DK158526B

DK158526B - Reagens til lipasebestemmelse og fremgangsmaade til fremstilling deraf

Info

Publication number: DK158526B
Application number: DK001380A
Authority: DK
Inventors: Ulrich Neumann; Karl-Wolfgang Knitsch; Joachim Ziegenhorn; Albert Roeder; Werner Zwez; Werner Kraemer
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1979-02-05
Filing date: 1980-01-02
Publication date: 1990-05-28
Also published as: EP0014252A1; ATE2227T1; FI69640B; FI69640C; ES487676A1; DE2964508D1; DE2904305B1; ZA80630B; EP0014252B1; DD148830A5; SU1367867A3; AU515131B2; FI800199A7; JPS5728275B2; DE2904305C2; HU181539B; DK158526C; AR219647A1; CS236458B2; US4343897A

Description

i

DK 158526B

Den foreliggende opfindelse angår et genfortyndeligt tørreagens til turbidimetrisk bestemmelse af lipase, hvilket reagens ved vandtilsætning danner en emulsion med et indhold af substratolie, beskyttelseskolloid, emulgator og aktivator.

5

Endvidere angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af tørreagenset.

Bestemmelserne af enzymerne amylase (E.C. 3.2.1.1) og 10 lipase (E.C. 3.1.1.3) har en høj udsagnskraft for pankre-assygdommens diagnostik. I tilfælde af akut pankreatitis sker der i løbet af få timer en undertiden meget massiv forøgelse af begge enzymer i serumet. I tilfælde af intakt nyrefunktion bliver imidlertid amylasen som følge af dens 15 lave molekylvægt hurtigt igen udskilt, medens lipaseakti-viteten i serumet vedbliver at være forøget i længere tid.

En sikker diagnose af pankreatitis kan fås ved bestemmelse af begge enzymerne.

20 Lipasen splater primært α-esterbindingen i et triglycerid, fortrinsvis med langkædede fedtsyrerester, til dannelse af di-glyceridet og den frie fedtsyre. Den videre omsætning til dannelse af monoglyceridet forløber betydeligt langsommere.

25 Medens de sædvanlige af enzymer katalyserede reaktioner forløber i den vandige fase, fungerer lipasen kun ved grænsefladen oliedråber/vand. Herved adskiller den sig fra esteraserne, som kun reagerer i den vandige fase. Foruden de kemiske parametre bliver kinetiken derfor i høj grad på-30 virket af beskaffenheden af substratets overflade.

Titrimetriske lipasebestemmelsesmetoder kendes. De kunne imidlertid som følge af den til dels vanskelige håndtering, længere reaktionstid og det højere prøvebehov kun i be-35 grænset omfang vinde indpas i det klinisk-kemiske rutine laboratorium.

DK 158526 B

2

De væsentlige ulemper ved den titrimetriske bestemmelsesmetode, nemlig det høje prøvebehov og de lange inkubationstider, undgås ved de turbidimetriske metoder, ved hvilke uklarhedsklaringen i en triglycerid/vand-emulsion kontrolleres 5 fotometrisk. Et betydeligt problem ved den turbidimetriske bestemmelse er imidlertid fremstillingen af en emulsion, der til stadighed har pålidelig ens dråbestørrelse.

Denne er af særlig betydning, da reaktionens kinetik påvirkes kraftigt af størrelsen af triglyceriddråberne. Fra 10 tysk fremlæggelsesskrift nr. 1.961.983 kendes ganske vist allerede en olivenolie-tøremulsion, der er egnet til den titrimetriske bestemmelse af lipaseaktiviteten. Med denne tøremulsion er triglyceridindholdet imidlertid ikke egnet til en fotanetrisk bestemmelse af uklarhedsklaringen som 15 følge af den høje lysabsorption. Ved fortynding af dette reagens med henblik på også at gøre det egnet til den turbidimetriske, kinetiske lipasebestemmelse forskydes imidlertid parametrene således, at man ikke længere opnår en reaktion af nulte orden.

20

Endvidere kendes fra tysk offentliggørelsesskrift 2.719.704 et reagens til anvendelse ved bestemmelse af en prøves lipaseak-tivitet. Det således kendte reagens består af en fast grundmasse af et ensartet med et triglycerid imprægneret hjælpe-25 stof, der består af polyethylenglycol og en sukkerart eller sukkeralkohol valgt blandt mannitol, inositol, sorbitol, maltose, dextrose, lactose og dextran samt blandinger deraf.

Endelig kendes fra Chemical Abstracts Vol. 84, (1976), nr.

30 70752E, Rathelot et. al., en fremgangsmåde til bestemmelse af pancreatisk lipase og colipase. Ved hjælp af denne fremgangsmåde blev hydrolysehastigheden af langkædede triglycerider ved hjælp af ren kvægpankreasli påse bestemt i nærværelse af varierende mængder galdesyresalte og colipase. Den enzymkatalyserede 35 hydrolyse af langkædede triglycerider ved hjælp af pankreasli-pase fra nogle arter blev aktiveret ved tilsætning af colipase

DK 158526B

3 fra andre arter. Undersøgelser vedrørende aktiveringen af pancreas! ipase ved hjælp af colipase i nærværelse af galdsyresal-te muliggjorde re-evaluering af de optimale betingelser for bestemmelsen af lipase og udviklingen af en procedure til ana-5 lyse af colipase.

Den foreliggende opfindelse tager derfor sigte på at angive et især til den turbidimetriske eller nephelometriske aktivitetsbestemmelse af lipase egnet reagens, som foreligger i tør form og ved hjælp af simpel tilsætning af vand kan overføres til en emulsion med reproducerbar ens dråbestørrelse. Et yderligere formål med opfindelsen er at angive te sådant reagens, med hvilket dråbestørrelsen i den gendannede emulsion kan reguleres ved hjælp af tørreagensets kvantitative sammensætning og i vid udstrækning er uafhængig af den til fremstilling af tørreagens benyttede tri'glycerinemulsion. Herved skal det undgås, at anvenderen selv skal fremstille triglyceridemulsionen umiddelbart før prøvens gennemførelse. Da nemlig substratover- 2 Π fladens beskaffenhed i stort omfang bestemmer enzymets aktivitet (Clin. chem. 23, 522-531, 1977), kræves der til pålidelige resultater en substatoverflade, der konstant vedbliver at være ens, også i henseende til dråbestørrelsen. Emulsionskvaliteten er imidlertid stærkt afhængig af 2 5 fremstillingsteknikken og er erfaringsmæssigt endog ved overholdelse af bestemte forskrifter forskellig ved gennemførelse af forskellige personer, så at betydelige afvigelser optræder i de målte aktivitetsværdier. Også denne vanskelighed skal afhjælpes ved hjælp af opfindelsen.

30

Disse formål opnås ved hjælp af et genfortyndeligt - tørreagens til især turbidimitrisk bestemmelse af lipase, der ved vandtilsætning danner en emulsion med et indhold af substratolie, beskyttelseskolloid, emulgator og aktivator, 3 5 hvilket reagens er ejendommeligt ved, at det indeholder 0,2 til 10 vægt-S flydende triglycerid, 20 til 90 vægt-% beskyttelseskolloid,

DK 158526B

4 5 til 60 vægt-% galdesyrealkalisalt, 0,001 til 0,1 vægt-% colipase, 0,1 til 2,0 vægt-% konserveringsmiddel, eventuelt 5 til 20 vægt-% urinstof, 5 3 til 50 vægt-% puffermateriale for pH 6,0 til 10,5 og o,5 til 5 vægt-% aktivator.

Det har overraskende vist sig, at med sammensætningen i-følge opfindelsen af et tørreagens opnås altid samme drå-bestørrelse i den gendannede emulsion i tilfælde af uforandret kvantitativ sammensætning, og desuden også at beskaffenheden af substratoverfladen reproducerbart er således beskaffen, at der altid opnås en høj reaktionshastighed og et reaktionsforløb af nulte orden, hvilket er forudsæt-15 ning for en i praksis tilfredsstillende turbidimetrisk, kinetisk aktivitetsbestemmelse.

Ved hjælp af ændring af den kvantitative sammensætning indenfor rammerne af de ovenfor for de enkelte bestanddele 20 i reagenset angivne variationsbredder kan der uafhængigt af fremstillingen fastlægges en bestemt dråbestørrelse for den gendannede eller genfortyndede emulsion. Eftersom reagensmængdens begyndelsesekstinktion bliver betinget af indholdet af triglycerid, skal man i reglen gå ud fra en 25 bestemt ønsket triglyceridkoncentration, og mængderne af de øvrige bestanddele kan derefter afpasses efter de givne forhold med hensyn til den tilstræbte dråbestørrelse.

Som triglycerid egner sig i og for sig såvel naturlige som 30 syntetiske triglycerider med fedtsyrerester mellem ca. 4 og ca.. 22 carbonatomer. Eksempelvis har også tributyrin vist sig egnet. Imidlertid foretrækkes triglycerider med længe- rekædede, umættede fedtsyrerester, især triglycerider, hvis fedtsyrerester indeholder 8 til 20 carbonatomer og 1 til 8, 3 5 fortrinsvis 1 til 3 qarbon-carbon-dobbeltbindinger. P.g.a. sin lette tilgængelighed foretrækkes især triolein, men også olivenolie er meget velegnet. Den foretrukne triglyceridmængde andrager 0,2 til 2,0 vægt-%.

5

DK 158526B

Som beskyttelseskolloid kommer de af kemikeren hertil kendte stoffer i betragtning, såsom polyhydroxyforbindelser, serumalbumin, polyvinylpyrrolidon, faste polyethylenoxider og lignende. Polyhydroxyforbindelser foretrækkes, især monomer eller 5 polymer pentose eller hexose med 1 til 10 pentose- eller hexo* se-enheder i molekylet og/eller ved stuetemperatur fast poly-ethylenglykol. Foretrukne eksempler på egnede hydroxyforbin-delser er mannitol og lignende sukkeralkoholer, oligosaccharid af glucose, mannose, maltoheptaose, polyethylenglykol med en middelmolekylvægt mellem 3500 og 7000 og lignende. Andre anvendelige beskyttelseskolloider er f.eks. aminosyrer, såsom alanin, plantegummiarter, såsom gummi arabicum osv. Den foretrukne mængde beskyttelseskolloid eller en blanding af beskyttelseskolloider andrager 50 til 70 vægt-%. Særlig egnet har en *5 blanding af sukkeralkohol og polyalkylenglykol vist sig at være .

Som galdesyre kommer de kendte overfladeaktive galdesyrer, såsom cholsyre, taurocholsyre, desoxycholsyre, taurodesoxy- 20 cholsyre, glydodesoxycholsyre eller salte deraf, især natriumsaltet i betragtning. Den foretrukne mængde andrager 10 til 15 vægt-%.

En yderligere væsentlig bestanddel af reagenset ifølge opfin- 25 delsen er colipase. Særlig egnet er en for forureninger fri colipase. Den foretrukne mængde andrager 0,003 til 0,01 vægt-%.

Som konserveringsmidler anvendes indenfor opfindelsens rammer sådanne, som ikke påvirker den enzymatiske aktivitet af lipa- o 0 sen, der skal bestemmes. Særligt egnede er alkaliazideE·, især natriumazid. Også andre konserveringsmidler, såsom eksempelvis thiozid og andre svovlholdige konserveringsmidler, er imidlertid ligeledes egnede. Den foretrukne mængde konserveringsmiddel andrager 0,2 til 0,7 vægt-%.

Reagenset ifølge opfindelsen indeholder endvidere urinstof, fortrinsvis 10 til 15 vægt-%.

35

DK 158526 B

6

Som puffermateriale egner sig alle kendte puffere, der er i stand til indenfor rammerne af reagenset ifølge opfindelsen at indstille en pH- værdi mellem 6,0 og 10,5. Det foretrukne pH-område ligger mellem 8,3 og 9,5. Eksempler på egnede puffere 5 er diethanolaminpuffer, triethanolaminpuffer, tris-puffer og goodpuffer, såsom hepes-puffer (velegnet til tilsætning før lyophiliseringen), taps-puffer og bicine. Især foretrækkes tris-puffer. Den foretrukne puffermaterialemængde ligger mellem 3 og 10 vægt-%. En yderligere aktivator er calciumioner. Da 10 disse danner uopløselige forbindelser med desoxycholsyre, foretrækkes taurodesoxycholsyre som galdesyre i tilfælde af tilstedeværelse af calcium, da denne syre tillader højere calciumkoncentrationer i området fra 1 til 5 mmol.

15 Udover de nævnte væsentlige bestanddele kan reagenset ifølge opfindelsen også til bestemte formål yderligere indeholde indifferente tilsætningsstoffer (fyldstoffer), som letter håndteringen.

20 Endelig indeholder reagenset ifølge opfindelsen også aktivator for lipasen. Lipaseaktivatorer kendes. Chlorider foretrækkes, især natriumchlorid, men også andre alkali- eller jordalkali-chlorider, for så vidt de ikke fører til dannelse af uopløselige forbindelser med andre bestanddele af reagenset ifølge 25 opfindelsen eller prøven. Også magnesiumioner virker aktiverende .

Vedrørende virkemåden af de enkelte bestanddele i reagenset ifølge opfindelsen indenfor opfindelsens rammer foreligger 30 der ikke klarhed i enhver henseende. Det antages imidlertid, at colipasen ophæver en som følge af det høje indhold af galdesyresalt, især af desoxycholat, taurodesoxycholat eller glykodesoxycholat, bevirket hæmning af enzymet og forbedrer lineariteten af reaktionsforløbet. Urinstof synes at udøve en 35 indflydelse på emulsionens vand/lipid-overflade og at stabilisere denne.

i

DK 158526B

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af tørrea--genset er ejendommelig ved, at man fresmtiller en vandig emulsion af triglyceridet, som indeholder galdesyresalt, colipase, mindst 10 vægt% beskyttelseskolloid, i det mindste en del af 5 konserveringsmidlet og eventuelt aktivator, lyofiliserer emulsionen og i lyofilisatet iblander puffermateriale, lirinstof og eventuelt resterende beskyttelseskolloid og konserveringsmiddel samt eventuelt yderligere aktivator.

10 Tørreagenset ifølge opfindelsen fremstilles ved lyofi 1isering af en ifølge sædvanlige metoder fremstillet emulsion af triglyceridet, hvilken emulsion indeholder galdesyresalt, colipase, mindst 10 vægt% beskyttelseskolloid, i det mindste en del af konserveringsmidlet og eventuelt aktivator. Derved 15 bliver puffermateriale, urinstof og eventuelt også en del af beskyttelseskolloidet og konserveringsmidlet samt eventuelt aktivatoren først tilsat efter lyofi 1isering af "tøremulsionen". Emulsionen, der er blevet underkastet lyofi 1isering, kan fremstilles ifølge sædvanlige metoder, eksempelvis ved indfø-20 ring af alle bestanddelene i det vandig opløsningmiddel, emulgering ved hjælp af sædvanlige metoder, såsom ultralyd, kol-loidmølle og lignende, og derefter indfrysning ved ca. -40eC og tørring i vakuum under de sædvanlige betinelser, altså ca. 13,33 til 13,33xl0“3 Pa.

25

Ved lyofi 1iseringen skal galdesyresalt, colipase, mindst 20% beskyttelseskolloid, i det mindste en del af konserveringsmidlet og eventuelt aktivatoren være tilsat. En foretrukken fremgangsmåde til fremstilling af den til lyofi 1 iser ingen 30 bestemte vandige emulsion består i, at man opløser de nævnte bestanddele med undtagelse af triglyceridet i vand og i opløsningen derefter indsprøjter en opløsning af triglyceridet i et flygtigt organisk opløsningsmiddel i en fin stråle under omrøring. Som flygtige organiske opløsningsmidler egner sig 35 især alifatiske alkoholer og ketoner med 1 til 4 carbonatomer.

DK 158526 B

8

Galdesyresaltene renses fortrinsvis for forureninger, såsom nedbrydningsprodukter og lignende, eksempelvis ved hjælp af ekstraktion med n-butanol under alkaliske betingelser, omkrystallisation fra alkohol-acetone og lignende 5 rensningsmetoder.

De øvrige bestanddele i reagenset ifølge opfindelsen, nemlig puffermaterialet, urinstof og eventuelt yderligere be-skyttelseskolloid, konserveringsmiddel og aktivator, kan 10 sættes til lyophilisatet umiddelbart efter dets fremstil ling eller først senere.

Det har overraskende vist sig, at reagenset ifølge opfindelsen efter genfortyndingen tilvejebringer en ekstinktion eller en 15 ekstinktionsændring pr. tidsenhed, der i vidt omfang er uafhængig af udgangsemulsionens ekstinktion og reagensets fremstilling. Endvidere er ekstinktionskonstanten for den gendannede eller genfortyndende emulsion overraskende god.

20 Denne overraskende egenskab ved reagenset ifølge opfindelsen blev ved bestemmelse af dråbestørrelsesfordelingen før og efter lyofiliserihgen' undersøgt ved hjælp af en coulter-tæller. Med dette apparat er det muligt at bestemme den procentuelle fordeling af partikler med diametre fra 480 til 25 16000 nmi afstande fra 100 til 1000 nm. Det viste sig herved, at dråbefordelingen før lyofiliserihgen svingende kraftigt fra mængde til mængde, og efter lyofiliseringen og eventuelt yderligere fremgangsmådetrin, såsom iblanding af reagensets andre bestanddele og lignende, til stadighed udviste et godt overens-30 stemmende fordelingsmønster (indstilling af en termodynamisk ligevægt). Den således fremstillede tøremulsion udmærker sig endvidere ved, at også ved termisk belastning (tre uger/35°C) sikres en udmærket konstant dråbefordeling. Den maksimale dråbefordeling blev fundet ved 500 til 1000 nm.

35 Den er derfor særlig egnet til den fotometriske registrering af uklarhedsklaringen ved 340 eller 365 nm.

Ved en partikelstørrelse væsentligt under 340 nm er en

DK 158526B

9 nedbrydning af triglyceriddråberne ikke længer konstaterbar, hvorimod store dråber ikke er noget ideelt substrat for lipasen.

5 En væsentlig fordel ved reagenset ifølge opfindelsen består i, at det såvel i tilfælde af human pankreasli-pase som i tilfælde af svinepankreaslipase udviser samme aktivitetsændring pr. tidsenhed. Da disse to lipaser ved den titrimetriske prøve ifølge Rick ligeledes viser 10 samme aktivitetskoncentrationer, er det muligt at benytte en svinepankreasholdig standard til kalibreringen.

En yderligere væsentlig fordel ved reagenset ifølge opfindelsen er mangelen på en stillings-fase. Det er kendt, 15 at ved turbidimetriske lipaseprøver optræder der først et reaktionsforløb af nulte orden efter nogen tid. Et sådant reaktionsforløb er imidlertid ubetinget nødvendigt for den nøjagtige bestemmelse af aktivitetskoncentrationen af et enzym (se H.U. Bergmeyer, Grundlagen der enzymatischen 20 Analyse, 1979, 58ff). Tiden indtil opnåelse af dette reaktionsforløb betegnes som stillings-fase.

De følgende eksempler belyser opfindelsen yderligere i forbindelse med tegningen.

25 På tegningen viser fig. 1 dråbestørrelsesfordelingen efter genfortynding, såvel i frisk tilstand som efter 3 ugers belastning ved 35°C i tør 30 tilstand, der er målt på coulter-tælleren, fig. 2 fordelingen af dråbestørrelsen med og uden belastning (se eksempel 7), 35 fig. 3 (sammen!igningséksempel - eksempel 8) ligeledes fordelingen af dråbestørrelsen med og uden belastning, og 10

DK 158526B

fig. 4 også dråbestørrelsesfordelingen belastet og ubelastet (se eksempel 9 ).

5 Eksempel 1 0,06 g CaCl2, 22,72 g natriumdesoxycholat, 25,35 g polye-thylenglykol, molekylvægt 4000, 1,1 g natriumazid, 0,02 g colipase og 50,8 dele mannitolopløses i 1,0 1 destilleret vand. I den opnåede opløsning indsprøjtes under omrøring 10 1,42 g triolein, som er opløst i 32 ml n-propanol, ved et tryk på 2 bar gennem en dyse med 1,5 mm diameter. Den således opnåede trioleinemulsion indfryses ved -40°C og tørres ved hjælp af lyofiliserihg..

15 8,95 g natriumdesoxycholat, 7,25 g tris, 1,20 g tris, HC1, 7,5 g polyethylenglykol, molekylvægt 4000, 1,97 g NaCl, 16,2 g urinstof og 56,9 g manitol blandes tørt med hinanden. 2 vægtdele af den således opnåede pufferblanding bliver ved hjælp af en spiralblander blandet med 1 vægtdel 20 . ..

af lyofilisatet til dannelse af et homogent reagens.

Til gennemførelse af lipasebestemmelsen optages 150 mg af dette reagens i 2,5 ml vand, blandes med 0,1 ml prøve og måles fotometrisk ved 365 nm og 25°C mod vand. Som prøve 25 egner sig eksempelvis serum, duodenalsaft, urin og andre legemsvæsker.

Rigtigheden af metoden blev konstateret ved sammenligning med den titrimetriske metode ifølge Rick. Ved en undersø-30 gelse af 60 humansera med forskellig lipaseaktivitet opnåedes følgende data:

Korrelation: (x = Rick; y = prøve ifølge opfindelsen) Y = 0,93 · x - 20; r = 0,96.

Prøvens linearitet bibeholdtes indtil ca. 13oo Rick-enheder.

35

DK 158526B

En Rick-enhed = 1 jimol FFA/minut = 1U

FFA = frigjorte fedtsyrer.

5 Eksempel 2 1,500 g mannitol, 0,900 g polyethylenglykol, molekylvægt 4000, 0,524 g natriumdesoxycholat, 1,5 mg colipase og 8 mg natrium-azid opløses i 50 ml destilleret vand. I denne opløsning ind-sprøjtes gennem en fin dyse under omrøring 145 mg triolein, som er opløst i 5,0 ml propanol. Den opnåede emulsion indfryses ved -40°C og lyofiliseres.

3,50 g urinstof, 3,73 g natriumdesoxycholat, 0,4 g NaCl, 1 mg 15 natriumazid, 2 mg calciumcarbonat, 1,355 g tris og 0,200 g tris, HC1 blandes intimt med hinanden. Hertil sættes det findelte, tørre lyophilisat, og der blandes homogent.

Den komplette blanding = 12,266 g indeholder; 20 triolein 0,145 g = 1,2 vægt-% mannitol·. 1,500 g polyethylenglykol 0,900 g, tilsammen 2,4 g = 19,6 vægt-% natriumdesoxycholat 4,254 g =34,7 vægt-% colipase 1,5 mg 25 natriumazid 9 mg tris i 1,355 g tris, HC1 0,200 g, tilsammen'1,555 g = 12,7 vægt-% urinstof 3,5 g =28,5 vægt-%

NaCl 0,4 g 30 CaCOg 0,2 mg 37 mg af denne blanding opløses i 2,5 ml destilleret vand og måles fotometrisk med 200 μΐ prøve (serum) ved 340 nm og 25 eller 30°C mod vand eller luft. Udfra ekstinktionsforskel-35 len/minut opnås bestemmelsen af lipaseaktiviteten.

Dråbestørrelsesfordelingen efter genfortynding, såvel i frisk tilstand som efter 3 ugers belastning ved 35°C i tør tilstand, der er målt på coulter-tælleren, vises i fig. 1 på tegningen.

DK 158526B

12

Eksempel 3 8.41 g kvægserumalbumin, 12,2 g nåtriumdesoxycholat, 0,02 g natriumazid og 0,034 g colipase opløses i 100 ml destilleret ® vand. Under omrøring bliver en opløsning af 3,5 g triolin i 7 ml propanol under tryk indsprøjtet i denne opløsning. Den således dannede emulsion indfryses ved -40°C og lyofi-liseresi 17.4 g mannitol, 4 g fast polyethylenglykol, 7 g urinstof, 10 7,47 g nåtriumdesoxycholat, 0,82 g NaCl, 0,2 g natriumazid, 2.71 g tris og 0,4 g tris, HC1 formales og blandes intimt med hinanden. Hertil sættes den findelte tøremulsion, og der blandes homogent.

15 90 mg af dette pulverformede reagens sættes til 2 ml destil leret vand, og efter opløsning tilsættes 100 jul prøve (serum) . Reaktionen følges fotometrisk ved 340 (365) nm Hg.

Eksempel 4 20 8.41 g alanin, 1,22 g nåtriumdesoxycholat, 0,02 g natriumazid og 0,034 g colipase opløses i 100 ml destilleret vand. Under omrøring indsprøjtes en opløsning af 3,5 g triolein i 7 ml propanol under tryk i denne opløsning. Den således dannede 25 emulsion indfryses ved -40°C og lyofiliseres.

17.4 g mannitol, 4 g fast polyethylenglykol, 7 g urinstof, 7,47 g nåtriumdesoxycholat, 0,82 g NaCl, 0,2 g· natriumazid, 2.71 g tris og 0,4 g tris, HC1 formales og blandes intimt 30 med hinanden. Derpå tilsættes den findelte tøremulsion, og der blandes homogent.

90 mg af dette pulverformede reagens indføres i 2 ml destilleret vand, og efter opløsning tilsættes 100 jil prøve (serum) .

35 Reaktionen følges fotometrisk ved 340 (365) nm Hg.

13

DK 158526B

Eksempel 5 4,205 g polyethylenglykol, molekylvægt 4000, 4,205 g kvægse-rumalbumin, 1,22 g natriumdesoxycholat, 0,02 g natriumazid 5 og 0,034 g colipase opløses i 100 ml destilleret vand. Under omrøring indsprøjtes en opløsning af 3,5 g triolein i 7 ml propanol under tryk i denne opløsning. Den således dannede emulsion indfryses ved -40°C og lyofiliseres.

10 17,4 g mannitol, 4 g polyethylenglykol, molekylvægt 4000, 7 g urinstof, 7,47 g natriumdesoxycholat, 0,82 g NaCl, 0,2 g natriumazid, 0,71 g tris og 0,4 g tris, HC1 formales og blandes intimt med hinanden. Hertil sættes den findelte tøremulsion, og der blandes homogent.

15 90 mg af dette pulverformede reagens sættes til 2 ml destilleret vand, og efter opløsning tilsættes 100 pi prøve (serum). Reaktionen følges fotometrisk ved 340 (365) nm Hg.

20

Eksempel 6 6,73 g polyethylenglykol (polywachs 4000) , 1,68 g polyvi-nylpyrrolidon, 1,22 g natriumdesoxycholat, 0,02 g natrium-25 azid og 0,034 g colipase opløses i 100 ml destilleret vand.

Under omrøring indsprøjtes en opløsning af 3,5 g triolein i 7 ml propanol under tryk i denne opløsning. Den således dannede emulsion indfryses ved -40°C og lyofiliseres..

30 17,4 g mannitol, 4 g polyethylenglykol, 7 g urinstof, 7,47 g natriumdesoxycholat, 0,82 g NaCl, 0,2 g natriumazid, 2,71 g tris og 0,4 g tris, HC1 formales og blandes intimt med hinanden. Hertil sættes den findelte tøremulsion, og der blandes homogent.

90 mg af dette pulverformede reagens sættes til 2 ml destilleret vand, og efter opløsning tilsættes 100 pi Prøve 35

DK 158526B

14 (serum). Reaktionen følges fotometrisk ved 340 (365) nm Hg.

Eksempel 7 (sammenligningseksempel; for lidt galdesyresalt) 5 4,69 g mannitol, 4,69 g polyethylenglykol (polywachs 4000), 0,38 g natriumdesoxycholat, 0,o2 natriumazid og 0,034 g co-lipase opløses i 100 ml destilleret vand. Under omrøring indsprøjtes en opløsning af 3,5 g triolein i 7 ml propanol under tryk i denne opløsning. Den således dannede emulsion 10 indfryses ved -40°C og lyofiliseres.

17,4 g mannitol, 4 g polyethylenglykol, molekylvægt 4000, 7 g urinstof, 7,47 g natriumdesoxycholat, 0,82 g NaCl, 0,2 g natriumazid, 2,71 g tris og o,4 g tris, HC1 formales og 15 blandes intimt med hinanden. Hertil sættes den findelte tøremulsion, og der blandes homogent.

90 mg af dette pulverformede reagens indføres i 2 ml destilleret vand, og efter opløsning tilsættes 100 pi prøve 20 (serum). Reaktionen følges fotometrisk ved 340 (365) nm Hg.

Fordelingen af dråbestørrelsen med og uden belastning (se eksempel 2) er vist i fig. 2 på tegningen.

25

Eksempel 8 (sammenligningseksempel) 3,76 g mannitol, 5,63 g polyethylenglykol, molekylvægt 4000, 0,19 g natriumdesoxycholat, 0,02 g natriumazid og 0,034 g 30 colipase opløses i 100 ml destilleret vand. Under omrøring indsprøjtes en opløsning af 3,5 g triolein i 7 ml propanol under tryk i denne opløsning. Den således dannede emulsion indfryses ved -40°C og lyofiliseres.

35 17,4 g mannitol, 4 g polyethylenglykol, molekylvægt 4000, 7 g urinstof, 7,47 g natriumdesoxycholat, 0,82 g NaCl, 0,2 g natriumazid, 2,71 g tris og 0,4 g tris, HC1 formales og

DK 158526 B

15 blandes intimt med hinanden. Hertil sættes den findelte tøremulsion, og der blandes homogent.

90 mg af dette pulverformede reagens sættes til 2 ml destil-5 leret vand, og efter opløsning tilsættes 100 μΐ prøve (serum). Reaktionen følges fotometrisk ved 340 (365) nm Hg.

Fordelingen af dråbestørrelsen med og uden belastning (se eksempel 2) er vist i fig. 3 på tegningen.

10

Eksempel 9 8,88 g mannitol, 0,86 g natriumdesoxycholat, 0,1 g natrium- azid og 0,034 g colipase opløses i 100 ml destilleret vand.

Under omrøring indsprøjtes en opløsning af 2,5 g triolin i 15 7 ml propanol under tryk i denne opløsning. Den således dannede emulsion indfryses ved -40°C og lyofiliseres.

22,4 g mannitol, 4 g polyethylenglykol med molekylvægt 4000, 2Q 2 g urinstof, 7,47 g natriumdesoxycholat, 0,82 g NaCl, 0,2 g natriumazid, 2,71 g tris og 0,4 g tris, HC1 formales og blandes intimt med hinanden. Hertil sættes den findelte tøremulsion, og der blandes homogent.

2 g 90 mg af dette pulverformede reagens indføres i 2 ml destilleret vand, og efter opløsning tilsættes 100 ^il prøve (serum) . Reaktionen følges fotometrisk ved 340 (365) nm Hg.

Dråbestørrelsesfordelingen belastet og ubelastet (se eksempel 3Q 2) er vist i fig. 4 på tegningen.

Eksempel 10 I 1000 ml destilleret vand opløses: 75 g mannitol, 25 g polyethylenglykol med molekylvægt 4000, 20 g taurodesoxycholat, 55 mmol HEPES-puffer, pH 6,8, 0,3 g 35

Claims

1. Genfortyndeligt tørreagens, især til turbidimetrisk 20 bestemmelse af lipase, hvilket reagens ved vandtilsætning danner en emulsion med et indhold af substratolie, beskyt-telseskolloid, emulgator og aktivator, kendetegnet ved, at det indeholder 0,2 til 10 vægt-% flydende trigly-cerid, 20 til 90 vægt-% beskyttélseskolloid, 5 til 60 vægt-% 25 galdesyrealkalisalt, 0,001 til 0,1 vægt-% colipase, 0,1 til 2,0 vægt-% konserveringsmiddel, 5 til 20 vægt-% urinstof, 3 til 50 vægt-% puffermateriale for pH 6,0 til 10,5, og 0,5 til 5 vægt-% aktivator.

2. Reagens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at triglyceridets fedtsyrerester indeholder 8 til 20 carbon-atomer og 1 til 8 carbon-carbon-dobbeltbindinger.

3. Reagens ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet 35 ved, at det indeholder 0,2 til 2,0 vægt-% triglycerid. DK 158526 B

4. Reagens ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at beskyttelseskolloidet består af en eller flere polyhydroxyforbindelser.

5. Reagens ifølge krav 4, kendetegnet ved, at po- lyhydroxyforbindelsen er en monomer eller polymer pentose eller hexose med 1 til 10 pentose- eller hexose-enheder i molekylet og/eller en fast polyethylenglykol.

5 Lyofilisatet opløses i·2,0 ml destilleret vand. Lipasebe-stemmelsen gennemføres ved tilsætning af 100 pi serum og fotometrisk måling ved 340 eller 365 nm. Ved en lagring af lyofilisatet ved 4°C og 35°C blev der ef^ 10 ger 3 uger ikke fastslået nogen forskel i begyndelsesekstinktionen og i prøveforløbet ved opløsning i redistilleret vand. HEPES = 2-[4-(2-hydroxyethyl)-piperazin-(l)]-ethansulfon-15 syre. P_a_t_e_n_t_k_r a v

6. Reagens ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at det indeholder 50 til 70 vægt-% beskyt-telseskolloid.

7. Reagens ifølge ethvert af de foregående krav, kende-I5 tegnet ved, at det indeholder 10 til 15 vægt-% galdesyresalt.

8. Reagens ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at det indeholder 0,003 til 0,01 vægt-% co-lipase. 20

9. Reagens ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at det som konserveringsmiddel indeholder et alkaliazid.

10. Reagens ifølge ethvert af de foregående krav, ken detegnet ved, at det indeholder 10 til 15 vægt-% u~ rinstof.

11. Reagens ifølge ethvert af de foregående krav, k e n -30 det egnet ved, at det indeholder 3 til 10 vægt-% pufferstof .

12. Reagens ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at det som pufferstof indeholder HEPES- 35 puffer, tabs-puffer, good-puffer,, tris-puffer, triethanol-amin-puffer eller diethanolamin-puffer. DK 158526B

13. Reagens ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at det som aktivator indeholder et natrium-, calcium- eller magnesiumchlorid.

14. Fremgangsmåde til fremstilling af tørreagenset ifølge ethvert af kravene 1 til 13, kendetegnet ved, at man fremstiller en vandig emulsion af triglyceridet, som indeholder galdesyresalt, colipase, mindst 10 vægt-% beskyt-telseskolloid, i det mindste en del af konserveringsmidlet 10 og eventuelt aktivator, lyofiliserer emulsidnen og i lyofi-lisatet iblander puffermateriale, urinstof og eventuelt resterende beskyttelseskolloid og konserveringsmiddel samt eventuelt yderligere aktivator.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at man i en opløsning af beskyttelseskolloid, galdesyresalt, colipase og eventuelt konserveringsmiddel og aktivator under omrøring i en fin stråle indsprøjter en opløsning af triglyceridet i et flygtigt,organisk opløsningsmiddel. 20 25 30 35