JP2700501B2 - リパーゼ定量用単一試薬系およびその製造方法 - Google Patents

リパーゼ定量用単一試薬系およびその製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、比濁法によるリパーゼ定量のための単一試
薬系に関する。
［従来の技術］ ヒト膵臓リパーゼは、分子量がほぼ45,000ダルトンの
糖蛋白質である。リパーゼは、乳化された長鎖トリグリ
セリドを開裂して、モノおよびジグリセリドと、脂肪酸
とを生成する。リパーゼによるトリグリセリドの開列
が、水性乳濁液中の油滴の油−水境界面においてのみ行
われることは公知である。換言すれば、リパーゼ活性
は、連続的な水相中に分散相として存在する油滴の境界
面上でのみ発揮されるのである。リパーゼに誘導される
トリグリセリドの開裂は、基質表面の事象の影響を受け
る。
急性ならびに慢性膵臓炎、膵臓癌、膵臓の損傷、およ
び、諸々の腹部疾患の指標として、患者の血清および組
織のリパーゼ活性は、有力な診断手段となっている。し
かしながら、リパーゼは独特の反応機序を有するがため
に、その診断上の有用性は、その測定に用いられる方法
に左右される。
血清リパーゼ検定には、数種類の方法が公知である。
旧式の方法、例えばチェリー−クランダル法は、試料を
１晩温置し、色の変化する終点までの時間が長い滴定を
行う必要がある。必要とされる段階が多いことから、こ
の手順にはともすれば再現性に乏しいという欠点があっ
た。
チェリー−クランダル法の変形が報告されているが、
それらの限界は、もっぱらトリグリセリドの乳濁液に存
在する。リパーゼ活性は、乳濁液中の油滴の全表面積に
伴って変化するため、再現性のある結果を得るのが困難
である。最善の努力を払ったとしても、これらの方法に
用いられる乳濁液は、回分ごとに変化する。
初期の検定方法における別の問題点は、リポ蛋白質リ
パーゼによる干渉作用を識別できないことである。ヘパ
リンが薬剤として投与されている患者の間では特に、ポ
リ蛋白質リパーゼの干渉が顧慮されない場合に、リパー
ゼ値が偽りの増大を示すという結果が得られている。
リパーゼ定量のための比濁分析法も公知である。典型
的な比濁分析検定法においては、含リパーゼ血清を既知
量のトリグリセリドの水性乳濁液に混合し、乳濁液の濁
りの清澄化を測光法を用いて追跡する。
比濁分析の手法は、旧来の滴定法による血清リパーゼ
試験よりも信頼性と簡便性の双方に富んではいるもの
の、この手法には一定の欠点がある。最大の問題点は、
乳化された油滴の大きさの不均一性によるものである。
分光側光法が行えるためには、乳濁液は非常に希薄でな
ければならない。否定的なリパーゼ値を得ることもしば
しばあるが、それは、試験の測定段階の間に吸光度が増
大するからである。
油滴の大きさの不均一性という問題の解決によって比
濁分析手法の改善を図ろうとする試みも公知である。ノ
イマン（Neumann）らに対する米国特許第4,343,897号明
細書には、リパーゼの比濁定量のための、水を加えると
乳濁液が形成される乾燥試薬が記載されている。この乾
燥試薬は、慣用の方法を用いて形成される乳濁液の凍結
乾燥によって調製される。凍結乾燥の経費に加えて、乳
濁液の再現の際の人為的誤差の可能性という固有の欠点
がこの試薬には存在する。
［発明が解決しようとする課題］ 上記により、一貫して整合する結果が得られ、工場で
容易に一体的に製造され、かつ単一の試薬系として現場
で直ちに使用されるようなリパーゼ定量用試薬に対する
必要性を満たすのが本発明の目的である。
［課題を解決するための手段］ 本発明によれば、リパーゼ定量のための単一の系によ
る試薬が提供される。この試薬は、リパーゼが作用し得
る（lipase−active）脂肪酸源（例えば、トリグリセリ
ド）と、コリパーゼを成分とする第１リパーゼ活性剤
と、第２リパーゼ活性剤と、リポ蛋白質リパーゼ阻害剤
と、トリトン（Triton）Ｘ−100を成分とする第１乳濁
液安定剤と、第２乳濁液安定剤と、緩衝液と、抗沈澱剤
とからなる乳濁液として調剤される。本発明において
は、脂肪酸源とは、リパーゼにより開裂されて脂肪酸を
生じる化合物のことをいう。この試薬は、工場で一体的
に製造され、かつ、リパーゼ定量用の完全試薬として現
場で直ちに使用されることが可能である。
更に特定して述べるならば、第２活性剤としては、塩
化ナトリウムまたは塩化カルシウムが使用される。リポ
蛋白質リパーゼ阻害剤としては、胆汁酸塩、例えばデオ
キシコール酸ナトリウムを作用させる。第１乳濁液安定
剤であるトリトンＸ−100は、ポリエチレングリコール
ｐ−イソオクチルフェニルエーテルの一種である。好適
な第２乳濁液安定剤は尿素である。２−アミノ−２−ヒ
ドロキシメチル−1,3−プロパンジオールは、トリス（T
RIS）またはトリス緩衝液として一般的に知られてお
り、緩衝液として好適である。好適な抗沈澱剤は、ブリ
ジ（Brij）−35なるポリオキシエチレンエーテルの一種
である。微生物増殖抑制剤、例えばアジ化ナトリウムを
調剤物に添加することもできる。
試薬は、初めにコリパーゼ、塩化カルシウムまたは塩
化ナトリウム、胆汁酸塩、緩衝液、微生物増殖抑制剤、
および抗沈澱剤などの水性成分を混ぜ合わせることによ
ってこれを調製する。リパーゼが作用し得る脂肪酸源、
および（安定剤としての）トリトンＸ−100などの油性
成分は、別個にこれを混合する。これら２成分を別個に
濾過し、次いで、撹拌しつつ混ぜ合わせて、均一かつ直
ちに使用が可能な乳濁液を形成させるのである。
本発明の単一リパーゼ試薬系は、56℃で少なくとも約
12日間は安定であるが、これは４℃における少なくとも
２年間という有効期間に相当し、製品の世界のいかなる
個所に発送して使用時まで保管することを勘案するにも
充分過ぎる期間である。更に、検定は、商業的に許容し
得るに必要な、10分以内にこれを完了することができ
る。
前述の通り、本発明によれば、比濁分析によるリパー
ゼ定量のための単一の系による試薬が提供される。この
試薬は、工場で一体的に製造することが可能な、簡便か
つ直ちに使用が可能な乳濁液として調剤されている。乳
濁液は、リパーゼが作用し得る脂肪酸源と、コリパーゼ
を成分とする第１リパーゼ活性剤と、第２リパーゼ活性
剤と、リポ蛋白質リパーゼ阻害剤と、トリトンＸ−100
を成分とする第１乳濁液安定剤と、第２乳濁液安定剤
と、緩衝液と、抗沈澱剤とからなる。微生物増殖抑制剤
を添加することもできる。
有用なリパーゼが作用し得る脂肪酸源としては、長鎖
トリグリセリド、短鎖または中鎖のモノまたはジグリセ
リド、およびツィーン（Tween）系界面活性剤（ソルビ
トール無水物のオレイン酸との部分的混合エステルのポ
リオキシエチレンエーテル）がある。リパーゼによって
優先的に開裂されることから、長鎖トリグリセリド（鎖
の長さが炭素原子数で14〜25である脂肪酸残基を有する
トリグリセリド）が好適である。対照的に、その他の上
記基質はカルボキシルエステラーゼによる開裂をも受け
る。トリオレイン、すなわち、炭素原子数17の脂肪酸断
片を有するトリグリセリドは、好適なトリグリセリドで
ある。オリーブ油もまた、別の有用なリパーゼが作用し
得る脂肪酸源である。濃度範囲が約0.2〜約0.4ミリモル
のリパーゼが作用し得る脂肪酸源を用いることによっ
て、許容可能な試薬調剤物を調製することができる。脂
肪酸源は、そのアルコール溶液とするのが好適である。
好適な溶媒としてはｎ−ペンタノールがある。
リパーゼによるトリグリセリドの開裂は、油が不連続
相であって水が連続相である乳濁液の、油−水境界面に
おいてのみ行われることが公知である。リパーゼが乳化
されたトリグリセリドに接近するのを阻害する化合物に
は、リパーゼ活性に対する阻害作用がある。胆汁酸塩、
リン脂質、および遊離脂肪酸には、極性領域と非極性領
域の双方が存在し、境界面に集中してリパーゼを阻害す
る傾向がある。蛋白質、例えばアルブミンにも同様の作
用があるが、おそらくこれは、疎水相に誘引されるアル
ブミンにリパーゼが結合するためであると思われる。
本発明では、10,000ダルトンほどの分子であるコリパ
ーゼがリパーゼ活性剤として用いられ、これが脂質小球
にリパーゼをいわば「係留」することによって、リパー
ゼ阻害性作用因の阻害作用を打ち消すのである。コリパ
ーゼの好適な濃度範囲は約70〜約590単位/mlである。
コリパーゼに加え、本試薬には、アルカリ金属塩化
物、アルカリ土類金属塩化物、およびそれらの混合物か
らなる一群から選択される第２リパーゼ活性剤が含まれ
る。塩化ナトリウムおよび塩化カルシウムがともに用い
られるのが好適である。塩化ナトリウムは、100ミリモ
ル以上の濃度ではリパーゼ阻害剤となるが、コリパーゼ
および胆汁酸塩の存在下では、その阻害作用が排除され
る。約20〜約40ミリモルの濃度では、塩化ナトリウムは
リパーゼ活性剤となる。同様に、試薬に塩化カルシウム
が含まれる場合は、リパーゼ活性が増大する。カルシウ
ムは、反応動態を線形に保つのに役立ち、乳濁液の安定
性を更に促進する。本発明に好適なカルシウムの濃度
は、約0.05〜約0.5ミリモルの範囲である。
上記の通り、ある主の被験試料におけるリポ蛋白質リ
パーゼの存在は、リパーゼの正確な定量に干渉を及ぼ
す。リポ蛋白質リパーゼの作用を阻害するためには、胆
汁酸またはその塩を試薬に含ませるのが望ましい。通
常、胆汁酸はリパーゼとポリ蛋白質リパーゼの双方の活
性を阻害するが、コリパーゼの存在下では、リパーゼ活
性に対する影響は無効となる。適切な胆汁酸塩として
は、デオキシコール酸塩、およびタウロデオキシコール
酸塩があるが、デオキシコール酸ナトリウムが好適であ
る。胆汁酸または胆汁酸塩の好適な濃度範囲は、約15〜
約30ミリモルである。
乳濁液安定剤も加えられる。２種類の異なる安定剤を
用いるのが好適である。第１乳濁液安定剤は、トリトン
Ｘ−100として市販のポリエチレングリコールｐ−イソ
オクチルフェニルエーテルからなる。この一群の化合物
は一般式 CH3C（CH3）2CH2C（CH3）２−C6H6−Ｏ（CH2CH2O）xH で示され、平均的な組成はC34H62O11である。トリトン
Ｘ−100は、機能することが知られている唯一のもので
あって、全組成物の約0.025〜約0.13重量％の濃度で用
いられる。その等価物が他にも存在することを無視する
ものではないが、トリトンＸ−100は、本発明の乳濁液
の安定性を長期間保持させる性能において他に類を見な
い。
第２乳濁液安定剤は、尿素であるのが好ましく、その
濃度は、約0.01〜約1.0重量％である。
試薬のpHを制御するために、緩衝液を添加する。本発
明に好適な緩衝液はトリスであって、これはトリス緩衝
液としても知られている。すなわち、２−アミノ−２−
ヒドロキシメチル−1,3−プロパンジオールである。許
容可能な緩衝液の濃度は、約0.025〜約0.13重量％の範
囲である。
試薬を更に安定させ、かつヒトの血清試料の沈澱を抑
えるために、抗沈澱剤、例えば脂肪族アルコールのポリ
オキシエチレンエーテル［「ブリジ（Brij）」として市
販］を添加する。好適な抗沈澱剤は、ブリジ−35、すな
わちポリオキシエチレン（炭素原子数23）ラウリルエー
テルである。好適な抗沈澱剤の濃度は、約0.02〜約0.2
重量％の範囲である。
上記成分に加え、試料には微生物増殖抑制剤を含有さ
せるのが望ましい。好適な抑制剤はアジ化ナトリウムで
あって、濃度は約0.05〜約0.2重量％であって、これに
代えて、含硫防腐剤を用いることもできる。
本発明は、それぞれが広い許容可能な範囲の濃度また
は値をとる成分および条件による集合体として上記に示
されている。好適な乳濁液における各成分の好適かつ至
適な値を決定するための最適化調査を行った。結果を第
１表に示す。
本発明はまた、リパーゼ定量用単一試薬系の製造方法
をも包含する。この方法は下記の段階からなる。すなわ
ち、 リパーゼが作用し得る脂肪酸源をトリロンＸ−100を
成分とする第１乳濁液安定剤と混合して、油性成分を調
製する段階。
前記油性成分を濾過する段階。
コリパーゼからなる第１リパーゼ活性剤と、第２リパ
ーゼ活性剤（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウ
ム、およびそれらの混合物）と、例えば尿素を成分とす
る第２乳濁液安定剤と、緩衝液（例えば、２−アミノ−
２−ヒドロキシメチル−1,3−プロパンジオール）と、
抗沈澱剤（例えば、ブリジ−35）とを混合して水性成分
を調製する段階。水性成分には、微生物増殖抑制剤（例
えば、アジ化ナトリウム）も含まれるのが好適である。
前記水性成分を濾過する段階。
濾過された前記油性成分を濾過された前記水性成分と
混合して安定な乳濁液を形成させる段階。油性成分に対
する水性成分の好適な比率は、ほぼ40:1である。この結
果、リパーゼの比濁分析による定量に用いることができ
る、使用が簡便な単一試薬系が得られる。
本発明の１好適実施例においては、水性成分のpHは、
乳濁液形成の前に調整される。許容可能な結果が得られ
るのは、pHが約8.8〜約9.6の範囲内にある場合である。
pHは、約9.0〜約9.4の範囲内にあるのが好適であり、最
適の結果はpH9.2のときに得られる。
下記実施例は、本発明の具体的な説明を目的として記
載されている。
［実施例］ 実施例１ 蒸留水に下記の成分を表示の濃度で溶解させて、水溶
液を調製する。すなわち、175単位/mlのコリパーゼ、0.
2ミリモルの塩化カルシウム、20ミリモルのデオキシコ
ール酸ナトリウム、0.25重量％の尿素、20ミリモルのト
リス緩衝液、35ミリモルの塩化ナトリウム、0.1重量％
のアジ化ナトリウム、0.06重量％のブリジ−35である。
溶液のpHを9.2に調整し、これを濾過する。12.5ミリモ
ルのトリオレインと３重量％のトリトンＸ−100とを含
有するｎ−プロパノール溶液を作成して、油性成分を調
製する。この成分を濾過する。
水性成分を油性成分と40:1の比率で混合して、作業乳
濁液を作成する。作業乳濁液の最終的組成を第２表に示
す。
第２表 成分 濃度 コリパーゼ 171U/ml 塩化カルシウム 0.195mM デオキシコール酸ナトリウム 19.5mM トリオレイン 0.305mM 尿素 0.244％ トリトンＸ−100 0.249％ トリス 19.5mM 塩化ナトリウム 32.2mM アジ化ナトリウム 0.098％ ブリジ−35 0.058％ 作業乳濁液の反応動態の線形性を検定した。結果を第
１図に示す。図示の通り、実施例１によって製造した試
薬は、少なくとも700国際単位のリパーゼ濃度まで線形
性を保っている。換言すれば、リパーゼの広い濃度範囲
にわたって、正確なリパーゼの定量が行えることにな
る。試料約40を試薬1mlと混合した場合に良好な比濁
分析感度および線形性が得られる。すなわち、このよう
な試料対試薬の比率において、毎分１リパーゼ国際単位
あたり約1.1x10-4絶対単位という感度が達成される。
試薬の経時的安定性も測定されている。実施例１に記
載の要領で乳濁液を混合し、温度変化の下においた。試
料に対する試薬の比率は2ml:0.080mlであった。試料
は、リパーゼを強化したヒト血清である。比濁測定は、
反応時間を４分間として、37℃で波長340nmについて行
った。結果を第３表に示す。
第３表に図示の通り、乳濁液は、47℃では少なくとも
14日間、また、57℃では12日間安定であって、これは、
４℃においては２日間を越える有効期間に相当する。
本発明は、例示および好適実施例によって説明されて
いるが、これに制約されるものではない、当業界の技術
の習熟者には、本発明の基本的精神、および対照範囲か
ら逸脱することなく、多数の追加的な変更および改良を
なし得ることが認識されるものと思われる。したがっ
て、本発明は、上記の開示によってではなく、付記の請
求範囲によってのみ制約されるものとする。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の組成物について得ることができる、
試料のリパーゼの濃度と吸光度の変化との間の線形関係
を示すグラフである。

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記を含むリパーゼ定量用単一乳濁液試薬
    システム： リパーゼが作用し得る脂肪酸源、 リパーゼを脂質小球に係留するのに十分な量で供給され
    るコリパーゼからなる第１リパーゼ活性剤、 アルカリ土類金属塩化物並びにアルカリ土類金属塩化物
    及びアルカリ金属塩化物の混合物から選択する活性化さ
    せる量の第２リパーゼ活性剤、 胆汁酸及び胆汁酸塩から選択するリポ蛋白質リパーゼ阻
    害剤、 オクチルフェノキシポリエトキシエタノールを含む安定
    化させる量の第１乳濁液安定剤、 該第１乳濁液安定剤と組合せて用いられたときに、乳濁
    液を56℃で少なくとも12日間安定に維持させる第２乳濁
    液安定剤、 約8.8〜9.6のpHを維持するのに十分な量で存在する緩衝
    液、及び ヒト血清の成分の沈澱を防止するのに十分な量で供給さ
    れる抗沈澱剤。
  2. 【請求項２】リパーゼが作用し得る脂肪酸源がトリグリ
    セリド又はオリーブ油である、請求項１に記載の試薬シ
    ステム。
  3. 【請求項３】リパーゼが作用し得る脂肪酸源が約0.2〜
    0.4mMの濃度を有し、及び／又は、コリパーゼが約70〜5
    90単位/mlの濃度を有する、請求項１に記載の試薬シス
    テム。
  4. 【請求項４】オクチルフェノキシポリエトキシエタノー
    ルが約0.025〜0.13重量％の濃度を有する、請求項１に
    記載の試薬システム。
  5. 【請求項５】抗沈澱剤が高級脂肪族アルコールのポリオ
    キシエチレンエーテルを含む、請求項１に記載の試薬シ
    ステム。
  6. 【請求項６】ポリオキシエチレンエーテルがポリオキシ
    エチレン（23）ラウリルエーテルである、請求項５に記
    載の試薬システム。
  7. 【請求項７】微生物増殖抑制剤が更に含まれる、請求項
    １に記載の試薬システム。
  8. 【請求項８】下記を含む乳濁液として配合されたリパー
    ゼ定量用単一システム試薬： 約0.25〜0.35mMのトリオレイン、 約100〜350単位/mlのコリパーゼ、 約0.15〜0.25mMの塩化カルシウム、 約30〜35mMの塩化ナトリウム 約17〜25mMのデオキシコール酸塩、 約0.05〜0.1重量％のオクチルフェノキシポリエトキシ
    エタノール、 約0.2〜0.5重量％の尿素、 約17〜22mMの２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−1,3
    −プロパンジオール、及び 約0.04〜0.1重量％のポリオキシエチレン（23）ラウリ
    ルエーテル。
  9. 【請求項９】リパーゼが作用し得る脂肪酸源をオクチル
    フェノキシポリエトキシエタノールを成分とする第１乳
    濁液安定剤と混合して油性成分を形成させる段階と、前
    記油性成分を濾過する段階と、コリパーゼを成分とする
    第１リパーゼ活性剤と、塩化ナトリウム、塩化カルシウ
    ム、およびそれらの混合物からなる一群から選択された
    第２リバーゼ活性剤と、該第１乳濁液安定剤と組合せて
    用いたときに乳濁液を56℃で少なくとも12日間安定に維
    持させる第２乳濁液安定剤と、緩衝液と、微生物増殖抑
    制剤と、ヒト血清の成分の沈澱を防止する抗沈澱剤とを
    混合して水性成分を形成させる段階と、前記水性成分を
    濾過する段階と、濾過された前記油性成分を濾過された
    前記水性成分と混合して安定な乳濁液を形成させる段階
    とからなることを特徴とする請求項１に記載のリパーゼ
    定量用単一乳濁液試薬システムの製造方法。
JP2132776A 1989-05-25 1990-05-24 リパーゼ定量用単一試薬系およびその製造方法 Expired - Lifetime JP2700501B2 (ja)

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