HU215495B

HU215495B - Enzimes eljárás optikailag aktív ciánhidrinek enantioszelektív előállítására

Info

Publication number: HU215495B
Application number: HU9203428A
Authority: HU
Inventors: Herfried Griengl; Norbert Klempier; Peter Pöchlauer
Original assignee: Chemie Linz Gmbh.
Priority date: 1991-10-31
Filing date: 1992-10-30
Publication date: 1999-01-28
Also published as: SI9200266B; AT396252B; AU2628892A; KR100255439B1; HUT63659A; UA26382C2; AU656812B2; ATA217491A; DE59209147D1; ES2111028T3; CZ326892A3; RU2067089C1; ATE162554T1; YU88092A; JP3174171B2; KR930008156A; EP0539767A1; SK280163B6; TW237479B; DK0539767T3

Abstract

A találmány tárgya egy enantiőszelektív eljárás valamilyen őptikailagaktív ciánhidrin S-enantiőmerjének előállítására őly módőn, hőgy egyaldehidet vagy egy aszimmetrikűs ketőnt valamilye cianidcsőpőrt-dőnőrral reagáltatnak egy S-hidrőxinitriláz jelenlétében. A reakciótvalamilyen hígítószerben végzik, és a képződött ciánhidrint eztkövetően izőlálják a reakcióelegyből. ŕ

Description

A találmány optikailag aktív ciánhidrinek enantioszelektív előállítására szolgáló enzimatikus eljárásra vonatkozik, melynek során valamilyen aldehidből vagy aszimmetrikus ketonból és egy cianidcsoport-donorból indulunk ki, és ezt egy hidroxinitriláz hatásának tesszük ki.

A ciánhidrinek jelentősége abban van, hogy belőlük biológiailag hatásos anyagok, mint például gyógyszerhatóanyagok, vitaminok vagy piretroid vegyületek előállításához szükséges α-hidroxisavakat lehet szintetizálni.

A ciánhidrineket például úgy állítják elő, hogy cianidcsoportot addicionáltatnak egy aldehid vagy egy keton karbonilszénatomjára, mimellett aldehid vagy aszimmetrikus keton alkalmazása esetén optikailag aktív ciánhidrinekből álló enantiomer elegyek keletkeznek. Minthogy a biológiai szempontból hatásos enantiomer elegyekben általában a két enantiomer közül csak az egyik enantiomer hatásos biológiailag, eddig sem hiányoztak azok a fáradozások, hogy olyan eljárást találjanak, melynek segítségével egy bizonyos optikailag aktív ciánhidrin kívánt enantiomeije lehetőleg magas értékű optikai tisztaságban előállítható.

így a Chemistry Letters, The Chemical Society of Japan (1986), 931-934 irodalmi helyen egy eljárást publikálnak valamilyen aldehid ciánhidrinezésére, melynek során egy cianidcsoport-donort és katalizátorként egy szintetikus úton készített dipeptidet alkalmaznak. Ez a reakció azonban csak igen kis mértékben enantioszelektív és a termékek optikai tisztasága nem kielégítő.

Az EP-A-0 326 063 számú szabadalmi publikációból ismertté vált egy reakció, melynek során alifás, aromás vagy heteroaromás aldehideket, illetve ketonokat hidrogén-cianiddal reagáltatnak egy oxinitriláz jelenlétében, amikor is enantioszelektíven a megfelelő R- vagy S-ciánhidrinek keletkeznek. A hidrogén-cianid használata azonban - alacsony forráspontja miatt - nehézséget okoz, ezen túlmenően a hidrogén-cianid egy igen mérgező vegyület, melyet ezért technikai eljárásban nem szívesen alkalmaznak.

A J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 6992-6996 irodalmi helyen eljárást ismertetnek R-ciánhidrinek előállítására. A reakciót úgy végzik, hogy aromás vagy alifás aldehideket egy D-oxinitriláz jelenlétében acetonciánhidriddel reagáltatnak. Annak érdekében, hogy enantiomerek tekintetében feldúsult termékeket kapjanak, az eljárást valamilyen vízzel nem elegyedő szerves oldószerben kell megvalósítani, minthogy vizes oldatban a termék racemizálódása következik be.

Teljesen váratlan módon mármost egy enantioszelektív eljárást sikerült találnunk valamilyen optikailag aktív ciánhidrin S-enantiomerjének előállítására, melynél a termékeket nagyfokú optikai tisztasággal kapjuk meg, és az eljáráshoz nem kell sem hidrogén-cianidot, sem szerves oldószert használni. Az S-ciánhidrineket, melyek alifás aldehidekből keletkeznek, ilyen módon első ízben sikerült egy S-hidroxinitriláz segítségével előállítani.

A találmány tárgya ennélfogva egy enantioszelektív eljárás valamely optikailag aktív ciánhidrin S-enantiomerjének előállítására egy aldehidnek vagy egy aszimmetrikus ketonnak valamilyen ciáncsoport-donorral történő reagáltatása útján, azzal jellemezve, hogy az aldehidet vagy a ketont valamilyen higítószerben és egy S-hidroxinitriláz jelenlétében reagáltatjuk a cianidcsoport-donorral, majd a reakcióelegyből a képződött ciánhidrint izoláljuk.

A találmány szerinti eljárásban kiindulási anyagként egy aldehidet vagy egy aszimmetrikus ketont, valamilyen cianidcsoport-donort, egy hidroxinitrilázt, valamint egy hígítószert alkalmazunk.

Aldehidek alatt alifás, aromás vagy heteroaromás aldehideket kell érteni. Az aszimmetrikus ketonok ugyancsak alifás, aromás vagy heteroaromás ketonok, melyeknél a karbonilszénatom nem azonos csoportokkal van helyettesítve. Előnyösen aldehideket, különösen előnyösen alifás vagy aromás aldehideket használunk. A szóban forgó aldehidek és ketonok ismert vegyületek, vagy a szokásos módon előállíthatok.

Cianidcsoport-donorként valamilyen R^QOHXCN) általános képletű ciánhidrin jön tekintetbe, ahol R, és R₂egymástól függetlenül hidrogénatomot vagy valamilyen helyettesítetlen, illetve a reakció körülményei között inért csoportokkal helyettesített szénhidrogéncsoportot, vagy pedig R] és R₂ együtt 4- vagy 5-szénatomos alkíléncsoportot jelent, de R₍ és R₂ egyidejűleg nem jelenthet hidrogénatomot. A szénhidrogéncsoportok alifás vagy aromás csoportok, melyek közül az alifás csoportok előnyösek. R! és R₂ előnyösen valamilyen 1-6 szénatomos alkilcsoportot jelent. Cianidcsoport-donorként nagyon előnyös vegyület az aceton-ciánhidrin.

A cianidcsoport-donor előállítását ismert eljárásokkal lehet megvalósítani. A ciánhidrineket, különösen az aceton-ciánhidrint, a kereskedelemben is beszerezhetjük.

Hidroxinitrilázként az S-hidroxinitrilázok, így például a Sorghum bicolorból (tarka cirok) és a Hevea brasiliensisből (kaucsukfa) származók jönnek tekintetve. Különösen alkalmas az a hidroxinitriláz, melyet Hevea brasiliensisből állítanak elő. A hidroxinitrilázt emellett tisztított vagy tisztítatlan, illetve természetes vagy immobilizált alakban lehet előállítani. A hidroxinitriláz készítését és tisztítását például ammónium-szulfáttal végzett kicsapással és ezt követő gélfiltrációval valósítjuk meg, példának okáért a D. Serlmar és szerzőtársai által leírtak szerint (Physiologia Plantarum 75(1989), 97-101).

A reakciót valamilyen hígítószerben valósítjuk meg. Különösen előnyös, hogy a reakciót egy vizes hígítószerben, szerves oldószer hozzátétele nélkül is megvalósíthatjuk, ami egyébként gyors ütemben csökkenti az enzim aktivitását és váratlan módon ez nem vezet a termék racemizálódásához. A találmány szerinti reakciót azonban valamilyen szerves hígítószerben vagy szerves oldószer jelenlétében is meg lehet valósítani. Emellett a szerves oldószer egy vizes rendszerben társoldószerként, vagy pedig egy kétfázisú rendszerben, mint például egy membránreaktorban oldószerként szolgálhat. Szerves hígítószerként alkalmazhatunk adott esetben halogénezett alifás vagy aromás szénhidrogéneket, továbbá alkoholokat, étereket és

HU 215 495 Β észtereket. Szerves társoldószerként vízzel elegyedő szerves oldószereket, így alkoholokat, míg kétfázisú rendszerekben oldószerként vízzel nem elegyedő szerves oldószereket, így például adott esetben halogénezett alifás vagy aromás szénhidrogéneket, továbbá étereket, észtereket használhatunk. A reakciót előnyösen nem egy szerves oldószer jelenlétében, hanem valamilyen vizes hígítószerben folytatjuk le. Vizes hígítószerként vizet, továbbá valamilyen vizes sóoldatot vagy pufferoldatot alkalmazunk. Előnyösen vizes pufferoldatot, egészen különös módon előnyösen olyant használunk, amely nátrium-citrátot tartalmaz, mimellett ezek pH-értékének 7 alatt, előnyösen körülbelül 3 és 5 között kell lennie.

Az aldehid vagy az aszimmetrikus keton egy grammnyi mennyiségéhez mintegy 150-300 g hígítószert és 500-2000 IU, előnyösen mintegy 800-1500 IU aktivitású hidroxinitrilázt adunk. Emellett 1 IU (International Unit, azaz nemzetközi egység, NE) percenként 1 mikrontól termék keletkezését fejezi ki 1 g nyers enzimizolátum hatására. Az esetenként szükséges hidroxinitriláz mennyiségét legjobban egy aktivitási teszttel határozzuk meg, nagyjából a Selmar és szerzőtársai szerint leírt módon, lásd: Analytical Biochemistry 166 (1987), 208-211.

Az alkalmazott vegyület aldehid- vagy ketocsoportjának 1 mólnyi mennyiségére számítva legalább 1 mól, előnyösen 1-2 mól cianidcsoport-donor hozzáadása szükséges.

A reakcióelegyet körülbelül 0 °C és a hidroxinitriláz dezaktiválódási hőmérséklete közötti hőmérsékleten, előnyösen 20-30 °C között rázatjuk vagy keverjük, miközben a cianidcsoport-donorból származó cianidcsoport az alkalmazott aldehid vagy keton karbonilszénatomjára addicionálódik és túlnyomó részben a reakcióhoz használt aldehidnek vagy ketonnak megfelelő optikailag aktív ciánhidrin S-enantiomerje keletkezik. A reakció előrehaladását emellett gázkromatográfiás módszer alkalmazásával követjük.

A reakció befejeződése után a keletkezett ciánhidrint valamilyen vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, így adott esetben halogénezett alifás vagy aromás szénhidrogénnel, mint például pentánnal, hexánnal, benzollal, toluollal, metilén-dikloriddal, kloroformmal, klór-benzollal, továbbá valamilyen éterrel, így dietiléterrel vagy diizopropil-éterrel, vagy valamilyen észterrel, példának okáért ecetsav-etilészterrel, illetve a felsorolt oldószereket tartalmazó oldószereleggyel végzett extrahálással nyeljük ki a reakcióelegyből. Amennyiben az extrahált tennék tisztasága nem kielégítő, úgy a fentiek után egy tisztítási műveletet végzünk. A tisztítás ismert módszerekkel történhet, és legjobban kromatografálással sikerül.

Egy előnyös megvalósítási forma értelmében mintegy 100 mg aldehidet 15-30 g vizes pufferoldatban, amely nátrium-citrátot tartalmaz és a pH-ja körülbelül 4, az alkalmazott aldehid- vagy ketocsoport 1 móljára számítva 2 mól aceton-ciánhidrinnel és 200 IU aktivitásnak megfelelő, Hevea brasiliensisből származó hidroxinitrilázzal szobahőmérsékleten rázatunk. A reakció előrehaladását gázkromatográfiás módszerrel követjük. A reakció befejeződése után a reakcióelegyet metiléndikloriddal extraháljuk, a szerves fázist szárítjuk és bepároljuk. A maradék további tisztítását oszlopkromatográfiás módszerrel végezzük.

A találmány szerinti eljárással így egyszerű útonmódon optikailag aktív S-enantiomerre nézve dúsított ciánhidrineket állítunk elő anélkül, hogy ehhez hidrogén-cianidot vagy szerves oldószert kellene alkalmazni. Az eljárás ennélfogva hozzájárul a technika gazdagításához.

1. példa

100 mg (1 mmol) kapronaldehidet (hexanal) feloldunk 20 ml 0,1 mólos citrátpufferben, melynek pH-értéke: 4. Ezt 1 g fagyasztva szárított nyers enzimizolátummal (grammonként 100 IU aktivitás, előállítva D. Selmar és szerzőtársai szerint, Physiologica Plantarum, 75 (1989) 97-101), valamint 168 mg (2 mmol) aceton-ciánhidrinnel elegyítjük, majd ezt egy rázóberendezéssel 2 órán át szobahőmérsékleten rázatjuk. A reakciót gázkromatográfiás módszerrel követjük. A reakció befejeződése után három ízben, alkalmanként 25 ml metilén-dikloriddal extrahálást végzünk. Ezután a szerves fázisokat egyesítjük, nátrium-szulfát felett szárítjuk és az oldószert forgó bepárlóberendezésben elpárologtatjuk.

Ilyen módon 114 mg S-kapronaldehid-ciánhidrint kapunk, ami az elméleti kitermelés 90%-ának felel meg, és a tennék enantiomer tisztasága (ee): 84%-os.

2. példa mg (0,75 mmol) benzaldehidet és 128 mg (1,5 mmol) aceton-ciánhidrint az 1. példában leírt módon 15 ml 0,1 mólos (pH-érték = 4) citrátpufferben az

1. példában ismertetett nyers enzimizolátum 1 g-nyi mennyiségével reagáltatunk.

Ilyen módon 45 mg S-benzaldehid-ciánhidrint kapunk, ami az elméleti kitermelés 45%-ának felel meg. Ennek enantiomer tisztasága (ee): 94%-os.

A keletkezett aldehid-ciánhidrinek optikai tisztaságának meghatározása gázkromatográfiás módszerrel történt, mentil-karbonátos kapillároszlopon (lásd: J. W. Westley és szerzőtársai, J. Org. Chem. 33 (1968), 3978-3980).

A keton-ciánhidrinek optikai tisztaságának meghatározását gázkromatográfiás módszerrel végeztük egy királis elválasztó fázison, a V. Schurig és szerzőtársai által leírt módon (lásd: Ang. Chemie 102 (1990), 969-986).

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Enantioszelektív eljárás valamely optikailag aktív ciánhidrin S-enantiomeijének előállítására egy aldehidnek vagy egy aszimmetrikus ketonnak valamilyen cianidcsoport-donorral történő reagáltatása útján, azzal jellemezve, hogy az aldehidet vagy a ketont valamilyen hígítószerben és egy S-hidroxinitriláz jelenlétében rea3

HU 215 495 Β gáltatjuk a cianidcsoport-donorral, majd a reakcióelegyből a képződött ciánhidrint izoláljuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy alifás, aromás vagy heteroaromás aldehidet reagáltatunk.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy alifás vagy egy aromás aldehidet reagáltatunk.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy cianidcsoport-donorként egy (R!)(R₂)C(OH)(CN) általános képletű ciánhidrint használunk, ahol R| és R₂ alkilcsoportot jelent.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy cianidcsoport-donorként aceton-ciánhidrint alkalmazunk.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy higítószerként valamilyen vizes hígítószert alkalmazunk.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakciót egy olyan pufferoldatban valósítjuk meg, melynek pH-értéke 3 és 5 között van.
8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, 5 azzal jellemezve, hogy hidroxinitrilázként egy olyan

S-hidroxinitrilázt alkalmazunk, amely Hevea brasiliensisből vagy Sorghum bicolorból származik.
9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a képződött ciánhidrint a reak10 cióelegyből extraháljuk, majd azt kromatografálással tisztítjuk.
10. Eljárás Hevea brasiliensisből vagy Sorghum bicolorból származó S-hidroxinitriláz alkalmazására, azzal jellemezve, hogy az 1-9. igénypont bármelyike
15 szerinti eljárásban S-ciánhidrinek előállítására alkalmazzuk.