NO311965B1 - Anvendelse av antistoffer rettet mot variant -CD44- (vCD44)- overflateprotein for fremstilling av et farmasöytisk preparat - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av antistoffer, spesielt monoklonale antistoffer rettet mot varianter av glykoprotein CD44 (vCD44) for overflateprotein for fremstilling av et farmasøytisk preparat.

CD44 er et glykoprotein som befinner seg på celleoverflaten og som opprinnelig er blitt beskrevet som "lymfocytt-målsøkingsreseptor", og den antas å inngå ved tilhefting av lymfocytter til visse mukøse endotelceller i vener (peyerske flekker eller peyerske plakk; eller folliculi lymphatici aggregati), eller postkapillære vener i lymfeknutene (S.T. Jalkanen et al., Eur. J. Immunol. 16, 1195-1202,1986; R.L. Camp et al., J. Exp. Med. 173, 763-766, 1991). Dessuten mener man at CD44-glykoproteinet deltar ved utvikling og aktivering av lymfocytter, eller at det har en nødvendig (tilleggs-)effekt ved den økte bevegelsesevne hos alle lymfoblaster (f.eks. R.L. Camp et al., 1991., som ovenfor; S. Huet et al., J. Immunol. 143, 798-801,1989) og at det skal spille en rolle som forankringssted for andre tilheftings-molekyler (Y. Shimizu et al., J. Immunol. 143, 2457-2463, 1989). Hittil er imidlertid ikke alle disse funksjoner hos CD44 entydig avklart.

Nylig er det, når det gjelder rotte-tumorceller som metastaserer over det lymfatiske system (BSp73-celler fra et spontant rottebukspyttkjerteladenokarsinom), blitt påvist at disse celler uttrykker varianter av CD44 (vCD44) og er ansvarlige for utbredelsen ("trafikkeringen") av tumorceller. Disse forhold kan likeledes påvises for andre tumorcellelinjer.

Det kan vises at dette vCD44-glykoprotein gir en tidligere ikke-metastaserende tumor metastase-evner, mens standardtype-CD44 (sCD44) ikke er i stand til dette. Følgelig kan man i dag gå ut fra at vCD44 er et metastasespesifikt protein overfor sCD44, som gir tumorer evne til å metastastere over lymfebanene (U. Gunthert et al., Cell 65, 13-24,1991).

U. Gunthert et al., 1991, som ovenfor, har lykkes i å komme frem til den ytterligere kunnskap om vCD44-glykoproteinet hos rotten som hittil er den endelige karakterisering av DNA- og aminosyresekvensen, ved hjelp av BSp73-rottecelle-systemet, som består av to morfologisk eller fenotypisk forskjellige syngene celle-varianter: en ikke-metastaserende variant AS (BSp73AS) og en metastaserende variant ASML (BSp73ASML) (S. Matzku et al, Cancer Research 49, 1294-1299, 1989).

For dette formål er det blitt fremstilt monoklonale antistoffer (mAb'er) som oppfatter de antigene determinanter på den metastaserende variant BSp73ASML.

Det ble uttatt cellelinjer både fra primærtumoren (subkutane ikke-metastaserende knuter som besto av BSp73 AS-celler) og fra en metastase av denne (BSp73ASML-celler, som metastaserer i lymfeknuter og lunge). Det ble fremstilt mAb'er som er rettet mot membranproteinene hos BSp73ASML-celler (S. Matzku et al., 1989, som ovenfor). Ett av disse mAb'er, som bare oppfatter epitoper på BSp73ASML-celler, men ikke epitoper på BSp73AS-celler eller andre ikke-tumorogene celler, ble benyttet til å gjennomsøke (screening) et E. coli cDNA-ekspresjonsbibliotek, fremstilt av poly(A)<+>RNA fra BSp73ASML-celler og et egnet vektorsystem. På denne måte kunne det identifiseres en klon (pMeta-1) som inneholder det fullstendige cDNA med en lengde på 3207 bp og som koder for et ytterligere doméne på 162 aminosyrer. Dette doméne finnes verken i sCD44-celler eller i andre ikke-metastaserende tumorceller, og det inneholder den mAb-spesifikke epitopkodende region. Ved hjelp av mRNA-preparater fra celler i forskjellige vev og mRNA:DNA-hybridiseringer utført med disse med forskjellige DNA-prober fra cDNA-klonene kunne det fastslås at vCD44 representerer en skjøtingsvariant av sCD44 og at ekspresjon av vCD44-RNA'ene skjer ved fremkomsten av metastaser. Hermed er det sikkert at det ytterligere ekstracellulære doméne som er kodet ved det 486 bp lange innskudd (aminosyrer 224-385 i pMeta-1), er den metastase-relevante del av overflateglykoproteinet vCD44.

Den metastatiske tumorvekst (adenokarsinom hos rotte) kunne undertrykkes etter immunisering med monoklonale antistoffer som oppfatter den forannevnte epitop, eller som reagerer spesifikt med dette ekstracellulære område på vCD44 (S. Reber et al., Int. J. Cancer 46, 919-927, 1990).

Identifisering av disse ekstracellulære variantområder hos rotte (pMeta-1 henholdsvis rMeta-1) gjør det også mulig å oppklare de menneskelige nukleotid- og aminosyresekvenser som er ekvivalente til disse: Med en sonde avledet av DNA fra vCD44-doménet hos rotte kunne man ved hybridisering, eventuelt under strenge betingelser, med genom-DNA fra forskjellige artsspesifikke cellelinjer (for eksempel menneske, rotte, mus), finne homologe områder i disse DNA'er. En slik probe kan deretter anvendes for hybridisering overfor RNA'er fra forskjellige humane cellelinjer, spesielt tumorcellelinjer, for eksempel storcellede lungekarsinomer, melanomer, kolonkarsinomer, brysttumorer og keratinocytter. På denne måte kan det uten videre oppfinnes en egnet human-cellelinje, for eksempel av et storcellet lungekarsinom, som inneholder sekvenser homologe til cDNA-proben fra rotte. Ved PCR (polymerasekjedereaksjon), en kjent in vitro-fremgangsmåte for selektiv anriking av DNA-områder med definert lengde og definert sekvens, kan det, ut fra en blanding av DNA-molekyler, ved anvendelse av en DNA-polymerase og en egnet primer, fås cDNA-molekyler som koder for sCD44 og vCD44, av RNA-preparater fra forskjellige humancellelinjer, for eksempel celler av storcellede lungekarsonimer, melanomer, kolonkarsinomer eller immortaliserte keratinocytter.

En slik cDNA som er oppnådd ved PCR, kan innføres i en egnet klonings-vektor ved kjente metoder, og deretter, etter passende dyrkning av vertsceller som er transformert med denne, fortrinnsvis bakterier, for eksempel E. coli, sekvenseres. På denne måte får man fra de forskjelligste humane celler, utvalgt blant alle mulige tumorceller eller cellelinjer, spesielt fra slike som oppviser metastaserings-egenskaper, DNA-sekvenser som enten koder for et normalt humant sCD44-glykoprotein med kjent størrelsesorden i området 350 aminosyrer (I. Stamenkovic et al., Cell 56, 1057-1062, 1989), som inneholder et ekstracellulært doméne i området 85 kDa (S. Jalkanen et al., J. Cell Biol. 105, 983-990, 1987), eller som koder for et humant variant-vCD44-glykoprotein, som kan omfatte et ytterligere ekstracellulært doméne med forskjellig lengde, spesielt mellom 850 bp og 1,5 kb, eksempelvis 1014 bp (eller 338 aminosyrer), og som er innført i DNA-sekvensen som koder for det normale sCD44-glykoprotein, for eksempel mellom nukleotidstillingene 782 og 783 (fig. 4). En slik DNA-sekvens kan finnes i flere, for eksempel fem, doméner, som representerer forskjellige eksoner og som både kan finnes i forskjellige dyrecelle-linjer (for eksempel rotte eller mus) og i humancellelinjer.

På fig. 4A er det som eksempel vist en cDNA som er homolog med den lengste oppnådde variant-del av humane tumorcellelinjer, og som er blitt isolert fra rottetumorcellelinjen BSpASML ved PCR. En direkte sammenlikning av aminosyresekvensen avledet fra denne, med aminosyresekvensen fra en humanklon av en mennesketumorcellelinje, viser at doméne I viser 83%, doméne II viser 83%, doméne III viser 71%, doméne IV viser 82% og doméne V viser 66% homologi med rotte-DNA-sekvensen. Totalt viser dette at ca. 76% av human-sekvensene i variant-områdene er konservert i forhold til rottesekvensen. De tilsvarende rottesekvenser, som gir tumoren metastatisk potensiale (U. Gunthert et al., 1991, som ovenfor), omfatter aminosyrene 258-420 og kodes ved doménene II og III.

Det var hermed klart for fagmannen at poly- eller monoklonale antistoffer, som spesifikt oppfatter disse epitoper, d.v.s. dette ytterligere ekstracellulære område på forskjellige skjøtingsvarianter av vCD44, og reagerer med dem, og som kan merkes med radioisotoper og/eller konjugeres med cytocid eller cytotoksisk virkende stoffer, kan anvendes til diagnostisk og terapeutisk bruk ved en metastaserende tumortilstand hos mennesker.

De ovenfor kort omtalte forhold er gjenstanden for den internasjonale patent-søknad WO 91/17248.

Det er nå overraskende blitt funnet at antistoffer, spesielt monoklonale antistoffer, som reagerer med de forskjellige metastasespesifikke varianter av CD44 (vCD44), utvikler immunundertrykkende virkning; denne nye egenskap kunne på ingen måte ventes på grunnlag av de ovenfor omtalte forhold.

Formålet med oppfinnelsen er derfor anvendelse av antistoffer rettet mot variant-CD44-(vCD44)-overflateprotein hos et pattedyr eller deler derav, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for frembringelse av en immunundertrykkelse i en pattedyrorganisme i form av blokkert aktivering av B-celler og T-celler, og drastisk reduksjon av cytotoksisk T-cellerespons.

Det skal her fremheves at hvert vilkårlige variant-CD44 (cCD44)-glykoprotein av animalsk eller menneskelig opprinnelse og de nukleinsyrer som koder for disse (DNA'er og RNA'er), som foreligger som innskudd innenfor genområdet som koder for sCD44, følgelig nå er tilgjengelige for en fagmann, og at det ligger innenfor rammen av en gjennomsnittsfagmanns kunnskap å benytte disse proteiner og de nukleinsyrer som koder for disse proteiner, til fremstilling av ønskede antistoffer, spesielt monoklonale antistoffer, fragmenter og dervater av disse, for anvendelse ifølge oppfinnelsen og til bruk.

Med betegnelsen vCD44 eller, synonymt til denne, ekstracellulære variant-doméner eller områder av CD44 eller sCD44, menes det, når det er tale om nukleinsyrer, hver RNA, DNA som koder for én eller flere vCD44-proteiner eller -doméner, eller transkripsjoner av disse, innbefattende slike som er blitt forandret ved mutasjoner, for eksempel ved utelukkelser, innføringer, substitusjoner, inversjoner, transisjoner, trans versjoner, og slike som hybridiserer med DNA-sekvensen som vist på fig. 4A ved de kjente vanlige betingelser, og hvis komplementære kodings-strenger koder for et protein som gir tumorer metastase-egenskaper, uavhengig av om fremstillingen og isoleringen av disse nuklerinsyrer skjer på vanlig måte ved cellekulturer, eller ved DNA-rekombinasjon, ved syntetiske eller halvsyntetiske fremgangsmåter.

Med betegnelsen vCD44, eller synonymt til denne, ekstracellulære variant-doméner eller områder av CD44 eller sCD44, menes det, når det er tale om et tilsvarende overflateprotein, alle glykoproteiner som stammer fra dyr eller mennesker, og som, uavhengig av sin fremstilling eller isolering ved vanlige cellekulturer eller ved DNA-rekombinasjon eller ved syntetiske eller halvsyntetiske fremgangsmåter, foreligger som tilleggsdel i sCD44 og gir en tumor metastase-egenskaper.

Med betegnelsen antistoffer menes mono- eller polyvalente antistoffer og poly- og monoklonale antistoffer, men også slike som slike som utgjør fragmenter av disse og derivater av disse, innbefattende F(ab')2-, Fab<1-> og Fab-fragmenter, men også kimære antistoffer eller hybrid-antistoffer med minst to antigen- eller epitop-bindingssteder, eller bispesifikke rekombinante antistoffer (for eksempel kvadrom, triom), interart-hybridantistoffer, anti-idiotypiske antistoffer og de av disse som er blitt kjemisk modifisert og som er å oppfatte som derivater av disse antistoffer, og som kan fremstilles enten ved de kjente vanlige fremgangsmåter for antistoff-utvinning eller ved DNA-rekombinasjon, via hybridomteknikker eller antistoff-gensløyd eller syntetisk eller halvsyntetisk på i og for seg kjent måte, og som viser nøytraliserings- eller bindingsegenskaper med hensyn til det ovenfor beskrevne og definerte vCD44. Som eksempel skal det fra den mangfoldige litteratur bare vises til arbeider av G. Kohler & C. Milstein, Nature 256, 495-497, 1975; S. Biocca et al., EMBO J. 9, 101-108, 1990; R.E. Bird et al., Science 242, 423-426, 1988; M.A. Boss et al., Nucl. Acids Res. 12, 3791-3806, 1984; G.L. Boulianne et al, Nature 312, 643-646, 1984; J. Bukovsky & R.H. Kennett, Hybridoma 6, 219-228, 1987, M. Diano et al., Anal. Biochem. 166,223-229, 1987; J.S. Huston et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85, 5879-5883, 1988; P.T. Jones et al., Nature 321, 522-525, 1986; J.J. Langone & H.V. Vunakis (Hrsg.), Methods Enzymol. 121, Academic Press, London 1987; S. Morrison et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81, 6851-6855, 1984; V.T. Oi & S.L. Morrison, BioTechniques 4, 214-221, 1986; L. Riechmann et al., Nature 332, 323-327, 1988; A. Tramontano et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83, 6736-6740, 1986; CR. Wood et al., Nature 314, 446-449, 1985.

Når det gjelder fremstilling av polyklonale antistoffer mot epitoper av vCD44, er det tilgjengelig et antall fremgangsmåter. For eksempel kan det for dette formål, på i og for seg kjent måte, immuniseres forskjellige dyr ved injeksjon med vCD44, som kan være av naturlig opprinnelse eller kan være fremstilt ved DNA-rekombinasjon eller syntetisk, eller fragmenter derav, og av de deretter utvunnede sera kan de ønskede polyklonale antistoffer utvinnes og renses ifølge kjente metoder. Som alternativ kan det også anvendes intakte celler. Forskjellige hjelpestoffer for forsterkning av immunforsvaret overfor vCD44-dosen kan, avhengig av det dyr som utvelges for immunisering, likeledes anvendes - for eksempel Freunds adjuvans, mineralgeler så som f.eks. aluminiumhydroksyd, overflateaktive substanser så som f.eks. polyanioner, peptider, oljeemulsjoner, hemocyanin, dinitrofenol eller lysolecitin.

De foretrukkede monoklonale antistoffer mot en epitop av vCD44 for anvendelse ifølge oppfinnelsen kan fas ved hvilken som helst ønsket teknikk som står til rådighet for fremstilling av antistoffer ved dyrkning av cellelinjer. Til slike kjente teknikker hører f.eks. fremgangsmåtene beskrevet av G. Kohler & C. Milstein, 1975, som ovenfor, eller Taggart & Samloff, Science 219, 1228-1230, 1983, med hybridomceller eller fremgangsmåter med humane B-cellehybridomer (Kozbor et al., Immunology Today 4, 72-79, 1983). Kimære antistoffer mot vCD44 kan for eksempel være sammensatt av et museantigen-bindingsdoméne og humane konstante regioner (Morrison et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81, 6851-6855, 1984; Takeda et al., Nature 314,452-454, 1985).

Antistoffene kan renses ved kjente metoder, eksempelvis ved immun-absorpsjons- eller immunaffinitetskromatografi, ved HPLC (høy-ytelses væske-kromatografi) eller ved kombinasjoner av disse. Antistoff-fragmenter som inneholder idiotypen av molekylet, kan likeledes fremstilles ved kjente fremgangsmåter. For eksempel kan F(ab')2-fragmenter fås ved pepsin-nedbryting av det fullstendige poly- eller monoklonale antistoff. Fab'-fragmenter kan fås ved at for eksempel disulfidbroene i det aktuelle F(ab')2-fragment reduseres, og Fab-fragmenter kan for eksempel fas ved behandling av antistoffmolekylene med papain og et reduksjons-middel.

For identifisering og utvelgelse av antistoffer, fragmenter eller derivater av disse, som reagerer med en epitop av vCD44, kan hver kjent fremgangsmåte anvendes, for eksempel ved at disse kan påvises etter passende merking, når de er blitt bundet til isolert eller renset vCD44, eller ved immunutfelning av vCD44 som for eksempel er renset ved hjelp av polyakrylamidgeler, eller ved at antistoffer mot vCD44 konkurrerer med andre vCD44-antistoffer om bindingen til vCD44.

Hybridomcellelinjer kan også anvendes til fremstilling av antistoffene eller et preparat.

Med hensyn til ytterligere detaljer angående den generelle anvendelse av monoklonale antistoffer for immunundertrykkelse og ved autoimmunsykdommer, av hybridantistoffer for terapeutiske formål og antistoffer fremstilt ved DNA-rekombinasjon, vises det til Progress in Allergy vol. 45, "Monoclonal Antibody Therapy", 1988, og til arbeidet av W.E. Seaman et al., Ann. Rev. Med. 39, 231-241, 1988.

Det ytterligere doméne i vCD44 så vel hos dyr (f.eks. rotte) som hos mennesker, er fullstendig avslørt ved hjelp av stoffparameteren (DNA- og aminosyresekvens, lokalisasjon innenfor det fullstendige gen som koder for CD44) og fremstillingen av den, slik at det ved denne avsløring er blitt gjort mulig for en fagmann å fremstille hvilke som helst antistoffer eller monoklonale antistoffer i henhold til de ovenfor angitte definisjoner for hver epitop som er lokalisert på dette ytterligere ekstracellulære doméne av vCD44 og benytte den ifølge oppfinnelsen, slik at anvendelsen av den ikke er begrenset til bestemte spesifkkke antistoffer eller de hybridcellelinjer som danner dem. For eksempel er epitopen som oppfatter 1.1ASML, nøyaktig definert ved aminosyresekvensen E-E-A-A-T-Q-K-E-K-W eller Glu Glu Ala Ala Thr Gin Lys Glu Lys Trp (fig. 4A).

Anvendelsen ifølge oppfinnelsen av slike antistoffer, fragmenter og derivater derav er ikke beskrevet innenfor teknikkens stand.

Ifølge oppfinnelsen finner preparater med slike antistoffer anvendelse ved immunregulatoriske forstyrrelser og sykdommer hos dyr og mennesker, som omfatter forhindring eller forebygging, kontrollering, diagnostisering eller behandling av disse.

På grunn av sin immunundertrykkende virkning er de nevnte antistoffer, eller de preparater som inneholder dem, egnet til forhindring og behandling av sykdommer og tilstander hvor det trenges en midlertidig eller vedvarende nedsettelse eller undertrykking av et immunforsvar. Særlig omfatter anvendelsen av dem undertrykkelse av aktivering av formeringen av lymfocytter eller cytotoksiske T-celler og/eller immunocytter, eksempelvis til forhindring eller behandling av autoimmunsykdommer, så som f.eks. sykdommer innenfor det reumatiske område, multippel sklerose, psoriasis, atopisk dermatitt, eller til forhindring av avstøting av transplanterte vev eller organer så som f.eks. nyrer, hjerte, lunger, benmarg, milt, hud eller øye-hornhinne, ved uønskede reaksjoner under eller etter transfusjoner, av allergiske sykdommer, spesielt slike som angår gastrointestinalsystemet og som kan påvises der som inflammasjon, eller av inflammatoriske, proliferative og hyperproliferative sykdommer og utslag på huden, immunologisk betingede sykdommer så som f.eks. eksematøse dermatitter, urticaria, vaskulitter, sklerodermi.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig anvendelse ifølge krav 6 til behandling av degenerative, inflammatoriske, proliferative og/eller hyperproliferative immunologiske sykdommer.

Anvendelsen ifølge oppfinnelsen er basert på den uventede observasjon at et antistoff rettet mot variant-delen av CD44 (vCD44) sterkt reduserte det T-celle-avhengige og T-celle-uavhengige immunforsvar in vivo og in vitro. Ved at det ved ett eller flere av de ovenfor beskrevne antistoffer, eller fragmenter eller derivater av disse, oppnås at virkningen av vCD44, om hvilken man kan anta at den ikke bare er nødvendig for det humorale immunforsvar, men også for aktiviteten av formeringen av cytotoksiske T-celler, nøytraliseres, blir det ved anvendelsen ifølge oppfinnelsen av disse antistoffer mulig en tilsiktet og - avhengig av mengden, varigheten og beskaffenheten av antistoffpreparatet som skal tilføres - når det gjelder intensiteten og varigheten, styrbar undertrykkelse av et immunforsvar. Følgelig er det spesielt fordelaktig med en klinisk anvendelse av disse antistoffer for de ovenfor nærmere beskrevne forstyrrelser, sykdommer og tilstander, d.v.s. når en immunundertrykkelse er ønsket i en animalsk eller menneskelig organisme.

Avhengig av arten og årsaken til sykdommen eller forstyrrelsen som skal behandles, eller den tilstand som skal påvirkes, i en dyre- eller menneskekropp, kan det være ønskelig å tilføre antistoffpreparatet systemisk, lokalt eller topisk på, eller i, det aktuelle vev eller organ. En systemisk virkemåte er for eksempel da ønsket når forskjellige organer eller organsystemer trenger behandling, så som f. eks. ved systemiske autoimmunsykdommer eller allergier eller ved transplantasjoner av fremmede større organer eller vev. På den annen side ville man måtte ta i betraktning en lokal virkning når bare en stedlig fremkomst av en immunologisk tilstand skal påvirkes, så som for eksempel ved småflate-transplantasjoner av huden og hornhinnen eller ved lokal dermatitt.

De aktuelle antistoffer kan administreres ved hvilken som helst av de enterale eller parenterale tilførselsmåter som er kjent for en fagmann. For systemisk tilførsel kan det for eksempel anvendes intravenøs, intravaskulær, intramuskulær, intra-arteriell, intraperitoneal, oral eller intratekal administreringsmåte. En heller lokal tilførsel kan for eksempel skje subkutant, intrakutant, intrakardialt, intralobulært, intramedullært, intrapulmonalt, eller i eller på vevet som skal behandles (binde-, muskel-, nerve-, epitel- eller benvev). Avhengig av varigheten og styrken av den immunundertrykkende virkning som skal oppnås, kan antistoffpreparatene administreres én gang eller flere ganger, også intermitterende, pr. dag over flere dager, uker eller måneder, og i forskjellige doser. For fremstilling av et antistoff-preparat som er egnet for nevnte anvendelser, kan de injiserbare, fysiologisk tolererbare løsninger som er kjent for fagfolk, anvendes i steril form. For fremstilling av en bruksferdig løsning for parenteral injeksjon eller infusjon er det tilgjengelig kjente vandige isotoniske løsninger, for eksempel saltløsninger eller en tilsvarende plasmaproteinløsning uten gammaglobulin. Preparatet kan imidlertid også foreligge i form av et lyofilisat eller et tørket preparat, som kan rekondisjo-neres med én av de kjente injiserbare løsninger umiddelbart før bruk under sterile betingelser, f.eks. som et sett av deler. Den endelige fremstilling av et antistoff-preparat for anvendelse ifølge oppfinnelsen for injeksjon, infusjon eller perfusjon skjer ved blanding av antistoffer renset ved kjente metoder ifølge ovenfor angitte definisjoner, med én av de nevnte fysiologisk tolererbare løsninger, som eventuelt kan være supplert med kjente bærer- eller hjelpestoffer (f.eks. serumalbuminer, dekstrose, natriumbisulfitt, EDTA).

Mengden av antistoffene for administrering avhenger av typen og graden av sykdommen eller forstyrrelsen som skal behandles, eller den tilstand som skal påvirkes, og den aktuelle pasient (dyr eller menneske). Man kan imidlertid gå ut fra en anvendelsesdosering på 1-1000 mg, fortrinnsvis 5-200 mg, av det aktuelle antistoff pr. dose-enhet, slik som det også er vanlig for andre antistoffer eller monoklonale antistoffer, hvorav det kan gis mellom 0,01 og 20 mg pr. dag og fra 0,1 til 100 mg pr. kg kroppsvekt pr. dag, i lengre tid (dager, uker, måneder), for oppnåelse av den ønskede effekt - alt etter hvor intensiv og over hvilket tidsrom en immunundertrykkelse ønskes oppnådd.

Forklaring av figurene:

Fig. 1: Krysshybirdisering av vCD44-sekvenser mellom rotte, mus og menneske. Bane 1 = rotte (leverceller),

bane 2 = mus (L-celler), bane 3 = menneske

(mammakarsinomcellelinje T47D)

Fig. 2: Ekspresjon av vCD44- og sCD44-sekvenser i

menneske-tumorcellelinjer. Bane 1 = LCLC103, bane 2 = LCLC97, bane 3 = CH3LC, bane 4 = EPLC32M1, bane 5 - SCLC24,

bane 6 = SCLC18. Bane 7 tilsvarer rottecellelinjen BSp73ASML og bane 8 rottecellelinjen BSp73AS.

GAPDH = glycerolaldehydfosfatdehydrogenase for relativ mengdebestemmelse av de påsatte RNA-mengder.

Fig. 3: Agarosegelelektroforetisk oppløsning av cDNA'er oppnådd ved PCR-forøkning, og som er komplementær til CD44-RNA'ene

uttrykt i forskjellige humane cellelinjer.

Bane 1 SW620, bane 2 - MeWo, bane 3 - HT29,

bane 4 = LCLC97, bane 5 = HPKII, bane 6 = lengdemarkør, Boehringer Mannheim, nr. 7.

Fig 4A: DNA- og aminosyresekvens av vCD44-regionen av cellelinje LCLC97

hos mennesker. Til sammenlikning er angitt DNA- og aminosyresekvensen av rotte-tumor-cellelinjen BSpASML, som ble avledet av den oppnådde DNA. Pilene angir grensene for de fem eksoner eller doméner D I - D V. H = menneske, R = rotte. Epitopen som det monoklonale antistoff 1.1ASML oppfatter, er kjennetegnet ved

Fig. 4B: Skjematisk gjengivelse av de fem eksoner (doméner) D I - D V

innenfor den ekstracellulære region av LCLC97. Tallangivelser = antall aminosyrer

Fig. 5: Innflytelse av anti-vCD44 (1.1 ASML) på den allogene aktivering av T-lymfocytter (målt som H-tymidin-innbygging etter stimulering

= CPM). I = milt-celler, II = lymfeknuteceller, begge fra DA-rotter. Immunisering av DA-rottene med BDX (lymfocytter, bestrålt med 3000R).

Immunisering med BCX, stimulert med BCX in vitro

= Immunisering med BCX i nærvær av 1.1 ASML,

stimulert med BCX in vitro

I Immunisering og stimulering med BDX i nærvær av 1.1 ASML

Fig. 6: Innflytelse av anti-vCD44 (1.1 ASML) på aktiveringen av cytotoksiske T-celler, primære CTL. Immunisering av DA-rotter med BDX (lymfocytter bestrålt med 3000 R).

Immunisering med BDX

Immunisering med BDX i nærvær av 1.1 ASML

E : T = Forhold mellom effektorceller (E, milt-celler) og målceller (T, -^Cr-merkede BDX-lymfoblaster).

Følgende eksempler vil belyse oppfinnelsen nærmere.

Eksempel 1: Karakterisering av vCD44 hos rotte

Fremgangsmåten og midlene for denne, som fører til karakterisering av vCD44-glykoproteinet hos rotte, og DNA-sekvensen som koder for disse, er

beskrevet fullstendig i publikasjonen av U. Gunthert et al., Cell 65,13-24,1991, slik at det kan henvises spesielt til denne. En ytterligere detaljert gjengivelse av de data som er beskrevet i denne publikasjon, er derfor overflødig. Denne publikasjon skal derfor i sin helhet forstås som en del av eksempel 1.

Eksempel 1: Karakterisering av vCD44 hos mennesker

2.1 Identifisering av homologe vCD44-sekvenser mellom rotte, mus og menneske

Det ble isolert genom-DNA både fra rotteleverceller, L-celler hos mus og fra mammakarsinomcellelinjen T47D hos mennesker (ATCC nr. HTB133) ved kjent metode (T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook i: Molecular Cloning, a laboratory manual, 1982, Cold Spring Harbor). Fra hver av disse ble det fullstendig nedbrutt 10 jig ifølge standardfremgangsmåter med EcoRI, og dette ble preparert og filter-fiksert ifølge kjent metode for den etterfølgende krysshybirdisering med en hybridi-seringsprobe som besto av cDNA-delen av posisjonene 941-1108 av pMeta-1 av variant-CD44-området fra rotte (U. Gunthert et al., Cell 65., 13-24, 1991), for DNA:DNA-Southern-hybridisering. Hybridiseringen skjedde over natten ved 65°C i 6xSSC. Filtrene ble deretter vasket tre ganger i 30 minutter hver gang ved 65°C i vaskebuffer (2xSCC, 0,1% SDS) og til slutt én gang i 0,5xSCC, 0,1% SDS. Det ble funnet DNA-fragmenter hos menneske, rotte og mus som klart er homologe med hverandre (fig. 1).

2.2 Ekspresjon av vCD44-sekvenser i tumorceller hos mennesker

Fra de kjente lungekarsinomcellelinjer SCLC18, SCLC24, EPLC32M1, CH3LC, LCLC97 og LCLC103, for hvilke både dyrkningsbetingelsene og egen-skapene er beskrevet (G. Bepler et al, J. Cancer Res. and Clin. Oncol. J_L3_, 31-40, 1987; G. Bepler et al., Differentiation 3J, 158-171, 1988; H.-H. Heidtmann et al.,

Cancer Res. 42, 6960-6965, 1989) ble det i hvert tilfelle preparert 3 ug poly(A)<+ >RNA for RNA-hybridiseringen ved Northern Blotting. Før "blottingen" av RNA farget med etidiumbromid i gelen, forsikret man seg om at det var like mengder av hver av RNA påsatt på gelen, eller tilstede pr. bane. Prepareringen av poly(A)<+->RNA, denatureringen av den og blottingen så vel som den videre fremgangsmåte for RNA-blot-analyse ble utført ifølge U. Gunthert et al., 1991, som ovenfor. Probe A fra variant-CD44-området av pMeta-1, som ble anvendt for hybridiseringen, var identisk med den som er angitt under punkt 2.1. Som probe B, som stammer fra den normale CD44-region av pMeta-1 som ligger nedstrøms etter vCD44, ble området angitt i U. Gunthert et al., 1991, som ovenfor, utvalgt. Som det kan sees av fig. 2, uttrykte human-cellelinjen LCLC97 av et storcelle-lungekarsinom sekvenser som er homologe til probe A av vCD44 av rotte. Med hensyn til probe B (normalt sCD44-område hos rotte), kunne det også påvises tydelige hybridiseringssignaler eller ekspresjoner av sCD44 i andre cellelinjer. Cellelinjene SCLC18 og SCLC24 var negative for begge prober. Til sammenlikning ble RNA'ene fra rottecellelinjene BSpAS (ikke-metastaserende) og BSpASML (metastaserende) påsatt (fig. 2, baner 7 og 8).

2.3 Isolering og karakterisering av CD44-varianter hos mennesker

Poly(A)<+->RNA'ene ble isolert ifølge kjent metode (M. Schwab et al., Nature 203., 497-501, 1983) fra de kjente cellelinjer SW260, HT29 (fas fra ATCC nr. CCL227 eller nr. HTB38), LCLC97 (som beskrevet under 2.2), HPKII (keratinocytt-cellelinje, beskrevet i P. Boukamp et al., J. Cell Biol. 106., 761-771, 1988) og MeWo (melanom-cellelinje, T.E. Carey et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 23., 3278-3282, 1976), og de ble deretter transkribert for PCR-forøkning med AMV-reversert transkriptase (20 enheter) i enkeltkjedet DNA.

For fremstilling av cDNA'ene ved PCR-forøkning ble det benyttet to primere fra normale human-CD44-cDNA-sekvenser, og i virkeligheten oligonukleotider som representerer posisjonene 513-540 og 900-922 (I. Stamenkovic et al., Cell 56, 1057-1062,1989). Denne utvelging skjedde på denne måte, siden innskuddene av de metastasespesifikke ekstrasekvenser hos rotten finnes mellom disse posisjoner (U. Gunthert et al., 1991, som ovenfor). Etter 60 cykluser ble PCR avsluttet og de oppnådde DNA-produkter oppløst ifølge kjent metode (T. Maniatis et al., 1982, som ovenfor) ved agarosegelelektroforese (1% agarose, Sigma) og farget med etidiumbromid. Med hensyn til den "normale" CD44-RNA-ekspresjon (sCD44) ble det ved anvendelse av denne primer oppnådd en cDNA med lengde 440 bp (innbefattende restriksjonsstedet for kloningen), slik som det kunne ventes for ekspresjon av denne RNA (MeWo- og SW620-celler). Når det gjelder RNA'ene fra de andre cellelinjer forefinnes det likeledes et bånd med samme lengde fra hver av disse, men i tillegg større PCR-produkter (cDNA'er). Fremherskende fragmenter med lengde 850 bp ble oppnådd med HT29- og LCLC97-celler. I HPKII-celler kunne de sterkeste bånd, ved siden av båndet på 440 bp, finnes i lengdeområdet 1,5 kb. Disse forhold er vist på fig. 3.

Alle cDNA'er som var oppnådd ved PCR-forøkning, ble klonet inn i vektoren pT7T3-19 (BRL, Gibco) og deretter sekvensert ifølge standardmetoder. Kloner av MeWo-celler og av SW60-celler inneholdt de normale CD44-(sCD44)-sekvenser (I. Stamenkovic et al., 1989, som ovenfor).

DNA- og aminosyresekvensen av hele variantregionen av de lengste cDNA som var oppnådd fra LCLC97-celler ved PCR og klonet i pT7T3-19, er vist på fig. 4A. Variantdelen omfatter 1014 bp (eller 338 aminosyrer), som er innført mellom nukleotidposisjonene 782 og 783 i den "normale" sCD44-RNA. Sekvensen i dette variantområde er under-inndelt i fem seksjoner eller doméner, hvilket er i overens-stemmelse med oppdagelsen av mindre PCR-produkter, som omfatter nøye definerte områder av den største klon (fra LCLC97). På grunn av det faktum at slike kloner kan isoleres reproduserbart fra forskjellige cellelinjer, kan det herav avledes at disse fem doméner D I - D V i LCLC97-cellelinjen (fig. 4A) gjenspeiler fem forskjellige eksoner som frembringer RNA'ene som PCR-klonene stammer fra, ved differensiell RNA-skjøting. Eksistensen av slike doméner kunne bekreftes ved oppdagelse av like forhold hos rottetumorcellelinjer.

En skjematisk oversikt over forholdene, slik som de foreligger når det gjelder LCLC97, er vist på fig. 4B. Ifølge kjent metode (U. Gunthert et al., 1991, som ovenfor) ble det ved PCR isolert en cDNA-klon homolog med det lengste skjøtings-produkt i LCLC97-celler fra den metastaserende rottetumorcellelinje BSpASML. Fig. 4A viser en sammenlikning av den derav avledede aminosyresekvens med aminosyresekvensen fra det menneskelige klon (fra LCLC97). Posisjonen av innskuddet av disse variantsekvenser er forskjellige ved tre aminosyrer (aminosyre-posisjon 222 hos mennesker, posisjon 226 hos rotter). Doméne I viser 83%, doméne II 83%, doméne III 71%, doméne IV 82% og doméne 66% homologi i forhold til de tilsvarende aminosyresekvenser hos rotter.

cDNA hos rotter som svarer til LCLC97 på fig. 4A, og som gir en tumor metastatisk potensial (U. Gunthert et al., 1991, som ovenfor), omfatter aminosyrene

258-420 og koder for doménene II og III. Aminosyresekvensen hos begge disse doméner er identisk med den aminosyrekvens som er avledet fra cDNA fra klonen pMeta-1, av det spesifikke BSp73ASML-ekstradoméne som er publisert av U. Gunthert et al., 1991, som ovenfor.

Eksempel 3: Immunundertrykkende virkning av det monoklonale antistoff

1.1 ASML som er rettet mot vCD44

3.1 Innvirkning av anti-vCD44 (1.1 ASML) på det humorale immunforsvar

På tidspunktet for antigenadministreringen ble det injisert intravenøst 200 /ug av det monoklonale antistoff 1.1 ASML til BDX-rotter. Som T-celle-uavhengig antigen ble det tilført intraperitonealt 50 fig 2,4,6-trinitrofenyl-lipopolysakkarid (TNP-LPS) (J.M. Fidler, Cellul. Immunol. 1Å, 223, 1975) og som T-celleavhengig antigen 5x10 celler av hapten-protein-konjugatet av 2,4,6-trinitrofenyl-røde hesteblodceller (TNP-HRBC) (M.B. Rittenberg, Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 132, 575-581, 1969) for immunisering av rottene. Antallet av cellene som danner de antigenspesifikke plakk (plakkdannende celler, PFC) ble bestemt 3 og 5 dager etter antigen-tilførselen eller injeksjon av 1.1 ASML, hvor det som målceller ble anvendt konjugater av 2,4,6-trinitrofenyl med saue-erytrocytter (røde saueblodceller (TNP-SRBC)) og HRBC (heste-erytrocytter eller røde hesteblodceller). PFC ble bestemt ifølge en modifikasjon (M. Zoller & G. Andrighetto, Cellul. Immunol. £9-, 310, 1984) av den hemolytiske plakkanalyse (N.K. Jerne & A.A. Nordin, Science 140, 405, 1963). Mengdebestemmelsen av anti-TNP-antistoffer i serum fira de immuni-serte rotter ble utført ifølge kjent metode (M. Zoller, Scand. J. Immunol. 31, 619, 1990), idet serumtitreringskurver ble sammenliknet med standardkurver av rensede monoklonale Anti-TNP-antistoffer ved hjelp av ELISA (E. Engvall & P. Perlman, J. Immunol. 109, 129, 1982).

Immunforsvarene både overfor det T-celleuavhengige antigen og det T-celle-avhengige antigen ble sterkt redusert eller undertrykket i nærvær av 1.1 ASML. Antallet av antigenspesifikke PFC ble redusert med 8-21% i forhold til kontroll-stimulerte dyr, og likeså ble det oppståtte serum-antistoffspeil undertrykket (tabell I)

Disse data muliggjør den tolkning at antistoffene enten bare virker ved hemning av B-lymfocyttstimuleringen eller at både B- og T-lymfocytter blokkeres.

Ekspresjon av vCD44 var imidlertid ikke bare nødvendig for det humorale, men også for det cellulære immunforsvar.

3.2. Innvirkning av anti-vCD44 på aktiveringen av T-lymfocytter

Effektiviteten av en allogen stimulering ble bestemt 4 dager etter immunisering ved bestemmelse av formeringen av T-celler etter fornyet stimulering in vitro.

DA-rottene som ble anvendt til dette, ble immunisert enten bare med 5x10 n bestrålte lymfocytter (3000 R) fra BDX-rotter, eller med bestrålte BDX-lymfocytter pluss 1.1 ASML (200 fig). Milt- og lymfeknutecellene fra disse ble stimulert på nytt in vitro med bestrålte BDX-lymfocytter.

Miltene og lymfeknutene ble oppsamlet 5 dager senere. Organene ble finknust forsiktig, og etter vasking i 15 ml RPMI 1640 ble cellene innstilt til 3 x 10^ celler pr. ml RPMI 1640, supplert med L-glutamin (4 mM), antibiotika (34 jiiM

penicillin, 32 [ iM streptomycin), 5 x 10 <5> M 2-merkaptoetanol, 10 <3> M Hepesbuffer og 2% varme-inaktivert rotteserum (RPMI-s). Porsjoner av cellesuspensjonen ble titrert tre ganger i mikrotiterplater med U-formige fordypninger. I hver fordypning ble det tilsatt 1,5 x 10<5> bestrålte (3000 R) BDX-lymfocytter i 100 /il RPMI-s, så vel som eventuelt monoklonale antistoffer 1.1 ASML i en sluttkonsentrasjon på 10 ug/ ml RPMI-s, renset ved protein A Sepharose 4B-kromatografi (Pharmacia).

Kulturene ble inkubert i 72 timer ved 37°C med 5% C02-gass ved atmosfæretrykk. Formeringen av DA-lymfocyttene ble bestemt ved tilsetning av 50 fiCi H-tymidin i løpet av de siste 8 timer av dyrkningen.

Innbyggingen av H-tymidin som mål for formeringen av T-celler og milt-celler fra slike rotter som ble immunisert sammen med l.lASML-allogen, var, sammenliknet med celler fra rotter som ble immunisert i fravær av antistoffet, drastisk redusert. Dette resultat var fortsatt det samme, uavhengig av om miltceller og lymfeknuteceller bare ble stimulert på nytt med allogene celler alene eller med allogene celler pluss 1.1 ASML (fig. 5).

3.3 Innvirkning av anti-vCD44 på aktiveringen av cytotoksiske T-celler

I forbindelse med T-celleformeringen i eksempel 3.2. ble den cytotoksiske aktivitet bestemt den syvende dag etter den allogene stimulering. Med hensyn til nødvendigheten av vCD44 under utviklingen og/eller aktiveringen av cytotoksiske T-celler (CTL), fikk man det praktisk talt identiske bilde som under eksempel 3.2 (fig. 5). I nærvær av 1.1 ASML ble antallet av cytotoksiske T-lymfocytter drastisk redusert (fig. 6).

Miltceller fra DA-rotter (DA-miltceller) som var blitt immunisert med BDX-lymfocytter som beskrevet i eksempel 3.2, ble oppsamlet 7 dager etter immunise-ringen og undersøkt med hensyn til cytotoksisk aktivitet overfor BDX-lymfoblaster (primære CTL).

Umiddelbart etter immunisering av oppsamlede DA-miltceller, ble de justert til 1x10 celler pr. ml RPMI-s. Porsjoner av cellesuspensjonen (effektorceller, E) ble titrert i mikrotiterplater med U-formige fordypninger, og 100 fil målceller (Target cells, T, 1 x 10<4> 51Cr-merkede BDX-conkanavalin A-lymfoblaster) ble tilsatt. Etter 6 timers inkubering ved 37°C, ble platene sentrifugert, porsjoner av supernatantene ble uttatt og den radioaktive stråling av51 Cr ble bestemt i en T-teller. På fig. 6 er vist middel-prosentsatsen for den spesifikke radioaktivitet av tre verdier.

Claims (21)

1. Anvendelse av antistoffer rettet mot variant-CD44-(vCD44)-overflateprotein hos et pattedyr eller deler derav, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for frembringelse av en immunundertrykkelse i en pattedyrorganisme i form av blokkert aktivering av B-celler og T-celler, og drastisk reduksjon av cytotoksisk T-cellerespons.

2. Anvendelse av antistoffer ifølge krav 1 til nedsettelse og/eller undertrykking av et immunforsvar.

3. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2 til terapeutisk behandling av immunregulatoriske forstyrrelser og/eller sykdommer.

4. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2 til forhindring og/eller forebygging av immunregulatoriske forstyrrelser og/eller sykdommer.

5. Anvendelse ifølge krav 1 til bekjempelse og/eller diagnostisering av en immunregulatorisk forstyrrelse.

6. Anvendelse ifølge kravene 1-3 til forhindring og/eller terapeutisk behandling av sykdommer og tilstander hvor det er nødvendig med en midlertidig eller varig nedsettelse eller undertrykking av et immunforsvar.

7. Anvendelse ifølge krav 6 for behandling av autoimmunsykdommer.

8. Anvendelse ifølge krav 6 til behandling av allergiske sykdommer.

9. Anvendelse ifølge krav 6 til behandling av degenerative, inflammatoriske, proliferative og/eller hyperproliferative, immunologiske sykdommer.

10. Anvendelse ifølge krav 9 til behandling av sykdommer i det reumatiske område, av multippel sklerose, psoriasis og atopisk dermatitt.

11. Anvendelse ifølge krav 6 til forhindring av vevs- og/eller organavstøting av transplanterte vev eller organer.

12. Anvendelse ifølge kravene 1 -11, idet pattedyrorganismen er en menneske-organisme.

13. Anvendelse ifølge kravene 1-12, idet antistoffet er et monoklonalt antistoff.

14. Anvendelse av et antistoff ifølge ett av kravene 1-13, idet antistoffet oppfatter et vCD44-overflateprotein eller deler av dette, som i det minste foreligger som en tilleggsdel til det normale CD44-doméne (sCD44).

15. Anvendelse ifølge krav 13, idet det monoklonale antistoff oppfatter epitopen definert ved aminosyresekvensen E-E-A-A-T-Q-K-E-K-W.

16. Anvendelse ifølge kravene 1-15, idet antistoffet er et fragment eller et derivat derav, eller et kimært eller hybrid-antistoff, et anti-idiotypisk antistoff eller et bispesifikt antistoff.

17. Anvendelse ifølge ett av kravene 1-16, idet det farmasøytiske preparat som inneholder antistoffet, foreligger som bruksferdig løsning, som tørrpreparat i en form som er egnet for rekondisjonering, eller som sett.

18. Anvendelse ifølge krav 17, idet det farmasøytiske preparat som inneholder antistoffet, foreligger i en tilførselsform for enteral eller parenteral, systemisk, lokal og/eller topisk administrering.

19. Anvendelse ifølge krav 17 og 18, idet det farmasøytiske preparat som inneholder antistoffet, foreligger i en form som er egnet for tilførsel som injeksjon, infusjon eller perfusjon.

20. Anvendelse av en hybridomcellelinje som utsondrer et antistoff ifølge ett av kravene 1-16, til fremstilling av et farmasøytisk preparat for frembringelse av en immunundertrykkelse i en pattedyrorganisme.

21. Anvendelse ifølge krav 20, idet hybridomcellelinjen utsondrer et monoklonalt antistoff som oppfatter epitopen definert ved aminosyresekvensen E-E-A-A-T-Q-K-E-K-W.