SI21171A

SI21171A - Uporaba sevov parapoksvirusa ovis proti fibrozi organov

Info

Publication number: SI21171A
Application number: SI200120047A
Authority: SI
Inventors: Claudia Hirth-Dietrich; Tobias Schlapp; Angela Siegling; Andreas Knorr; Olaf Weber; Gudrun Theiss
Original assignee: Bayer Aktiengesellschaft
Priority date: 2000-07-11
Filing date: 2001-07-11
Publication date: 2003-10-31
Also published as: HUP0303830A2; MA25765A1; WO2002004019A3; HU227668B1; EP1303302A2; US6632647B2; EP1303302B1; LV12991B; WO2002004019A2; CZ200372A3; US20020076418A1; NO20030081L; EE200300019A; RU2003104522A; HUP0303830A3; GB0302629D0; FI20030038A; JP2004502741A; NO20030081D0; NZ523535A

Abstract

Predloženi izum se nanaša na humano uporabo inaktiviranih parapoksvirusov pri profilaksi in zdravljenju obolenj, ki so povezana s povečanim odlaganjem kolagena, pri čemer so prizadeti tako notranji organi, kot npr. jetra, kot tudi koža in njene dodatne strukture. Posebno relevantni sta fibroza jeter oz. ciroza jeter po virusnem hepatitisu ali obolenju jeter, induciranem z etanolom, kot tudi cistična fibroza.ŕ

Description

BAYER AKTIENGESELLSCHAFT

Uporaba sevov parapoksvirusa ovis proti fibrozi organov

Predloženi izum se nanaša na humano uporabo inaktiviranih parapoksvirusov pri profilaksi in zdravljenju obolenj, ki so povezana s povečanim odlaganjem kolagena, pri čemer so prizadeti tako notranji organi, kot npr. jetra, kot tudi koža in njene dodatne strukture. Posebno se nanaša na fibrozo jeter oz. cirozo jeter po virusnem hepatitisu ali obolenju jeter, induciranem z etanolom, kot tudi na cistično fibrozo.

Predloženi izum se nanaša zlasti na humano uporabo izolatov parapoksvirusa ovis, npr. sevov D1701, orf-11, grškega orf seva 176, grškega orf seva 155, novozelandskih (NZ) izolatov, npr. NZ2, NZ7 in NZ10, in tudi Baypamuna®, izvedenega iz D1701.

Poleg izhodnih sevov so v smislu predloženega izuma tudi dešcendenti, pridobljeni s pasažo in/ali adaptacijo na določene celice, npr. WI 38. Poleg kompletnih virusov so v smislu predloženega izuma tudi deli ali fragmenti teh virusov. Pod dele razumemo s prikladnimi vektorji, npr. vakcinija, v prikladnih sistemih, kot fibroblastnih celičnih kulturah, eksprimirane genomske ali subgenomske fragmente. Pod fragmente razumemo frakcije, pridobljene z biokemičnim čiščenjem, kot je kromatografija, ali delce, pridobljene po uporabi fizikalnih metod, kot je razbitje z ultrazvokom.

Znano je, da parapoksvirus lahko stimulira nespecifično imunoreakcijo vretenčarjev. Baypamun^@, pripravek kemično inaktiviranega parapoksvirusa ovis, sev D1701, se uporablja za profilakso, metafilakso in terapijo infekcijskih obolenj kot tudi za preprečevanje obolenj, induciranih s stresom, pri živalih.

Patent DE 3 504 940 A (Mayr, Anton) uči o ugodnem učinku Baypamuna® pri stanjih, kot so imunska pomanjkljivost zaradi obsevanj z močno energijo, kemoterapije, AIDS, imunosupresija, poškodbe, povezane s starostjo, kot tudi detoksicimih učinkih, ne uči pa o neposrednem zmanjšanju fibroze jeter. Nadalje uči DE 3 504 940, da Baypamun® kot dodatek podpira učinkovitost tumorske terapije in da ščiti novorojence pred obolenji, izzvanimi zaradi nezadostne materine imunske obrambe.

Izhajajoč iz predloženega stanja znanja smo sedaj presenetljivo ugotovili, da dajanje inaktiviranih parapoks virusov lahko znižuje ali preprečuje fibrozo jeter. Ta učinek smo ugotovili v živalskih modelih pri fibrozi jeter, inducirani z ogljikovim tetrakloridom, ki temelji na toksični poškodbi jeter, in pri fibrozi jeter, inducirani s heterolognim serumom, pri kateri ne pride do vnetja jeter. Razen tega je presenetljiv obseg terapevtskega učinka: prebitno proizvajanje kolagena pri fibrozi jeter je v modelu z ogljikovim tetrakloridom inhibirano za 60 %, v modelu s serumom pa skoraj popolnoma. V skladu s temi rezultati iz dolgotrajnih eksperimentov je sedaj razvidno, da po akutnem dajanju ogljikovega tetraklorida Baypamun® in pripravki, pridobljeni iz zgoraj navedenih sevov parapoksvirusa ovis, zavirajo transformacijo hepatičnih zvezdastih celic v tip miofibroblastov, ki proizvajajo kolagen.

Fibrozo jeter oz. cirozo jeter lahko izzovemo z različnimi škodljivimi dejavniki, kot npr. z virusnimi infekcijami in zlorabo alkohola, vendar pa se ti različni patomehanizmi stekajo na skupni končni poti, proizvajanju kolagena. Kot je razvidno iz rezultatov eksperimentov pri živalih zgoraj opisanih neinfektivnih modelov, preprečuje dajanje inaktiviranih parapoksvirusov presenetljivo odlaganje kolagena, neodvisno od inducirajočih škodljivih dejavnikov.

Parapoksvirusi odpirajo tako nov terapevtski princip učinkovanja na končni poti, ki je skupna za vsa obolenja, ki vodijo k fibrozi.

Ta učinek obeta posebno učinkovito terapijo tudi za virusno inducirano fibrozo jeter s pripravki parapoksvirusov, ker so za take pripravke znani dodatni imunostimulatomi učinki.

Sedaj ugotovljen močan antifibrotični učinek Baypamuna® odpira možnost za uporabo Baypamuna® ali pripravkov NZ2 kot referenčnih standardov za ocenjevanje antifibrotičnih učinkov pri poskusih za iskanje antifibrotičnih snovi.

Inaktivirani parapoksvirusi ali njihovi descendenti in pripravki, pridobljeni iz zgoraj navedenih sevov, imajo torej univerzalni antifibrotični spekter učinkovitosti in zato niso prikladni samo za profilakso in terapijo fibrotičnih obolenj jeter, ampak tudi pri fibrotičnih obolenjih drugih organov, kot npr. pljuč, pankreasa, srca in kože. Posebno prednostna je uporaba izolatov parapoksvirusov pri profilaksi in zdravljenju fibroze jeter in ciroze jeter.

Glede na klinične težave apliciramo terapevtik na osnovi parapoksvirusa sistemsko, npr. intramuskuiarno, subkutano, intraperitonealno, intravenozno, oralno, z inhalacijo ali lokalno. Parapoksvirus je pri tem bodisi očiščen in liofiliziran in ga neposredno pred aplikacijo suspendiramo v prikladnem topilu, ali pa je v drugi prikladni formulaciji ali aplikacijski obliki, odporni proti želodčnemu soku, ali drugi oralni aplikacijski obliki.

Pri tem so lahko potrebne številne aplikacije ali dolgotrajno zdravljenje po časovnih shemah, ki ustrezajo zahtevam kliničnih težav.

Predloženi izum se nanaša na uporabo izolatov parapoksvirusov, pridobljenih iz sevov D 1701, orf-11, grškega orf seva 176, grškega orf seva 155 kot tudi iz novozelandskih (NZ) sevov, za pripravo zdravil s preventivnim ali kurativnim učinkom na fibrozo organov pri človeku. Prednostno uporabimo novozelandske (NZ) seve, seve NZ2, NZ7 in NZ10 za pripravo zdravil s preventivnim ali kurativnim učinkom na fibrozo organov pri človeku, pri čemer je posebno prednosten NZ2. Poleg tega lahko predhodno opisane parapoksviruse modificiramo s pasažo ali adaptacijo na prikladne celice in take s pasažo ali adaptacijo pridobljene parapoksviruse uporabimo za pripravo zdravil s preventivnim ali kurativnim učinkom na fibrozo organov pri človeku, pri čemer lahko za pasažo ali adaptacijo uporabimo npr. humane celice, kot WI-38, MRC-5, goveje celice, kot BK-K13A47/Reg ali MDBK in ovčje celice, kot MDOK. Tudi dele ali fragmente predhodno navedenih parapoksvirusov lahko uporabimo za pripravo zdravil s preventivnim ali kurativnim učinkom na fibrozo organov pri človeku. Pod dele razumemo genomske ali subgenomske fragmente, eksprimirane s prikladnimi vektorji, kot so virusi vakcinije, v prikladnih sistemih, kot so fibroblastne celične kulture, in pod fragmente razumemo z biokemičnim čiščenjem, kot je kromatografija, pridobljene frakcije eksprimiranih ali fizikalno, npr. z učinkom ultrazvoka, razbitih virusnih delcev. Nadaljnji predmet predloženega izuma je uporaba predhodno opisanih sevov parapoksvirusa ovis ali modifikatov, pridobljenih iz le-teh, kot je predhodno opisano, v kombinaciji z drugimi sredstvi za pripravo zdravil in farmacevtskih pripravkov s preventivnim ali kurativnim učinkom na fibrozo organov pri človeku kot tudi na uporabo Baypamuna® samega ali v kombinaciji z drugimi sredstvi za pripravo zdravil in farmacevtskih pripravkov s preventivnim ali kurativnim učinkom na fibrozo organov pri človeku. Prednostni predmet predloženega izuma je uporaba predhodno opisanih sevov parapoksvirusa ovis ali modifikatov, pridobljenih iz le-teh, kot je predhodno opisano, v kombinaciji z drugimi sredstvi v formulaciji za oralno aplikacijo, npr. v kapsulah, odpornih proti želodčnemu soku.

Nadaljnji predmet predloženega izuma je uporaba Baypamuna® ali pripravkov NZ2 kot reference za ocenjevanje antifibrotičnih učinkov pri poskusih za iskanje antifibrotičnih snovi.

Parapoksvirus ovis NZ2, naveden tukaj kot primer, je bil deponiran 10. julija 2001 pri European Collection of Celi Cultures, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, Velika Britanija. Depozitna številka je ECACC-01071006.

Primer 1

Učinek parapoksvirusa ovis, sev D 1701, Bavpamun

Metodologija

Baypamun®, suho snov, pripravek, pridobljen iz kemično inaktiviranega parapoksvirusa ovis, sev D 1701, po predpisih raztopimo z vodo za injekcije (titer glede na TCID50 (50-odstotna tkivnokultuma infektivna doza) pribl. 10⁷ na ml).

Kot raztopino placeba damo živalim v kontrolni skupini raztopino poligelina z enako vsebnostjo proteinov kot v raztopini Baypamuna®.

0,5 ml raztopine damo i. p. na žival in aplikacijo. Aplikacijo izvedemo trikrat na teden, vendar nikoli na zaporedne dni.

Baypamun® preizkusimo v dveh živalskih modelih z različno genezo fibroze, v modelu z ogljikovim tetrakloridom in modelu s prašičjim serumom.

Kronično obdelovanje z ogljikovim tetrakloridom je standardna metoda za eksperimentalno induciranje fibroze jeter s kasnejšo cirozo (McLean EK, McLean AEM, Sutton PM. Instant cirrhosis. Br. J. Exp. Pathol. 1969; 50: 502-506). To je splošno priznano kot model za človeško fibrozo jeter in cirozo jeter. Uporabimo samice podgan Sprague-Dawley. Za maksimalno indukcijo mikrosomalnega metabolizma ogljikovega tetraklorida dobijo živali 1 g/1 izoniazida s pitno vodo že en teden pred začetkom obdelovanja. Ogljikov tetraklorid damo oralno vsak peti dan v dozi 0,1 ml na 100 g telesne mase (ogljikov tetraklorid : mineralno olje =1:1). Živali po sedemtedenskem obdelovanju usmrtimo in raziščemo. Obdelovanje z Baypamunom® izvedemo vzporedno z obdelovanjem z ogljikovim tetrakloridom.

Obdelovanje s heterolognim serumom, npr. prašičjim serumom pri podganah, je prav tako metoda, pogosto navedena v literaturi, za induciranje fibroze jeter s kasnejšo cirozo, ki v nasprotju z drugimi modeli izzove le minimalno poškodbo in vnetje parenhimnih celic jeter (Bhunchet E. in Wake K. (1992): Role of mesenchymal celi populations in porcine serum-induced rat liver fibrosis. Hepatology 16: 1452-1473). Samice podgan Sprague Dawley obdelamo i. p. 2-krat na teden z 0,5 ml sterilnega prašičjega seruma (Sigma) na žival, kontrolne živali pa s sterilno fiziološko raztopino soli (2-krat na teden 0,5 ml na žival i. p.). Obdelovanje z Baypamunom® poteka vzporedno z obdelovanjem s prašičjim serumom, vendar nikoli na isti dan. Po sedmih tednih obdelovanja živali usmrtimo in odvzamemo jetra za kvantitativno določevanje vsebnosti kolagena.

Za histološko raziskavo jetrnega tkiva izsekamo standardizirane transferzalne tkivne valje (pribl. 10 x 2 mm) iz desnega prednjega režnja jeter. Zamrznjene rezine obarvamo z 0,1-odstotno raztopino pikrosirius rdečega za detekcijo brazgotinskega kolagena, induciranega s fibrozo jeter.

Fast Green uporabimo kot nasprotno obarvanje za ojačanje kontrasta. Obseg fibroze jeter določimo v vsaki rezini kot odstotni del površine, obarvane s pikrosirius rdečim na celotni merilni površini. Parametri videomikroskopske barvne detekcije so standardizirani in jih vzdržujemo konstantne pri celotnem poskusu. 64 polj standardiziranega rastra 31 mm izmerimo pri 50-kratni končni povečavi.

Za kvantitativno določitev obsega transformacije hepatičnih zvezdastih celic (HSC; tudi Ito-celice ali celice, ki akumulirajo vitamina A) po akutni obdelavi podgan z ogljikovim tetrakloridom imunohistokemično detektiramo α-gladkomišični laktinpozitivne celice, α-gladkomišični laktin-pozitivno površino potrdimo pri 200-kratnem končnem povečanju v vsaki rezini v vsakokrat 16 centrolobulamih poljih 248 x 180 pm. Transformacija HSC v miofibroblastnim podobne celice, proizvajajoče kolagen in rastni faktor, je znano odločilni korak pri induciranju fibroze jeter. Zato so transformirani HSC zgodnji indikator fibrogene aktivnosti v jetrih.

Za polavtomatsko morfometrijo uporabimo Leica Quantimed 500MC (Leica, Nemčija).

Za določitev OH-prolina posušimo vsakokrat 50-100 mg jetrnega tkiva in ga kuhamo s 6N HCI pribl. 17 ur. Po uparjenju kisline v vakuumskem sušilniku ostanek raztopimo s 5 ml destilirane vode in filtriramo. 200 μΐ filtrirane raztopine inkubiramo z 200 μΐ etanola in 200 μΐ oksidacij ske raztopine (7-odstotna vodna kloramin T hidratna raztopina 1 : 4 razredčena z acetat-citratnim pufrom pH 6,0) 25 minut pri sobni temperaturi. Nato dodamo 400 μΐ Ehrlichovega reagenta (12 g 4-dimetilaminobenzaldehida v 20 ml etanola + 2,74 ml koncentrirane žveplove kisline v 20 ml etanola). Po 3 urah inkubacije pri 35 °C izmerimo absorpcijo pri 573 nm. Kot standardno vrsto uporabimo vodne OH-prolin (Sigma)-raztopine. Vsebnost OHprolina v vzorcih jeter izračunamo v mg na g suhe mase jeter.

Za nadzorovanje tvorbe reaktivnih radikalov kisika izmerimo koncentracijo reduciranega a-tokoferola (α-TOC), sredstva za prestrezanje radikalov v jetrih, in aktivnost encima 7-etoksiresorufin-deetilaze (EROD), občutljivega za radikale, v serumu. Oba parametra sta karakteristično regulirana navzdol pri zastrupitvi z ogljikovim tetrakloridom in dopuščata ocenitev težavnostne stopnje za oksidativno poškodbo tkiva.

Stanje jeter pri živali določimo z merjenjem standardnih serumskih parametrov: alanin-aminotransferaza (ALT), alkalna fosfataza (AP), aspartat-aminotransferaza (AST), γ-glutamil-transferaza (GGT), glutamat-dehidrogenaza (GLDH), celotni bilirubin (TBIL).

Rezultati:

Obdelovanje z Baypamunom® znatno zmanjša obseg fibrotične degeneracije jeter pri podganah, obdelanih z ogljikovim tetrakloridom (Fig. 1).

Na Fig. 1 je prikazan učinek PPVO D1701 (Baypamun®) na fibrozo jeter, inducirano s CC1₄; doza 5 χ 10⁶ TCID₅₀/žival; število živali: n = 6 zdravih kontrol, n = 12 CC1₄kontrol, n = 13 CC1₄ + D1701;*p< 0,02, ** p < 0,01 (Kolmogorow-Smimow-test) proti CC1₄.

Poleg tega lahko opazimo skoraj popolno inhibicijo transformacije HSC (Fig. 2). Število neparenhimnih celic, ki proliferirajo v jetrih pri živalih, obdelanih z Baypamunom®, je znatno znižano (Fig. 3). Neparenhimne celice vključujejo HSC in Kupfferjeve celice, ki so enako udeležene pri fibrogenezi.

Serumski indikatorji za hepatocelulamo poškodbo, kot ALT, AP, AST, GGT, GLDH in TBIL (tabela 1), kažejo nagnjenje k normaliziranju.

Enako zmanjšanje EROD in α-tokoferolnih koncentracij v kontrolni skupini in skupini, obdelani z Baypamunom®, dokazuje navzočnost toksičnih reaktivnih radikalov kisika zaradi zastrupitve z ogljikovim tetrakloridom v obeh skupinah (tabeli 1 in 2). Tako lahko antifibrotični učinek Baypamuna® zaradi detoksikacijskega učinka izključimo.

V serumskem modelu kaže Baypamun® skoraj popolno supresijo fibroze (Fig. 4): tako vsebnost hidroksiprolina kot tudi površine v jetrih, ki se dajo obarvati s sirius rdečim, so pri podganah, obdelanih s Baypamunom®, skoraj na nivoju zdravih kontrolnih živali, medtem ko so pri kontrolnih podganah, obdelanih s serumom, večkrat povečane. Porast vsebnosti kolagena, induciran z obdelovanjem s prašičjim serumom, je v Baypamunski skupini le 10 % ustrezne vrednosti v kontrolni skupini.

Na Fig. 4 je prikazan učinek PPVO D1701 (Baypamun®) na fibrozo jeter, inducirano s prašičjim serumom; doza 5 χ 10⁶ TCID₅₀/žival; število živali: n = 15 na serumsko skupino, n = 5 zdravih kontrol; ** p < 0,01 (Kolmogorow-Smimow-test) proti serumski kontroli.

Primer 2:

Parapoksvirusovis, sev NZ2

Metodologija:

NZ2-virus namnožimo v zalogah v kadeh. Zato kultiviramo BK-klon3A celice v posodah za celične kulture (37 °C) od 3 do 5 dni v EMEM 2 g + 10 % FCS, dokler ni celično rastišče od 90- do 100-odstotno konfluentno. Na zalogo v kadi uporabimo 4 posode celične kulture kot inokulum in napolnimo z medijem (EMEM 2 g + 10 % FCS) na volumen 2,5 1. Po 3 do 5 dneh inkubacije pri 37 °C (od 90- do 100-odstotno konfluentno celično rastišče) zamenjamo medij z 2 g EMEM brez dodatka seruma in kulturo inficiramo z NZ2-virusom (MOI od 0,001 do 0,01).

Ko dosežemo 100 % CPE (inkubacija 37 °C, pribl. 7 do 8 dni) virus požanjemo. Zato polnimo virusno suspenzijo v sterilne medijske vrečke in zamrznemo pri -80 °C. Suspenzijo nato odtajamo pri 37 °C v inkubacijski sobi in ji odstranimo celice z globinsko filtracijo (velikost por 5 μιη). Nato virusno suspenzijo skoncentriramo z ultrafiltracijo (mejna vrednost 100 kDa) za faktor 20 do 40. Alternativno lahko virus skoncentriramo z ultracentrifugiranjem (Ti45 30000 r/min, 4 °C, 60 min).

S skoncentriranjem doseženi titer virusa, vsebovanega v suspenziji, določimo s titracijo na BK-klon3A celicah. Potem ko virusni titer naravnamo na 6,0 z medijem EMEM brez FCS, virus 2 uri toplotno inaktiviramo pri 58 °C. Inaktivacijo kontroliramo z inaktivimo kontrolo na BK-klon3A celicah.

Parapoksvirus ovis sev NZ2 raziščemo v modelu, uporabljenem v Primeru 1, za fibrozo jeter pri podganah, inducirano s prašičjim serumom: samice podgan Sprague Dawley obdelamo i. p. dvakrat na teden z 0,5 ml sterilnega prašičjega seruma (Sigma)

-1010 na žival, kontrolne živali pa s sterilno fiziološko raztopino soli (2-krat na teden 0,5 ml na žival i. p.). Sev NZ2 damo i. p. 3-krat na teden v dozah 1,5 χ 10⁵ oz. 5,0 χ 10⁵TCID₅₀ na žival (aplikacijski volumen: 0,5 ml na žival). Za spodnjo dozo izhodni material razredčimo s medijem celične kulture (minimalni esencialni medij Eagle, Sigma). Kontrolne živali obdelamo z medijem celične kulture. Obdelovanje s sevom NZ2 poteka vzporedno z obdelovanjem s serumom, vendar nikoli na isti dan. Po 7 tednih obdelovanja živali usmrtimo, odvzamemo jetra in kvantitativno določimo fibrozo jeter tako morfometrično kot tudi glede vsebnosti OH-prolina. Metodologija za to je opisana v Primeru 1.

Rezultati:

Rezultati za določitev kolagena so navedeni na Fig. 5.

Na Fig. 5 je prikazan učinek PPVO NZ2 na fibrozo jeter, inducirano s prašičjim serumom; število živali: n = 15 na serumsko skupino, n = 5 zdravih kontrol;

*** p < 0,01 ((Kolmogorow-Smimow-test) proti serumski kontroli.

Presenetljivo lahko obdelovanje s sevom NZ2 suprimira nastajanje fibroze jeter: kontrolne živale, obdelane s serumom, kažejo v primerjavi z zdravimi živalmi znatno povišanje vsebnosti OH-prolina in kolagena, ki se da obarvati s sirius rdečim. Ta porast znižamo z NZ2 na način, odvisen od doze. Presenetljiv je tudi obseg učinka: doza 5 χ 10⁵ TCID₅₀ zniža porast vsebnosti kolagena v jetrih na manj kot 10 % kontrolne vrednosti. Iz kvalitativnega ocenjevanja histoloških preparatov je razvidno, da seje delež živali s kolagenskimi septami znižal od 93 % (14/15) na 33 % (5/15) v

1,5 χ 10⁵ TCID50-skupini in na 0 % v 5,0 χ 10⁵ TCID50-skupini.

Primer 3

Antifibrotični učinek PPVO po oralnem dajanju

PPVO formuliramo kot suhi liofilizat v kapsulah, odpornih proti želodčnemu soku (Elanco, Indianapolis, ZDA).

-1111

Štiri skupine po šest poskusnih živali obdelamo takole: kontrolni skupini (skupina 1) damo oralno le eno kapsulo, odporno proti želodčnemu soku (brez PPVO) in ji dodatno injiciramo i. p. sterilno raztopino kuhinjske soli (0,5 ml na žival). Skupini 2 damo oralno kapsulo, odporno proti želodčnemu soku (brez PPVO) skupaj z 0,5 ml ogljikovega tetraklorida na žival in ji injiciramo i. p. 0,5 ml fiziološke raztopine kuhinjske soli. Živalim v skupini 3 damo spet oralno kapsulo, odporno proti želodčnemu soku (brez PPVO) skupaj z 0,5 ml ogljikovega tetraklorida na žival. Živalim v skupini 3 poleg tega injiciramo i. p. PPVO D1701 (doza: 5 χ 10⁶ TCID5ona žival) v 0,5 ml vode za injekcije. Skupini 4 damo oralno PPVO D1701 (doza: 5 χ 10⁶TCID50 na žival, formulirano v kapsuli, odporni proti želodčnemu soku) skupaj z 0,5 ml ogljikovega tetraklorida. Živalim v skupini 4 poleg tega injiciramo i. p. 0,5 ml sterilne raztopine kuhinjske soli.

Po 48 urah odvzamemo jetra in imunohistokemično določimo v reprezentativnih tkivnih rezinah α-gladkomišični aktin (a-SMA)-pozitivne centrilobulame površine v odstotku celotne merilne površine pri vsaki živali (Johnson S J, Hines JE, Burt AD. Phenotypic modulation of perisinusoidal celiš following acute liver injury: a quantitative analysis. Int. J Exp. Path. 1992; 73; 765-772). Ta vrednost je merilo za transformacijo jetrnih zvezdastih celic.

Izvedemo 2 poskusni vrsti po zgornjem opisu. Rezultati poskusov prve poskusne vrste so navedeni v tabeli 3, rezultati druge poskusne vrste so v tabeli 4.

V poskusni vrsti 1 je delež α-SMA pozitivnih centrilobulamih površin v jetrnem tkivu živali, kateri smo aplicirali i. p. PPVO D1701 (skupina 3), nerazložljivo (in v nasprotju s siceršnjim eksperimentalnim pričakovanjem) višji kot pri živalih, ki jim nismo dali PPVO. Zaradi tega smo izvedli poskusno vrsto 2 kot ponavljalni eksperiment.

-1212

V obeh poskusnih vrstah smo skladno in presenetljivo ugotovili po oralnem dajanju PPVO D1701 (vsakokrat skupina 4) pribl. 50-odstotno inhibiranje transformacije v primerjavi s kontrolno skupino (vsakokrat skupina 2). V drugi poskusni vrsti je inhibiranje transformacije po oralnem dajanju PPVO D1701 (skupina 4) podobno učinkovito kot pri peritonealnem dajanju PPVO D1701 (skupina 3).

Iz teh rezultatov lahko ugotovimo, da razvije PPVO svoj antifibrotični učinek tudi po oralnem dajanju.

Tabela 1

Vpliv Baypamuna® na serumski parameter stanja jeter in indikatorji intoksikacije
	ALT U/l	AST U/l	AP U/l	GGT U/l	GLDH U/l	TBIL pmol/l	EROD nmol g χ min
Kontrola	49,1	45,7	162,8	0,8	12,5	1,6	0,30
SEM	3,7	8,7	14,76	0,2	7,9	0,2	0,02
ogljikov tetraklorid	95,6	92,4	392,7	6,1	37,1	2,9	0,15
SEM	14,7	14,1	43,0	1,3	14,8	0,3	0,01
CC1₄ + Baypamun®	72,0	65,9	329,5	4,5	18,2	1,9	0,17
SEM	9,9	9,1	26,9	0,8	4,0	0,2	0,03

ALT : alanin-aminotransferaza	GLDH :	glutamat-dehidrogenaza
AST : aspartat-aminotransferaza	TBIL :	celotni bilirubin
AP : alkalna fosfataza	EROD :	7-etoksiresorufin-deetilaza
GGT : γ-glutamil-transferaza

-1313

Tabela 2

Vpliv Baypamuna® na jetrni a-tokoferol
	a-tokoferol nmol/g tkiva
kontrola	73,1
SEM	2,2
ogljikov tetraklorid	35,7
SEM	2,3
CCI4 + Baypamun®	38,5
SEM	6,1

-1414

Tabela 3

Vpliv PPVO po intraperitonealnem ali oralnem dajanju na transformacijo jetrnih zvezdastih celic po dajanju fibrogene doze ogljikovega tetraklorida (poskusna vrsta 1)

Fibroza	Aplikacija	Doza	a-SMA (%)
skupina 1 intaktna	prazna kapsula, oralno + voda za injekcije i. p.		0,28 ± 0,04
skupina 2 ogljikov tetraklorid	prazna kapsula, oralno + voda za injekcije i. p.		2,76 ± 0,79
skupina 3 ogljikov tetraklorid	PPVO v vodi za injekcije i. p. + prazna kapsula, oralno	5 x 10⁶TCID_5O/ žival	5,05 ± 2,00
skupina 4 ogljikov tetraklorid	PPVO v kapsuli, oralno + voda za injekcije i. p.	5 χ 10⁶ TCID₅₀/ žival	1,46 ±0,34

-1515

Tabela 4

Vpliv PPVO po intraperitonealnem ali oralnem dajanju na transformacijo jetrnih zvezdastih celic po dajanju fibrogene doze ogljikovega tetraklorida (poskusna vrsta 2)

Fibroza	Aplikacija	Doza	a-SMA (%)
intaktna skupina 1	prazna kapsula, oralno + voda za injekcije i. p.		0,20 ± 0,04
ogljikov tetraklorid skupina 2	prazna kapsula, oralno + voda za injekcije i. p.		3,18 ±0,56
ogljikov tetraklorid skupina 3	PPVO v vodi za injekcije i. p. ± prazna kapsula, oralno	5 x 10⁶TCID₅₀/ žival	1,22 ±0,35
ogljikov tetraklorid skupina 4	PPVO v kapsuli, oralno + voda za injekcije i. p.	5 χ 10⁶TCID₅₀/ žival	1,55 ±0,34

Claims

PATENTNI ZAHTEVKI

1. Uporaba izolatov parapoksvirusov za pripravo zdravil s preventivnim ali kurativnim učinkom na fibrozo organov pri človeku.
2. Uporaba izolatov parapoksvirusov, na primer sevov D1701, orf-11, grškega orf seva 176, grškega orf seva 155 kot tudi novozelandskih (NZ) sevov, za pripravo zdravil s preventivnim ali kurativnim učinkom na fibrozo organov pri človeku.
3. Uporaba izolatov parapoksvirusov po zahtevkih 1-2, označena s tem, da kot novozelandske (NZ) seve uporabimo seve NZ2, NZ7 in NZ10 za pripravo zdravil s preventivnim ali kurativnim učinkom na fibrozo organov pri človeku.
4. Uporaba parapoksvirusov po zahtevkih 1-3, modificiranih s pasažo ali adaptacijo na prikladne celice, za pripravo zdravil s preventivnim ali kurativnim učinkom na fibrozo organov pri človeku.
5. Uporaba parapoksvirusov po zahtevkih 1-3, modificiranih s pasažo ali adaptacijo na prikladne celice, za pripravo zdravil s preventivnim ali kurativnim učinkom na fibrozo organov pri človeku, označena s tem, da za pasažo ali adaptacijo uporabimo humane celice, kot WI-38, MRC-5, goveje celice, kot BK-K13A47/reg ali MDBK, in ovčje celice, kot MDOK.
6. Uporaba delov ali fragmentov virusov po zahtevkih 1-5 za pripravo zdravil s preventivnim ali kurativnim učinkom na fibrozo organov pri človeku, označena s tem, da pod dele razumemo s prikladnimi vektorji, kot so virusi vakcinije, v prikladnih sistemih, kot fibroblastnih celičnih kulturah, eksprimirane genomske ali subgenomske fragmente in pod fragmente razumemo z biokemičnim čiščenjem, kot je kromatografija, pridobljene frakcije eksprimiranih ali fizikalno induciranih virusnih delcev.

-1717
7. Uporaba enega od izolatov po zahtevkih 1-6 v kombinaciji z drugimi sredstvi za pripravo zdravil in farmacevtskih pripravkov s preventivnim ali kurativnim učinkom na fibrozo organov pri človeku.
8. Uporaba parapoks ovis D 1701 samega ali v kombinaciji z drugimi sredstvi za pripravo zdravil in farmacevtskih pripravkov s preventivnim ali kurativnim učinkom na fibrozo organov pri človeku.
9. Uporaba parapoks ovis D 1701 po zahtevku 8, označena s tem, da so farmacevtski pripravki in zdravila prikladni za oralno dajanje.