HU216020B

HU216020B - Eljárás vCD44 sejtfelületi protein elleni antitesteket tartalmazó immunszuppresszív gyógyszerkészítmények előállítására, és ilyen antitesteket tartalmazó diagnosztikai készlet

Info

Publication number: HU216020B
Application number: HUP9203337A
Authority: HU
Inventors: Peter Herrlich; Helmut Ponta; Margot Zöller
Original assignee: Boehringer Ingelheim International Gmbh.; Deutsches Krebsforschungszentrum; Forschungszentrum Karlsruhe Gmbh
Priority date: 1991-10-23
Filing date: 1992-10-22
Publication date: 1999-04-28
Also published as: EP0538754A2; DE4134982A1; IL103510A0; KR100252620B1; EP0538754B1; DE59209129D1; ZA928162B; GR3026526T3; ATE162079T1; KR930007460A; CA2081150A1; JPH05310596A; HUT63063A; AU659687B2; TW273514B; CA2081150C; NO924103L; ES2111031T3; EP0538754A3; US5951982A

Abstract

A találmány tárgya eljárás egy emlős variáns CD44 felületi prőtein(vCD44) vagy ennek egy része ellen irányűló antitestet minthatóanyagőt tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására, amely abbanáll, hőgy az említett, ismert módőn előállítőtt antitestet agyógyszerkészítésben szőkásősan alkalmazőtt egy vagy többsegédanyaggal összekeverve emlősök szervezetében (beleértve az embertis) mműnszűppresszió előidézésére szőlgáló gyógyszerkészítménnyéalakítják. A találmány tárgyát képezi tővábbá az említett antitestekettartalmazó, imműnregűlációs zavarők felismerésére és/vagy kőntrőlljáraszőlgáló diagnősztikai készlet. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás a CD44 glikoproteinek variánsai (vCD44) ellen irányuló antitesteket, különösen monoklonális antitesteket mint hatóanyagokat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására immunszuppresszió előidézésére emlősállatoknál és embernél. A találmány tárgya továbbá az ilyen antitesteket tartalmazó diagnosztikai készlet immunregulációs zavarok felismeréséhez.

A CD44 egy, a sejtfelületen lokalizált glikoprotein, amelyet eredetileg „lymphocyte homing receptor”-ként írtak le, és jelentése szükséges limfociták vénák bizonyos mucosus endotélsejtjein (Peyer-folt; Peyer’s patch vagy Peyer plaque, illetve follikulusz limfocita aggregátum; Folliculi lymphatici aggregati), illetve a nyirokcsomók posztkapilláris vénáin végbemenő adhéziójánál [S. T. Jalkanen et al., J. Immunoi, 16, 1195- 1202 (1986); R. L. Camp et al., J. Exp. Med., 173, 763-766 (1991)]. Ebből kifolyólag CD44 glikoproteinnek a limfociták érésével és aktiválásával kapcsolatos, illetve az összes limfoblasztok fokozott migrációs képességében közreműködő hatást kifejtő szerepet tulajdonítanak [lásd például R. L. Camp et al., 1991, előbb idézve; S. Huet et al., J. Immunoi., 143, 798- 801 (1989)], és kapcsolódási helyként kell szerepelnie más adhéziós molekulák esetén is [Y. Shimizu et al., J. Immunoi., 143, 2457-2463 (1989)]. Mostanáig sem tisztázták azonban egyértelműen a CD44 minden ilyen funkcióját.

Nemrég sikerült megállapítani olyan patkány daganatsejtekről, amelyek a nyirokrendszeren keresztül áttételt okoznak (BSp73 sejtek patkány spontán hasnyálmirigy-adenokarcinómából), hogy ezek a sejtek a CD44 variánsait (vCD44) fejezik ki, és felelősek a daganatsejtek terjesztéséért. Más daganat-sejtvonalaknál ugyancsak bizonyíthatók voltak ezek a kapcsolatok.

Bizonyítható volt, hogy ez a vCD44 glikoprotein egy, a priori áttételt nem okozó daganatnak áttételre való képességet kölcsönöz, míg a standard típusú CD44 (sCD44) erre nem képes. Tehát kiindulhatunk abból, hogy a vCD44 az sCD44-gyel ellentétben egy áttétel-specifikus protein, amely daganatoknak azt a képességet kölcsönzi, hogy azok a nyirokpályákon keresztül áttételt okozzanak [U. Günthert et al., Cell, 65, 13-24(1991)].

A patkány vCD44 glikoprotein szerkezetének további felderítése egészen a DNS- és aminosav-szekvenciák végleges azonosításáig U. Günthert és munkatársainak sikerült (1991, előbb idézve) a BSp73 patkány sejtrendszer alapján, amely két, morfológiailag, illetve fenotípusosan különböző, genetikusán azonos egyedekből származó (szingenikus) sejtvariánsból áll: egy áttételt nem okozó AS variánsból (BSp73AS) és egy áttételt okozó ASML variánsból (BSp73ASML) [S. Matzku et al., Cancer Research, 49, 1294- 1299 (1989)].

Erre a célra monoklonális antitesteket (mAb) állítottak elő, amelyek az áttételt okozó BSp73ASML variánson lévő antigén determinánst felismerik.

Kinyertek mind a primer tumorból (BSp73AS sejtekből álló, szubkután áttételt nem okozó csomók), mind ennek egy áttételéből (BSp73ASML sejtek, amelyek nyirokcsomókban és tüdőben okoznak áttételt) származó sejtvonalakat is. Előállítottak monoklonális antitesteket, amelyek a BSp73ASML sejtek membránproteinjei ellen irányulnak S. Matzku et al., 1989, előbb idézve). Egyet ezek közül az mAb-ek közül, amelyek csak a BSp73ASML epitópját képesek felismerni, de a BSp73AS sejtek vagy más daganatot nem okozó sejtek epitópjait nem, felhasználtak egy BSp73ASML sejtek poly(A)+ RNS-éből és egy alkalmas vektorrendszerből létrehozott E. coli cDNS expressziós könyvtár szűrésére (screening). Ezen a módon azonosítható volt egy klón (pMeta- 1), amely a teljes 3207 bp hosszúságú cDNS-t tartalmazza, és amely egy 162 aminosavból álló járulékos domént kódol. Ez a dómén sem sCD44 sejtekben, sem más, áttételt nem okozó daganatsejtekben nem található meg, és tartalmazza az mAb-specifikus, epitópkódoló régiót. Különböző szövetek sejtjeiből nyert mRNS preparátumok és a cDNS klónokból nyert DNS-től eltérő minták ezzel kivitelezett mRNS: DNS hibridizálásai alapján megállapították, hogy a vCD44 az sCD44 egy száltoldásos variánsa (azaz az ilyen variáns tartalmaz még egy járulékos exont), és a vCD44 RNS-ek expreszsziója áttételek keletkezésével jár. Ezért biztos, hogy a 486 bp hosszúságú inszertum által kódolt járulékos extracelluláris dómén (224-385. aminosavak a pMeta- 1 -ben) a vCD44 felületi glikoproteinnek a daganat kialakulását meghatározó része.

Az áttételt okozó daganatnövekedés (patkány adenokarcinóma) elnyomható olyan monoklonális antitestekkel végzett immunizálás után, amelyek az előbb említett epitópot felismerik, illetve amelyek specifikusan a vCD44 ezen extracelluláris területével reagálnak [S. Reber et al., Int. J. Cancer, 46, 919-927 (1990); Immunobiology, 183 (3-4), 221-222, abst. H. 17(1991)].

Ezen variáns extarcelluláris, patkányban lévő domének (pMeta- 1, illetve rMeta- 1) azonosítása lehetővé teszi az ezzel ekvivalens humán nukleotid- és aminosav-szekvenciák tisztázását is.

Egy, a patkány vCD44 dómén DNS-éből levezethető cDNS szonda segítségével, adott esetben szigorú feltételek mellett, különböző faj specifikus (például humán, patkány, egér) sejtvonalakból származó genomiális DNS-sel végzett hibridizálással találhatók homológ területek ezekben a DNS-ekben. Egy ilyen próba azután használható különböző humán sejtvonalakból, különösen daganat-sejtvonalakból, például nagysejtes tüdőkar cinómából, melanómából, vastagbélrákból, emlődaganatokból és keratinocitákból származó RNS-sel végzett higridizáláshoz. Ezen a módon minden további nélkül találhatunk egy alkalmas humán sejtvonalat, például ilyen egy nagysejtes tüdőkarcinóma, amely a patkány cDNS próbával homológ szekvenciákat tartalmaz. PCRrel (polymerase chain reaction; polimeráz láncreakció) egy meghatározott hoszszúságú és meghatározott szekvenciájú DNS-szakaszoknak DNS-molekulák keverékéből egy DNS polimeráz és egy megfelelő primer alkalmazásával végzett szelektív feldúsítására szolgáló ismert in vitro eljárással kaphatók különböző humán sejtvonalakból (például nagysejtes tüdőkarcinómák sejtjeiből, melnómákból, vastagbél-karcinómákból, immortalizált

HU 216 020 Β keratinocitákból) RNS preparátumok olyan cDNS-ei, amelyek sCD44-et és vCD44-et kódolnak.

Egy ilyen, PCR-rel nyert cDNS ismert módszerek szerint ligálható egy megfelelő klónozóvektorba, és az ezzel transzformált gazdasejtek, előnyösen baktériumok, például E. coli megfelelő tenyésztése után végül szekvenálható. Ilyen módon az összes lehetséges daganatsejt, illetve sejtvonal, különösen az áttételt okozó tulajdonságokkal rendelkezők közül kiválasztott legkülönbözőbb humán sejtekből nyerhetünk olyan DNS-szekvenciákat, amelyek vagy egy olyan 350 aminosav nagyságrendű tartományba eső ismert nagyságú normál humán sCD44 glikoproteint kódolnak [I. Stamenkovic et al., Cell, 56, 1057-1062 (1989)], amely egy 85 kD nagyságrendű extracelluláris domént tartalmaz [S. Jakanen et al., J. Cell. Bioi., 105, 983-990 (1987)], vagy egy olyan humán vCD44 glikoprotein-variánst kódolnak, amely egy eltérő hosszúságú, különösen 850 bp és 1,5 kb közötti, például 1014 bp (vagy 338 aminosav) hosszúságú járulékos extracelluláris domént tartalmazhat, és amely a normál sCD44 glikoproteint kódoló DNS-szekvencián belül, például a 782 és 783 helyzetű nukleotidok közé van inszertálva (4. ábra). Egy ilyen DNS-szekvencia több, például öt doménban is előfordulhat, amelyek különböző exonokat képeznek, és amelyek mind állati (például patkány vagy egér) sejtvonalakban, mind humán sejtvonalakban megtalálhatók.

A 4.A ábrán példaként bemutatott cDNS-t, amely homológ a humán daganatsejtvonalakból leghosszabban kinyert variánsrésszel, a BSp73ASML patkány sejtvonalból PCR-en át izoláltuk. Az ebből levezetett aminosav-szekvenciának egy humán daganatsejtvonalakból kapott humán klón aminosav-szekvenciájával való közvetlen összehasonlítása azt mutatja, hogy az I dómén 83%-os, a II dómén 83%-os, a III dómén 71%-os, a IV dómén 82%-os és az V dómén 66%-os homológiát mutat a patkány DNS-szekvenciával. Ebből összegezve az következik, hogy a patkány szekvenciával összehasonlítva a humán szekvenciák körülbelül 76%-a a variáns tartományokban konzerválva van. A megfelelő patkány szekvenciák, amelyek a daganatáttételt okozó képességet hordozzák (U. Günthert et al., 1991, előbb idézve), a 258-tól a 420. aminosavig terjednek, és ezeket a II és III domének kódolják.

A szakember számára nyilvánvaló, hogy olyan polivagy monoklonális antitestek, amelyek specifikusan ezeket az epitópokat, azaz vCD44 különböző száltoldásos variánsain lévő ezen járulékos extracelluláris területet felismerik és reagálnak azzal, és amelyek radioizotópokkal jelölhetők és/vagy citocid vagy citotoxikus hatású anyagokkal konjugálva lehetnek, az ember áttételt okozó daganatos eseményeinél diagnosztikai és gyógyászati alkalmazásra kerülhetnek.

A fentiekben röviden ismertetett tényállás a WO 91/17248 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentés tárgyát képezi.

Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy az olyan antitestek, különösen az olyan monoklonális antitestek, amelyek a CD44 különböző áttétel-specifikus variánsaival (vCD44) reagálnak, immunszupresszív hatást fejtenek ki. Ez az új tulajdonság semmiképpen sem volt várható az előbbiekben vázolt tényállás alapján.

A találmány tárgya eljárás egy emlős CD44 áttételspecifikus variánsa vagy ennek egy része elleni monoklonális antitesteket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására emlősökben és emberben átmeneti vagy tartós immunszupresszió létrehozására.

E helyütt kihangsúlyozandó, hogy minden tetszés szerinti, állati vagy emberi eredetű variáns CD44 (vCD44) glikoprotein és az ezeket kódoló nukleinsavak (DNS-ek és RNS-ek), melyek inszertként helyezkednek el az sCD44-et kódoló génterületen belül, a szakember számára jelenleg már hozzáférhető, és az átlagos szaktudás keretébe tartozik, hogy ezeket a proteineket és az ezeket a proteineket kódoló nukleinsavakat felhasználja arra, hogy tetszés szerinti antitesteket, különösen monoklonális antitesteket, ezek fragmentumait és származékait a találmány szerinti alkalmazás céljára előállítson és felhasználjon.

A vCD44 fogalom vagy szinonimája, a CD44, illetve sCD44 variáns extracelluláris doménei vagy területei alatt a találmány keretein belül, ha nukleinsavakról van szó, minden, egy vagy több vCD44 proteint vagy domént kódoló RNS-t, DNS-t vagy ezek transzkriptumait értjük, beleértve olyanokat is, melyek mutációk, például deléciók, inszerciók, szubsztitúciók, inverziók, tranzíciók, transzverziók által módosultak, és olyanokat is, amelyek a 4.A. ábrán bemutatott DNS-szekvenciával az ismert, szokásos feltételek mellett hibridizálnak, és azzal komplement, kódolószálakat, amelyek egy olyan proteint kódolnak, mely daganatáttételt okozó tulajdonságokat hordoz, függetlenül attól, hogy ezeknek a nukleinsavaknak az előállítása és izolálása hagyományosan sejttenyészeteken át vagy DNS-rekombinációval, szintetikus vagy félszintetikus eljárásokkal történik.

A vCD44 fogalom vagy szinonimája, a CD44, illetve sCD44 variáns extracelluláris doménei vagy területei alatt, ha egy megfelelő felületi proteinról van szó, a találmány keretein belül minden olyan állatból vagy emberből származó glikoproteint értünk, amely a hagyományos sejttenyészeteken vagy DNS-rekombinációs vagy szintetikus vagy félszintetikus eljárásokon át történő előállításától vagy izolálásától függetlenül járulékos részként jelen van az sCD44-en belül, és egy daganatáttételt okozó tulajdonságot eredményez.

Antitest fogalom alatt mono- vagy polivalens antitestek és mono- vagy poliklonális antitestek értendők, de olyanok is, melyek ezek fragmensei és származékai, beleértve a F(ab’)₂-, Fab’- és Fab-fragmentumokat is, de a legalább két antigén-, illetve epitóp-kötöhellyel rendelkező kiméra vagy hibrid antitesteket (például kvadrómákat, triómákat), interspecies-hibrid antitesteket, antiidiotípusos antitesteket és olyanokat is, amelyek kémiai úton módosítottak, és ezen antitestek származékainak tekinthetők, és amelyek vagy az ismert, hagyományos antitest-termelési eljárásokkal vagy DNS-rekombinációs technika alkalmazásával hibridóma technikákkal vagy „antitest-engineering”-gel vagy szintetikusan vagy félszintetikusan, önmagában ismert módszer szerint előállíthatok, és semlegesítési vagy kötési tulajdonságaikat

HU 216 020 Β tekintve a fent leírt és definiált vCD44 tulajdonságaival rendelkeznek. A sokféle irodalomból csak példaként említünk néhány munkát: Köhler, G. & Milstein, C., Natúré, 256, 495-497 (1975); Biocca, S. et al., EMBO J„ 9, 101- 108 (1990); Bírd, R. E. et al., Science 242, 423-426 (1988); Boss, M. A. et al., Nucl. Acids Rés. 12, 3791-3806 (1984); BoulianneG. L. et al., Natúré, 312, 643-646 (1984); Bukovsky, J. & Kennett, R. H., Hybridoma, 6, 219-228 (1987); Diano, M. et al., Anal. Biochem., 166, 223-229 (1987); Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, 5879-5883 (1988); Jones, P. T. et al., Natúré, 321,522- 525 (1986); Langone, J. J. & Vunakis, Η. V. kiadásában, Methods Enzymol., 121, Academic Press, London, 1987; Morrison, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 6851-6855 (1984); Oi, V. T. & Morrison, S. L., Biotechniques, 4. 214-221 (1986); Riechmann, L. et al., Natúré, 332, 323- 327 (1988); Tramontano, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83, 6736-6740 (1986); Wood, C. R. et al., Natúré, 314,446-449 (1985).

A vCD44 epitópja elleni poliklonális antitestek előállítására vonatkozólag számos eljárás áll rendelkezésre. Ilyen célból például, ismert módon, különböző állatokat injekcióként beadott vCD44-gyel, amely természetes eredetű vagy DNS-rekombináns technikával vagy szintetikusan előállított lehet, vagy fragmenseivel immunizálunk, és ezután a termelt szérumokat, amelyek a kívánt poliklonális antitesteket tartalmazzák, ismert módszerek szerint kinyerjük és tisztítjuk. Alternatív megoldásként intakt sejteket is használhatunk. A vCD44-beadásra jelentkező immunválasz fokozására, az immunizáláshoz kiválasztott állattól függően, különböző adjuvánsok is alkalmazhatók, például Freund-féle adjuváns, ásványi gélek, így például alumínium-hidroxid, felületaktív anyagok, például polianionok, peptidek, olajemulziók, hemocianinok, dinitro-fenol vagy lisolecitin.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazott, a vCD44 egy epitópja elleni monoklonális antitestek bármely olyan tetszés szerinti technikával elóállíthatók, amely az antitestek sejtvonalak tenyésztése útján való előállításához rendelkezésünkre áll. Ilyen ismert technikáknak számítanak például a Köhler, G. & Milstein, C. (1975, korábban idézve) vagy a Taggart és Samloff [Science, 219, 1228- 1230 (1983)] által leírt, hibridóma sejtekkel végzett eljárások vagy a humán B-sejt hibridómákkal végzett eljárások [Kozbor et al., Immunology Today, 4, 72-79 (1983)]. A vCD44 elleni kiméra antitestek például egy egér antigént kötő doménjéból és humán konstans régiókból szerkeszthetők [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 6851-6855 (1984); Takeda et al., Natúré, 314, 452-454 (1985)].

Az antitestek ismert módszerekkel tisztíthatók, például immunabszorbciós vagy immunaffinitás-kromatográfiával, HPLC-vel (High Performance Liquid Chromatography; nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia) vagy ezek kombinációival. Olyan antitest-fragmentumok, melyek a molekula idiotípusát tartalmazzák, ismert eljárások szerint hasonlóképp elóállíthatók. Például F(ab’)₂-fragmentumok a teljes poli- vagy monoklonális antitestek pepszines emésztésével kaphatók. Fab’-fragmentumok úgy kaphatók, hogy például az illető F(ab’)₂fragmens diszulfidhídjait redukáljuk, Fab-fragmentumok pedig például az antitest molekulák papainnal és egy redukálószerrel történő kezelésével állíthatók elő.

Olyan antitestek, fragmenseik vagy származékaik azonosításához és kiválasztásához, amelyek vCD44 egy epitópjával reagálnak, minden ismert eljárás alkalmazható. Felhasználható például az, hogy ezek megfelelő jelölés után detektálhatok, ha izolált vagy tisztított vCD44-hez kötődnek, vagy például poliakrilamid gélen tisztított vCD44 immunkicsapása vagy az, hogy vCD44 elleni antitestek más, vCD44 antitestekkel a vCD44-hez való kötődésért versengenek.

A találmány tárgya még a megfelelő hibridóma sejtvonalak alkalmazása az antitestek előállításához.

A monoklonális antitesteknek immunszupresszióhoz és autoimmun betegségeknél, a hibrid antitesteknek pedig gyógyászati célokra való általános alkalmazására és a DNS-rekombinációs technika során előállított antitestekre vonatkozólag további részleteket illetően a következő szakirodalomra utalunk: Progress in Allergy, Vol. 45, „Monoclonal Antibody Therapy”, 1988 és Seaman, W. E. et al., Ann. Rév. Med., 39, 231-241 (1988).

A vCD44-ben mind állatban (például patkányban), mind emberben meglévő járulékos domének esetében az anyagparamétereket (DNS- és aminosav-szekvencia, elhelyezkedés a komplett vCD44-et kódoló génen belül) és előállításukat tekintve teljesen nyilvánvaló, hogy a szakember számára a jelen leírás alapján lehetővé válik, hogy tetszés szerinti antitesteket, illetve monoklonális antitesteket a fent megadott definíciók értelmében a vCD44 ezen járulékos extracelluláris doménjén lokalizálódon mindegyik epitóphoz előállítson, és ezeket a találmány szerint felhasználja, úgyhogy alkalmazásuk nem korlátozódik bizonyos specifikus antitestekre vagy az ezeket termelő hibrid sejtvonalakra. Például azt az epitópot, amelyet az mAB 1.1ASML felismer, az Ε-E-A-A-T-Q-K-Ε-K-W, illetve Glu Glu Alá Alá Thr Gin Lys Glu Lys Trp aminosav-szekvenciával (lásd 4. A ábra) egzaktul definiálhatjuk.

Ilyenfajta antitesteknek, fragmentumaiknak és származékaiknak a találmány gyógyszerkészítményekben történő felhasználása a technika állása szerint nem ismert, nincs leírva.

A találmány szerint előállított gyógyszerkészítmények, melyek az ilyenfajta antitesteket tartalmazzák, embernél és állatnál előforduló immunregulációs zavarok és megbetegedések kezelésénél kerülnek felhasználásra, ami ezek megakadályozását vagy megelőzését, kontrollját, diagnózisát vagy kezelését is magában foglalja.

Immunszupresszív hatásuk alapján a bemutatott antitestek, illetve az ezeket tartalmazó készítmények olyan betegségek és állapotok megakadályozására, illetve kezelésére alkalmasak, amelyek egy immunválasz átmeneti vagy tartós csökkentését vagy elfojtását igénylik. Különösen széles körű az alkalmazásuk a limfociták vagy a citotoxikus T-sejtek és/vagy immunociták szaporodása aktiválásának elnyomásánál, például az autoimmun betegségek, így például a reumatikus formakörbe tartozó betegségek, sclerosis multiplex, pikkelysömör, atopikus

HU 216 020 Β börgyulladás megakadályozásánál vagy kezelésénél vagy a transzplantált szövetek vagy szervek, mint például szív, vese, tüdő, csontvelő, lép, bőr vagy szaruhártya kilökődésének megakadályozásánál, a transzfúzió közben vagy után jelentkező nemkvánatos reakciók vagy allergiás megbetegedések megakadályozásánál, különösen olyanoknál, amelyek a gyomor-bél traktust érintik, és ott be nem gyógyulóan manifesztálódhatnak, vagy nem gyógyuló, proliferatív és hiperproliferatív megbetegedések és a bőrön manifesztálódó immunológiai hátterű megbetegedések, mint például az ekcémás börgyulladás, csalánkiütés, érgyulladás, szkleroderma megakadályozásánál.

A találmány szerinti alkalmazás azon a nem várt megfigyelésen alapul, hogy egy, a CD44 egy variáns része (vCD44) ellen irányuló antitest in vivő és in vitro erősen csökkentette a T-sejt-függö ésT-sejttöl független immunválaszt. Azáltal, hogy egy vagy több fent leírt antitesttel vagy ennek fragmentumával vagy származékával elérjük, hogy a vCD44 hatása, amelyről feltételezendő, hogy nemcsak a humorális immunválaszért, hanem a proliferáció és a citotoxikus T-sejtek aktiválásáért is szükség van rá, semlegesítödik, ezen antitesteknek a találmány szerinti alkalmazásával lehetséges az immunválasz célzott és - az alkalmazandó antitest-készítmény mennyiségétől, tartósságától és minőségétől függően - az intenzitás és hatástartam tekintetében irányítható szupressziója.

Különösen előnyös ezen antitesteknek a klinikai alkalmazása az előbbiekben részletesebben leírt rendellenességek, megbetegedések és állapotok esetében, azaz akkor, ha egy állati vagy emberi szervezetben immunszupresszió kívánatos.

Egy állati vagy emberi testben előforduló kezelendő beteség vagy rendellenesség vagy befolyásolandó állapot jellegétől és okától függően kívánatos lehet, hogy az antitestkészítményt szisztémásán, lokálisan vagy helyileg az illető szövetbe vagy szervbe juttatva alkalmazzák. Szisztematikus hatás például akkor kívánatos, ha például különböző szervek vagy szervrendszerek szorulnak kezelésre, mint például szisztémás autoimmun betegségek vagy allergiák esetében vagy idegen, nagyobb szervek vagy szövetek átültetésénél. Ezzel szemben lokális hatást akkor kell számításba vennünk, ha egy immunológiai eseménynek csak a helyi megnyilvánulása befolyásolandó, mint például kis területű bőrátültetések és szaruhártya-átültetés, vagy lokális börgyulladás esetében.

Az illető antitestek a szakember által ismert minden enterális vagy parenterális alkalmazási módon beadhatók. A szisztémás alkalmazás számára például az intravénás, intravaszkuláris, intramuszkuláris, intraarteriális, intraperitoneális, orális vagy intratekális út kínálkozik. Egy korábban lokális alkalmazás történhet például szubkután, intrakután, intrakardiális, intralobáris, intramedulláris, intrapulmonális úton vagy a kezelendő szövetekbe vagy szövetekre (kötő-, csont-, izom-, ideg-, epitel- vagy csontszövetek) juttatva. Az immunszupreszszív hatás célzott időtartamától és erősségétől függően az antitest-készítmények adhatók naponta egyszer vagy többször, időszakosan is, több napon, héten vagy hónapon keresztül és eltérő dózisokban is. Az említett alkalmazásokra megfelelő antitest-készítmények előállításához a szakember által ismert injektálható, fiziológiásán elviselhető oldatokat steril formában alkalmazzuk. Egy parenterális injekcióhoz vagy infúzióhoz szükséges, használatra kész oldat előállításához rendelkezésre állnak a vizes izotóniás oldatok, például sóoldat vagy egy gammaglobulin nélküli megfelelő plazmafehérje-oldat. A készítmény lehet azonban liofilizált, illetve száraz preparátum formájában is, amely az ismert injektálható oldatok egyikével közvetlenül a felhasználás előtt steril körülmények között rekonstruálható (részegységekből álló kit). Egy injekcióra, infúzióra vagy perfúzióra szolgáló, találmányunk szerint alkalmazandó antitest-készítmény végleges elkészítése az előbb megadott definíció szerinti, ismert módszerek szerint tisztított antitesteknek az említett fiziológiásán elviselhető olyan oldatok valamelyikével való összekeverésével történik, amelyek adott esetben ismert hordozó- vagy segédanyagokat (például szérumalbumin, glükóz, nátrium-hidrogén-szulfit, EDTA) is tartalmazhatnak.

A beadandó antitestek mennyisége függ a kezelendő betegség vagy rendellenesség vagy befolyásolandó állapot jellegétől és súlyosságától és az illető pácienstől (állat vagy ember). Az alkalmazandó dózisnál, illetőleg dózisegységenként 1- 1000 mg, előnyösen 5-200 mg megfelelő antitestből kell kiindulni, ahogy az más antitestek, illetve monoklonális antitestek esetében is szokásos, viszont 0,01-20 mg/nap és 0,1-100 mg/testtömeg-kg/nap közötti mennyiség is adható hosszabb ideig (napok, hetek, hónapok) kívánt hatások elérése céljából aszerint, hogy milyen intenzitással és milyen időtartamon át akarunk immunszupressziót elérni.

Az ábrák magyarázata:

1. ábra: Patkány-, egér- és humán vCD44-szekvenciák kereszthibridizációja

l.sáv: patkány (májsejtek), 2. sáv: egér (májsejtek), 3. sáv: humán (T47 emlőrák sejtvonal)

2. ábra: vCD44- és sCD44-szekvenciák kifejeződése humán daganat-sejtvonalakban 1. sáv: LCLC103, 2. sáv: LCLC97, 3. sáv: CH3LC, 4. sáv: PLC32M1, 5. sáv: SCLC24,

6. sáv: SCLC18, 7. sáv: BSp73ASML patkány sejtvonalnak, 8. sáv: BSp73AS patkány sejtvonalnak felel meg

GAPDH= glicerinaldehid-foszfát dehidrogenáz, a felvitt RNS-mennyiség relatív menynyi ségi meghatározásához

3. ábra: PCR-amplifikációból kapott, a különböző humán sejtvonalakban kifejezett CD44 RNS-ekkel komplementer cDNS-ek agarózgél-elektroforézises elválasztása

l.sáv: SW620,2. sáv: MeWO,3.sáv: HT29,

4. sáv: LCLC97, 5. sáv: HPKII, 6. sáv: marker (Boehringer Mannheim, Nr. 7)

4. A ábra: Humán LCLC97 sejtvonal vCD44 régiójának DNS- és aminosav-szekvenciája. Össze1

HU 216 020 Β hasonlításként patkány BSpASML tumor sejtvonalat adunk meg, amelyből a kapott DNS származik. A nyilak az 5 exon, illetve Dl- DV domének határait mutatják H= ember, R= patkány

Az epitópot, melyet az 1.1ASML monoklonális antitest felismer, ::::::::::::::: pontozással sötétítvejelöljük

4. B ábra: Az LCLC97 extracelluláris régióján belül lévő öt exon (DI-DV dómén) sematikus ábrázolása

Számadatok= az aminosavak száma

5. ábra: Az anti-vCD44 (1.1ASML) hatása Tlimfociták allogenikus aktiválására (stimulálás után ^{2 3}H-timidin-beépülésként mérve= CPM) 1= lépsejtek, 11= nyirokcsomósejtek, mindig DA patkányokból

DA patkányok immunizálása BDX-szel (limfociták 3000 R-nel besugározva) keresztben sűrűn vonalkázott oszlop= immunizálás BDX-szel, stimulálás BDX-szel in vitro ferdén vonalkázott oszlop= immunizálás

BDX-szel 1.1ASML jelenlétében, amelyet BDX-szel in vitro stimuláltunk vonalkázatlan oszlop= immunizálás és stimulálás BDX-szel 1.1ASML jelenlétében

6. ábra: Az anti-vCD44 (1.1ASML) hatása a citotoxikus T-sejtek aktiválására, primer CTL. DA patkányok immunizálása BDX-szel (limfociták 3000 R-nel besugározva) € = immunizálás BDX-szel = immunizálás BDX-szel 1.1ASML jelenlétében

E: T= effektorsejtek (E, lépsejtek) és célsejtek (T, ⁵¹Cr-mal jelölt BDX limfoblasztok) aránya

A következő példák a találmányt részletesebben szemléltetik.

1. példa

Patkány vCD44 jellemzése

A patkány vCD44 glikoproteinjének jellemzésére szolgáló eljárást és az ehhez szükséges anyagokat és az ezt kódoló DNS-szekvenciákat Günthert és munkatársai [Cell, 65, 13-24 (1991)] publikálták, úgyhogy erre kizárólagosan hivatkozhatunk. Az ebben a közleményben leírt tényállás újbóli részletes ismétlése ezért megtakarítható. Ez a közlemény tekintendő ezért teljességében az 1. példának.

2. példa

Humán vCD44 jellemzése

2.1 Homológ vCD44-szekvenciák azonosítása patkány, egér és ember között

Patkánymájból, egér L-sejtekből és humán T47D emlőrák sejtvonalból (ATCC HTB133) ismert módszer szerint (T. Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sambrook: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor) izoláljuk a genomiális DNS-t. Ebből

10-10 pg-okat standard eljárás szerint ECoRI-gyel teljesen emésztünk, és az ezt követő, a patkány variáns CD44 pMeta-1 terület 941-1108. helyzetű cDNS-részéböl származó hibridizációs próbával [U. Günthert et al., Cell, 65, 13-24 (1991)] végzendő kereszthibridizációhoz, majd a DNS: DNS Southern hibridizációhoz ismert módszer szerint előkészítjük és szűrőre rögzítjük. A hibridizálás 65 °C-on, 6xSSC-ben, éjszakán át történik. A szűröket ezt követően 30-30 percig 65 °Con mosópufferben (2x SSC; 0,1% SDS) háromszor és végül 0,5x SSC, 0,1 SDS-ben egyszer mossuk. Embernél, patkánynál és egérnél is találtunk olyan DNS-fragmenseket, amelyek egyértelműen homológok egymással (1. ábra).

2.2 vCD44-szekvenciák expressziója humán daganatsejtekben

Az ismert SCLC18, SCLC24, EPLC32H1, CH3LC, LCLC97, LCLC103 türödrák sejtvonalakból, amelyeknél mind a tenyésztési körülményeket, mind a tulajdonságaikat leírták [G. Bepler et al., J. Cancer Rés. and Clin. Oncol., 113, 31-40 (1987); G. Bepler et al., Differentiation, 37, 158-171 (1988); H.-H. Heidtmann et al., Cancer Rés., 49, 6960-6965 (1989)] 3-3 pg poly(A)+ RNS-t készítettünk elő a Northern-blot eljárással végzendő RNS-hibridizáláshoz. A „blotting” eljárás előtt etídium-bromiddal megfestett RNS a gélben bitzosítékot adott arról, hogy a gélre mindig azonos mennyiségű RNS lett felvive, illetve sávonként azonos mennyiségek vannak jelen. Apoly(A)+ RNS preparálását, denaturálását és a blottingot, valamint az RNS-blot analízis további műveleteit U. Günthert és munkatársai (1991, korábban idézve) szerint végezzük. A hibridizáláshoz használt A próba a pMeta- 1 variáns CD44 területből származik, és azonos a 2.1 pont alatt megadottal. A B próbaként, amely a pMeta-1-nek a leolvasás irányában a vCD44 régió mögött lévő normál CD44 régiójából származik, az U. Günthert és munkatársai (1991, korábban idézve) által megadott tartományt választottuk ki. Amint a 2. ábrából kitűnik, az LCLC97 humán sejtvonal egy nagysejtes tüdökarcinóma szekvenciáit fejezi ki, amelyek homológok a patkány vCD44-böl származó A próbával. A B próbát (a patkány normál sCD44 területe) tekintve más sejtvonalakban is voltak értelmes hibridizációs szignálok, illetve sCD44 expressziók kimutathatók. Az SCLC18 és SCLC24 sejtvonalak mindkét próba esetében negatívak voltak. Összehasonlításként a BSpAS (áttételt nem okozó) és a BSpASML (áttételt okozó) patkány sejtvonalakból származó RNS-eket vittünk fel (2. ábra, 7. és 8. sáv).

2.3 Humán CD44 variánsok izolálása és jellemzése

Az ismert SW260, HT29 (ATCC CCL227, illetve

HTB38), LCLC97 (a 2.2 példánál leírva), HPKII [keratinocita sejtvonal; leírva P. Boukamp et al., J. Cell. Bioi., 706, 761- 771 (1988)] és MeWo [melanoma sejtvonal; T. E. Carey et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 73, 3278- 3282 (1976)] sejtvonalakból ismert eljárással [M. Schwab et al., Natúré, 303, 497-501 (1983)] izoláljuk a poly(A)+ RNS-eket, és utána a PCR-ampli1

HU 216 020 Β fikációhoz AMV-reverz transzkriptázzal (20 egység) átírjuk egyszálú DNS-sé.

A cDNS-ek PCR-amplifikáció útján való előállításához normál humán CD44 cDNS-szekvenciákból származó két prímért használtunk, mégpedig olyan oligonukleotidokat, amelyek az 513- 540 és 900- 922 pozíciókat tartalmazzák [I. Stamenkovic et al., Cell, 56, 1057- 1062 (1989)]. A választás azért esett ezekre a pozíciókra, mert az áttétel-specifikus extraszekvenciák inszertálódása ezen pozíciók között fordul elő patkányoknál (U. Günthert et al., 1991, korábban idézve). 60 ciklus után a PCR-t befejezzük, és a kapott DNS termékeket ismert módszerrel (T. Maniatis et al., 1982, korábban idézve) agarózgél-elektroforézis (1% agaróz, Sigma) segítségével szétválasztjuk, és etídium-bromiddal megfestjük. A „normál” CD44 RNS (sCD44) expressziót tekintve, ezen primer alkalmazásakor egy 440 bp hosszúságú cDNS-t kapunk (beleértve a klónozáshoz szükséges restrikciós helyeket), ahogy ezen RNS expressziója esetén remélhető (MeWo és SW620 sejtek). A más sejtvonalakból származó RNSeknél mindig találunk egy hasonló hosszúságú sávot, persze nagyobb PCR termékek (cDNS-ek) mellett. 850 bp hosszúságú prominens fragmenseket HT29 és LCLC97 sejtekkel kapunk. A HPKII sejtekben a legerősebb sáv a 440 bp hosszúságú mellett az 1,5 kb-os hossztartományban található. Ezeket a viszonyokat a 3. ábrán mutatjuk be.

Minden, a PCR-amplifikációkból nyert cDNS-t a pT7T3- 19-vektorba (BRL, Gibco) klónoztunk, és utána standard módszerekkel szekvenáltuk. A MeWo és SW60 sejtek kiónjai tartalmazták a normál CD44(sCD44) szekvenciákat (I. Stamenkovic et al., korábban idézve).

Az LCL97 sejtekből PCR-rel nyert és pT7T3-ban klónozott leghosszabb cDNS teljes variáns régiójának DNS- és aminosav-szekvenciáját a 4.A ábrán mutatjuk be. A variáns rész 1014 bp-ból (vagy 338 aminosavból) áll, amely a „normál” sCD44 RNS 782. és 783. nukleotid pozíciója közé van inszertálva. Ezen variáns terület szekvenciája 5 szekcióra vagy doménre oszlik, ami összhangban van azon kisebb PCR termékek észlelésével, amelyek a legnagyobb klón (LCLC97-ból) pontosan definiált tartományait ölelik fel. Azon tény alapján, hogy ilyen kiónok különböző sejtvonalakból megismételhetóen izolálhatok voltak, arra kell következtetnünk, hogy az LCLC97 sejtvonalnak ez az öt (DI-DV) doménje (4. ábra) öt különböző olyan exon megnyilvánulása, amelyek differenciális RNS-betoldáson (splicing) át előhozzák azokat az RNS-eket, amelyekből a PCR-klónok származnak. Az ilyen domének létezése patkány daganatsejtvonalaknál azonos viszonyok észlelésével megerősíthető volt.

A 4.B ábra mutat egy sematikus áttekintést a viszonyokról, ahogy azok az LCLC97-nél fennállnak. Ismert módszer szerint végzett PCR-rel (U. Günthert et al., 1991, korábban idézve) izoláltunk az áttételt okozó patkány BSpASML sejtvonalból egy, az LCLC97 sejtekben lévő leghosszabb száltoldásos termékkel homológ cDNS-klónt. Az ebből levezetett aminosav-szekvenciának a (LCLC97-böl származó) humán klón aminosav-szekvenciájával való összehasonlítását mutatja be a 4.A ábra. Ezen variáns szekvencia inszerciójának helyzete három aminosavban különbözik (222. aminosav-pozíció embernél, 226. aminosav-pozíció patkánynál). Az I dómén 83%-os, a II dómén 83%-os, a III dómén 71%-os, a IV dómén 82%-os és az V dómén 66%-os homológiát mutat a patkány megfelelő aminosav-szekvenciáival szemben.

A 4. A ábrán szereplő LCLC97-nek megfelelő patkány cDNS, mely egy daganat-áttételi potenciált hordoz (U. Günthert et al., 1991, korábban idézve), a 258-420. aminosavakat öleli fel, és a II és III doméneket kódolja. Ezen két dómén aminosav-szekvenciája azonos az U. Günthert és munkatársai által publikált BSp73ASML specifikus extradoménnek (1991, korábban idézve) a pMeta- 1 klón cDNS-éböl levezethető aminosav-szekvenciájával.

3. példa

A vCD44 ellen irányuló 1.1ASML monoklonális antitest immunszupresszív hatása

3.1 Anti-vCD44 (1.1ASML) hatása a humorális immunválaszra

BDX patkányokba az antigénbeadás időpontjában 200 pg 1.1ASML monoklonális antitestet injektálunk intravénásán. T-sejt-független antigénként 50 pg (2,5,6-trinitro-fenil)-lipopoliszacharidot (TNP- LPS) [J. M. Fidler, Cellul. Immunoi., 16, 223 (1975)] és Tsejt-függö antigénként 5x 10⁸ ló vörösvérsejt/2,5,6-trinitro-fenol haptén-protein-konjugátumot (TNP- HRBC) [Μ. B. Rittenberg, Proc. Soc. Exp. Bioi. Med., 132, 575-581 (1969)] adunk intraperitoneálisan a patkányok immunizálására. Az antigén-specifikus plakkképzö sejtek (plaque forming cells, PFC) számát az antigén-beadás, illetve az 1.1ASML injektálás után 3 és 5 nappal meghatározzuk, ekkor célsejtekként 2,4,6trinitro-fenol juh-eritrocitákkal (sheep red blood cells; SRBC) és ló-eritrocitákkal (horse red blood cells; HRBC) képzett konjugátumait (TNP-SRBC és TNP-HRBC) használjuk. A PFC-ket a hemolitikus plakk meghatározás [N. K. Jerne & A. A. Nordin, Science, 140, 405 (1963)] egy módosított változatával [M. Zöller & G. Andrighetto, Cellul. Immunoi., 89, 310 (1984)] határozzuk meg. Az immunizált patkányok szérumában lévő anti-TNP antitestek mennyiségi meghatározását ismert módszerrel [M. Zöller, Scand, J. Immunoi, 31, 619 (1990)] végezzük, amennyiben a szérum titrációs görbéket tisztított anti-TNP monoklonális antitestek ELISA-módszerrel felvett standard görbéivel [E. Engvall & P. Pellman, J. Immunoi., 709, 129 (1982)] hasonlítjuk össze.

Mind a T-sejt-független antigén elleni, mind a Tsejt-függő antigén elleni immunválasztok 1.1ASML jelenlétében erősen csökkennek, illetve elnyomottak. Az antigén-specifikus PFC-k száma a kontroll stimulált állatokhoz viszonyítva 8-21%-ra csökkent, és ugyancsak csökkent a keletkezett szérum-antitest tükör (1. táblázat).

HU 216 020 Β

1. táblázat

Anti-vCD44 1.1ASML hatása a B-sejtek aktiválására

Antigén	mAB	PFC/10⁶ SC*	Szérum anti-TNP (mg/ml)
anti-TNP	anti-HRBC
TNP-LPS	-	620		108,0
	1.1ASML	52		6,1
TNP-HRBC	-	214	1582	5,4
	1.1ASML	20	337	2,7

inAB- monoklonális antitest * SC= lépsejtek

Ezek az adatok arra engednek következtetni, hogy az antitest vagy csak a B-limfociták stimulálásának gátlásán keresztül funkcionál, vagy mind a B-, mind a T-limfocitákat blokkolja.

A vCD44 expressziója azonban nemcsak a Immorális, hanem a celluláris immunválasz miatt is szükséges volt.

3.2 Az anti-vCD44 hatása a T-limfociták aktiválására

Egy allogén stimulálás hatásosságát immunizálás után 4 nappal határoztuk meg a T-sejtek szaporodásának megismételt stimulálás utáni in vitro mérésével. Az ehhez használt patkányokat vagy csak 5x 10⁷ sugárkezelt (3000 R) BDX patkány limfocitával, vagy sugárkezelt BDX limfocitákkal és 200 pg l.lASML-lel immunizáltuk. Lép- és nyirokcsomósejtjeiket sugárkezelt BDX limfocitákkal in vitro restimuláltuk. A lépeket és nyirokcsomókat 5 nappal később összegyűjtöttük. A szerveket óvatosan szétnyomkodtuk, és 15 ml RPMI 1640-ben végzett mosás után, a sejtszuszpenziót 3x 10⁶ sejt/ml koncentrációra állítottuk be 4 mM L-glutaminnal, antibiotikumokkal (34 μΜ penicillin, 32 μΜ sztreptomicin), 5x 10 ⁵ M 2-merkapto-etanollal, 10 ³ M HEPES pufferral és 2% hőinaktivált patkány szérummal kiegészített RPMI-vel (RPMI-s). A sejtszuszpenzió alikvotjait háromszorosan titráltuk U alakban mélyített mikrotiter lemezeken. Minden egyes mélyedésbe l,5x 10⁵ sugárkezelt (3000 R) BDX limfocitát adtunk 100 μΐ RPMI- sben, valamint adott esetben 10 pg/1 ml RPMI- s végkoncentrációban Protein A Sepharose 4B oszlopon (Pharmacia) végzett kromatografálással tisztított 1.1ASML monoklonális antitestet. A tenyészetet 72 órán keresztül 37 °C-on 5% szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában inkubáltuk. A DA-limfociták szaporodását a tenyésztés utolsó 8 órája során hozzáadott 50 pCi ³Htimidin hozzáadásával határoztuk meg.

A ³H-timidin-beépülés, mint az olyan patkányok Tsejtjei és lépsejtjei szaporodásának mértéke, amelyeket 1.1ASML allogénnel együtt immunizáltunk, drasztikusan csekként olyan patkányok sejtjeinek szaporodásához viszonyítva, amelyeket az antitest nélkül immunizáltunk. Ez az eredmény változatlanul megmaradt, attól függetlenül, hogy a lépsejteket és a nyirokcsomósejteket csak egyedül allogén sejtekkel vagy allogén sejtekkel és 1.1ASML sejtekkel restimuláltuk-e (5. ábra).

3.3 ANti-vCD44 hatása citotoxikus T-sejtek aktiválására

A T-sejt szaporodással szemben a 3.2 példában a citotoxikus aktivitás az allogén stimulálás 7. napja után lett meghatározva. A vCD44-nek citotoxikus T-sejtek (CTL) érése és/vagy aktiválása során való szükségességére vonatkozólag gyakorlatilag ugyanaz a kép adódott, mint a 3.2 példában (5. ábra). 1.1ASML jelenlétében a citotoxikus T-limfociták száma drasztikusan csökkent (6. ábra).

Olyan DA patkányok lépsejtjeit (DA lépsejtek), melyeket BDX limfocitákkal immunizáltunk a 3.2 példában leírtak szerint, az immunizálás után 7 nappal össze30 gyűjtjük, és BDX limfoblasztok elleni citotoxikus aktivitásra teszteljük (primer CTL).

Közvetlenül immunizálás után nyert DA lépsejteket lx 10⁷ sejt/ml RPMI- s koncentrációra hígítunk. A sejtszuszpenzió (effektorsejtek, E) alikvotjai U alakban mé35 lyített mikrotitráló lemezeken titráljuk, 100 μΐ célsejtet (targetsejt, T, lx 10⁴⁵¹Cr-mal jelzett BDX konkanavalin A limfoblasztok) adunk hozzá. A lemezeket 37 °C-on végzett 6 órás inkubálás után centrifugáljuk, a felülúszók alikvotjait eltávolítjuk, és az ⁵¹Cr radioaktív su40 gárzását egy gammaszámlálóban meghatározzuk. A 6. ábrán a specifikus radioaktivitás három mérésből átlagolt százalékos értékeit ábrázoljuk.

Claims

45 SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás egy emlős variáns CD44 felületi protein (vCD44) vagy ennek egy része ellen irányuló antitestet mint hatóanyagot tartalmazó gyógyszerkészítmény elő50 állítására, azzal jellemezve, hogy az említett, ismert módon előállított antitestet a gyógyszerkészítésben szokásosan alkalmazott egy vagy több segédanyaggal összekeverve emlősök szervezetében immunszupresszió előidézésére szolgáló gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.

55
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy immunválasz átmeneti vagy tartós csökkentésére és/vagy elfojtására szolgáló gyógyszerkészítményt állítunk elő.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal

60 jellemezve, hogy immunregulációs zavarok és/vagy o

HU 216 020 Β megbetegedések kezelésére szolgáló gyógyszerkészítményt állítunk elő.
4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy immunregulációs zavarok és/vagy megbetegedések megelözösére szolgáló gyógyszerkészítményt állítunk elő.
5. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy autoimmun betegségek kezelésére szolgáló gyógyszerkészítményt állítunk elő.
6. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy allergiás betegségek kezelésére szolgáló gyógyszerkészítményt állítunk elő.
7. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy degeneratív, gyulladásos, proliferatív és/vagy hiperproliferatív megbetegedések kezelésére szolgáló gyógyszerkészítményt állítunk elő.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reumatikus betegségek körébe tartozó megbetegedések, szklerózis multiplex, pikkelysömör vagy atopikus börgyulladás kezelésére szolgáló gyógyszerkészítményt állítunk elő.
9. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy transzplantált szövetek vagy szervek kilökődésének megakadályozására szolgáló gyógyszerkészítményt állítunk elő.
10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy emberekben immunszupresszió előidézésére szolgáló gyógyszerkészítményt állítunk elő.
11. Az 1- 10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként egy vCD44 felületi protein E-E-A-A-T-Q-K-E-K-W aminosav-szekvenciával meghatározott epitópját felismerő monoklonális antitestet alkalmazunk.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott antitest a nevezett antitest egy funkcionális fragmense vagy származéka, kiméra vagy hibrid, egy anti-idiotípusos vagy egy bispecifikus an5 titest.
13. Az 1- 12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az előállított gyógyszerkészítmény felhasználásra kész oldat formájú vagy rekonstitúcióhoz alkalmas formában lévő száraz ké10 szítmény.
14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy enterális, parenterális, szisztémás, lokális és/vagy topikális beadásra alkalmas gyógyszerkészítményt állítunk elő.
15 15. A 13. vagy 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy injekcióval, infúzióval vagy perfúzióval való beadásra alkalmas gyógyszerkészítményt állítunk elő.
16. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez20 ve, hogy az említett antitestet egy megfelelő hibridóma sejtvonallal termeltetjük.
17. Immunregulációs zavar felismerésére és/vagy kontrolljára szolgáló diagnosztikai készlet (kit), amely tartalmaz:

25 - legalább egy vCD44 felületi protein vagy ennek egy része ellen irányuló antitestet, ennek egy funkcionális fragmensét vagy származékát,

- megfelelő oldószereket és puffereket,

- a kimutatáshoz szükséges reagenseket és

30 - standard készletet.
18. A 17. igénypont szerinti kit, amely antitestként az E- E- A- A- T- Q- K- E- K- W epitópot felismerő monoklonális antitestet tartalmazza.