KR20030019562A - 기관 섬유증에 대한 파라폭스바이러스 오비스 균주의 용도 - Google Patents

기관 섬유증에 대한 파라폭스바이러스 오비스 균주의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간에서 간 등의 내부 기관 및 피부 및 이의 부속 구조에도 영향을 미치는 콜라겐 침착 증가에 수반되는 질환의 예방 및 치료시에 불활성화된 파라폭스바이러스의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 간염 바이러스 감염 후의 간 섬유증 및 간 경변 또는 에탄올로 유도된 간 질환, 예를 들어 낭포성 섬유증에서의 용도에 관한 것이다.

Description

기관 섬유증에 대한 파라폭스바이러스 오비스 균주의 용도 {Use of Strains of the Parapox Ovis Virus Against Organ Fibrosis}
본 발명은 인간에서 간 등의 내부 기관 및 피부 및 이의 부속 구조 모두에 영향을 미칠 수 있는 콜라겐 침착 증가에 수반되는 질환의 예방 및 치료시에 불활성화된 파라폭스바이러스 (parapoxvirus)의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 간염 바이러스 감염 후의 간 섬유증 및 간 경변 또는 에탄올로 유도된 간 질환 및 또한 낭포성 섬유증에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 인간에서 파라폭스바이러스 오비스 (parapoxvirus ovis)의 단리물, 예를 들어 균주 D1701, orf-11, 그릭 (Greek) orf 균주 176, 그릭 orf 균주 155, 뉴질랜드 (New Zealand, NZ) 단리물, 예를 들어 NZ-2, NZ-7 및 NZ-10 및 또한 D1701로부터 유래한 바이파문 (Baypamun) (등록상표)의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 출발 균주 뿐 아니라, 이들 균주를 계대 배양하고(하거나) 특정 세포, 예를 들어 WI-38 등에 적응시켜 수득된 이들 균주의 자손에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 완전한 바이러스 뿐 아니라, 이들 바이러스의 일부 또는 단편에 관한 것이다. 일부란, 섬유아세포 배양 시스템 등과 같은 적합한 시스템 중에서 백시니아 벡터 등의 적합한 벡터를 사용하여 발현되는 게놈 또는 서브게놈 단편인 것으로 이해된다. 단편이란, 초음파 처리에 의한 파괴 등의 물리적 방법을사용한 후에 수득된 바이러스 입자를 크로마토그래피 등의 생화학적 정제법을 통해 수득한 분획물인 것으로 이해된다.
파라폭스바이러스는 척추동물에서 비특이적 면역 반응을 자극할 수 있음이 공지되어 있다. 바이파문 (등록상표)은 화학적으로 불활성화된 파라폭스바이러스 오비스, 균주 D1701의 제제로서, 동물에서 감염성 질환의 예방, 중간치유 (metaphylaxis) 및 치료법 및 스트레스로 유도된 질환의 저해에 사용된다.
특허 DE 504 940 A (마이르, 안톤 (Mayr, Anton))는 에너지가 높은 조사(照射), 화학요법, AIDS, 면역억제, 노화-관련 손상 및 해독 효과 등에 의해 유도된 면역불충분과 같은 상태에서 바이파문 (등록상표)의 유리한 효과에 관해 교시하고 있으나, 간 섬유증의 즉각적인 감소에 관해서는 교시하지 않는다. 또한, DE 3 504 940은 바이파문 (등록상표)이 보조약으로서 종양 치료법의 효능을 보조하며, 신생아에서 모체(母體)의 부적절한 면역 방어에 의해 초래된 질환을 검출한다고 교시하고 있다.
이러한 기존의 지식을 출발 요지로 하여 고려할 때, 놀랍게도 불활성화된 파라폭스바이러스의 투여가 간 섬유증을 감소시키거나 저해시킬 수 있음이 새로이 밝혀졌다. 동물 모델에서, 이러한 효과는 간에 독성 손상을 입히는 사염화탄소로 유도된 간 섬유증 및 이종 혈청에 의해 유도되며 감 염증은 수반하지 않는 간 섬유증의 경우에서 밝혀졌다. 치료 효과의 정도 역시 놀라운 것이었다: 사염화탄소 모델에서는 간 섬유증과 관련한 콜라겐의 과도한 생성이 60％ 억제되었으며, 혈청 모델에서는 거의 완벽하게 억제되었다. 그 후, 장기간의 실험에서 얻은 이들 결과와일치하여, 사염화탄소의 급성 투여로 인해 간 성상(星狀) 세포가 콜라겐-생성 근섬유아세포 형태로 전환되는 과정이 바이파문 (등록상표) 및 상기 언급한 파라폭스바이러스 오비스 균주로부터 수득된 제제에 의해 억제된다는 것을 입증할 수 있었다.
간 섬유증 및(또는) 간 경변은 바이러스 감염 및 알콜 남용 등과 같은 상이한 병독에 의해 유도될 수 있으나, 상이한 병리(病理)메카니즘 (pathomechanism)들은 콜라겐 생성이라는 공통적인 최종 경로로 귀결한다. 놀랍게도, 상기 기재한 비-감염성 모델로부터 얻은 동물 실험 결과는 불활성화된 파라폭스바이러스의 투여가 병독에 의해 유도된 콜라겐 침착을 독립적으로 저해한다는 것을 입증했다.
따라서, 파라폭스바이러스는 섬유증을 유발하는 모든 질환에 공통적인 최종 경로에 효과를 발휘하는 신규 치료 원리를 열었다.
파라폭스바이러스 제제가 추가의 면역자극 효과를 보유한다고 공지되어 있기 때문에, 이러한 효과는 파라폭스바이러스 제제를 사용하면, 바이러스로 유도된 간 섬유증의 경우일지라도 특히 효과적인 치료법이 달성될 것임을 제안하는 것이다.
바이파문 (등록상표)의 강력한 항-섬유증 효과는 항-섬유증 물질을 확인하기 위한 분석법에서 항-섬유증 효과를 평가하는 기준이 되는 표준 물질로서 바이파문 (등록상표) 또는 NZ-2 제제의 사용 가능성을 열게 된 것이다.
결과적으로, 불활성화된 파라폭스바이러스 또는 이들의 자손 및 상기 균주들로부터 수득된 제제는 모든 가능한 항-섬유증의 활성 스펙트럼을 보유하므로, 간에서의 섬유증 질환의 예방 및 치료법 뿐 아니라 폐, 췌장, 심장 및 피부 등을 비롯한 다른 기관에서의 섬유증 질환의 예방 및 치료법에도 적합하다. 특히 바람직하게는, 파라폭스바이러스의 단리물을 간 섬유증 및 간 경변의 예방 및 치료에 사용한다.
임상적 문제에 따라, 파라폭스바이러스 기재의 치료제는 전신적으로, 즉, 예를 들어 근육내, 피하, 복강내, 정맥내, 경구 또는 흡입 투여하거나 국소적으로 투여한다. 이때, 파라폭스바이러스는 정제 및 동결건조된 상태로 존재하여 투여 직전에 적합한 용매 중에 현탁하거나, 다른 적합한 조성물 중에 존재하거나, 또는 위액-내성 경구 투여 형태 또는 몇몇 다른 경구 투여 형태로 존재한다.
이와 관련하여, 시간적인 계획안에 따라, 임상적 문제에 대한 요구사항에 상응하는 여러회의 투여 또는 장기간의 처치가 필요할 수 있다.
본 발명은 인간에서의 기관 섬유증에 저해 효과 또는 치유 효과가 있는 의약의 제조시에 균주 D1701, orf-11, 그릭 orf 균주 176, 그릭 orf 균주 155 및 뉴질랜드 (NZ) 균주로부터 수득된 파라폭스바이러스 단리물의 용도에 관한 것이다. 인간에서의 기관 섬유증에 저해 효과 또는 치유 효과가 있는 의약의 제조시에 뉴질랜드 (NZ) 균주, 즉, 균주 NZ-2, NZ-7 및 NZ-10을 사용하는 것이 바람직하며, 균주 NZ-2를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 추가로, 상기 기재한 파라폭스바이러스는 계대 배양하거나 적합한 세포에 적응시킴으로써 변형시킬 수 있으며, 예를 들어 계대 배양 또는 적응에 WI-38, MRC-5 등의 인간 세포, BK-K13A47/Reg 또는 MDBK 등의 소 세포 및 MDOK 등의 양 세포를 사용할 수 있다는 점에서, 이러한 계대 배양 또는 적응을 통해 수득된 파라폭스바이러스를 사용하여 인간에서의 기관 섬유증에 저해 효과 또는 치유 효과가 있는 의약을 제조할 수 있다. 또한, 인간에서의 기관 섬유증에 저해 효과 또는 치유 효과가 있는 의약의 제조시에 상기 언급한 파라폭스바이러스의 일부 또는 단편을 사용할 수도 있다. 여기서, 일부는 섬유아세포 배양 시스템 등과 같은 적합한 시스템 중에서 백시니아 바이러스 벡터 등의 적합한 벡터를 사용하여 발현되는 게놈 또는 서브게놈 단편인 것으로 이해되고, 단편은 발현된 바이러스 입자 또는 초음파 처리 등을 통해 물리적으로 파괴한 바이러스 입자를 크로마토그래피 등의 생화학적 정제법을 통해 수득한 분획물인 것으로 이해된다. 추가로, 본 발명은 인간에서의 기관 섬유증에 저해 효과 또는 치유 효과가 있는 의약 또는 의약 제제의 제조시에 다른 작용제와 병용한 상기 파라폭스바이러스 오비스 균주의 용도 또는 상기 기재한 바와 같이 이로부터 수득된 변형체의 용도에 관한 것이고; 인간에서의 기관 섬유증에 저해 효과 또는 치유 효과가 있는 의약 또는 의약 제제의 제조시에 바이파문 (등록상표) 단독의 용도 또는 다른 작용제와 병용한 바이파문 (등록상표)의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 바람직하게는 경구 투여용 조성물, 예를 들어 위액-내성 캡슐의 제조시에 다른 작용제와 병용한 상기 파라폭스바이러스 오비스 균주의 용도 또는 상기 기재한 바와 같이 이로부터 수득된 변형체의 용도에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 항-섬유증 물질을 확인하기 위한 분석법에서 항-섬유증 효과를 평가하는 기준 물질로서 바이파문 (등록상표) 또는 NZ-2 제제의 용도에 관한 것이다.
본원에서 하나의 예로서 언급한 파라폭스바이러스 오비스 NZ-2는 영국 에스피4 0제이쥐 윌트샤이어 살리스베리 포르톤 다운에 소재하는 ECACC (유러피안 콜렉션 오브 셀 컬쳐스 (European Collection of Cell Cultures), 센터 포 어플라이드 마이크로바이올로지 앤드 리써치 (Centre for Applied Microbiology and Research))에 2001년 7월 10일자로 기탁 번호 01071006으로 기탁되었다.
실시예 1: 파라폭스바이러스 오비스, 균주 D1701인 바이파문 (등록상표)의 효과
<방법>
화학적으로 불활성화된 파라폭스바이러스 오비스, 균주 D1701에서 단리된 제제인 건조 바이파문 (등록상표)을 지시된 바에 따라 (TCID50(조직 배양물을 50％ 감염시키는 투여량)을 기초로 하는 역가는 대략 107TCID50/mL임) 주사용 물 중에 용해시켰다.
상기 바이파문 (등록상표) 용액과 단백질 함량이 동일한 폴리겔린 (Polygeline) 용액을 위약 용액으로서 대조군 동물에 투여했다.
동물 1마리 당 상기 용액을 0.5 mL씩 복강내 투여했다. 투여는 매주 3회 수행하였으나, 투여 다음날에는 투여하지 않았다.
바이파문 (등록상표)을 섬유증 원인이 상이한 2가지 동물 모델, 즉, 사염화탄소 모델 및 돼지 혈청 모델에서 시험했다.
사염화탄소의 만성 처치는 실험적으로 간 섬유증을 유도한 후 간 경변을 유도하는 표준 방법이다 [McLean EK, McLean AEM, Sutton PM. Instant cirrhosis. Br. J Exp. Pathol. 1969; 50:502-506]. 통상적으로, 이는 인간 간 섬유증 및 간경변에 대한 모델로 인지된다. 암컷 스프라그-돌리 래트를 사용했다. 미소체에 의한 사염화탄소 대사를 최대로 유도하기 위해, 처치 시작 1주일 전에 상기 동물에게 이소니아지드 1 g/L의 음료수를 먹였다. 사염화탄소를 체중 1OO g 당 O.1 mL의 투여량으로 매 5일 마다 경구 투여했다 (사염화탄소 : 미네랄 오일 = 1 : 1). 처치하고 7주가 지난 후에, 상기 동물을 희생시켜 조사했다. 바이파문 (등록상표) 처치는 사염화탄소 처치와 병행하여 수행했다.
마찬가지로, 이종 혈청의 처치, 예를 들어 래트에게 돼지 혈청을 처치하는 것은 간 섬유증을 유도한 후 간 경변을 유도하는데 종종 사용되는 방법이며, 이 모델은 다른 모델과는 달리 간 실질 세포에 최소의 손상 및 염증만을 유발한다 [Bhunchet, E. and Wake, K. (1992): Role of mesenchymal cell populations in porcine serum-induced rat liver fibrosis. Hepatology 16:1452-1473]. 암컷 스프라그-돌리 래트에 동물 1마리 당 멸균 돼지 혈청 (시그마 (Sigma) 제품)을 0.5 mL씩 매주 2회 처치했으며, 대조군 동물에는 멸균된 생리적 염화나트륨 용액을 처치했다 (매주 2회, 동물 1마리 당 0.5 mL씩 복강내 투여함). 바이파문 (등록상표) 처치는 돼지 혈청 처치와 병행하여 수행했으나, 같은 날에 수행하지는 않았다. 처치하고 7주가 지난 후에, 상기 동물을 희생시키고 간을 꺼내 콜라겐 함량을 정량했다.
간 조직을 조직학적으로 조사하기 위해서, 표준화된 횡단 (transverse) 조직 실린더 (대략 10 ×2 mm)를 간의 우측 전엽에서부터 삽입했다. 냉동된 절편을 0.1％ 피크로시리우스 레드 (Picrosirius red) 용액으로 염색하여 간 섬유증에 의해생성된 콜라겐성 반흔을 검출했다.
콘트라스트 증폭을 위한 대비염색약으로서 패스트 그린 (Fast Green)을 사용했다. 각 절편에서 피크로시리우스 레드로 염색된 면적을 측정하여 전체 면적에 대한 비율(％)로서 나타냄으로써 간 섬유증 정도를 측정했다. 비디오현미경 색상 검출법의 파라미터를 표준화하고 실험 전반에 걸쳐 일정하게 유지시켰다. 50배 최종 배율에서, 표준화된 31 mm2격자 내의 64개 영역을 측정했다.
래트에게 사염화탄소를 급성 처치한 후, 간 성상 세포 (HSC; 또한 이토 세포 또는 비타민 A 저장 세포라고도 공지되어 있음)의 전환 정도를 정량하기 위해서, α-평활근 액틴-양성 세포를 면역조직화학적으로 검출했다. 각 경우 마다 각 절편에 있는 16개 영역의 소엽중심부 (248 ×180 ㎛)에서 α-평활근 액틴-양성 세포를 200배 최종 배율로 확인했다. HSC가 콜라겐을 생성하고 성장 인자를 생성하는 근섬유아세포-유사 세포로 전환되는 단계가 간 섬유증 유도의 결정적인 단계라고 공지되어 있다. 따라서, 전환된 HSC는 간에서의 섬유소생성 활성에 대한 초기 지시자이다.
레이카 퀀타임드 500MC (Leica Quantimed 500MC)를 반자동 형태계측술에 사용했다.
OH-프롤린을 측정하기 위해서, 각 경우 마다 간 조직을 50 내지 100 mg씩 건조시키고 대략 17시간 동안 6 N HCl과 함께 끓였다. 진공-건조 오븐에서 상기 산을 증발시킨 후에, 잔류물을 증류수 5 mL 중에 용해하고 이 용액을 여과했다. 여과된 용액 200 ㎕를 에탄올 200 ㎕ 및 산화 용액 200 ㎕ (아세트산-시트르산 완충액을 사용하여 1 : 4로 희석시킨 7％ 클로르아민 T 수화물 수용액 (pH 6.0))과 함께 실온에서 25분 동안 인큐베이션했다. 이어서, 에를리히 (Ehrlich's) 시약 (에탄올 20 mL 중 4-디메틸아미노벤즈알데히드 12 g + 에탄올 20 mL 중 진한 황산 2.74 mL) 400 ㎕를 첨가했다. 35℃에서 3시간 동안 인큐베이션한 후에, 573 nm에서의 흡광도를 측정했다. OH-프롤린 (시그마 제품) 수용액을 일련의 표준물로서 사용했다. 간 샘플에서 간의 건조 질량 1 g 당 OH-프롤린 함량 (mg)을 계산했다.
반응성 산소 유리 라디칼의 형성을 모니터링하기 위해서, 유리 라디칼 포획제로서 환원된 α-토코페롤 (α-TOC)의 농도를 간에서 측정하고, 유리 라디칼에 민감한 효소인 7-에톡시레소루핀 데에틸라제 (EROD)의 활성을 혈청에서 측정했다. 두가지 파라미터 모두 사염화탄소 중독시에 특징적으로 하향 조절되기 때문에, 상기 조직에 대한 산화적 손상의 심각성을 추정할 수 있다.
하기한 몇몇 표준 혈청 파라미터를 측정하여 상기 동물들에서의 간 상태를 측정했다: 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT), 알칼리성 포스파타제 (AP), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST), γ-글루타밀 트랜스퍼라제 (GGT), 글루타메이트 데히드로게나제 (GLDH) 및 총 빌리루빈 (total bilirubin, TBIL).
결과:
바이파문 (등록상표) 처치는 사염화탄소를 처치한 래트의 간에서 섬유성 변성 정도를 유의하게 감소시켰다 (도 1). 또한, HSC 전환을 거의 완벽하게 억제함을 관찰할 수 있었다 (도 2). 바이파문 (등록상표)을 처치한 동물의 간에서 증식하는 비-실질 세포의 수는 현저하게 감소되었다 (도 3). 비-실질 세포로는 마찬가지로 섬유성장에 관여하는 HSC 및 쿠퍼 세포 등이 있다.
간세포 손상의 혈청 지시자, 예를 들어 ALT, AP, AST, GGT, GLDH 및 TBIL (표 1)은 정상화되는 경향을 나타냈다.
대조군 및 바이파문 (등록상표)을 처치한 군에서 EROD 및 α-토코페롤 농도의 동일한 감소는 두가지 군 모두에서 사염화탄소 중독에 의한 독성 반응성 산소 유리 라디칼이 존재함을 증명하는 것이다 (표 1 및 표 2). 따라서, 해독 효과에 의한 바이파문 (등록상표)의 "항-섬유증" 효과 가능성이 도출될 수 있다.
혈청 모델에서, 바이파문 (등록상표)은 섬유증을 거의 완벽하게 억제했다 (도 4): 바이파문 (등록상표)을 처치한 래트의 간에서는 히드록시프롤린의 함량 및 시리우스 레드로 염색되는 면적 모두가 실제로 건강한 대조군 동물에서 나타난 수준이었고, 혈청을 처치한 대조군 래트에서는 이 값들이 몇 배 증가했다. 바이파문 (등록상표) 군에서, 돼지 혈청을 처치하여 유도된 콜라겐 함량의 증가 수준은 대조군에서의 상응하는 값의 10％에 불과했다.
실시예 2: 파라폭스바이러스 오비스, 균주 NZ-2
<방법>
NZ-2 바이러스를 탱크 (tank stacks)에서 복제시켰다. 이를 위해서, BK 클론 3A 세포를 세포층이 90 내지 100％ 조밀해질 때까지 EMEM 2 g + 10％ FCS 중의 세포 배양 디쉬에서 3 내지 5일 동안 배양했다 (37℃). 4개의 세포 배양 디쉬를 각 탱크에서의 접종물로서 사용했고, 상기 탱크에 배지 (EMEM 2 g + 10％ FCS)를2.5 L의 부피로 채웠다. 37℃에서 3 내지 5일 동안 인큐베이션 (세포층이 90 내지 100％ 조밀해짐)한 후에, 상기 배지를 혈청이 첨가되지 않은 EMEM 2 g으로 교체하고 상기 배양물을 NZ-2 바이러스로 감염시켰다 (MOI, 0.001 내지 0.01).
100％ CPE에 도달한 후에 (37℃에서 대략 7일 또는 8일 동안 인큐베이션시킴) 바이러스를 수거했다. 이를 위해서, 상기 바이러스 현탁액을 멸균 배지 백으로 분취하여 -80℃에서 동결시켰다. 이어서, 상기 현탁액을 37℃의 인큐베이션실에서 해동시키고, 심층 (deep-bed) 여과 (공극 크기: 5 ㎛)를 통해 세포를 수집했다. 이후, 상기 바이러스 현탁액을 한외여과 (컷오프: 100 kDa)를 통해 20 내지 40배 농축시켰다. 별법으로, 상기 바이러스를 초원심분리 (Ti45, 30,000 rpm, 4℃, 60분)를 통해 농축할 수도 있다.
상기 농축된 현탁액 중에 존재하는 바이러스 역가를 BK 클론 3A 세포에 대한 적정을 통해 측정했다. FCS 없는 EMEM 배지를 사용하여 바이러스 역가를 6.0으로 조정한 후에, 상기 바이러스를 58℃에서 2시간 동안 가열하여 불활성화시켰다. BK 클론 3A 세포에 불활성화 대조군을 시험함으로써 상기 바이러스가 불활성화되었음을 확인했다.
파라폭스바이러스 오비스, 균주 NZ-2를 실시예 1에서 이미 사용했던 모델인 돼지 혈청으로 유도한 간 섬유증 래트 모델에서 조사했다: 암컷 스프라그-돌리 래트에 동물 1마리 당 멸균 돼지 혈청 (시그마 제품)을 0.5 mL씩 매주 2회 복강내 처치했으며, 대조군 동물에는 멸균된 생리적 염화나트륨 용액을 처치했다 (매주 2회,동물 1마리 당 0.5 mL씩 복강내 투여함). 균주 NZ-2를 각각 1.5 ×105및 5.0 ×105TCID50/동물의 투여량으로 매주 3회씩 복강내 투여했다 (투여 부피: 0.5 mL/동물). 더 낮은 투여량의 경우에는 출발 물질을 세포 배양 배지 (이글 (Eagle's) 최소 필수 배지, 시그마 제품)로 희석했다. 대조군 동물에는 세포 배양 배지를 처치했다. 균주 NZ-2 처치는 혈청 처치와 병행하여 수행했으나, 같은 날에 수행하지는 않았다. 처치하고 7주가 지난 후에, 상기 동물을 죽이고 간을 꺼냈다: 이어서, 형태계측적으로 정량하면서 OH-프롤린 함량을 정량하여 간 섬유증을 정량했다. 이 방법은 상기 실시예 1에 이미 기재되어 있다.
결과:
콜라겐 측정 결과를 도 5에 도시하였다. 놀랍게도, 균주 NZ-2를 처치하면 간 섬유증의 진행을 억제할 수 있었다: 건강한 동물과의 비교에서, 혈청을 처치한 대조군 동물은 OH-프롤린의 함량 및 시리우스 레드로 염색되는 면적이 현저하게 증가한 것으로 나타났다. 이러한 증가는 NZ-2에 의해 투여량-의존적 방식으로 감소되었다. 또한, 이러한 효과의 정도 역시 놀라운 것이었다: 5 ×105TCID50의 투여량은 간의 콜라겐 함량을 대조군 값의 10％ 미만으로 감소시켰다. 제제에 대한 조직학적 질적 평가를 통해, 콜라겐 중격(中膈) (septa)이 있는 동물의 비율이 1.5 ×105TCID50군에서는 93％ (14/15)에서 33％ (5/15)로 감소된 것으로 나타났고, 5×105TCID50군에서는 0％로 감소된 것으로 나타났다.
실시예 3: 경구 투여한 PPVO의 항-섬유증 효과
PPVO를 위액-내성 캡슐 중의 동결건조물로서 제형화했다 (미국 인디애나폴리스에 소재하는 엘란코 (Elanco) 제품).
각각 6마리의 실험 동물로 구성된 4개 군에 다음과 같이 처치했다: 대조군 (제1군)에는 위액-내성 캡슐만을 경구 투여 (PPVO는 투여하지 않음)했고, 멸균된 염화나트륨 용액 (0.5 mL/동물)도 추가로 복강내 투여했다. 제2군에는 동물 1 마리 당 위액-내성 캡슐을 사염화탄소 0.5 mL과 함께 경구 투여 (PPVO는 투여하지 않음)했고, 생리적 염화나트륨 용액 0.5 mL도 복강내 투여했다. 제3군의 동물에는 다시 동물 1 마리 당 위액-내성 캡슐을 사염화탄소 0.5 mL과 함께 경구 투여 (PPVO는 투여하지 않음)했다. 또한, 제3군의 동물에는 주사용 물 0.5 mL 중의 PPVO D1701 (투여량: 5 ×106TCID50/동물)를 복강내 투여했다. 제4군에는 PPVO D1701 (투여량: 5 ×106TCID50/동물, 위액-내성 캡슐 중에 제형화함)을 사염화탄소 0.5 mL과 함께 경구 투여했다. 또한, 제4군의 동물에는 멸균된 염화나트륨 용액 0.5 mL도 복강내 투여했다.
48시간 후에 간을 꺼내고, 각 동물에 대해 각 조직 절편에서 α-평활근 액틴 (α-SMA)-양성 소엽중심부의 면적을 조직화학적으로 측정하여 전체 면적에 대한 비율(％)로서 나타냈다 [Johnson S J, Hines JE, Burt AD. Phenotypic modulation ofperisinusoidal cells following acute liver injury: a quantitative ana]ysis. Int. J Exp. Path. 1992; 73:765-772]. 이 값은 간 성상 세포 전환에 대한 척도이다.
상기 기재한 바에 따라 일련의 실험을 2회 수행했다. 제1 실험의 결과는 표 3에 나타냈고, 제2 실험의 결과는 표 4에 나타냈다.
제1 실험에서, PPVO D1701을 복강내 투여한 동물들 (제3군)의 간에서 α-SMA-양성 소엽중심부 면적의 비율은 특이하게도 (실험한 나머지 동물들에서와는 반대로) PPVO를 투여하지 않은 동물에서 보다 더 높았다. 이 때문에, 제2 실험을 반복 실험으로서 수행했다.
2회의 일련의 실험 모두에서 공통적으로 놀랍게도 PPVO D1701를 경구 투여 (각 실험에서 제4군)한 후에는 대조군 (각 실험에서 제2군)에 비해 전환이 대략 50％ 억제된 것으로 관찰되었다. 제2 실험에서, PPVO D1701의 경구 투여 (제4군) 후의 전환 억제는 PPVO D1701을 복강에 투여한 경우 (제3군)에 관찰된 것과 유사한 수준이었다.
이들 결과로부터, 경구 투여한 PPVO도 항-섬유증 효과를 나타낸다는 것을 추론할 수 있다.
간 α-토코페롤에 대한 바이파문 (등록상표)의 영향
α-토코페롤 (nmol/g 조직)
대조군 73.1
SEM 2.2
사염화탄소 35.7
SEM 2.3
사염화탄소 + 바이파문 (등록상표) 38.5
SEM 6.1
사염화탄소를 섬유소생성량으로 투여한 후, 복막내 또는 경구 투여한 PPVO의 간 성상 세포의 전환에 대한영향 (제1 실험)
섬유증 투여 투여량 α-SMA(％)
제1군 (무손상) 빈 캡슐 (경구) + 주사용 물 (복강내) --- 0.28 ±0.04
제2군(사염화탄소) 빈 캡슐 (경구) + 주사용 물 (복강내) --- 2.76 ±0.79
제3군(사염화탄소) 주사용 물 중 PPVO (복강내) + 빈 캡슐 (경구) 5 ×106TCID50/동물 5.05 ±2.00
제4군(사염화탄소) 캡슐 중 PPVO (경구) + 주사용 물 (복강내) 5 ×106TCID50/동물 1.46 ±0.34
사염화탄소를 섬유소생성량으로 투여한 후, 복막내 또는 경구 투여한 PPVO의 간 성상 세포의 전환에 대한영향 (제2 실험)
섬유증 투여 투여량 α-SMA(％)
제1군 (무손상) 빈 캡슐 (경구) + 주사용 물 (복강내) --- 0.20 ±0.04
제2군(사염화탄소) 빈 캡슐 (경구) + 주사용 물 (복강내) --- 3.18 ±0.56
제3군(사염화탄소) 주사용 물 중 PPVO (복강내) + 빈 캡슐 (경구) 5 ×106TCID50/동물 1.22 ±0.35
제4군(사염화탄소) 캡슐 중 PPVO (경구) + 주사용 물 (복강내) 5 ×106TCID50/동물 1.55 ±0.34

Claims (10)

  1. 인간에서의 기관 섬유증에 저해 효과 또는 치유 효과가 있는 의약의 제조시에 파라폭스바이러스 (parapoxvirus) 단리물의 용도.
  2. 인간에서의 기관 섬유증에 저해 효과 또는 치유 효과가 있는 의약의 제조시에 파라폭스바이러스 단리물, 예를 들어 균주 D1701, orf-11, 그릭 (Greek) orf 균주 176, 그릭 orf 균주 155 및 뉴질랜드 (New Zealand, NZ) 균주 단리물의 용도.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간에서의 기관 섬유증에 저해 효과 또는 치유 효과가 있는 의약의 제조시에 사용하는 뉴질랜드 (NZ) 균주가 NZ-2, NZ-7 및 NZ-10이라는 것을 특징으로 하는 파라폭스바이러스 단리물의 용도.
  4. 인간에서의 기관 섬유증에 저해 효과 또는 치유 효과가 있는 의약의 제조시에 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 파라폭스바이러스를 계대 배양하거나 적합한 세포에 적응시킴으로써 변형시킨 파라폭스바이러스의 용도.
  5. 인간에서의 기관 섬유증에 저해 효과 또는 치유 효과가 있는 의약의 제조시에 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 파라폭스바이러스를 계대 배양하거나 적합한 세포에 적응시킴으로써 변형시킬 때 사용하는 세포가 WI-38, MRC-5 등의 인간 세포, BK-K13A47/Reg 또는 MDBK 등의 소 세포 및 MDOK 등의 양 세포임을 특징으로 하는 파라폭스바이러스의 용도.
  6. 인간에서의 기관 섬유증에 저해 효과 또는 치유 효과가 있는 의약의 제조시에 제1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 바이러스의 일부 또는 단편의 용도로서, 여기서의 일부는 섬유아세포 배양 시스템 등과 같은 적합한 시스템 중에서 백시니아 바이러스 벡터 등의 적합한 벡터를 사용하여 발현되는 게놈 또는 서브게놈 단편인 것으로 이해되고, 단편은 발현된 바이러스 입자 또는 물리적으로 파괴한 바이러스 입자를 크로마토그래피 등의 생화학적 정제법을 통해 수득한 분획물인 것으로 이해된다는 것을 특징으로 하는 것인 용도.
  7. 인간에서의 기관 섬유증에 저해 효과 또는 치유 효과가 있는 의약 또는 제약 제제의 제조시에 다른 치료약과 병용한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 단리물의 용도.
  8. 인간에서의 기관 섬유증에 저해 효과 또는 치유 효과가 있는 의약 및 제약 제제의 제조시에 파라폭스바이러스 오비스 (parapoxvirus ovis) D1701 단독의 용도 또는 다른 치료약과 병용한 파라폭스바이러스 오비스 D1701의 용도.
  9. 항-섬유증 물질을 확인하기 위한 분석법에서 항-섬유증 효과를 평가하는 기준이 되는 표준 물질로서 파라폭스바이러스 오비스 D1701 또는 NZ-2 제제의 용도.
  10. 제8항에 있어서, 상기 제약 제제 및 의약이 경구 투여에 적합하다는 것을 특징으로 하는 파라폭스바이러스 오비스 D1701의 용도.
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