NO178717B - Ekstraksjon og rensing av en antikoagulerende substans fra den söramerikanske igle, Haementeria ghilianii - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår isolering og rensing

av en proteinaktig substans som har faktor Xa inhiberende aktivitet fra spytt eller spyttkjertler av iglen Haementeria ghilianii under anvendelse av kromatografisk separasjons-teknikk.

Ahtikoagulasjonsmidler er anvendbare terapeutiske mid-ler ved farmakologisk behandling av for eksempel akutt dyp venøs trombose, pulmonar embolisme, akutt arteriell embolisering av ekstremitetene, myokardialtinfarkt, og utbredt intravaskulær koagulasjon. Profylaktisk administrering av antikoagulasjonsmidler er antatt å forhindre en tilbakedannelse av embolisme i pasienter med rheumatiske eller arteriosclerotisk hjertesykdom og forhindre visse thromboemboliske komplikasjoner med kirurgi. Administrering av antikoagulasjonsmidler har også blitt indikert ved behandling av coronar arterie- og cerebrovaskulær sykdom. Arteriell trombose, i særdeleshet i arteriene som tilfører hjertemuskel og hjernen, er den førende dødsårsak.

Blodkoagulasjon avhenger av mange enzymer og kofaktorer for dens vellykkethet, og forløper etter to separate baner, den indre og ytre bane. I den indre eller kaskadebanen er alle fak-torer til stede i.det sirkulerende blod, men såsnart koagula-sjonen er startet ved denne mekanisme, tar den flere minutter å fullføres. Ved den ytre bane frigis visse lipoproteiner, dvs. faktor III, som ikke normalt er tilstede i sirkulerende blod, av skadede celler og koagulasjon begynner i løpet av sekunder.Disse baner konvergerer ved et punkt i koagulasjonsprosessen hvor faktor X CL, sammen med faktor V og calsiumion, danner prothrombinasekomplek-set for å katalysere omdannelsen av prothrombin til thrombin. Således er faktor X Sl av vital betydning for begge koagulasjons-baner og dens inhibering vil redusere blodkoagulasjon uten hensyn til årsak. Selv om flere inhibitorer av faktor X cler kjent, er slike inhibitorer enten av klorketonklassen som er relativt toksiske eller er ikke-spesifikke inhibitorer av serinproteaser. En spesifikk og ikke-toksisk inhibitor av faktor X& vil således ha en viktig terapeutisk verdi.

Igler er blitt anvendt medisinsk siden antikken. Den medisinske anvendelse av igler i det tidlige 1900-årét forår-saker en nærmest utryddelse av artene Hirudo medicinalis og forårsaket at Russland måtte innføre kvotebestemmelser med hensyn til dets eksport. Mer nylig har iglesekresjoner blitt mer vitenskapelig undersøkt og er blitt funnet å inneholde et utall av biologiske produkter med et vidt spektrum av biokjemiske og farmakologiske aktiviteter slik som antikoagulerende, antimeta-statisk anestetiske, antibiotisk og vaskodilaterende egenskaper. Eksempelvis er Hirudin isolert fra spyttkjertelen av iglen Hirudo medicinalis den mest spesifikke og kraftige thrombin-inhibitor som er kjent. Videre er Hementin, som isoleres fra spyttkjertelen av iglen Haementeria ghilianii, et fibrin-o<g>en) olyttisk enzym med rapportert høy molekylvekt. Det antikoagulerende prinsipp for denne igle er rapportert. Dette enzym nedbryter fibrinogen og fibrin snarere enn å aktivere det vert-fibrinolyttiske system, eller å inhibere koagulasjonssystemet.

Det er nå blitt identifisert og isolert fra spytt og ekstrakter av spyttkjertelvev fra iglen Haementeria ghilianii é~n;:proteinaktig~subsians som er en spesifikk inhibitor av faktor X& og som er en anvendbar inhibitor av blodkoagulasjon.

Den proteinaktige substans som har faktor X ainhiberende aktivitet og som stammer fra spyttkjertel av iglen Haementeria ghilianii og er isolert derfra, er et anvendbart antikoagulasjonsmiddel. Substansen isoleres ved å underkaste iglespytt eller spyttkjertelekstrakt fra iglen Haementeria ghilianii en kromatografisk separasjon under anvendelse av en anionisk bytterharpiks og eluering med en økende saltgradient. De fraksjoner som har høy faktor X ainhiberende aktivitet og antikoagulerende aktivitet underkastes deretter omvendt fase-høytrykks-væskekromatografi (HPLC) for ytterligere å rense substansen med faktor X inhiberende aktivitet.

a

Uttrykket spytt som anvendt her innbefatter ikke bare spytt (eller spyttaktige sekresjoner), men homogenisert vev .fra hele iglen såvel som en hvilken som helst del av iglen, i særdeleshet spyttkjertlene. Uttrykket spytt innbefatter også ethvert . isolat av spyttet, selvsagt så lenge isolatet eller vevhomogenatet inneholder den proteinaktige substans ifølge oppfinnelsen med faktor X& inhiberende aktivitet. En proteinaktig substans lik i aktivitet kan også finnes i spyttet av andre arter av Haementeria slik som H.officinalis.

Den proteinaktige substans som har faktor Xa inhiberende aktivitet, antas å være sammensatt av flere sekvens-beslektede proteiner, hvor minst to av disse proteiner er primært ansvarlige for den faktor Xa inhiberende aktivitet. For oppfinnelsens formål taes alle proteiner/peptider som har hovedsakelig faktor Xa inhiberende aktivitet, dvs. som har en IC50 på minst 1000 nM, individuelt og i kombinasjon, slik som kombinasjonen isolert ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fra spytt fra iglen Haementeria ghilianii i betraktning. Det taes spesifikt i betraktning at den proteinaktige substans ifølge oppfinnelsen omfatter slik substans enten den er avledet via sekvensvis og blokksyntese eller via genkloning og ekspresjon.

Selv om den komplette aminosyresekvens av disse peptider ennå ikke er kjent, er visse egenskaper blitt klar-lagt. Peptidene omfattende den proteinaktige substans har en molekylvekt på ca. 18 kdal og er ikke høyt glykosylert. Selv om enkelte sukkergrupper kan være til stede, er det blitt funnet at den tilsynelatende molekylvekt ikke varierer signifikant med polyakrylamidgelkonsentrasjonen ved SDS-PAGE bestemmelse, hvilket antyder signifikant mangel på glykosylgrupper på peptidene. Det er også blitt funnet at hvert peptid har ca. seks alaninrester, fem methioninrester, 12 - 14 lysinrester, 18 - 21 argininrester og 16 - 17 prolinrester, og en lav andel av aromatiske rester slik som fire fenylalanin- og seks tyrosylrester når aminosyreanalyse utføres. Mer nøyaktig informasjon om sammensetning, slik som antall cystein/cystin og tryptofanrester( avventer tilgjengelighet av større mengder av peptid og sekvensanalyse.

De etterfølgende vanlige forkortelser av aminosyrene anvendes i foreliggende^ beskrivelse:

Ala (eller A) - alanin

Arg (eller R) - arginin

Asx - asparagin og/eller asparaginsyre

Gly (eller G) - glycin

Glx - glutaminsyre og/eller glutamin

His (eller H) - histidin

Leu (eller L) - leucin

Lys (eller K) - lysin

Met (eller M) - methionin

Phe (eller F) - fenylalanin

Pro (eller P). - prolin

Ser (eller S) - serin

Thr (eller T) - threonin

Tyr (eller Y) - tyrosin

Val (eller V) - valin

Oppfinnelsen angår således en fremgangsmåte for isolering og rensing av en proteinaktig substans med Faktor Xa inhiberende aktivitet fra spytt eller spyttkjertler av iglen Haementeria ghilianii, hvilken fremgangsmåte er kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn: a) et ekstrakt av spyttkjertler fremstilles ved at spyttkjertelvev underkastes gjentatt massering og lydbehandling i 20 mM HEPES, pH 7,8, før separering av ekstraktet ved sentrifugering; b) vevsekstraktet underkastes ionebytterkromatografi på en DEAE-5PW celluloseanionbytterharpiks, og den proteinaktige substans med Faktor Xa inhiberende aktivitet segregeres ved eluering fra 0,1-0,2 M NaCl; c) den angitte substans underkastes affinitetskromatografi omfattende ett eller flere av trinnene: 1. angitte substans underkastes en FXa-Affi-Gel-15 agarosematriks, og den proteinaktige substans med Faktor Xa inhiberende aktivitet med affini-tet overfor Faktor Xa segregeres og elueres med 0,05 M HEPES, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 0,1 % Tween-20, og 0,1 M benzamidin; 2. angitte substans underkastes Heprin-Affi-Gel-15 affinitetsmatriks, og den proteinaktige substans med Faktor Xa inhiberende aktivitet med affini-tet overfor heparin segregeres og elueres mellom 0,45-0,55 M NaCl; d) den angitte substans underkastes høytrykksvæske-kromatografi, én eller flere ganger, på en C-18 reversfase-kolonne, og den del av eluatet med den rene proteinaktige substans med Faktor Xa inhiberende aktivitet segregeres.

De proteinaktige substanser som har faktor Xa inhiberende aktivitet, kan som mange proteiner/peptider danne farmasøytisk akseptable salter med en hvilken som helst ikke-toksisk, organisk eller uorganisk syre. Eksempler på uorgan-iske syrer som danner egnede salter innbefatter saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre og fosforsyre og sure metallsalter, slik som natriummonohydrogenorthofosfat og kaliumhydrogen-sulfat. Eksempler på organiske syrer som danner egnede salter innbefatter mono-, di- og tricarboxylsyrer. Eksempler på slike syrer er for eksempel eddiksyre, glykolsyre, melkesyre, pyruv-syre, malonsyre, ravsyre, glutarsyre, fumarsyre, eplesyre, vin-syre, sitronsyre, ascorbinsyre, maleinsyre, hydroxymaleinsyre, benzoesyre, hydroxybenzoesyre, fenyleddiksyre, kanelsyre, salicylsyre, 2-fenoxybenzoesyre og sulfonsyrer slik som methan-sulfonsyre og 2-hydroxyethansulfonsyre. Salter av den carboxy-terminale aminosyredel innbefatter de ikke-toksiske carboxyl-syresalter som dannes med en hvilken som helst egnet uorganisk eller organisk base. Eksempler på disse salter innbefatter de av alkalimetaller slik som for eksempel natrium og kalium; jordalkalimetaller som calsium og magnesium; lett-metaller av grupper HIA innbefattende aluminium; og organiske primære, sekundære og tertiære aminer, slik som for eksempel trialkyl-aminer, innbefattende triethylamin, procain, dibenzylamin, 1-ethanamin, N,N<1->dibenzylethylendiamin, dihydroabiethylamin, N-(lavere)alkylpiperidin, og et hvilket som helst annet egnet amin.

Den antikoagulerende dose av den proteinaktige substans med faktor Xa inhiberende aktivitet er fra 0,2 mg/kg til 250 mg/kg kroppsvekt pr. dag, avhengig,av for eksempel pasienten og strengheten av den thrombotiske tilstand som skal behandles. Den egnede dose for en bestemt pasient kan bestemmes. Fortrinnsvis vil fra 1 til 4 daglige doser bli administrert, typisk med fra 5 mg til 100 mg aktiv forbindelse pr. dose. Den nødvendige konsentrasjon av den proteinaktige substans ifølge oppfinnelsen som har faktor X ainhiberende aktivitet til å inhibere X clnår den anvendes for å inhibere blodkoagulasjon med faktor X& i et medium slik som lagret blod/ kan lett bestemmes av fagmannen.

Antikoagulerende terapi er indikert for behandling og hindring av et utall av thrombotiske tilstander, i særdeleshet coronar arterie og cerebrovaskulær sykdom. Fagmannen innen dette område er klar over omstendighetene som krever antikoagulerende terapi. Uttrykket "pasient" som anvendt her er ment å angi pattedyr slik som primater, innbefattende mennesker, .sauer, hester, kveg, griser, hunder, katter, rotter og mus. Inhibering av faktor X Sler. anvendbar ikke bare i antikoagulerende terapi av individer med thrombotiske tilstander, men er anvendbare hver gang inhibering av blodkoagulasjon er nødvendig slik som for å forhindre koagulasjon av lagret helblod og for å forhindre koagulasjon i andre biologiske prøver for .testing eller lagring. Således kan den proteinaktige substans med faktor Xa inhiberende aktivitet tilsettes til eller bringes i kontakt med et hvilket som helst medium inneholdende eller som mistenkes for å inneholde faktor Xa, og hvor det er ønskelig at blodkoagulasj on inhiberes.

Selv om den proteinaktige substans som har faktor Xa inhiberende aktivitet kan overleve passasje gjennom tarmen etter oral administrering, foretrekkes det ikke-oral administrering, f.eks. subcutan, intravenøs, intramuskulær eller intraperitonealt; administrering ved depotinjeksjon, eller ved implantatpreparering.

For parenteral administrering kan den proteinaktige substans med faktor Xa inhiberende aktivitet administreres som injiserbare doser av en løsning eller suspensjon av substansen i et fysiologisk akseptabelt fortynningsmiddel med en farma-søytisk bærer som kan være en steril væske slik som vann og

oljer, med eller uten tilsetning av et overflateaktivt middel i og andre farmasøytisk akseptable adjuvanser.

Eksempler på oljer som kan anvendes i disse preparater er petroleumsoljer, og de av animalsk, vegetabilsk eller syntetisk opprinnelse, for eksempel peanøttolje, soya&ønneolje eller

mineralolje. Generelt er vann, saltvann, vandig dekstrose og

* beslektede sukkerløsninger, ethanol og glykoler slik som propylenglykol eller polyethylenglyko^ foretrukne væskeformige bærere, i særdeleshet for injiserbare løsninger. ;Den proteinaktige substans som har faktor Xa inhiberende aktivitet kan administreres i form av en depotinjeksjon eller implantat-preparat som kan formuleres på en slik måte at det muliggjøres en forlenget frigivelse av den aktive bestand- ;del. Den aktive bestanddel kan presses til pellets eller små sylindre og implanteres subcutant eller intramuskulært som depotinjeksjoner eller implantater. Implantater kan anvende inerte materialer slik som bionedbrytbare polymerer eller syntetiske silikoner, f.eks. "Silastic", silikongummi eller andre polymerer fremstilt av Dow-Corning Corporation. ;Den proteinaktige substans fremstilles som ovenfor angitt fra iglespytt. Spyttkjertelekstrakt fra enten de fremre eller bakre spyttkjertler av H.ghilianii eller begge, for anvendelse ved erholdelse og rensing av den proteinaktige substans ifølge oppfinnelsen, kan erholdes på flere måter, slik som kirurgisk fjerning av kjertlene og homogenisering, ekstrahering av vevhomogenat med for eksempel ammoniumsulfatløsning eller andre salter slik som natriumklorid eller buffere, eller med aceton og konsentrering eller dehydratisering av ekstraktet, eller ved ultrasentrifugering av vevhomogenatet. Det resulterende urene spyttkjertelekstrakt underkastes deretter konvensjonell kromatografi for å isolere den del som har FXa og antikoagulerende aktivitet. Det er blitt anvendt kromatografi på DEAE-cellulose, en anionisk bytterharpiks, og på en heparin-agaroseharpiks og eluering med en lineær, økende saltgradient av natriumklorid. ;Det resulterende rensede spyttkjertelekstrakt underkastes deretter et affinitetskromatografitrinn under anvendelse av faktor Xa, slik som kveg-faktor X&, bundet til en kromatografi-harpiks slik som de harpikser som typisk anvendes innen affinitetskromatografi som har kjemiske grupper tilgjengelig for binding av faktor Xfl. Det er blitt anvendt " hffi-Gel"-15, en N-succimidylester-holdig harpiks tilgjengelig fra Bio-Rad Corporation. Med denne harpiks, kan faktor X bindes ved inkubering av harpiksen sammen med faktor X& med 4-morfolino-propansulfonsyre og deretter med ethanolamin. Det rensede spyttkjertelekstrakt kromatograferes under anvendelse av denne harpiks og eluering med HEPES, 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazin-ethansulfonsyre inneholdende reversibel serinproteaseinhibitor for det aktive sted, benzamidin, og oppsamling av den porsjon som har antikoagulerende og amidolyttisk aktivitet. Forskjellige konvensjonelle variasjoner av denne affinitetskromatografi-teknikk vil være vel kjent innen faget. ;Den resulterende urene proteinaktige substans som har faktor Xa inhiberende aktivitet, renses deretter ytterligere. Denne rensing kan utføres på en hvilken som helst konvensjonell måte slik som ved omvendt fasekromatografi, en type av kromatografi hvori den stasjonære fase er ikke-polar og den eluerende fase er polar. Den stasjonære fase er typisk en hydrocarbon-kjede kjemisk bundet til en inert overflate slik som glass, og den eluerende fase er vandig methanol, acetonitril eller propa-nol. Når det gjelder hydrofob interaksjonskromatografi er den stasjonære fase ikke-polar og den eluerende fase er polar, slik som vann eller vandig buffer. Det er blitt anvendt en C-18 ;type harpiks som er en harpiks hvori hydrocarbonet bundet til denne faste harpiks, er hovedsakelig 18 carbonholdig hydrocarbon, slik som 'kquapore" RP-300, C-18 harpiks og eluering med en lineær, økende gradient av vandig acetonitril inneholdende trifluoreddiksyre. Imidlertid kan andre egnede kolonner innbefatte C^; ^4' ^6' ^8 • ;Eksempler ;Oppfinnelsen illustreres ytterligere i de etterføl-gende eksempler. ;Eksempel 1 ;Fremstilling av FX^- inhiberende substans fra H. qhillianii spyttkjertelekstrakt og karakterisering ;Koagulasjon, kromogeniskeog fibrin( ogen) olyttiske bestemmelser. ;Prothrombintider ble bestemt som én-trinns glødnings-bestemmelser og overvåket spektrofotometrisk med en "Electra" 800 automatisk koagulasjonstidtager (Medical Laboratory Automation, Inc.), under anvendelse av standard-programmer og reagenser anbefalt av fabrikant. Kort angitt ble forskjellige mengder av enten (i) et urent ekstrakt fra spyttkjertelvevet fra Haementeria ghilianii i 20 mM HEPES, 0,15 M NaCl, 2,5 mM CaCl2, pH 7,4, (ii) kromatografiske fraksjoner av H.ghilianii-spyttkjertelekstrakt i kolonnebuffer eller (iii) renset FX ainhibitor fra H;ghilianii spyttkjertler i 20 mM HEPES, 0,15 M NaCl, 2,5 mM CaCl2, pH 7,4 tilsatt til 100 ul citrert normal human plasma. Levringstider ble bestemt etter tilsetning av 200 ul thromboplastin-reagens fDADE" ) inneholdende 11,6 mM CaClz 0. Kromogeniske bestemmelser av FX a og thrombinamidolyt-tiske aktiviteter ble utført i 96 brønners mikrotiterplater (Accurate Chemical and Scientific Corp., Westbury, NY) med methoxycarbonyl-D-cyklohexylglycyl-glycyl-arginin-p-nitroanilidacetat og H-D-hexahydrotyrosyl-L-alanyl-L-arginin-p-nitroanilidacetat. I disse bestemmelser ble fra 0,15 til 16 ng enzym i ;25 ul 20 mM HEPES; 0,15 m NaCl, pH 7,4 (prøvebuffer) tilsatt ;til 25 ul prøvebuffer, etterfulgt av tilsetning av 50 ul av den egnede inhibitorprøve. Løsningene ble inkubert i 10 minutter ved romtemperatur og bestemmelsen ble startet ved tilsetning av 100 ul kromogenisk substrat til en sluttkonsentrasjon på 2,5 x ;-4 ;10 M. De amidolyttiske aktiviteter i fravær eller nærvær av inhibitor ble overvåket spektrofotometrisk ved 405 nm med hensyn til p-nitroanilidabsorbans med en 'EL309 Microplate Autoreader" ;(BIO-TEK Instruments) ved 1 minutts intervall-nedtegnelser. ;125 ;I-merket (humant) fibrinogen ble fremstilt som beskrevet av Knight, et al., Thromb. Haemostas (Stuttgart) 46, 593-596 (1981). 5 mg fibrinogen i 5 ml 50 mM tris-HCl, 0,1 M NaCl, 0,025 M natriumcitrat, pH 7,9 ble blandet med 500 uCi av Na125I (New England Nuclear, Boston, MA) med 5 ul 0,045 % Nal-baerer i et plastdyrkningsrør og avkjølt på is. For å starte reaksjonen ble blandingen overført til et avkjølt rør belagt med 100 ug jodogen og ble omrørt forsiktig på et isbad i 1 time. For å stoppe radiojoderingsreaksjonen ble proteinløsningen de-kantert i et plastdyrkningsrør for å separere jodogen fra reak-tantene. 5 mg BSA ble deretter tilsatt til prøven og løsningen ble deretter fraksjonert på en 0,5 x 12 ml kolonne av "BioGel" P-2 ekvilibrert i 0,05 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, pH 7,9 for å separere ethvert gjenværende fritt I fra I-merket-fibrinogen. Den ;o ;spesifikke radioaktivitet er 1,9 x 10 dpm/mg. ;Den fibrinogenolyttiske bestemmelse var basert på hementins evne (S.M. Malinconico, et al., J. Lab. Clin. Med. 103, 44-58 (1984)) i kromatografiske fraksjoner til å nedbryte<1>25I-merket fibrinogen til trikloreddiksyre-løselige <125>I-merkede peptider. I denne bestemmelse ble 100 ul av DEAE-5PW-125 ;kromatografiske fraksjoner inkubert med 50 ug I-merket fibrinogen i 227 ul 50 mM Tris-HCl, 0,1 M NaCl, pH 7,9, prøven ble justert til 10 mM i CaCl2 og ble deretter inkubert over natten ved 37° C. Til dette ble tilsatt 100 ul BSA (3 mg/ml) ;1 inkuberingsbuffer, etterfulgt av tilsetning av 427 ul iskald ;20 % trikloreddiksyre (TCA). Prøvene ble anbragt på is i 2 timer, ble underkastet sentrifugering og radioaktiviteten i pellettene og supernatantene ble bestemt ved gamma-telling. Fibrinogenolyttisk aktivitet er uttrykt som forholdet mellom TCA-løselige "slag" på de TCA-uløselige "slag" (TCA sol/TCA ppt). ;Fremstilling av spyttkjertelekstrakt. Spyttkjertler ;av H.ghilianii svarende til 50 enheter hementin (S.M. Malinconico, et al., J. Lab. Clin. Med. 103, 44-58 (1984)) aktivitet (49 enheter/mg protein) ble oppbløtt med en glasstav i en 3 ml's glass-"Reacti-Vial" (Pierce Chemical Co.) inneholdende 2 ml 20 mM HEPES, pH 7,8 (ekstraksjonsbuffer). Ampullen ble anbragt på is og innholdet underkastet mikrosonde-spiss-lydbehandling (Branson Sonic Power Supply) med fire 30 sekunders kraftutbrudd under anvendelse av en 30 % arbeidssyklus og kraftnivå 3. Ampullen ble sentrifugert i 5 minutter ved 3750 omdr. pr. min., super-natanten ble oppsamlet og ble deretter resentrifugert ved 8500 omdr. pr. min. på en Eppendorf bordsentrifuge. Pelletten fra det første sentrifugeringstrinn ble resuspendert i 2 ml ekstraksjonsbuffer og den ovenfor angitte prosedyre ble gjentatt. Supernatantene resulterende fra de to lydbehandlingsekstraksjoner ble kombinert og anvendt umiddelbart for rensing. ;Fremstilling av kveg FX - Affi- Gel- 15 affinitetsmatrise ;Kveg FXa ble <3k>.oblet til "Affi-GeT-15 ved inkubering av ;2 mg renset enzym i 2 ml 4-morfolino-propansulfonsyre (MOPS), pH 7,5 (koblingsbuffer) med 2,5 ml harpiks ved 4° C over natten. Perlene ble grundig vasket og deretter resuspendert i 3 ml kob-lingsbuf f er. Perlene ble deretter omsatt med 0,3 ml IM ethanolamin, pH 8,0 over natten ved 4° C, og ble deretter vasket grundig med 0,05M HEPES, 0,1 M NaCl, pH 7,5 inneholdende 0,1 %,Tween-20. ;Rensing av FX^- antikoagulant. ;a . ;Spyttkjertelekstrakt inneholdende 4 mg løselig protein ;i 4 ml ekstraksjonsbuffer, ble anbragt til en DEAE-5PW (Waters Associates) anionbyttekolonne (0,46 x 7,5 cm) ekvilibrert i 20 mM HEPES, pH 6,7 (Buffer A). Proteiner ble deretter eluert med en lineær gradient av NaCl varierende fra 100 % Buffer A (begynnelsesbetingelser) til 100 % Buffer B (Buffer A inneholdende 0,5M NaCl) i løpet av 60 minutter. Strømningshastigheten var 1 ml/minutt. Fraksjonene som eluerte mellom 0,1 - 0,20 M NaCl inneholdende både antikoagulant og anti-FXa aktiviteter ble oppsamlet (se fig. 2), ble fortynnet med Buffer A til en led-ningsevne på _< 10 mS/cm og ble deretter påført en 0,5 x 5 cm heparin-agarosekolonne (Bethesda Research Laboratories Life Technologies, Inc.). Den ytterligere rensing av DEAE-fraksjonene med antikoagulantaktivitet på heparin-agarose er vist i fig. 3. Kolonnen ble grundig vasket med Buffer A og deretter eluert med en lineær saltgradient; gradienten ble variert fra 100 % Buffer A til 100 % Buffer B (Buffer A + 1 M NaCl) i løpet av 75 minutter. Strømningshastigheten var 1 ml/minutt. I enkelte anvendelses-former ble anti-FX claktiviteten gjenvunnet ved fraksjonering av proteinene over en kolonne av kveg FX cl-Affi-Gel"-15 (fig. 4) . Råekstrakter eller kromatografiske fraksjoner som har antikoagulerende aktivitet, ble justert til 0,1 % "Tween^-20 og fraksjonert ved affinitetskromatografi på en kolonne med et 2 ml sjiktvolum av kveg FX a.<J>Affi-Gel-15. Kolonnen ble grundig vasket i 0,05 M HEPES, 0,1 M NaCl, pH 7,5 inneholdende 0,1 %"Tween-20, og proteinene ble eluert med med 0,05 M HEPES, 0,1 %"Tween-20, ;pH 7,5 inneholdende 0,1 M benzamidin. Levringsforsøk og amidolyttiske forsøk ble utført på 1/500 fortynninger av de oppsamlede fraksjoner. Kolonnen ble eluert ved en strøm-ningshastighet på 4 ml/time. Sluttfraksjonering av antikoagulanten og amidolyttiske aktiviteter ble utført på en 2,1 x 30 mm 'lAquapore" RP-300, C-18 omvendt fasekolonne med Applied Biosystems modell 130 protein/peptid-separasjonssystem. Proteiner ble eluert med en lineær gradient av acetonitril, idet gradienten varierte fra 100 % Buffer A (0,1 % trifluoreddiksyre. i H20) til 100 % Buffer B (0,07 % trifluoreddiksyre/70 % acetonitril/ ;29,93 % H20) i løpet av 40 minutter. Fraksjoner (se fig. 5) inneholdende protein ble tørket over natten ved et "Savant ;speed vac"-system. Prøvene ble oppløst på nytt i 0,1 % trifluoreddiksyre/H20 og forskjellige alikvoter ble analysert ved SDS polyakrylamidgel-elektroforese, gass-fase mikrosekvensering, arainosyreanalyse og for antikoagulerende og amidolyttiske aktiviteter. ;Analyttisk polyakrylamid- gel- elektroforese ;Polyakrylamidgeler (8 x 8 cm og 1 mm tykke), 20 % og 12 % i akrylamid, inneholdende en 3 % stablingsgel ble anbragt i en "Mighty Small" elektroforeseenhet (Hoefer Scientific Co.) og underkastet en konstant strøm på 10 mA/gel. Gelene inne-holdt 0,25 M Tris-HCl, pH 9,0 og 0,1 % natriumdodecylsulfat (SDS). Elektroforese ble utført i 25 mM Tris-HCl, 0,2 M glycin, 0,1 % SDS, pH 8,4. Tørkede prøver ble oppløst i 35 ul 10 mM Tris-HCl, pH 6,8, 1 % SDS, 20 % sucrose, 1 mM EDTA, 6 M urea, 1 % 2-mercaptoethanol og 0,03 % bromfenolblått, og før elektroforese ble prøvene oppvarmet til 60° C i 15 minutter. Gelene ble fiksert og proteinene bestemt ved sølvbeisingprosedyren ifølge Merrill, et al, Anal. Biochem., 105, 361 (1980). Tilsynelatende molekylvekter av proteiner ble bestemt ved ekstra-polering fra en standard-kurve av logaritmen av molekylvektene mot den elektroforetiske mobilitet av standard-proteiner. Standardproteinene var fosforylase B (94 000), kvegserum-albumin (67 000), ovalbumin (43 000), carbonsyreanhydrase (30 000) , a-chymotrypsinogen (25 700), soyabønnetrypsininhibitor (20 000), p-lactoglobulin (18 400), a-lactalbumin (14 400), lysozym (14 300), kvegtrypsininhibitor (6200) og insulin (3000) . ;Sekvensanalyse. ;Automatisert Edman nedbrytninger ble utført på en Model 470A protein — peptidsekvensanordning (Applied Biosystems, Inc.) med reagenser, instruksjoner og standard-programmer til-ført av fabrikanten. Fenylthiohydantoin-derivatiserte aminosyrer ble analysert ved hver syklus på en Model 120 PTH-Analyzer (Applied Biosystems, Inc.) direkte på linje med 470A gass-fase-sekvensanordningen. ;Aminosyreanalyse. ;Autooppsamlings-mikroampuller (Hewlett Packard), anvendt som hydrolyserør, ble lydbehandlet i methanol og ble deretter oppvarmet i en ovn til 500° C i 4 timer. Peptidene ble hydrolysert ved gassfasehydrolyse i en Picotag Workstation (Waters Associates) ved 105° C i 20 timer med 200 ul konstant-kokende HC1 (Pierce Chemical Co.) inneholdende noen få mikro-liter væskeformig fenol (MCB). Hydrolyserte prøver ble bragt til tørrhet i en "speed vac" konsentrator (Savant), ble oppløst i et lite volum (typisk 15 - 30 ul) 0,1 N HCl og ble anbragt i autooppsamleren av en Model 1090 HPLC (Hewlett Packard). Amino-syreanalyser ble utført under anvendelse av "Aminoquant"-analysatoren fra Hewlett Packard i sterk sensibilitetskonfigu-rasjon (fluorescenspåvisning). Aminosyrer ble påvist etter prekolonnederivatisering med først O-fthaladehyd (OPA) for primære aminosyrer og deretter 9-fluorenylmethylklorformiat (FMOC) for sekundære aminosyrer. De derivatiserte aminosyrer ble separert ved omvendt fase-HPLC med kolonner, reagenser og instruksjoner fra fabrikant. Dette system kvantifiserer nøyaktig 1 - 500 pmol av aminoacylmasse. Fig. 1 viser anti-FX -aktiviteten i urene spytt-kjertelekstrakter fra H.ghilianii. Den aktive bestanddel inhi-berer både humant (se innføyning) og kveg FX cL, men ikke humane og kveg-thrombiner (data ikke vist). Fig. 2 viser kromatografi av 4 mg av det løselige proteinekstrakt ved anionbytting på DEAE. Antikoagulanten og FXa inhiberende aktiviteter koeluertes mellom 0,1 og 0,16 M ;NaCl (felt A) mellom fraksjoner 30 - 35. Den fibrinogenolyttiske aktivitet, uten anti-FX c= L aktivitet, eluerte over 0,2 0 M NaCl (felt B) mellom fraksjoner 37 - 44 (skravert område). Dette materiale aktiverte levrings (fibrin)-lyse, nedbrøt <125>I-merket fibrinogen (fig. 2, felt B) og ble vist å nedbryte a,p-og y-kjeder av renset fibrinogen ved SDS-PAGE (ikke vist). Den fibrin(ogen)olyttiske virkning av denne fraksjon tilskrives hementin. Ennvidere utviste fraksjoner med anti-FX SL aktivitet ikke noen fibrin(ogen)olyttisk aktivitet. Basert på resultatene fra fig. 1 og 2 skyldes den inhiberende eluering mellom 0,1 - 0,16 M NaCl ikke hirudin fra Hirudo medicinalis (J. Dodt, et al., Biol Chem. Hoppe-Seyler 366, 379 - 385 (1985)) eller hementin, den fibrin(ogen)olyttiske komponent a<y> Haementeria ghilianii (S.M. Malinconico, et al., J. Lab. Clin. Med. 103, 44-58 (1984)). Som vist på fig. 2, forlenget 25 ul av fraskjonene med en topp-aktivitet prothrombintiden med 16 sekunder og inhiberte fullstendig 17 ng FX cli den amidolyttiske bestemmelse. Basert på bestemmelsene på DEAE-fraksjonert ekstrakt, er den FX 3.-inhiberende aktivitet ansvarlig for hoved-antikoagulasjonsaktiviteten. ;De antikoagulerende fraksjoner med anti-FX CL-aktivitet fra DEAE-kolorinen ble samlet og deretter fraksjonert ved heparin-agarose-kromatografi (fig. 3). Antikoagulant og anti-FXa amidolyttiske aktiviteter koeluerte mellom 0,45 - 0,55 M NaCl. Ennvidere forlenget fraksjoner som utviste topp-antikoagulantaktivitet, prothrombintiden med ca. 17 sekunder og inhiberte fullstendig hydrolysen av det kromogeniske substrat ved 16 ng ;av renset FX^. ;a ;Fraksjonering av de antikoagulant/anti-FX cl-aktiviteter ved affinitetskromatografi på FX cl-Affi-Gel-15 er vist på fig. 4. Som vist ble antikoagulanten og anti-FX cL-aktiviteter eluert sammen fra kolonnen med 0,1 M benzamidin, en reversibel aktiv, sete-serinproteaseinhibitor. ;Ytterligere fraksjonering av inhibitoren ved "microbore" omvendt fase HPLC er vist i fig. 5. Som det frem-går ble fire mindre og to hovedtopper oppløst med antikoagulantaktivitet fordelt over multipletten av toppene. Refraksjonering ga seks adskilte topper, betegnet P0~P5 *se innfØyning). Av disse utviste P4 og P5 hoved-antikoagulerende aktivitet og anti-FXa-aktiviteter hvor P1~P3 utviste moderat mindre aktivitet. Ingen aktivitet ble påvist i Pn.

SDS-PAGE (20 % akrylamid) av fraksjoner P0~P5 bekreftet at disse proteiner har lignende mobiliteter med tilsynelatende molekylvekter på tilnærmet lik 18 000 (ikke vist) . Fig. 6 viser den kromatografiske profil av P5 på "microbore" omvendt fase-HPLC. Innføyningen viser en 12 % SDS-PAGE (12 % akrylamid) av P5c. Denne rene komponent har en tilsynelatende molekylvekt på 18 000, dvs. at den tilsynelatende molekylvekt av den rensede FX -

a inhibitor ikke varierer signifikant med polyakrylamid-gel-konsentrasjonen mellom 12 og 20 %, hvilket antyder at den ikke er sterkt glykosylert.

Fig. 7 viser den dose-avhengige inhibering av FX cl av P,.. Konsentrasjonen av P^ som gir halvparten av maksimal inhibering, er 60 picomolar.

Tabell I viser aminosyresammensetningen av fraksjoner Pq-P^. Aminosyre-innholdet av P^-^ var meget liktmed hensyn til de fleste rester med unntak av at P^ og P,_ utviste svakt høyere Asx og Glx og signifikant høyere Lys og Pro. Pq avvek signifikant fra P^-P^ i dets innhold av Asx, Glx, Thr, Arg, Val, Met, Ile, Lys og Pro. Den reduserte aktivitet av P^, P2 og P^ er muligens forbundet med det signifikant reduserte innhold av Lys og Pro. Den totale likhet i sammensetning med unntak av Lys og Pro, antyder at P^-^ er sekvens-beslektede proteiner.

Forklaring av figurene

Fig. 1. Inhibering av FX av urent spyttkjertelekstrakt av Haementeria ghilianii. Ca. 11 ug av spyttkjertelekstrakt (løselig protein) ble tilsatt til 16 ng renset FX cl. Prøvene ble inkubert i 10 minutter ved romtemperatur og den amidolyttiske aktivitet ble bestemt etter tilsetning av methoxycarbonyl-D-cyklohexylglycyl-glycyl-arginin-p-nitroanilidacetat; p-nitroanilid-dannelse ble overvåket spektofotometrisk ved 1 minutts intervaller og nedtegninger ved 405 nm. Toppkurve: kveg FX a og kromogenisk substrat; bunnkurve: kveg FXa=,

spyttkjertelekstrakt og kromogenisk substrat. Innføyning: (toppkurve) humant FX clog kromogenisk substrat: (bunnkurve) humant FX cl, spyttkjertelekstrakt og kromogenisk substrat. Spyttkjertelekstrakt av H.ghilianii inhiberte ikke hydrolysen av H-D-hexahydrotyrosyl-L-alanyl-L-arginin-p-nitroanilidacetat med kveg og human-thrombiner (ikke vist).

Fig- 2.

Fraksjonering av urent spyttkjertelekstrakt (4 mg løselig protein) på en 0,46 x 7,5 cm DEAE anionbyttekolonne. Proteinene ble eluert med en lineær gradient av NaCl i 20 mM HEPES, pH 7,8 (se metodene for detaljer). Strømningshastigheten var 1 ml/minutt og 1 ml fraksjoner ble oppsamlet. Felt A: Antikoagulerende aktivitet (åpne sirkler) ble bestemt ved en

én -trinns levringsbestemmelse som forlengelse i prothrombintid.

Inhibering av FX ble målt ved 405 nm for inhibering av p-nitroaniliddannelse (åpne kvadrater) under anvendelse av det kromogeniske substrat methoxycarbonyl-D-cyklohexylglycyl-glycyl-arginin-p-nitroanilid-acetat. Felt B: Dette felt viser H. ghilianii proteinelueringsprofil overvåket ved absorpsjon

ved 280 nm. Den fibrinogenolyttiske aktivitet er vist ved tverrskravert område. Denne aktivitet koeluerte ikke med anti-FXa eller hoved-antikoagulantaktivitetene.'

Fig. 3. Fraksjonering av den delvis rensede FX 3-inhibitor ved heparin agarosekromatografi. DEAE-fraksjoner med koeluerende antikoagulant- og anti-FXa~aktiviteter ble ansamlet og fylt på

en 0,5 x 5 cm kolonne av heparinagarose. Proteinene ble eluert med en lineær gradient av NaCl til 1 M i 20 mM HEPES, pH 7,8. Strømningshastigheten var 1 ml/minutt og 1 ml fraksjoner ble oppsamlet. Antikoagulerende aktivitet (åpne sirkler) ble bestemt ved en én-trinns levringsbestemmelse som forlengelsen i prothrombintid. Inhibering av FXa ble målt ved 405 nm for inhibering av p-nitroaniliddannelse (åpne kvadrater) under anvendelse av det kromogene substrat methoxy-D-cyklohexylglycyl-glycyl-arginin-p-nitroanilidacetat.

Fi g" . 4. Fraksjonering av FX 3-inhibitor ved affinitetskromatografi på kveg FXa~Affi-Gel-15. Proteinene ble eluert fra kolonnen med 0,1 M benzamidin. Strømningshastigheten var 4 ml/ time og 1,2 ml fraksjoner ble oppsamlet, og 1/500 fortynninger av de kromatografiske fraksjoner ble bestemt for antikoagulerende (åpen sirkel) og anti-FX (fylte sirkler) aktiviteter som beskrevet.

Fig. 5. Rensing av H.^ghilianii anti-FX -substanser ved omvendt fase HPLC. Toppfraksjoner med koeluerende antikoagulant og anti-FX a-aktiviteter ble fraksjonert ved "microbore" omvendt fase HPLC på en'2,1 x 30 mm "Aquapore" RP-300 kolonne. Det skygge-lagte område viser den antikoagulerende aktivitet fordelt over toppfraksjonene. Innføyningen viser rekromatografi av den opp-rinnelige omvendt fase-separasjon på samme kolonne. Ved rekromatografi ble adskilte, ikke-overlappende topper erholdt. Den hoved FXa~inhiberende aktivitet ble funnet i P^ og P5 (sterk skyggelegging) ; og aktivitet ble også påvist i P.^ P2 og P^

(lettere skyggelegging). Ingen aktivitet ble påvist i Pq (ingen skyggelegging).

Fig. 6. "Microbore" omvendt fase HPLC av P^. Absorbans ble overvåket ved 214 nm for H. ghilianii protein P5. Innføyningen viser SDS-PAGE (12 % akrylamid) av P,. isolert ved "microbore" omvendt-fase HPLC. Spor a viser molekylvekt standard-proteiner og b renset P^. Proteiner ble påvist ved sølvbeising i henhold til metoden av Merrill et al. Fig. 7. Dose-avhengig inhibering av FXa (0,15 % ng) med renset P^ ble testet ved de angitte konsentrasjoner for dets evne til å inhibere hydrolysen av methoxycarbonyl-D-cyklohexylglycyl-glycyl-arginin-p-nitroanilid-acetat. p-nitroanilid-dannelse ble overvåket ved 405 nm.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for isolering og rensing av en proteinaktig substans med Faktor Xa inhiberende aktivitet fra spytt eller spyttkjertler av iglen Haementeria ghilianii, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: a) et ekstrakt av spyttkjertler fremstilles ved at spyttkjertelvev underkastes gjentatt massering og lydbehandling i 20 mM HEPES, pH 7,8, før separering av ekstraktet ved sentrifugering; b) vevsekstraktet underkastes ionebytterkromatografi på en DEAE-5PW celluloseanionbytterharpiks, og den proteinaktige substans med Faktor Xa inhiberende aktivitet segregeres ved eluering fra 0,1-0,2 M NaCl; c) den angitte substans underkastes affinitetskromatografi omfattende ett eller flere av trinnene: 1. angitte substans underkastes en FXa-Affi-Gel-15 agarosematriks, og den proteinaktige substans med Faktor Xa inhiberende aktivitet med affini-tet overfor Faktor Xa segregeres og elueres med 0,05 M HEPES, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 0,1 % Tween-20, og 0,1 M benzamidin; 2. angitte substans underkastes Heprin-Affi-Gel-15 affinitetsmatriks, og den proteinaktige substans med Faktor Xa inhiberende aktivitet med affini-tet overfor heparin segregeres og elueres mellom 0,45-0,55 M NaCl; d) den angitte substans underkastes høytrykksvæske- > kromatografi, én eller flere ganger, på en C-18 reversfase-kolonne, og den del av eluatet med den rene proteinaktige substans med Faktor Xa inhiberende aktivitet segregeres.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den anioniske bytterhar piks er DEAE-cellulose.

3- Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at HPLC-harpiksen er en N-succimidylester-holdig harpiks.