JPH02138300A - 南アメリカ蛭ハエメンテリアギリアニからの抗凝固剤精の抽出及び精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はファクターＸａ抑制活性を有する蛋白質性の物
質に関し、そしてクロマトグラフィー分離技術を用いて
蛭、ハエメンチリアギリアニ（Ｈａｅｍｅｎｔｅｒｉａ
　ｇｈｉｌｉａｎｉｉ）の唾液腺又は唾液からのその単
離方法に間するものである。

抗凝固剤は、薬理学的処理、例えば急性の深部静脈血栓
、肺塞栓症、急性の四肢の動脈塞栓、心筋梗塞、及び伝
染性静脈内凝固の治療に有用な治療剤である。抗凝固剤
の予防的な投与は、リウマチ性又は動脈硬化性の心臓病
を有する患者の寒栓症の再発の防止及び手術によるある
種の血栓塞栓合併症の防止をすると信じられている。抗
凝固剤の投与は又冠状動脈及び脳血管病の治療に有用で
あることが示されている。動脈血栓、特に心臓筋肉及び
脳に供給している動脈中のものは死亡の主要な原因であ
る。

血液の凝固が成功する為には多くの酵素及び共同因子に
依存し、二つの別々の経路、即ち内部経路及び外部経路
によって進行する。内部、即ちカスケード経路に於ては
、全ての因子は循環する血液中に存在するが、この機構
による凝固は、開始され、達成まで数分かかる。外部経
路に於ては、ある種のリボ蛋白質、即ち循環する血液中
に通常は存在しないファクター■が痛められた細胞によ
って放出され、凝固は数秒以内に開始する。これらの経
路はファクター■及びカルシウムイオンと共にファクタ
ーＸａがプロトロンビナーゼ複合体を形成し、プロトロ
ンビンのトロンビンへの転化を触媒する凝固過程のある
点に於て収束する。従ってファクターＸａは両方の凝固
経路にとって絶対必要であり、そしてその抑制は原因に
関係なく血液凝固を減少する。ファクターＸａの幾つか
の抑制剤が知られているが、そのような抑制剤は非常に
毒性のあるクロロケトン類であるかセリンプロテアーゼ
の非特異的阻害剤である。従ってファクターＸａの特異
的で非毒性の抑制剤は重要な治療的価値を有する。

〔従来の技術〕

蛭は古くから医学的に使用されてきた。１９世紀初朋の
医学的な蛭の使用によってヒルド　メディシナリス（ｌ
ｌｉｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）が殆ど絶滅し
、ロシアはその軸出に関税を課した。より最近では蛭の
分泌物はより化学的に研究され、抗凝固剤、抗転移剤、
麻酔剤、抗生物質、及び血管拡張剤等の広い生化学的及
び薬理学的な活性のスペクトラムを有する種々の生物的
製品を含有することが見出された１例えば、ヒルド　メ
ディシナリスの唾液腺から単離されたヒルデインは知ら
れている最も特異的で強力なトロンビン抑制剤である。

更に蛭のハエメンテリア　ギリアニの唾液腺から単離さ
れたヘメチンは高い分子量と報告されたフィブリ（フー
プ）ン分解酵素である。これは抗凝固性のこの蛭の精で
あると報告されている。この酵素は宿主ブイプリン分解
系を活性化したり又は凝固系を抑制することをしないで
、フィブリノーゲン及びフィブリンを分解する。

〔課題を解決する手段〕

本発明者はファクターＸａの特異的な抑制剤であり、血
液凝固の有用な抑制剤である蛋白質性の物質を蛭ハエメ
ンテリアギリアニの唾液及び唾液腺Ｍ１ｍの抽出物から
同定し単離した。

蛭のハエメンテリア　ギリアニの唾液腺から生じ、そこ
から単離されたファクターＸａ抑制活性を有する蛋白質
性の物質は有用な抗凝固剤である。

この物質は蛭の唾液又は蛭ハエメンテリア　ギリアニの
唾液腺抽出物を陰イオン交換樹脂を用いるクロマトグラ
フィー分離にかけ、そして増加する塩勾配で溶離するこ
とによって単離した。高いファクターＸａ抑制活性及び
抗凝固活性を有するこれらのフラクションを次に逆相高
圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけて更にフ
ァクターＸａ抑制活性を有する物質をＩｌｌ！ｔ、、た
。

本明細書で使用する唾液という用語は唾液（又は唾液分
泌物）のみならず、蛭全体からのホモゲナイズした組織
、並びに蛭のいかなる部分、特に唾液腺の均質化した組
織も含むものである。唾液という用語には単離物又は組
織ホモゲネートがファクターＸａ抑制活性を有する本発
明の蛋白質性の物質を含有する限り任意の唾液の単離物
も含むものである。

本発明に活性が類似した蛋白質性の物質もＨ。

オフィシナリス（Ｉｆ、　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）な
どのハエメンテリアの他の種の唾液中に見出され得る。

ファクターＸａ抑制活性を有する本発明の蛋白質性の物
質は幾つかの配列して繋がっている関連した蛋白質から
なると信じられ、これらの蛋白質の少なくとも二つは主
としてファクターＸａ抑制活性を担っている０本発明の
目的の為には実質的なファクターＸａ抑制活性を有する
、即ち少なくとも＋０００ηＭの　ｔＣＳｏを有する蛋
白質／ペプチドの全てであって、独立及び組合せ、例え
ば蛭ハエメンテリア　ギリアニの唾液から本発明の方法
によって単離された組合せを包含することが意図されて
いる。本発明者は特定的に本発明の蛋白質性の物質は連
続したシーケンシャル及びブロック合成を通じてのもの
又は遺伝子クローニング又は表現に依るものの何れかか
ら誘導される物質を含むことを意図している。

これらのペプチドの完全なアミノ酸配列は未だ知られて
いないが、ある種の特性は確立されている０本発明の蛋
白質性の物質を含むペプチドは約１８キロダルトンの分
子量を有し、高度にグリコジル化されてはいない。幾ら
かの糖基が存在するが、本発明者は見掛けの分子量はＳ
ＤＳ　　ＰＡＧＥ測定に於けるポリアクリルアミドゲル
濃縮で有意義に変化せず、ペプチド上に有意義なグリコ
ジル基が無いことを示唆している。又本発明者は、各ペ
プチドが６個のアラニン残基、５個のメチオニン残基、
１２〜１４個のりジン残基、１８〜２１個のフルギニン
残基、及び１６〜１７個のプロリン残基を有し、そして
例えば４個のフェニルアラニン及び６個のチロシル残基
等芳香族残基が豊富ではないことをアミノ酸分析を実施
したときに見出した。より厳密な組成情報、例えばシス
ティン／シスチンの数、トリプトファン残基の数は大量
のペプチドが人手できること及び配列分析が出来ること
に待つ。

次の一般的なアミノ酸の短縮形がこの明、ｗ書を通じて
使用される。

Ａｌａ（又はＡ）−アラニン Ａｒｇ（又はＲ）−フルギニン Ａｓｘ−アスパラギン叉はアスパラギン酸Ｇｌｙ（又は
Ｇ）−グリシン Ｇｌｘ−グルタミン酸又はグルタミン Ｈｉｓ（又はＨ）−ヒスチジン Ｌｅｕ（又はし）−ロイシン Ｌｙｓ（又はに）−リジン Ｎｅｔ（又はＭ）−メチオニン Ｐｈｅ（又はＦ）−フェニルアラニン Ｐｒｏ（又はＰ）−プロリン ５ｅｒ（又はＳ）−七リン Ｔｈｒ（又はＴ）−スレオニン Ｔｙｒ（又はＹ）−チロシン Ｖａｌ（又はＶ）−バリン ファクターＸａ抑制活性を有する本発明の蛋白質性の物
質は多くの蛋白質／ペプチドのように任意の無毒の有機
又は無機酸と製薬上受入れられる塩を形成する。適当な
塩を形成する無機酸の例には塩酸、臭化水側り硫酸、燐
酸、及び酸金属塩、例えばオルト燐酸−水素ナトリウム
及び硫酸水素カリウムが含まれる。適当な塩を形成する
有機酸の例にはモノ、ジ及びトリカルボン酸が含まれる
。

そのような酸の例には、例えば酢酸、グリコール酸、乳
酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フ
マール酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン
酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、ヒ
ドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、桂皮酸、サリチル酸
、２−フェノキシ安息香酸及びスルホン酸、例えばメタ
ンスルホン酸及び２−ヒドロキシェタンスルホン酸が含
まれる。

カルボキシ末端アミノ酸の塩には任意の適当な無機又は
有機塩基と形成される無毒のカルボン酸塩が含まれる。

例示すれはこれらの塩にはアルカリ金属、例えばナトリ
ウム及びカリウムとのもの、アルカリ土類金属、例えば
カルシウム、及びマグネシウムとのもの、ｍＡ族のアル
ミニウムを含めた軽金属とのもの、及び有機第一級、第
二級及び第三級アミン、例えはトリエチルアミンを含め
たトリアルキルアミン、プロ力イン、ジベンジルアミン
、ｌ−エタナミン、Ｎ、Ｎ’−ジベンジルエチレンジア
ミン、ジヒドロアビエチルアミン、Ｎ−（低級）アルキ
ルピペリジン、及び任意の池の適当なアミンとのものが
含まれる。

本発明のファクターＸａ抑制活性を有する蛋白質性の物
質の抗凝固投与量は、治療されるべき患者血栓症状のひ
どさに依存し、−日当たり患者体重キログラム当たり０
．２ｍｇ〜２５Ｏｎ＋ｇである。特定の患者に対する適
当な投与量は容易に決定され得る。

好ましくは１〜４回の毎日の投与がなされ典型的には投
与量たり５１Ｉｇ〜１００Ｂの活性化合物が投与される
。保存された血液等の媒体中に於ける血液凝固又はファ
クターＸａを抑制するときに使用されるときに、ファク
ターＸａを抑制するのに要するファクターＸａ抑制活性
を有する本発明の蛋白質性の物質の濃度は、容易に当業
者により決定され得る。

抗凝固療法は種々の血栓症状、特に冠状動脈及び脳血管
病の処置及び予防に示唆されている。この分野で経験を
積んだ者は、抗凝固療法を要求するような状況に容易に
気がつく。本明細書で使用する「患者」という用語は、
哺乳類、例えば人を含めた霊長類、羊、馬、牛、豚、犬
、猫、ラット及びマウスを意味するものとする。ファク
ターＸａ抑制は、血栓症状を有する個人の抗凝固療法に
有用であるのみらなす血液凝固の抑制が望ましい場合、
例えば保存された全血の凝固の防止及び試験又は貯蔵の
ための他の生物学的試料に於ける凝固の防止などに於い
てなとあらゆる場合に有用である。従ってファクターＸ
ａ抑制活性を有する本発明の蛋白質性の物質はファクタ
ーＸａを含有しているか又は含有していると疑われる任
意の媒体に加えるか又はこれと接触することが出来る。

そして血液凝固が抑制されろことが望まれる任意の媒体
に加え又は接触することが出来る。

ファクターＸａ抑制活性を有する本発明の蛋白質性の物
質は経口投与の後、腸を通過しても生延び得るが、本発
明者は非経口投与、例えば皮下、静脈内、筋肉内Ｚは腹
腔内投与、デボ−注射による投与、移植製剤による投与
が好ましいと考えている。

非経口投与の為にはファクターＸａ仰制活性を有する本
発明の蛋白質性の物質は、表面活性剤及び他の製薬上受
は入れられる助剤の添加有り又は篇しで、水又は油の様
な滅菌液体であり得る製薬担体と共に生理学的に受は入
れられる希釈剤中のこの物質の溶液又は懸濁液の注射可
能な投与物として投与され得る。これらの製剤中で使用
できる油の例は石油、動物、植物、又は合成起源のもの
、例えばピーナツ油、大豆油、及び鉱油である。−般に
、水、塩水、デキストロース水溶液及び関連１１溶液、
エタノール及びグリコール類、例えばプロピレングリコ
ール又はポリエチレングリコールが好ましい液体担体て
、特に注射溶液に良い。

ファクターＸａ抑制活性を有する本発明の蛋白質性の物
質は、デボ−注射又は移植製剤の形態で投与することが
出来、これらは活性成分の持続放出を可能とするような
方法で処方され得る。活性成分は、ペレット又は小シリ
ンダー形に圧縮され皮下又は筋肉内にデボ−注射又は移
植片として移植される。移植片は生物分解可能な頃合体
又は合成シリコン、例えばシラスチック、即ちダウーコ
ニングコーポレーションにより製造されたシリコンゴム
又は他の重合体なとの不活性物質を使用することが出来
る。

本発明の蛋白質性の物質は蛭の唾液から製造される。本
発明の蛋白質性の物質を取得し、そして精製するのに使
用するハエメンテリア　ギリアニの前部又は後部唾液線
又はこれらの両方からの唾液腺抽出物は、幾つかの方法
、例えば唾液腺の外科的な除去及び均質化、紺繕ホモゲ
ネートの例えば燐酸アンモニウム叉は他の塩、例えば塩
化ナトノウム又は緩衝液又はアセトンでの抽出、及び抽
出物の濃縮又は脱水又は組織ホモゲネートの超遠心によ
って得ることが出来る。生じる粗製唾液腺抽出物を次に
ファクターＸａ抑制活性及び抗凝固活性を有するその蛋
白質を単離する為に慣用のクロマトグラフィーにかける
０本発明者はＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ−セルロース、陰イオン交
換樹脂上でのクロマトグラフィー及びヘパリン−アガロ
ース樹脂上でのクロマトグラフィーであって、塩化ナト
リウムの線形で増加する塩勾配での溶離を行なうものを
用いた。他の樹脂も勿論これに置き換えることが出来、
そして他の種々の勾配での他の塩での溶離、又は有機溶
媒又は混合物での溶離で置き換えることも出来、変化す
るカラム流速を用いてファクターＸ＆抑制活性及び抗凝
固活性を有するその蛋白質を通常の方法で単離すること
が出来る。

生じる精製された唾液腺抽出物を次にファクターＸａを
結合するのに利用できる化学基を有するアフィニティー
クロマトグラフィーで典型的に使用されるような樹脂な
どのクロマトグラフィー樹脂に結合した牛ファクターＸ
ａ等のファクターＸａを用いてアフィニティークロマト
グラフィー段階にかけられる０本発明者はバイオラドコ
ーポレーションから人手できる樹脂を含有しているアフ
ィーゲル−１５（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ−１５）、即ちＮ−
コハク酸イミジルエステルを使用した。この樹脂ではフ
ァクターＸａは樹脂をファクターＸａ、４−モルホリノ
プロパンスルホン酸とともに培養し、そして次にエタノ
ールアミンと共に培養することによって結合できる。精
製した唾液腺抽出物をこの樹脂を用い活性位置逆転可能
なセリンプロテアーゼ阻害剤、ベンザミジンを含有する
ＩＩＥＰＥｓ、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピ
ペリジンエタノールスルホン酸で溶離し、抗凝固及びア
ミド分解活性を有する部分を集める０種々の慣用のこの
アフィニティークロマトグラフィー技術に対する変更は
当業者に明らかである。

ファクターＸａ抑制活性を有するｍ製蛋白質性の物質を
次に更に精製する。この精製は任意の慣用の方法、例え
ば逆相クロマトグラフィー即ち静置相が非極性で溶離相
が極性であるクロマトグラフィーの種類で達成できる。

静置相は典型的には不活性表面、例えばガラスに化学的
に結合した炭化水素鎖であり、溶離相は水性メタノール
、アセトニトリル又はプロパツールである。疎水性の相
互作用クロマトグラフィーの場合には静置相は非極性で
あり、溶離相は極性、例えば水又は水性緩衝液である。

本発明者はＣ−１８型の樹脂を使用した。

即ち、固体樹脂に結合している炭化水素が実質的に１８
個の炭素原子を有する炭化水素、例えばアクアボール（
Ａｑｕａｐｏｒｅ）　ＲＰ　−３００、Ｃ−１８である
樹脂を使用、し、トリフルオロ酢酸を含有する水性アセ
トニトリルの線形の増加する勾配での溶離を使用した。

しかし他の適当なカラムはＣ３、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８等を
含み得る。

〔実施例〕

本発明は次の非限定実施例によって説明される。

実施例１ 検定 １段階凝固検定としてプロトロンビン時間を測定し、そ
して標準のプログラム及び製造業者によって推奨された
試薬を用いてエレクトラ８００自動凝固タイマー（メデ
ィカルラボラトリーオートメーションインコーボレーテ
ット）で分光光度計によってモニターした。簡単に言え
ば、種々の量の（ｉ）２０ｎ＋Ｍ　ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　
、　０．１５ＭＮ　ａＣＩ、２．５ｍＭＣａＣｌ２．１
）Ｈ７，４中のハエメンテリア　ギリアニからの唾液腺
組織の粗製抽出物、（ＩＩ）カラム溶ａｍ衝液中のハエ
メンテリア　ギリアニ唾液腺抽出物のクロマトグラフィ
ーフラクション、又は（ｉ　ｉ　ｉ　）２０ｍＭＨＥ　
Ｐ　Ｅ　Ｓ　、　Ｏ，Ｉ５ＭＮａＣｌ、２．５ｍＭＣａ
ＣＩ。、ｐ）１７．４中のハエメンテリフ　キリアニ唾
液腺からの生成したＦＸａ抑制剤の何れかをクエン酸塩
化した通常の人の血偵（Ｊ）　＋００７１Ｎ、：加えた
。１１．６ｎ＋ＭＣａＣ１２を含有する２００μＩのト
ロンボプラスチン試薬（ＤＡＤＥＲ）の添加につづいて
凝固時間を測定した。

ＦＸａのクロマトグラフィー検定及びトロンビンアミド
分解活性をメトキシカルボニル−０−シクロヘキシルグ
リシル−グリシル−フルギニンーｐ−ニトロアニリドア
セテート及びＨ−Ｄ−ヘキサヒドロチロシル−し−アラ
ニル−し−アルギニン−ｐ−ニトロアニリドアセテート
を夫々有する９６のウェルのミクロ滴定プレートにュー
ヨーク　ウェストバリーのアキュレートケミカルアンド
サイエンティフィックコーポレーション）中で実施した
。これらの検定で２５μｍの２０ｍＭＨＥＰＥＳ中の０
．１５〜１６ｎｇの酵素、０．１５Ｍ　Ｎ　ａＣＩ、ｐ
Ｈ７，４（検定ｆｉｌ衝液）を２５μｍの検定緩衝液に
加え、続いて５０μｍの適当な抑制剤試料を加えた。溶
液を室温で１０分間培養し、検定を最終濃度２．５ｘ１
０−’Ｍに於て１００７１１の色素発生性基質を添加す
ることによって開始した。抑制剤の存在下及び非存在下
に於けるアミド分解活性を１分間間記録でＥＬ３０９ミ
クロプレートオートリーダー（ＢＩＯ−ＴＥＫインスト
ラメンツ）でｐ−ニトロアニリドの吸光度に対する４０
５ｎｍに於て分光光度計でモニターした。

１２５１標ｍ（人）フィブリノーゲンをナイト等、Ｔｈ
ｒｏｍｂ、Ｈａｅｍｏｓｔａｓ（シスタ・ソトガルト）
　４６．５９３−５９６（＋９８１）に記載されるよう
に製造した。　５１１１（７）５０１１門トリス−ＨＣ
ｌ、Ｏ，１ＭＮａＣｌ、０．０２５Ｍクエン酸ナトリウ
ム、ｐＨ７，９中のフィブリノーゲン（５ａ＋ｇ）を５
００７１ＣｉのＮａ１２６１　にューイングランドニュ
ークリアー、ボストン、マサチューセッツ州）と、５μ
ｌの０．０４５ＸＮ　ａ　Ｉキャリアーと、プラスチッ
ク製の培養管中で混合し、氷上で冷やした０反応を開始
させる為に混合物を１００μｓのヨードゲンで被覆され
た冷却した試験官に移し、水浴中でゆっくりと１時閉撹
拌した。ラジオヨード化反応を停止させる為に蛋白質溶
液をプラスチック培養管中に傾斜し、反応体からヨード
ゲンを分離した。ＢＳＡ（５ｍｇ）を次に試料に加え、
溶液を次に０．０５Ｍ　）リス−ＨＣｌ、０．ＩＭ　Ｎ
　ａＣｌ、ｌｌＨ？、９中で平衡にしたバイオゲル（Ｂ
ｉｏＧｅｌ）Ｐ−２の０．５ｘ１２ｍｌＯカラム上で分
画し、１２５■標識フイブリノーゲンから任意の残存す
る遊、１ｔ１２６■を分離した。特定の放射能は１．９
　ｘ　１０１１ｄｐｓ＋／Ｉｍｇである。

フィブリノーゲン分解検定はクロマトグラフィーフラク
ション中のヘメチン（ニス、エム、マリンコニコ等、Ｊ
、　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、　１０３．４４−
５８（）９Ｂ４）が１＆？６１４１ｉ識フイアリノーゲ
ンをトリクロロ酢酸可溶性の１２５１標識ペプチドに分
解する能力に基づいていた。この検定に於て、１００μ
ＩのＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ−５ＰＷクロマトグラフイーフラク
シヨンを２２７μｍの５０１１Ｍ　　）リス−ＨＣｌ、
ＯｌＩＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７，９中の５０Ｍｇの１２５
■標識フイアリノーゲンと共に培養した。試料をＣａＣ
ｌ２中の１０肩旧こ調整し、次に３７℃で一夜培養した
。これに培養緩衝液中の１００μｍ０Ｂ　Ｓ　Ａ　（３
ｍｇ／ｍｌ）を加え、続いて４２７７１１の氷冷した２
０ニトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加えた。試料を氷上に
二時間置き、遠心分離にかけ、ペレット中及び上澄み中
の放射能をγ係数によって測定した。フィブリノーゲン
分解活性はＴＣＡ可溶性のもののカウントのＴＣＡ不溶
性のもののカウントの比として表現した（　Ｔ　ＣＡｓ
ｏｌ／　Ｔ　ＣＡｐｐｔ）　。

唾液腺抽出物の製造 ５０単位のヘメチン活性に対応するハエメンテリア　ギ
リアニの唾液腺（ニス、エム、マリンコニコ等、　Ｊ、
　　Ｌａｂ、　　Ｃｌ１ｎ、　　門ｅｄ、　　１０３．
　４４−５８　　（１９８４））（４９単位／ｌ１１８
蛋白質）を２１の２Ｏｎ＋ＭＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　、　ｐ
Ｈ７，８（抽出緩衝液）を含有している：（１のガラス
リアクチイーバイアル（Ｒｅａｃｔｉ−Ｖｉａｌ）　　
（ピアースケミカルカンパニー）中でガラス棒でふやけ
させた。ガラスビン（バイアル）を氷上に置き、内容物
をミクロプローブの先端の超音波処理にかけた（ブラソ
ンソニックバワーサブライ）。これは３０２の使用サイ
クル、そして電力水準３を用いて４つの３０秒パワーバ
ーストで行なった。ガラスビンを３７５０ｒｐｍで５分
間遠心にかけ、上澄みを次にエラペンドルフチ−アルト
ップ遠心分離段階で８５００ｒｐｎ＋で遠心分離にかけ
た。最初の遠心分離段階からのペレットを２１の抽出緩
衝液中に再＋！！濁し、上の手順を繰り返した。二つの
超音波処理抽出物から生じる上澄み液を次に一緒にし、
生成の為に即座に使用した。

牛ＦＸａを２１の４−モルホリノ−プロパノスルホンｍ
　（ＭＯＰＳ）ｐＨ７，５（結合緩衝液）中の精製した
酵素２ｍｇと２．５１の樹脂を４℃で一夜培養すること
によってアフィーゲル−１５（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ−１５
）に結合した。ビーズを充分に洗浄し、次に３ｍｌの結
合緩衝液中に再懸濁した。ビーズを次に０．３１の１Ｎ
エタノールアミン、ｐｕｓ、ｏと一夜４℃で反応させ、
次に０．１％のＳツイーン２０を含有している０、０５
Ｍ　ＨＥＰＥＳ、０．ＩＭＮａＣｌ、ｐＨ７，５で充分
に洗浄した。

ＦＸａ抗凝固剤の精製 ４Ｂの可溶性蛋白質を４１の抽出緩衝液中に含有してい
る唾液腺抽出物を２０ａ＋Ｍ　ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　、　
ｐＨ７，８（緩衝液Ａ）中で平衡にしたＤＥＡＥ−５Ｐ
Ｗ（ウォーターアソシエーツ）陰イオン交換カラム（０
゜４６ｘ７．５ｃｎ＋）にかけた。蛋白質を次に１００
％緩衝液Ａ（期間状ａ）から１０ｏｚ緩衝液Ｂ　（０，
５ＭＮ　ａＣｌを含有している緩衝液Ａ）迄の範囲をな
すＮａＣｌの線形勾−配で６０分間かけて処理した。流
速は１１７分であった。抗凝固剤及びＦＸａ活性の両方
を含有している０、１〜０．２０ＭＮ　ａＣ１０間で溶
離するフラクションをプールしく第２図１ｊ照）、緩衝
液Ａで導電性≦ｌ０ｍ５／ｃｍに希釈し、次に０．５χ
５ｃｍへパリ・ンーアガロース力ラムに適用した（ベセ
スダリサーチラボラトリーズ、ライフテクロノジーズイ
ンコーボレーテッド）。ＤＥＡＥフラクションを更に精
製し、ヘパリン−アガロース上で抗凝固活性を第３図に
示す。このカラムは緩衝液Ａで充分に洗浄し、次に線形
の塩勾配で？ｆＩＭした。７５分間にわたる勾配はＩｐ
ＯＸの緩衝液Ａから１００％の緩衝液Ｂの範囲であった
（緩衝液Ａ　＋　ＩＭ　Ｎ　ａＣｌ）−流速は１ｍｌ／
分であった。ある応用に於て、抗ＦＸａ活性を牛ＦＸａ
−アフィーゲル−１５のカラム上で蛋白質を分画するこ
とによって１ｏｌ収した。（第４図）、抗凝固活性を有
する粗製抽出物又はクロマトグラフィーフラクションを
０．１１ツイーン−２０に調整し、牛ＦＸａ−７フイー
ゲルー１５の２１ベツド容量を有するカラム上でアフィ
ニティークロマトグラフィーによて分画１ノた。カラム
を０．１χのツイーン−２０を含有する０、０５Ｍ　Ｈ
ＥＰＥＳ、　Ｏ，ＩＭ　ＮａＣ１、ｐＨ７，５中で充分
に洗浄し、そして蛋白質を０．１Ｍベンスフ　ミＦ　；
含有ス；Ｓ０．０５Ｍ　ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ、０．１１ツ
イーン−２０、ｌ］Ｈ７，５で溶離した。凝固及びアミ
ド分解検定を集めたフラクションの１１５００希釈上で
実施した。カラムを４１χ時の流速で溶離した。抗凝固
剤及びアミド分解活性の最終フラクションを２゜Ｉ　ｘ
　３０ｍｍアクアボール（Ａｑｕａｐｏｒｅ）　ＲＰ−
３００、Ｃ−１８逆相方ラム上で、アプライドバイオシ
ステムモデル＋３０蛋白／ペプチド分離系で実施した。

蛋白質をアセトニトリルの線形勾配で溶離し、線形勾配
は１００％の緩衝液Ａ（Ｈ，２０中に０．１’！のトリ
フルオロ酢酸）〜１００％の緩衝ｊ１Ｂ（０，０７χの
トリフルオロ酢酸／７０１アセトニトリル／　２９．９
３１Ｈ２ｏ　）迄の範即をなし、４０分間にわたって行
なった。蛋白質を含有しているフラクション（第５図参
照）をサバン）　（Ｓａｖａｎｔ）スピードｖａｃａｆ
ｍ上で一夜乾燥した。試料をＯ，Ｉ！トリフルオロ酢酸
／Ｈ２０中で再溶解し、種々のアリコートをＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動、ガス相ミクロ配列決定、
アミノ酸分析、そして抗凝固及びアミド分解活性につい
て分析した。

分析用ポリアクリルアミドゲル電気泳動３ｚのスタッキ
ングゲルを含有しているアクリルアミド２０χ及び　＋
２１のポリアクリルアミドゲル（８ｘ８ｃｓ及びｌ　ｍ
　ｍ　Ｉ’ｄみ）をマイティースモール電気泳動ユニッ
ト（ホエファーサイエンティフィックカンパニー〉中に
着き、そして一定電流１０ｍＡ／ゲルニカけた。ゲルは
０．２５Ｍ　）リス−ＨＣｌ、ｐ）１９．０及び０．１
χナトリウムＦデシルサルフエー）（ＳＤＳ）を含有し
ていた。電気泳動を２５１１１Ｍ　）リス−ＨＣｌ、０
．２Ｍグリシン、Ｏ，ＩＸＳ　Ｄ　Ｓ　、　ｐＨ８，４
中で実施シタ。

乾燥試料を３５７１１のｌＯｍＭ）リス−ＭＣＩ、ｐＨ
６，訳ｌＸＳ　Ｄ　Ｓ、２０［塘、ＩｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　
Ａ、６Ｍ尿素、ＩＸ（１）２−メルカブトエタ、′−ル
及び０．０３Ｘのブロモフェノールブルー中に電気泳動
に先立って可溶化し、試料を６５℃で１５分間加熱した
。ゲルを固定し、そして蛋白質をメリル等、Ａｎａｌ、
　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０５．３６１（＋９８１）の銀
ステイン（ｓｉｌｖｅｒ　５ｔａｉｎ）手用向によって
検出した。蛋白質の醸掛けの分子量を、標準蛋白質の電
気泳動移動度に対する分子量の対数の標準プロットから
外挿することによって測定した。

蛋白質標準物はホスホリラーゼＢ　（９４，０００）　
、牛血清アルブミン（６７，０ｏＯ）、オハルブミン（
４３，０００）、カルボニックアンバイトラーゼ（３０
，０００）、α−キモトリプシノーゲン（２５，Ｔｏｏ
）　、大豆トリプシンインヒビター（２０，０００）　
、β−ラクトグロブリン（１８，４００）　、α−ラク
トアルアミン（１４，４００）、リゾチーム（１４，３
００）　、牛トリプシンインヒビター（６，２００）　
、及びインシュリン（３，０００）であった。

配列分析 自動化されたエドマン（［：ｄｍａｎ）の減成をモデル
４７０Ａｉ白質−ペブチト　シーケンサ−（アプライド
バイオシステムズインコーボレーテツド）で、製造業者
によって供給された試薬、インストラクション、及び標
準プログラムで実施した。フェニルチオヒダントイン誘
導化アミノ酸を各サイクルでモデル＋２０Ｐ　Ｔ　Ｈア
ナライザー（アブライドバイオシステムズインコーボレ
ーテッド）上で４７ＯＡガス相シーケンサ−と直接オン
ラインで分析した。

アミノ酸分析 加水分解管として使用したオートサンプラーミクロバイ
アル（ヒユーレットパラカード）をメタノール中で＃ｊ
ｉ音波処理し次に５００℃で４時間加熱した。ペプチド
をガス相加水分解でビコターグワークステーション（ウ
ォータースアソシエーツ）中で１０５℃２０時閏、数μ
ｍの液化フェノール（ＭＣＢ）を含有している２００７
１１の一定沸騰ＨＣＩ（ピアースケミカルカンパニー）
でカス相加水分解で加水。

分解した。加水分解試料をスピードＶａＣ濃縮機（サバ
ント＝ｓａｖａｎｔ）中で乾１６１シ、小容量（典型的
には１５〜３０μｍ）の０．ＩＮＨＣｌ中に溶解し、そ
してモデルｌ０９０ＨＰ　Ｌ　Ｃ（ヒユーレットバラカ
ード）のオウトサンプラー中に入れた。高感度コンフィ
ギユレーション（蛍光検出）に於てヒユーレットバラカ
ードでアミノクワット分析機を用いてアミノ酸分析を実
施した。アミノ酸を最初０−フタルアルデヒｉ’（ＯＰ
Ａ）で第１のアミノ酸について、そして次に９−フルオ
レニルメチルクロロホルメート（ＦＭＯＣ）で第２のア
ミノ酸についてプレカラム誘導化をした後に測定した。

誘導化アミノ酸を逆相ＨＰＬＣによって分離し、カラム
、試薬及びインストラクションは製造業者によって供給
されたものを使用した。このシステムは正確に１〜５０
０ｐモルの７ミノアシルマスを定量する。

第１図はハエメンテリア　ギリアニの粗製唾液腺抽出物
中の抗ＦＸａ活性を示す。活性な精は人（挿入されてい
るグラフを参照）及び牛ＦＸａの両方を抑制するが、人
及び牛のトロンビンを抑制しない（データーをここで示
す）。

第２図はＤＥＡＥｋの陰イオン交換による４Ｂの可溶性
蛋白質抽出物のクロマトグラフィーを示す。抗凝固及び
ＦＸａ抑制活性はフラクション３０〜３５０間の０．１
〜０．１（３Ｍ　Ｎ　ａＣ！　（パネルＡ）の間で一緒
に溶離される。抗ＦＸａ活性を有しないフィブリノーゲ
ン分解活性は、フラクション３７〜４４の間（ハツチン
グした区域）で０．２０ＭＮ　ａＣＩ　（パネルＢ）よ
り上で溶離する。この物質は凝固物（フィブリン）溶解
を促進し、１２５■標識フイブリノーゲンを減成させ（
第２図、パネルＢ）そしてＳ［）Ｓ−ＰＡＧＥ　（図示
なし）により精製したフィブリノーゲンのα、β及びγ
鎖を分解することが示された。このフラクションのフィ
ブリ（フープ）ン分解性作用はヘメチンによるものであ
る。

更に抗ＦＸａ活性を有するフラクションはフィブＪ（フ
ープ）ン分解性活性を示さなかった。第１図及び第２図
の結果に基づいて、０．１〜Ｏ，１６Ｍ　ＮａＣ１の間
で溶離する抑制剤は、ヒルド　メディシナリス（Ｈｉｒ
ｕｄｏ　ｗ＋ｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）のヒルデイン（ジ
エ、ドツト等、８ｉｏ１．　ＣｈｅＩｌｌ、　Ｈｏｐｐ
ｅ−５ｅｙｌｅｒ　３６６．３７９−３８５（＋９８５
））又はヘメチン、即ちハエメンテリア　ギリアニのフ
ィブリ（フープ）ン分解性成分（ニス、エム、マリンコ
ニコ等１，１．　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、　１
０３．４４−５８（１９８４））によるものではない。

第２図に示されるように２５μｍのピーク活性を有する
フラクションは１６秒だけプロトロンビン時間を長くし
、そしてアミド分解検定に於て１７ｎｇのＦＸａを完全
に抑制した。ＤＥＡＥフラクション抽出物の検定に基づ
いて、ＦＸａ抑制活性は主要な抗凝固活性の理由となっ
ている。

ＤＥＡＥカラムからの抗ＦＸａ活性を有する抗凝固フラ
クションをプールし、次にヘパリン−７ガロースクロマ
トグラフイーによって分画した（第３図）。抗凝固剤、
及び抗ＦＸａアミド分解活性は、０．４５〜０．５５Ｍ
　Ｎ　ａＣｌの間で一緒に溶離した。更にピーク抗凝固
活性を示す２５μｍのフラクションは２１７秒だけプロ
トロンビン時間を長くし、そして＋６ｎｇの精製ＦＸａ
によって色素発生性の基質の加水分解を完全に抑制した
。

ＦＸａ−アフィーゲル−１５ｈのアフィニティークロマ
トグラフィーによる抗凝固／抗ＦＸａ活性の分画を第４
図に示す。示されるように抗凝固及び抗ＦＸａ活性をカ
ラムからＯ，１Ｍベンズアミジン、即ち逆転可能な活性
位置のセリンプロテアーゼ阻害剤と共に溶離した。

更に、阻害剤のミクロボア逆相ＨＰＬＣによる分画を第
５図に示す。ここに見られるように、４つの小さな、そ
して２つの主要なピークが解像され、抗凝固活性は複数
のピークにわたって分配された。再分画によって６つの
区別されるピークが生し、Ｐｏ−Ｐｓ（挿入されている
部分を参照）、勿論、Ｐ４及びＰｓは主要な抗凝固及び
抗ＦＸａ活性を示し、Ｐ、〜Ｐ３は中程度のより少ない
活性を示した。Ｐｏでは活性は検出されなかった。

フラクションＰ。〜Ｐ、の５ＤＳ−ＰＡＧＥ（２０Ｘア
クリルアミド）は、これらの蛋白質が見掛は分子量〜１
８．０００　（図示なし）を有する類似の移動度を有す
ることを確認した。第６図はミクロボア逆相ＨＰＬＣ上
でのＰｓのクロマトグラフィープロフィ。

−ルを示す。挿入部分はＰｓの１２％５ＤＳ−ＰＡＧＥ
（１２１アクリルアミド）を示す。この純粋な成分は見
掛は分子量１８，０００を有した。即ち精製したＦＸａ
抑制剤の見掛は分子量は１２１と２０Ｘの濃度の間のポ
リアク＋フルアミドゲル濃度で有意義に変ることはなく
、非常にグリコジル化されてはいないことを示唆する。

第７図はＰｓによる投与機に依存するＦＸａ抑制を示す
。鰻大限の半分の抑制を与えるＰｓの濃度は６０ピコモ
ルであう。

表■はフラクションＰ。〜Ｐ５の７ミノ＃組成を示す、
Ｐ、〜Ｐ５のアミノ酸含有量は多くの夕％基に関して非
常に類似しているｂｌ、例外としてＰ４及びＰｓはわず
かに高いＡｓｘ及びＧｌｘを示し、かなり高いＬｙｓ及
びＰｒｏを示す。ｐ、は有意義にＡｓｘ、ＧＩＸ、　Ｔ
ｈｒ、Ａｒｙ、、　Ｖａｌ、Ｍｅｔ、　ｌ　Ｉｅ、　Ｌ
ｙｓ９．　Ｕ　Ｐｒｏの含有量に於て、Ｐ、〜Ｐ５と異
なる。Ｐｌ、Ｐ２及びＰ、の減少した活性はおそら＜　
Ｌｙｓ及びＰｒｏの有意義に減少した含有量に関連して
いる。練成の全体的な類似性はＬｙｓ及びＰｌの例外は
あるが、Ｐ１〜Ｐ５が配列的に関係した蛋白質であるこ
とを示唆している。

図面の解説 第１図 ハエメンテリア　ギリアニの粗製唾液腺抽出物によるＦ
Ｘａの抑制。およそ１１８ｇの唾液腺抽出物（可溶蛋白
）を＋６ｎｇの精製ＦＸａに加えた。試料を１０分間、
室温で培養し、そしてアミド分解活性をメトキシカルボ
ニル−〇−シクロへキシルグリシル−グリシル・アルキ
ニン−ｐ−ニトロアニリドアセテートの添加の後に測定
した。１】−ニトロアニリド形成を１分間隔で４０５ｎ
ｍに於いて強くして分光光度計でモニターした。トップ
カーフコ牛ＦＸａ及び色素発生性基質。下のカーブ：牛
ＦＸａ、唾液腺抽出物及び色素発生性基質。挿入：（ト
ップカーブ）人ＦＸａ及び色素発生性基質、（下のカー
ブ）人ＦＸａ、唾液線抽出物及び色素発生性基質。Ｈ。

ギリアニの唾液線抽出物は、牛及び人トロンビンによる
Ｈ−Ｄ−ヘキサヒドロチロシル−し−アラニル−し−ア
ルギニン−ｐ−ニトロアニリドアセテートの加水分解を
抑制しなかったく図示なし）。

第２図 ０．４６Ｘ　７．５ｃ＋ａ　Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅイオン交換
カラムヒての粗製唾液腺抽出物（４ｍｇ可溶性蛋白Ｍ）
の分画。

蛋白質を２０ｍＭ　ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　、　ｐＨ７，８
中のＮａＣｌの線形勾配で溶離したく詳細は方法を参照
）。流速はＩ＋＋ｌ／分で１１フラクシヨンを集めた。

パネルＡ：抗凝固活性（オーブンサークル）をプロトロ
ンビン時間の長期化として一段階凝血検定によって測定
した。ＦＸａの抑制は色素発生基質メトキシカルボニル
−〇−シクロヘキシルグリシルーグリシル−アルギニン
−ｐ−ニトロアニリドアセテートを用いてｐ−ニトロア
ニリド形成（オーブンスフウェア）の抑制に対し、４０
５ｎｍで測定した。パネルＢ：このパネルは２８０ｎｎ
＋の吸収によりモニターしたＨ。

ギリアニ蛋白溶離プロフィールを示す。フィブリノーゲ
ン分解活性を交差したハツチングの区域で示す。この活
性は抗ＦＸａ又は主要な抗凝固活性と共に一緒に溶離し
ない。

第３図 ヘパリンアカロースクロマトグラフィーによる部分的に
精製したＦＸａインヒビターの分画。

緒に溶離する抗凝固剤及び抗ＦＸａ活性を有するｔ）Ｅ
ＡＥフラクションを集め、０．５Ｘ　Ｓｃｍカラムのヘ
パリン７カロース上に装填した。蛋白質を２０ｍＭＨＥ
ＰＥＳ、ｐｉ（７，８中のＩＭまでのＮａＣ１の線形勾
配で溶離した。流速は１１／分で１１フラクシヨンを集
めた。抗凝固活性（オーブンサークル）は、プロトロン
ビン時閉の長萌化として一段階凝血検定によって測定し
た。ＦＸａの抑制は色素発生性基質のメトキシ−０−シ
クロへキシルグリシル−グリシル−アルキニン−ｐ−ニ
トロアニリドアセテートを用いてｐ−ニトロアニリド生
成の抑制につき（オーブンスフウェア）　４０５ｎｍで
測定した。

第４図 牛ＦＸａ−アフィーゲルー１５上でのアフィニティーク
ロマトグラフィーによるＦＸａ抑制剤の分画。

蛋白質を０．１ＭベンズアミジンでカラムからｍＲした
。流速は４１７時で１．２１のフラクションを集めた。

　ｌ１５００希釈の色素発生性フラクションを抗凝固（
オーブンサークル）及び抗ＦＸａ（塗り潰したサークル
）の活性につき上記の様に検定した。

第５図 逆相ＨＰＬＣによるハエメンテリア　ギリアニ抗ＦＸａ
精の精製、−緒に溶離される抗凝固及び抗ＦＸａ活性を
有するピークフラクションを２．１×３０１１ＩＩ１１
アクアボールＲＰ−３００カラム上でマイクロポア逆相
ＨＰ　Ｌ　Ｃによって分画した。影を付けた区域はピー
クフラクションにわたって分配されている抗凝固活性を
示す。挿入された部分は、同じカラム上での最初の逆相
分なの再クロマトグラフィーを示す、再クロマトグラフ
ィーによって別々のオーバーラツプのないピークが得ら
れた。主要なＦＸａ抑制活性は、Ｐ４とＰ５に見出され
（Ｉい陰影の部分）、活性はまたＰｌ、　Ｐ２及びＰ３
にも検出された（薄い陰影の部分）　、　Ｐｏには活性
が検出されなかった（陰影なし）。

第６図 Ｐ５のマイクロポア逆相ＨＰＬＣ，ハエメンテリア　キ
リアニ蛋白買Ｐ５に対して吸光度を２１４ｎｍでモニタ
ーした。挿入部分Ｃえマイクロポア逆相１（ＰＬＣによ
って単離されたＰ５のＳＤＳ　　ＰＡＧＥ　（１２％ア
クリルアミド）を示す。ａのレーンは分子量標準蛋白質
そして１）のレーンは精製されたＰ５を示す。メリル等
の方法に従って銀ステインによって蛋白質を検出した。

第７図 精製したＰ５による投与量に依存したＦＸａの抑制（０
，１５ｎｇ）をメトキシカルボニル−Ｄ−シクロヘキシ
ルグリシル−グリシル−アルギニン−ｐ−ニトロアニリ
ドアセテートの加水分解を抑制するその能力について示
された濃度に於いて試験した。ｐ−ニトロアニリド生成
を４０５ｎｎ＋でモニターした。

蛋白質モル当たりの残基で表現。値は６残基１モルのＡ
ｌａ含有量に対し正規化された。

【図面の簡単な説明】

第１図はハエメンテリアギリアニの粗製唾液腺抽出物中
の抗ＦＸａ活性を示すグラフである。 第２図はＤＥＡＥ上の陰イオン交換による４ｍｇの可溶
性蛋白質抽出物のクロマトグラフィーを示すグラフであ
る。 第３図はＤＥＡＥカラムからの抗ＦＸａ活性を有する抗
凝固フラクションをプールし、次にヘパリン−７カロー
スクロマトグラフイーによって分画したときのグラフで
ある。 第４図はＦＸａ−アフィーゲル−１５ｈの７フイニテイ
ークロマトグラフイーによる抗凝固／抗ＦＸａ活性の分
画を示すグラフである。 第５図は阻害剤のミクロボア逆相１−！ＰＬＣによる分
画を示すグラフである。 第６図はミクロボア逆相Ｈ’ＰＬＣヒでのＰ６のクロマ
トグラフィープロフィールを示ｆグラフである。 第７図はＰ５による投与量に依存するＦＫａ抑制を示す
グラフである。 ７ラクシーン ６自Ｉツへ（−ジトフ ７６Ｃ）　ｌ−ｏ　ｙ　？＝ｙ時ｍＦ＞ｔ’ｔｈ。 （紗ン ｏＸ乞／！す９ｍ句 ７）トロ〉ヒ゛’＞　ａ’４間の増力Ω（卿） ロ、β−先１べｔ ４０９物ｉ 喰見な λ１＋消雇 ７″′細ンビンａ９Ｊ）ｎ檜如（ｉｆ）咳梵４ ＋Ｑ５Φ情 （方式）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）陰イオン交換樹脂上、増加する塩勾配に、蛭
   ハエメンテリアギリアニ（￥Ｈａｅｍｅｎｔｅｒｉａｇ
   ｈｉｌｉａｎｉｉ￥）の唾液をかけ、そしてファクター
   Ｘａ抑制活性を有する溶離物の部分を分離し、 （ｂ）（ａ）部からの単離したフラクシヨンをヘパリン
   、ファクターＸａ又はヘパリンとファクターＸａの両方
   に基づいたアフィニティークロマトグラフィーにかけ、
   抗凝固及びアミド分解活性を有する部分を分離し、 （ｃ）（ｂ）部から単離した単離物を逆相の液体高圧ク
   ロマトグラフィーにかけ、そしてファクターＸａ抑制活
   性を有する溶離物の部分を分離することからなる、 蛭ハエメンテリアギリアニの唾液からファクターＸａ抑
   制活性を有する蛋白質性の物質を単離する方法。 ２、陰イオン交換樹脂がＤＥＡＥ−セルロースである特
   許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、ＨＰＬＣ樹脂がＮ−コハク酸イミド含有樹脂である
   特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ４、特許請求の範囲第１〜３項に記載の方法によって単
   離された、蛭ハエメンテリアギリアニの唾液からのファ
   クターＸａ抑制活性を有する蛋白質物質。 ５、６０ｐＭの濃度に於てファクターＸａを最大の半分
   抑制する能力を有すること、そして１５，０００〜２０
   ，０００ダルトンの分子量を有することによって特徴付
   けられる蛭ハエメンテリアギリアニの唾液から単離され
   た蛋白質性の物質である本質的に純粋なファクターＸａ
   抑制物質。 ６、ファクターＸａ含有媒体をファクターＸａを抑制す
   るのに有効な特許請求の範囲第４項に記載のファクター
   Ｘａ抑制活性を有する蛋白質性の物質のある量と接触さ
   せることからなるファクターＸａを抑制する方法。 ７、製薬上受入れられる担体と共に特許請求の範囲第４
   項に記載のファクターＸａ抑制活性を有する蛋白質性の
   物質の抗凝固有効量を投与することからなる必要とする
   患者の血液凝固を減少する方法。