HU227668B1

HU227668B1 - Use of strains of the parapox ovis virus against organ fibrosis

Info

Publication number: HU227668B1
Application number: HU0303830A
Authority: HU
Inventors: Claudia Hirth-Dietrich; Tobias Schlapp; Angela Siegling; Andreas Knorr; Olaf Weber; Gudrun Theiss
Original assignee: Aicuris
Priority date: 2000-07-11
Filing date: 2001-07-11
Publication date: 2011-11-28
Also published as: HUP0303830A2; MA25765A1; WO2002004019A3; EP1303302A2; US6632647B2; EP1303302B1; LV12991B; WO2002004019A2; CZ200372A3; US20020076418A1; NO20030081L; EE200300019A; RU2003104522A; SI21171A; HUP0303830A3; GB0302629D0; FI20030038A; JP2004502741A; NO20030081D0; NZ523535A

Description

Parapoxvirus ovis törzsek alkalmazása szervfíforózis ellen

A. jelen találmány inaktivált parapoxvirnsok alkalmazására vonatkozik emberben olyan betegségek megelőzésére és kezelésekre, amelyek a kollagén fokozott lerakodásával párosul nak, amely mind a belső szervekkel, mint pl. máj, mind a bőrrel kapcsolatos és annak járulékos szerkezeteire hat. A találmány különösen vírusos hepatitiszt követő máj fibrozisra és máj cirrözisra, vagy etanol-indukált májbetegségekre, valamint cisztás iibrözisra is vonatkozik.

A jelen találmány különösen Parapoxvlrus ovis izoiáta-mok, mint például Dl?01, )PAbAél~'éöre-sek-r--o-reek--ur;£.....tor-z-s.....

.Gr-es^-'OTf”X:ö-r«-s™-T5”§^ New őealand (N2; izolátumok, pl. N22, ,te_?......Nőiéi.....éP''''Dlv'ől'^:“t;é'I-azá'rmo'rtatöt't'»a'ypamün<H alkalmazására vonatkozik emberben.

j.5 A találmány tárgyát a kiindulási törzseken kívül a származékok képezik, amelyeket passzálással és/vagy bizonyos sejtekhez, például NI 30 történő, adaptálással kapunk meg. A találmány a teljes vírusokon kívül, ezen vírusok részeire vagy

ΑοοίΟίΧΑ fragmenéköhbe.....Is vonatkozik. A részeket ügy értelmezzük, mint genomiális vagy sznbgenomíál is fragmenseket, amelyek alkalmas vektorok, például vaccinia felhasználásával expresszálhatok alkalmas rssnlszerekben, mint pl. fibrobiasst sejttenyészet, A Α,νΟχ-ο-ja .χ fragmena-ek.....alatt azokat a frakciókat értjük, melyeket biokémiai tisztítás, például kromatogr áfás. útján kapunk, vagy azo25 kát a részecskéket, melyeket fizikai eljárásokkal, mint pl. ultrahang segítségével történő széttöréssel nyerünk.

Ismert, hogy a Psrapoxvirus a nem-specifikus immünreakoiót képes stimulálni a gerincesekben. A Baypamunőy amely a kémiailag inaktivált Parapoxvlrus ovis, DI701 törzs készitmé30 nye alkalmazható fertőző betegségek profilaxisára, merüli··· taxisára és kezelésére, továbbá stressz-índukáit betegségek megelőzésére emlősökben.

A DE 3 504 940 A számú szabadalmi leírás (Mayr, Anfcon) a

Sappamon® kedvező hatásait ismerteti olyan á1lapotokban. mint pl. energia-gazdag sugárkezelés, kemoterápia, AIDS, immunszuppresszió, korral összefüggő károsodások és detoxikálő ha.5 tárok által előidézett immunelégtelenség, de a máj fibrözis azonnali csökkenését nem ismerteti. A DE 3 504 940 szabadalma, leírás azt ismerteti, hogy a BaypamnnSk kiogészítőként a tumor kezei és hatékonyságát segíti, és hogy a nem-megfelelő anyai ianmunvédekezés ál tal okozott áj szülöttkor! betegségeket kimutatja.

A tudomány jelen állását véve kiinduló pontként, meglepő módon azt találtuk, hogy inakéivalt parapoxvirusok adagolása csökkentheti vagy megelőzheti a májtibrőzist, Állat modellekben. ezt a hatást találtuk a szén-tetraklorid-indnká.11 máj15 fibrözis esetén, amely alapja a toxikus májkárosodásnak, továbbá a heterológ szérum által indukált májfibrózis esetén, amikor nincs májgyulladás. A gyógykezeiés hatása szintén meglepő: a szén-tetraklorid modellben a máj f ibrőzishoz: kapcsoldvm.<

dó túlzott holiagéntermelés SOi-kaá, mig a szérum modellben b) szinte teljes mértékben gátolt. A hosszantartó kisérietekkel kapott ezen eredmények alapján lehetővé vált, hogy a széntezraklorid beadását követően bemutassuk, hogy a Baypamunfy és a fent ismertetett Parapoxvirus ovis törzsből kapott készítmény a hopatikus csillag-alakú sejtek kollagén-termelő myofíbrobiaszt típussá történő átalakulását gátolja.

A máj,fsörözést es/vagy -círrőzist különböző ártalmas tényezők várhatják ugyan ki, mint pi, vírusos fertőzés és alkohol-függőség, de a különböző patomvchan.lzmusok egy közös utolsó lépést indítanak el, azaz a kollagéntermeiést. Amint a fent ismertetett nem-fertőző modelleken végzett állatkísérletek eredményei mutatják, az ínaktlváit parapoxvirusok beadása meglepően megakadályozza a kollagén lerakodást függetlenül a kiváltó ártalmas tényezőtől.

A parapoxvirusok exért egy új terápiás utat nyitnak meg, átível tatást gyakorolnakas összes fibröxishoz vezető betegségbedkközös lépésre.

Ez a hatás arra engedh^-ki következtetni , hogy amikor 5 parapoxvirus Részi tményeket alkalmazunk., különöséé hatékony terápia érhető el a vírus-indukált májfibrözis esetében, is, mivel ismert, Rogy esek a készítmények további immunstimuláiő hatásokkal rendelkezne k, é, Baypamunb erős antifibrotikus hatása megnyitga a lehelő tőséget a Baypamunb vagy hoz készítmények felhasználására az antifibrotíkus anyagok azonos!tására szolgáló vizsgálati módszere Rben az antifibrotikus hatás kiértékelésére.

foome se

Következésképpen a fenti törzsekből kizbzert inaktívált parapoxvirusok és származékaik, valamint a készítmények minis dent átfogó antifibrotikus hatásspektrumnál rendelkeznek és ezért alkalmasak nem csupán a máj fibrotikns betegségeinek megelőzésére és kezelésére, de ezzel összefüggően más szervek fíbroéíkus betegségeiben is, például tudd, hasnyálmirigy, szív és bőr betegségeiben. Különösen előnyős a parapoxvirus ízoiátumok alkalmazása a májfibrözis és mágcirrézis megelőzésében és kezelésében, & klinikai problémától függően a parapoxvirus alapú terápiás szert szisztémásán, például intramuszkuiárísan, szubkután, íntraperitoneálisan, intravénásán vagy orálisan, inha25 iáisíöval vagy lokálisan adagoljuk. A parapoxvirus vagy tisztított és iiofiüzált tormában van jelen, és közvetlenül a beadást megelőzően egy alkalmas oldószerben oldjuk, vagy pedig más alkalmas készítményben vagy a gyomornedvvei szemben ellenálló orális beadási formában vagy néhány egyéb orális beadási formában van jelen.

Ebben az összefüggésben számos beadás vagy egy kronológiai sorrend szerinti hosszantartó kezelés szükséges, amely a klinikai probléma követelményeinek megfelel.

A jelen találmány D1701_v (a-r-f-d-l·?......Greek......ονό-Ί-Τ-ρχ......6reek mm.f......1.5,5) és New áealsnd (HZ) törzsekből szármáz Látott parapóxviras-.izoiáfunok felhasznál sere vonatkozik olyan gyógyszerek előállításában, amelyek preventív vagy gyógyító hatást .5 fejtenek ki szervfibrőzisra emberben. Előnyös:^ a New bealand (MZ) fesez-sebr-oe-aet MZ2, M-7-~éo-óiW törzspt o 1 y a n g y ög y s z e r e k előállításában, amelyek preventív vagy gyógyító hatást fejtenek ki a szervfibrőzisra emberben^ leálón-ds-en-.....ainmyrls.~...&-..~ital ásee-si Továbbá a fent ismertetett parapoxvirusok módosíthatók pssszálássa! vagy megfelelő sejthez történő adaptálással, és a passz li.ással vagy adaptálással kapott parapoxvirusok falhasználhatók olyan gyógyszerek, előállításában, amelyek preventív vagy gyógyító hatást fejtenek ki a szervf ibrőzisra. easberberg haséi kapósa latban lehetséges barnán sejtek, sünt pl,

W'f-38, HRC-5, szarvasmarha sejtek, rmot pl, BK-Ki3A47/Reg,

NoBK vagy juh sejtek, mint pl. MbOh felhasználása például, a passzáiáshoz vagy adaptáláshoz. Továbbá lehetséges a fent Ιοί· ; x. :.x ,χ-Ολmerhetett parspoxvirusok részeinek vagy f ragmens-a-íne-k a felhasználása olyan gyógyszerek előállításához, amelyek megelőző vagy gyógyító hatást fejtenek ki a szerviiferőzisra emberben, h. részeket úgy értelmezzük, mint genomiális vagy szubgenomláiis fragmenseket, amelyek alkalmas vektorok, mint például vaccinía varasok felhasználásával expresszárhatók alkalmas rendszerekben, mint pl. fibroblaszt sejftenyészetben. A frag25 mensekmt úgy értelmezzük, mint vlrális részecskék expresszált vagy fizikai, el járásokkal, például ultrahangos kezeléssel gOg,··· szétszaki tottv'blokémíai tisztítás, például kromatográfía útján kapott frakcióit, á. ftaiáimá-;y-fovábfcá' á font ismertetett

Parapoxvirus ovis törzsek vagv a fent ismerletett elzárással k .,b <1;

módosítot t parapozvirusok felhasználására 'Vona-bko.z),.k más szerekkel kombinálva olyan gyógyszerek és győgyszerkészitmények előállítására, amelyek preventív vagy gyógyító hatást fejtenek xr a szerv!rferőzzsra emberben, R tvl-álm-án-y—eség -to-vé-bteá-o·;

o ő',, ... .7 ···.

Ο · V ^:;-----,ν, <* «4 «<·4* <· * -« « * 4

Λ 4 > Ψ** *^ν* # %' > ♦ Λ » < ·> .< ^Α* ^Α* < *'

C, η,Κ......7

Saypamun® feIhaszriál^S^;m-'V-e«afe4í^«44§ önmagéban vagy más szerekkel. kombinálva olyan gyógyszerek és gyógyszerkészítmények előállítására, amelyek preventív vagy gyógyító hatást fejtenek ki a szervfibrőzisra emberben, A találmány előnyösen a lent ismertetett Parapoxvirus ovis törzsek vagy a fent ismertetett eljárással módosított Parapoxvirus ovin törzsek felhasználására vonatkozik, más szerekkel kombinálva orális beadásra alkalmas készítményben, például gyomornedv rezlsztens kapszuláiéban.

A találmány továbbá a Bsypamurbá vagy Nz2 készítmények referenciaként történő felhasználására vonatkozik az antlfíbrotikus anyagok azonosítására szolgáló vizsgálati mődsze rekben az antifíbrotikns hatás kiértékelésére.

Ma. .aXáfeXmazefcé.. .Hőmé .£arapexvár-U'S-'üvóe't Ar'2'eet--2ő:éX.>· éú~ ) 15 iius 10-én letétbe helyeztük as bgropeáh Collection of Cell Cniteres, Centre tor Applied Microbiology and Research (Porton ...Dev/ft, Salisfoury dilistire, SP4 OJG, UK} intézetnél, F

A találmány szerinte megoldást a következő példákkal szemléltetjük, a korlátozás szándéka nélkül.

1. példa

A Parspcxvlrns ovis, D 1701 törzs,· Baypamun^ hatása

Módszertan

Baypamun® száraz anyagot, egy kémiailag inaktivált előÁdeir

2o Parapoxvirus ovi a D 1701 törzsből ieel-áit készítményt vízben oldunk injekcióhoz, utasítás szerint (iCIbhO (501 szövetkultúra fertőző dózisj alapú titer kb. 10^: per ml; .

Polygeline oldatot,, amely azonos fehérje tartalmú, mint a Baypamun® oldat, adagolunk a kontroll csoport állatoknak lö piacebo oldatként.

V b\_; g

0,- ö ml oldatot adagolunk l.p. állatonként. A beadást hetente háromszor végezzük, de sohasem az egymást követő napokon .

b,d db * X Λ

A Baypamun@-t két ál latmodellben. teszteljük, amelyekben a fibrózis eredete különböző, pl. a szén-tetrakiorid modellben és a sertés szérum modellben,

A. szén-tetzekioríddal történő krónikus kezelés a kísér5 letíieg indukált májfibrózis és ezt követő oirrőzis standard módszere [Mofean EK, McLeart ASM, Sution PM. Instant cirrhosis, Br. J Bxp. Pafhoi. S-0, 502-506 (19-69)). Általában ágy

Ismert, mint a humán májfibrózis és májcirrózis modellje. Nőstény hprague-Daeiey patkányokat alkalmazunk, Abfoő-i a cél10 bői, hogy biztosítsuk a szén-tetraklorid maximális mikroszömális meiabeJ.izmusát, 1 g izoníazidv.1. ivóvizet adagolunk az állatoknak a kezelés megkezdése előtt egy héttel. Minden ötödik napon szén-tefcrakloeíuot adagolunk orálisan 0,1 ml/100 g testtömeg dózisban iszén-tetraklorid:ásványi

Ϊ5 olaj “1:1) , A. kezelés hetedik hete után az állatom' leéljük és vizsgáljuk, A. Baypamun® kezelést a szén-betrakiorid kezeléssel párhuzamosan végezzük,

A heterológ szérummal, például sertés szérummal történő kezelés a patkányok esetében hasonlóképpen egy olyan módszer,

2e fiimelyet gyakran alkalmaznak az irodalomban májfibrózis és ezt követő oirrőzis indukálásóra. Ez a módszer a többi modellel ellentétben a máj parenohímális sejtek ménimái is károsodását és gyulladását okozza (Bhunchet 7. és kaka K. (1592;: Bole of mesenchymal coll populations ín porolna serűm-indused rak river frbrosis, Bepafology 16-, 1452-1473). Nőstény Sprague

Dawiey patkányokat hetente 2x pl, állatonként 0,5 mi steril sertés szérummal iSigmag kezelnek, és a kontroll állatoknak steril fizroiőgiás nátrzum-kiorid oldatot adunk (hetente kétszer 0,5 ml/állat i.p.), A Baypamunö kezelést a sertés szérum kezeléssel párhuzamosan végezzük, de sohasem, ugyanazon a napon, Bét hétig tartó kezelés után az állatokat leöljük, és a magaf eltávolítjuk a kollagén tartalom mennyiségi meghatározásához .

A méjszovet hlsztoiógiaí vizsgálatához Standard!zált tarántszövet hangárakat (körülbelül 10 x 2 mm) vágunk ki a máj jobboldali elülső lebenyéből. A. lefagyasztott metszeteket 0,1¾ Pierosirius vörös oldattal megfestjük a májfiforőzis ál5 tál előidézett kollagén forradás detektálására.

Utánszínezóként kast Grean~t alkalmazunk az ellentétes amplifHáláshoz. A máj fibrőzis terjedelmét mindegyik metszetben meghatározzuk a mért teljes terület százalékos frakciójaként, melyet a Pia ros írios vörössel festödött terület jelez. A videóm!kroszköpos szinkövetés paramétereit standardizáljak és állandó értéken tartjuk a vizsgálat során. 64, 31 mrö'-as terhietet mérünk egy standardizált rácson 50-szeres végső nagyításban.

A, patkányok szén-tefcrakloriődal történő akut kezelését követően ahhoz, hogy a máj csillag-alakú sejtek (HSC; ito sejtek vagy A-vitamin táróié sejtek) transzformációjának terjedelmét mennyiségileg meghatározzuk, as a-simaisom aktín-pozitiv sejtjeit immun-hisztokémiaiiag detektáljuk. Az a-simaIzom akt.in~poz.it iv területet 200-ssoros végső nagyításban meghatározzuk minden metszetben, minden esetben 15 oentriiobuláris 246 χ 180 gm területen, Ögy tudjuk, hogy a májfibrőzis előidézésének döntő iépése a HSC kollagén-termelő és növekedési faktor-terimelő myofibrobiasztszerü sejtekké történő transzformációja. Ezért a transzformáit HSC a iihro25 genikus aktivitás korai, indikátora a májban.

Sgy Leics Quantimed őOOMC-t(Leica Germany} alkalmazunk a félautomata mórfőmetriához «.

A OH-proiin meghatározásához 50-1.00 mg májszdvetet megszorítunk és kb. 17 őrén át 5H HGi-iel forralunk minden eset20 ben, A sarat vákuum-szárítóban eítávolitjuk, majd a maradékot 5 ml íonmentesitett vízben feloldjuk, és ezt az oldatot szűrjük, 200 ul szűrt oldatot szobahőmérsékleten 25 percig 200 pl etanolial és 200 pl oxidációs oldattal (7% vizes klóramín-Thidrát oldat 1:4 arányban acetát-citrát pufferrel ípH-6,0] hígítva) inkubálunk. Est követően 400 pl Enriich-féle reagenst (12 g 4-dimetii-amino-benzaidehid 20 mi etanoíban e 2, 74 ml koncentrált kánsav 20 ni etanoíban) adunk hozzá.

3dC-on 3 órán át inkubáljuk, majd az abszorpciót S73 m-en Mérjük. A. standard, sorozathoz vizes OH-prolln (Sigma) oldatokat alkalmazunk. A aáj mintákban az GH-prolin tartalmat mg/gban számítjuk ki a máj szárított tömegára vonatkoztatva.

A. reaktív oxigén szsbadgyökök képződésének monitorozásá10 hoz a. csökkent α-tokoferoi {o-TOC), egy szabadgyökképzo szer koncentrációját mérjük a májban, mig a szabadgyök-szenzítlv enzim 7~etoxí-rezorufIn-dezetiláz (ERŐD) aktivitását a szérumban mérjük. Mindkét paraméter jellemzően down.~reguláit a szén-tetraklorid mérgezéssel összefüggésben és lehetővé telő szí _f hogy a szövet oxidativ károsodásának súlyosságát felbecsüljük .

Az állatok májának állapotát a kővetkező néhány standard szérum paraméter mérésével határozzuk meg: aianin-amlnotranszferár (ALT), alkálikus foszzatáz Í .AP) , aszpartát-amino20 transzferáz (AST) , v-giufcami..l~transzfsrsz 1GGT) , giutamátdehidrogenáz (GLGH) és összes bilirabén ÍTBTLh.

Eredmények

A Saypamuníb-na 1 történő kezelés jelentősen csökkenti a s sén-tetrakiöriddal kezelt patkányok máj áma-kW ébretikus degenerácíóg-Ane^· kiterjedését (1, ábra). Továbbá a HSC transzferábra), A

m.áciő majdnem teljes gátlása figyelhető meg proiiferálö nem-parenchimális sejtek száma a Eaypamuirb-nai kezeit állatok májában kifejezetten csökkent (3. ábra). A nem-parenchimális sejtek közé tartoznak a HSC és Kupffersejtek,. amelyek hasonlóképpen részt vesznek a fibrogenezi eben.

A. hepatoceliuiária károsodás szérum indikátorai, mint

Pl. ALT, A.?, AST, GGT, GLDH és Tölt (1. táblázat) a normáli zári őr a. való tendenciát mutatnak.

Ugyanez az ERŐD és σ-tokoferol koncentrációban történő csökkenés a kontroll csoportban és a Bnypamun®-kecelt csoportban bizonyltja, hogy a szén-tetrakloridböl keletkező to5 xikus reaktív oxigén szabadgyökök mindkét csoportban mérgesnek U. és 2- táblázat) . Ezért annak lehetősége, hogy a Baypamur:© _/faní if ibrotikus hatása a detoxifikáló hatásnak köszönhető, kizárható.

á szérum modellben, a Baypamnnö a fibrőzist szinte tel10 je.sen szuppresszálja (4. ábra): A Baypamunb-kezelt patkányokban a májban a hidroxi-proiin és a sirius pirossal megresehető területek virtuálisan azon a szinten vannak, mint az egészséges kontroli állatokban, mig a szérum-kezeit kontroll patkányokban ezek a területek néhánysxorosára megnovekednek,

A Baypamunó csoportban a sertés szérum kezeléssel kiváltott növekedés a kollagén··· torta lomban csupán 10%-a a kontroli csoportban megfigyelhető megfelelő értéknek.

2, példa

Parapoxvlrus óvás. Kbj2 törzs

Módszertan.:

Az N22 vírust tartályok sorozatában replikáijuk. S célból a BK klón 3A sejteket 3-5 napig sejttenyésztő edényekben (37°C) 2 gr 10% FCS-t tartalmazó EMSP tápközegben tenyésztjük, amíg a sejt tenyészet 90-100%-ban egybe nem. olvadt Négy sejttenyésztő edényt alkalmazunk inukulumként mindegyik tartályhoz, és az utóbbiakat 2,5 liter térfogatig tapközeggel (2 gr 10% FCS-t tartalmazó EKEK tápközeg; feltöltjük. 37^öC-on 3-5 napig ínku.báijuk (30-100% egybeolvadt sejttenyészet·, majd a tápközeget 2 gr EKEM-vei helyettesítjük, hozzáadott szérum nélkül és a tenyészetet öZ2 vírussal beoltjuk. (M01, 0,θδΙ~0,Ül) ,

100% CPE elérését követően ; fiö-on kb, 7-2 napig tartó inkubáció) a uirusr összegyüjrjük, Ehhez a vírus szuszpenzíót ♦ ·* steril tápközeq tasakokba egyenlő részekre osztjuk (aiikvotokét késeitünk; és SO^C-on lefagyasztjuk. Ezt követően a szuszpenzíót 37^cC--on egy inkubációs szobában felolvasztjuk, és a sejteket süllyesztett-ágyas szűréssel (pórus-átmérő 5 pm) szabaddá tesszük. Ezt kővetően _a vírus szuszpenzidt ul.traszüréssel. (100 kb küszöbérték) 20-40 szorosára betöményítjük. A vírust másképpen ultracentrifügálással (Ti45, 30000 rpm, ^fC_; 00 perc) is betömónyithetjűk.

A. betöményítés után kapott szuszpenziő vírus-literét úgy 10 határozzuk meg, hogy BK klón 3Ά sejteken títraljnk. FCS nélküli EMEE tápközeg felhasználásával a virus-tltért 0,0-ra beállítjuk', majd a vírust öfdC-on 2 érán át hővel ínaktiváljuk. Az inaktiválást EK klón 3A, sejteken kivitelezett inaktiválásé kontrollal ellenőrizzük,, ...

,···’ Y

A Parapoxviros ovís H3h2 törzset abban, a modellben, vizs0.·· géljük, amelyet az 1. példában a sertés szérum-indukált májfibrozisban patkányokban már alkalmaztunk: nőstény Eprsgue Dawiey patkányokat hetente zx i.p, 0,5 ml steril sertés szérummal (Sigma) kezelünk állatonként, mig a kontroll állatok20 nak steril fiziológiás nátrium-kiorid oldatot adunk (hetente 2x 0,5 ml/állat i.p.), A NE2 törzset i.p. hetente háromszor l, 5x1 (V, illetve 0, 5x1-0·' TClDsu/állat dózisban adagoljuk (beadási térfogat: 0,5 ml/állat). A kisebb dózisokhoz a kiindulási anyagot sejttenyésztő tápközeggei hígítjuk ÍEMEM-^:EagÍe25 féle minimum esszenciális tápközeg, Sigma) . A. kontroli állatokat sej ttenyésztő tápközeggel kezeljük. Az NE2 törzzsel, történő kezelést a szérum kezeléssel párhuzamosan végezzük, de sosem azonos napon adagoljuk. 7 hetes kezelést követően az állatokat ieöijük, és a májat eltávolítjuk; majd a májiibrá30 zist morfometríkusan és az QH-prolin tartalom alapján mennyiségrieg meghatározzuk. Ennek a módszertanát az 1. példában már ismertettük.

Eredmények :

A koliauén meuhatarozás eredménvei az 5, ábrán Láthatók. P

Meglepően ar ME<2 törzzsel történő kezelés a májfibrózis fejlődését szuppresszálja: az egészséges állatokkal összehason5 látva a. szérum-kezeit kontroll állatok az OH-proiin és a sirius níros-f estödö kol laseatar balomban határozott növekeászt matatnak. Ez a növekedés az Kidé által dozisi függő módon csökken^ Λ hatás nagysága is meglepő; as SziO TCIDso dős.is a k<májban a kell ágéntartálcm növekedését kevesebb, mint 1 öt-dal 10 ősökként! a kontroll értékhez viszonyítva., A his:etológiái készitmények minőségi kiértékelése azt mutatja, hogy a kollagén válaszfallal (septuaö rendelkező állatok aránya Psé-rői (14/15) 33%~ra (5/15? csökkent a í_z5xlO_5o TCitn?? csoportban és öl-ra csökkent a TCXD50 csoportban.

3. példa

PF7O antififorotikas hatása orális beadást követően

A PPV'ö-t (Parapoxvirus ovis) száraz lioíilizátumkénfc tormuláljuk gyomornedv rezlsztens kapszulákban (Slanco, Ind lanapolis, OS A}.

Mégy csoportot, mindegyikben hat kísérleti állattal, az alábbiak szerint kezelünk: Az egyik kontroli csoportnak öl., csoport) gyomornedv rezlsztens kapszulát (PPVO nélkül; adagolunk orálisan, továbbá steril nátrinm-kloríd oldatot Injektálunk i.p. A 2. csoportnak gyomornedv rezlsztens kapszulát (PPVO nélkül) adagolunk 0,5 mi szén-tetrakloriődai együtt orálisan állatonként, továbbá steril nátrium.-klorid oldatot injektálunk i.p. A 3. csoportba tartozó állatoknak szintén gyomornedv rezlsztens kapszulát ÍPPVO nélküli adagolunk 0,5 mi szén-tetrakloriddal együtt orálisan. Továbbá a 3, oso30 portba tartozó állatoknak 0,5 ml vizben PPVO Pi?öi-t (5xL0^sTClivc/állat dózis) injektálunk i.p, A 4, csoportnak PPVO DlvOI-t (áxlCö TCIP;.:,/ai lat dózis, gyomornedv rezlsztens kapszulára formuláivá) és 0,5 ml szén-tetrafcloridot adagolunk •Sí orálisan, A 4. csoportba tartozó á 11 a tokos k 0,7· ml steril nátrium-klorid oldatot is adagolunk., amelyet i.p. injektálunk be.

óra elteltével a májat eltávolítjuk és az «-simaizom aktin (α-SMA)-poritiv centrilobuiáris területet hisztokémiaiiag minden egyes állatban meghatározzuk, a jellegzetes szóvetmetszetekben avárt teljes terület százalékos értékeként i Johnson. S. Hines u, S,, Búrt A. ö. : Phenotypic modulation of perisinusoídal cells foilowing acute liver 10 injary: a guantitative anaiysis, lat, J Exp, Path, 1992; 73: 765--772: , Ez az érték a máj csillag-alakú sejtek transzformációjának mérője.

bét kísérlet-sorozatot végzünk a fenti leírás szerint, Az első kísér le t~ sorozat kísérleti eredményeit a. 3·. táblásat15 bán, míg a 2. kísérlet-sorozat eredményeit a 4. táblázatban un tatjuk be.

Az 1. kísérlet-sorozatban az (a-SMA)-poritív centrilobuiáris terület aránya a PPVO D1701-val i.p. kezelt állatok máj szövetében {3. csoport) megmagyarázhatatlanul (és a kisér20 let! gyakorlattal ellentétben) magasabb volt, mint azokban az állatokban, amelyek nem kaptak PPVO-f. Ez okból egy 2, kísérlet-sorozatot is végzünk az 1. kísérlet megismétlése céljából ,

Mindkét kísérlet.....sorozatban, egybehangzóan és meglepő móló óon a transzformáció kb. 50%-os gátlása figyelhető meg a kontroll csoporthoz (mindegyik esetben, a 2, csoport) viszonyítva a PPVO Dl'701 orális beadását követően (mindegyik esetben a 4. csoport) , A 2. kísér let-sorozatban a transzformáció gátlása a PPVO D1701 orális beadását követően (4. csoport) hasonló nagyságú, mint a PPVO D17JÍ peritoneáils beadásakor me g f1g ye11 13, c s opo r ü,

Ezekből az eredményekből levonható az a következtetés, hogy a PPVO az orális beadást követően Is kifejti antifibroν<

tikus hatását 1. táblásat

BaypaHmn® hatása a má j állapotának ssérum-paraméterei re és az intoxikáció ϊ ndikátoraira

	ALT E/1	MST E/1	AP E/1	GGT 2/1	..................... GLDH E/1	TBTL E/1	E.E9D TilföO 1 g x perc
Kontroll	49,1	45, 7	162, 6	7, 3:	12, 5	1,6	0, 30
SEM	3,7	8,7	14/76	0,2	7, 9	0, 2	0, 02
Szén-tét t aki ovid	95, 6	92, 4	392, 7	6, 1	37,1	2, 9	0, 15
SEM	14,7	14, 1	43,0	1,3	14,8	0,3	0, 01
Ct 4 Baypamin.®	7 2, 0	6 5, 9 ;	329, 5	9,5 i	18, £	1/9	0,17
SEM	9, 9	9, 1	2 6,9	0, 8 :	4,0	0,2	0, 03

AL?: alanín-aminotranszferáz AST: aszpartát-anlnotraaszferáz AP: alkálikra foszfatáz GGT: γ-glutard. 1- transzterez

GLDH: glutamát-dehidrogená TB1L: összes oliirafoín.

EP OD; 7 ~ e t ο x i r e Z.O· e u f i n de eset Hsa

2. táblázat

Ba-ypamínC· hatása a. máj a-toko-ferol szintjére

i	a~Tekolerái nmoi/g szövet
Kontroll.	73/1
SEM	2,2
Szén-tetraklorid	35,7
SEM	A· G> z -· í
C,t a BsypaminS	33,5 I
SEM	6,1 \|

Φ 4

3, táblázat

A PPVO hatása, á máj csi.il agalakű sejtjeinek transzformáci-ójára szén-tetraklorid fiferogén dózisának intraperxtoneális vagy orális beadást követően 5 íl. kisérletsorozat)

Fíbrózis	Ö -i- St	Dó n i s	a-SMA (%>
1, csoport Intakt	Üres kapszula. orálisan * víz l-p. injekció	.......	1,2810,04
z. csoport Szen-tétrsklorid	Üres kapszula orálisan + víz i . p. i n j e ke A. 6	........	2,7610,79 _:
3. csoport Szén-tatra klórtd	PPVO vízben, l.p. injekció -elites kapszula orálisan		5,05.12,00
4. csoport S z én -1 et raklór id ...................................................1	PPVO kapszulában orálisan e víz i.p. Injekció		1,46+0,37 :

4, táblázat

A PPVO hatása a máj csíllagalaká sejtjeinek transzformációjára szén-tetraklorid fibrogén dózisának intraperitoneális vagy orális beadást követően 5 (2, klsérletsorozstS

Fibrózia	Adagolás	Dózis	io-DMA (%>
l- csoport Intakt	Üres kapszula orálisan + viz i.p, inj okoló		0, 2 010,04
2. csoport Szén-tetraklorid	Üres kapszula orálisan + vis i,p, injekció-		3,1310,56
3 - csoport Szén-tetraklorid	:PFVO vízben, i.p, injekció 4-üres kapszula orálisan	5 x 1O'^; Td1 í.4.·;·;'/ a 1 z a t	I, 22.10, 35
4. csoport Szén-tetraklorid	FFVO kapszulában orálisan f víz i.p, injekció	5 x 10* TCIDWállafc	1, 35í 0,3 4

ΐδ

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Parapoxvíxus D1701 törzs önmagában vagy New Zea.l?xnd (NZ) NZ2 törzs önmagában történő alkalmazása olyan gyógyszerkészítmények előállításában, amelyek preventív vagy gyógyító hatást fejtenek ki szerviibrőzisokra emberben.
2. As 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol olyan Parapoxvirusokat alkalmazunk, amelyeket passzálással vagy alkalmas sejthez történő adaptálással módosítottunk.
3. A 2. Igénypont szerinti alkalmazás, ahol a passzáláshoz vagy adaptáláshoz humán sejteket, előnyösen WI38, MRC-S, szarvasmarha sejteket, előnyösen 3K-K13A47/Reg_:, P1SBK, vagy pedig juh. sejteket, előnyösen MDO-K sejteket alkalma zunk , ahol a Farapoxvírások reszelt ~ célszerűen ajj&aáéiás vektorok, különösen vaocinia vírusok segítségáyél alkalmas rendszerekben, különösen f ibr obi asz jt tenyészetben expresszált genomiális vagy szgbkyíhomiáiis f ragmenseiket -, vagy pedig fragmenttímaijpa-f''- célszerűen az expresszált vagy fizikailag fel tá^fe-^vírusx-és zeeskék biokémiai tisztítással, célszerűen

Λ A b

Λ/ΑΖ 1··/. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszerkészítmények orális beadásra alkalmasak.,

3 /. harapom ovis D 1701 törzs önmagában vagy bűz törzs önmagában történő alkalmazása referencia standardként antifibrotlkus anyagok azonosítására szolgáló vizsgálati módszerekben az antififorotikus hatás kiértékelésére.