HU205149B - Process from extracting material having anticoagulant activity from haementeria ghilianii leech and for purifying same - Google Patents

Description

Atalálmány tárgya eljárás antikoaguláns, azazXgfaktort gátló hatású, fehérje szerű új anyagnak Haementeria ghilianii píóca-nyáláhól vagy nyálmirigyeiből történő elkülönítésére és tisztítására kromatográfiás elválasztási technikákalkahnazásával.

Az antikoagulánsok hasznos gyógyszerek pl. a következő betegségek gyógyszeres kezelésében: akut mélyvénás trombózis, tüdőembólia, a végtagok akut arteríális embóliája, szívizominfarktus és a szétszórt intravaszkuláris koaguláció. Feltételezések szerint az antikoagulánsok profilaktikus adagolása megelőzi az embóliás állapot visszatérését reumatikus vagy arterioszWerotikus eredetű szívbetegségben szenvedő betegekben és megakadályozza bizonyos tromboembóliás szövődmények fellépését sebészeti beavatkozások esetén. Antikoakulánsok bevitele javasoltnak látszik az artéria coronaria és az agyi érrendszer betegségeinek kezelésében. Az arteríális trombózis, különösen a szívizmot és az agyat ellátó artériákban, az'egyik vezető elhalálozási ok.

A véralvadás sikere számos enzim és kofaktor függvénye és két, eymástól elkülönült úton megy végbe; ezek: a belső (intrinsic) ésakülső (extrinsic) út. Abelső (vagy kaszkád) út esetében valamennyi tényező jelen van a keringő vérben, de ezen mechanizmus szerint a már megindult alvadás befejeződéséhez több; percre van szükség. A külső út esetében egyes lipoproteinek. pl, a ΠΓ. faktor (amelyek a keringő vérben normális körülmények között nincsenek jelen) szabadulnak fel, károsodott sejtekből, és másodperceken belülmegkezdődik az alvadás. Ezek az utak az alvadási folyamatban egy ponton találkoznak, amikor is az Xg faktor az V. faktorral és a kalcium-ionnal együtt - a protrombínáz komplexet képezi, a protrombin trombinná való átalakításának katalizálására, így az X_a faktor létfontosságú mindkét koaguláciős út szempontjából és gátlása - az októl függetlenül - csökkentené a véralvadás intenzitását. Több X_a faktor inhibitor ismert, ezek azonban vagy a klór-keton típushoz tartoznak, amelyek teljesen toxikusak, vagy nem-specifikus szerinprotaáz inhibitorok. így egy olyan anyag, amely az X_a faktor specifikus és nem-toxikus inhibitora, jelentős terápiás értékkel rendelkezne.

A piócákat az ókortól kezdve használják a gyógyászatban. A piócák gyógyászati alkalmazása a 19. század elején olyan mértékűvé vált, hogy aHirudo medicinalis faj csaknem kipusztult és Oroszország ennek folytán kénytelen vol( export-kvótákat meghatározni. Újabban tudományosabb alapokon talnulmányozzák a'piócák által kiválasztott anyagokat és azt találták, hogy ezekszámos különböző biológiai terméket tartalmaznak, amelyek széles spektrumú biokémiai és farmakológiai aktivitást (pl. antikoaguláns, áttétel-képződés elleni, érzéstelenítő, antibiotikus és értágító hatást) mutatnak. A Hirudo medícinalis pióca nyálmirigyéből elkülönített hirudin pl. a legspecifikusabb és leghatásosabb ismert trombin inhibitor. A hementin viszont, amelyet a Haementeria ghlidianii pióca nyálmirigyéből izoláltak, állítólagosán magas molekulasúlyú fibrin(ogen)olitikus enzim (4,390,630 számú amerikai szabadalmi leírás). Közismerten ez az említett pióca antikoaguláns hatóanyaga. Ez az enzim inkább olymódon hat, hogy lebontja a fibrinogént és afibrint, mint oly módon, hogy aktiválná a gazdaszervezet fibrinolitiíais rendszerét vagy gátolná a koagulációs rendszert. Vizsgálataink során olyan fehérje-természetű anyagot azonosítottunk és különítettünk el á Haementeria ghilianii pióca nyálából és nyálmirigy-szövet kivonataiból, amely specifikus Xa faktor inhibitor ésfelhasználható a véralvadásgátlására.

A találmány szerinti eljárás során a Haementeria ghilianii pióca nyálát vagy nyálmirigyeinek kivonatát kromatográfiás szétválasztási műveletnek vetjük alá, anioncserélő gyanta felhasználásával, és növekvő sógrádienssel eluálunk. Ezután a magas X_a-faktor-gátló és alvadásgátló aktivitással rendelkező frakciókat fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiának (HPLC) Vetjük alá, az Xg faktort gátló hatást mutató anyag további tisztítására.

Á találmány szerinti eljárással előállított fehérjetermészetű anyag több, hasonló szekvenciájú fehérjéből áll, és ezek közül legalább 2 fehérje tehető alapvetőenfelelőssé azX_a faktort gátló aktivitásért, mely fehérjék, illetve peptidek jelentős X_a faktort gátló aktivitást mutatnak, azaz IC₅₀ értékűek legalább lOOOpM.

Vizsgálataink során azt találtuk, hogy a találmány szerinti fehérjeszerű anyag olyan peptideket tartalmaz, melyek molekulatömege kb. 18 kdal és ezek nem nagymértékben glikozilezettek, továbbá azt, hogy míg egyes cukor-csoportok jelen lehetnek ugyan, a látszólagos molekulatömeg nem váltakozik jelentősen az SDS PAGE meghatározása során a poliakrilamid gél koncentrációval, ez arra mutat, hogy a peptideken nincs jelen nagyszámú glikozil-csoport. Ugyancsak megállapítottuk, hogy mindegyik peptid kb. 6 alanin csoportot, 5 metionin csoportot, 12-14 lizin csoportot, 18-21 arginin csoportot és 16-17 prolin csoportot tartalmaz és az aromás csoportok valamilyen nagyobb mennyiségben vannak jelen (pl. 4 fenil-alanin és 6 tirozin csoport határozható meg).

A leírásban a következő ismert rövidítéseket alkalmazzuk az aminosavak jelölésére:

Alá (vagy A) - alanin

Arg (vagy R) - arginin

Asn (vagy N) - aszparagin

Asx - aszparagin és/vagy aszparaginsav

Asp (vagyD)-aszparginsav

His (vagyH) -hisztidin

Ser (vagy S) - szer ín

Gin (vagy Q) - glutamin

Pyr-E -piroglitaminsav

Glu (vagy G) -glicin

Glx -glutaminsav és/vagy glutamin

Leu (vagy L) - leucin

De (vagy I) - izoleucin

Lys (vagyK) -lizin

Cys (vagy C) -cisztein

Met (vagy M) - metionin

Phe (vagy F) - fenil-alanin

HU 205 149 Β

Pre (vagy P)-prolin

Thr (vagy T) -treonin

Tyr (vagy Y)- tirozin

Val (vagy V)-valin

A találmány szerinti eljárással előállított fehérjetermészetű anyagot alkotó peptidek - mint általában a fehérjék/peptidek - bármely nem toxikus szerves vagy szervetlen savval gyógyászati szempontból elfogadható sókat képezhetnek.

A gyógyászatilag elfogadható sók előállításánál általában szem előtt tartani az „Alán G. Marshall, Biophysical Chemistry, Principles, Techniques and Applications, Page 58-63,” és „E. J. Cohn, Chem, Rec. 19,241 (1936)” közleményekben a makromolekuláris oldhatóság fizikai tulajdonságaival és főbb jellemzőivel kapcsolatban leírtakat.

Jellegzetes szervetlen sav például, amellyel megfelelő só képezhető, a. sósav, hidrogénbromid, kénsav, foszforsav és a savas fém-sók, például a nátrium-monohidrogén-ortofoszfát és a kálium-hidrogén-szulfát. Jellegzetes szerves savak, amelyekkel megfelelő sók képezhetők, például a mono-, di- és trikarbonsavak. Jellegzetes ilyen savak például az ecetsav, glikolsav, tejsav, piroszőlősav, malonsav, borostyánkősav, glutársav, fumársav, almasav, bőrkősav, citromsav, aszkorbinsav, maleinsav, hidroxi-maleinsav, benzoesav, hidroxi-benzoesav, fenil-ecetsav, fahéjsav, szalicilsav, 2-fenoxi-benzoesav és a szulfonsavak, például a metán-szulfonsav és a 2-hidroxi-etán-szulfonsav. A karboxi-terminális aminosav-maradék sói a bármely megfelelő szervetlen vagy szerves bázissal képzett nem-toxikus karbonsav-sókat jelentik. Ilyen sók jellegzetesen például a következők: alkálifém-, például nátrium- és kálium-sók, alkáli-földfém-, például kalcium- és magnézium-sók, a ΠΙΑ csoportba tartozó könnyűfémek, ideértve az alumínium-sók, a ΠΙΑ csoportba tartozó könnyűfémek, ideértve az alumíniumot is, sói; és a szerves primer, szekunder és tercier aminokkal - amilyen például egy tri-alkil-amin, mint a trietilamin, prokain, dibenzil-amin, L-etén-amin, N,N’-dibenziÍ-etilén-diamin-dihidro-abietíl-amin,N(rövidszénláncú)-alkil-piperidin és bármely más megfelelő amin - alkotott sók.

A tallmány szerinti, X_a faktort gátló hatású fehérjeszerű anyagok alvadásgátló dózisa 0,2 mg/kg 250 mg/kg testtömeg/nap, pl. a beteg állapotának és a kezelendő trombotilais betegség súlyosságának függvényében. Egy adott beteg esetében a megfelelő dózis könnyen meghatározható. Előnyösen napi 1-4 dózist viszünk be, amelyek jellegzetes esetben 5-100 mg/dózis aktív vegyületet tartalmaznak. A szakember könynyen meghatározhatja a találmány szerinti, X_a faktort gátló aktivitással rendelkező anyag ahhoz szükséges koncentrációját, hogy a véralvadás gátlására való felhasználás esetén gátolja az X_a faktort, vagy valamely közegben, pl. tárolt vérben gátolja az X_a faktort.

Az antikoaguláns terápia, javallt számos trombotikus állapot, különösen az artéria coronaria és az agyérrendszer betegségeinek kezelésére és megelőzésére. A szakember számára könnyen felismerhetők azok a körülmények, amelyek antikoaguláns terápia alkalmazását igénylik. A „beteg” kifejezést Itt olyan értelemben használjuk, hogy az emlősöket, közelebbről főemlősöket jelent, ideértve azembert, valamint olyan emlősöket, mint a juh, ló, szarvasmarha, sertés, kutya, macska, patkány és egér, „Az X_a faktor gátlása nemcsak azoknak az embereknek az antikoaguláns terápiája esetében hasznos, akik trombotikus betegségekben szenvednek, hanem minden olyan esetben is, amikor a vér alvadásának gátlására van szükség (pl. a teljes vér koagulációjának megelőzésére tárolás közben és a koaguláció megakadályozására más, vizsgálat vagy tárolás céljából levett biológiai mintákban), fgy a találmány szerinti, X_a faktort gátló hatású fehérjeszerű anyag hozzáadható valamely olyan közeghez (vagy ezzel érintkezésbe hozható), amely Xg faktort tartalmaz (vagy feltehetően tartalmaz) és amelyben a.véralvadást meg kíván juk gátolni.

Bár a találmány szerinti, X_a faktort gátló fehérjeszerű anyag elkerülheti a bomlást az orális bevitelt követően a bélrendszeren való áthaladás során, előnyben részesítjük a nem-orális, hanem pl. a következő úton történő bevitelt: szubkután, intravénás, intramuszkuláris vagy intraperitoneális; bevitel depó-injekcióval vagy beültethető készítménnyel.

Parenterális bevitelhez a találmány szerinti, X_a faktort gátló hatású fehérjeszerű anyag injektálható dózisok alakjában készíthető kí, oldatként vagy szuszpenzióként, amely az anyagot egy fiziológiai szempontból elfogadható hígítóban tartalmazza - amilyen egy steril folyadék, pl. a víz és az olajok -. felületaktív anyag és más, gyógyászati szempontból elfogadható hatásfokozók adott esetben való hozzáadásával. Az ilyen készítményekben alkalmazható olajok közé tartozik az ásványolaj, az állati és növényi eredetű vagy szintetikus olajok, pl. a mogyoróolaj, szójaolaj. Folyékony hordozóként, különösen injektálható oldatok esetében általában a következőket részesítjük előnyben: víz, sóoldat, vizes dextróz és hasonló cukor-oldatok, etanol és glikolok, pl. a propilénglikol vagy a polietilénglikol.

A találmány szerinti, X_a faktort gátló hatású fehérjeszerü anyag bevihető depó-injekció vagy beültetett készítmény alakjában is. Ezek oly módon készíthetők ki, hogy lehetővé tegyék az aktív komponens késleltetett felszabadulását. Az aktív komponens pelletekké vagy kis hengerekké sajtolható és szubkután vagy intravénásán beültethető depó-injekció vagy beültetett test alakjában. A beültethető készítményekben közömbös anyagokat, így biológiai úton lebontható polimereket vagy szintetikus szilikonokat alkalmazhatunk. Ilyen, pl. a Silastic, a szilikon-gumi vagy más polimer, amelyeket a Dow-ComingCo. állít elő.

A találmány szerinti fehérjeszerű anyagot a pióca nyálából vagy nyálmirigyeiből nyerjük ki. Többféle módon juthatunk a nyálmirigy-kivonathoz, amely a H. ghilianii elülső vagy hátsó (vagy mindkét) nyálmirigyéből származik és amelyet a találmány szerinti fehérjeszerű anyag előállítására és tisztítására felhasználunk. Ilyen megoldás pl. a mirigyek sebészeti eltávo3

HU -205149 Β

Iítása és homogenizálása; a szövet-homogenizátum extrakciója HEPES puff errel és az extraktum betöményítése vagy Yízmentesítése; vagy a szövet-homogenizátum ultracentrifngálása.Akapottnyers nyálmirigykivonatot ezután a szokásos kromatográfiás eljárással dolgQzzukfel, azXg faktort gátló és alvadásgátló aktivitással rendelkező' frakció elkülönítésére. A kromatografáláshoz DEAE-cellulózt, anioncserélő gyantát és heparin-agaróz gyantát alkalmazunk és az eluálást lineárisan növekvő nátrium-klorid koncentráció alkalmazásával végezzük.

Akapott tisztított nyálmirigy-kivonatot ezután egy affinitás-kromatográfiás műveletnek vetjük alá, egy kromatográfiás gyantához kötött X_& faktor, pl. szarvasmarha-Xg faktor felhasználásával. Az affinitáskromatográfiában általában alkalmazott gyantákat használhatjuk fel, amelyek rendelkeznek hozzáférhető csoportokkal az X_a faktor kémiai megkötéséhez. Affi-Gel-15 Oszlopot alklamazunk e célra; ez egy Nszukcimidü-észtert tartalmazó gyanta, amely a BioRad Co-tól szerezhető be. Az X_a faktor úgy köthető meg ezzel a gyantával, hogy a gyantát és az Xa faktort 4-morfolmo-propán-szulfonsawal, majd etanolaminnal inkubáljuk. A tisztított nyálmirigy-kivonatot ezen gyanta alkalmazásával kromatografáljuk; az eluálást 0,05 mólos HEPES-sel [4-(2-hidroxi-etil)-l-piperazin-etán-szulfonsav] végezzük, amely 0,1 mól benzamidint-az aktív helyet tekintve reverzibilis szerin-proteáz-inhibitort — tartalmaz, és felfogjuk azt a frakciót, amely alvadásgátló és amidolitikus aktivitást mutat. A szakember számára nyilvánvaló, hogy az affinitás-kromatográfiás technika tekintetében különböző szokásos változtatások haj thatók végre.

Az X_a faktort gátló aktivitással rendelkező, kapott nyers fehérjeszerű anyagút ezután tovább tisztítjuk. Ez a tisztítás bármely szokásos módon végezhető, pl. fordított fázisú kromatográfiával; ez olyan típusú kromatográfia, amelyben az álló fázis nempoláris és az eluáló fázis poláris. A stacionárius fázis jellegzetesen egy szénhidrogén lánc, amelyet kémiai kötéssel rögzítünk egy közömbös felülethez, pl. üveghez. Az eluáló fázis vizes metanol, acetonitril és propánok Hidrofób interakciós kromatográfia esetében a stacionárius fázis nempoláris, és az eluáló fázis poláris, pl. víz vagy vizes puffer.

A találmány szerinti eljárás során C-18 típusú gyantát használunk, vagyis egy olyan gyantát, amelyben a szilárd gyantához kötött szénhidrogén lényegében egy 18 szénatomot tartalmazó szénhidrogén, pl. az Aquapore RP-300. A C-18 gyanta eluálását lineráris, növekvő, trifluor-ecetsavat tartalmazó vizes acetonitril oldat gradienssel végezzük.

A találmányt a következő, nem-korlátozó jellegű példával szemléltetjük.

Az X_a faktort gátló hatású anyag előállítása H. ghilianii nyálmirigy kivonatából és jellemzése

Alvadási, kromogén és fibrin/ogen/olitikus vizsgálatok

A protrombin-időket (véralvadási időt, melyet az alábbiakban ismertetünk) egyfázisú alvadásos vizsgálatokkal határozzuk meg és spektrofotometrikusan követjük Electra 800 automatikus alvadási idő mérővel (Medical Laboratory Automation, Inc.) a gyártó által ajánlott standard programok és reagensek alkalmazásával. Röviden összefoglalva: különböző mennyiségű (i) nyers kivonatot, amelyet a Haementeria ghilianii nyálmirigy szövetéből nyerünk ki, 20 mmól HEPES-t, 0,15 mól NaCl-t és 2,5 mmól CaCl₂-t tartalmazó, pH 7,4 oldatban, vagy (ii) a H. ghilianii nyálmirigy kivonat kromatográfiás frakcióit, az oszlop eluálásához használt pufférben, vagy (iii) a H. ghilianii nyálmirigyéből kapott tisztított X^ faktor inhibitort 20 mmól HEPES-t, 0,5 mól NaCl-t, 2,5 mmól CaCI₂-t tartalmazó pH 7,4 oldatban hozzáadunk 100 ©normál, citrátos emberi plazmához. 200 μ - CaCl₂-re 11,6 mmól töménységű - tromboplasztin reagens (DADE^R) hozzáadása után meghatározzuk az alvadási időket. Az X_a faktor kromogén meghatározását és a trombin amidolitikus aktivitás meghatározását 96 helyes mikrotitráló lemezeken (Accurate Chemical and Scientific Co., Westbury, NY) végezzük, metoxikarbonil-D-ciklohexil-glicil-gÜcü-arginm-p-nitroanilid-acetát ill. H-D-hexahidrotirozil-L-alanil-L-argínin-p-nitroanilid-acetát alkalmazásával. Ezen vizsgálatok során 0,15-16 ng enzimet, 25 © pH 7,4 pufferben (20 mmól HEPES, 0,15 mól NaCI) hozzáadunk 25 © ugyanilyen pufferhez, majd 50 © megfelelő inhibitor mintát adagolunk. Az oldatokat 10 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk és a meghatározást 100 © kromogén szubsztrát hozzáadásával kezdjük meg, 2,425xl0'⁴ mól végkoncentrációban. Az inhibitor távollétében ill. jelenlétében megfigyelhető amidolitikus aktivitást spektrofotometriásán követjük 405 nm-en, a p-nitroanilid abszorpció 1 perces időközökkel történő leolvasásával, EL309 Microplate Autoreader (BIO-TEK Instruments) alkalmazásával.

A ¹²⁵I-dal jelzett (emberi) fibrinogént a Knight et al. által leírt módon (Thromb.Haemostas., Stuttgart, 46,593-596, (1981) határozzuk meg. 5 mg fibrinogént 5 ml 50 mmól Tris-HCl-t, 0,1 mól NaCl-t és 0,025 M nátrium-citrátot tartalmazó, pH 7,9 pufferben összekeverünk 500 μ© Na ¹²⁵I-dal (New England Nuclear, Boston, MA) és 5 © 0,045% NaI hordozóval egy műanyag kémcsőben és a mintát jégbe hűtjük be. A reakció megindításához a mintát átvisszük egy lehűtött kémcsőbe, amelyet 100 pg jodogénnel vontunk be és jégfürdőben 1 órán át lassan keverjük. Aradiojódozási reakció leállítására a fehérje-oldatot egy műanyag kémcsőbe dekantáljuk, annak érdekében, hogy a jodogént elkülönítsük a reagensektől. Ezután 5 mg BSA-t adunk a mintához és az oldatot 0,5 x 12 ml-es BioGel P-2 oszlopon frakciónál juk - amelyet 0,05 mól TrisHC1 + 0,1 mól NaCl-ot tartalmazó pH 7,9 pufferrel ekvilibráltunk -, az esetleg visszamaradt szabad ^12SI és a ¹²⁵I-dal jelzett fibrinogén szétválasztására. A fajlagos radioaktivitás 1,9 x 10⁸dpm/mg.

HU 205149 Β

A fibrinogenolitikus vizsgálat a kromatográfiás frakciókban jelenlevő hementin azon képességén alapul ASM Malinoconieo et al., J.Lab.ClinMed. 103, 44-58 (1984)/, hogy a¹²⁵I-dal jelzett fibrinogént triklór-ecetsavban oldható ¹²⁵I-dal jelzett fibrinogénnel inkubálunk 227 μΐ 50 mmól Tris-HCl-t és 0,1 mól NaCl-t tartalmazó pH 7,9 oldatban. A minta CaCl₂ koncentrációját 10 mmól-ra állítjuk be, majd egy éj jelen át 37 ’C-on inkubáljuk. Ezután hozzáadunk 100 μΐ BSA-t (3 mg/ml az inkubáláshoz használt pufferben oldva), majd 427 μΐ jéghideg 20%-os triklór-ecetsavat (TCA). A mintákat 2 órára jégbe tesszük, centrifugáljuk és gamma-számlálással meghatározzuk a pelletek és a felülüszók radioaktivitását.

A fibrinogenolitikus aktivitást úgy fejezzük ki, mint a TCA-ban oldható frakció számlálási eredménye és a TCA-ban oldhatatlan frakció számlálási eredménye arányát (TCA sol/TCAppt).

A nyálnürígy-kivonat előállítása

A H. ghilianii nyálmirigyeit, olyan mennyiségben, amely 50 egység hementin-aktivitásnak - 49 egység/mg fehérje - felel meg /SM Malinconieo et al.,

J.Lab.ClmMed, 103,44-58 (1984)/ üvegbottal eldörzsöljük egy 3 ml-es Reacti-fioíában (Pierce Chemical Co.), amely 2 ml pH 7,8 20 mmól HEPES-t (extrakciós puffer) tartalmaz. A fiolát jégre helyezzük és tartalmát mikrokémcsőnek megfelelő heggyel ellátott ultrahang-berendezéssel (Branson Sonic Power Supply) kezel jük (négy, 3 energia-szintű 30 másodperces energiasokk, a ciklus 30%-os kapacitás-kihasználásával). A fiolát 5 percen át centrifugáljuk 3750 ford/perc sebességgel; a felülúszót összegyűjtjük, majd 8500 ford/perc sebességgel Eppendorf-f. asztali centrifugával újra centrifugáljuk. Az első centrifugálási lépésben kapott pelleteket 2 ml extrakciós pufferben újra szuszpendáljuk és megismételjük az előbbi eljárást. A két ultrahangos extrakcióból származó felülúszót egyesítjük és azonnal felhasználjuk a tisztítási lépésben.

Az X_a faktort gátló hatású, antikoaguláns anyag tisztítása

A nyálmirigy-kivonatot, amely 4 mg oldható fehérjét tartalmaz 4 ml extrakciós pufferben, felvisszük egy DEAE-5PW (Waters Associates) anioncserélő oszlopra (0,46 x 7,5 cm), amelyet 20 mmól HEPES-sel (A puffér, pH 7,8) hoztunk egyensúlyba. A fehérjéket lineáris NaCl gradiens alkalmazásával eluáljuk, amely 60 perc alatt 100% A puffertől (kiindulási körülmények) 100% B puff érig (0,5 mól NaCl-ot is tartalmazó A puffer) terjed. Az áramlási sebesség 1 ml/perc. A 0,1-0,2 mól NaCl koncentráció között eluált frakciókat, amelyek antikoaguláns és X_a faktort gátló aktivitású anyagokat egyaránt tartalmaznak, egyesítjük (2. ábra), A pufferrel 10 mS/cm vezetőképességig hígítjuk és felvisszűk egy 0,5 x 5 cm-es heparin-agaróz oszlopra (Bethesda Research Laboratorues Lif e Technologies Ifié.)

A 2. ábra az oldható protein extrakt DEAE anioncserélő gyantán végzett kromatográfiás vizsgálati eredményeit mutatja. A 30-35 frakciók tartalmazzák az antikoaguláns és Xg faktort gátló hatású anyagot 0,1-0,16 mólos NaCl-dal eluálva (A rész), A 37-44. frakciók pedig a fibrinogenolitikus aktivitású és X_a faktort gátló aktivitás nélküli anyagot tartalmazzák 0,20 mólosnál töményebb NaCl-dal eluálva (B rész). Ez az anyag elősegíti a fibrin-lizist, degradálja az I¹²⁵ fibrinogént (2. ábra, B rész) továbbá a tisztított fibrinogén α,β és γ láncot is degradálja (nincs jelezve). Ennek a frakciónak a fibrinogenolitikus működése a hementinnek tulajdonítható. Az X_a faktort gátló aktivitással rendelkező frakciók nem rendelkeznek fibrinogenolitikus aktivitással. Az 1, és 2. ábra szerint a 0,ΙΟ, 16 mólos NaCl-dal eluál t inhibitor sem a Hirudomedicinalis-ból származó hirüdin (J. Dodt, et al., Bio Chem.' Hoppe-Syler 366, 379-385 (1985)), sem a hementin, amely a Heamenteria ghilianii fibrinogenolitikus komponensé (SM. Malinconieo, et al., 7. Lob. Clin. Med. 103,44-58 (1984)). A görbén csúcsot mutató frakciók 25 μ-e meghosszabbítja a protrombin időt 16 másodperccel és teljesen gátolja 17 ng X_a faktort gátló hatású anyag működését az amidolitikus vizsgálatban. A DEAE frakeionált extrakciós vizsgálatok alapján az X_a faktort gátló hatású anyag tekinthető a fő aktikoaguláns anyagnak.

Heparín affinitás kromatográfia

A DEAE frakciók további tisztítását, az antikoaguláns hatású anyag dúsítására, heparin-agarózon a 3. ábrán mutatjuk be. Az oszlopot alaposan mossuk A pufferrel, majd lineáris só-grádienssel eluáljuk. A gradiens 100%4 puffertől 75 perc alatt 100%-Bpufferig (A puffer + 1 mól NaCl) terjed. Az áramlási sebesség 1 ml/perc.

A DEAE oszlopról nyert, X_a faktort gátló aktivitással rendelkező, antikoaguláns frakciókat egyesítjük, majd a frakciókat heparin-agarózon kromatografáljuk (3. ábra). Az antikoaguláns ésX_a faktort gátló amidolitikus hatású anyagok 0,45-0,55 mólos NaCl-dal koeluálódnak. A görbén csúcsot mutató, antikoaguláns aktivitású frakciók 25 μΐ-e meghosszabbítja a protrombin időt 17 másodperccel és lőng tisztítottX_a faktort gátló hatású anyag a kromogén szubsztrát hidrolízisét teljesen gátolja.

FX_a affinitás kromatográfia

Egyes foganatosiításí módok esetében azX_a faktort gátló aktivitású anyagot úgy nyerjük ki, hogy a fehérjéket szarvasmarha-X_a-faktor-Affi-Gel-15-ót tartalmazó oszlopon frakciónál juk (4. ábra). A nyers nyálmirigy-kivonatot vagy bármely, á tisztításifolyamat során nyert, antikoaguláns aktivitással rendelkező kromatográfiás frakciót 0,l%Tween-20 töménységre állítjuk be és affinitás-kromatográfiával frakcionáljuk egy oszlopon, amely 2 ml ágy-térfogatú, szarvasmarha-X_a faktor-Affi-Gel-15-öt tartalmaz. Az oszlopot alaposan mossuk 0,1% Tween-20-at tartalmazó 0,05 mólos HEPES-sel, amely 0,1 mól NaCl-ot is tartalmaz (pH 7,5), majd a fehérjét 0,1% Tween-20-at és 0,1 mól benzamidot tartalmazó 0,05 mólos HEPES-sel (pH 7,5) 4 ml/óra áramlási sebességgel eluáljuk. Az alvadási és az amidolitikus meghatározásokat az öszszegyűjtött frakciók 1/500-szeres hígításaival végez5

HU 205149 Β zük.

A szarvannarha X_a faktort úgy kapcsoljuk az AffiGel-15-höz, hogy 2 ml tisztított enzimet 2 ml 4-morfolino-propán-szulfonsavban (MOPS) (PH 7,4; kapcsoló puffer) 2,5 ml gyantával egy éjen át 4 ’C-on inkubálunk. A gyöngyöket alaposan mossuk, majd 3 ml kapcsoló pufferben újra szuszpendáljuk. A gyöngyöket ezután 0,3 ml 1 mólos (pH 8,0) etanol-aminnal reagáltatjuk 4 ’C-on egy éjjen át, majd alaposan mossuk 0,1% Tween-20-at tartalmazó 0,05 mólos HEPES-sel, mely 0,1 mól NaCl-ot is tartalmaz (pH 7,5),

Az antikoaguláns/X_a faktort gátló aktivitású anyagnak FX_a-Affi-Gel-15 oszlopon, affinitás kromatográfiával végezett frakcionálását a 4. ábra mutatja. Az antikoaguláns ésX_a faktort gátló aktivitású anyag az oszlopról együtt eluálható, ha az eluálásnál 0,1 mól benzamidint tartalmazó eluálószert alkalmazunk.

Revers fázisú HPLC

A végső frakcionálási, ami az antikoaguláns és az amidolitikus aktivitás elkülönítését illet, egy 2,lx3ömm-esAguaporeRP-300, C-18 fordított fázisú oszlopon végezzük (Applied Biosystems 130., fehérje/peptid elválasztásra szolgáló rendszer). Afehérjéket lineáris acetonitril gradienssel eluáljuk, a gradiens 100% A puffertól (0,1% trifluor-ecetsav vízben) 100% B pufféiig (0,07% trifluor-ecetsav/70% acetonitril/29,93% H₂O) terjed, 40 perc alatt. A fehérjét tartalmazó frakciókat (5. ábra) egy éjjelen át a Savant speed vac rendszerben szárítjuk. A mintákat 0,1%-os vizes trifluor-ecetsavban újra feloldjuk és különböző mennyiségű mintákat elemzésnek vetünk alá (SDS poliákrilamid gél-elektroforézis, gázfázisú szekvenciameghatározás mikroméretben, aminosav-meghatározás, az antikoaguláns és az amidolitikus aktivitás meghatározása).

Az inhibitort mikrobor reverz fázisú HPLC-vel tovább frakciónáljuk, melynek eredményét a kis 5. ábra mutatja. A görbén többek között két fő és 4 kisebb csúcs látható. Újbóli frakcionálás után hat (PQ-P5) diszkrét csúcs látható, melyek közül a P₄ és P₅ mutatja a fő, míg a Pj-P₃ a kisebb antikoaguláns és X_a faktort gátló aktivitást. AP₀-nál nem tapasztaltunk aktivitást.

Szekvencia analízis

Az 50,65-53,65 perc közötti, P₅ aktivitási csúcsot mutató eluátum frakciót piridü-etUezzük és sómentesítjük mikrobor (mickrobore, kisszemcsés7 μ-os szilikagél, gyártja az Applied Biosystem-hez tartozó Brownlee) nagynyomású folyadékkromatográfiás módszer alkalmazásával. A piridil-etilezett anyag terminális aminocsoportját piroglutamát-aminopeptidázzal blokkoljuk oly módon, hogy az enzim/peptid arány 1:10. Az emésztést 10 mmól EDTA-t, 5 mmól ditiotreitolt és 5% glicerint tartalmazó 0,1 mólos Na₂HPO₄-ban (pH 8,0), 24 órán át, szobahőmérsékleten végezzük. A szekvencia-analízis előtt a polipeptidet ezután mikrobor nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel sómentesítjük.

Az automatizált Edman-lebontásokat az Applied Biosystems, Inc.470Afehérje“peptid szekvencia vizsgáló berendezésével határozzuk meg azokkal a reagensekkel és azon utasítások és standard programok szerint, amelyeket agyártó bocsát rendelkezésre. Afeniltio-bidantoin származékká átalakított aminosavak mindegyik ciklusban az Applied Biosystems, Inc. 120 PTH elemzőberendezésével határozzuk meg, amely közvetlen on-line kapcsolatban áll a 470A gázfázisú szekvencia-meghatározó berendezéssel.

A kvantitatív aminosav analízist Hewlett Packard Aminosav analizátorra (Hewlett Packard, Palo Alto, CA)végezzük.

A vizsgált fehérje - melyet ghilanten-nek nevezünk - szekvenciája a következő:

pyr-EGPFGPGCEE AGCPEGSACN HTDRCTCPE VRCRVYCSHG FQRSRYGCEV CRCRTEPMKA TCDISECPEG MMCSRLTNKC DCKIDINCRK TCPNGLKRDK LGCEYCECKP KRKLVPRLS (119), pyr-E jelentése piroglutaminsav.

Analitikai poliakrilamid gél-elektroforézis

8x8 cm méretű, 1 mm vastagságú poliakrilamid gél lemezeket 20% és 12% akrilamidban, 3% tömörítő gél alkalmazása mellett (Heefer Sci. Co.) és 10 mA/gel intenzitású egyenáram hatásának tesszük ezeket ki. A gélek 0,25 mól Tris-HCI-t és 0,1% nátrium-dodecilszulfátot tartalmaznak (SDS), pH 9,0. Azelektroforézist 25 mmól Tris-HCl-t, 0,2 mól glicint és 0,1% SDS-t tartalmazó pH 8,4 oldattal végezzük. A szárított mintákat 35 μΐ pH 6,8 oldatban oldjuk, amely a következőket tartalmazza: 10 mmól Tris-HCl, 1% SDS, 20% szacharóz, 1 mmól EDTA, 6 mól karbamid, 1% 2-merkapto-etanol és 0,03% brómfenolkék. Az elektroforézis előtt a mintákat 15 percen át 60 ’C-on tartjuk. A géleket Merrill et al. ezüst festékes eljárásával rögzítjük és kimutatjuk a fehérjéket (Anal, Biochem. 105, 361, 1980). A fehérjék látszólagos molekulasúlyát extrapolálással határozzuk meg egy standard görbéből, amelyamolekulasúlyoklogaritmusátstandardfehérjék elektroforetikus mozgékonyságával szemben tünteti fel. A standard fehérjék a következők: foszforilát N (94,000), szarvasmarha-szérumalbumin (67,000), ovalbumin (43,000), szénsav-anhidráz (30,000), alfa-kimotripszinogén (35,700), szőjababtripszininhibítor (20,000) béta-laktoglobulin (18,400), alfa-laktalbumin (14,400), lizozim (14,300), szarvasmarha-tripszininhibitor (6,200) és inzulin (3,000).

Aminosav-elemzés

A hidrolízishez felhasznált mikro-ampullákat (Hewlett Packard automatikus mintavevő) metanolban ultrahang-kezelésnek vetjük alá, majd 4 órán át egy kemencéhez 500 ’C-on tartjuk. A peptideket gázfázisban hidrolizáljuk egy Picetag Wbrkatation-ban (Waters Associates) 105 ’C-on, 20 órán át, 200 μΐ állandó forrásban levő HCl-lel (Pierce Chemical Co.), amely néhány mikroliter cseppfolyósított fenolt (MCB) tartalmaz. A hidrolizált mintákat speed vac cencentrator-ban (Savant) szárazra pároljuk, majd a maradékot kistérfogatú (általában 15-30 μ) 0,1 mól HCl-ban oldjuk és bevisszük egy Hewlett Packard 1090 HPLC automatikus mintavevőjébe. Az amino6

I

HU 205149 Β sav-elemzést úgy végezzük, hogy a .Hewlett Packard cég Aminoquant elemzőberendezését használjuk, a nagyérzékenységű üzemmódban (fluóreszcenciás kimutatás). Az aminosavakat olyan körülmények között határozzuk meg, hogy az oszlopra való felvitelt meg- 5 előzőén származékképzést hajtunk végre először 0f talaldehiddel (OPA) a primer aminosavak, majd klórhangyasav-9-fluörenil-metüészterrel (PMOC) a szekunder aminosavak átalakítására. A származékká alakított aminosavakat fordított fázisú HPLC-vel választjuk szét, a gyártó által rendelkezésre bocsátott oszlopokkal, reagensekkel és műveleti utasításokkal. Ez a rendszer alkalmas 1-500 pmól mennyiségű amino-acil-csoport pontos meghatározására.

TÁBLÁZAT

A. H. ghilianii nyálmirigy-kivonataiból mikropórusú HPLCrvel kapottP₀-P₅ frakció aminosav elemzési eredményei^

Aminosav	P.5		p3	P2	Pr	Pn
Asx	17	18	14	16	17	11
Glx	22	24	19	19	20	14
Ser	9	10	7	8	8	7
His	2	2	2	2	2	2 - .
Gly	14	18	13	13	.14	10
Thr	9	10	10	10	11	7
Ala	6	6	6	6 '	6	6
Arg	18	20	18	19	21 .	13
Tyr	6	6	6	6	6 .	5
Val	7	7	5	7	7	,4.
Met	5	5	5	5	5	3
Ile	8	8	7	7	8	5
Phe	4	4	3	4	4	3
Leu	9	9	10	11	. 1 .	9
Lys	12	14	7	5	6	4
Pro	17	16	6	6 !	6	3.

^a”Maradék/mól fehérje” értékben kifejezve. Az értékeket 6 maradék/mól Ala-tartalomra normalizáltuk.

Az I. ábra azX_a faktor ellenes aktivitást mutatja be a H. ghilianii nyers nyálmirigy kivonataiban. Az aktív anyag egyaránt gátolja az emberi (1. a külön bemutatott kis ábrát) és a szarvasmarhaX_a faktort, de nem gátolja az emberi és a szarvasmarha trombínt (ezeket az adatokat nem mutatjuk be).

A 2. ábra 4 mg oldható fehérjekivonat anioncserélő kromatográfiáját - DEAE-n - mutatja be. Az antikoaguláns és az X_a faktort gátló aktivitás együtt eluálódik, 0,1 -0,16 mól NaCI töménység között (2/A ábra), a 30-35. frakció között. A fibronogenolitikus aktivitás- az X_a faktor elleni aktivitás nélkül O^OmóI NaCI felett eluálódik (2/B ábra), a

37-44. frakció között (vonalkázott terü. let). Ez az anyag elősegíti az olvadék (fibrin) lizisét, elbontja a ¹²⁵I-dal jelzett fibrinogént (2. ábra, B részábra) és kimutattuk, hogy elbontja a tisztított fibrinogén alfa-, béta- és gamma-láncát SDS-PAGE elemzés során (ezeket az adatokat nem közöljük). Ennek a frakciónak a fibrinogenoliti. . kus aktivitása a hementinnek tulajdonítható. Az X_a faktor elleni aktivitással rendelkező frakciók néni mutatnak fibrin/ogen/olitikus aktivitást. Az 1. és a 2. ábra eredményei alapján úgy tűnik, hogy a

0,1-0,16 mól NaCI között eluálódó inhibitor nem függ össze aHirude medicínalis hirudinjavai (J. Dodt et al, Biol.Chem. Hoppe-Seyler 366, 379-385, 1985) vagy a hementinnel, a Haémenteria ghilianii fibrin/ogen/olitikus komponensével (S.M. Maiinconico et al, J.Lab.Clin.Mad., 103, 44-58,1984). Mint a 2. ábrán bemutatjuk, a csúcs-aktivitású frakciókból 25 pl 16 másodperccel hosszabbítja meg a protromin időt és teljesen gátol 17. ng Xa faktort az amidolitikus vizsgálatban. A · DEAE-n frákcionált kivonatokkal végzett vizsgálatok alapján azt állíthatjuk, hogy az X_a faktort gátló hatás teszi ki az alvadásgátló aktivitás zömét.

A DEAE oszlopról kapott, X_a faktor ellenes aktivitással rendelkező antikoagluáns frakciókat egyesítjük, majd heparin agaróz kromatográfiával frakciónál juk (3. ábra). Az alvadásgátló és az X_a-faktor- elleni ill. amidolitikus aktivitás együtt eluálódik 0,45-0,55 mól NaCI között. A csúcs-alvadásgátló aktivitást mutató frakciókból 25 pl a protrombin-időt 17 másodperccel hosszabbítja meg és teljesen meggátolja 16 ng tisztított X_a faktornak a kromogénszubsztrát hidrolízisére kifejtett hatását.

Az alvadásgátló és az X_a faktor elleni aktivitás X_a faktor-Affi-GeI-15-ön végzett affinitás’kromatögrá7

HU 205149 Β fiával való szétválasztását a 4. ábrán mutatjuk be. Mint látható, azalvadásgátló és azX_a faktor elleni aktivitás együtt eluálhatő az oszlopról 0,1 mól benzamidinnel, egy reverzibilis aktív helyű szerin-proteáz-inhibitorral.

Az inhibitor további frakeionálását - mikrobar f ordított fázisú HPLC-vel -az 5. ábrán mutatjuk be. Mint látható, 4 kisebb és 2 nagyobb csúcs rezolválása eredményeként az alvadásgátíó aktivitás számos csúcs kozott oszlik meg. Az újra-frakcionálás 6 elkülönült, P_oP₅ jelű csúcsot eredményez (1. a beiktatott kis ábrát). Ezek közül a P₄ és a P₅ csúcs mutatja a nagyobb alvadásgátló és Xg faktor elleni aktivitást és a P1-P3 csúcs valamivel kisebb aktivitású. Nem mutatható ki aktivitás a P_o csúcsban.

A P₀P₅ frakció SDS PAGE elemzése (20% akrilamid) arra mutat, hogy ezek a fehérjék hasonló mozgékonyságűak és virtuális molekulasúlyuk 18,000 (nem mutatjuk be). A 6. ábra a-P₅ kromatográfiás profilját mutatja bemikropórusú fordított fázisú HPLC-vel. A kis ábra a P₅ 12% akrilamíddal végzett SDS PAGE elemzéseeredményeit mutatja be. Ennek a tisztakomponensnek a virtuális molekulasúlya 18,000, azaz a tisztított X_a faktor inhibitor látszólagos molekulasúlya nem változik jelentősen a poliakrüamid gél koncentráció 12 és 20% közötti változásával. Ez arra mutat, hogy nem nagy mértékben, glikozilezett.

A 7. ábra a P₅-nek az X_a faktorra kifejtett dózisfüggő gátló hatását mutatja be. AP₅-nek az akoncentrációja, amely a maximális gátlás felét eredményezi, 60 pmól.

A 27. oldalon levő táblázat a P₀P₅ frakció aminosav-osszetételét mutatja be. AP j-P₅ komponens aminosav-tartalma a legtöbb maradék tekintetében nagyon hasopló, azzal az eltéréssel, hogy a P₄ és a P₅ Asx és Glx tartalma valamivel magasabb és Lys és Pro tartalma jóval magasabb. A P_o jelentősen különbözik a PpPj frakciótól, ami az Asx, Glx, Thr, Arg, Val, Met, He, Lys és Pro tartalmat illet. A P j, P₂ és P₃ csökkent aktivitása feltehetően a jelentősen csökkent Lys és Pro tartalommal függ össze. Az összetétel általános hasonlósága, a Lys és a Pro tartalomtól eltekintve, arrámutat, hogyaP^-Pjhasonlószekvenciájú fehérje.

Az ábrák részletesebb magyarázata

1. ábra AzX_a faktor gátlása a Haementeria ghilianiinyálmirigyenyers kivonatával.

Kb. 11 pg nyálmirigy-kivonatot (oldható fehérje) hozzáadunk 16ngtisztítottX_a faktorhoz. Amintát 10 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk és meghatározzuk az amidolitikus aktivitást, miután metoxikarbonil-D-ciklohexil-glicil-glicil-arginin-p-nitroanüid -acetátot adagoltunk. A p-nitroanilid képződését spektrofotometriásán követjük; 1 perces időközönként végzünk leolvasást 405 nm-en. Felső görbe*, szarvasmarha Xa faktor és kroraogén szubsztrát; alsó görbe: szarvasmarha X_a faktor, nyálmirigy-kivonat és kromogén szubsztrát. Kis ábra:

- felső görbe: emberi faktor és kromogén szubsztrát;

- alsó görbe: emberi X_a faktor, nyálmirigy-kivonat és kromogén szubsztrát.

AH. ghilianiinyálmirigy-kivonata nemgátolja aHD-hexahÍdrotirozil-L-alanil-L-arginin-p-nitroanilid -acetát szarvasmarha és emberi trombin hatására végbemenő hidrolízisét (ezeket azadatokatnemmutatjuk be).

2. ábra. A nyers nyálmirigy-kivonat (4 mg oldható fehérje) frakcionálása egy 0,46 x7,5 cm-esDEAE anioncserélő oszlopon.

A fehérjéket lineáris NaCl gradienssel - 20 mM HEPES-ben, pH 7,8 - eluáljuk (a részletek tekintetében 1. az eljárást). Az áramlási sebesség 1 ml/perc; 1 ml-es frakciókatfogunkfel.

A. részábra:

Azantikoaguláns aktivitást (körök) egyfázisú alvadási kísérletben határozzuk meg, mint a protrombinidő meghosszabbodását. Az X_a faktort gátló hatást 405 nm-en mérjük, a p-nitroanilid képződés gátlásaként (négyzetek). Kromogén szubsztrátként metoxikarboníl-D-ciklohexil-glicil-glicil-argínin-p-nitroani lid-acetátot alkalmazunk.

B. részábra:

Ez az ábra a H. ghilianii fehérje-eluciős görbéjét mutatja be, amelyet 280 nm-en mérhető abszorpcióval követünk. A fibrinogenolitikus aktivitást a vonalkázott terület mutatja be. Ez az aktivitás nem eluálódik együtt az Xg faktor elleni vagy nagyobb mértékű alvadásgátíó aktivitással.

3. ábra: A részlegesen tisztított X_a faktor inhibitor frakcionálása heparin agaróz kromatográfiával.

A DEAE-ről levált frakciókat - amelyek az együtt eluálódó alvadásgátíó és X, faktor elleni aktivitást tartalmazzák - egyesítjük és felvisszük egy heparin agarózt tartalmazó 0,5 x 5 cm-es oszlopra. Afehérjéket 1 mól-ig terjedő lineáris NaCl gradienssel - 20 mól pH 7,8 HEPES-ben - eluáljuk. Az eluátumot folyamatosan átvezetjük egy olyan műszeren, amelyhez egy regisztráló berendezés csatlakozik. A műszer 405 nmnél az oldat fényelnyelését regisztrálja, ami az ábrán a folyamatos vonallal van jelölve. A fényelnyelésí arány a jobboldali ordinátán olvasható le (dimenzió nélküli szám). Az eluátum ezután a frakciógyűjtőbe kerül, ahol 1 ml-es frakciókat szerünk. Az alvadásgátíó aktivitást (üres körök) egyfázisú alvadási kísérlettel határozzuk meg, a protrombin-idő meghosszabbításaként. ÁzX;, faktor gátlását 405 nm-en mérjük, a p-nitroanilid-képződés(iíres négyzetek) gátlása alapján; kromogén szubsztrátként metoxi-D-ciklohexil-glicil-glicilarginin-p-nitroanilid-acetátot alkalmazva.

4. ábra. Az X_a faktor inhibitor frakcionálása szarvasmarha-X_a faktor-Affi-Gel-15-ön végzett affinitáskromatográf ia segítségével

Afehérjéket 0,1 mól benzamidín-oldattal eluáljuk az oszlopról. Az áramlási sebesség 4 ml/őra; 1,2 ml-es frakciókatszedünk.Akromatográfiásfrakciók 1/500szoros hígítását használjuk fel az alvadásgátíó (üres körök) és az X,j faktort gátló (fekete körök) aktivitásnak a leírt módon való meghatározására.

5. ábra. A H. ghilianii Xg faktort gátló komponense® tisztítása fordított fázisú HPLC-vel.

Az alvadásgátíó és X_a faktort gátló aktivitás szem8

HU 205 149 Β pontjából kiválasztott csúcs-frakciókat mikropórusú fordított fázisú HPLC-vel frakcionáljuk egy 2,1 x 30 mm-es Aquapore RP-300 oszlopon. Az árnyékolt terület arra mutat, hogy az antikoaguláns aktivitás megoszlik a csúcs-frakciók között. A kis ábra a kiindu- δ lási fordított fázisú szétválasztással kapott frakciók ugyanezen oszlopon való újra-kromatografálásának eredményeit mutatja be. Az újra-kromatografálással elkülönült, nem-átfedő csúcsokat kapunk. Az X_a faktort gátló aktivitás zömét a P₄ és a P₅ frakcióban talál- 10 juk (sötétebb szín); aktivitás mutatható ki a P j és a P₂, valamint a P₃ frakcióban is (világosabb szín). Nem tartalmaz aktív anyagot a P_o frakció (színtelen).

6. ábra. A P₅ frakció mikropórusú fordított fázisú

HPLC-bel való vizsgálata. 15

A h. ghilianii-ból elkülönített P₅ fehérje frakció abszorpcióját 214 nm-en követjük. A kis ábra a mikropórusú fordított fázisú HPLC-vel elkülönített P₅ SDS PAGE (12%.akrilamid) elemzési eredményeit mutatja be. Az a) sáv a standard molekulasúlyú fehérjéket, ab) 20 sáv pedig a tisztított P₅ frakciót mutatja be. A fehérjéket az ezüst-festéses módszerrel mutatjuk ki, Merrill et al. fent idézett eljárása szerint.

7. ábra.

AzX_afaktor (0,15ng) dózis-függő gátlását tisztított 25 P₅ frakció alkalmazásával a feltüntetett koncentrációkban vizsgáljuk a metoxikarbonil-D-ciklohexil-glicil-glicil-arginin-p-nitroanüid-acetát hidrolízisének gátlása alapján. A p-nitroanilid-képződést 405 nm-en követjük. 30

Claims (4)

1. SZABADALMIIGÉNYPONTOK

   1. Eljárás X_a faktort gátló hatású fehérjeszerű anyagnak Haementeria ghilianii pióca nyálából vagy 35 nyálmirigyeiből történő izolálására és tisztítására, azzal jellemezve, hogy

   1) a nyálmirigyet - célszerűen eldörzsöléssel és az ezt követő ultrahangos kezeléssel - 20 mmólos,

   7,8 pH-jú 4-92-hidroxi-etil)-l-piperazin-etánszulfonsawal extraháljuk,
2. 2) a kapott extraktumot vagy a nyálat egy DEAE cellulóz anioncserélő gyantán kromatografáljuk, eluensként 0,1-0,2 mólos NaCl-oldatot használva,
3. 3) a kapott X_a faktort gátló hatású fehérjeszerű anyagot tartalmazó frakciót affiriitáskromatográfiának vetjük alá,

   i) EX_a-Affi-Gél-15 alkalmazásával, eluensként 0,05 mólos 4-(2-hidroxi-etil)-l-piperazin-etán-szulfonsavat használva, mely 0,1 mól NaCl-ot, 0,1% Tween-20-at és 0,1 mól benzamidint tartalmaz, és amelynek pH-ja 7,5, és/vagy ii) heparin-agaróz alkalmazásával, eluensként 0,450,55 mólos NaCI oldatot használva, majd
4. 4) a kapott eluátumot egyszer vagy többször nagynyomású folyadékkromatográfiának vetjük alá, egy C-l 8 típusú gyantát tartalmazó, reverz fázisú oszlop alkalmazásával és elkülönítjük az

   X_a faktort gátló hatású fehérjeszerű anyagot tartalmazó eluátum frakciókat.

   2. Az 1. igénypont szerinti eljárás tiszta, X_a faktort gátló hatású pyr-EGPFGPGCEE AGCPEGSACN LITDRCTCPE VRCRVYCSHG FQRSRYGCEV CRCRTEPMKA TCDISECPEG MMCSRLTNKC DCKIDINCRK TCPNGLKRDKLGCÉYCECKPKRKLCPRLS aminosavszekvenciájú fehérjének - mely 60 pM koncentrációban az X_a faktort gátló hatás maximumának felét fejti ki, és amelynek 12%-os SDS-poliakrilamid gél-elektroforézissel mért molekulatömege 15.000-20.000 dalton - előállítására, azzal jellemezve, hogy a 4) eljáráslépésben a második nagynyomású folyadékkromatográfiás elválasztás során kapott P₅ aktivitási csúcsot mutató eluátum frakciót elkülönítjük.