JP5950964B2 - 臓器線維形成に対するパラポックスウイルスｏｖｉｓ株の使用 - Google Patents

Description

本発明は、ヒトにおける、内臓、例えば肝臓および皮膚並びにそれに付属する構造の両方が冒されることに関連してコラーゲンの沈着の増加を伴う疾患を予防および処置するための不活化されたパラポックスウイルスの使用に関する。本発明は、特に、ウイルス性肝炎またはエタノール誘発性肝疾患の結果としての肝線維形成および肝硬変、および嚢胞性線維形成にも関する。

本発明は、特に、パラポックスウイルス ovisの単離体、例えばＤ１７０１株、ｏｒｆ−１１株、Ｇｒｅｅｋ ｏｒｆ １７６株、Ｇｒｅｅｋ ｏｒｆ １５５株およびＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ（ＮＺ）単離体、例えばＮＺ２、ＮＺ７およびＮＺ１０、およびさらにＤ１７０１に由来するBaypamun（登録商標）の使用に関する。

初発の株に加えて、本発明はさらに、例えば、ＷＩ３８等の、継代および／または特定の細胞への適合によって得られるその子孫に関する。完全なウイルスに加えてさらに、本発明はさらに、これらウイルスの一部または断片に関する。一部とは、培養線維芽細胞等の適当な系において、ワクシニア等の適当なベクターを用いて発現するゲノムまたはサブゲノム断片であると理解される。断片とは、クロマトグラフィー等の生化学的な精製によって得られる一部分、または音波処理による破壊等の物理的方法を用いて得られる粒子であると理解される。

パラポックスウイルスが脊椎動物の非特異的な免疫反応を刺激することができることは知られている。化学的に不活化したパラポックスウイルス ovis Ｄ１７０１株の調製物であるBaypamun（登録商標）は、感染性疾患の予防、感染後防御（metaphylaxis）および治療、並びに動物におけるストレス性疾患の予防に用いられる。

特許DE 3 504 940 A (Mayr, Anton) は、高エネルギー放射線照射、化学療法、AIDS、免疫抑制、加齢に関連する損傷および解毒作用によって引き起こされた免疫不全などの状態における、Baypamun（登録商標）の望ましい効果を教示しているが、肝線維形成の迅速な寛解は教示していない。DE 3 504 940はさらに、Baypamun（登録商標）が添加剤として癌治療の効力を支援すること、および不十分な母親の免疫防御によって引き起こされる疾患から新生児を守ることを教示している。

出発点としての現状の知識水準を考慮すれば、意外にも、不活化したパラポックスウイルスの投与によって肝線維形成を軽減または予防することができることがここに見出された。動物モデルにおいて、中毒性肝傷害に基づく四塩化炭素誘発肝線維形成の場合、および肝臓の炎症が存在しない異種血清誘発肝線維形成の場合にこの効果が見い出された。また、その治療効果の程度も顕著である：肝繊維症に関連するコラーゲンの過剰産生は、四塩化炭素モデルにおいては６０％阻害され、血清モデルではほぼ完全に阻害される。長期間の実験から得られたこれらの結果にしたがって、次に、四塩化炭素の迅速投与によって、Baypamun（登録商標）および上記のパラポックスウイルス ovis 株から得られた調製物によって肝星細胞のコラーゲン産生筋線維芽様型への形質転換を阻害することを実証することが可能であった。

肝線維形成および／または肝硬変は、異なる病毒、例えばウイルス感染やアルコール中毒によって誘発されるが、その異なる病理メカニズムは共通の最終経路、即ち、コラーゲン産生に入る。上記の非感染モデルから得られた動物実験モデルが実証しているように、不活化したパラポックスウイルスの投与は、意外にも、原因となる病毒に関係なくコラーゲン沈着を阻止する。

従って、パラポックスウイルスは、線維形成につながるすべての疾患に共通する最終経路に対して効果を発揮するための新しい治療原理の可能性を開く。

この効果は、パラポックスウイルス調製物を使用する場合、そのような調製物がさらなる免疫刺激作用を有することが知られているので、ウイルス性肝線維形成の場合でも、特に有効な治療が達成されることを示唆している。

ここに見出されたBaypamun（登録商標）の強い抗線維形成効果は、抗線維形成物質の同定のための分析において抗線維形成効果を調べるための標準としてBaypamun（登録商標）またはＮＺ２の調製物を用いることの可能性を開く。

不活化したパラポックスウイルスまたは子孫、および上記の株から得られる調製物は、結果として活性の包括的な抗線維形成スペクトルをを有し、それゆえ肝線維形成疾患の予防および治療だけでなく、関連して他の臓器、例えば肺、膵臓、心臓および皮膚の線維形成疾患においても適している。特に好ましいのは、肝線維形成および肝硬変の予防および処置におけるパラポックスウイルスの単離体の使用である。

臨床上の問題に依存して、パラポックスウイルスを基礎とする治療剤を全身投与、即ち、例えば、筋肉内、皮下、腹腔内、静脈内、経口または吸入あるいは局所的に投与する。次いで、パラポックスウイルスを精製し、凍結乾燥し、投与の直前に適当な溶媒に懸濁するか、または別の適当な製剤に存在させる、あるいは耐胃液性の経口投与剤型またはその他の経口投与剤型中に存在させる。

これに関連して、臨床上の問題の必要に対応した時間的計画に従っていくつかの投与または長期治療が必要になるかもしれない。

本発明は、ヒトにおける臓器線維形成に対する予防的または治療的効果を有する医薬の製造のための、Ｄ１７０１株、ｏｒｆ−１１、Ｇｒｅｅｋ ｏｒｆ １７６株、Ｇｒｅｅｋ ｏｒｆ １５５株、およびNew Zealand (NZ) 株から得られたパラポックスウイルスの単離体の使用に関する。好ましいのは、ヒトにおける臓器線維形成に対する予防的または治療的効果を有する医薬の製造のための、New Zealand (NZ)株、即ちＮＺ２、ＮＺ７およびＮＺ１０株の使用であって、ＮＺ２株を用いるのが特に好ましい。これに加えて、上記のパラポックスウイルスを継代または適当な細胞に適合させることにより修飾することができ、継代または適合化により得られたそれらパラポックスウイルスを、ヒトにおける臓器線維形成に対する予防的または治療的効果を有する医薬の製造のために使用することができる。これに関連して、継代または順化のために例えばＷＩ−３８、ＭＲＣ−５等のヒト細胞、ＢＫ−Ｋｌ３Ａ４７／ＲｅｇまたはＭＤＢＫ等のウシ細胞およびＭＤＯＫ等のヒツジ細胞を用いることが可能である。さらに、ヒトにおける臓器線維形成に対する予防的または治療的効果を有する医薬の製造のために上記のパラポックスウイルスの一部または断片を使用することも可能である。一部とは、培養線維芽細胞等の適当な系において、ワクシニアウイルス等の適当なベクターを用いて発現するゲノムまたはサブゲノム断片であると理解され、断片とは、発現した、または例えば超音波処理により物理的に破壊されたウイルス粒子の、クロマトグラフィー等の生化学的な精製によって得られる一部分であると理解される。本発明はさらに、ヒトにおける臓器線維形成に対する予防的または治療的効果を有する医薬および医薬調製物の製造のための、他の作用物質と組み合わせた、上記パラポックスウイルス ovis 株または上記の通りにそれから得られる修飾体の使用、およびヒトにおける臓器線維形成に対する予防的または治療的効果を有する医薬および医薬調製物の製造のための、Baypamun（登録商標）のそのままでのまたは他の作用物質を組み合わせた使用に関する。好ましくは、本発明は、上記パラポックスウイルス ovis 株または上記の通りにそれから得られる修飾体の、例えば耐胃液カプセル中での、経口投与のための製剤中の他の試薬との組み合わせの使用に関する。

本発明はさらに、Baypamun（登録商標）またはＮＺ２の調製物の、抗線維形成物質の同定のための分析において抗繊維症効果を調べるための標準としての使用に関する。

本明細書に一例として記載したパラポックスウイルス ovis ＮＺ−２は、European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, United Kingdomにおいて２００１年７月１０日に寄託された。受託番号はＥＣＡＣＣ−０１０７１００６である。

ＣＣＬ４誘発肝線維症に対するＰＰＶＯ Ｄ１７０１の効果を示す。 Baypamun（登録商標）によるＨＳＣ形質転換の阻害を示す。 Baypamun（登録商標）による肝臓における増殖非実質細胞数の減少を示す。 ブタ血清誘発肝線維症に対するＰＰＶＯ Ｄ１７０１の効果を示す。 ブタ血清誘発肝線維症に対するＰＰＶＯ ＮＺ−２の効果を示す。

実施例１
パラポックスウイルス ovis Ｄ１７０１株、Baypamun（登録商標）の効果
方法
Baypamun（登録商標）（乾燥品、化学的に不活化されたパラポックスウイルス ovis Ｄ１７０１株から単離された調製物）を説明書にしたがって注射用水に溶解した（ＴＣＩＤ５０に基づく力価(５０％組織培養感染量)約１０⁷／mL)。

Baypamun（登録商標）溶液中の量と同量のタンパク量を有するポリゲリン（Polygeline）溶液をプラセボ溶液として対照群の動物に投与した。

０.５ｍLの溶液を各動物に腹腔内投与した。投与は、１週間に３回行ったが２日連続の投与は行わなかった。

Baypamun（登録商標）を線維形成の原因が異なる２つの動物モデルで試験した。即ち、四塩化炭素モデルおよびブタ血清モデル。

四塩化炭素による長期的処置は、結果として肝硬変を伴う肝線維形成を実験的に誘発するための標準的方法である(McLean EK, McLean AEM, Sutton PM. Instant cirrhosis. Br. J Exp. Pathol. 1969; 50: 502-506)。このモデルは、一般にヒト肝線維形成および肝硬変のモデルであると認識されている。雌性Sprague-Dawleyラットを用いた。四塩化炭素のミクロソーム代謝を最大限に誘導するために、処置の開始１週間前にラットにイソニアジド１g／Ｌを飲料水と共に与えた。四塩化炭素を０．１ｍL／１００ｇ体重の用量で５日毎に経口投与した(四塩化炭素：ミネラルオイル＝１：１）。処置から７週間後に、ラットを屠殺し、試験した。Baypamun（登録商標）による処置を四塩化炭素による処置と平行して行った。

異種血清による処置、例えばラット場合におけるブタ血清、は結果として肝硬変を伴う肝線維形成を誘発するための、文献においてよく用いられる同様の方法である。この方法は、他の方法とは異なり、最小限の肝実質細胞に対する損傷および肝実質細胞の感染しか引き起こさない(Bhunchet, E. and Wake, K. (1992): Role of mesenchymal cell populations in porcine serum-induced rat liver fibrosis. Hepatology 16: 1452-1473)。雌性のSprague Dawleyラットを２×、即ち、０．５ｍLの滅菌ブタ血清 (Sigma)／動物で、１週間ごとに処置し、対照動物については滅菌生理塩化ナトリウム溶液(２×、１週間ごと、０．５ｍL／動物、腹腔内)を投与した。Baypamun（登録商標）による処置をブタ血清処置と平行して行ったが、同じ日には行わなかった。７週間処置した後、動物を屠殺し、肝臓を摘出してコラーゲンの量を定量した。

肝臓組織を試験するために、標準化された円筒形の横断組織（transverse tissue cylinder）(約１０×２ｍｍ）を肝臓の右前葉から打ち抜いた。肝線維形成によって産生された瘢痕コラーゲンを検出するために、凍結した組織片を０．１％のPicrosiriusレッド溶液で染色した。

Fast Greenをコントラスト増幅のための対比染色として用いた。各組織片における肝線維形成の程度を、全体の面積に対するPicrosiriusレッドの面積によって示される面積の百分率として求めた。顕微鏡画像色検出のパラメーターを標準化して実験中は一定に保った。最終倍率５０倍で、標準化された３１ｍｍ²の格子中に６４個の桝目が観察された。

四塩化炭素を用いたラットの急性処置後の、肝星細胞(HSC; 伊東細胞またはビタミンＡ貯蔵細胞)の形質転換の程度を測定するために、α−平滑筋活性陽性細胞を免疫組織化学的に検出した。１６の小葉中心の２４８×１８０μｍの領域それぞれの各組織片のぞれぞれにおいて、α−平滑筋活性陽性細胞が最終倍率２００倍で確認された。ＨＳＣのコラーゲン産生および成長因子産生筋線維芽様細胞への形質転換は、肝線維形成の誘導における重要な段階として知られている。形質転換したＨＳＣは、肝臓における線維形成活性の初期の指標である。

半自動化形態計測のために、ライカQuantimed 500MC (Leica Germany)を用いた。

ＯＨ−プロリンを測定するために、各例について５０〜１００ｍgの肝臓組織を乾燥し、６Ｎ ＨＣlと共に約１７時間煮沸した。真空乾燥オーブン内で塩酸を蒸発させた後、残留物を５ｍLの蒸留水に溶解し、この溶液を濾過した。２００μLの濾過した溶液を２００μLのエタノールおよび２００μLの酸化溶液(７％クロラミンＴ水和物水溶液、酢酸−クエン酸緩衝液 pＨ６.０で１：４に希釈)と共に室温で２５分間インキュベーションした。その後、４００μLのEhrlich試薬（エタノール２０ｍL中の１２ｇの４−ジメチルアミノベンズアルデヒド＋エタノール２０ｍL中の濃硫酸２.７４ｍL)を加えた。３５℃で３時間インキュベーションした後、５７３ｎｍで吸光度を測定した。ＯＨ−プロリン水溶液(Sigma)を標準希釈列として用いた。肝臓試料中のＯＨ−プロリンの量を肝臓の乾燥重量１ｇあたりのミリグラム数として計算した。

反応性の酸素フリーラジカルの形成をモニターするために、フリーラジカル捕捉剤である還元α−トコフェロール（α−ＴＯＣ）の濃度を肝臓において測定し、フリーラジカル感受性酵素７−エトキシレゾルフィン脱エチル化酵素（ＥＲＯＤ）の活性を血清中で測定した。両パラメーターは、四塩化炭素毒作用に関連して特徴的に下方調節され、組織に対する酸化による傷害の重篤度を見積もることが可能である。

動物における肝臓の状態は、いくつかの標準的な血清パラメーターを測定することにより調べることができる:
アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、ホスカリホスファターゼ（ＡＰ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(ＡＳＴ)、γ−グルタミルトランスフェラーゼ(ＧＧＴ)、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(ＧＬＤＨ)、および総ビリルビン(ＴＢＩＬ)。

結果：
Baypamun（登録商標）での処置により、四塩化炭素処置したラットの肝線維形成による変性の程度が有意に減少する (図１)。さらに、ＨＳＣ形質転換のほぼ完全な阻害を観察することができる（図２）。Baypamun（登録商標）処置した動物の肝臓における増殖非実質細胞の数は顕著に減少している(図３)。非実質細胞には、同様に線維形成に関与するＨＳＣおよびKupffer細胞が含まれる。

肝細胞損傷の血清指標、例えば、ＡＬＴ、ＡＰ、ＡＳＴ、ＧＧＴ、ＧＬＤＨおよびＴＢＩＬ(表１)は、正常化の傾向を示している。

対照群およびBaypamun（登録商標）処置群において、ERODとα−トコフェロール濃度が同様に減少したことは、両群における四塩化炭素の毒作用によってもたらされる有毒な反応性の酸素のフリーラジカルの存在の証拠を与える(表１および２)。したがって、Baypamun（登録商標）の解毒作用に起因する「抗線維形成」効果の可能性は除外され得る。

血清モデルにおいて、Baypamun（登録商標）は、線維形成のほぼ完全な抑制を示している（図４）: Baypamun（登録商標）処置したラットでは、ヒドロキシプロリンの量および肝臓におけるsinusレッド染色領域はいずれも、健康な対照動物においてみられるレベルであったが、血清処置された対照ラットにおいては数倍に増加している。Baypamun群では、ブタ血清処置によって誘導されるコラーゲン量の増加は、対照群において相当する値の１０％に過ぎなかった。

実施例２
パラポックスウイルス ovis ＮＺ２株
方法
ＮＺ２ウイルスをタンク内で複製させた。このため、ＢＫクローン３Ａ細胞を、細胞が９０〜１００％コンフルエントになるまで、ＥＭＥＭ２ｇｒ＋１０％ＦＣＳ中、培養皿にて３〜５日間培養した（３７℃）。各タンクにつき、４つの培養細胞皿を接種材料として用い、タンクに培地(ＥＭＥＭ２ｇｒ＋１０％ＦＣＳ)を２.５Ｌになるように入れた。３７℃にて３〜５日間培養した後(９０〜１００％コンフルエントの細胞)、培地を血清無添加のＥＭＥＭ２ｇに置き換えて、培養細胞をＮＺ２ウイルス(ＭＯＩ、０.００１〜０.０１)で感染させた。

ＣＰＥが１００％に達した後(３７℃にて約７〜８日間培養）ウイルスを回収した。このため、ウイルス上清のアリコートを滅菌した培地バッグにいれ−８０℃で凍結した。次いで、この懸濁液を培養室中３７℃で融解し、ディープベッド濾過(孔サイズ５μｍ）により細胞を除去した。その後、ウイルス懸濁液を限外濾過（１００ｋＤａカットオフ）により２０〜４０倍に濃縮した。別法として、ウイルスを超遠心により濃縮することができる(Ｔｉ４５、３００００ｒｐｍ、４℃、６０分)。

濃縮により達成された、懸濁液に存在するウイルスの力価を、ＢＫクローン３Ａ細胞に対して滴定を行うことにより決定した。ウイルス力価をＦＣＳ無添加ＥＭＥＭを用いて６.０に調整した後、５８℃で２時間ウイルスを熱不活化させた。不活化をＢＫクローン３Ａ細胞に対する不活化管理を行うことによりチェックした。

パラポックスウイルス ovis ＮＺ２株を、ラットにおけるブタ血清誘発肝線維形成の実施例１で用いたモデルにおいて試験した：
雌性Sprague Dawleyラットを、０.５ｍLの滅菌ブタ血清(Sigma)／動物を用いて2 x にて１週間ごとに腹腔内処置し、対照動物を滅菌生理塩化ナトリウム溶液（２×、１週間ごと、０.５ｍL／動物、腹腔内)で処置した。ＮＺ２株をそれぞれ１.５×１０⁵および５.０×１０⁵のＴＣＩＤ₅₀／動物の用量で１週間に３回投与した（投与体積：０.５ｍL／動物）。低用量については、出発物質を培地 (Eagle最小必須培地、Sigma)で希釈した。対照動物を培地で処置した。血清処置ＮＺ２株での処置と平行して行ったが、同日には行わなかった。処理の７週間後、動物を屠殺し、および肝臓を摘出した；肝線維形成は、形態計測およびＯＨ−プロリン量の両方を定量した。このための方法は、既に実施例１に記載されている。

結果：
コラーゲン投与の結果を図５に示す。意外にも、ＮＺ２株による処置は肝線維形成の発症を抑制することが可能である：健康な動物と比較して、血清処置した対照動物は、ＯＨ−プロリンおよびsinusレッド染色されたコラーゲン量の顕著な増加を示す。この増加は、ＮＺ２により用量依存的に減少する。効果の程度もまた顕著である：５×１０⁵ＴＣＩＤ₅₀の用量により、肝臓におけるコラーゲン量の増加が対照の値の１０％未満に減少した。組織学的調製物の定性試験は、コラーゲン中隔（collagen septa）を有する動物の割合が、１．５×１０⁵ＴＣｌＤ₅₀の群で９３％（１４／１５）から３３％（５／１５）、５.０×１０⁵ＴＣｌＤ₅₀の群では０％に減少したことを示した。

実施例３
経口投与後のＰＰＶＯの抗線維化効果
PPVOを、耐胃液カプセル内の凍結乾燥品として製剤化した (Elanco, Indianapolis, USA)。
各例６匹の実験動物の４つの群を以下のとおり処置した：１つの対照群（グループ１）には、耐胃液カプセルのみ（ＰＰＶＯなし）を経口投与し、さらに滅菌塩化ナトリウム溶液（０.５ｍL／動物）を腹腔内注射した。グループ２には、耐胃液カプセル（ＰＰＶＯなし）を０.５ｍL／動物の四塩化炭素と一緒に経口投与し、０.５ｍLの生理塩化ナトリウム溶液を腹腔内注射した。グループ３の動物にも同じく、耐胃液カプセル（ＰＰＶＯなし）を０.５ｍL／動物の四塩化炭素と一緒に経口投与した。さらに、グループ３の動物には、注射用水０.５ｍL中のＰＰＶＯ Ｄ１７０１ (用量: 5×10⁶ ＴＣＩＤ₅₀／動物)を腹腔内注射した。グループ４には、ＰＰＶＯ Ｄ１７０１ (用量: 5×10⁶ ＴＣＩＤ₅₀／動物、耐胃液カプセル中で製剤化）を０.５ｍLの四塩化炭素と一緒に経口投与した。グループ４の動物にはさらに０.５ｍLの滅菌塩化ナトリウム溶液を腹腔内投与した。

４８時間後、肝臓を摘出し、各動物についてα−平滑筋アクチン（α―ＳＭＡ）陽性小葉中心領域を組織化学的に測定し、代表的な組織片において測定された面積全体の百分率を求めた（Johnson S J, Hines JE, Burt AD. Phenotypic modulation of perisinusoidal cells following acute liver injury: a quantitative analysis. Int. J Exp. Path. 1992; 73: 765-772）。この数値は、肝星細胞の形質転換の程度を示すものである。

上記の記載にしたがって、実験を２回行った。最初の実験の結果を表３に示し、２回目の実験の結果を表４に示す。

１回目の実験では、ＰＰＶＯ Ｄ１７０１を腹腔内投与した動物（グループ３）の肝臓組織におけるα−ＳＭＡ陽性小葉中心領域の割合はなぜか(そしてそのほかの実験での経験とは異なり）ＰＰＶＯを投与しなかった動物よりも高かった。この理由のため、２回目の実験を反復実験として行った。

両実験において、対照群と比較して、約５０％の形質転換の阻害(グループ２の各例において）が、ＰＰＶＯ Ｄ１７０１の経口投与後、一致した且つ顕著な結果として観察された（グループ４の各例）。２回目の実験では、ＰＰＶＯ Ｄ１７０１の経口投与（グループ４）後の阻害は、ＰＰＶＯ Ｄ１７０１を腹腔内投与した場合に観察されたのと同程度であった（グループ３）。

これらの結果から、ＰＰＶＯは、経口投与後、抗線維化効果も示すことが推論される。

ALT：アラニンアミノトランスフェラーゼ GLDH:グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
AST:アスパラギン酸 TBIL：総ビリルビンアミノトランスフェラーゼ
AP:アルカリホスファターゼ EROD:７−エトキシレゾルフィン脱エチル化酵素
GGT:γ−グルタミルトランスフェラーゼ

表３
四塩化炭素の線維形成用量の投与後の、肝星細胞の形質転換に対する腹腔内投与または経口投与の後のPPVOの影響 (１回目の実験)

表４
四塩化炭素の線維形成用量の投与後の、肝星細胞の形質転換に対する腹腔内投与または経口投与後のＰＰＶＯの影響(２回目の実験)

Claims (4)

1. ヒトにおける臓器線維形成の予防または治療のための医薬の製造のための、パラポックスウイルスの単離体の使用。
2. ヒトにおける臓器線維形成の予防または治療のための医薬の製造のための請求項１に記載のパラポックスウイルスの単離体の使用であって、細胞に適合させるためパラポックスウイルスが継代または順化することにより修飾されている、使用。
3. ヒトにおける臓器線維形成の予防または治療のための医薬の製造のための請求項１に記載のパラポックスウイルスの単離体の使用であって、細胞に適合させるためパラポックスウイルスが継代または順化することにより修飾されており、継代または順化にヒト細胞ＷＩ−３８またはMRC-5、ウシ細胞ＢＫ−Ｋｌ３Ａ４７／ＲｅｇまたはＭＤＢＫ、またはヒツジ細胞ＭＤＯＫを用いることを特徴とする使用。
4. ヒトにおける臓器線維形成の予防または治療のための医薬および医薬調製物を製造するための、他の作用物質と組み合わせた、請求項１に記載のパラポックスウイルスの単離体の使用。

Images