングに許容可能であると決定するステップをさらに含む、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アラインメントされた配列中の各塩基の前記カバレッジが、4回未満であると決定するステップと、前記アラインメントされた配列の全体にわたり、4回またはこれを超えるカバレッジをもたらすように、サンガーシーケンシングを実施するステップとをさらに含む、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルス由来の治療剤が、RNAウイルスであるかまたはこれに由来する、請求項1から3または6から19のいずれかに記載の方法。
- 前記ウイルス由来の治療剤が、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ムンプスウイルス、インフルエンザウイルス、風疹ウイルス、HIV、もしくはHTLVであるかもしくはこれに由来するか;またはMMRワクチン、MMRVワクチン、A型肝炎ワクチン、C型肝炎ワクチン、インフルエンザワクチン、HIVワクチン、HTLVワクチン、ヒトパピローマウイルス、もしくはポリオワクチンである、請求項1から3または6から19のいずれかに記載の方法。
- 前記ポリオワクチンが、PVS−RIPOである、請求項21に記載の方法。
- 前記ウイルス配列改変体が、内部リボソーム侵入部位(IRES)内の変異を含む、請求項22に記載の方法。
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