HU181539B

HU181539B - Reagent for the determination of lipase and process for the production thereof

Info

Publication number: HU181539B
Application number: HU80249A
Authority: HU
Inventors: Ulrich Neumann; Karl-Wolfgang Knitsch; Joachim Ziegenhorn; Albert Roeder; Werner Zwez; Werner Kraemer
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1979-02-05
Filing date: 1980-02-04
Publication date: 1983-10-28
Also published as: IE49039B1; DK158526C; EP0014252A1; FI69640B; DK158526B; ATE2227T1; US4343897A; ES487676A1; IE800020L; AU515131B2; IL59132A0; IL59132A; DK1380A; CA1139201A; ZA80630B; AU5512580A; AR219647A1; FI69640C; DD148830A5; JPS5728275B2

Description

A hasnyálmirigy diagnosztikája szempontjából az amiláz (E. C. 3.2.1.1) és lipáz (E. C. 3.1.1.3) enzimek meghatározása 5 nagy jelentőséggel rendelkezik. Akut pankreatitis esetén néhány órán belül olykor nagyon megemelkedik mindkét szérum szintje a szérumban. Ép vesefunkció esetén azonban az amiláz kis molekulasúlya miatt gyorsabban választódik ki ismét, míg a lipáz aktivitása hosszabb ideig nagyobb marad 10 a szérumban. A pankreatitis biztos diagnózisa mindkét enzim együttes meghatározásával kapható.

A lipáz elsődlegesen egy triglicerid, főleg hosszú szénláncú zsírsavakkal észteresített triglicerid, α-észterkötését hasítja diglicerid és szabad zsírsav keletkezése közben. A monogliceriddé történő további átalakítás lényegesen lassabban megy végbe.

Míg az enzimek által katalizált szokásos reakciók a vizes fázisban mennek végbe, a lipáz csak az olajcsepp/víz határfelületen hat. Ebben különbözik az észterázoktól, amelyek a vizes fázisban reagálnak. A kémiai paraméterek mellett ezért a kinetikát nagymértékben befolyásolja a szubsztrát felületének minősége.

Titrimetriás lipázmeghatározási módszerek ismertek. Ezek azonban a részben nehézkes kivitelezhetőség, a hosszú reakcióidő és a nagy mintaszükséglet miatt csak korlátozott mértékben kerülhetnek bevezetésre a klinikai — kémiai rutinlaboratóriumban.

A titrimetriás meghatározási módszerek lényeges hátrányait, nevezetesen a nagy mintaszükségletet és a hosszú inkubálási időt a turbidimetriás módszereknél elkerüljük, amelyeknél triglicerid/víz emulzió zavarosodását méljük fotometriásan. A turbidimetriás meghatározás esetében lényeges probléma viszont az állandóan közelítőleg azonos cseppnagyságú emulzió készítése. Ez különös jelentőségű, mivel a reakció kinetikáját a triglicerid cseppecskék nagysága erősen befolyásolja. A 19 61 983 sz. német szövetségi köztársaságbeli közzétételi iratból már ismeretes egy olívaolajos szárazemulzió, amely a lipázaktivitás titrimetriás meghatározására megfelelő. Ennél a szárazemulziónál azonban a trigliceridtartalom a zavarosodás fotometriás meghatározására a nagy fényabszorpció miatt nem megfelelő. A reagens azon célból történő meghígítása esetén, hogy ezt is alkalmassá tegyük a turbidimetriás kinetikus lipázmeghatározásra, a paraméte15 rek annyira eltolódnak, hogy többé már nem nulladrendű reakciót kapunk.

A találmány feladata ezért az, hogy a lipáz főleg turbidimetriás illetve nefelometriás aktivitás meghatározására olyan alkalmas reagenst biztosítson, amely száraz formájú, 20 és vízzel való egyszerű elegyítéssel reprodukálhatóan azonos cseppnagyságú emulzióvá alakítható. A találmány egy további célja, ezenkívül egy olyan reagens biztosítása, amely a rekonstituált emulzió cseppnagyságát a szárazreagens kvantitatív összetételével szabályozza, és messzemenően füg25 getlen a száraz reagens előállítására használt trigliceridemulziótól. Ezáltal elkerülhető, hogy a triglicerid-emulziót a felhasználónak magának kelljen elkészíteni közvetlenül a vizsgálat elvégzése előtt. Mivel a szubsztrátfelület minősége nagymértékben meghatározza az enzim aktivitását [Clin. 30 Chem. 23,522—53 (1977)], kielégítő eredményekhez mindig

-1181539 azonosan maradó szubsztrátfelület — a cseppnagyság tekintetében is—szükséges. Az emulzió minősége mindig nagyon erősen függ a készítés technikájától, és mivel természetszerűleg a kivitelezésnél bizonyos előírások betartása más — más személyeknél nem azonos, így a mért aktivitási értékekben jelentős különbségek lépnek fel. Ezt a nehézséget is el kell kerülni a találmánnyal.

Ezt a feladatot különösen a lipáz turbidimetriás meghatározására alkalmas rekonstituálható szárazreagenssel oldottuk meg, amely víz hozzáadásakor szubsztrátolajat, védőkolloidot, emulgeátort és aktivátort tartalmazó emulziót képez, amelyre az jellemző, hogy

0,2—10 súly% folyékony, 14—22 szénatomos zsírsavcsoportokat és 1—8 szén-szén kettős kötést tartalmazó trigliceridet,

20—90 súly% védőkolloidot,

5—60 súly% epesav-alkálifém-sót, 0,001—0,1 súly% kolipázt, 5—20 súly% karbamidot,

3—50 súly% 6,0—10,5 pH-hoz alkalmas pufferanyagot és 0,5—5 súly% alkálifém- vagy alkáliföldfémsó aktivátort és adott esetben

0,1—2,0 súly% tartósítószert tartalmaz.

Meglepődve tapasztaltuk, hogy egy találmány szerinti összetételű szárazreagensnél állandóan maradó kvantitatív összetétel esetén a rekonstruált emulzió megbízhatóan állandóan azonos cseppnagyságát érjük el, és azonkívül a szubsztrátfelület minőségét is reprodukálhatóan úgy állítjuk be, hogy mindig nagy reakciósebességet és nulladrendű reakciólefutást érünk el, ami előfeltétele egy gyakorlatban jól kivitelezhető turbidimetriás, kinetikus aktivitásmeghatározásnak.

A kvantitatív összetételnek a fentebb a reagens egyes alkotórészeire megadott változtatási lehetőség keretein belül való változtatásával az elkészítéstől függetlenül a rekonstruált emulzió meghatározott cseppnagysága állítható be. Mivel a trigliceridtartalomtól függ a reagensadalék kezdeti extinkdója, rendszerint egy bizonyos kívánt trigliceridkoncentrációból kell kiindulni, és a szokásos alkotórészek mennyiségeit azután az elérni kívánt cseppnagyságra való tekintettel a mindenkori adottságokhoz igazíthatjuk.

Trigliceridként mind természetes, mind szintetikus trigliceridek megfelelők, amelyek 14 és 22 közötti szénatomszámú zsírsavak észterei. A hosszúszénláncú telítetlen zsírsavakat tartalmazó trigliceridek bizonyultak előnyösnek, különösen az olyan trigliceridek, amelyekben 14—20 szénatomos és

1—8, előnyösen 1—3 szén—szén kettőskötést tartalmazó zsírsavak vannak. Könnyű hozzáférhetősége miatt a trióiéin különösen előnyös, olívaolaj is nagyon jól megfelel. Az előnyös triglicerid mennyiség 0,2-2,0 súly%.

Védőkolloidként a vegyészek által az ilyen célra ismert anyagok jönnek számításba, így polihidroxi-vegyületek, szérumalbumin, polivinilpirrolidon, szilárd polietilén-oxidok és hasonlók. Előnyösek a polihidroxi-vegyületek, különösen a molekulánként 1—10 pentóz- illetve hexóz-egységet tartalmazó monomer vagy polimer pentóz- vagy hexóz-származékok és/vagy a szobahőmérsékleten szilárd polietilénglikol. Alkalmas polihidroxi-vegyületekre előnyös példa mamiit és hasonló cukoralkoholok, a glükóz, mannóz, maltoheptaóz oligoszacharidjai, 3500 és 7000 közötti átlagos molekulasúlyú polietilénglikol és egyebek. Egyéb használható védőkolloidok például aminosavak, igy alanin, növényi gumik, igy gumiarábikum stb. A védőkolloid, illetve védőkolloid elegyének előnyős mennyisége 50—70 súly%. Különösen megfelelőnek bizonyult cukoralkohol és polialkilénglikol elegye.

Epesavként az ismert felületaktív epesavak, így kólsav, taurokólsav, dezoxikólsav, taurodezoxikólsav, glikodezoxikólsav, illetve ezek alkálifémsói, különösen a nátriumsók jönnek számításba. Az előnyös mennyiség 10—15 súly%.

A találmány szerinti reagens egy további lényeges alkotórésze a kolipáz, ez egy kisebb molakulasúlyú protein, amely , epesavsó jelenlétében aktiválja a lipázt (Biochem. et. Biophys. Acta, 271., 400—421., 1972. és Eur. J. Biochem., 58., í 555—559., 1975.). Az előnyös mennyiségű,003—0,01 súly%.

Tartósítószerként a találmány keretén belül olyanokat * alkalmazunk, amelyek a meghatározandó lipáz enzimaktivitását nem befolyásolják. Különösen megfelelőek az alkálifém-azidok, főleg a nátrium-azid. Más tartósítószerek, így például tioazid és egyéb kéntartalmú tartósítószerek is éppen megfelelnek. A tartósítószer előnyös mennyisége 0,2— 0,7 súly%.

A találmány szerinti reagens továbbá karbamidot is tartalmaz, előnyösen 10—15 súly%-nyi mennyiségben.

Pufferanyagként minden olyan ismert puffer megfelel, amely a találmány szerinti reagens keretein belül 6,0 és 10,5 közötti pH-érték tartására képes. Az előnyös pH-tartomány

8,3 és 9,5 közötti. Alkalmas pufferok például: dietanol-amin-puffer, trietanol-amin-puffer, TRIS-puffer és Good-pufferok, [lásd Biochemistry, 5., (1966) 467. oldaltól], igy HEPESpuffer (jól megfelel a liofilizálás előtt való hozzáadás céljára), TAPS-puffer és bicin [(HOCH₂CH₂)= ‘ NHCH₂COO ]. Különösen előnyös a TRIS-puffer. Az előnyös puffermenynyiség 3—10 súly% közötti. További aktivátor a kalciumion. Minthogy a kalciumionok dezoxikólsawal oldhatatlan csapadékká alakulnák, kalcium jelenlétében epesavként a taurodezoxikólsav az előnyös, mert ez magasabb — 1— 5 mmól tartományba eső — kalcium-koncentrációt tesz lehetővé.

Az említett lényeges alkotórészeken kívül a találmány szerinti reagens meghatározott célokra még inért adalékanyagokat (töltőanyagokat) is tartalmazhat, amelyek a kezelést megkönnyítik.

Végül a találmány szerinti reagens aktivátort is tartalmaz a lipáz részére. Lipázaktivátorok ismertek. Előnyösek a kloridok, különösen nátrium-klorid, de más alkálifém- vagy alkáli foldfém-kloridok is alkalmazhatók, amennyiben nem képeznek oldhatatlan vegyületeket a találmány szerinti reagens vagy a minta más összetevőivel. Magnéziumionok is aktiválólag hatnak.

A találmány szerinti reagens egyes alkotórészeinek a hatásmódja a találmány keretein belül nem minden tekintetben világos. Feltételezzük azonban, hogy a kolipáz az enzimnek a nagy epesavtartalomra, különösen a dezoxikolátra, taurodezoxikolátra vagy glikodezoxikolátra gyakorolt hatását fokozza, és javítja a reakciólefutás linearitását. Úgy tűnik, hogy a karbamid az emulzió víz/lipid határfelületére befolyással van, és ezt stabilizálja.

A találmány szerinti szárazreagenst az alkotórészek szokásos módszerekkel előállított emulziójának liofilizálásával készítjük. A pufferanyagot, karbamidot és adott esetben a védőkolloid és a tartósítószer valamint adott esetben az aktivátor egy részét is előnyösen csak a „szárazemulzió” liofilizálása után adjuk hozzá. A liofilizálásnak alávetendő emulzió a szokásos módszerekkel állítható elő, például az összes alkotórészek a vizes oldószerhez való hozzáadásával, szokásos módszerekkel, így ultrahanggal, kolloidmalommal és hasonlókkal történő emulgeálásával, és végül körülbelül —40 ’C-on végzett fagyasztásával, & vákuumban a szokásos körülmények között, tehát körülbelül 10 ⁴—10 ⁴ torr nyomáson történő szárításával.

-2181539

A liofilizálásnál az epesav-sót, kolipázt, legalább 20 súly% védőkolloidot, a tartósítószer legalább egy részét és adott esetben az aktivátort hozzá kell adni az elegyhez. A liofilizálásra kerülő vizes emulzió készítésének egy előnyös eljárása az, hogy az említett alkotórészeket, a triglicerid kivételével, 5 feloldjuk vízben, és utána keverés közben vékony sugárban befecskendezzük az oldatba a triglicerid valamilyen illékony szerves oldószerrel készült oldatát. Illékony szerves oldószerként különösen 1—4 szénatomos alifás alkoholok és ketonok megfelelők. 10

A találmány szerinti reagens fennmaradó alkotórészeit, nevezetesen a pufferanyagot, karbamidot és adott esetben további védőkolloidot, tartósítószert és aktivátort a liofilizátumhoz közvetlenül elkészítése után vagy csak később adjuk hozzá. 15

Mint már említettük, meglepően azt találtuk, hogy a találmány szerinti reagens a rekonstitúció után olyan extinkciót vagy olyan időegységenkénti extinkcióváltozást eredményez, amely messzemenően független a kiindulási emulzió extinkciójától és a reagens elkészítésétől. Ezenkívül a rekonstruált 20 emulzió extinkciós állandója meglepően jó.

Az epesavsókat előnyösen megtisztítjuk a szennyezésektől, így bomlástermékektől és hasonlóktól, például n-butanollal lúgos körülmények között végzett extrakcióval, alkohol/aceton elegyből végzett átkristályosítással és hasonló 25 tisztítási módszerekkel.

A találmány szerinti reagens ezen meglepő tulajdonságát a liofilizálás előtti és utáni cseppnagyság-eloszlás meghatározásával vizsgáltuk egy Coulter-részecskeszámláíó segítségével. Ezzel a készülékkel meg lehet határozni a 480— 30 16000 nm átmérőjű részecskék százalékos eloszlását 100— 1000 nm tartományban. Azt találtuk, hogy a cseppnagyság a liofilizálás előtt tételről tételre nagyon erősen ingadozott, a liofilizálás és adott esetben további műveletek, így a reagens többi alkotórészeinek hozzákeverése és hasonlók után 35 viszont mindig jól egybevágó eloszlási képet kaptunk. (Termodinamikai egyensúly beállása). Az így előállított szárazemulzió továbbá azzal tűnik ki, hogy cseppeloszlása nagyon jól állandó marad termikus terhelés (3 hét/35 ’C) esetén is.

A cseppeloszlás maximumát 500—lOOOnm-nél találtuk. 40 Ezért különösen alkalmas a zavarosodás-megszűnés 340 vagy 365 nm-nél való fotometriás követésére. A trigliceridcseppecskék lebontása 340 nm-nél lényegesen kisebb részecskeméretnél már nem állapítható meg, nagyobb cseppecske viszont nem ideális szubsztrát a lipáz részére. 45

A találmány szerinti reagens lényeges előnye az, hogy mind humán pankreász-lipáznál, mind sertés pankreászlipáznál időegységenként azonos aktivitásváltozást mutat. Mivel a Rick-féle titrimetriás tesztben ez a két lipáz szintén 50 azonos aktivitáskoncentrációt mutat, kalibrálásra sertéspankreász tartalmú standard alkalmazható.

A találmány szerinti reagens további lényeges előnye, hogy nincs lag-fázis. Ismeretes, hogy turbidimetriás lipáztesztnél csak bizonyos idő múlva áll be nulladrendü reakció- 55 lefutás. Az ilyenfajta reakciólefutás viszont egy enzim aktivitáskoncentrációjának pontos meghatározásához feltétlenül szükséges (lásd H. U. Bergmeyer: Grundlagen dér enzymatischen Analyse, 1979., 10/22., 58. old.-tól). Ennek a reakciólefutásnak az eléréséig eltelő időt hívják lag-fázisnak. 60

A következő példák a mellékelt ábrákkal együtt a találmány további magyarázatául szolgálnak. Az ábrákon levő rajzok grafikus ábrázolásban mutatják az emulzió részecskenagyság-eloszlását, amelyet Coulter-részecskeszámlálóval kaptunk különböző példákban és leírt kísérletekben. 65

1. példa

0,06 g kalcium-kloridot, 22,72 g nátrium-dezoxikolátot,

25,35 g 4000-es molekulasúlyú polietilénglikolt, 1,1 g nátrium-azidot, 0,02 g kolipázt gyártja Boehringer Mannheim GmbH) és 50,8 rész mannitot feloldunk 1,0 liter desztillált vízben. A kapott oldatba keverés közben befecskendezzük 2 bar nyomással egy 1,5 mm átmérőjű fúvókán át 1,42 g trióiéin 32 ml n-propanollal készült oldatát. Az így kapott triolein-emulziót —40 ’C-on megfagyasztjuk, és liofilizálással szárítjuk.

8,95 g nátrium-dezoxikolátot, 7,85 gTRIS-t 1,20 gTRIShidrokloridot, 7,5 g 4000 molekulasúlyú polietilénglikolt, 1,97 gnátrium-kloridot, 16,2 g karbamidot és 56,9 gmannitot szárazon összekeverünk egymással. Az így kapott pufferkeverékből 2 súlyrésznyit spirálkeverővel homogén reagenssé keverünk 1 súlyrésznyi liofilizátummal.

A lipázmeghatározás kivitelezése céljából 150 mg ilyen reagenst 2,5 ml vízzel oldunk, 0,1 ml mintával elegyítjük, és fotometriásan mérjük 365 nm-nél 25 °C-on vízzel szemben. Mintaként például szérum, duodenum-nedv, vizelet és más folyadékok használhatók.

A módszer pontosságát a Rick-féle titrimetriás módszerrel való összehasonlítással ellenőriztük, 60 különböző lipázaktivitású humán-szérum vizsgálatánál a következő adatokat kaptuk:

Korreláció: (x=Rick; Y=találmány szerinti teszt)

Y=0,93 · x-20; r=0,96.

A teszt linearitása körülbelül 1300 Rick-egységig megmarad.

Egy Rick-egység= 1 pmól szabaddá vált zsírsav/ perc=lU.

2. példa

1,500 g mannitot, 0,900 g 4000 molekulasúlyú polietilénglikolt, 0,524 g nátrium-dezoxikolátot, 1,5 mg kolipázt és 8 mg nátrium-azidot feloldunk 50 ml desztillált vízben. Ebbe az oldatba keverés közben kislyukú fúvókán át befecskendezzük 150 mg trióiéin 5,1 ml propanollal készült oldatát. A kapott emulziót -40 ’C-on megfagyasztjuk, és liofilizáljuk.

3,50 g karbamidot, 3,73 g nátrium-dezoxikolátot, 0,4 g nátrium-kloridot, 0,10 g nátrium-azidot, 2 mg kalciumkarbonátot, 1,355 gTRIS-t és 0,200 g TRIS-hidrokloridot bensőségesen összekeverünk egymással. Ehhez a keverékhez hozzáadjuk a felaprított száraz liofilizátumot, és homogénné keveijük.

A teljes keverék 12,27 g, a következőket tartalmazza:

Mannit	1,500 g
Polietilén-
glikol	0,900 g	összeg=2,4 g= 19,4 súly%,
Nátrium-
-dezoxikolát	4,254 g	= 34,4súly%,
Kolipáz	1,5 mg
Nátrium-azid	9 mg
TRIS	1,355 g
TRIS-
-hidroklorid	0,200 g	összeg= 1,555= 12,6 súly%,
Karbamid	3,5 g	=28,3súly%.

mg ilyen keveréket oldunk 2,5 ml desztillált vízben,

200 μΐ mintával (szérum) elegyítjük, és 340 nm-nél és 25

-3181539 vagy 30 'C-on vízzel vagy levegővel szemben méljük fotometriásan. A percenkénti extinkciókülönbségből határozzuk meg a lipázaktivitást.

A Coulter-részecskeméret számlálóval meghatározott cseppnagyság eloszlást rekonstitúció után frissen készített állapotban és száraz állapotban 35 °C-on 3 hetes hőterhelés után az 1. ábrán láthatjuk.

3. példa

8,41 g borjú szérumalbumint, 12,2 g nátrium-dezoxikolátot, 0,02 g nátrium-azidot és 0,034 g kolipázt feloldunk 100 ml desztillált vízben. Ebbe az oldatba keverés közben nyomás alatt befecskendezzük 3,5 g trióiéin 7 ml propanollal készült oldatát. Az így létrejött emulziót - 40 ’C-on megfagyasztjuk, és liofilizáljuk.

17,4 g mannitot, 4 g szilárd polietilénglikolt, 7 g karbamidot, 7,47 g nátrium-dezoxikolátot, 0,82 g nátrium-kloridot, 02 g nátrium-azidot, 2,71 g TRIS-t és 0,4 g TRIS-hidrokloridot megőrlünk, és bensőségesen összekeverünk egymással. Ehhez hozzáadjuk a felaprított szárazemulziót, és homogénné keveijük.

mg ilyen poralakú reagenst adunk 2 ml desztillált vízhez, és az oldódás után 100 μΐ mintával (szérum) elegyítjük. A reakciót 340 (365) nm-nél (higanygőzlámpa, Hg) fotometriásan követjük.

4. példa

8,41 galanint, 1,22 g nátrium-dezoxikolátot, 0,02 g nátrium-azidot és 0,034 g kolipázt feloldunk 100 ml desztillált vízben. Keverés közben 3,5 g trióiéin 7 ml propanollal készült oldatát fecskendezzük bele nyomás alatt ebbe az oldatba. Az így létrejövő emulziót -40 ’C-on megfagyasztjuk, és liofilizáljuk.

17,4 g mannitot, 4 g szilárd polietilénglikolt, 7 g karbamidot, 7,47 g nátrium-dezoxi-kolátot, 0,82 g nátrium-kloridot, 02 g nátrium-azidot, 2,71 g TRIS-t és 0,4 g TRIS-hidrokloridot megőrlünk, és egymással bensőségesen összekeverünk. Ehhez hozzáadjuk a felaprított szárazemulziót, és homogénné keveijük.

mg ilyen poralakú reagenst adunk 2 ml desztillált vízhez, és az oldás után 100 μΐ mintával (szérum) elegyítjük. A reakciót 340 (365) nm-nél (Hg) fotometriásan követjük.

5. példa

4,205 g 4000 molekulasúlyú polietilénglikolt, 4,205 g borjú szérumalbumint, 1,22 g nátrium-dezoxikolátot, 0,02 g nátrium-azidot és 0,034 g kolipázt feloldunk 100 ml desztillált vízben. Ebbe az oldatba keverés közben nyomás alatt befecskendezzük 3,5 g trióiéin 7 ml propanollal készült oldatát. Az így keletkezett emulziót -40 ’C-on megfagyasztjuk, és liofilizáljuk.

17,4 g mannitot, 4 g molekulasúlyú polietilénglikolt, 7 g karbamidot, 7,47 g nátrium-dezoxikolátot, 0,82 g nátriumkloridot, 0,2 g nátrium-azidot, 2,71 g TRIS-t és 0,4 g TRIShidrokloridot megőrlünk, és bensőségesen összekeveijük. Ehhez hozzáadjuk a felaprított szárazemulziót, és homogénre összekeveijük.

mg ilyen poralakú reagenst adunk 2 ml desztillált vízhez, és oldódás után 100 μΐ mintával (szérum) elegyítjük. A reakciót 340 (365) nm-nél (Hg) fotometriásan követjük.

6. példa

6,73 g polietilénglikolt (Polywachs 4000), 1,68 g polivinilpirrolidont, 1,22 g nátrium-dezoxikolátot, 0,02 g nátriumazidot és 0,034 g kolipázt feloldunk 100 ml desztillált vízben. Ebbe az oldatba keverés közben nyomás alatt befecskendezzük 3,5 g trióiéin 7 ml propanollal készült oldatát. Az így létrejött emulziót -40 ’C-on megfagyasztjuk, és liofilizáljuk.

17,4 g mannitot, 4 g polietilénglikolt, 7 g karbamidot,

7,47 g nátrium-dezoxikolátot, 0,82 g nátrium-kloridot, 0,2 g nátrium-azidot, 2,71 g TRIS-t és 0,4 g TRIS-hidrokloridot megőrlünk, és bensőségesen összekeverünk. Ehhez hozzáadjuk a felaprított szárazemulziót, és homogénre keveijük.

7. példa (összehasonlítási példa; túl kevés epesavsó)

4,69 g mannitot, 4,69 g polietilénglikolt (Polywachs 4000), 0,38 g nátrium-dezoxikolátot, 0,02 g nátrium-azidot és 0,034 g kolipázt 100 ml desztillált vízben oldunk. Ebbe az oldatba keverés közben nyomás alatt befecskendezzük 3,5 g trióiéin 7 ml propanollal készült oldatát. Az így keletkezett emulziót -40 ’C-on megfagyasztjuk, és liofilizáljuk.

17,4 g mannitot, 4 g 4000 molekulasúlyú polietilénglikolt, 7 g karbamidot, 7,47 g nátrium-dezoxikolátot, 0,82 g nátrium-kloridot, 0,2 g nátrium-azidot, 2,71 g TRIS-t és 0,4 g TRIS-hidrokloridot megőrlünk, és bensőségesen összekeverünk egymással. Ehhez hozzáadjuk a felaprított szárazemulziót, és homogénre összekeveijük.

A cseppnagyság eloszlását hőterheléssel és anélkül (lásd 2. példa) a 2. ábrán láthatjuk.

8. példa (összehasonlítási példa)

3,76 g mannitot, 5,63 g 4000 molekulasúlyú polietilénglikolt, 0,19 nátrium-dezoxikolátot, 0,02 g nátrium-azidot és 0,034 g kolipázt oldunk 100 ml desztillált vízben. Ebbe az oldatba keverés közben nyomás alatt befecskendezzük 3,5 g trióiéin 7 ml propanollal készült oldatát. Az így keletkező emulziót -40 ’C-on megfagyasztjuk, és liofilizáljuk.

17,4 g mannitot, 4 g 4000 molekulasúlyú polietilénglikolt, 7 g karbamidot, 7,47 g nátrium-dezoxikolátot, 0,82 g nátrium-kloridot, 0,2 g nátrium-azidot, 2,71 g TRIS-t és 0,4 g TRIS-hidrokloridot megőrlünk, és bensőségesen összekeverünk. Ehhez hozzáadjuk a felaprított szárazemulziót, és homogénre keverjük.

A cseppnagyság eloszlását hőterheléssel és anélkül (lásd 2. példa) a 3. ábrán láthatjuk.

-4181539

9. példa

8,88 g mannitot, 0,86 g nátrium-dezoxikolátot, 0,1 g nátrium-azidot és 0,034 g kolipázt 100 ml desztillált vízben oldunk. Ebbe az oldatba keverés közben nyomás alatt befecskendezzük 2,5 g trióiéin 7 ml propanollal készített oldatát. Az így keletkező emulziót —40 °C-on megfagyasztjuk, és liofilizáljuk.

22,4 g mannitot, 4 g 4000 molekulasúlyú polietilénglikolt, 2 g karbamidot, 7,47 g nátrium-dezoxikolátot, 0,82 g nátrium-kloridot, 0,2 g nátrium-azidot, 2,71 g TRIS-t és 0,4 g TRIS-hidrokloridot megőrlünk, és bensőségesen összekeverünk egymással. Ehhez hozzáadjuk a felapritott szárazemulziót, és homogénre keveijük.

mg ilyen poralakú reagenst adunk 2 ml desztillált vízhez, és az oldódás után 100 μΐ mintával (szérum) elegyítjük. A reakciót 340 (365) nm-nél (Hg) fotometriásan követjük.

A cseppnagyság eloszlását hőterheléssel és anélkül (lásd 2. példa) a 4. ábrán láthatjuk.

10. példa

1000 ml vízben feloldjuk az alábbiakat:

g mannit, 25 g 4000 molekulasúlyú polietilénglikol, 20 g taurodezoxikolát, 55 mmól 6,8 pH-jú HEPES-puffer, 0,3 g kalcium-klorid és 9 mg kolipáz. Ehhez az oldathoz 1 g oldott trioleint fecskendezünk (keverés közben). Ebből az emulzióból 1—1 ml-t töltünk fiolákba, és liofilizáljuk.

A liofilizátumot 2,0 ml desztillált vízben oldjuk. A lipázmeghatározást 100 μΐ szérum hozzáadásával és 340 vagy 365 nm-nél történő fotometriás méréssel végezzük.

A liofilizátum 4 °C-on és 35 °C-on 3 héten át való tárolása után kétszer desztillált vízben történő feloldásakor semmilyen eltérést nem állapítottunk meg a kezdeti extinkcióban és a kísérlet lefolyásában sem.

A leírás során használt rövidítések:

HEPES = 2-[4-(2-hidroxi-etil)-piperazin-l -ilj-etánszulfonsav;

TAPS = N-trisz(hidroxi-metil)-metil-3-amino-propán-szulfonsav;

TRIS =trisz(hidroxi-metil)-amino-metán.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Szubsztrátolajat, védőkolloidot, emulgeátort és aktivátort tartalmazó rekonstituálható olyan szárazreagens lipáz turbidimetriás meghatározására, amely víz hozzáadására emulziót képez, azzal jellemezve, hogy

0,
2—10 súly% folyékony, 14—22 szénatomos zsírsavcsoportokat és 1—8 szén-szén kettős kötést tartalmazó trigliceridet,

20—90 súly% védőkolloidot, előnyösen polietilén-glikolt, polivinil-pirrolidont, aminosavakat, oligoszacharidot vagy szérumalbumint,

5—60 súly% epesav-alkálifémsót,

0,001—0,1 súly% kolipázt,

5—20 súly% karbamidot,
3—50 súly% 6,0—10,5 pH tartására szolgáló pufferanyagot, 0,5—5 súly% alkálifém- vagy alkáliföldfémsó aktivátort és adott esetben

0,1-2,0 súly% tartósítószert tartalmaz.
5 2. Az 1. igénypont szerinti reagens kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy 0,2-2,0 súly% trigliceridet tartalmaz.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti reagens kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy egy vagy több polihidroxi-vegyületet tartalmaz védőkolloidként.

10 4. A 3. igénypont szerinti reagens kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy polihidroxi-vegyületként molekulánként

1—4 pentóz-, illetve hexóz-egységből álló monomer vagy polimer pentózt vagy hexózt vagy/és valamilyen szilárd polietilénglikolt tartalmaz.

15 5. Bármelyik megelőző igénypont szerinti reagens kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy 50—70 súly% védőkolloidot tartalmaz.
6. Bármelyik megelőző igénypont szerinti reagens kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy 10—15 súly%epesavsóttartal-

20 máz.
7. Bármelyik megelőző igénypont szerinti reagens kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy 0,003—0,01 súly% kolipázt tartalmaz.
8. Bármelyik megelőző igénypont szerinti reagens kiviteli

25 alakja, azzal jellemezve, hogy tartósítószerként valamilyen alkálifém-azidot tartalmaz.
9. Bármelyik megelőző igénypont szerinti reagens kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy
10—15 súly% karbamidot tartalmaz.

30 10. Bármelyik megelőző igénypont szerinti reagens kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy 3—10 súly% pufferanyagot tartalmaz.
11. Bármelyik megelőző igénypont szerinti reagens kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy pufferanyagként 2-[4-(2-hidro-

35 xi-etil)-piperazin-l-il]-etánszulfonsav puffért, vagy trisz(hidroxi-metil)-amino-metán puffért tartalmaz.
12. Bármelyik megelőző igénypont szerinti reagens kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy aktivátorként nátrium-, kalcium- vagy magnézium-kloridot tartalmaz.

40
13. Eljárás az 1—12. igénypontok bármelyike szerinti szárazreagens előállítására, azzal jellemezve, hogy a 14—22 szénatomos zsírsavcsoportokat és 1—8 szén-szén kettős kötést tartalmazó trigliceridből vizes emulziót készítünk, amelyben epesavsót, kolipázt, legalább 10 súly% védőkolloi45 dót, előnyösen polietilén-glikolt, polivinil-pirrolidont, aminosavakat, oligoszacharidokat vagy szérumalbumint és adott esetben alkálifém- vagy alkáliföldfémsó aktivátort és ha tartósítószert is alkalmazunk, annak legalább egy részét, keverünk össze, majd az emulziót liofilizáljuk, és a liofilizá50 tumhoz pufferanyagot, karbamidot és adott esetben a maradék védőkolloidot és tartósítószert, valamint adott esetben további aktivátort keverünk hozzá.
14. A 13. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a védőkolloid, epesavsó, kolipáz és 55 adott esetben tartósítószer és aktivátor oldatához keverés közben vékony sugárban hozzáfecskendezzük a triglicerid valamilyen illékony szerves oldószerrel készült oldatát.