HU217613B

HU217613B - Az N-terminálison módosított peptidek, az azokat tartalmazó gyógyszerkészítmények és eljárás előállításukra

Info

Publication number: HU217613B
Application number: HU9300972A
Authority: HU
Inventors: Hans Georg Alpermann; Gerhard Breipohl; Hermann Gerhards; Stephan Henke; Jochen Knolle; Bernward Schölkens; Klaus Wirth
Original assignee: Hoechst Ag.
Priority date: 1992-04-04
Filing date: 1993-04-02
Publication date: 2000-03-28
Also published as: EP0564972B1; HU9300972D0; RU2109747C1; NO311941B1; DK0564972T3; IL105287A; KR930021656A; EP0564972A3; AU667707B2; NO931287D0; KR100273825B1; ES2136626T3; SK281970B6; DE59309726D1; GR3031543T3; CN1077202A; ATE183197T1; FI931474A0; CA2093305A1; ZA932399B

Abstract

A találmány szerinti bradikininantagonista hatású új peptidek (I)általános képletben Z-P-A-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH(I) A jelentése Arg, D-Arg, D-Lys vagy kémiai kötés, P jelentésekémiai kötés, vagy –NR2–(U)–CO– általános képletű csoport, amelyben–NR2U jelentése okta- hidroindol-1,2-ilén- vagy 2-azabiciklo[3.3.0]-oktán-2,3-ilén-csoport, vagy U jelentése 1–6 szénatomos alkilén-csoport vagy 3–8 szénatomos cikloalkiléncsoport, és R2 jelentésehidrogénatom vagy 9-fluorenil-metil-oxi-- karbonil-amino-csoporttalszubsztituált, 1–6 szénatomos alkilcsoport és Z jelentése i)X1X2CH–CO– általános képletű csoport, amelyben X1 és X2 jelentéseegymástól függetlenül H, fenil-C1–C4-alkil-csoport, 1–4 szénatomosalkilcsoport, 1– 6 szénatomos alkilcsoporttal egyszeresenszubsztituált fenilcsoport, indolil- vagy dimetil-xantinil-csoportvagy –NR’R” általános képletű csoport, amelyben R’ és R” jelentésefenil-C1–C4-alkilcsoport, vagy X1 és X2 együttesen 3–6 szénatomosalkiléncsoportot alkot; ii) X3n–NH–(CH2)n–CO– általános képletűcsoport, amelyben n értéke 1–7, X3 jelentése 4-benzoil-benzoil-csoportvagy iii) 9-fluorenil-metil-oxikarbonil-csoport, C1-C6-alkil-szulfonil-C1–C4-alkil-[(naftil)-C1–C4-alkanoil]-csoport, naftalimido-C1–C4-alkanoil-csoport vagy benzoilcsoport. ŕ

Description

A találmány bradikininantagonista hatású, új peptidekre, előállításukra és azokat tartalmazó gyógyszerkészítményekre vonatkozik.

Bradikininantagonista hatású peptidek a WO 86/07263 szám alatt publikált nemzetközi szabadalmi bejelentésből, valamint a 370 453, 413 277, 455 133 és 472 220 számon közzétett európai szabadalmi bejelentésekből ismertek.

A találmány új, bradikininantagonista hatású peptidekre vonatkozik. Az új vegyületek az (I) általános képletnek felelnek meg:

Z-P-A-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-ArgOH (I) e képletben

A jelentése Arg, D-Arg, D-Lys vagy kémiai kötés,

P jelentése kémiai kötés, vagy -NR²-(U)-CO- általános képletű csoport, amelyben -NR²U jelentése oktahidroindol-l,2-ilén- vagy 2-azabiciklo[3.3.0]oktán-2,3-ilén-csoport, vagy U jelentése 1-6 szénatomos alkiléncsoport vagy 3-8 szénatomos cikloalkiléncsoport, és R² jelentése hidrogénatom vagy 9-fluorenil-metil-oxi-karbonil-amino-csoporttal szubsztituált 1-6 szénatomos alkilcsoport és

Z jelentése

i) X'X²CH-CO- általános képletű csoport, amelyben

X¹ és X² jelentése egymástól függetlenül H, fenilC|-C₄-alkil-csoport, 1-4 szénatomos alkilcsoport, 1-6 szénatomos alkilcsoporttal egyszeresen szubsztituált fenilcsoport, indolil- vagy dimetil-xantinilcsoport vagy

-NR’R” általános képletű csoport, amelyben R’ és R” jelentése feml-C|-C₄-alkil-csoport, vagy

X¹ és X² együttesen 3-6 szénatomos alkiléncsoportot alkot;

ii) X³-NH-(CH₂)_n-CO- általános képletű csoport, amelyben n értéke 1-7,

X³ jelentése 4-benzoil-benzoil-csoport vagy iii) 9-fluorenil-metil-oxikarbonil-csoport, C₁-C₆-alkil-szulfonil-C₁-C₄-alkil-[(naftil)C, -C₄-alkanoil]-csoport, naftalimido-C) -C₄-alkanoil-csoport vagy benzoilcsoport.

A találmány a fenti vegyületek fiziológiailag elfogadható savaddíciós sóira is kiterjed.

Amennyiben mást nem kötünk ki, a sztereojelzés nélküli aminosavrövidítés az L formát jelenti [vö.: Schröder, Lübke, The Peptides, I. kötet, New York 1965, XXII-XX1II. oldal; Houben-Weyl, Methoden dér organischen Chemie XV/1. és 2. kötet, Stuttgart 1974.].

Ha külön mást nem említünk, az alkilcsoportok mind egyes, mind elágazó szénláncúak lehetnek, és ez érvényes a levezetett csoportokra, így az alkoxi-, aralkil- és alkanoilcsoportokra is.

Uretán védőcsoportokat például A. Hubbuch (Kontakté Merck 3/79,14-23. oldal) sorol fel. Az Fmoc és a Cbz csoport előnyös.

Az (I) általános képletű vegyületek sóiként a savaddíciós sók jöhetnek számításba. A savaddíciós sókat szervetlen és szerves savakkal (HC1, HBr, kénsav, foszforsav, maleinsav, fumársav, citromsav, borkősav, ecetsav) képezzük, önmagában ismert módon, például oly módon, hogy az (1) általános képletű vegyületet oldószerben oldjuk, melegítés közben a savat adagoljuk, majd a kivált sót elkülönítjük.

A találmány az (1) általános képletű peptidek előállítására is vonatkozik. A találmány értelmében az (I) általános képletű vegyületeket úgy állítjuk elő, hogy a kívánt esetben védett aminosavakat az (I) általános képletnek megfelelő sorrendben - kívánt esetben valamely ismert hordozón - kondenzáljuk, majd a kapott pepiidről adott esetben lehasítjuk, a gyantáról és/vagy a kapott peptidről a védőcsoportokat lehasítjuk, és kívánt esetben a kapott (I) általános képletű vegyületet fiziológiailag elviselhető savaddíciós sóvá alakítjuk.

A jelen találmányban szereplő peptideket a peptidkémiában általánosan ismert módszerekkel (például Houben-Weyl, Methoder dér organischen Chemie, 15/2. kötet), előnyösen szilárd fázison történő szintézissel [például B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963), vagy R. C. Sheppard, Int. J. Peptide Protein Rés. 21, 118 (1983)], vagy egyéb ismert, ekvivalens módszerrel állítjuk elő. Az ω-aminocsoport védelmére uretán védőcsoportok, így terc-butoxi-karbonil (Boc)vagy a fluorenil-metoxi-karbonil (Fmoc)-védőcsoportok alkalmazhatók. Amennyiben mellékreakciók elnyomása vagy különleges peptidek szintézise céljából szükségessé válik, az aminosavak oldalláncában lévő egyéb reakcióképes csoportokat alkalmas védőcsoportokkal (például T. W. Greene, „Protective Groups in Organic Synthesis”) védjük, elsősorban az alábbiak szerint: Arg(Tos), Arg(Mts), Arg(Mtr), Arg(Pmc), Ser(Bzl), Ser(But).

A szilárd fázison történő szintézis a peptid Cterminális végén kezdődik azzal, hogy egy védett aminosavat megfelelő gyantához kapcsolunk; a védett aminosavat például észter- vagy amidkötés révén klór-metil-, hidroxi-metil-, benzhidril-amino (BHA)-, metil-benzhidril-amino (MBHA)-csoporttal módosított polisztirolvagy poliakrilamidgyantához kapcsolhatjuk. A hordozóként alkalmazható gyanták a kereskedelemben kapható termékek. BHA- és MBHA-gyantákat többnyire akkor használunk, ha az előállítani kívánt peptid C-terminálisán szabad amidcsoport lesz. Amennyiben a peptid Cterminális végén szekunder amidcsoport lesz, klór-metil-, illetve hidroxi-metil-gyantát alkalmazunk, és a lehasítást a megfelelő aminnal végezzük. Ha például etilamidot akarunk előállítani, a peptidet etil-aminnal hasítjuk le a hordozóról. Az oldalláncban lévő védőcsoportokat ezt közvetően, más reagensekkel hasítjuk le. Ha a peptid oldalláncán lévő terc-butil-védőcsoportokat meg kívánjuk hagyni, az aminosav ω-aminocsoportját ideiglenesen Fmoc-védőcsoporttal blokkoljuk, például R. C. Sheppard (J. Chem. Soc., Chem. Comm. 1982, 587) módszerével; az arginin guanidinocsoportját piridiniumperkloráttal végzett protonálás segítségével védjük, és az egyéb, az oldalláncban reakcióképes aminosavakat a ka2

HU217613 Β talitikus transzfer-hidrogénezéssel [A. Félix et al., J. Org. Chem. 13, 4194 (1978)] vagy folyékony ammóniában oldott nátriummal [W. Roberts, J. Am. Chem. Soc. 76, 6203 (1954)] lehasítható benzilcsoporttal védjük.

A gyantához kapcsolt aminosav aminovédő csoportjának alkalmas reagenssel (Boc esetén például diklór-metános trifluor-ecetsav, Fmoc esetén 20%-os dimetil-formamidos piperidinoldat) végzett lehasítása után a következő védett aminosavakat a kívánt sorrendben kapcsoljuk. A következő aminosav hozzákapcsolása előtt a közbenső termékként keletkező, N-terminálisan védett peptidgyantán a fent megadott reagensekkel a blokkolást megszüntetjük.

Kapcsolási reagensként a peptidszintézisben szokásos aktiválóreagenseket (például Houben-Weyl, Methoden dér organischen Chemie, 15/2. kötet) alkalmazhatjuk. A karbodiimidek, így az N, N’-diciklohexilkarbodiimid, az Ν,Ν’-diizopropil-karbodiimid vagy az N-etil-N ’-(3-dimetil-amino-propil)-karbodiimid különösen előnyös. A kapcsolási műveletet közvetlenül végezhetjük úgy, hogy az aminosavszármazékot - az aktiválóreagens és adott esetben a racemálódást visszaszorító adalék, például 1-hidroxi-benzotriazol (HOBt) [W. König, R. Geiger, Chem. Bér. 103, 708 (1970)] vagy 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidrobenzotriazin (HOObt) [W. König. R. Geiger, Chem. Bér. 103, 2054 (1970)] jelenlétében - a gyantához kapcsoljuk. Eljárhatunk úgy is, hogy az aminosavszármazék szimmetrikus anhidrid vagy HOBt-, illetve HOOBt-észter képzése révén történő aktiválását külön végezzük és az aktivált vegyületet alkalmas oldószerben adjuk a kapcsolódásra képes gyantához.

Az aminosavszármazékok kapcsolása, illetve aktiválása oldószerben történik. Alkalmas oldószerek a dimetil-formamid, az N-metil-pirrolidon, diklór-metán vagy a felsoroltak elegyei. Az aktivált aminosavszármazékot általában 1,5-4-szeres feleslegben alkalmazzuk. Ha a kapcsolódás nem teljes, a kapcsolási műveletet ismételjük anélkül, hogy a peptidgyanta ω-aminocsoportján a blokkolást megszüntetnénk (ahogy ez a következő aminosav hozzákapcsolása előtt szükséges lenne).

A kapcsolás sikeres lefutását a ninhidrinreakció segítségével ellenőrizhetjük [lásd például E. Kaiser et al., Anal. Biochem. 34, 595 (1970)]. A szintézist automatán, például az Applied Biosystem cég Synthesizer 430A típusú automatikus szintézisgépén is végezhetjük, ahol a cég szintézisprogramjait, vagy pedig saját programokat alkalmazunk, az utóbbira főleg Fmoc-csoporttal védett aminosavszármazékok esetén kerül sor.

A fent leírt szintézise után a peptidet egy reagenssel, például folyékony hidrogén-fluoriddal (előnyös a Bocmódszerrel előállított peptidek esetén) vagy trifluorecetsavval (előnyös az Fmoc-módszerrel előállított peptidek esetén) lehasíthatjuk. Az említett reagensek nemcsak a peptidet hasítják le a gyantáról, hanem az aminosavszármazékok oldalláncában lévő egyéb védőcsoportokat is. így a peptidet - kivéve BHA- és MBHA-gyanták alkalmazása esetén - szabad sav formájában kapjuk. BHA-, illetve MBHA-gyanta alkalmazása esetén a hidrogén-fluoriddal vagy trifluor-metánszulfonsavval végzett lehasítás során a peptidet savamid formájában kapjuk. Peptidamidok előállítására irányuló egyéb eljárások a P 37 11 866.8 és P 37 43 620.1 számú NSZK-beli szabadalmi bejelentésekből ismertek. Az ott részletezett eljárásokban a peptidamidot a peptidkémiában szokásosan alkalmazott közepesen erős savakkal (például trifluor-ecetsawal) végzett kezelés után hasítják le a gyantáról, amikor is kationfogó reagensként az alábbiakat használják: fenol, kreazol, tiokrezol, anizol, tioanizol, etánditiol, dimetil-szulfid, etil-metil-szulfid vagy hasonló, a szilárd fázisú peptidkémiában szokásosan alkalmazott kationfogók. A felsoroltak egyikét vagy pedig kettő vagy több kationfogó elegyét alkalmazzák. A trifluor-ecetsav alkalmas oldószerrel, például diklórmetánnal hígított is lehet.

Amennyiben azt akarjuk, hogy az oldalláncokon lévő tere-butil, illetve benzil védőcsoportok megmaradjanak, a különlegesen módosított hordozón szintetizált peptid lehasítása trifluor-ecetsav 1%-os diklór-metános oldatával végezhető el (vö. például R. C. Sheppard, J. Chem. Soc., Chem. Comm. 1982, 587). Ha csak egyes tere-butil-, illetve benzilcsoportokat akarunk megtartani, a szintézis- és hasításlépések alkalmas kombinációjával dolgozunk.

C-terminális amidcsoporttal vagy omega-amino-, illetve omega-guanidinoalkil-csoporttal rendelkező peptidek szintézisét szintén a Sheppard által leírt módosított hordozógyantán végezzük. Szintézis után az oldalláncban teljesen védett peptidet a gyantáról lehasítjuk, és ezt közvetően a klasszikus oldatszintézisben reagáltatjuk a megfelelő aminnal, illetve omega-amino-alkil-aminnal vagy omega-guanidinoalkil-aminnal, amikor esetleg meglévő további reakcióképes csoportokat ismert módon ideiglenesen védünk.

Omega-amino-alkil-csoportot tartalmazó peptidek szintézisére a 264 802 számon publikált európai szabadalmi bejelentés is ismertet eljárást.

A jelen találmányban szereplő peptidek főleg a szilárd fázisú technika segítségével készültek, a védőcsoportok vonatkozásában két alapvető taktika szerint:

A szintézishez az Applied Biosystems 430A típusú peptid-synthesizer gépét alkalmaztuk, az ω-aminocsoport ideiglenes védelmére Boc-, illetve Fmoc-csoportokat használva.

Boc-csoport esetén a szintézis során a gép gyártójának előprogramozott szintézisciklusait alkalmaztuk.

A C-terminális végén szabad karboxilcsoportot tartalmazó peptidek előállítását a megfelelő aminosavval aktivált 4-(hidroxi-metil)-fenil-acetamido-metil-polisztirol-gyantán [R. B. Merrifield, J. Org. Chem 43, 2845 (1978)] végeztük. A gyanta az Applied Biosystems terméke. A peptidamidok előállítására MBHAgyantát (szintén Applied Biosystems) alkalmaztunk. Aktiválóreagensként Ν,Ν’-diciklohexil-karbodiimid vagy Ν,Ν’-diizopropil-karbodiimid kerültek felhasználásra. Az aktiválás szimmetrikus anhidrid, HOBt-észter vagy HOOBt-észter képzése útján történt, oldószergyantát diklór-metán, diklór-metán és dimetil-formamid elegye vagy NMP jelenlétében. Az aktivált aminosav3 származékot 2-4 ekvivalensnyi feleslegben alkalmaztuk. Nem teljes kapcsolódás esetén a lépést ismételtük.

Amikor is az alfa-aminocsoport ideiglenes védelmét Fmoc-védőcsoportokkal oldjuk meg, a fent említett szintézisgépbe saját szintézisprogramjainkat tápláltuk be. Hordozóként ismert módon a megfelelő aminosavval észterezett (E. Atherton et al., J. C. S. Chem. Comm. 1981, 336) p-benziloxi-benzil-alkohol-gyantát [S. Wang, J. Am. Chem. Soc. 95, 1328 (1973)] alkalmaztunk, amely a Bachem cég terméke. Az aminosavszármazék HOBt- vagy HOOBt-észterezéssel történő aktiválását közvetlenül a gép gyártója szállította patronokban végeztük úgy, hogy az aminosav HOBt vagy HOOBt patronban lévő elegyéhez diizopropil-karbodiimid dimetil-formamidos oldatát adtuk.

Alkalmazhatunk azonban kész Fmoc-aminosavOOBt-észtereket is (247 573 számú publikált európai szabadalmi bejelentés). Az Fmoc-védőcsoportot a reakcióedényben hasítottuk le, piperidin 20%-os dimetil-formamidos oldatával. A reakcióképes aminosav-származék feleslege 1,5-2,5 ekvivalensnyi volt. Ha a kapcsolódás nem volt teljes, ugyanúgy, mint a Boc-módszer esetén is, megismételtük.

Az (I) általános képletű peptidek - egyenként vagy egymással kombinálva - bradikininantagonista hatást mutatnak, amelyet különböző modelleken lehet tesztelni (Handbook of Exp. Pharmacol. Vol. 25, Springer Verlag, 1970, 53-55. oldal), így például az izolált patkányuteruszon, tengerimalac ileumán vagy a tengerimalac izolált pulmonális artériáján.

Az izolált Artéria pulmonalison végzett kísérletekhez Dunklin Hartley fajtájú, 400-450 g testtömegű tengerimalacokat tarkón csapással megöltünk. A mellkast felnyitottuk, és az Artéria pulmonalist óvatosan kipreparáltuk. A környező szöveteket eltávolítottuk, és az artériát 45°-os szögben spirálszerűen felvágtuk.

A 2,5 cm hosszúságú, 3-4 mm szélességű ércsíkot 5 10 ml térfogatú szervfürdőben rögzítettük. A fürdő

Ringer-féle oldattal van töltve, amelynek összetétele az alábbi:

NaCl	mmol/1 154
KC1	5,6
CaCl₂	1,9
NaHCO₃	2,4
glükóz	5,0
Az oldaton keresztül 95 térfogat% O₂- és 5 térfo-

gat% CO₂-tartalmú gázelegyet buborékoltattunk, és az oldatot 37 °C-ra melegítettük. A pH 7,4, a csík előterhelése 1,0 g volt.

Az izotonikus összehúzódás változását emelővel HF-modem típusú átmérőre (gyártja: Hugó Sachs) köz20 vetítettük, és kompenzációs írókészülékkel (BEC, Goerz Metrawatt SE 460) regisztráltuk.

Egyórás kiegyenlítődés után a kísérlet kezdődött. Miután az ércsíkok a 2x10 ⁷ mol/1 koncentrációjú bradikininnel szembeni maximális érzékenységüket el25 érték (bradikinin az ércsík összehúzódását eredményezi), a peptideket 5χ 10^-8— 1 χ 10 ⁵ dózisokban 10 percen át hatni hagyjuk, és újabb bradikininadagolás után a bradikinin hatásának csökkenését vizsgáltuk, és a kontrollal hasonlítottuk össze.

Esetleges parciálagonista hatás kimutatására a peptideket 1 χ 10^-5 és 1 χ 10³ közötti dózisban alkalmaztuk.

A dózis/hatás görbékből kiszámított IC₅₀-értékeket (pulmonális artéria) az 1. táblázatban adjuk meg.

1. táblázat

Példa száma	Szekvencia	!C₅o
1.	Fmoc-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH	9,9x10-’
2.	Fmoc-Aoc-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH	8,5x10-’
3.	2,2-(Dibenzil)-acetil-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH	1,7x10-«
4.	Ciklohexil-karbonil-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH	9,1x10’
5.	Fmoc-E-aminokaproil-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH	4,1x10-’
6.	N,N-dibenzil-Gly-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH	2,2x10-«
7.	Fmoc-D-Aoc-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH	2,2x10-«
8.	2-(4-Izobutil-fenil)-propionil-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH	2,5x10-«
9.	2-R-(terc-Butil-szulfonil-metil)-3-(l-naftil-propionil-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic- Arg-OH	1,2x10-«
10.	Indol-3-il-acetil-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH	8,8x10’
11.	2-(4-Izobutil-fenil)-propionil-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-D-Tic-Oic-Arg-OH	1,8x10-«
12.	2-(4-Izobutil-fenil)-propionil-6-aminohexanoíl-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic- Arg-OH	7,8x10-’
13.	6-(4-Benzoil-benzoilamino)-hexanoit-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH	2,7x10-«
14.	Fmoc-Aeg(Fmoc)-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH	1,5x10-«
15.	Fmoc-(4-Amino-ciklohexil-karbonil)-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH	2,5x10-«
16.	1,8-Naftálimido-acetil-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH	7,8x10-’

HU 217 613 Β

7. táblázat (folytatás)

Példa száma	Szekvencia	IC50
17.	2R-(terc-Butil-szulfonil-metil)-3-(l-naftil)-propionil-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic- Oic-Arg-OH	8,3x10-’
18.	Indol-3-il-acetil-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH	6,2x10’
19.	Fmoc-(4-amino-ciklohexil-karbonil)-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH	2,2xl0-⁸
20.	7-Teofillin-acetil-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH	1,4x10-8
21.	N-Benzoil-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH	8,1x10-’
22.	Fmoc-Aeg(Fmoc)-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH	6,6x10-8
23.	Fmoc-D-Lys-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH	1,4x10-8
24.	Fmoc-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH	2,6x10-8
25.	Fmoc-Oic-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH	2,5x10-8
26.	Fmoc-transz-4-aminometil-ciklohexil-karbonil-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH	3,5xl0-⁷

Néhány (I) általános képletű vegyület esetén azt 20 kenységének az 50%-át visszanyerte. Ezt az időt T₅₀az időt is mértük, amely alatt az ércsík, miután a nek nevezik, és a hatás tartósságának mércéje. A T₅₀peptidtartalmú puffért „üres” pufferre lecseréltük, a kiszámított értékeit a 2. táblázatban adjuk meg.

2xl0~⁷ mol/1 baradikininnel szembeni korábbi érzé2. táblázat

T₅₀-értékek (pulmonális artéria)

Példa száma	Szekvencia	T₅o
1.	F moc-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-T ic-Oic-Arg-OH	143,3 min
2.	Fmoc-Aoc-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tíc-Oic-Arg-OH	253,3 min
3.	2,2-(dibenzil-acetil)-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH	67,3 min
4.	Ciklohexil-karbonil-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH	76,7 min
5.	Fmoc-c-aminokaproil-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH	314,4 min

Néhány kiválasztott vegyülettel in vivő vizsgálatot is végeztünk a gyulladáscsökkentő hatás meghatározására, a Carrageenan-mancsödémateszt segítségével.

Az akut szisztémás lázcsökkentő hatás kimutatására a patkányokon végzett fenti teszt Winter C. A. és munkatársai szerinti változata [Proc. Soc. Exp., Bioi. N.Y. 111, 544 (1962)] szolgál. Hímnemű, körülbelül 170 g testtömegű Sprague-Dawley-patkányoknak 5-ös csoportokban a vizsgálni kívánt vegyületeket beadtuk (szubkután, desztillált vízben oldva, 1 ml/kg testtömeg). 15 perccel később, a mancs kiindulási térfogatának megmérése után az éterrel elaltatott állatok bal hátsó mancsába 0,1 ml 0,5%-os Carrageenan-oldatot befecskendeztünk. Három óra, illetve hat óra elteltével mérjük a duzzadás okozta térfogat-növekedést. A kontroll csak hordozóanyagot kapott. A mancs térfogatát ml-ben adjuk meg a 3. táblázatban átlagértékekkel és szabványeltéréssel.

3. táblázat

Pclda száma	Dózis (mg/kg)	Mancstcrfogat (ml)	Térfogatváltozás
3 óra	6 óra után (ml)
Kontroll 1.		1,28 ±0,06	0,67±0,16	0,42±0,10
0,1	l,35±0,l 1	0,13±0,06	0,14±0,05
1,0	l,36±0,03	0,11 ±0,05	0,08±0,01
Kontroll		1,33 ±0,02	0,50±0,10	0,44±0,03
0,1	l,32±0,06	0,13±0,04	0,29±0,08
	1,0	l,29±0,03	0,19±0,06	0,27±0,06
Kontroll		l,24±0,04	0,62 ±0,11	0,54±0,ll
3.	0,1	1,23 ±0,05	0,19±0,07	0,22±0,14

HU 217 613 Β

3. táblázat (folytatás)

Pclda száma	Dózis (mg/kg)	Mancstcrfogat (ml)	Térfogatváltozás
3 óra	6 óra után (ml)
Kontroll 4.	0,1	l,24±0,04 1,21 ±0,05	0,62 ±0,11 0,17±0,08	0,54±0,l 1 0,31±0,10
Kontroll 5.	o,l 1,0	1,33 ±0,02 l,38±0,08 l,33±0,09	0,50±0,10 0,18 ±0,04 0,13 ±0,03	0,44±0,03 0,20±0,06 0,17±0,06
Kontroll 6.	0,1	l,24±0,04 1,25 ±0,02	0,62 ±0,11 0,31 ±0,06	0,54±0,l 1 0,40±0,ll

A találmány szerint előállítható peptidek terápiás alkalmazhatósága az összes olyan kóros állapotra kiterjed, amelyet a bradikinin és rokon hatású peptidek közvetítenek, kiváltanak vagy fokoznak. Idetartoznak egyebek között a traumák, így sebek, égési sérülések, továbbá kiütések, eritémák, ödémák, angina, artritisz, asztma, allergiák, rinitis, sokk, gyulladások, alacsony vérnyomás, fájdalom, viszketés és a spermiumok megváltozott mozgékonysága.

Ezért a találmány az (I) általános hatóanyagokat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására is kiterjed.

A készítmények egy vagy több (I) általános képletű hatóanyagot tartalmaznak hatékony dózisban, a gyógyászatban alkalmazható szerves vagy szervetlen hordozóanyag mellett.

Az alkalmazás enterálisan, parenterálisan - így például szubkután, im. vagy iv. -, szublingválisan, epikután, nazálisán, rektál, hüvelyen belül, intrabukkálisan vagy inhalációval történhet. A dózis a melegvérű fajától, testtömegétől, korától és az alkalmazás módjától függ.

A gyógyászati készítményeket ismert oldási, keverési, granulálási vagy drazséképző műveletekkel állítjuk elő.

Orális beadás vagy a nyálkahártyákon keresztül történő alkalmazás céljából a hatóanyagokat a szokásosan ilyen célra alkalmazott hordozóanyagokkal, stabilizátorokkal vagy közömbös hígítószerrel összekeveijük, és ismert módon alkalmazható készítménnyé alakítjuk. Alkalmas formák például a tabletták, drazsék, kapszulák, vizes, alkoholos vagy olajos szuszpenziók vagy vizes, alkoholos vagy olajos oldatok. Közömbös hordozóként például az alábbiak alkalmazhatók: gumiarábikum, magnézium-oxid, magnézium-karbonát, kálium-foszfát, tejcukor, glükóz, magnézium-sztearil-fümarát vagy keményítő, előnyösen kukoricakeményítő. Az elkészítés során mind száraz, mind nedves granulálási alkalmazhatunk. Olajos hordozóanyagként vagy oldószerként például növényi vagy állati eredetű olajokat, így napraforgóolajat vagy csukamájolajat alkalmazhatunk.

Helyi alkalmazás céljára a készítmény például vizes vagy olajos oldat, lotion, emulzió vagy zselé, kenőcs, zsíros kenőcs, vagy amennyiben lehetséges spray (permet) lehet, adott esetben tapadásjavító polimer adalékkal.

Intranazális alkalmazás céljára a hatóanyaghoz az erre a célra alkalmas adalékokat, így stabilizátort vagy közömbös hígítószert adunk, és alkalmas készítménynyé, így vizes, alkoholos vagy olajos szuszpenzióvá vagy oldattá alakítunk. Vizes intranazális készítményben kelátképzőt, etilén-diamin-N,N,N’,N’-tetraecetsavat, citromsavat, borkősavat vagy a felsoroltak sóit adhatjuk. Az oldat adagolása adagolóporlasztó segítségével történhet, vagy a viszkozitást növelő adalékkal ellátott oldatot cseppentetővel adagoljuk, vagy kenhető gélt vagy orrkrémet készítünk.

Inhalációs alkalmazáshoz közömbös nyomógázzal permetezhető készítményt állítunk elő.

Intravénás, szubkután, epikután vagy intradermális alkalmazás céljára az aktív vegyületből vagy fiziológiailag elviselhető sójából oldatot, szuszpenziót vagy emulziót készítünk, adott esetben a gyógyszerkészítésben szokásos segédanyagokkal, így izotonikus szerrel, a pH-érték beállításához alkalmas adalékkal, oldódást elősegítő adalékkal, emulgeátorral vagy egyéb segédanyaggal.

Tekintettel arra, hogy az új hatóanyagok közül néhánynak testnedvekben rövid a felezési ideje, célszerű, ha befecskendezhető, késleltetett hatású gyógyszert készítünk. Ilyenek például olajos kristályszuszpenziók, mikrokapszulák, rodok vagy implantátumok; az utóbbiakhoz szövetbarát polimerek, különösen biológiailag lebontható polimerek alkalmazhatók, amelyek például politejsav-poliglikolsav-kopolimer- vagy humán-albumin-alapúak lehetnek.

Helyileg és inhalációval alkalmazható készítmények általában 0,001-5 mg/ml, szisztemikus formák 0,001-10 mg/kg hatóanyag-tartalmúak.

Az aminosavak rövidítései a peptidkémiában szokásos hárombetűs kódnak felel meg [Europ. J. Biochem. 138, 9 (1984)]. A további rövidítések az alábbi jelentésűek:

Aeg N-(2-amino-etil)-glicin ε-Ahx ε-amino-hexanoil-csoport

Aoc cisz,endo-2-azabiciklo[3.3.0]oktán-3Skarbonil-csoport,

Boc terc-butoxikarbonil-csoport

Bút terc-butil-csoport

Bzl benzilcsoport

Cbz benzil-oxi-karbonil-csoport

Dic dihidroindol-karbonil-csoport

DMF dimetil-formamid

DOMT O-metil-(D)-treonil-csoport

Dnp 2,4-dinitro-fenil-csoport

HU217613 Β

Fmoc	9-fluorenil-metil-oxi-karbonil-csoport
Hyp	hidroxi-prolin
MDY	O-metil-(D)-tirozil-csoport
Me	metilcsoport
4-Mebzil 4-metil-benzil-csoport
Mtr	4-metoxi-2,3,6-trimetil-fenil-szulfonil- csoport
Mts	mezitilén-2-szulfonil-csoport
NMP	N-metil-pirrolidin
Oic	cisz,endo-oktahidroindol-2-karbonil-csoport
Opr	izoxazolidin-2-il-karbonil-csoport
Pál	piridil-alanil-csoport
Pmc	2,2,5,7,8-pentametil-kromán-6-szulfonil- csoport
Tbg	terc-butil-glicil-csoport
TBTU	2-( 1 H-benzotriazol-1 -il)-1,1,3,3-tetrametilurónium-tetrafluor-borát
tBu	terc-butil-csoport
TFA	trifluor-ecetsav
Tcs	4-metil-fenil-szulfonil-csoport
Thia	2-tienil-alanil-csoport
Tic	l,2,3,4-tetrahidro-izokinolin-3-karbonil- csoport
TOTU	O-[(ciano-/etoxi-karbonil/metilidén)-amino]1,1,3,3-tetrametil-urónium-tetrafluor-borát

Az alábbi példákkal a találmány szerint előállítható peptidek szilárd fázison történő szintézisének előnyös módszereit közelebbről ismertetjük anélkül, hogy a találmányt ezekre a példákra korlátoznánk.

Egyebek között az alábbi aminosavszármazékok kerültek alkalmazásra: Fmoc-Arg(Mtr)-OH, Fmoc-DArg(Mtr)-OH, Fmoc-D-Arg(Pmc)-OH, Boc-(D)-ArgOH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Hyp-OH, Fmoc-ProOObt, Fmoc-Gly-OObt, Fmoc-Ser(tBu)-OObt, Fmoc(D)-Tic-OH, Fmoc-Aoc-OH, Fmoc-Thia-OH, FmocOic-OH, Fmoc-Lys(BOC)-OH, Fmoc-a-Ahx-OH.

1. példa

Fmoc-D-A rg-A rg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-TicOic-Arg-OH

A cím szerinti vegyületet az Applied Biosystems cég 430A típusú peptidszintetizáló gépével állítjuk elő az Fmoc-módszer szerint, Fmoc-Arg(Mtr)-OH-val észterezett p-benzil-oxi-benzil-alkohol-gyantán (gyártja: Novabiochem; terhelés: körülbelül 0,5 mmol/g gyanta), az Fmoc-módszemek megfelelően módosított szintézisprogram segítségével.

A szintetizáló gép patronjaiba 1 mmol szabad karboxilcsoportos aminosavszármazékot és 0,95 mmol HOObt-ot mérünk be. Az aminosav aktiválását közvetlenül a patronban végezzük úgy, hogy az aminosavat 4 ml dimetil-formamidban oldjuk, és 2 ml 0,55 mólos dimetil-formamidos diizopropil-karbodiimid-oldatot adagolunk.

A többi aminosav HOObt-észterét 6 ml N-metilpirrolidinben oldjuk, és utána - akár az in situ előaktivált aminosavat - az előzetesen piperidin 20%-os DMF-os oldatával védőcsoportjaitól megszabadított gyantához kötjük. A szintézis befejeztével a peptidet trifluor-ecetsavval, kationfogóként tioanizolt és etándiolt alkalmazva lehasítjuk a gyantáról. A trifluorecetsav eltávolítása után kapott maradékot többszörösen etil-acetátban digeráljuk, majd centrifugáljuk. A maradékot Sephadex LH 20 adszorbensen 10%-os ecetsavval kromatografáljuk. A tiszta peptidet tartalmazó frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. MS(FAB): 1526,9

2. példa

Fm oc-Aoc-D-A rg-A rg-Pro-Hyp-Gly- Th ia-Ser-DTic-Oic-A rg- OH

Úgy állítjuk elő a cím szerinti terméket, hogy az 1. példához analóg módon előállított Fmoc-D-Arg(Pmc)Arg(Mtr)-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser(but)-D-Tic-OicArg(Mtr)-gyanta szekvenciájú peptidgyantáról először az N-terminális Fmoc-védőcsoportot piperidinnel és dimetil-formamiddal lehasítjuk, a gyantát dimetil-formamiddal mossuk, az Fmoc-Aoc-OH-t a TOTU uróniumkapcsoló reagens segítségével rákondenzáljuk, végül a peptidet trifluor-ecetsav, trimetil-szilil-bromid és m-krezol elegyével lehasítjuk a gyantáról. A tisztítást az 1. példában leírtak szerint végezzük.

MS(FAB): 1663,8

Az alábbi peptideket a 2. példa szerint állítjuk elő.

3. példa

Dibenzil-acetil-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-SerD- Tic-Oic-Arg- OH MS(FAB): 1526,7

4. példa

Ciklohexil-karbonil-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-ThiaSer-D-Tic-Oic-Arg-OH MS(FAB): 1414,7

5. példa

Fmoc-z-aminohexanoil-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-GlyThia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH MS(FAB): 1639,6

6. példa

N,N-Dibenzil-glicil-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-ThiaSer-D-Tic-Oic-Arg-OH MS(FAB): 1542,2

7. példa

Fmoc-D-A oc-A rg-A rg-Pro-Hyp-Gly-Th ia-Ser-DTic-Oic-A rg-OH MS(FAB): 1663,8

8. példa

2-(4-Izobutil-fenil)-propionil-Arg-Arg-Pro-HypGly- Th ia-Ser-D- Tic-Oic-A rg- OH MS(FAB): 1493

9. példa

2-R-(Terc-butil-szulfonil-metil)-3-(l-naftilpropionil-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-OicArg-OH

MS(FAB): 1621

HU217613 Β

10. példa

Indol-3-il-acetil-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-SerD-Tic-Oic-Arg-OH MS(FAB): 1462

11. példa

2-(4-Izobutil-fenil)-propionil-D-Arg-Arg-Pro-HypGly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH MS(FAB): 1493

12. példa

2-(4-Izobutil-fenil)-propionil-6-aminohexanoil-DArg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-Arg-OH MS(FAB): 1606

13. példa

6- (4-Benzoil-benzoil-amino)-hexanoil-D-Arg-ArgPro-Hyp- Gly- Th ia-Ser-D- Tic- Oic-A rg- OH MS(FAB): 1625,8

14. példa

Fmoc-Aeg(Fmoc)-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-ThiaSer-D-Tic-Oic-A rg- OH MS(FAB): 1849,8

15. példa

Fmoc-(4-amino-ciklohexil-karbonil)-D-Arg-ArgPro-Hyp-Gly- Thia-Ser-D- Tic- Oic-A rg- OH MS(FAB): 1652

16. példa

1,8-Naftalim ido-acetil-D-A rg-A rg-Pro-Hyp-GlyThia-Ser-D- Tic-Oic-A rg-OH MS(FAB): 1542,3 / 7. példa

2-R-(terc-Butil-szulfonil-metil)-3-(l-naftil)-propion il-D-A rg-A rg-Pro-Hyp-Gly- Th ia-Ser-D- Tic- Oic-A rgOH

MS(FAB): 1621,9

18. példa

Indol-3-il-acetil-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-ThiaSer-D- Tic-Oic-A rg-OH MS(FAB): 1462

19. példa

Fmoc-(4-amino-ciklohexil-karbonil)-Arg-Pro-HypGly- Th ia-Ser-D- Tic-Oic-Arg- OH MS(FAB): 1496

20. példa

7- teofillinil-acetil-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-DTic-Oic-A rg-OH

MS(FAB): 1369

21. példa

N-Benzoil-D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-DTic-Oic-Arg-OH MS(FAB): 1410

22. példa

Fmoc-Aeg(Fmoc)-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-DTic-Oic-Arg- OH MS(FAB): 1694

23. példa

Fmoc-D-Lys-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-TicOic-Arg-OH MS(FAB): 1500

24. példa

Fmoc-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-Oic-ArgOH

MS(FAB): 1371

25. példa

Fmoc-Oic-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D-Tic-OicArg-OH

MS(FAB): 1523

26. példa

Fmoc-transz-4-aminometil-ciklohexil-karbonilA rg-Pro-Hyp- Gly- Th ia-Ser-D- Tic-Oic-Arg- OH MS(FAB): 1511

Claims

1. (I) általános képletű peptidek

Z-P-A -Arg-Pro-Hyp-Gly-Thia-Ser-D- Tic-Oic-A rgOH (I) e képletben

A jelentése Arg, D-Arg, D-Lys vagy kémiai kötés,

P jelentése kémiai kötés vagy-NR²-(U)-CO- általános képletű csoport, amelyben -NR²U jelentése oktahidroindol-l,2-ilén- vagy 2-azabiciklo[3.3.0]oktán2,3-ilén-csoport vagy U jelentése 1-6 szénatomos alkiléncsoport vagy 3-8 szénatomos cikloalkiléncsoport, és R² jelentése hidrogénatom vagy 9-fluorenil-metil-oxi-karbonil-amino-csoporttal szubsztituált 1-6 szénatomos alkilcsoport és

Z jelentése

i) X^lX²CH-CO- általános képletű csoport, amelyben

X¹ és X² jelentése egymástól függetlenül H, fenilCi-C₄-aíkilcsoport, 1-4 szénatomos alkilcsoport, 1-6 szénatomos alkilcsoporttal egyszeresen szubsztituált fenilcsoport, indolil- vagy dimetilxantinil-csoport vagy

-NR’R” általános képletű csoport, amelyben R’ és R” jelentése fenil-C₁-C₄-alkilcsoport, vagy X¹ és X² együttesen 3-6 szénatomos alkiléncsoportot alkot;

ii) X³-NH—(CH₂)_n-CO- általános képletű csoport, amelyben n értéke 1 -7,

X³ jelentése 4-benzoil-benzoil-csoport vagy iii) 9-fluorenil-metil-oxikarbonil-csoport, C|-C₆-alkil-szulfonil-C,-C₄-alkil-[(naftil)Cj -C₄-alkanoil]-csoport,

HU 217 613 Β naftalimido-C, -C₄-alkanoil-csoport vagy benzoilcsoport, és e vegyületek fiziológiailag elfogadható savaddíciós sói.

2. Eljárás az 1. igénypont szerinti (I) általános kép- 5 letű peptidek előállítása, azzal jellemezve, hogy az adott esetben védett aminosavakat az (I) általános képletnek megfelelő sorrendben - kívánt esetben valamely ismert hordozón - kondenzáljuk, majd a kapott peptidet adott esetben lehasítjuk a gyantáról, és/vagy a kapott pepiidről a védőcsoportokat adott esetben lehasítjuk, és kívánt esetben a kapott (I) általános képletű vegyületet fiziológiailag elfogadható savaddíciós sóvá alakítjuk.

3. Gyógyszerkészítmény, amely hatóanyagként legalább egy (I) általános képletű vegyületet tartalmaz hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal együtt.

4. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 2. igénypont szerint előállított, 1. igénypont szerinti vegyületet vagy fiziológiailag elfogadható savaddíciós sóját hordozó- és/vagy egyéb se10 gédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.