SK280163B6 - Enantioselektívny spôsob výroby s-enantiomérov opt - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka enantioselektívneho spôsobu výroby S-cnantiomérov opticky aktívnych kyánhydrínových derivátov z aldehydu a asymetrického ketónu a donoru kyanidových skupín za pôsobenia enzýmu hydroxynitrillyázy. Vynález sa týka aj použitia uvedeného enzýmu na výrobu kyánhydrínových derivátov.

Doterajší stav techniky

Kyánhydrínové deriváty majú vyznám napríklad pri syntéze cc-hydroxykyselín, ktoré majú svoje použitie pri výrobe biologicky účinných látok, vitamínov a tiež pyretroidných zlúčenín.

Kyánhydrínové deriváty je možné získať napríklad tak, žc sa kyanidová skupina naviaže na uhlíkový atóm karbonylovej skupiny aldehydu alebo ketónu, pričom pri použití aldehydu alebo asymetrického ketónu vznikajú zmesi enantiomérov opticky aktívnych kyánhydrínov. Vzhľadom na to, že v biologicky účinných zmesiach enantiomérov je všeobecne biologicky účinný len jeden z týchto enantiomérov, boli vykonávané pokusy nájsť spôsob, ktorým by bolo možné získať požadovaný enantiomér opticky aktívneho kyánhydrínu s čo možno vysokou optickou čistotou.

Napríklad V Chemistry Letters, The Chemical Society of Japan (1986), 931 až 934 sa opisuje spôsob získavania kyánhydrínu z aldehydu pri použití donoru kyanidových skupín a syntetického dipeptidu ako katalyzátora. Táto reakcia však prebieha enantioselektívne len vo veľmi obmedzenej miere a optická čistota produktu je neuspokojivá.

Z európskeho patentového spisu č. 0 326 063 je známe nechať reagovať alifatické, aromatické alebo heteroaromatické aldehydy alebo ketóny s kyselinou kyanovodíkovou v prítomnosti oxynitrilázy za enantioselektívneho vzniku zodpovedajúcich R- alebo S-kyánhydrínov. Použitie kyseliny kyanovodíkovej je však vzhľadom na nízku teplotu topenia tejto látky veľmi ťažké. Okrem toho je kyselina kyanovodíková veľmi jedovatá a z tohto dôvodu je využívaná v technických postupoch len v prípade nevyhnutnosti.

V publikácii J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 6992 až 6996 je opísaný spôsob výroby R-kyánhydrínov reakciou aromatických alebo alifatických aldehydov s acetónkyánhydrínom za prítomnosti enzýmu D-oxynitrilázy. Aby bolo možné získať produkty, obohatené o požadovaný enantiomér, je nutné postup uskutočňovať v prítomnosti organického, s vodou nemiešateľného rozpúšťadla vzhľadom na to, že v prípade uskutočňovania reakcie len vo vodnom roztoku dochádza k racemizácii produktu.

Podstata vynálezu

Teraz bol neočakávane nájdený spôsob enantioselektívneho získavania S-enanliomérov opticky aktívnych kyánhydrínov, pri ktorom je možné získať výsledné produkty s vysokou optickou čistotou a pri ktorom nie je nutné použiť ani kyselinu kyanovodíkovou ani žiadne organické rozpúšťadlo. S-kyánhydríny, odvodené od alifatických aldehydov, je možné týmto spôsobom prvýkrát získať pri použití S-hydroxynitrillyázy.

Podstatu vynálezu teda tvorí enantioselektívny spôsob výroby S-enantiomérov opticky aktívnych kyánhydrínov reakciou aldehydu alebo asymetrického ketónu s acetónkyánhydrínom vo vodnom a/alebo organickom rozpúšťadle za prítomnosti S-hydroxynitrillyázy z Hevea brasiliensis. Získaný kyánhydrín sa z reakčnej zmesi izoluje.

Ako východiskové materiály pre spôsob podľa vynálezu sa použijú aldehyd asymetrický ketón, acetónkyánhydrín, hydroxynitrillyáza a riedidlo.

Z aldehydov je možné použiť alifatické, aromatické alebo hetcroaromatické aldehydy. Nesymetrické ketóny sú alifatické, aromatické alebo heteroaromatícké ketóny, v ktorých je atóm uhlíka karbonylovej skupiny substituovaný nesymetricky. Výhodné na toto použitie sú aldehydy, najmä alifatické alebo aromatické aldehydy. Aldehydy a ketóny uvedených typov sú známe a je možné ich tiež vyrobiť známymi spôsobmi.

Ako donor kyanidových skupín prichádza do úvahy kyánhydrín všeobecného vzorca R*R²C(OH)(CN), v ktorom R¹ a R² znamenajú nezávisle od seba atóm vodíka alebo nesubstituovanú alebo za reakčných podmienok inertnými skupinami substituovanú uhľovodíkovú skupinu, alebo tvorí R¹ a R² spoločne alkylénovú skupinu so 4 až 5 atómami uhlíka za predpokladu, že oba uvedené symboly neznamenajú súčasne atómy vodíka. Uhľovodíkové skupiny môžu byť alifatické alebo aromatické, výhodne alifatické. Výhodne znamenajú R¹ a R² alkylové skupiny s 1 až 6 atómami uhlíka, najmä výhodným donorom kyanidových skupín je acetónkyánhydrin.

Donor kyanidových skupín je možné vyrobiť na základe známych postupov. Kyánhydríny, najmä acetónkyánhydrín sa tiež bežne obchodne dodávajú.

Z hydroxynitrillyáz prichádzajú do úvahy S-hydroxynitrillyázy a Hevea brasiliensis. Bolo dokázané, že zvlášť výhodným enzýmom na toto použitie je hydroxynitrillyáza z Hevea brasiliensis. Je možné použiť hydroxynitrillyázu čistenú alebo nečistenú, samu osebe alebo v imobilizovanej forme. Príprava a čistenie hydroxynitrillyázy môže byť uskutočnené napríklad zrážaním pomocou síranu amónneho s následnou filtráciou na géli, napríklad podľa publikácie D. Selmar a ďalší, Phvsiologia Plantarum 75. 1989, str. 97 až 101.

Reakcia sa uskutočňuje v riedidle. Ako zvlášť výhodné sa ukázalo uskutočňovanie spôsobu vo vodnom riedidle bez prísady organických rozpúšťadiel, ktoré rýchlo spôsobí pokles účinnosti enzýmu, pričom neočakávane nedochádza k žiadnej racemizácii výsledného produktu. Spôsob podľa vynálezu však je tiež možné uskutočniť v organickom riedidle alebo za prítomnosti organického rozpúšťadla. Organické rozpúšťadlo je v tomto prípade možné použiť ako pomocné rozpúšťadlo vo vodnom systéme alebo ako rozpúšťadlo v dvojfázovom systéme, napríklad v reaktore, opatrenom membránou. Ako organické riedidlo je možné použiť alifatické alebo aromatické uhľovodíky, ktoré sú prípadne halogénované, ďalej alkoholy, étery, estery. Ako pomocné organické rozpúšťadlá je možné použiť s vodou miešateľné organické rozpúšťadlá, napríklad alkoholy, ako rozpúšťadlá pre dvojfázový' systém je možné použiť organické rozpúšťadlá, nemiešateľné s vodou, ako alifatické alebo aromatické uhľovodíky, prípadne halogénované, étery alebo estery-·. Výhodne sa spôsob podľa vynálezu uskutočňuje v neprítomnosti organického rozpúšťadla vo vodnom riedidle. Ako vodné riedidlo je možné použiť vodu, vodný roztok soli alebo vodný roztok pufra. Výhodne sa použije vodný roztok pufra, najmä pufra, obsahujúceho citrát sodný. Hodnota pH má bvť upravená pod 7, výhodne v rozmedzí 3 až 5.

Na 1 g aldehydu alebo asymetrického ketónu je potrebné použiť približne 15 až 300 g riedidla a 500 až 2000 medzinárodných jednotiek (RJ) enzýmu hydroxynitrillyázy, výhodne 800 až 1500 IU enzýmu. Jedna IU je taká účin2

SK 280163 Β6 nosť enzýmu, pri ktorej dochádza na 1 g surového enzýmu k vzniku jedného mikromolu výsledného produktu za minútu. Množstvo enzýmu, ktoré je potrebné na uskutočnenie reakcie je možné stanoviť pomocou testu na účinnosť enzýmu podľa pubhkácie Selmar a ďalší, Analytical Biochemistry 166,1987, 208 až 211.

Na 1 mol použitých aldehydových skupín alebo ketónových skupín je nutné do reakčnej zmesi pridať aspoň 1 mol, výhodne 1 až 2 moly donoru kyanidových skupín.

Reakčná zmes sa pretrepáva alebo mieša pri teplote 0 °C až do teploty, pri ktorej dochádza k deaktivácii enzýmu hydroxynitrillyázy, výhodne pri teplote 20 až 30 °C.

Za týchto podmienok dochádza k prenosu kyanidovej skupiny z donoru kyanidových skupín na atóm uhlíka karbonylovej skupiny použitého aldehydu alebo ketónu a vzniká prevažne S-enantiomér opticky aktívneho kyánhydrínu, zodpovedajúci použitému aldehydu alebo ketónu. Priebeh reakcie je možné sledovať napríklad plynovou chromatografiou.

Po skončení reakcie je možné takto vytvorený kyánhydrín z reakčnej zmesi extrahovať pomocou organického rozpúšťadla, nemiešateľného s vodou, napríklad alifatického alebo aromatického uhľovodíka, prípadne halogénovaného, ako je pentán, hexán, benzén, toluén, metylénchlorid, chloroform, chlórbenzén, étery, napríklad dietyléter, diizopropyléter alebo estery, napríklad etylester kyseliny octovej, je možné použiť aj zmesi uvedených rozpúšťadiel. V prípade, že čistota takto extrahovaného produktu nie je dostatočná, je možné výsledný produkt ďalej čistiť. Toto čistenie je možné uskutočniť niektorým zo známych spôsobov, výhodne chromatograficky.

Vo výhodnom uskutočnení je možné postupovať tak, že sa pri teplote miestnosti pretrepáva reakčná zmes, obsahujúca 100 mg aldehydu v 15 až 30 g vodného roztoku pufra s pH približne 4 s obsahom citrátu sodného, 2 moly acetónhydrinu na 1 mol použitých aldehydových skupín alebo ketoskupín a 200 IU hydroxynitrillyázy z Hevea brasiliensis. Priebeh reakcie j e možné sledovať plynovou chromatografiou. Po skončení reakcie sa reakčná zmes extrahuje metylénchloridom, organická l'áza sa vysuší a potom sa odparí. Ďalšie čistenie odparku je možné uskutočniť chromatografiou na stĺpci.

Spôsobom podľa vynálezu je teda možné jednoduchou cestou vyrobiť opticky aktívne, o S-enantiomér obohatené kyánhydríny, bez toho aby bolo potrebné použiť kyselinu kyanovodikovú alebo organické rozpúšťadlo. Spôsob podľa vynálezu teda znamená dokázateľný technický pokrok.

Praktické uskutočnenie spôsobu podľa vynálezu bude vysvetlené nasledujúcimi príkladmi, ktoré však nemajú slúžiť na obmedzenie rozsahu vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

100 mg, 1 mmol aldehydu kyseliny kaprónovej sa rozpustí v 20 ml 0,lM citrátového pufra s pH 4, potom sa pridá 1 g surového izolovaného prášku, získaného spôsobom podľa publikácie D. Selmar a ďalší, Physiologia Plantarum 75,1989, str. 97 až 101 a 168 mg, 2 mmol acetónkyánhydrínu a zmes sa pretrepáva 2 hodiny pri teplote miestnosti na trepacom zariadení. Priebeh reakcie sa sleduje plynovou chromatografiou. Po skončení reakcie sa zmes extrahuje 3 x 25 ml metylénchloridu. Organické fázy sa spoja, vysušia sa síranom sodným a rozpúšťadlo sa odparí na rotačnom odparovači.

Týmto spôsobom sa vo výťažku 90 % teoretického množstva získa 114 mg S-kaprónaldehydkyánhydrínu s enantiomémou čistotou približne 84 %.

Príklad 2 mg, 0,75 mmol benzaldehydu a 128 mg, 1,5 mmol acetónkyánhydrínu sa nechá reagovať spôsobom, opísaným v príklade 1 v 15 ml 0,lM citrátového pufra s pH 4 s 1 g surového izolovaného enzýmu, opísaného v príklade 1.

Týmto spôsobom sa vo výťažku 45 % teoretického množstva získa 45 mg S-benzaldehydkyánhydrinu, ktorého cnantioméma čistota je približne 94 %.

Stanovenie optickej čistoty takto získaných aldehydkyánhydrínov je možné uskutočniť plynovou chromatografiou pri použití kapilárneho stĺpca vo forme metylkarbonátu spôsobom, opísaným v publikácii J. W. Westley a ďalší, J. Org. Chem. 33, 1968, str. 3978 až 3980.

Stanovenie optickej čistoty ketónkyánhydrínov bolo uskutočňované taktiež plynovou chromatografiou pri použití chirálnej deliacej fázy spôsobom podľa publikácie vSchurig a ďalší, Andrew. Chemie 102, 1990, str. 969 až 986.

Claims (7)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Enantioselektívny spôsob výroby S-enantiomérov opticky aktívnych kyánhydrinov reakciou aldehydu alebo asymetrického ketónu s acetónkyánhydrínom, vyznačujúci sa tým, že aldehyd alebo ketón reaguje s acetónkyánhydrínom vo vodnom a/alebo organickom rozpúšťadle za prítomnosti S-hydroxynitrillyázy z Hevea brasiliensis a získaný kyánhydrín sa z reakčnej zmesi izoluje.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa nechá reagovať alifatický, aromatický alebo heteroaromatický aldehyd.
3. 3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že sa nechá reagovať alifatický alebo aromatický aldehyd.
4. 4. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že sa ako rozpúšťadlo použije voda.
5. 5. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že sa reakcia vykonáva vo vodnom roztoku pufra pri pH v rozmedzí 3 až 5.
6. 6. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že sa vytvorený kyánhydrín z reakčnej zmesi extrahuje a potom sa chromatograficky čistí.
7. 7. Použitie S-hydroxymtrillyázy z Hevea brasiliensis na výrobu S-kyánhydrínov.