LV12991B - Use of strains of the parapox ovis virus against organ fibrosis - Google Patents
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Description
-1 - LV 12991
Venvendung von Stammen des Parapoxvirus ovis gegen Organfibrosen
Die vorliegende Erfindung betrifft die Humanvenvendung von inaktivierten Parapox-viren bei der Prophylaxe und Behandlung von Erkrankungen, die mit erhohter Kollagenablagerung einhergehen, wobei sowohl innere Organe, wie z.B. die Leber, als auch die Haut und ihre Anhangsgebilde betroffen sein konnen. Insbesondere sind betroffen Leberfibrose bzw. Leberzirrhose im Gefolge von Virushepatitis oder Ethanol-induzierten Lebererkrankungen sowie Zystische Fibrose.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Humanvenvendung von Isolaten von Parapoxvirus ovis, beispielsweise der Stāmme D1701, orf-11, Greek orf strain 176, Greek orf strain 155, New Zealand (NZ) Isolaten, z.B. NZ2, NZ7 und NZ10, einschlieBlich des von D1701 abgeleiteten Baypamun®.
Betroffen sind neben den Ausgangsstāmmen auch die durch Passagierung und/oder Adaptation an bestimmte Zellen, beispielsweise WI 38, erhaltenen Abkdmmlinge. Betroffen sind neben den kompletten Viren auch Teile oder Bruchstucke dieser Viren. Unter Teilen sind mittels geeigneter Vektoren beispielsweise Vaccinia in geeigneten Systemen wie Fibroblastenzellkulturen exprimierte genomische oder subgenomische Fragmente zu verstehen. Unter Bruchstucken versteht man die durch biochemische Aufreinigung wie Chromatografie erhaltenen Fraktionen oder die nach Anwendung physikalischer Methoden wie Aufschluss mit Ultraschall erhaltenen Partikel.
Es ist bekannt, dafi Parapoxvirus die nonspezifische Immunreaktion von Vertebraten stimulieren kann. Baypamun®, eine Prāparation von chemisch inaktiviertem Parapoxvirus ovis, Strain D1701 wird fur die Prophylaxe, Metaphylaxe und Thera-pie von Infektionserkrankungen sowie zur Prāvention von stressinduzierten Erkrankungen bei Tieren eingesetzt. -2-
Das Patent DE 3 504 940 A (Mayr, Anton) lehrt die gunstige Wirkung von Baypamun® bei Zustanden wie der Immuninsuffizienz durch energiereiche Be-strahlung, Chemotherapie, AIDS, Immunsuppression, altersbedingten Schāden sowie detoxifizierende Effekte, nicht aber die unmittelbare Reduktion einer Leberfibrose. Weiterhin lehrt DE 3 504 940, dass Baypamun® als Adjunkt die Wirksamkeit einer Tumortherapie unterstiitzt, und dass es Neugeborene vor durch unzureichende mater-nale lmmunabwehr hervorgerufenen Erkrankungen schiitzt.
Ausgehend vom vorliegenden Stand der Wissenschaft wurde jetzt ūberraschen-denveise gefunden, daB die Gabe inaktivierter Parapoxviren die Leberfibrose ver-ringem bzw. verhindem kann. Diese Wirkung vvurde in Tiermodellen bei der Tetrachlorkohlenstoff-induzierten Leberfibrose gefunden, die auf einer toxischen Leberschādigung beruht, und bei der durch artfremdes Serum induzierten Leberfibrose, bei der es nicht zu einer Leberentziindung kommt. Ūberraschend ist auBerdem das AusmaB des therapeutischen Effekts: Die in der Leberfibrose ūberschieBende Kollagen-Produktion wird im Tetrachlorkohlenstoff-Modell zu 60 %, im Serum-Modell fast vollstāndig gehemmt. In Ūbereinstimmung mit diesen Ergeb-nissen aus Langzeitexperimenten konnte nach akuter Gabe von Tetrachlorkohlenstoff jetzt gezeigt werden, daB Baypamun® und die aus den oben genannten Stāmmen von Parapoxvirus ovis erhaltenen Zubereitungen die Transformation der hepatischen Stemzellen zum kollagenproduzierenden Myofibroblasten-Typ hemmen.
Leberfibrose bzw. Leberzirrhose kann durch unterschiedliche Noxen wie bei-spielsweise virale Infektionen und Alkoholabusus ausgelost werden, doch miinden die unterschiedlichen Pathomechanismen in eine gemeinsame Endstrecke, die Kollagen-Produktion, ein. Wie die tierexperimentellen Ergebnisse aus den oben ge-schilderten nicht-infektiosen Modellen zeigen, verhindert die Gabe inaktivierter Parapox-Viren uberraschendervveise die Kollagenablagerung unabhāngig von der auslosenden Noxe. -3- LV 12991
Parapox-Viren eroffnen damit ein neuartiges Therapieprinzip zur Einwirkung auf die allen zur Fibrose fuhrenden Erkrankungen gemeinsame Endstrecke.
Dieser EfFekt lāsst eine besonders effektive Therapie auch der virai induzierten 5 Leberfibrose mit Zubereitungen von Parapoxviren envarten, da fiir solche Zube-reitungen zusātzliche immunstimulatorische Wirkungen bekannt sind.
Die jetzt aufgefundene starke antifibrotische Wirkung von Baypaxnun® dffnet die Moglichkeit, Baypanum® oder Zubereitungen von NZ2 als Referenz Standard fur 10 die Beurteilung der antifibrotischen EfFekte in Assays zur Auffindung antifibrotischer Substanzen einzusetzen.
Inaktivierte Parapox-Viren oder deren Abkommlinge und Zubereitungen erhalten aus den oben genannten Stāmmen besitzen also ein universelles antifibrotisches 15 Wirkspektrum und sind daher nicht nur fiir die Prophylaxe und Therapie fibrotischer Erkrankungen der Leber, sondem auch bei fibrotischen Erkrankungen anderer Organe, wie beispielsweise der Lunge, des Pankreas , des Herzens und der Haut geeignet. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Isolaten von Parapoxviren bei der Prophylaxe und Behandlung von Leberfibrose und Leberzirrhose. 20
Je nach klinischer Fragestellung wird das Therapeutikum auf der Basis von Parapoxvirus systemisch, also beispielsweise intramuskulār, subcutan, intra-peritoneal, intravenos, per os, per inhalationem oder lokal appliziert. Das Parapoxvirus liegt dabei entvveder aufgereinigt und lyophilisiert vor und wird 25 unmittelbar vor der Applikation in einem geeigneten Lāsungsmittel suspendiert oder es liegt in einer anderen geeigneten Formulierung vor oder es liegt in einer magensaftresistenten oder einer anderen oralen Applikationsform vor.
Mehrere Applikationen oder Langzeitbehandlung nach Zeitschemen, die den Erfor-30 demissen der klinischen Fragestellung entsprechen, konnen dabei notvvendig sein. -4-
Die vorliegende Erfīndung betrifft die Venvendung von Isolaten von Parapoxviren zur Herstellung von Arzneimitteln mit vorbeugender oder heilender Wirkung auf Organfibrosen des Menschen. Isolate von Parapoxviren, erhalten aus den Stāmmen D1701, orf-11, Greek orf strain 176, Greek orf strain 155, sovvie den New Zealand (NZ) Stāmmen zur Herstellung von Arzneimitteln mit vorbeugender oder heilender Wirkung auf Organfibrosen des Menschen. Bevorzugt vervvendet vverden New Zealand (NZ) Stāmme, die Stāmme NZ2, NZ7 tmd NZ10 zur Herstellung von Arzneimitteln mit vorbeugender oder heilender Wirkung auf Organfibrosen des Menschen, wobei der Stamm NZ2 besonders bevorzugt ist. Dariiber hinaus konnen die vorstehend beschriebenen Parapox Viren durch Passagierung oder Adaptation an geeigneten Zellen modifiziert werden und solche durch Passagierung oder Adaptation erhaltenen Parapox Viren zur Herstellung von Arzneimitteln mit vorbeugender oder heilender Wirkung auf Organfibrosen des Menschen vervvendet vverden, vvobei zur Passagierung oder Adaptation beispielsvveise humane Zellen wie WI-38, MRC-5, bovine Zellen, wie BK-K13A47/Reg oder MDBK und ovine Zellen, wie MDOK vervvendet vverden konnen. Auch Teile oder Bruchstucken der vorstehend genannten Parapox Viren konnen zur Herstellung von Arzneimitteln mit vorbeugender oder heilender Wirkung auf Organfibrosen des Menschen vervvendet vverden. Unter Teilen vvird verstanden mittels geeigneter Vektoren wie Vacciniaviren in geeigneten Systemen vvie Fibroblastenzellkulturen exprimierte genomische oder subgenomische Fragmente und unter Bruchstūcken die durch biochemische Aufreinigung vvie Chromatografie erhaltenen Fraktionen der exprimierten oder physikalisch, beispiels-vveise durch Einvvirkung von Ultraschall, aufgeschlossenen viralen Partikel. Ein vveiterer Gegenstand der Erfindung ist die Vervvendung der vorstehend beschriebenen Stāmme von Parapoxvirus ovis oder der daraus vvie vorstehend beschrieben erhaltenen Modifikate in Kombination mit anderen Mitteln zur Herstellung von Arzneimitteln und pharmazeutischen Zubereitungen mit vorbeugender oder heilender Wirkung auf Organfibrosen des Menschen sovvie die Venvendung von Baypamun® allein oder in Kombination mit anderen Mitteln zur Herstellung von Arzneimitteln -5- LV 12991 und pharmazeutischen Zubereitungen mit vorbeugender oder heilender Wirkung auf Organfibrosen des Menschen. Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist die Venvendung der vorstehend beschriebenen Stāmme von Parapoxvirus ovis oder der daraus wie vorstehend bescbrieben erhaltenen Modifikate in Kombination mit 5 anderen Mitteln in einer Formulierung fiir die orale Applikation, z.B. in magensaftresistenten Kapseln..
Weiter ist Gegenstand der Erfindung die Venvendung von Baypamun® oder Zubereitungen von NZ2 als Referenz fur die Beurteilung der antifibrotischen Effekte 10 in Assays zur Auffindung antifibrotischer Substanzen.
Der hier beispielhaft genannte Parapoxvirus ovis NZ-2 wurde am 10. Juli 2001 bei der European Collection of Celi Cultures, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG,United Kingdom hinterlegt. 15 Die Hintelegungsnummer lautet 01071006. -6-
Beispiel 1
Wirkung von Parapoxvirus ovis, Stamm D 1701, Baypamun®
Methodik
Baypamun® Trockensubstanz, eine Prāparation gevvonnen aus chemisch inakti-viertem Parapoxvirus Ovis, Strain D 1701, wurde nach Vorschrift mit Aqua pro injektione gelost (Titer bezogen auf die TCID50 (50 % tissue culture infective dose) ca. 107 pro ml).
Als Placebo-Losung wurde den Tieren der Kontrollgruppen eine Polygeline-Losung mit dem gleichen Proteingehalt wie in der Baypamun® - Losung verabreicht.
Pro Tier und Applikation wurden 0,5 ml Losung i.p. verabreicht. Die Applikation wurde drei mal pro Woche, jedoch nie an aufeinanderfolgenden Tagen durchgefiīhrt.
Baypamun®, wurde in zwei Tiermodellen mit unterschiedlicher Genese der Fibrose getestet, dem Tetrachlokohlenstoff-Modell und dem Schweineserum-Modell.
Die chronische Behandlung mit Tetrachlorkohlenstoff ist eine Standardmethode zur experimentellen Auslosung einer Leberfibrose mit anschlieBender Zirrhose (McLean EK, McLean AEM, Sutton PM. Instant cirrhosis. Br. J Exp. Pathol. 1969; 50: 502-506). Es ist allgemein als Modeli der menschlichen Leberfibrose und -zirrhose anerkannt. Es wurden weibliche Sprague-Dawley Ratten venvendet. Zur maximalen Induktion des mikrosomalen Metabolismus von Tetrachlorkohlenstoff erhielten die Tiere 1 g/1 Isoniazid mit dem Trinkwasser bereits eine Woche vor dem Beginn der Behandlung. Tetrachlorkohlenstoff wurde oral jeden funften Tag in einer Dosis von 0,1 ml/lOOg Korpergevvicht (Tetrachlorkohlenstoff: Mineralol = 1:1) gegeben. Die Tiere vvurden nach siebenwochiger Behandlung getotet und untersucht. Die Behandlung mit Baypamun® vvurde parallel zur Tetrachlorkohlenstoff-Behandlung durch-gefuhrt. -7- LV 12991
Die Behandlung mit heterologem Serum, z.B. Schweineserum bei Ratten, ist ebenfalls eine hāufig in der Literatur angewendete Methode zur Auslosung einer Leberfibrose mit anschlieBender Zirrhose, die im Gegensatz zu anderen Modellen nur eine minimale Schādigung und Entzundung der Leberzparenchymzellen hervor-ruft (Bhunchet, E. and Wake, K. (1992): Role of mesenchymal celi populations in porcine serum-induced rat liver fibrosis. Hepatology 16: 1452-1473). Weibliche Sprague Dawley Ratten wurden 2 x wochentlich mit 0,.5 ml/Tier sterilem Schweine-serum (Sigma) i.p. behandelt, Kontrolltiere mit steriler physiologischer Kochsalzlosung (2 x vrochentlich 0,5 ml/Tier i.p.).Die Behandlung mit Baypamun® erfolgte parallel zur Schweineserum-Behandlung, jedoch nie am selben Tag. Nach sieben Wochen Behandlung wurden die Tiere getotet und die Lebem zur Quanti-fizierung des Kollagengehalts entnommen.
Fur die histologische Untersuchung des Lebergewebes wurden standardisierte transverse Gewebezylinder (etvva 10 x 2 mm) aus dem rechten Vorderlappen der Leber gestanzt. Gefrierschnitte wurden fiir die Detektion von durch Leberfibrose hervorgerufenemNarbenkollagen mit 0,l%iger Pikrosiriusrot-Losung gefarbt.
Fast Green wurde als Gegenfārbung zur Kontrastverstārkung eingesetzt. Das AusmaB der Leberfibrose vvurde in jedem Schnitt als prozentualer Anteil der Pikrosiriusrot-gefarbten Flāche an der gesamten MeBflache bestimmt. Die Parameter der videomikroskopischen Farbdetektion wurden standardisiert und im gesamten Experiment konstant gehalten. 64 Felder eines standardisierten Rasters von 31 mm2 wurden bei 50-facher EndvergroBerung ausgemessen.
Zur Quantifizierung des AusmaBes der Transformation von hepatischen Stemzellen (HSC; auch Itozellen oder Vitamin-A-Speicherzellen) nach akuter Behandlung von Ratten mit Tetrachlorkohlenstoff vvurden die α-Glattmuskelaktin-positiven Zellen immunhistochemisch detektiert. Die α-Glattmuskelaktin-positive Flāche wurde bei 200-facher EndvergroBerung in jedem Schnitt in jeweils 16 zentrilobulāren Feldem -8- νοη 248 χ 180 μιη festgestellt. Die Transfonnation von HSC in kollagen- und wachstumsfaktorproduzierende myofibroblastartige Zellen ist bekanntlich der entscheidende Schritt bei der Auslosung der Leberfibrose. Daher sind transformierte HSC ein Friihindikator fibrogener Aktivitat in der Leber. 5
Fur die halbautomatische Morphometrie wurde ein Leica Quantimed 500MC (Leica Deutschland) eingesetzt.
Zur OH-Prolin-Bestimmung wurden je 50-100 mg Lebergewebe getrocknet und mit 10 6N HC1 ca. 17 Stunden gekocht. Nach Verdampfen der Saure im Vakuum-Trockenschrank wurde der Ruckstand mit 5 ml Aqua dest. gelost und filtriert. 200 μΐ der filtrierten Losung wurden mit 200 μΐ Ethanol und 200 μΐ Oxidationslosung (7%ige wassrige Chloramin T Hydrat-Losung 1 : 4 mit Acetat-Citrat-Puffer pH 6,0 verdūnnt) 25 min bei Zimmertemperatur inkubiert. Danach wurden 400 μΐ Ehrlich's 15 Reagenz (12 g 4-Dimethylaminobenzaldehyd in 20 ml Ethanol + 2,74 ml konzentrierte Schwefelsāure in 20 ml Ethanol) zugegeben. Nach 3 Stunden Inkubation bei 35°C wurde die Absorption bei 573 nm gemessen. Fur die Eichreihe wurden wāssrige OH-Prolin (Sigma)-Losungen venvendet. Der OH-Prolin-Gehalt der Leberproben wurde in mg pro g Leber-Trockengewicht berechnet. 20
Zur Verfolgung der Entstehung von reaktiven Sauerstoffradikalen wurde die Kon-zentration an reduziertem α-Tocopherol (a-TOC), einem Radikalfānger, in der Leber und die Aktivitat des radikalsensitiven Enzyms 7-Ethoxyresorufin-Deethylase (EROD) im Serum gemessen. Beide Parameter sind charakteristischenveise bei der 25 Tetrachlorkohlenstoffvergiftung herunterreguliert und erlauben eine Abschātzung des
Schweregrades der oxidativen Gewebeschādigung.
Der Leberstatus der Tiere wurde durch Messung einiger Standardserumparameter bestimmt: -9- LV 12991
Alaninaminotransferase (ALT), alkalische Phosphatase (AP), Aspartatamino-transferase (AST), y-Glutamyltransferase (GGT), Glutamatdehydrogenase (GLDH), Gesamtbilirubin (TBIL).
Ergebnisse: 5
Die Behandlung mit Baypamun® vermindert signifikant das Ausmafi der fibrotischen Degeneration der Lebem von tetrachlorkohlenstoffbehandelten Ratten (Abb. 1). Daneben ist eine fast komplette Hemmung der HSC-Transformation zu beobachten (Abb. 2). Die Anzahl proliferierender Nichtparenchymzellen in den Lebem 10 Baypamun®-behandelter Tiere ist deutlich verringert (Abb. 3). Nichtparen-chymzellen schlieOen HSC und die gleichfalls an der Fibrogenese beteiligten Kupfer-zellen ein.
Die Serumindikatoren fūr eine hepatozellulāre Schādigung wie ALT, AP, AST, 15 GGT, GLDH und TBIL (Tabelle 1) zeigen eine Tendenz zur Normalisierung.
Die gleiche Verminderung der EROD- und α-Tocopherolkonzentrationen in der Kontrollgruppe und der mit Baypamun® behandelten Gruppe belegt die Anwesen-heit von toxischen reaktiven Sauerstoffradikalen durch die Tetrachlorkohlenstofīver-20 giftung in beiden Gruppen (Tabelle 1 und 2). Daher kann ein ”antifībrotischer” Ef-fekt von Baypamun® durch eine detoxifizierende Wirkung ausgeschlossen werden.
Im Serum-Modell zeigt Baypamun® eine nahezu vollstāndige Unterdriickung der Fibrose(Abb 4): Sovvohl der Hydroxyprolin-Gehalt als auch die mit Siriusrot anfārb-25 bare Flāche der Lebem liegt bei den mit Baypamun® behandelten Ratten fast auf dem Niveau der gesunden Kontrolltiere, wāhrend sie bei den Serum-behandelten Kontrollratten um ein Mehrfaches erhoht ist. Der durch die Schweineserum-behandlung induzierte Anstieg des Kollagengehalts betrāgt in der Baypamun-Gruppe nur 10 % des entsprechenden Wertes in der Kontroll-Gruppe. -10-
Beispiel 2:
Parapoxvirus ovis, Strain NZ 2
Methodik: NZ2-Virus vvurde in Wannenstapeln vermehrt. Hierzu wurden BK-Klon3A Zellen in Zellkulturschalen (37°C) 3 bis 5 Tage in EMEM 2 gr + 10 % FCS angezogen bis der Zellrasen 90 bis 100% konfluent war. Pro Wannenstapel wurden 4 Zellkulturschalen als Inokulum vervvendet und mit Medium (EMEM 2 gr + 10% FCS) auf ein Voluinen von 2,5 Liter aufgefullt. Nach 3 bis 5 Tagen Inkubation bei 37°C (90 bis 100% konfluenter Zellrasen) vvurde das Medium gegen EMEM 2g ohne Serumzusatz ausgetauscht und die Kultur mit NZ2-Virus (MOI 0,001 bis 0,01) infiziert.
Nach Erreichen von 100% CPE (Inkubation 37°C, ca. 7 bis 8 Tage) vvurde das Viras geemtet. Hierzu vvurde die Virussuspension in sterile Mediensācke abgefiillt und bei -80°C eingefroren. AnschlieBend vvurde die Sušpension bei 37°C im Brutraum aufgetaut und durch eine Tiefenfiltration (PorengroBe 5pm) zellbefreit. Hierauf vvurde die Virussuspension durch Ultrafiltration (100 kDa cutoff) um den Faktor 20 bis 40 aufkonzentriert. Altemativ kann das Viras durch Ultrazentrifugation (Ti45 30.000 rpm, 4°C, 60 Min) aufkonzentriert vverden.
Der durch die Aufkonzentrierung erreichte Titer des in der Suspension enthaltenen Viras wurde durch Titration auf BK-Klon3A Zellen bestimmt. Nachdem der Virus-titer auf 6,0 mittels EMEM Medium ohne FCS eingestellt vvurde, vvurde das Viras 2h bei 58°C hitzeinaktiviert. Die Inaktivierung vvurde durch eine Inaktivierungskontrolle auf BK-Klon3A Zellen kontrolliert.
Parapoxviras ovis, Strain NZ2 vvurde in dem bereits in Beispiel 1 vervvendeten Modeli der Schvveineseram-induzierten Leberfibrose bei Ratten untersucht: -11 - LV 12991
Weibliche Sprague Dawley Ratten wurden 2 x wochentlich mit 0,5 ml/Tier sterilem Schweineserum (Sigma) i.p. behandelt, Kontrolltiere mit steriler physiologischer Kochsalzlosung (2 x w5chentlich 0,5 ml/Tier i.p.)· Strain NZ 2 wurde 3 x wochent-lich in den Dosierungen 1,5 x 10s bzw. 5,0 χ 105 TCIDJ0/Tier i.p. verabreicht 5 (Applikationsvolumen: 0,5 ml/Tier). Fiir die untere Dosis wurde das Ausgangs-material mit Zellkultunnedium (Minimum Essential Medium Eagle, Sigma) verdūnnt. Kontrolltiere wurden mit Zellkultunnedium behandelt. Die Behandlung mit Strain NZ 2 erfolgte parallel zur Serum-Behandlung, jedoch nie am selben Tag. Nach 7 Wochen Behandlung vvurden die Tiere getotet, die Lebem entnommen und 10 die Leberfibrose sowohl morphometrisch als auch tlber den OH-Prolin-Gehalt quanti-fiziert. Die Methodik hierzu ist bereits in Beispiel 1 beschrieben.
Ergebnisse: 15 Die Ergebnisse der Kollagenbestimmungen sind in Abb. 5 dargestellt. Ūber-raschendenveise kann die Behandlung mit Strain NZ 2 das Entstehen der Leberfibrose unterdrucken: Die Serum-behandelten Kontroll-Tiere zeigen im Ver-gleich zu gesunden Tieren eine deutliche Erhčhung des OH-Prolin-Gehalts und des Siriusrot-farbbaren Kollagens. Dieser Anstieg wird durch NZ 2 dosisabhāngig redu-20 ziert. Ūberraschend ist auch das Ausmafi des Effekts: Die Dosis 5 x 10J TCID50 reduziert den Anstieg des Kollagengehalts in der Leber auf weniger als 10 % des Kontrollwertes. Eine qualitative Bewertung der histologischen Prāparate ergab, dass der Anteil der Tiere mit Kollagen-Septen von 93 % (14/15) auf 33 % (5/15) in der 1.5 χ 105 TCIDJ0-GTuppe und auf 0 % in der 5,0 x 10s TCIDJ0-Gruppe gesenkt wird. - 12-
Beispiel 3
Antifibrotische Wirkiing von PPVO nach oraler Verabreichung. 5 PPVO wurde als trockenes Lyophilisat in magensaftresistenten Kapseln (Elanco, Indianapolis, USA) formuliert.
Vier Gruppen von je sechs Versuchstieren wurden wie folgt behandelt: Eine Kon-trollgruppe (Gruppe 1) erhielt lediglich eine magensaftresistente Kapsel (ohne 10 PPVO) oral verabreicht, und zusātzlich sterile Kochsalzlāsung (0,5 ml/Tier) i.p. inji-ziert. Bei Gruppe 2 wurde eine magensaftresistente Kapsel (ohne PPVO) zusammen mit 0,5 ml Tetrachlorkohlenstoff/ Tier oral verabreicht und 0,5 ml physiologische Kochsalzlāsung i.p. injiziert. Tiere der Gruppe 3 erhielten vviederum eine magensaftresistente Kapsel (ohne PPVO) zusammen mit 0,5 ml Tetrachlorkohlen-15 stoff / Tier oral verabreicht. Die Tiere der Gruppe 3 erhielten auBerdem PPVO D1701 (Dosis: 5 χ 106 TCIDJ0 / Tier) in 0,5 ml Aqua pro injektione i.p. injiziert. Gruppe 4 erhielt PPVO D1701 (Dosis: 5 χ 106 TCIDJ0 / Tier, in einer magensaftresistenten Kapsel formuliert) zusammen mit 0,5 ml Tetrachlorkohlenstoff oral verabreicht Tiere der Gruppe 4 erhielten auBerdem 0,5 ml sterile 20 Kochsalzlāsung i.p. injiziert.
Nach 48 Stunden wurden die Lebem entnommen und in reprasentativen Gevvebe-schnitten die a-Glattmuskelaktin (α-SMA) -positive zentrilobulāre Flāche in % der gesamten Messflāche immunhistochemisch fur jedes Tier bestimmt (Johnson S J, 25 Hines JE, Burt AD. Phenotypic modulation of perisinusoidal celis following acute liver injury: a quantitative analysis. Int. J Exp. Path. 1992; 73: 765-772). Dieser Wert ist ein MaB fur die Transformation der Leberstemzellen. -13 - LV 12991
Es vvurden 2 Versuchsreihen nach obiger Beschreibung durchgefuhrt. Die Versuchsergebnisse der ersten Versuchsreihe sind in Tabelle 3, die Ergebnisse der 2. Versuchreihe sind in Tabelle 4 wiedergegeben. 5 In Versuchsreihe 1 ist der Anteil der a-SMA positiven zentrilobulāren Flāche in Lebergewebe von Tieren, die PPVO D1701 i.p. appliziert bekamen (Gruppe 3) unerklārlichenveise (und entgegen der sonstigen experimentellen Erfahrung) hoher als bei Tieren, die kein PPVO verabreicht bekamen. Aus diesem Grunde wurde die Versuchsreihe 2 als Wiederholungsexperiment durchgefuhrt. 10
In beiden Versuchsreihen vvurde tibereinstimmend und uberraschendenveise nach oraler Gabe von PPVO D1701 (jeweils Gruppe 4) eine ca. 50 %ige Hemmung der Transformation gegentiber der Kontrollgruppe (jeweils Gruppe 2) festgestellt In der 2. Versuchsreihe ist die Hemmung der Transformation nach oraler Gabe von PPVO 15 D1701 (Gruppe 4) āhnlich effektiv wie bei peritonealer Verabreichung von PPVO D1701 (Gruppe 3).
Aus diesen Ergebnissen lāsst sich ableiten, dass PPVO seine antifibrotische Wirkung auch nach oraler Gabe entfaltet. 20 -14-
Tabelle 1
EinfluB von Baypamun® auf Serumparameter des Leberstatus und Indikatoren einer Intoxikation ALT AST AP GGT GLDH TBIL EROD U/l U/l U/l U/l U/l pmol/l nmol gxmin Kontrolle 49.1 ac n f-/. / 162.8 0.8 12.5 1.6 0.30 SEM 3.7 8.7 14.76 0.2 7.9 0.2 0.02 Tetrachlorkohlenstoff 95.6 92.4 392.7 6.1 37.1 2.9 0.15 SEM 14.7 14.1 43.0 1.3 14.8 0.3 0.01 T. + Baypamun® 72.0 65.9 329.5 4.5 18.2 1.9 0.17 SEM 9.9 9.1 26.9 0.8 4.0 0.2 0.03 ALT : Alaninaminotransferase GLDH Glutamatdehydrogenase AST : Aspartataminotransferase TBIL Gesamtbilirubin AP : alkalische Phosphatase EROD 7-Ethoxyresorufindeethylase GGT : y-Glutamyltransferase -15- Tabelle 2
Einflufi von Baypamun® auf Leber-a-Tocopherol a-Tocopherol nmol / g Gewebe Kontrolle 73.1 SEM 2.2 Tetrachlorkohlenstoff 35.7 SEM 2.3 T. + Baypamun® 38.5 SEM 6.1 LV 12991 - 16-
Taballe 3
Einfluss von PPVO nach intraperitonealer oder oraler Gabe auf die Transfonnation von Leberstemzellen nach Gabe einer fibrogenen Dosis Tetrachlorkohlenstoff. 5 (Versuchsreihe 1)
Fibrose Applikation DOSIS a-SMA (%) Gruppe 1 Intakt Leerkapsel oral + Aqua pro injektione i.p. 0.28 ± 0.04 Gruppe2 Tetrachlorkohlenstoff Leerkapsel oral + Aqua pro injektione i.p. 2.76 ± 0.79 Gruppe 3 Tetrachlorkohlenstoff PPVO in Aqua pro injektione i.p. + Leerkapsel oral 5 x 106TCIDso/ Tier 5.05 ±2.00 Gruppe 4 Tetrachlor kohlenstoff PPVO in Kapsel oral + Aqua pro injektione i.p. 5 x 10* TCIDJ0/ Tier 1.46 + 0.34 -17- LV 12991
Tabelle 4
Einfluss von PPVO nach intraperitonealer oder oraler Gabe auf die Transformation von Leberstemzellen nach Gabe einer fibrogenen Dosis Tetrachlorkohlenstoff. (Versuchsreihe 2)
Fibrose Applikation DOSIS a-SMA (%) Intakt Gruppe 1 Leerkapsel oral + Aqua pro injektione i.p. 0.20 + 0.04 Tetrachlorkohlenstoff Gruppe 2 Leerkapsel oral + Aqua pro injektione i.p. 3.18 + 0.56 Tetrachlorkohlenstoff Gruppe 3 PPVO in Aqua pro injektione i.p. + Leerkapsel oral 5 x 106 TCIDJ0/Tier 1.22 + 0.35 Tetrachlorkohlenstoff Gruppe 4 PPVO in Kapsel oral + Aqua pro injektione i.p. 5 x 106 TCID50/Tier 1.55 + 0.34 LV 12991 17-1
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0-1 0-1-1 Formular - PCT/RO/134 (EASY) Angaben zu einem hinterlegten Mikroorganismus und/oder anderem hinterlegten bioiogischen Material erstellt durch Benutzung von PCT-EASY Version 2. (aktualisiert 01.01 91 .2001) 0-2 Internatlonales Aktenzeichen. 0-3 Aktenzeichen des Anmelders oder Anvvalts LEA34714-WO
1 1-1 1-2 Oie nachstehenden Angaben betreffen den Mikroorganismus und/oder anderes biologisches Material, der/das in der Beschreibung genannt ist Seite Zeile 5 11 1-3 Angaben betr. Hinterlegung 1-3-1 Name der Hinterlegungssteile European Collection of Celi Cultures 1-3-2 Anschrift der Hinterlegungssteile Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, United Kingdom 1-3-3 Datum der Hinterlegung 10 Jnli 2001 (10.07.2001) 1-3-4 Eingangsnummer ECACC 1-4 VVeitere Angaben KEINE 1-5 Bestimmungsstaaten, tur die besondere Angaben gemacht werden aile Bestinmrangsstaaten 1-6 Gesondert eingereichte Angaben Oiese Angaben werden dem Intemationalen Būra spāter Obermittelt KEINE
VOM ANMELDEAMT AUSZUFŪLLEN 0-4 □ieses Formular ist mit der intemationalen Anmeldung 11 JUL 2001 (ņ 07. Ot) eingegangen \ (ja oder nota) \£X 0-4-1 Bevollmāchtigter Befflensteter Ssbfon
VOM INTERNATIONALEN BŪRO AUSZUFŪLLEN 0-5 Dieses Formular ist an folgendem Datum beim intemationalen BOro eingegangen l 3 5 MOV 2001 (\ 5· «· 81J 0-5-1 Bevollmāchtigter Bediensteter -18- LV 12991
Patentanspriiche; 1. Venvendung von Isolaten von Parapoxviren zur Herstellung von Arznei-mitteln mit vorbeugender oder heilender Wirkung auf Organfibrosen des Menschen 2. Verwendung von Isolate von Parapoxviren, beispielsweise der Stāmme D 1701, orf-11, Greek orf strain 176, Greek orf strain 155, sowie der New Zealand (NZ) Stāmme zur Herstellung von Arzneimitteln mit vorbeugender oder heilender Wirkung auf Organfibrosen des Menschen. 3. Venvendung von Isolaten von Parapoxviren gemāB Anspruch 1-2, wobei als New Zealand (NZ) Stāmme die Stāmme NZ2, NZ7 und NZ10 zur Herstellung von Arzneimitteln mit vorbeugender oder heilender Wirkung auf Organfibrosen des Menschen vervvendet werden. 4. Venvendung von durch Passagierung oder Adaptation an geeignete Zellen modifizierte Parapox Viren der Anspriiche 1-3 zur Herstellung von Arzneimitteln mit vorbeugender oder heilender Wirkung auf Organfibrosen des Menschen 5. Venvendung von durch Passagierung oder Adaptation an geeignete Zellen modifizierte Parapox Viren der Anspriiche 1-3 zur Herstellung von Arzneimitteln mit vorbeugender oder heilender Wirkung auf Organfibrosen des Menschen, wobei zur Passagierung oder Adaptation humane Zellen wie WI-38, MRC-5, bovine Zellen, wie BK-K13A47/Reg oder MDBK und ovine Zellen, wie MDOK venvendet werden. 6. Venvendung von Teilen oder Bruchstiicken der Viren gemāss Anspruch 1-5 zur Herstellung von Arzneimitteln mit vorbeugender oder heilender Wirkung auf Organfibrosen des Menschen, wobei unter Teilen mittels geeigneter
Vektoren wie Vacciniaviren in geeigneten Systemen wie Fibroblasten-zellkulturen exprimierte genomische oder subgenomische Fragmente und unter Bruchstilcken die durch biochemische Aufreinigung wie Chromato-grafie erhaltenen Fraktionen der exprimierten oder physikalisch aufge-schlossenen viralen Partikel 2x1 verstehen sind.
Vervvendung von einem der Isolate entsprechend Anspruch 1-6 in Kombination mit anderen Mitteln zur Herstellung von Arzneimitteln und pharmazeutischen Zubereitungen mit vorbeugender oder heilender Wirkung auf Organfibrosen des Menschen.
Venvendung von Parapox ovis D 1701 allein oder in Kombination mit anderen Mitteln zur Herstellung von Arzneimitteln und pharmazeutischen Zubereitungen mit vorbeugender oder heilender Wirkung auf Organfibrosen des Menschen.
Venvendung von Parapox ovis D 1701 oder Zubereitungen von NZ2 als Referenz-Standard ftir die Beurteilung antifibrotischer Effekte in Assays zur Auffindung antifibrotischer Substanzen.
Venvendung von Parapox ovis D 1701 entsprechend Anspuch 8, wobei die pharmazeutischen Zubereitungen und Arzneimittel fur die orale Verab-reichung geeignet sind. LV 12991 -1 /4 - LV 12991 Fig. 1 Fldche %
Ko Ko D1701 Ko Ko D1701
Effekt von PPVO D1701 (Baypamun®) aut die CCl4-induzierfe Leber-fibrose. Dosis 5x10^TCID5o/Tier
Tierzahlen:n=6gesunde Kontrolieri,n=12 CCl4-Kontrollen,n=13CCl4+ D1701 *p<0.02 **p<0.01 (Kolmogorow-Smirnow-Tēst) versus CC14 2 LV 12991
-2/4 - PCNAi-nuclei/mm2 1 of-SMA-pos. Fldche(%eines zentrilobuldren Feldes} of-SMA-positive zentrilobuldre Flache
Kontrolle CCI4 CCI4+ Baypamun ig. 3 PCNA-positive zentrilobulare Nichtparenchymzellen
Baypamun LV 12991 -3/4 -
Fi g. 4 OH-Prolin 2,5-|-
gesunde Ko Serum Serum+ D1701
Effekt von PPVO D1701 (Baypamun®) auf die Schweineserum-indu-zierte Leberfibrose. Dosis: 5x10^TCI D50/Tier. Tierzahlen;n=15pro Serum-Gruppe,n=5 gesunde Kontrollen **p<0.01 (Kolmogorow-Smirnow-Test) versus Serum Ko LV 12991 -4/4 -
Fi g. 5
Vo Fldche mg OH-Fh)lm/g Leber (trocken) OH-Prolin
9,0 Morphometrie 8,0» 7.0-6.0- 5.0- 4.0- 3.0-2,ΟΙ,0-o,ol
*** kein Serum Serum+ Serum+ Serum Kontrolle 1,5x10e5 5,0*10e5 TCIDso/Tier TCID^Tier
Effekt von PPVO NZ2 auf die Schweineserum-induzierte Leber-fi brase.
Tierzahlen:n=15 pro Serum-Gruppe,n=5 gesunde Kontrolieri ***p<0.01 (Kolmogorow-Smirnow-Tesf) versus Serum Kontnolle LV 12991
Zusammenfassung:
Die vorliegende Erfindung betrifft die Humanverwendung von inaktivierten Parapoxviren bei der Prophylaxe und Behandlung von Erkrankungen, die mit erhohter Kollagenablagerung einhergehen, wobei sowohl innere Organe, wie z.B. die Leber, als auch die Haut und ihre Anhangsgebilde betroffen sein konnen. Insbesondere sind betroffen Leberfibrose bzw. Leberzirrhose im Gefolge von Virushepatitis oder Ethanol-induzierten Lebererkrankungen sowie Zystische Fibrose.
Claims (10)
- LV 12991 IZGUDROJUMA FORMULA 1. Parapoksvīrusu kultūru izmantošana medikamentu ražošanai ar profilaktisku vai ārstējošu iedarbību uz cilvēka orgānu fibrozēm.
- 2. Parapoksvīrusu kultūru, piemēram, celmu D1701, orf-11, Greek orf celma 176, Greek orf celma 155, kā arī New Zealand (NZ) celmu izmantošana 1 o medikamentu ražošanai ar profilaktisku vai ārstējošu iedarbību uz cilvēka orgānu fibrozēm.
- 3. Parapoksvīrusu kultūru izmantošana saskaņā ar 1. vai 2. punktu, pie kam New Zealand (NZ) celmi, kuri tiek izmantoti medikamentu ražošanai ar 15 profilaktisku vai ārstējošu iedarbību uz cilvēka orgānu fibrozēm, ir celmi NZ2, NZ7 un NZ10.
- 4. Punktos no 1. līdz 3. punktam aprakstīto parapoksvīrusu, kas modificēti, pārsējot vai adaptējot piemērotām šūnām, izmantošana medikamentu 20 ražošanai ar profilaktisku vai ārstējošu iedarbību uz cilvēka orgānu fibrozēm.
- 5. Punktos no 1. līdz 3. punktam aprakstīto parapoksvīrusu, kas modificēti, pārsējot vai adaptējot piemērotām šūnām, izmantošana medikamentu 25 ražošanai ar profilaktisku vai ārstējošu iedarbību uz cilvēka orgānu fibrozēm, pie kam pārsēšanai un adaptēšanai tiek izmantotas cilvēka šūnas, tādas kā WI-38, MRC-5, vērša šūnas, tādas kā BK-KI3A47/Reg vai MDBK, un aitas šūnas, tādas kā MDOK. 30
- 6. Vīrusu saskaņā ar punktiem no 1. līdz 5. punktam daļu vai fragmentu izmantošana medikamentu ražošanai ar profilaktisku vai ārstējošu iedarbību uz cilvēka orgānu fibrozēm, pie kam ar daļām ir jāsaprot genomiski vai subgenomiski fragmenti, kas ir ekspresēti ar piemērotu vektoru, tādu kā vaccinia vīrusi, palīdzību piemērotās sistēmās, tādās kā 35 fibroblasta šūnu kultūras, un ar fragmentiem ir jāsaprot ekspresētu vai 2 fizikāli sašķeltu vīrusu daļiņu frakcijas, kas iegūtas bioķīmiskās attīrīšanas, tādas kā hromatogrāfija, ceļā.
- 7. Kultūru izmantošana saskaņā ar punktiem no 1. līdz 6. punktam 5 kombinācijā ar citiem ārstniecības līdzekļiem medikamentu un farmaceitisko preparātu ar profilaktisku vai ārstējošu iedarbību uz cilvēka orgānu fibrozēm ražošanai.
- 8. Parapox ovis D 1701 viena paša vai kombinācijā ar citiem līdzekļiem 10 izmantošana medikamentu un farmaceitisko preparātu ražošanai ar profilaktisku vai ārstējošu iedarbību uz cilvēka orgānu fibrozēm.
- 9. Parapox ovis D 1701 vai NZ2 preparātu izmantošana par etalonstandartiem antifibrotisko efektu novērtēšanai antifibrotisku vielu 15 meklēšanas pārbaudēs.
- 10. Parapox ovis D 1701 izmantošana saskaņā ar 8. punktu, pie kam farmaceitiskie preparāti un medikamenti ir piemēroti perorālai ievadīšanai.
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