CN1034335C - 由南美水蛭中提取和纯化抗凝血成分 - Google Patents

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Abstract

申请人已经从水蛭(H.ghilianii)的唾液腺提取物中分离出抑制因子Xa的物质。应用二乙氨乙基纤维素和肝素-琼脂糖色谱树脂分离提取物，用递增的盐梯度进行洗脱。应用结合到Affi-Gel-15树脂上的因子Xa，使提取物进行亲和色谱分离，用含有苄脒的HEPES进行洗脱。反相色谱分离得到几种具有抑制因子Xa活性的纯肽或纯蛋白质。本申请还公开了上述FXa抑制剂的性质和临床上应用的组合物。

Description

由南美水蛭中提取和纯化抗凝血成分
本发明是关于具有抑制凝血因子Xa活性的蛋白质以及用色谱分离技术从南美水蛭(Haementeria ghilianii)的唾液或唾液腺中分离它的方法。
在急性深部静脉血栓形成、肺栓塞、肢体急性动脉栓塞、心肌梗死及弥漫性血管内凝血的治疗中，抗凝血剂是有效的治疗药物。一般认为，预防性服用抗凝血剂能防止风湿性心脏病或动脉硬化性心脏病患者栓塞复发，并可防止外科某些血栓栓塞性合并症。在冠状动脉和脑血管疾病的治疗中，应用抗凝血剂也被认为是必需的。动脉栓塞，特别是供应心肌和脑的动脉栓塞，是死亡的主要原因。
有效的血液凝固取决于多种酶和辅因子参与，并由二条独立的途径，即内源性凝血途径和外源性凝血途径进行。在内源性凝血途径中，所有凝血因子都存在于循环血液中，但由此途径引起的血凝固一旦开始需要几分钟时间才能完成。而在外源性凝血途径中，某些脂蛋白，例如凝血因子III，通常并不存在于循环血液中，而是由受损细胞释放，血凝固可在数秒钟内开始。这两条凝血途径都集中在血凝固过程的某一点上，其中，凝血因子Xa与凝血因子V和钙离子形成凝血酶原激活物，后者能催化凝血酶原转化为凝血酶。因此，在二条凝血途径中凝血因子Xa都起着至关重要的作用，不管原因任何，因子Xa受抑制便会减弱凝血作用。虽然因子Xa的若干抑制剂是已知的，但这类抑制剂或属于毒性很大的氯酮类，或属于丝氨酸蛋白酶的非特异性抑制剂。因此，一种特异性的和无毒的因子Xa抑制剂具有重要的治疗价值。
自古以来，水蛭一直用于医学。早在十九世纪，水蛭的医学应用导致医用水蛭(Hirudo medicinalis)几乎灭绝，并促使俄国征收出口限额税。近年来，对水蛭的分泌物进行了较详细的科学研究，并且发现它含有多种具有广谱生物化学和药理学活性的生物学产物，如抗凝血剂、抗转移剂、麻醉剂、抗生素和血管扩张剂。例如，从医用水蛭的唾液腺分离出的水蛭素是已知最具有特异性的作用最强的凝血酶抑制剂。此外，从南美水蛭(H.ghilianii)的唾液腺分离得到的水蛭素，据报告是一种高分子量的纤维蛋白(原)溶解酶。据报告，它是这种水蛭的抗凝血成分。这种酶的作用是使纤维蛋白原和纤维蛋白降解，而不是激活宿主的纤维蛋白溶解系统或抑制血凝固系统。
申请人已从南美水蛭(H.ghiliauii)的唾液和唾液腺组织的提取物中分离并鉴定一种蛋白质，它是凝血因子Xa的特异性抑制剂，并且它是有效的血凝固抑制剂。
这种来源于南美水蛭(H.ghiliauii)唾液腺并从其中分离得到的具有抑制凝血因子Xa活性的蛋白质，是一种有用的抗凝血剂。这种蛋白质通过以下方法分离纯化：先将南美水蛭(H.ghiliauii)的唾液或唾液腺提取物用阴离子交换树脂进行色谱分离并用盐浓度梯度递增的方法进行洗脱，再将具有强的抑制凝血因子Xa活性和抗凝血活性的那些洗脱部分进行反向高压液相色谱(HPLC)分离，以进一步纯化具有抑制凝血因子Xa活性的这种蛋白质。
本发明所用的术语“唾液”，不仅包括唾液(或唾液分泌物)，而且也包括用水蛭任何部分尤其是唾液腺以及整个水蛭所制备的组织匀浆。当然，“唾液”这一术语也包括唾液的分离物，只要这种分离物或组织匀浆含有本发明所阐述的有抑制凝血因子Xa活性的蛋白质。在其他种水蛭，如药用水蛭(H.officinalis)的唾液中也可以发现在活性方面类似于本发明的蛋白质。
本发明的具有抑制凝血因子Xa活性的蛋白质被认为是由几种与氨基酸排列顺序有关的蛋白质所组成，其中至少有二种蛋白质主要与抑制凝血因子Xa活性有关。本发明的目的是希望得到所有的能抑制因子Xa活性的，半数抑制浓度(Ic50)至少为1000nm的蚕白质/肽，它们可以是单一的成分，或为混合物，如用本发明的方法从南美水蛭(H.ghiliauii)的唾液中分离出来的混合物。本申请的目的尤其是，本发明的蛋白质还包括诸如用顺序合成和区段合成方法或用基因克隆和基因表达方法获得该类物质。
虽然这些肽的全部氨基酸排列顺序还尚未不清楚，但某些性质业已确定。组成本发明蛋白质的肽其分子量约为18000道尔顿，并且糖基化程度不高。尽管这些肽可能含一些糖基，但申请人发现，用SDS PAGE技术测得的分子量并不明显地随聚丙烯酰胺凝胶浓度的变化而改变，这表明肽分子上缺乏糖基。申请人还发现，氨基酸分析表明每种肽的氨基酸组成大致如下：丙氨基残基6个，甲硫氨酸残基5个，赖氨酸残基12-24个，精氨酸残基18-21个，脯氨酸残基16-17个，此外还含少量的芳香族氨基酸残基，例如苯丙氨酸残基4个，酪氨酸残基6个。更精确的氨基酸组成资料，如半胱氨酸(或胱氨酸)和色氨酸残基数，有待得到更大数量的肽和进行氨基酸排列顺序分析。
本申请说明书采用的氨基酸通用的缩写如下：
Ala(或A)-丙氨酸
Arg(或R)-精氨酸
Asx-天冬酰胺和/或天冬氨酸
Gly(或G)-甘氨酸
Glx-谷氨酸和/谷氨酰胺
His(或H)-组氨酸
Leu(或L)-亮氨酸
Met(或M)-甲硫氨酸
Phe(或F)-苯丙氨酸
Pro(或P)-脯氨酸
Ser(或S)-丝氨酸
Thr(或T)-苏氨酸
Tyr(或Y)-酪氨酸
Val(或V)-缬氨酸
和其他许多蛋白质或肽一样，本发明的具有抑制因子Xa活性的蛋白质也可以与各种无毒的有机酸或无机酸作用形成药学上可接受的盐。能形成适当盐的无机酸的例子有盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸和酸式金属盐(如磷酸氢二钠，硫酸氢钾)。能形成适当盐的有机酸的例子有一元羧酸、二元羧酸和三元羧酸。作为这类酸的实例有乙酸、羟基乙酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、延胡索酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、羟基马来酸、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、水杨酸、2-苯氧基苯甲酸以及磺酸(如甲磺酸和2-羟基乙磺酸)。羧基末端氨基酸的盐包括与任何适当的无机碱或有机碱所形成的无毒的羧酸盐。举例来说，这些盐包括与碱金属(如钠或钾)；碱土金属(如钙和镁)；包括铝在内的IIIA族轻金属；有机伯胺、仲胺和叔胺，例如三烷基胺(如三乙胺)、普鲁卡因、二苄胺、1-乙烯胺(1-ethenamine)、N，N′-二苄基乙二胺、二氢枞酸胺、N-(低级)烷基哌啶以及其他适当的胺所形成的盐。
能抑制因子Xa活性的本发明蛋白质的抗凝血剂量取决于病人状况和需治疗的血栓形成严重程度，其剂量范围为0.2-250mg/kg体重/天。一个具体病人的适当剂量是容易确定的。较可取的给药方法是每天1-4次剂量，每次剂量给予活性成分5-100mg。用于抑制因子Xa以阻止血液凝固，或抑制介质(如贮藏的血液)中因子Xa所需要的本发明蛋白质的浓度能容易地由熟悉本专业的人员确定。
抗凝血剂治疗的适应症是治疗和预防各种血栓形成，特别是冠状动脉和脑血管疾病。在这一领域有经验的人员容易发现需要抗凝血剂治疗的各种情况。这里所用的术语“病体”是指哺乳动物，如包括人在内的灵长类、羊、马、牛、猪、狗、猫、大鼠和小鼠。抑制凝血因子Xa不仅可用于有血栓形成的个体的抗凝血剂治疗，而且也可用于预防血液凝固，为防止贮藏的全血凝固，以及用于防止供检验或贮藏的其他生物样品的血凝固。因此，可以将本发明具有抑制因子Xa活性的蛋白质加到(或使其与)含有或怀疑含有因子Xa并希望防止血液凝固的任何介质中(接触)。
虽然本发明具有抑制因子Xa活性的蛋白质口服后通过肠道仍保留活性，但申请人还是推荐采用非口服(例如皮下、静脉内、肌内或腹腔内)给药方法，或采用长效注射液制剂或植入片制剂的给药方法。
本发明具有抑制因子Xa活性的蛋白质，其非肠胃道途径给药是将该蛋白质溶于或混悬干生理上可接受的稀释剂中，然后与药用载体(如水或油等无菌液体)一起制备注射剂，可以加或不加表面活性剂和其他药学上可接受的辅助剂。能用于该类制剂的油有石油产品、动物油、植物油以及合成来源的油，例如花生油、豆油和矿物油。总的来说，水、生理盐水、葡萄糖和有关的糖溶液、乙醇和乙二醇(如丙二醇或聚乙二醇)是优选的液体载体，尤其适于作注射溶液。
本发明具有抑制因子Xa活性的蛋白质可以按长效注射液制剂或植入片制剂的形式给药，它们可以按能使活性成分延缓释放的方式配制。本发明的活性成分可压制成小丸或小圆柱体，并以长效注射液或植入片制剂的形式注入皮下或肌内。植入片剂可以使用惰性材料，如生物降解的多聚物或合成的聚硅氧烷，例如硅橡胶、硅氧橡胶、或由DOW-Corning公司生产的其他多聚物。
本发明的蛋白质是从水蛭的唾液中制得的。用于制备并纯化的本发明蛋白质，其唾液腺提取物(它可以由南美水蛭(H.ghilianii)的前或后唾液腺或由前后二个唾液腺得到)可用几种方法得到，例如手术摘除唾液腺并制成匀浆，用硫酸铵溶液或其他的盐类(如氯化钠)或缓冲液，或用丙酮提取组织匀浆，然后浓缩提取物，或使提取物脱水，也可将组织匀浆进行超速离心。然后，将获得的唾液腺粗提物进行常规色谱分离，以分离出有Fxa和抗凝血活性的那部分。申请人采用的是属于阴离子交换树脂的DEAE纤维素色谱和肝素-琼脂糖树脂色谱，用氯化钠作渐增性线性梯度洗脱。当然，上述的二种树脂也可以用其他类型的树脂代替，并可按一般方法用其他盐以不同的梯度或用有机溶剂或其混合液进行洗脱，并可改变色谱柱流速，以便分离出有抑制因子Xa和具有抗凝血活性的那部分。
所得纯化的唾液腺提取物接着进行亲和色谱分离，即将因子Xa(如牛因子Xa)结合到色谱树脂上，如在亲和色谱分离中通常使用的容易与因子Xa结合的化学基团的那些树脂。申请人采用的是Affi-Gel-15树脂，它是一种购自Bio-Red公司的含N-琥珀酰亚胺基酯的树脂。将这种树脂和因子Xa先与4-吗啉代丙磺酸保温，再与乙醇胺一起保温，因子Xa就能结合到树脂上。经过纯化的唾液腺提取物用这种树脂进行色谱分离，用含有活性部位可逆性丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲脒的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)进行洗脱，收集具有抗凝血和酰胺解作用的那部分洗脱液。对于熟悉该项技术的人来说，有关亲和色谱技术的各种常规条件的改变将是容易理解的。
然后进一步纯化得到的具有抑制因子Xa活性的蛋白质粗制品。这种纯化可以用反相色谱的常规方法完成，反相色谱的固定相为非极性的，洗脱相为极性的。固定相一般是与玻璃之类的惰性表面化学结合的烃，洗脱相是甲醇水溶液、乙腈或丙醇。在疏水性相互作用色谱中，固定相是非极性的，洗脱相是极性的(如水或或水缓冲液)。申请人采用C-18型树脂，即在这种树脂中，与固相树脂结合的烃实质上是含18碳的烃(如Aquapore RP-300)。用含三氟乙酸的乙腈水溶液洗脱C18树脂。但是，其他适用的色谱柱还可以包括C3、C4、C6和C8等。
实例
本发明可以用下而的非限定的例子加以说明。
例1
从南美水蛭(H.Ghillianii)唾液提取物中制备抑制Fxa的物质及该物质的特性：
血凝固试验、生色试验和纤维蛋白(原)溶解试验：
在800型血凝固电子自动计时器(Madical LaboratorgAutomation公司)上，用厂家推荐的操作规程和试剂，按一步血凝固试验测定凝血酶原时间并用分光光度监测。简要地说，向含枸橼酸盐的100μl正常人血浆中加入不同量的溶于20mMHEPES，0.15M NaCl和2.5mM CaCl2缓冲液(pH7.4)中的水蛭唾液腺组织粗提物(i)；或加入不同量的溶于柱洗脱缓冲液中的水蛭唾液腺提取物色谱分离部分(ii)；或加入不同量的从水蛭唾液腺中分离纯化的Fxa抑制剂在20mMHEPES，0.15M NaCl，2.5mM CaCl2缓冲液(pH7.4)中的溶液(iii)。加入200μl含11.6mM CaCl2的促凝血酶原激酶试剂(DADE)后测定凝固时间。
Fxa和凝血酶酰胺解活性的生色试验分别用甲酯基-D-环己基甘氨酰-甘氨酰-精氨酸-P-硝基酰替苯胺乙酸盐和H-D-六氢酪氨酰-L-丙氨酰-L-精氨酸-P-硝基酰替苯胺乙酸盐，在96孔微量滴定板(Accurate Chemical andScientific公司，Westbury，NY)上进行。在这些试验中，将25μl含0.15-16ng酶的试验缓冲液(由20mM HEPS，0.15M NaCl组成，pH7.4)加到25μl试验缓冲液中，再加50μl适当的抑制剂样品。将溶液干室温下保温10分钟，然后加入100μl终浓度为2.5×10-4M的色原试剂引发反应，用EL309型微量板自动读数器(BIO-TEK仪器公司)在405nm处进行分光光度测定，每分钟记录一次在有效剂和无抑制存在条件下反映酰胺解活性的P-硝基酰替苯胺的吸光度。
按Knight等(Thromb.Haemostas(Stutgart)46,593-596(1981))报告的方法制备125I标记的人纤维蛋白原。在一塑料培养管中顺序加入5ml含5mg纤维蛋白原的缓冲液(pH7.9，由50mM Tris-HCl，0.1M NaCl，0.025M枸橼酸钠组成)； 500μci Na125I(New EnglandNuclear，Boston，MA)和5μl 0.045％Na I载体，混合，置冰浴上冷却。为了引发反应，将此混合物移入一只用100μg碘原包裹的冷却试管中，在冰浴中轻轻搅动1小时。为了中止放射性碘化反应，将此蛋白质溶液倾入一只塑料培养管中，以便将碘原与反应物分离。然后在此蛋白质溶液中加入5mg牛血清白蛋白(BSA)，再将其加到用0.05M Tris-HCl，0.1MNaCl，pH7.9缓冲液平衡过的0.5×12ml BioGel p-2色谱柱上，分部收集，以便将残留的游离125I和125I标记的纤维蛋白原分开。比放射活性为1.9×10dpm/mg。
纤维蛋白原溶解试验是基于色谱分离部分中的水蛭素(S.M.Malinconico等：J.Lab.Clin.Med.103，44-58(1984)将125I标记的纤维蛋白原降解为三氟乙酸可溶的125I标记肽的能力。在本试验中，100μl DEAE-5 PW色谱洗脱分部与227μl含50μg125I标记纤维蛋白原的50mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH7.9缓冲液保温；将样品调节为10mM的CaCl2溶液，然后于37℃保温过夜。顺序加入100μl BSA(3mg/ml)保温缓冲液和427μl冰冷却的20％三氯乙酸(TCA)，将内容物置冰浴上2小时，离心并用γ计数仪器测定沉淀物和上清液的放射活性。纤维蛋白原溶解活性用TCA可溶部分的计数值与TCA不可溶部分的计数值的比值(TCA溶解/TCA沉淀)表示。
制备唾液腺提取物将相当于50单位水蛭素(S.M.Malinconico等：J.Lab.Clin.Med，103，44-58(1984))活性(49单位/mg蛋白)的南美水蛭(H.ghilianii)的唾液腺用玻璃棒浸入容量为3ml的玻璃反应瓶(Pierce Chemical公司)中，瓶内含2ml 20mM HEPES，pH7.8(提取缓冲液)。将此反应瓶置于冰浴上，内容物用微探针超声破碎仪(Branson Sonic Power Supply公司)处理，超声处理条件是，超声破碎仪的负载循环为30％，功率级为3，一次超声破碎30秒钟，共4次。将此玻瓶以3750rpm速度离心5分钟，收集上清液，并在Eppendorf型台式离心机上以8500rpm速度再离心一次。第一次离心的沉淀部分重新混悬于2毫升提取缓冲液中，并重复以上操作，合并二次超声破碎提取所得的上清液，并立即用于纯化。牛Fxa-Affi-Gel-15亲和基质的制备
用下法将牛Fxa偶联到Affi-Gel-15树脂上：2ml含2mg纯化酶的4-吗啉代丙磺酸(MOPS)，pH7.5缓冲液(偶联缓冲液)与2.5ml树脂混合，于4℃保温过夜。充分洗涤树脂并重新混悬于3ml偶联缓冲液中。然后加入0.3ml 1M乙醇胺，pH8.0，混合，于4℃反应过夜，接着用含0.1％吐温-20的0.05MHEPES，0.1M IIaCl，pH7.5缓冲液充分洗涤。
Fxa抗凝血剂的纯化
将含4mg可溶性蛋白的唾液腺提取物置于4ml提取缓冲液中，加到用pH7.8的20mM HEPES缓冲液(缓冲液A)平衡过的DEAE-5PW(Water Associates公司产品)阴离子交换柱(0.46×7.5cm)上。然后蛋白质用氯化钠溶液作线性梯度洗脱，范围自100％缓冲液A(起始条件)到100％缓冲液B(含0.5M氯化钠的缓冲液A)，洗脱全程为60分钟，流速为1ml/分钟。合并含抗凝血剂和抗Fxa活性的氯化钠浓度为0.1-0.2M之间的几部分洗脱液(见图2)，并用缓冲液A稀释到导电率为≤10ms/cm，按着加到0.5×5cm的肝素-琼脂糖柱(BethesdaResearch Laboratories Life Technologies公司产品)上作进一步纯化。具有抗凝血剂活性的DEAE洗脱部分进一步在肝素-琼脂糖色谱柱上纯化，结果见图3。用缓冲液A充分洗柱后再用线性梯度盐溶液洗脱，梯度范围为从100％缓冲液A到100％缓冲液B(缓冲液A＋1M NaCl)，洗脱全程为75分钟，流速为1ml/分钟。在某些应用中，具有抗Fxa活性的蛋白质在牛Fxa-Affi-Gel-15亲和色谱柱上分离回收(图4)。在具有抗凝血剂活性的粗提物或色谱洗脱液中加入吐温-20，使后者浓度为0.1％，然后在床体积为2ml的牛Fxa-Affi-Gel-15柱上作亲和色谱分离。用含0.1％吐温-20的0.05M HEPES，0.1M NaCl，pH7.5缓冲液充分洗柱后，用含0.1M苯甲脒的0.05M HEPES，0.1％吐温20，pH7.5缓冲液洗脱蛋白。收集的洗脱液以1∶500稀释度作凝固试验和酰胺解试验。色谱柱洗脱流速为4ml/小时。有抗凝血剂活性和酰胺解活性的蛋白组分再在2.1×30mm Aquapore RP-300，C-18反相色谱柱上，用Applied Biosystems 130型蛋白/肽分离系统，作最后一次分离。蛋白用乙腈作线性梯度洗脱，梯度范围从100％缓冲液A(0.1％三氟乙酸水溶液)到100％缓冲液B(0.07％三氟乙酸/70％乙腈/29.93％水)，洗脱时间为40分钟。含蛋白的各分部(见图5)置于Savant快速真空系统干燥过夜。将样品的重新溶于0.1％三氟乙酸水溶液，分成若干份分别作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析、气相微量顺序分析、氨基酸分析以及抗凝血和酰胺解活性检测。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
将含3％堆积凝胶、丙烯酰胺浓度分别为20％和12％的聚丙烯酰胺凝胶板(8×8cm和1mm厚)置于Migtty Small电泳仪(Hoefer Scientific公司产品)中，进行电泳，恒电流为10mA/每块凝胶板。凝胶含0.25M Tris-HCl缓冲液(pH9.0)和0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)。在25mM Tris-HCl，0.2M甘氨酸，0.1％SDS，pH8.4的电泳缓冲液中进行电泳。将干燥样品溶于35μl含10mM Tris-HC(pH6.8)，1％SDS，20％蔗糖，1mM EDTA，6M尿素，1％2-巯基乙醇和0.03％溴酚兰的缓冲液中。电泳前将样品于60℃加热15分钟。固定凝胶并按Merrill等(Anal.Biochem，105，361(1980))的方法用银染色法检测蛋白。从标准蛋白分子量的对数对电泳迁移率作图，从该标准图上用外推法求出被检蛋白质的表观分子量。蛋白标准品有磷酰化酶B(94,000)，牛血清白蛋白(67,000)，卵清蛋白(43,000)，碳酸酐酶(30,000)，α-胰凝乳蛋白酶原(25,700)，大豆胰蛋白酶抑制剂(20,000)，β乳球蛋白(18,400)，α-乳清蛋白(14,400)，溶菌酶(14,300)，牛胰蛋白酶抑制剂(6,200)和胰岛素(3,000)。
顺序分析
在470A型蛋白-肽顺序仪(Applied Biosystems公司产品)上，用厂商提供的试剂、说明和操作规程将被检蛋白作自动埃德曼降解。在与470A气相顺序仪直接联机的120型PHT分析仪(Applied Biosystems公司)上分析每一轮降解得到的氨基酸乙内酰苯硫脲衍生物。
氨基酸分析
将用作水解管的自动加样器微量瓶(Hewlett packard)置于甲醇中作超声处理，然后置于加热炉中在500℃加热4小时。将肽与含几微升液化酚(MCB)的200μl恒沸点盐酸(PierceChemical公司)共置于Picotag Workstation(WatersAssociates公司)中，用气相水解法在105℃使肽水解20小时。水解的样品在快速真空浓缩器(Savant)中干燥后溶于少量(一般15-30μl)0.1N盐酸中，置于1090型HPLC(Hewlwttpackard公司)的自动加样器中。用Hewlett packard公司的具有高灵敏结构(荧光检测)的氨基酸定量分析仪进行氨基酸分析。在柱前先用邻苯二醛(OPA)使伯氨基酸衍生，再用9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)使仲氨基酸衍生，然后测定氨基酸。用厂商提供的色谱柱、试剂和说明，用反相HPLC分离衍生的氨基酸。该系统能准确地定量测定1-500微微摩尔的氨酰基量。
图1表示南美水蛭(H.ghilianii)唾液腺粗提物抗-Fxa的活性。该活性成分能抑制人(见插图)和牛的Fxa，但不能抑制人和牛凝血酶(数据未图示)。
图2表示4mg可溶性蛋白提取物在DEAE阴离子交换色谱柱上的色谱分离结果。在0.1-0.16M NaCl即30-35分部(管)之间，有抗凝血活性和抑制Fxa活性的蛋白同时洗脱下来(方图A)。有纤维蛋白原溶解活性但没有抗-Fxa活性的蛋白在NaCl浓度＞0.2M(方图B)即37-44分部(管)之间(画斜线部分)洗脱下来。这种蛋白能促进纤维蛋白凝块溶解，使125I标记的纤维蛋白原降解(图2、方图B)，SDS-PAGE电泳证明，并使纯化纤维蛋白原的α、β和γ链降解(未图示)。这一组分纤维蛋白原溶解作用是水蛭素引起的结果。而且，有抗-Fxa活性的诸组分未显示纤维蛋白(原)溶解活性。根据图1和图2的结果，0.1-0.16M NaCl之间洗脱的这种抑制剂既不归因于医用水蛭的水蛭素(J.Dodt等：Biol Chem.Hoppe-Seyler 366，379-385(1985))，也不归因于南美水蛭的水蛭素(南美水蛭的纤维蛋白(原)成分(S.M.Malinconico等：J.Lab.Clin.Med.103，44-58(1984))。如图2所示，25μl有最高活性的分部可使凝血酶原时间延长约16秒，并能完全抑制酰胺解试验中17ng的Fxa。由DEAE色谱分离提取物的几种试验结果可看出，抑制Fxa活性是其抗凝血活性的主要原因。
将从DEAE柱上分离出的有抗Fxa活性的各抗凝血分部合并，然后用肝素-琼脂糖色谱分级分离(图3)。在NaCl浓度为0.45-0.55M之间，有抗凝血活性和抗-Fxa酰胺解活性的蛋白同时洗脱下来。而且，显示抗凝血活性峰的25μl分部使凝血酶原时间延长约17秒左右，并能完全抑制16ng纯化的Fxa色原基质的水解。
抗凝血或抗Fxa活性的分部在Fxa-Affi-Gel-15柱上亲和色谱分离的结果见图4。如图4所示，用0.1M苯甲脒——一种可逆性丝氨酸蛋白酶抑制剂——可将有抗凝血活性和抗-Fxa活性的组分从柱上一起洗脱下来。
该抑制剂用微孔反相HPLC进一步分离的结果用图5表示。正如所见，跨越诸峰分布的抗凝血活性解析为二个主峰和四个次峰。再次色谱分离得到六个相互分开的峰，命名为P0-P5(见插图)。这些峰中，P4和P5显示较高的抗凝血活性和抗Fxa活性，而P1-P3显示活性稍低。P0未能测出活性。
P0-P5各组分的SDS-PAGE(含20％丙烯酰胺)电泳证实，这些蛋白质的电泳迁移率相似，分子量约18,000(未图示)。图6显示P5在微孔反相HPLC柱上的色谱分离图。插图显示P5峰的12％SDS-PAGE(12％丙烯酰胺)电泳分离图。此纯组分的表观分子量为18,000，即用12％和20％聚丙烯酰胺凝胶的两个浓度电泳测得的该纯化了的Fxa抑制剂的表观分子量并无明显差别，表明该成份并不是高度糖基化的。
图7显示P5浓度与抑制Fxa之间的剂量依赖关系，能产生半数最大抑制作用的P5浓度为60微微摩尔。
表1列出P0-P5各组分的氨基酸组成。就大多数残基来说，除P4和P5含Asx和Glx稍高、含Lys和Pro明显高之外，P1-P5的氨基酸含量是十分类似的。P0的Asx、Glx、Thr、Arg、Val、Met、Ile、Lys和Pro含量明显不同于P、P1-P5。P1，P2和P3的活性降低可能与Lys和Pro含量明显减少有关。除Lys和Pro外，氨基酸组成的总体相似性表明，P1-P5是氨基酸排列顺序相关的蛋白质。
图解释
图1：南美水蛭唾液腺粗提取物对Fxa的抑制作用。约11μg唾液腺提取物(可溶性蛋白)加到16ng纯化的Fxa中。该样品于室温下保温10分钟，加入甲酯基-D-环己基甘氨酰-甘氨酰-精氨酸-P-硝基酰替苯胺乙酸盐后测定酰胺解活性。在分光光度计405nm波长处，每分钟记录录次，监测所生成的P-硝基酰替苯胺。上端曲线为牛Fxa和色原基质；底端曲线为牛Fxa、唾液腺提取物和色原基质；插图中的上端曲线为人Fxa和色原基质底端曲线为人Fxa、唾液腺提取物和色原基质。南美水蛭唾液腺提取物并不能抑制牛和人凝血酶水解H-D-六氢酪氨酰-L-丙氨酰-P-硝基酰替苯胺乙酸盐(未图示)。
图2：唾液腺粗提物(4mg可溶性蛋白)在0.46×7.5cmDEAE阴离子交换色谱柱上的分级分离。蛋白用溶于20mMHEPES，pH7.8缓冲液中的氯化钠线性梯度洗脱(详见方法部分)，流速为1ml/分钟，每分部(管)收集1ml。方图A：抗凝血活性(空心园圈)用一期凝固试验测定，以凝血酶原时间的延长表示。应用色原基质甲酯基-D-环己基甘氨酰-甘氨酰-精氨酸-P-硝基酰替苯胺乙酸盐，在405nm波长处监测抑制P-硝基酰替苯胺生成的情况来测定对Fxa的抑制作用(空心方块)。方图B：此方图表示在280nm波长处用吸光度监测南美水蛭蛋白质洗脱液各组分的分布。斜线区表示纤维蛋白原溶解活性。该活性部分与抗Fxa部分或主要的抗凝血活性部分不是同时洗脱下来的。
图3：部分纯化的Fxa抑制剂用肝素-琼脂糖色谱所作的分级分离。合并抗凝血活性和抗-Fxa活性同时洗脱下来的DEAE色谱各分部，并加到0.5×5cm肝素-琼脂糖柱上。蛋白用溶于20mM HEPES，pH7.8缓冲液中的NaCl线性梯度洗脱。流速为1ml/分钟，各分部(管)收集1ml。抗凝血活性(空心园圈)用一期凝固试验测定，以凝血酶原时间延长表示。应用色原基质甲酯基-D-环己基甘氨酰-甘氨酰-精氨酸-P-硝基酰替苯胺乙酸盐，在405nm波长处监测抑制P-硝基酰替苯胺生成的情况来测定对Fxa的抑制作用(空心方块)。
图4：Fxa抑制剂在牛Fxa-Alfi-Gel-15柱上的亲和色谱分级分离。蛋白用0.1M苯甲脒从柱上洗脱下来，流速为4ml/小时，各分部(管)收集1.2ml。收集到各分部洗脱液经1∶500稀释后按前述方法分别测定抗凝血活性(空心园圈)和抗Fxa活性(实心图)。
图5：用反相HPLC法纯化南美水蛭抗-Fxa成分。同时洗脱下来的抗凝血活性和抗-Fxa活性最高的分部在2.1×30mm的Aquapore RP-300柱上，用微孔反相HPLC色谱进一步作分级分离。阴影区域表示抗凝血活性，它跨越诸峰分布。插图表示首次反相色谱分离的纯化蛋白在相同的柱上再次色谱分离结果。通过再次色谱分离，得到不重叠的相互分开的5个峰。P4和P5峰具有较高的Fxa抑制活性(深阴影)；P1，P2和P3峰中也可检测出这种活性(浅阴影)，P0峰中检查不出这种活性(无阴影)。
图6：P峰的微孔反相HPLC色谱分离。在214nm波长处监测吸光度，以此检查南美水蛭蛋白P。插图表示用微孔反相HPLC分离的P5的SDS-PAGE(12％丙烯酰胺)电泳图谱。A行是分子量标准蛋白，B行是纯化的P5。按Merrill等的方法，用银染色法检查蛋白。
图7：在给出的P5浓度下，以其抑制甲酯基-D-环己基甘氨酰-甘氨酰-精氨酸-P-硝基酰替苯胺乙酸盐水解的能力，检查纯化P5蛋白与抑制Fxa之间的剂量依赖关系，在405mm处监测P-硝基酰苯胺生成量。
        表1南美水蛭唾液腺经微孔反相HPLC分离得到的P0-P5各组分的氨基酸分析a
    氨基酸     P5     P4     P3     P2     P1     P0
天冬酰胺和/或天冬氨酸谷氨酸和/或谷氨酰胺丝氨酸组氨酸甘氨酸苏氨酸丙氨酸精氨酸酪氨酸缬氨酸甲硫氨酸异亮氨酸苯丙氨酸亮氨酸赖氨酸脯氨酸     1722921496186758491217     182410218106206758491416     1419721310618655731076     1619821310619675741156     172082141162167584166     11147210761354353943
a以每摩尔蛋白的氨基酸残基数表示，表中数值以每摩尔蛋白含6个丙氨酸残基为标准。

Claims (3)

1.从水蛭(Haementeria ghilianii)的唾液中分离具有抑制因子Xa活性的蛋白质的方法，所述蛋白质在60pm下具有半数最大抑制Xa的能力和该蛋白质在12％SDS-PAGE上的表观分子量为18000道尔顿，该方法包括：
a)在阴离子交换树脂上使唾液进行递增的盐梯度洗脱，并且分离出具有抑制因子Xa活性的洗脱液；
b)以肝素、因子Xa，或肝素和因子Xa两者为基准，使由(a)分离出的部分进行亲和色谱分离，并且分离出具有抗凝血和酰胺解活性的部分，以及
c)使(b)的分离物进行反相高压液相色谱分离，并且分离出具有抑制因子Xa活性的洗脱液。
2.权利要求1的方法，其中阴离子交换树脂是二乙氨乙基纤维素。
3.权利要求1的方法，其中高压液相色谱树脂是含N-琥珀酰亚胺基酯的树脂。
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