DE10122233A1 - Verwendung von Stämmen des Parapoxvirus ovis gegen Organfibrosen - Google Patents
Verwendung von Stämmen des Parapoxvirus ovis gegen OrganfibrosenInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft die Humanverwendung von inaktivierten Parapoxviren bei der Prophylaxe und Behandlung von Erkrankungen, die mit erhöhter Kollagenablagerung einhergehen, wobei sowohl innere Organe, wie z. B. die Leber, als auch die Haut und ihre Anhangsgebilde betroffen sein können. Insbesondere sind betroffen Leberfibrose bzw. Leberzirrhose im Gefolge von Virushepatitis oder Ethanol-induzierten Lebererkrankungen sowie Zystische Fibrose.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft die Humanverwendung von inaktivierten Parapox
viren bei der Prophylaxe und Behandlung von Erkrankungen, die mit erhöhter
Kollagenablagerung einhergehen, wobei sowohl innere Organe, wie z. B. die Leber,
als auch die Haut und ihre Anhangsgebilde betroffen sein können. Insbesondere sind
betroffen Leberfibrose bzw. Leberzirrhose im Gefolge von Virushepatitis oder
Ethanol-induzierten Lebererkrankungen sowie Zystische Fibrose.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Humanverwendung von Isolaten
von Parapoxvirus ovis, beispielsweise der Stämme D1701, orf-11, Greek orf strain
176, Greek orf strain 155, New Zealand (NZ) Isolaten, z. B. NZ2, NZ7 und NZ10,
einschließlich des von D1701 abgeleiteten Baypamun®.
Betroffen sind neben den Ausgangsstämmen auch die durch Passagierung und/oder
Adaptation an bestimmte Zellen, beispielsweise WI 38, erhaltenen Abkömmlinge.
Betroffen sind neben den kompletten Viren auch Teile oder Bruchstücke dieser
Viren. Unter Teilen sind mittels geeigneter Vektoren beispielsweise Vaccinia in
geeigneten Systemen wie Fibroblastenzellkulturen exprimierte genomische oder
subgenomische Fragmente zu verstehen. Unter Bruchstücken versteht man die durch
biochemische Aufreinigung wie Chromatografie erhaltenen Fraktionen oder die nach
Anwendung physikalischer Methoden wie Aufschluss mit Ultraschall erhaltenen
Partikel.
Es ist bekannt, daß Parapoxvirus die nonspezifische Immunreaktion von Vertebraten
stimulieren kann. Baypamun®, eine Präparation von chemisch inaktiviertem
Parapoxvirus ovis, Strain D1701 wird für die Prophylaxe, Metaphylaxe und Thera
pie von Infektionserkrankungen sowie zur Prävention von stressinduzierten Erkran
kungen bei Tieren eingesetzt.
Das Patent DE 35 04 940 A (Mayr, Anton) lehrt die günstige Wirkung von
Baypamun® bei Zuständen wie der Immuninsuffizienz durch energiereiche Be
strahlung, Chemotherapie, AIDS, Immunsuppression, altersbedingten Schäden sowie
detoxifizierende Effekte, nicht aber die unmittelbare Reduktion einer Leberfibrose.
Weiterhin lehrt DE 35 04 940, dass Baypamun® als Adjunkt die Wirksamkeit einer
Tumortherapie unterstützt, und dass es Neugeborene vor durch unzureichende mater
nale Immunabwehr hervorgerufenen Erkrankungen schützt.
Ausgehend vom vorliegenden Stand der Wissenschaft wurde jetzt überraschen
derweise gefunden, daß die Gabe inaktivierter Parapoxviren die Leberfibrose ver
ringern bzw. verhindern kann. Diese Wirkung wurde in Tiermodellen bei der
Tetrachlorkohlenstoff-induzierten Leberfibrose gefunden, die auf einer toxischen
Leberschädigung beruht, und bei der durch artfremdes Serum induzierten
Leberfibrose, bei der es nicht zu einer Leberentzündung kommt. Überraschend ist
außerdem das Ausmaß des therapeutischen Effekts: Die in der Leberfibrose
überschießende Kollagen-Produktion wird im Tetrachlorkohlenstoff-Modell zu 60%,
im Serum-Modell fast vollständig gehemmt. In Übereinstimmung mit diesen Ergeb
nissen aus Langzeitexperimenten konnte nach akuter Gabe von Tetrachlorkohlenstoff
jetzt gezeigt werden, daß Baypamun® und die aus den oben genannten Stämmen von
Parapoxvirus ovis erhaltenen Zubereitungen die Transformation der hepatischen
Sternzellen zum kollagenproduzierenden Myofibroblasten-Typ hemmen.
Leberfibrose bzw. Leberzirrhose kann durch unterschiedliche Noxen wie bei
spielsweise virale Infektionen und Alkoholabusus ausgelöst werden, doch münden
die unterschiedlichen Pathomechanismen in eine gemeinsame Endstrecke, die
Kollagen-Produktion, ein. Wie die tierexperimentellen Ergebnisse aus den oben ge
schilderten nicht-infektiösen Modellen zeigen, verhindert die Gabe inaktivierter
Parapox-Viren überraschenderweise die Kollagenablagerung unabhängig von der
auslösenden Noxe.
Parapox-Viren eröffnen damit ein neuartiges Therapieprinzip zur Einwirkung auf die
allen zur Fibrose führenden Erkrankungen gemeinsame Endstrecke.
Dieser Effekt lässt eine besonders effektive Therapie auch der viral induzierten
Leberfibrose mit Zubereitungen von Parapoxviren erwarten, da für solche Zube
reitungen zusätzliche immunstimulatorische Wirkungen bekannt sind.
Die jetzt aufgefundene starke antifibrotische Wirkung von Baypamun® öffnet die
Möglichkeit, Baypamun® oder Zubereitungen von NZ2 als Referenz Standard für die
Beurteilung der antifibrotischen Effekte in Assays zur Auffindung antifibrotischer
Substanzen einzusetzen.
Inaktivierte Parapox-Viren oder deren Abkömmlinge und Zubereitungen erhalten aus
den oben genannten Stämmen besitzen also ein universelles antifibrotisches
Wirkspektrum und sind daher nicht nur für die Prophylaxe und Therapie fibrotischer
Erkrankungen der Leber, sondern auch bei fibrotischen Erkrankungen anderer
Organe, wie beispielsweise der Lunge, des Pankreas, des Herzens und der Haut
geeignet. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Isolaten von Parapoxviren bei
der Prophylaxe und Behandlung von Leberfibrose und Leberzirrhose.
Je nach klinischer Fragestellung wird das Therapeutikum auf der Basis von
Parapoxvirus systemisch, also beispielsweise intramuskulär, subcutan, intra
peritoneal, intravenös, per os, per inhalationem oder lokal appliziert. Das
Parapoxvirus liegt dabei entweder aufgereinigt und lyophilisiert vor und wird
unmittelbar vor der Applikation in einem geeigneten Lösungsmittel suspendiert oder
es liegt in einer anderen geeigneten Formulierung vor oder es liegt in einer
magensaftresistenten oder einer anderen oralen Applikationsform vor.
Mehrere Applikationen oder Langzeitbehandlung nach Zeitschemen, die den Erfor
dernissen der klinischen Fragestellung entsprechen, können dabei notwendig sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Isolaten von Parapoxviren
zur Herstellung von Arzneimitteln mit vorbeugender oder heilender Wirkung auf
Organfibrosen des Menschen. Isolate von Parapoxviren, erhalten aus den Stämmen
D1701, orf-11, Greek orf strain 176, Greek orf strain 155, sowie den New Zealand
(NZ) Stämmen zur Herstellung von Arzneimitteln mit vorbeugender oder heilender
Wirkung auf Organfibrosen des Menschen. Bevorzugt verwendet werden New
Zealand (NZ) Stämme, die Stämme NZ2, NZ7 und NZ10 zur Herstellung von
Arzneimitteln mit vorbeugender oder heilender Wirkung auf Organfibrosen des
Menschen, wobei der Stamm NZ2 besonders bevorzugt ist. Darüber hinaus können
die vorstehend beschriebenen Parapox Viren durch Passagierung oder Adaptation an
geeigneten Zellen modifiziert werden und solche durch Passagierung oder Adaptation
erhaltenen Parapox Viren zur Herstellung von Arzneimitteln mit vorbeugender oder
heilender Wirkung auf Organfibrosen des Menschen verwendet werden, wobei zur
Passagierung oder Adaptation beispielsweise humane Zellen wie WI-38, MRC-5,
bovine Zellen, wie BK-K13A47/Reg oder MDBK und ovine Zellen, wie MDOK
verwendet werden können. Auch Teile oder Bruchstücken der vorstehend genannten
Parapox Viren können zur Herstellung von Arzneimitteln mit vorbeugender oder
heilender Wirkung auf Organfibrosen des Menschen verwendet werden. Unter Teilen
wird verstanden mittels geeigneter Vektoren wie Vacciniaviren in geeigneten
Systemen wie Fibroblastenzellkulturen exprimierte genomische oder subgenomische
Fragmente und unter Bruchstücken die durch biochemische Aufreinigung wie
Chromatografie erhaltenen Fraktionen der exprimierten oder physikalisch, beispiels
weise durch Einwirkung von Ultraschall, aufgeschlossenen viralen Partikel. Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der vorstehend beschriebenen
Stämme von Parapoxvirus ovis oder der daraus wie vorstehend beschrieben erhal
tenen Modifikate in Kombination mit anderen Mitteln zur Herstellung von Arznei
mitteln und pharmazeutischen Zubereitungen mit vorbeugender oder heilender
Wirkung auf Organfibrosen des Menschen sowie die Verwendung von Baypamun®
allein oder in Kombination mit anderen Mitteln zur Herstellung von Arzneimitteln
und pharmazeutischen Zubereitungen mit vorbeugender oder heilender Wirkung auf
Organfibrosen des Menschen. Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist die
Verwendung der vorstehend beschriebenen Stämme von Parapoxvirus ovis oder der
daraus wie vorstehend beschrieben erhaltenen Modifikate in Kombination mit
anderen Mitteln in einer Formulierung für die orale Applikation, z. B. in
magensaftresistenten Kapseln.
Weiter ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung von Baypamun® oder
Zubereitungen von NZ2 als Referenz für die Beurteilung der antifibrotischen Effekte
in Assays zur Auffindung antifibrotischer Substanzen.
Baypamun® Trockensubstanz, eine Präparation gewonnen aus chemisch inakti
viertem Parapoxvirus Ovis, Strain D1701, wurde nach Vorschrift mit Aqua pro
injektione gelöst (Titer bezogen auf die TCID50 (50% tissue culture infective dose)
ca. 107 pro ml).
Als Placebo-Lösung wurde den Tieren der Kontrollgruppen eine Polygeline-Lösung
mit dem gleichen Proteingehalt wie in der Baypamun®-Lösung verabreicht.
Pro Tier und Applikation wurden 0,5 ml Lösung i.p. verabreicht. Die Applikation
wurde drei mal pro Woche, jedoch nie an aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt.
Baypamun®, wurde in zwei Tiermodellen mit unterschiedlicher Genese der Fibrose
getestet, dem Tetrachlorkohlenstoff-Modell und dem Schweineserum-Modell.
Die chronische Behandlung mit Tetrachlorkohlenstoff ist eine Standardmethode zur
experimentellen Auslösung einer Leberfibrose mit anschließender Zirrhose (Molean
EK, Molean AEM, Sutton PM. Instant cirrhosis. Br. J Exp. Pathol. 1969; 50:
502-506). Es ist allgemein als Modell der menschlichen Leberfibrose und -zirrhose
anerkannt. Es wurden weibliche Sprague-Dawley Ratten verwendet. Zur maximalen
Induktion des mikrosomalen Metabolismus von Tetrachlorkohlenstoff erhielten die
Tiere 1 g/l Isoniazid mit dem Trinkwasser bereits eine Woche vor dem Beginn der
Behandlung. Tetrachlorkohlenstoff wurde oral jeden fünften Tag in einer Dosis von
0,1 ml/100 g Körpergewicht (Tetrachlorkohlenstoff: Mineralöl = 1 : 1) gegeben. Die
Tiere wurden nach siebenwöchiger Behandlung getötet und untersucht. Die Behand
lung mit Baypamun® wurde parallel zur Tetrachlorkohlenstoff-Behandlung durch
geführt.
Die Behandlung mit heterologem Serum, z. B. Schweineserum bei Ratten, ist
ebenfalls eine häufig in der Literatur angewendete Methode zur Auslösung einer
Leberfibrose mit anschließender Zirrhose, die im Gegensatz zu anderen Modellen
nur eine minimale Schädigung und Entzündung der Leberzparenchymzellen hervor
ruft (Bhunchet, E. and Wake, K. (1992): Role of mesenchymal cell populations in
porcine serum-induced rat liver fibrosis. Hepatology 16 : 1452-1473). Weibliche
Sprague Dawley Ratten wurden 2× wöchentlich mit 0,5 ml/Tier sterilem Schweine
serum (Sigma) i.p. behandelt, Kontrolltiere mit steriler physiologischer
Kochsalzlösung (2× wöchentlich 0,5 ml/Tier i.p.). Die Behandlung mit Baypamun®
erfolgte parallel zur Schweineserum-Behandlung, jedoch nie am selben Tag. Nach
sieben Wochen Behandlung wurden die Tiere getötet und die Lebern zur Quanti
fizierung des Kollagengehalts entnommen.
Für die histologische Untersuchung des Lebergewebes wurden standardisierte
transverse Gewebezylinder (etwa 10 × 2 mm) aus dem rechten Vorderlappen der
Leber gestanzt. Gefrierschnitte wurden für die Detektion von durch Leberfibrose
hervorgerufenem Narbenkollagen mit 0,1%iger Pikrosiriusrot-Lösung gefärbt.
Fast Green wurde als Gegenfärbung zur Kontrastverstärkung eingesetzt. Das Ausmaß
der Leberfibrose wurde in jedem Schnitt als prozentualer Anteil der Pikrosiriusrot-
gefärbten Fläche an der gesamten Meßfläche bestimmt. Die Parameter der
videomikroskopischen Farbdetektion wurden standardisiert und im gesamten
Experiment konstant gehalten. 64 Felder eines standardisierten Rasters von 31 mm2
wurden bei 50facher Endvergrößerung ausgemessen.
Zur Quantifizierung des Ausmaßes der Transformation von hepatischen Sternzellen
(HSC; auch Itozellen oder Vitamin-A-Speicherzellen) nach akuter Behandlung von
Ratten mit Tetrachlorkohlenstoff wurden die α-Glattmuskelaktin-positiven Zellen
immunhistochemisch detektiert. Die α-Glattmuskelaktin-positive Fläche wurde bei
200facher Endvergrößerung in jedem Schnitt in jeweils 16 zentrilobulären Feldern
von 248 × 180 µm festgestellt. Die Transformation von HSC in kollagen- und
wachstumsfaktorproduzierende myofibroblastartige Zellen ist bekanntlich der
entscheidende Schritt bei der Auslösung der Leberfibrose. Daher sind transformierte
HSC ein Frühindikator fibrogener Aktivität in der Leber.
Für die halbautomatische Morphometrie wurde ein Leica Quantimed 500MC (Leica
Deutschland) eingesetzt.
Zur OH-Prolin-Bestimmung wurden je 50-100 mg Lebergewebe getrocknet und mit
6 N HCl ca. 17 Stunden gekocht. Nach Verdampfen der Säure im Vakuum-
Trockenschrank wurde der Rückstand mit 5 ml Aqua dest. gelöst und filtriert. 200 µl
der filtrierten Lösung wurden mit 200 µl Ethanol und 200 µl Oxidationslösung
(7%ige wässrige Chloramin T Hydrat-Lösung 1 : 4 mit Acetat-Citrat-Puffer pH 6,0
verdünnt) 25 min bei Zimmertemperatur inkubiert. Danach wurden 400 µl Ehrlich's
Reagenz (12 g 4-Dimethylaminobenzaldehyd in 20 ml Ethanol + 2,74 ml
konzentrierte Schwefelsäure in 20 ml Ethanol) zugegeben. Nach 3 Stunden
Inkubation bei 35°C wurde die Absorption bei 573 nm gemessen. Für die Eichreihe
wurden wässrige OH-Prolin (Signa)-Lösungen verwendet. Der OH-Prolin-Gehalt
der Leberproben wurde in mg pro g Leber-Trockengewicht berechnet.
Zur Verfolgung der Entstehung von reaktiven Sauerstoffradikalen wurde die Kon
zentration an reduziertem α-Tocopherol (α-TOC), einem Radikalfänger, in der Leber
und die Aktivität des radikalsensitiven Enzyms 7-Ethoxyresorufin-Deethylase
(EROD) im Serum gemessen. Beide Parameter sind charakteristischerweise bei der
Tetrachlorkohlenstoffvergiftung herunterreguliert und erlauben eine Abschätzung des
Schweregrades der oxidativen Gewebeschädigung.
Der Leberstatus der Tiere wurde durch Messing einiger Standardserumparameter
bestimmt:
Alaninaminotransferase (ALT), alkalische Phosphatase (AP), Aspartatamino transferase (AST), γ-Glutamyltransferase (GGT), Glutamatdehydrogenase (GLDH), Gesamtbilirubin (TBIL).
Alaninaminotransferase (ALT), alkalische Phosphatase (AP), Aspartatamino transferase (AST), γ-Glutamyltransferase (GGT), Glutamatdehydrogenase (GLDH), Gesamtbilirubin (TBIL).
Die Behandlung mit Baypamun® vermindert signifikant das Ausmaß der fibrotischen
Degeneration der Lebern von tetrachlorkohlenstoffbehandelten Ratten (Abb. 1).
Daneben ist eine fast komplette Hemmung der HSC-Transformation zu beobachten
(Abb. 2). Die Anzahl proliferierender Nichtparenchymzellen in den Lebern
Baypamun®-behandelter Tiere ist deutlich verringert (Abb. 3). Nichtparen
chymzellen schließen HSC und die gleichfalls an der Fibrogenese beteiligten Kupfer
zellen ein.
Die Serumindikatoren für eine hepatozelluläre Schädigung wie ALT, AP, AST,
GGT, GLDH und TBIL (Tabelle 1) zeigen eine Tendenz zur Normalisierung.
Die gleiche Verminderung der EROD- und α-Tocopherolkonzentrationen in der
Kontrollgruppe und der mit Baypamun® behandelten Gruppe belegt die Anwesenheit
von toxischen reaktiven Sauerstoffradikalen durch die Tetrachlorkohlenstoffver
giftung in beiden Gruppen (Tabelle 1 und 2). Daher kann ein "antifibrotischer" Ef
fekt von Baypamun® durch eine detoxifizierende Wirkung ausgeschlossen werden.
Im Serum-Modell zeigt Baypamun® eine nahezu vollständige Unterdrückung der
Fibrose (Abb. 4): Sowohl der Hydroxyprolin-Gehalt als auch die mit Siriusrot anfärb
bare Fläche der Lebern liegt bei den mit Baypamun® behandelten Ratten fast auf
dem Niveau der gesunden Kontrolltiere, während sie bei den Serum-behandelten
Kontrollratten um ein Mehrfaches erhöht ist. Der durch die Schweineserum
behandlung induzierte Anstieg des Kollagengehalts beträgt in der Baypamun-Gruppe
nur 10% des entsprechenden Wertes in der Kontroll-Gruppe.
NZ2-Virus wurde in Wannenstapeln vermehrt. Hierzu wurden BK-Klon3A Zellen in
Zellkulturschalen (37°C) 3 bis 5 Tage in EMEM 2 gr + 10% FCS angezogen bis der
Zellrasen 90 bis 100% konfluent war. Pro Wannenstapel wurden 4 Zellkultur
schalen als Inokulum verwendet und mit Medium (EMEM 2 gr + 10% FCS) auf ein
Volumen von 2,5 Liter aufgefüllt. Nach 3 bis 5 Tagen Inkubation bei 37°C (90 bis
100% konfluenter Zellrasen) wurde das Medium gegen EMEM 2 g ohne
Serumzusatz ausgetauscht und die Kultur mit NZ2-Virus (MOI 0,001 bis 0,01)
infiziert.
Nach Erreichen von 100% CPE (Inkubation 37°C, ca. 7 bis 8 Tage) wurde das Virus
geerntet. Hierzu wurde die Virussuspension in sterile Mediensäcke abgefüllt und bei
-80°C eingefroren. Anschließend wurde die Suspension bei 37°C im Brutraum
aufgetaut und durch eine Tiefenfiltration (Porengröße 5 µm) zellbefreit. Hierauf
wurde die Virussuspension durch Ultrafiltration (100 kDa cutoff) um den Faktor 20
bis 40 aufkonzentriert. Alternativ kann das Virus durch Ultrazentrifugation (Ti45
30.000 rpm, 4°C, 60 Min) aufkonzentriert werden.
Der durch die Aufkonzentrierung erreichte Titer des in der Suspension enthaltenen
Virus wurde durch Titration auf BK-Klon3A Zellen bestimmt. Nachdem der Virus
titer auf 6,0 mittels EMEM Medium ohne FCS eingestellt wurde, wurde das Virus 2 h
bei 58°C hitzeinaktiviert. Die Inaktivierung wurde durch eine Inaktivierungskontrolle
auf BK-Klon3A Zellen kontrolliert.
Parapoxvirus ovis, Strain NZ2 wurde in dem bereits in Beispiel 1 verwendeten
Modell der Schweineserum-induzierten Leberfibrose bei Ratten untersucht:
Weibliche Sprague Dawley Ratten wurden 2× wöchentlich mit 0,5 ml/Tier sterilem Schweineserum (Sigma) i.p. behandelt, Kontrolltiere mit steriler physiologischer Kochsalzlösung (2× wöchentlich 0,5 ml/Tier i.p.). Strain NZ2 wurde 3× wöchent lich in den Dosierungen 1,5 × 105 bzw. 5,0 × 105 TCID50/Tier i.p. verabreicht (Applikationsvolumen: 0,5 ml/Tier). Für die untere Dosis wurde das Ausgangs material mit Zellkulturmedium (Minimum Essential Medium Eagle, Sigma) verdünnt. Kontrolltiere wurden mit Zellkulturmedium behandelt. Die Behandlung mit Strain NZ2 erfolgte parallel zur Serum-Behandlung, jedoch nie am selben Tag. Nach 7 Wochen Behandlung wurden die Tiere getötet, die Lebern entnommen und die Leberfibrose sowohl morphometrisch als auch über den OH-Prolin-Gehalt quanti fiziert. Die Methodik hierzu ist bereits in Beispiel 1 beschrieben.
Weibliche Sprague Dawley Ratten wurden 2× wöchentlich mit 0,5 ml/Tier sterilem Schweineserum (Sigma) i.p. behandelt, Kontrolltiere mit steriler physiologischer Kochsalzlösung (2× wöchentlich 0,5 ml/Tier i.p.). Strain NZ2 wurde 3× wöchent lich in den Dosierungen 1,5 × 105 bzw. 5,0 × 105 TCID50/Tier i.p. verabreicht (Applikationsvolumen: 0,5 ml/Tier). Für die untere Dosis wurde das Ausgangs material mit Zellkulturmedium (Minimum Essential Medium Eagle, Sigma) verdünnt. Kontrolltiere wurden mit Zellkulturmedium behandelt. Die Behandlung mit Strain NZ2 erfolgte parallel zur Serum-Behandlung, jedoch nie am selben Tag. Nach 7 Wochen Behandlung wurden die Tiere getötet, die Lebern entnommen und die Leberfibrose sowohl morphometrisch als auch über den OH-Prolin-Gehalt quanti fiziert. Die Methodik hierzu ist bereits in Beispiel 1 beschrieben.
Die Ergebnisse der Kollagenbestimmungen sind in Abb. 5 dargestellt. Über
raschenderweise kann die Behandlung mit Strain NZ2 das Entstehen der
Leberfibrose unterdrücken: Die Serum-behandelten Kontroll-Tiere zeigen im Ver
gleich zu gesunden Tieren eine deutliche Erhöhung des OH-Prolin-Gehalts und des
Siriusrot-färbbaren Kollagens. Dieser Anstieg wird durch NZ2 dosisabhängig redu
ziert. Überraschend ist auch das Ausmaß des Effekts: Die Dosis 5 × 105 TCID50
reduziert den Anstieg des Kollagengehalts in der Leber auf weniger als 10% des
Kontrollwertes. Eine qualitative Bewertung der histologischen Präparate ergab, dass
der Anteil der Tiere mit Kollagen-Septen von 93% (14/15) auf 33% (5/15) in der
1,5 × 105 TCID50-Gruppe und auf 0% in der 5,0 × 105 TCLD50-Gruppe gesenkt wird.
PPVO wurde als trockenes Lyophilisat in magensaftresistenten Kapseln (Elanco,
Indianapolis, USA) formuliert.
Vier Gruppen von je sechs Versuchstieren wurden wie folgt behandelt: Eine Kon
trollgruppe (Gruppe 1) erhielt lediglich eine magensaftresistente Kapsel (ohne
PPVO) oral verabreicht, und zusätzlich sterile Kochsalzlösung (0,5 ml/Tier) i.p. inji
ziert. Bei Gruppe 2 wurde eine magensaftresistente Kapsel (ohne PPVO) zusammen
mit 0,5 ml Tetrachlorkohlenstoff/Tier oral verabreicht und 0,5 ml physiologische
Kochsalzlösung i.p. injiziert. Tiere der Gruppe 3 erhielten wiederum eine
magensaftresistente Kapsel (ohne PPVO) zusammen mit 0,5 ml Tetrachlorkohlen
stoff/Tier oral verabreicht. Die Tiere der Gruppe 3 erhielten außerdem PPVO
D1701 (Dosis: 5 × 106 TCID50/Tier) in 0,5 ml Aqua pro injektione i.p. injiziert.
Gruppe 4 erhielt PPVO D1701 (Dosis: 5 × 106 TCID50/Tier, in einer
magensaftresistenten Kapsel formuliert) zusammen mit 0,5 ml Tetrachlorkohlenstoff
oral verabreicht. Tiere der Gruppe 4 erhielten außerdem 0,5 ml sterile
Kochsalzlösung i.p. injiziert.
Nach 48 Stunden wurden die Lebern entnommen und in repräsentativen Gewebe
schnitten die α-Glattmuskelaktin (α-SMA)-positive zentrilobuläre Fläche in % der
gesamten Messfläche immunhistochemisch für jedes Tier bestimmt (Johnson S J,
Hines JE, Burt AD. Phenotypic modulation of perisinusoidal cells following acute
liver injury: a quantitative analysis. Int. J Exp. Path. 1992; 73: 765-772). Dieser Wert
ist ein Maß für die Transformation der Lebersternzellen.
Es wurden 2 Versuchsreihen nach obiger Beschreibung durchgeführt. Die
Versuchsergebnisse der ersten Versuchsreihe sind in Tabelle 3, die Ergebnisse der 2.
Versuchsreihe sind in Tabelle 4 wiedergegeben.
In Versuchsreihe 1 ist der Anteil der α-SMA positiven zentrilobulären Fläche in
Lebergewebe von Tieren, die PPVO D1701 i.p. appliziert bekamen (Gruppe 3)
unerklärlicherweise (und entgegen dey sonstigen experimentellen Erfahrung) höher
als bei Tieren, die kein PPVO verabreicht bekamen. Aus diesem Grunde wurde die
Versuchsreihe 2 als Wiederholungsexperiment durchgeführt.
In beiden Versuchsreihen wurde übereinstimmend und überraschenderweise nach
oraler Gabe von PPVO D1701 (jeweils Gruppe 4) eine ca. 50%ige Hemmung der
Transformation gegenüber der Kontrollgruppe (jeweils Gruppe 2) festgestellt. In der
2. Versuchsreihe ist die Hemmung der Transformation nach oraler Gabe von PPVO
D1701 (Gruppe 4) ähnlich effektiv wie bei peritonealer Verabreichung von PPVO
D1701 (Gruppe 3).
Aus diesen Ergebnissen lässt sich ableiten, dass PPVO seine antifibrotische Wirkung
auch nach oraler Gabe entfaltet.
Claims (10)
1. Verwendung von Isolaten von Parapoxviren zur Herstellung von Arznei
mitteln mit vorbeugender oder heilender Wirkung auf Organfibrosen des
Menschen.
2. Verwendung von Isolate von Parapoxviren, beispielsweise der Stämme D1701,
orf-11, Greek orf strain 176, Greek orf strain 155, sowie der New
Zealand (NZ) Stämme zur Herstellung von Arzneimitteln mit vorbeugender
oder heilender Wirkung auf Organfibrosen des Menschen.
3. Verwendung von Isolaten von Parapoxviren gemäß Anspruch 1-2, wobei als
New Zealand (NZ) Stämme die Stämme NZ2, NZ7 und NZ10 zur Herstellung
von Arzneimitteln mit vorbeugender oder heilender Wirkung auf
Organfibrosen des Menschen verwendet werden.
4. Verwendung von durch Passagierung oder Adaptation an geeignete Zellen
modifizierte Parapox Viren der Ansprüche 1-3 zur Herstellung von Arznei
mitteln mit vorbeugender oder heilender Wirkung auf Organfibrosen des
Menschen.
5. Verwendung von durch Passagierung oder Adaptation an geeignete Zellen
modifizierte Parapox Viren der Ansprüche 1-3 zur Herstellung von Arznei
mitteln mit vorbeugender oder heilender Wirkung auf Organfibrosen des
Menschen, wobei zur Passagierung oder Adaptation humane Zellen wie WI-
38, MRC-5, bovine Zellen, wie BK-K13A47/Reg oder MDBK und ovine
Zellen, wie MDOK verwendet werden.
6. Verwendung von Teilen oder Bruchstücken der Viren gemäss Anspruch 1-5
zur Herstellung von Arzneimitteln mit vorbeugender oder heilender Wirkung
auf Organfibrosen des Menschen, wobei unter Teilen mittels geeigneter
Vektoren wie Vacciniaviren in geeigneten Systemen wie Fibroblasten
zellkulturen exprimierte genomische oder subgenomische Fragmente und
unter Bruchstücken die durch biochemische Aufreinigung wie Chromato
grafie erhaltenen Fraktionen der exprimierten oder physikalisch aufge
schlossenen viralen Partikel zu verstehen sind.
7. Verwendung von einem der Isolate entsprechend Anspruch 1-6 in
Kombination mit anderen Mitteln zur Herstellung von Arzneimitteln und
pharmazeutischen Zubereitungen mit vorbeugender oder heilender Wirkung
auf Organfibrosen des Menschen.
8. Verwendung von Parapox ovis D1701 allein oder in Kombination mit
anderen Mitteln zur Herstellung von Arzneimitteln und pharmazeutischen
Zubereitungen mit vorbeugender oder heilender Wirkung auf Organfibrosen
des Menschen.
9. Verwendung von Parapox ovis D1701 oder Zubereitungen von NZ2 als
Referenz-Standard für die Beurteilung antifibrotischer Effekte in Assays zur
Auffindung antifibrotischer Substanzen.
10. Verwendung von Parapox ovis D1701 entsprechend Anspuch 8, wobei die
pharmazeutischen Zubereitungen und Arzneimittel für die orale Verab
reichung geeignet sind.
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