JPH02138300A - 南アメリカ蛭ハエメンテリアギリアニからの抗凝固剤精の抽出及び精製 - Google Patents

南アメリカ蛭ハエメンテリアギリアニからの抗凝固剤精の抽出及び精製

Info

Publication number
JPH02138300A
JPH02138300A JP1152461A JP15246189A JPH02138300A JP H02138300 A JPH02138300 A JP H02138300A JP 1152461 A JP1152461 A JP 1152461A JP 15246189 A JP15246189 A JP 15246189A JP H02138300 A JPH02138300 A JP H02138300A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
factor
activity
anticoagulant
fxa
inhibitory activity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP1152461A
Other languages
English (en)
Inventor
Alan D Cardin
アラン ダグラス カーディン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aventis Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Merrell Dow Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merrell Dow Pharmaceuticals Inc filed Critical Merrell Dow Pharmaceuticals Inc
Publication of JPH02138300A publication Critical patent/JPH02138300A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56Materials from animals other than mammals
    • A61K35/62Leeches; Worms, e.g. cestodes, tapeworms, nematodes, roundworms, earth worms, ascarids, filarias, hookworms, trichinella or taenia
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81Protease inhibitors
    • C07K14/815Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/814Enzyme separation or purification
    • Y10S435/815Enzyme separation or purification by sorption
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/855Proteins from animals other than mammals or birds

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Cephalosporin Compounds (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はファクターXa抑制活性を有する蛋白質性の物
質に関し、そしてクロマトグラフィー分離技術を用いて
蛭、ハエメンチリアギリアニ(Haementeria
 ghilianii)の唾液腺又は唾液からのその単
離方法に間するものである。
抗凝固剤は、薬理学的処理、例えば急性の深部静脈血栓
、肺塞栓症、急性の四肢の動脈塞栓、心筋梗塞、及び伝
染性静脈内凝固の治療に有用な治療剤である。抗凝固剤
の予防的な投与は、リウマチ性又は動脈硬化性の心臓病
を有する患者の寒栓症の再発の防止及び手術によるある
種の血栓塞栓合併症の防止をすると信じられている。抗
凝固剤の投与は又冠状動脈及び脳血管病の治療に有用で
あることが示されている。動脈血栓、特に心臓筋肉及び
脳に供給している動脈中のものは死亡の主要な原因であ
る。
血液の凝固が成功する為には多くの酵素及び共同因子に
依存し、二つの別々の経路、即ち内部経路及び外部経路
によって進行する。内部、即ちカスケード経路に於ては
、全ての因子は循環する血液中に存在するが、この機構
による凝固は、開始され、達成まで数分かかる。外部経
路に於ては、ある種のリボ蛋白質、即ち循環する血液中
に通常は存在しないファクター■が痛められた細胞によ
って放出され、凝固は数秒以内に開始する。これらの経
路はファクター■及びカルシウムイオンと共にファクタ
ーXaがプロトロンビナーゼ複合体を形成し、プロトロ
ンビンのトロンビンへの転化を触媒する凝固過程のある
点に於て収束する。従ってファクターXaは両方の凝固
経路にとって絶対必要であり、そしてその抑制は原因に
関係なく血液凝固を減少する。ファクターXaの幾つか
の抑制剤が知られているが、そのような抑制剤は非常に
毒性のあるクロロケトン類であるかセリンプロテアーゼ
の非特異的阻害剤である。従ってファクターXaの特異
的で非毒性の抑制剤は重要な治療的価値を有する。
〔従来の技術〕
蛭は古くから医学的に使用されてきた。19世紀初朋の
医学的な蛭の使用によってヒルド メディシナリス(l
lirudo medicinalis)が殆ど絶滅し
、ロシアはその軸出に関税を課した。より最近では蛭の
分泌物はより化学的に研究され、抗凝固剤、抗転移剤、
麻酔剤、抗生物質、及び血管拡張剤等の広い生化学的及
び薬理学的な活性のスペクトラムを有する種々の生物的
製品を含有することが見出された1例えば、ヒルド メ
ディシナリスの唾液腺から単離されたヒルデインは知ら
れている最も特異的で強力なトロンビン抑制剤である。
更に蛭のハエメンテリア ギリアニの唾液腺から単離さ
れたヘメチンは高い分子量と報告されたフィブリ(フー
プ)ン分解酵素である。これは抗凝固性のこの蛭の精で
あると報告されている。この酵素は宿主ブイプリン分解
系を活性化したり又は凝固系を抑制することをしないで
、フィブリノーゲン及びフィブリンを分解する。
〔課題を解決する手段〕
本発明者はファクターXaの特異的な抑制剤であり、血
液凝固の有用な抑制剤である蛋白質性の物質を蛭ハエメ
ンテリアギリアニの唾液及び唾液腺M1mの抽出物から
同定し単離した。
蛭のハエメンテリア ギリアニの唾液腺から生じ、そこ
から単離されたファクターXa抑制活性を有する蛋白質
性の物質は有用な抗凝固剤である。
この物質は蛭の唾液又は蛭ハエメンテリア ギリアニの
唾液腺抽出物を陰イオン交換樹脂を用いるクロマトグラ
フィー分離にかけ、そして増加する塩勾配で溶離するこ
とによって単離した。高いファクターXa抑制活性及び
抗凝固活性を有するこれらのフラクションを次に逆相高
圧液体クロマトグラフィー(HPLC)にかけて更にフ
ァクターXa抑制活性を有する物質をIll!t、、た
本明細書で使用する唾液という用語は唾液(又は唾液分
泌物)のみならず、蛭全体からのホモゲナイズした組織
、並びに蛭のいかなる部分、特に唾液腺の均質化した組
織も含むものである。唾液という用語には単離物又は組
織ホモゲネートがファクターXa抑制活性を有する本発
明の蛋白質性の物質を含有する限り任意の唾液の単離物
も含むものである。
本発明に活性が類似した蛋白質性の物質もH。
オフィシナリス(If、 officinalis)な
どのハエメンテリアの他の種の唾液中に見出され得る。
ファクターXa抑制活性を有する本発明の蛋白質性の物
質は幾つかの配列して繋がっている関連した蛋白質から
なると信じられ、これらの蛋白質の少なくとも二つは主
としてファクターXa抑制活性を担っている0本発明の
目的の為には実質的なファクターXa抑制活性を有する
、即ち少なくとも+000ηMの tCSoを有する蛋
白質/ペプチドの全てであって、独立及び組合せ、例え
ば蛭ハエメンテリア ギリアニの唾液から本発明の方法
によって単離された組合せを包含することが意図されて
いる。本発明者は特定的に本発明の蛋白質性の物質は連
続したシーケンシャル及びブロック合成を通じてのもの
又は遺伝子クローニング又は表現に依るものの何れかか
ら誘導される物質を含むことを意図している。
これらのペプチドの完全なアミノ酸配列は未だ知られて
いないが、ある種の特性は確立されている0本発明の蛋
白質性の物質を含むペプチドは約18キロダルトンの分
子量を有し、高度にグリコジル化されてはいない。幾ら
かの糖基が存在するが、本発明者は見掛けの分子量はS
DS  PAGE測定に於けるポリアクリルアミドゲル
濃縮で有意義に変化せず、ペプチド上に有意義なグリコ
ジル基が無いことを示唆している。又本発明者は、各ペ
プチドが6個のアラニン残基、5個のメチオニン残基、
12〜14個のりジン残基、18〜21個のフルギニン
残基、及び16〜17個のプロリン残基を有し、そして
例えば4個のフェニルアラニン及び6個のチロシル残基
等芳香族残基が豊富ではないことをアミノ酸分析を実施
したときに見出した。より厳密な組成情報、例えばシス
ティン/シスチンの数、トリプトファン残基の数は大量
のペプチドが人手できること及び配列分析が出来ること
に待つ。
次の一般的なアミノ酸の短縮形がこの明、w書を通じて
使用される。
Ala(又はA)−アラニン Arg(又はR)−フルギニン Asx−アスパラギン叉はアスパラギン酸Gly(又は
G)−グリシン Glx−グルタミン酸又はグルタミン His(又はH)−ヒスチジン Leu(又はし)−ロイシン Lys(又はに)−リジン Net(又はM)−メチオニン Phe(又はF)−フェニルアラニン Pro(又はP)−プロリン 5er(又はS)−七リン Thr(又はT)−スレオニン Tyr(又はY)−チロシン Val(又はV)−バリン ファクターXa抑制活性を有する本発明の蛋白質性の物
質は多くの蛋白質/ペプチドのように任意の無毒の有機
又は無機酸と製薬上受入れられる塩を形成する。適当な
塩を形成する無機酸の例には塩酸、臭化水側り硫酸、燐
酸、及び酸金属塩、例えばオルト燐酸−水素ナトリウム
及び硫酸水素カリウムが含まれる。適当な塩を形成する
有機酸の例にはモノ、ジ及びトリカルボン酸が含まれる
そのような酸の例には、例えば酢酸、グリコール酸、乳
酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フ
マール酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン
酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、ヒ
ドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、桂皮酸、サリチル酸
、2−フェノキシ安息香酸及びスルホン酸、例えばメタ
ンスルホン酸及び2−ヒドロキシェタンスルホン酸が含
まれる。
カルボキシ末端アミノ酸の塩には任意の適当な無機又は
有機塩基と形成される無毒のカルボン酸塩が含まれる。
例示すれはこれらの塩にはアルカリ金属、例えばナトリ
ウム及びカリウムとのもの、アルカリ土類金属、例えば
カルシウム、及びマグネシウムとのもの、mA族のアル
ミニウムを含めた軽金属とのもの、及び有機第一級、第
二級及び第三級アミン、例えはトリエチルアミンを含め
たトリアルキルアミン、プロ力イン、ジベンジルアミン
、l−エタナミン、N、N’−ジベンジルエチレンジア
ミン、ジヒドロアビエチルアミン、N−(低級)アルキ
ルピペリジン、及び任意の池の適当なアミンとのものが
含まれる。
本発明のファクターXa抑制活性を有する蛋白質性の物
質の抗凝固投与量は、治療されるべき患者血栓症状のひ
どさに依存し、−日当たり患者体重キログラム当たり0
.2mg〜25On+gである。特定の患者に対する適
当な投与量は容易に決定され得る。
好ましくは1〜4回の毎日の投与がなされ典型的には投
与量たり51Ig〜100Bの活性化合物が投与される
。保存された血液等の媒体中に於ける血液凝固又はファ
クターXaを抑制するときに使用されるときに、ファク
ターXaを抑制するのに要するファクターXa抑制活性
を有する本発明の蛋白質性の物質の濃度は、容易に当業
者により決定され得る。
抗凝固療法は種々の血栓症状、特に冠状動脈及び脳血管
病の処置及び予防に示唆されている。この分野で経験を
積んだ者は、抗凝固療法を要求するような状況に容易に
気がつく。本明細書で使用する「患者」という用語は、
哺乳類、例えば人を含めた霊長類、羊、馬、牛、豚、犬
、猫、ラット及びマウスを意味するものとする。ファク
ターXa抑制は、血栓症状を有する個人の抗凝固療法に
有用であるのみらなす血液凝固の抑制が望ましい場合、
例えば保存された全血の凝固の防止及び試験又は貯蔵の
ための他の生物学的試料に於ける凝固の防止などに於い
てなとあらゆる場合に有用である。従ってファクターX
a抑制活性を有する本発明の蛋白質性の物質はファクタ
ーXaを含有しているか又は含有していると疑われる任
意の媒体に加えるか又はこれと接触することが出来る。
そして血液凝固が抑制されろことが望まれる任意の媒体
に加え又は接触することが出来る。
ファクターXa抑制活性を有する本発明の蛋白質性の物
質は経口投与の後、腸を通過しても生延び得るが、本発
明者は非経口投与、例えば皮下、静脈内、筋肉内Zは腹
腔内投与、デボ−注射による投与、移植製剤による投与
が好ましいと考えている。
非経口投与の為にはファクターXa仰制活性を有する本
発明の蛋白質性の物質は、表面活性剤及び他の製薬上受
は入れられる助剤の添加有り又は篇しで、水又は油の様
な滅菌液体であり得る製薬担体と共に生理学的に受は入
れられる希釈剤中のこの物質の溶液又は懸濁液の注射可
能な投与物として投与され得る。これらの製剤中で使用
できる油の例は石油、動物、植物、又は合成起源のもの
、例えばピーナツ油、大豆油、及び鉱油である。−般に
、水、塩水、デキストロース水溶液及び関連11溶液、
エタノール及びグリコール類、例えばプロピレングリコ
ール又はポリエチレングリコールが好ましい液体担体て
、特に注射溶液に良い。
ファクターXa抑制活性を有する本発明の蛋白質性の物
質は、デボ−注射又は移植製剤の形態で投与することが
出来、これらは活性成分の持続放出を可能とするような
方法で処方され得る。活性成分は、ペレット又は小シリ
ンダー形に圧縮され皮下又は筋肉内にデボ−注射又は移
植片として移植される。移植片は生物分解可能な頃合体
又は合成シリコン、例えばシラスチック、即ちダウーコ
ニングコーポレーションにより製造されたシリコンゴム
又は他の重合体なとの不活性物質を使用することが出来
る。
本発明の蛋白質性の物質は蛭の唾液から製造される。本
発明の蛋白質性の物質を取得し、そして精製するのに使
用するハエメンテリア ギリアニの前部又は後部唾液線
又はこれらの両方からの唾液腺抽出物は、幾つかの方法
、例えば唾液腺の外科的な除去及び均質化、紺繕ホモゲ
ネートの例えば燐酸アンモニウム叉は他の塩、例えば塩
化ナトノウム又は緩衝液又はアセトンでの抽出、及び抽
出物の濃縮又は脱水又は組織ホモゲネートの超遠心によ
って得ることが出来る。生じる粗製唾液腺抽出物を次に
ファクターXa抑制活性及び抗凝固活性を有するその蛋
白質を単離する為に慣用のクロマトグラフィーにかける
0本発明者はD E A E−セルロース、陰イオン交
換樹脂上でのクロマトグラフィー及びヘパリン−アガロ
ース樹脂上でのクロマトグラフィーであって、塩化ナト
リウムの線形で増加する塩勾配での溶離を行なうものを
用いた。他の樹脂も勿論これに置き換えることが出来、
そして他の種々の勾配での他の塩での溶離、又は有機溶
媒又は混合物での溶離で置き換えることも出来、変化す
るカラム流速を用いてファクターX&抑制活性及び抗凝
固活性を有するその蛋白質を通常の方法で単離すること
が出来る。
生じる精製された唾液腺抽出物を次にファクターXaを
結合するのに利用できる化学基を有するアフィニティー
クロマトグラフィーで典型的に使用されるような樹脂な
どのクロマトグラフィー樹脂に結合した牛ファクターX
a等のファクターXaを用いてアフィニティークロマト
グラフィー段階にかけられる0本発明者はバイオラドコ
ーポレーションから人手できる樹脂を含有しているアフ
ィーゲル−15(Affi−Gel−15)、即ちN−
コハク酸イミジルエステルを使用した。この樹脂ではフ
ァクターXaは樹脂をファクターXa、4−モルホリノ
プロパンスルホン酸とともに培養し、そして次にエタノ
ールアミンと共に培養することによって結合できる。精
製した唾液腺抽出物をこの樹脂を用い活性位置逆転可能
なセリンプロテアーゼ阻害剤、ベンザミジンを含有する
IIEPEs、4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピ
ペリジンエタノールスルホン酸で溶離し、抗凝固及びア
ミド分解活性を有する部分を集める0種々の慣用のこの
アフィニティークロマトグラフィー技術に対する変更は
当業者に明らかである。
ファクターXa抑制活性を有するm製蛋白質性の物質を
次に更に精製する。この精製は任意の慣用の方法、例え
ば逆相クロマトグラフィー即ち静置相が非極性で溶離相
が極性であるクロマトグラフィーの種類で達成できる。
静置相は典型的には不活性表面、例えばガラスに化学的
に結合した炭化水素鎖であり、溶離相は水性メタノール
、アセトニトリル又はプロパツールである。疎水性の相
互作用クロマトグラフィーの場合には静置相は非極性で
あり、溶離相は極性、例えば水又は水性緩衝液である。
本発明者はC−18型の樹脂を使用した。
即ち、固体樹脂に結合している炭化水素が実質的に18
個の炭素原子を有する炭化水素、例えばアクアボール(
Aquapore) RP −300、C−18である
樹脂を使用、し、トリフルオロ酢酸を含有する水性アセ
トニトリルの線形の増加する勾配での溶離を使用した。
しかし他の適当なカラムはC3、C4、C6、C8等を
含み得る。
〔実施例〕
本発明は次の非限定実施例によって説明される。
実施例1 検定 1段階凝固検定としてプロトロンビン時間を測定し、そ
して標準のプログラム及び製造業者によって推奨された
試薬を用いてエレクトラ800自動凝固タイマー(メデ
ィカルラボラトリーオートメーションインコーボレーテ
ット)で分光光度計によってモニターした。簡単に言え
ば、種々の量の(i)20n+M HE P E S 
、 0.15MN aCI、2.5mMCaCl2.1
)H7,4中のハエメンテリア ギリアニからの唾液腺
組織の粗製抽出物、(II)カラム溶am衝液中のハエ
メンテリア ギリアニ唾液腺抽出物のクロマトグラフィ
ーフラクション、又は(i i i )20mMHE 
P E S 、 O,I5MNaCl、2.5mMCa
CI。、p)17.4中のハエメンテリフ キリアニ唾
液腺からの生成したFXa抑制剤の何れかをクエン酸塩
化した通常の人の血偵(J) +0071N、:加えた
。11.6n+MCaC12を含有する200μIのト
ロンボプラスチン試薬(DADER)の添加につづいて
凝固時間を測定した。
FXaのクロマトグラフィー検定及びトロンビンアミド
分解活性をメトキシカルボニル−0−シクロヘキシルグ
リシル−グリシル−フルギニンーp−ニトロアニリドア
セテート及びH−D−ヘキサヒドロチロシル−し−アラ
ニル−し−アルギニン−p−ニトロアニリドアセテート
を夫々有する96のウェルのミクロ滴定プレートにュー
ヨーク ウェストバリーのアキュレートケミカルアンド
サイエンティフィックコーポレーション)中で実施した
。これらの検定で25μmの20mMHEPES中の0
.15〜16ngの酵素、0.15M N aCI、p
H7,4(検定fil衝液)を25μmの検定緩衝液に
加え、続いて50μmの適当な抑制剤試料を加えた。溶
液を室温で10分間培養し、検定を最終濃度2.5x1
0−’Mに於て100711の色素発生性基質を添加す
ることによって開始した。抑制剤の存在下及び非存在下
に於けるアミド分解活性を1分間間記録でEL309ミ
クロプレートオートリーダー(BIO−TEKインスト
ラメンツ)でp−ニトロアニリドの吸光度に対する40
5nmに於て分光光度計でモニターした。
1251標m(人)フィブリノーゲンをナイト等、Th
romb、Haemostas(シスタ・ソトガルト)
 46.593−596(+981)に記載されるよう
に製造した。 5111(7)5011門トリス−HC
l、O,1MNaCl、0.025Mクエン酸ナトリウ
ム、pH7,9中のフィブリノーゲン(5a+g)を5
0071CiのNa1261 にューイングランドニュ
ークリアー、ボストン、マサチューセッツ州)と、5μ
lの0.045XN a Iキャリアーと、プラスチッ
ク製の培養管中で混合し、氷上で冷やした0反応を開始
させる為に混合物を100μsのヨードゲンで被覆され
た冷却した試験官に移し、水浴中でゆっくりと1時閉撹
拌した。ラジオヨード化反応を停止させる為に蛋白質溶
液をプラスチック培養管中に傾斜し、反応体からヨード
ゲンを分離した。BSA(5mg)を次に試料に加え、
溶液を次に0.05M )リス−HCl、0.IM N
 aCl、llH?、9中で平衡にしたバイオゲル(B
ioGel)P−2の0.5x12mlOカラム上で分
画し、125■標識フイブリノーゲンから任意の残存す
る遊、1t126■を分離した。特定の放射能は1.9
 x 1011dps+/Imgである。
フィブリノーゲン分解検定はクロマトグラフィーフラク
ション中のヘメチン(ニス、エム、マリンコニコ等、J
、 Lab、 Cl1n、 Med、 103.44−
58()9B4)が1&?6141i識フイアリノーゲ
ンをトリクロロ酢酸可溶性の1251標識ペプチドに分
解する能力に基づいていた。この検定に於て、100μ
IのD E A E−5PWクロマトグラフイーフラク
シヨンを227μmの5011M  )リス−HCl、
OlIM NaCl、pH7,9中の50Mgの125
■標識フイアリノーゲンと共に培養した。試料をCaC
l2中の10肩旧こ調整し、次に37℃で一夜培養した
。これに培養緩衝液中の100μm0B S A (3
mg/ml)を加え、続いて427711の氷冷した2
0ニトリクロロ酢酸(TCA)を加えた。試料を氷上に
二時間置き、遠心分離にかけ、ペレット中及び上澄み中
の放射能をγ係数によって測定した。フィブリノーゲン
分解活性はTCA可溶性のもののカウントのTCA不溶
性のもののカウントの比として表現した( T CAs
ol/ T CAppt) 。
唾液腺抽出物の製造 50単位のヘメチン活性に対応するハエメンテリア ギ
リアニの唾液腺(ニス、エム、マリンコニコ等、 J、
  Lab、  Cl1n、  門ed、  103.
 44−58  (1984))(49単位/l118
蛋白質)を21の2On+MHE P E S 、 p
H7,8(抽出緩衝液)を含有している:(1のガラス
リアクチイーバイアル(Reacti−Vial)  
(ピアースケミカルカンパニー)中でガラス棒でふやけ
させた。ガラスビン(バイアル)を氷上に置き、内容物
をミクロプローブの先端の超音波処理にかけた(ブラソ
ンソニックバワーサブライ)。これは302の使用サイ
クル、そして電力水準3を用いて4つの30秒パワーバ
ーストで行なった。ガラスビンを3750rpmで5分
間遠心にかけ、上澄みを次にエラペンドルフチ−アルト
ップ遠心分離段階で8500rpn+で遠心分離にかけ
た。最初の遠心分離段階からのペレットを21の抽出緩
衝液中に再+!!濁し、上の手順を繰り返した。二つの
超音波処理抽出物から生じる上澄み液を次に一緒にし、
生成の為に即座に使用した。
牛FXaを21の4−モルホリノ−プロパノスルホンm
 (MOPS)pH7,5(結合緩衝液)中の精製した
酵素2mgと2.51の樹脂を4℃で一夜培養すること
によってアフィーゲル−15(Affi−Gel−15
)に結合した。ビーズを充分に洗浄し、次に3mlの結
合緩衝液中に再懸濁した。ビーズを次に0.31の1N
エタノールアミン、pus、oと一夜4℃で反応させ、
次に0.1%のSツイーン20を含有している0、05
M HEPES、0.IMNaCl、pH7,5で充分
に洗浄した。
FXa抗凝固剤の精製 4Bの可溶性蛋白質を41の抽出緩衝液中に含有してい
る唾液腺抽出物を20a+M HE P E S 、 
pH7,8(緩衝液A)中で平衡にしたDEAE−5P
W(ウォーターアソシエーツ)陰イオン交換カラム(0
゜46x7.5cn+)にかけた。蛋白質を次に100
%緩衝液A(期間状a)から10oz緩衝液B (0,
5MN aClを含有している緩衝液A)迄の範囲をな
すNaClの線形勾−配で60分間かけて処理した。流
速は117分であった。抗凝固剤及びFXa活性の両方
を含有している0、1〜0.20MN aC10間で溶
離するフラクションをプールしく第2図1j照)、緩衝
液Aで導電性≦l0m5/cmに希釈し、次に0.5χ
5cmへパリ・ンーアガロース力ラムに適用した(ベセ
スダリサーチラボラトリーズ、ライフテクロノジーズイ
ンコーボレーテッド)。DEAEフラクションを更に精
製し、ヘパリン−アガロース上で抗凝固活性を第3図に
示す。このカラムは緩衝液Aで充分に洗浄し、次に線形
の塩勾配で?fIMした。75分間にわたる勾配はIp
OXの緩衝液Aから100%の緩衝液Bの範囲であった
(緩衝液A + IM N aCl)−流速は1ml/
分であった。ある応用に於て、抗FXa活性を牛FXa
−アフィーゲル−15のカラム上で蛋白質を分画するこ
とによって1ol収した。(第4図)、抗凝固活性を有
する粗製抽出物又はクロマトグラフィーフラクションを
0.11ツイーン−20に調整し、牛FXa−7フイー
ゲルー15の21ベツド容量を有するカラム上でアフィ
ニティークロマトグラフィーによて分画1ノた。カラム
を0.1χのツイーン−20を含有する0、05M H
EPES、 O,IM NaC1、pH7,5中で充分
に洗浄し、そして蛋白質を0.1Mベンスフ ミF ;
含有ス;S0.05M HE P E S、0.11ツ
イーン−20、l]H7,5で溶離した。凝固及びアミ
ド分解検定を集めたフラクションの11500希釈上で
実施した。カラムを41χ時の流速で溶離した。抗凝固
剤及びアミド分解活性の最終フラクションを2゜I x
 30mmアクアボール(Aquapore) RP−
300、C−18逆相方ラム上で、アプライドバイオシ
ステムモデル+30蛋白/ペプチド分離系で実施した。
蛋白質をアセトニトリルの線形勾配で溶離し、線形勾配
は100%の緩衝液A(H,20中に0.1’!のトリ
フルオロ酢酸)〜100%の緩衝j1B(0,07χの
トリフルオロ酢酸/701アセトニトリル/ 29.9
31H2o )迄の範即をなし、40分間にわたって行
なった。蛋白質を含有しているフラクション(第5図参
照)をサバン) (Savant)スピードvacaf
m上で一夜乾燥した。試料をO,I!トリフルオロ酢酸
/H20中で再溶解し、種々のアリコートをSDSポリ
アクリルアミドゲル電気泳動、ガス相ミクロ配列決定、
アミノ酸分析、そして抗凝固及びアミド分解活性につい
て分析した。
分析用ポリアクリルアミドゲル電気泳動3zのスタッキ
ングゲルを含有しているアクリルアミド20χ及び +
21のポリアクリルアミドゲル(8x8cs及びl m
 m I’dみ)をマイティースモール電気泳動ユニッ
ト(ホエファーサイエンティフィックカンパニー〉中に
着き、そして一定電流10mA/ゲルニカけた。ゲルは
0.25M )リス−HCl、p)19.0及び0.1
χナトリウムFデシルサルフエー)(SDS)を含有し
ていた。電気泳動を25111M )リス−HCl、0
.2Mグリシン、O,IXS D S 、 pH8,4
中で実施シタ。
乾燥試料を35711のlOmM)リス−MCI、pH
6,訳lXS D S、20[塘、ImME D T 
A、6M尿素、IX(1)2−メルカブトエタ、′−ル
及び0.03Xのブロモフェノールブルー中に電気泳動
に先立って可溶化し、試料を65℃で15分間加熱した
。ゲルを固定し、そして蛋白質をメリル等、Anal、
 Biochem、 105.361(+981)の銀
ステイン(silver 5tain)手用向によって
検出した。蛋白質の醸掛けの分子量を、標準蛋白質の電
気泳動移動度に対する分子量の対数の標準プロットから
外挿することによって測定した。
蛋白質標準物はホスホリラーゼB (94,000) 
、牛血清アルブミン(67,0oO)、オハルブミン(
43,000)、カルボニックアンバイトラーゼ(30
,000)、α−キモトリプシノーゲン(25,Too
) 、大豆トリプシンインヒビター(20,000) 
、β−ラクトグロブリン(18,400) 、α−ラク
トアルアミン(14,400)、リゾチーム(14,3
00) 、牛トリプシンインヒビター(6,200) 
、及びインシュリン(3,000)であった。
配列分析 自動化されたエドマン([:dman)の減成をモデル
470Ai白質−ペブチト シーケンサ−(アプライド
バイオシステムズインコーボレーテツド)で、製造業者
によって供給された試薬、インストラクション、及び標
準プログラムで実施した。フェニルチオヒダントイン誘
導化アミノ酸を各サイクルでモデル+20P T Hア
ナライザー(アブライドバイオシステムズインコーボレ
ーテッド)上で47OAガス相シーケンサ−と直接オン
ラインで分析した。
アミノ酸分析 加水分解管として使用したオートサンプラーミクロバイ
アル(ヒユーレットパラカード)をメタノール中で#j
i音波処理し次に500℃で4時間加熱した。ペプチド
をガス相加水分解でビコターグワークステーション(ウ
ォータースアソシエーツ)中で105℃20時閏、数μ
mの液化フェノール(MCB)を含有している2007
11の一定沸騰HCI(ピアースケミカルカンパニー)
でカス相加水分解で加水。
分解した。加水分解試料をスピードVaC濃縮機(サバ
ント=savant)中で乾161シ、小容量(典型的
には15〜30μm)の0.INHCl中に溶解し、そ
してモデルl090HP L C(ヒユーレットバラカ
ード)のオウトサンプラー中に入れた。高感度コンフィ
ギユレーション(蛍光検出)に於てヒユーレットバラカ
ードでアミノクワット分析機を用いてアミノ酸分析を実
施した。アミノ酸を最初0−フタルアルデヒi’(OP
A)で第1のアミノ酸について、そして次に9−フルオ
レニルメチルクロロホルメート(FMOC)で第2のア
ミノ酸についてプレカラム誘導化をした後に測定した。
誘導化アミノ酸を逆相HPLCによって分離し、カラム
、試薬及びインストラクションは製造業者によって供給
されたものを使用した。このシステムは正確に1〜50
0pモルの7ミノアシルマスを定量する。
第1図はハエメンテリア ギリアニの粗製唾液腺抽出物
中の抗FXa活性を示す。活性な精は人(挿入されてい
るグラフを参照)及び牛FXaの両方を抑制するが、人
及び牛のトロンビンを抑制しない(データーをここで示
す)。
第2図はDEAEkの陰イオン交換による4Bの可溶性
蛋白質抽出物のクロマトグラフィーを示す。抗凝固及び
FXa抑制活性はフラクション30〜350間の0.1
〜0.1(3M N aC! (パネルA)の間で一緒
に溶離される。抗FXa活性を有しないフィブリノーゲ
ン分解活性は、フラクション37〜44の間(ハツチン
グした区域)で0.20MN aCI (パネルB)よ
り上で溶離する。この物質は凝固物(フィブリン)溶解
を促進し、125■標識フイブリノーゲンを減成させ(
第2図、パネルB)そしてS[)S−PAGE (図示
なし)により精製したフィブリノーゲンのα、β及びγ
鎖を分解することが示された。このフラクションのフィ
ブリ(フープ)ン分解性作用はヘメチンによるものであ
る。
更に抗FXa活性を有するフラクションはフィブJ(フ
ープ)ン分解性活性を示さなかった。第1図及び第2図
の結果に基づいて、0.1〜O,16M NaC1の間
で溶離する抑制剤は、ヒルド メディシナリス(Hir
udo w+edicinalis)のヒルデイン(ジ
エ、ドツト等、8io1. CheIll、 Hopp
e−5eyler 366.379−385(+985
))又はヘメチン、即ちハエメンテリア ギリアニのフ
ィブリ(フープ)ン分解性成分(ニス、エム、マリンコ
ニコ等1,1. Lab、 Cl1n、 Med、 1
03.44−58(1984))によるものではない。
第2図に示されるように25μmのピーク活性を有する
フラクションは16秒だけプロトロンビン時間を長くし
、そしてアミド分解検定に於て17ngのFXaを完全
に抑制した。DEAEフラクション抽出物の検定に基づ
いて、FXa抑制活性は主要な抗凝固活性の理由となっ
ている。
DEAEカラムからの抗FXa活性を有する抗凝固フラ
クションをプールし、次にヘパリン−7ガロースクロマ
トグラフイーによって分画した(第3図)。抗凝固剤、
及び抗FXaアミド分解活性は、0.45〜0.55M
 N aClの間で一緒に溶離した。更にピーク抗凝固
活性を示す25μmのフラクションは217秒だけプロ
トロンビン時間を長くし、そして+6ngの精製FXa
によって色素発生性の基質の加水分解を完全に抑制した
FXa−アフィーゲル−15hのアフィニティークロマ
トグラフィーによる抗凝固/抗FXa活性の分画を第4
図に示す。示されるように抗凝固及び抗FXa活性をカ
ラムからO,1Mベンズアミジン、即ち逆転可能な活性
位置のセリンプロテアーゼ阻害剤と共に溶離した。
更に、阻害剤のミクロボア逆相HPLCによる分画を第
5図に示す。ここに見られるように、4つの小さな、そ
して2つの主要なピークが解像され、抗凝固活性は複数
のピークにわたって分配された。再分画によって6つの
区別されるピークが生し、Po−Ps(挿入されている
部分を参照)、勿論、P4及びPsは主要な抗凝固及び
抗FXa活性を示し、P、〜P3は中程度のより少ない
活性を示した。Poでは活性は検出されなかった。
フラクションP。〜P、の5DS−PAGE(20Xア
クリルアミド)は、これらの蛋白質が見掛は分子量〜1
8.000 (図示なし)を有する類似の移動度を有す
ることを確認した。第6図はミクロボア逆相HPLC上
でのPsのクロマトグラフィープロフィ。
−ルを示す。挿入部分はPsの12%5DS−PAGE
(121アクリルアミド)を示す。この純粋な成分は見
掛は分子量18,000を有した。即ち精製したFXa
抑制剤の見掛は分子量は121と20Xの濃度の間のポ
リアク+フルアミドゲル濃度で有意義に変ることはなく
、非常にグリコジル化されてはいないことを示唆する。
第7図はPsによる投与機に依存するFXa抑制を示す
。鰻大限の半分の抑制を与えるPsの濃度は60ピコモ
ルであう。
表■はフラクションP。〜P5の7ミノ#組成を示す、
P、〜P5のアミノ酸含有量は多くの夕%基に関して非
常に類似しているbl、例外としてP4及びPsはわず
かに高いAsx及びGlxを示し、かなり高いLys及
びProを示す。p、は有意義にAsx、GIX、 T
hr、Ary、、 Val、Met、 l Ie、 L
ys9. U Proの含有量に於て、P、〜P5と異
なる。Pl、P2及びP、の減少した活性はおそら< 
Lys及びProの有意義に減少した含有量に関連して
いる。練成の全体的な類似性はLys及びPlの例外は
あるが、P1〜P5が配列的に関係した蛋白質であるこ
とを示唆している。
図面の解説 第1図 ハエメンテリア ギリアニの粗製唾液腺抽出物によるF
Xaの抑制。およそ118gの唾液腺抽出物(可溶蛋白
)を+6ngの精製FXaに加えた。試料を10分間、
室温で培養し、そしてアミド分解活性をメトキシカルボ
ニル−〇−シクロへキシルグリシル−グリシル・アルキ
ニン−p−ニトロアニリドアセテートの添加の後に測定
した。1】−ニトロアニリド形成を1分間隔で405n
mに於いて強くして分光光度計でモニターした。トップ
カーフコ牛FXa及び色素発生性基質。下のカーブ:牛
FXa、唾液腺抽出物及び色素発生性基質。挿入:(ト
ップカーブ)人FXa及び色素発生性基質、(下のカー
ブ)人FXa、唾液線抽出物及び色素発生性基質。H。
ギリアニの唾液線抽出物は、牛及び人トロンビンによる
H−D−ヘキサヒドロチロシル−し−アラニル−し−ア
ルギニン−p−ニトロアニリドアセテートの加水分解を
抑制しなかったく図示なし)。
第2図 0.46X 7.5c+a D E A Eイオン交換
カラムヒての粗製唾液腺抽出物(4mg可溶性蛋白M)
の分画。
蛋白質を20mM HE P E S 、 pH7,8
中のNaClの線形勾配で溶離したく詳細は方法を参照
)。流速はI++l/分で11フラクシヨンを集めた。
パネルA:抗凝固活性(オーブンサークル)をプロトロ
ンビン時間の長期化として一段階凝血検定によって測定
した。FXaの抑制は色素発生基質メトキシカルボニル
−〇−シクロヘキシルグリシルーグリシル−アルギニン
−p−ニトロアニリドアセテートを用いてp−ニトロア
ニリド形成(オーブンスフウェア)の抑制に対し、40
5nmで測定した。パネルB:このパネルは280nn
+の吸収によりモニターしたH。
ギリアニ蛋白溶離プロフィールを示す。フィブリノーゲ
ン分解活性を交差したハツチングの区域で示す。この活
性は抗FXa又は主要な抗凝固活性と共に一緒に溶離し
ない。
第3図 ヘパリンアカロースクロマトグラフィーによる部分的に
精製したFXaインヒビターの分画。
緒に溶離する抗凝固剤及び抗FXa活性を有するt)E
AEフラクションを集め、0.5X Scmカラムのヘ
パリン7カロース上に装填した。蛋白質を20mMHE
PES、pi(7,8中のIMまでのNaC1の線形勾
配で溶離した。流速は11/分で11フラクシヨンを集
めた。抗凝固活性(オーブンサークル)は、プロトロン
ビン時閉の長萌化として一段階凝血検定によって測定し
た。FXaの抑制は色素発生性基質のメトキシ−0−シ
クロへキシルグリシル−グリシル−アルキニン−p−ニ
トロアニリドアセテートを用いてp−ニトロアニリド生
成の抑制につき(オーブンスフウェア) 405nmで
測定した。
第4図 牛FXa−アフィーゲルー15上でのアフィニティーク
ロマトグラフィーによるFXa抑制剤の分画。
蛋白質を0.1MベンズアミジンでカラムからmRした
。流速は417時で1.21のフラクションを集めた。
 l1500希釈の色素発生性フラクションを抗凝固(
オーブンサークル)及び抗FXa(塗り潰したサークル
)の活性につき上記の様に検定した。
第5図 逆相HPLCによるハエメンテリア ギリアニ抗FXa
精の精製、−緒に溶離される抗凝固及び抗FXa活性を
有するピークフラクションを2.1×3011II11
アクアボールRP−300カラム上でマイクロポア逆相
HP L Cによって分画した。影を付けた区域はピー
クフラクションにわたって分配されている抗凝固活性を
示す。挿入された部分は、同じカラム上での最初の逆相
分なの再クロマトグラフィーを示す、再クロマトグラフ
ィーによって別々のオーバーラツプのないピークが得ら
れた。主要なFXa抑制活性は、P4とP5に見出され
(Iい陰影の部分)、活性はまたPl、 P2及びP3
にも検出された(薄い陰影の部分) 、 Poには活性
が検出されなかった(陰影なし)。
第6図 P5のマイクロポア逆相HPLC,ハエメンテリア キ
リアニ蛋白買P5に対して吸光度を214nmでモニタ
ーした。挿入部分Cえマイクロポア逆相1(PLCによ
って単離されたP5のSDS  PAGE (12%ア
クリルアミド)を示す。aのレーンは分子量標準蛋白質
そして1)のレーンは精製されたP5を示す。メリル等
の方法に従って銀ステインによって蛋白質を検出した。
第7図 精製したP5による投与量に依存したFXaの抑制(0
,15ng)をメトキシカルボニル−D−シクロヘキシ
ルグリシル−グリシル−アルギニン−p−ニトロアニリ
ドアセテートの加水分解を抑制するその能力について示
された濃度に於いて試験した。p−ニトロアニリド生成
を405nn+でモニターした。
蛋白質モル当たりの残基で表現。値は6残基1モルのA
la含有量に対し正規化された。
【図面の簡単な説明】
第1図はハエメンテリアギリアニの粗製唾液腺抽出物中
の抗FXa活性を示すグラフである。 第2図はDEAE上の陰イオン交換による4mgの可溶
性蛋白質抽出物のクロマトグラフィーを示すグラフであ
る。 第3図はDEAEカラムからの抗FXa活性を有する抗
凝固フラクションをプールし、次にヘパリン−7カロー
スクロマトグラフイーによって分画したときのグラフで
ある。 第4図はFXa−アフィーゲル−15hの7フイニテイ
ークロマトグラフイーによる抗凝固/抗FXa活性の分
画を示すグラフである。 第5図は阻害剤のミクロボア逆相1−!PLCによる分
画を示すグラフである。 第6図はミクロボア逆相H’PLCヒでのP6のクロマ
トグラフィープロフィールを示fグラフである。 第7図はP5による投与量に依存するFKa抑制を示す
グラフである。 7ラクシーン 6自Iツへ(−ジトフ 76C) l−o y ?=y時mF>t’th。 (紗ン oX乞/!す9m句 7)トロ〉ヒ゛’> a’4間の増力Ω(卿) ロ、β−先1べt 409物i 喰見な λ1+消雇 7″′細ンビンa9J)n檜如(if)咳梵4 +Q5Φ情 (方式)

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、(a)陰イオン交換樹脂上、増加する塩勾配に、蛭
    ハエメンテリアギリアニ(¥Haementeriag
    hilianii¥)の唾液をかけ、そしてファクター
    Xa抑制活性を有する溶離物の部分を分離し、 (b)(a)部からの単離したフラクシヨンをヘパリン
    、ファクターXa又はヘパリンとファクターXaの両方
    に基づいたアフィニティークロマトグラフィーにかけ、
    抗凝固及びアミド分解活性を有する部分を分離し、 (c)(b)部から単離した単離物を逆相の液体高圧ク
    ロマトグラフィーにかけ、そしてファクターXa抑制活
    性を有する溶離物の部分を分離することからなる、 蛭ハエメンテリアギリアニの唾液からファクターXa抑
    制活性を有する蛋白質性の物質を単離する方法。 2、陰イオン交換樹脂がDEAE−セルロースである特
    許請求の範囲第1項に記載の方法。 3、HPLC樹脂がN−コハク酸イミド含有樹脂である
    特許請求の範囲第1項に記載の方法。 4、特許請求の範囲第1〜3項に記載の方法によって単
    離された、蛭ハエメンテリアギリアニの唾液からのファ
    クターXa抑制活性を有する蛋白質物質。 5、60pMの濃度に於てファクターXaを最大の半分
    抑制する能力を有すること、そして15,000〜20
    ,000ダルトンの分子量を有することによって特徴付
    けられる蛭ハエメンテリアギリアニの唾液から単離され
    た蛋白質性の物質である本質的に純粋なファクターXa
    抑制物質。 6、ファクターXa含有媒体をファクターXaを抑制す
    るのに有効な特許請求の範囲第4項に記載のファクター
    Xa抑制活性を有する蛋白質性の物質のある量と接触さ
    せることからなるファクターXaを抑制する方法。 7、製薬上受入れられる担体と共に特許請求の範囲第4
    項に記載のファクターXa抑制活性を有する蛋白質性の
    物質の抗凝固有効量を投与することからなる必要とする
    患者の血液凝固を減少する方法。
JP1152461A 1988-06-16 1989-06-16 南アメリカ蛭ハエメンテリアギリアニからの抗凝固剤精の抽出及び精製 Pending JPH02138300A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/207,415 US4832849A (en) 1988-06-16 1988-06-16 Extraction and purification of an anticoagulant principle from the south american leech, haementeria ghilianii
US207,415 1988-06-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH02138300A true JPH02138300A (ja) 1990-05-28

Family

ID=22770459

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP1152461A Pending JPH02138300A (ja) 1988-06-16 1989-06-16 南アメリカ蛭ハエメンテリアギリアニからの抗凝固剤精の抽出及び精製

Country Status (22)

Country Link
US (1) US4832849A (ja)
EP (1) EP0346894B1 (ja)
JP (1) JPH02138300A (ja)
KR (1) KR910000171A (ja)
CN (1) CN1034335C (ja)
AR (1) AR244702A1 (ja)
AT (1) ATE118013T1 (ja)
AU (1) AU621124B2 (ja)
CA (1) CA1335666C (ja)
DE (1) DE68920915T2 (ja)
DK (1) DK295589A (ja)
ES (1) ES2070145T3 (ja)
FI (1) FI94487C (ja)
GR (1) GR3015946T3 (ja)
HU (1) HU205149B (ja)
IE (1) IE61363B1 (ja)
IL (1) IL90573A (ja)
NO (1) NO178717C (ja)
NZ (1) NZ229503A (ja)
PH (1) PH26374A (ja)
PT (1) PT90861B (ja)
ZA (1) ZA894394B (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02111800A (ja) * 1988-06-24 1990-04-24 Yissum Res Dev Co Of Hebrew Univ Of Jerusalem Xa因子インヒビターおよびそれを含有する医薬組成物

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5385885A (en) * 1988-01-15 1995-01-31 Gasic; Gregory P. Inhibition of smooth muscle cell proliferation by antistasin and tick anticoagulant peptide
DE3819078A1 (de) * 1988-06-04 1989-12-07 Hoechst Ag Amblyommin, ein neuer wirkstoff fuer die antikoagulationstherapie
US5120537A (en) * 1989-06-14 1992-06-09 Oklahoma Medical Research Foundation Factor xa based anticoagulant compositions
AU624962B2 (en) * 1989-06-20 1992-06-25 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Ghilanten: antimetastatic principle from the south american leech, haementeria ghilanii
US5239058A (en) * 1989-09-07 1993-08-24 Merck & Co., Inc. Proteins having anticoagulant properties
US5328997A (en) * 1989-09-07 1994-07-12 Merck & Co., Inc. Processes for making proteins having anticoagulant properties
US5192747A (en) * 1989-10-03 1993-03-09 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Anticoagulant peptides
DE4001238A1 (de) * 1990-01-18 1991-07-25 Basf Ag Verfahren zur anreicherung bzw. reinigung von biomolekuelen
EP0444441B1 (en) * 1990-03-01 1996-09-25 Hewlett-Packard Company Minimizing eluate band widths in liquid chromatography
GB9007879D0 (en) * 1990-04-06 1990-06-06 Biopharm Ltd Treatment of thrombotic events
US5189019A (en) * 1990-04-23 1993-02-23 Merck & Co., Inc. Antistasin derived anticoagulant protein
CA2047527A1 (en) * 1990-07-24 1992-01-25 Christopher Dunwiddie Method for administering a therapeutic anticoagulant
CA2052486A1 (en) * 1990-10-09 1992-04-10 Thomas M. Connolly Protein for inhibiting collagen-stimulated platelet aggregation
GB9022040D0 (en) * 1990-10-10 1990-11-21 Biopharm Ltd Platelet adhesion inhibitor
DE4234921A1 (de) * 1992-10-16 1994-04-21 Basf Ag Neues, die Gerinnungszeit des Blutes verlängerndes Protein aus dem Landblutegel Haemadipsa sylestris
DE69429858D1 (de) * 1993-04-09 2002-03-21 Bio Technology General Corp Herstellung eines rekombinanten inhibitors des faktors xa des blutegels hirudo medicinalis
US5863534A (en) * 1993-04-09 1999-01-26 Bio-Technology General Corp. Polypeptide having factor Xa inhibitory method of reducing blood coagulation with a novel polypeptide having factor Xa inhibitory activity
IL109259A0 (en) * 1993-04-09 1994-07-31 Bio Technology General Corp Novel polypeptide having factor Xa inhibitory activity
US7005510B1 (en) * 1993-06-23 2006-02-28 Beckman Instruments, Inc. Recombinant DNase B derived from Streptococcus pyogenes
CN1057911C (zh) * 1994-08-30 2000-11-01 中国人民解放军264医院 治疗心血管病的中药及其制作方法
KR0141651B1 (ko) * 1994-09-07 1998-06-15 강재헌 금속이온 친화성 크로마토그라피를 이용한 히루딘의 정제방법
CN1089006C (zh) * 1999-08-13 2002-08-14 中国科学院生态环境研究中心 一种从茶叶提取活化的凝血因子十抑制组分(ati)方法
US7927612B2 (en) * 2000-01-19 2011-04-19 Baofa Yu Combinations and methods for treating neoplasms
CN100405060C (zh) * 2006-01-24 2008-07-23 李振国 一种水蛭指纹图谱的建立方法和水蛭药材的鉴别方法
CN101138634A (zh) 2006-09-07 2008-03-12 于保法 用于治疗肿瘤的组合物
CN101412726B (zh) * 2007-10-15 2011-05-11 南京中医药大学 杂环类化合物
MX2010008655A (es) * 2008-02-06 2010-10-06 Biocon Ltd Un metodo para purificar un peptido.
US8790711B2 (en) 2012-09-17 2014-07-29 Biopep Solutions, Inc. Treating diabetes with a whole, leech saliva extract
KR101341289B1 (ko) * 2013-07-09 2013-12-12 한선대 거머리 타액의 채취방법
SG11201704175WA (en) 2014-11-26 2017-06-29 Baofa Yu Hapten-enhanced chemoimmunotherapy by ultra-minimum incision personalized intratumoral chemoimmunotherapy
CN105349601A (zh) * 2015-11-17 2016-02-24 常熟理工学院 一种具有抗菌活性的水蛭多肽锌螯合物的制备方法
CN105890960A (zh) * 2016-05-06 2016-08-24 同济大学 一种蛋白质预分离方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3300383A (en) * 1963-10-15 1967-01-24 Dresden Arzneimittel Hirudine from leeches and process for recovery thereof
US3432596A (en) * 1967-10-13 1969-03-11 Dresden Arzneimittel Method for producing highly pure hirudine
US4390630A (en) * 1980-10-28 1983-06-28 The Regents Of The University Of California Hementin--a fibrinolytic agent
US4588587A (en) * 1983-03-01 1986-05-13 Pennsylvania Hospital Method of treatment to inhibit metastasis
IL83912A (en) * 1986-09-18 1993-05-13 Pennsylvania Hospital Protein having anticoagulant and antimetastatic properties

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02111800A (ja) * 1988-06-24 1990-04-24 Yissum Res Dev Co Of Hebrew Univ Of Jerusalem Xa因子インヒビターおよびそれを含有する医薬組成物

Also Published As

Publication number Publication date
ES2070145T3 (es) 1995-06-01
HUT50197A (en) 1989-12-28
EP0346894A3 (en) 1990-04-25
FI94487C (fi) 1995-09-25
IL90573A (en) 1994-07-31
NO892498D0 (no) 1989-06-15
NO178717C (no) 1996-05-22
IL90573A0 (en) 1990-01-18
DE68920915T2 (de) 1995-05-24
PT90861A (pt) 1989-12-29
FI892947A (fi) 1989-12-17
NO178717B (no) 1996-02-12
DK295589D0 (da) 1989-06-15
EP0346894A2 (en) 1989-12-20
FI94487B (fi) 1995-06-15
CA1335666C (en) 1995-05-23
ZA894394B (en) 1990-02-28
IE891941L (en) 1989-12-16
PT90861B (pt) 1994-11-30
HU205149B (en) 1992-03-30
NO892498L (no) 1989-12-18
ATE118013T1 (de) 1995-02-15
NZ229503A (en) 1991-09-25
EP0346894B1 (en) 1995-02-01
DK295589A (da) 1989-12-17
KR910000171A (ko) 1991-01-29
GR3015946T3 (en) 1995-07-31
CN1038649A (zh) 1990-01-10
IE61363B1 (en) 1994-11-02
US4832849A (en) 1989-05-23
DE68920915D1 (de) 1995-03-16
CN1034335C (zh) 1997-03-26
AU3634389A (en) 1989-12-21
AR244702A1 (es) 1993-11-30
FI892947A0 (fi) 1989-06-15
AU621124B2 (en) 1992-03-05
PH26374A (en) 1992-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH02138300A (ja) 南アメリカ蛭ハエメンテリアギリアニからの抗凝固剤精の抽出及び精製
Bouma et al. Human blood coagulation factor XI. Purification, properties, and mechanism of activation by activated factor XII.
Watson et al. The Purification, Characterization and Partial Sequence Determination of a Trout Testis Non‐histone Protein, HMG‐T
JPS60136597A (ja) デスルフアトヒルジン、その製造及びそれを含む製薬組成物
US5472942A (en) Anti-thrombins
Diniz et al. Purification and properties of a kininogenin from the venom of Lachesis muta (bushmaster)
AU682368B2 (en) Thrombin inhibitors
US6025330A (en) Inhibitors of fibrin cross-linking and/or transglutaminases
US5447911A (en) Ghilanten antimetastatic principle from the south american leech, Haementeria ghilianii
Brankamp et al. Studies on the anticoagulant, antimetastatic and heparin-binding properties of ghilanten-related inhibitors
Chow et al. Purification, Characterization, and Amino Acid Sequence Determination of Acanthins, Potent Inhibitors of Platelet Aggregation fromAcanthophis antarcticus (Common Death Adder) Venom
RU2112528C1 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА ДЕСТАБИЛАЗЫ, ОБЛАДАЮЩЕГО ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ, ТРОМБОЛИТИЧЕСКОЙ, ЭНДО- И ЭКЗО- ε(γ GLY)-LYS-ИЗОПЕПТИДАЗНОЙ И АМИДОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ
Hercz Proteolytic cleavages in α1-antitrypsin and microheterogeneity
EP0239644A1 (en) Novel physiologically active substance having blood coagulation controlling activity
KR0137519B1 (ko) 한국산 흡혈종 거머리(Hirudo nipponia)로 부터 분리한 일래스테이즈 억제 단백질 및 그의 제조방법
Tan The amino acid sequence of lima bean inhibitor fraction IV
JPS63146900A (ja) 抗凝血性及び抗転移性特性を有するタンパク質
JPH0276900A (ja) 新規トリプシンインヒビターおよびその製造法