HRP20050670A2

HRP20050670A2 - Active immunization to generate antibodies to soluble a-beta

Info

Publication number: HRP20050670A2
Application number: HR20050670A
Authority: HR
Inventors: Bard Frederique; Yednock Ted; Vasquez Nicki; A. Seubert Peter
Original assignee: WYETH Neuralab Limited
Priority date: 2003-02-01
Filing date: 2005-07-22
Publication date: 2005-12-31
Also published as: WO2004069182A2; CA2513722A1; AU2004209981A1; CR7922A; KR20050118669A; MXPA05008156A; WO2004069182A3; US20080279873A1; NO20053862D0; AU2004209981B2; PL378571A1; RU2005127429A; EP1594969B1; ZA200505782B; NO20053862L; CN1745175A; RU2390350C2; ECSP055939A; EP1594969A2; BRPI0407058A

Description

Navodi koji upućuju na srodne prijave

Ova prijava je koristi mogućnost prema članku 35 U.S.C. §119(e) US prijave patenta br. 60/444,150, prijavljene 1. veljače 2003. godine, koja je navodom uključena u svojoj potpunosti za sve svrhe.

Tehničko područje

Izum se nalazi u tehničkom polju imunologije i medicine.

Pozadina izuma

Alzheimer-ova bolest (AD) je progresivna bolest koja rezultira senilnom demencijom. Vidi općenito Selkoe, TINS 16, 403-409 (1993); Hardy i sur., WO 92/13069; Selkoe, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 438-447 (1994); Duff i sur., Nature 373, 476-477 (1995); Games i sur., Nature 373, 523 (1995). U širem smislu, bolest pripada u dvije kategorije: kasno nastupanje, gdje se pojavljuje u starosti (65+ godina) i rano nastupanje, gdje se razvija puno ranije od razdoblja senilnosti, tj. između 35 i 60 godine. U oba tipa bolesti, patologija je ista ali obično su abnormalnosti jače i više proširene u slučajevima kada bolest nastupa u ranijoj dobi. Bolest je karakterizirana s najmanje dva tipa lezija u mozgu, senilnim plakovima i neurofibrilarnim čvorovima. Senilni plakovi su područja neorganiziranih neuropila do 150 μm u presjeku s izvanstaničnim amiloidnim nakupinama koji su u središtu vidljivi mikroskopskom analizom presjeka moždanog tkiva. Neurofibrilarni čvorovi su unutarstanične nakupine mikrotubula koji su udruženi s tau proteinom koji se sastoji od dva filamenta omotanih jedan oko drugoga u parovima.

Osnovni sastavni dio plakova je peptid nazvan Aβ ili β-amiloidni peptid. Aβ peptid je unutrašnji fragment od 39-43 amino kiseline proteina prekursora nazvanog prekursor amiloidnog proteina (APP). Nekoliko mutacija unutar proteina APP dovode se u vezu s prisutnošću Alzheimer-ove bolesti. Vidi, npr., Goate i sur., Nature 349, 704) (1991) (valin717 u izoleucin); Chartier Harlan i sur., Nature 353, 844 (1991)) (valin717 u glicin); Murrell i sur., Science 254, 97 (1991) (valin717 u fenilalanin); Mullan i sur., Nature Genet. 1, 354 (1992) (dvostruka mutacija koja mijenja lizin595-metionin596 u asparagin595-leucin596). Smatra se da takve mutacije uzrokuju Alzheimer-ovu bolest povećanjem ili izmjenom prijelaza iz APP u Aβ, posebice prijelazom APP u povećane količine dugačkog oblika proteina Aβ (tj. Aβ1-42 i Aβ1-43). Smatra se da mutacije na ostalim genima, kao što su presenilin geni, PS1 i PS2, posredno utječu na postupnu promjenu APP i stvaranje povećanih količina dugačkog oblika Aβ (vidi Hardy, TINS 20, 154 (1997)). Ova opažanja ukazuju da je Aβ, a posebice njegov dugački oblik, uzročni element u Alzheimer-ovoj bolesti.

Imunizacija transgeničnih miševa modela AD s imunogenima izvedenim β-amiloid peptidom (Aβ) rezultira odgovorom protutijela koja spriječavaju nastajanje i/ili čiste amiloidne plakove u mozgovima miševa (Schenk i sur., (1999) Nature 400, 173-177; Janus i sur., (2000) Nature 408, 979-982, Morgan i sur., (2000) Nature 408, 982-985, Sigurdson i sur., (2001) Am. J. Pathol. 159, 439-447.1-4)). Pasivnom primjenom protutijela na Aβ postignuti su slični učinci. Kao jedan od mehanizama čišćenja postojećih amiloidnih plakova predložena je fagocitoza stanica mikroglije i/ili makrofaga ovisna o Fc-u koja je odvija posredstvom protutijela (Bard i sur., (2000) Nat. Med., 6, 916-919)). Ovaj prijedlog temelji se na rezultatu da određena periferno primijenjena protutijela na Aβ ulaze u CNS transgeničnih miševa, preuređuju amiloidne plakove, i potiču čišćenje plakova. Također, postoje izvještaji o vrlo jakoj međusobnoj ovisnosti između protutijela koja su učinkovita in vivo i u ex vivo testu u kojem se rabe presjeci PDAPP ili mozga oboljelog od Alzheimer-ove bolesti (AD) da bi se izmjerila aktivnost čišćenja plaka. Fc receptori na stanicama mikroglije utječu na odgovor čišćenja u ex vivo testu. Međutim, također postoji izvješće da se učinkovitost protutijela može postići in vivo mehanizmima koji su neovisni o Fc interakcijama (Bacskai i sur., (2002) J. Neurosci., 22, 7873-7878). Objavljeno je da protutijelo usmjereno na srednji dio Aβ, koji ne može prepoznati amiloidne plakove, veže topljivi Aβ i smanjuje nakupljanje plaka (DeMattos i sur., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 8850-8855). Također je objavljeno da kratkotrajni tretman ovim protutijelom poboljšava izvođenje pri zadatku prepoznavanja objekta i pri tome ne utječe na amiloidno opterećenje (Dodart i sur., (2002) Nat. Neurosci., 5, 452-457).

Ova prijava vezana je na patente WO 00/72880 prijavljen 26. svibnja 2000, WO 99/27944, prijavljen 30. studenog 1998, SAD prijavu br. 60/067,740, prijavljena 2. prosinca 1997, SAD prijavu br. 60/080,970, prijavljena 7. travnja 1998, i SAD prijavu br. 09/201,430, prijavljena 30. studenog 1998, svaka od ovih prijava je navodom uključena u svojoj potpunosti za sve svrhe.

Kratki opis crteža

Slike 1A-C. Protutijela proizvedena imunizacijom s N-terminalnim fragmentima Aβ vežu se na amiloidne plakove. Slika 1A. Peptidi koji obuhvaćaju različite domene Aβ1-42 (SEQ ID NO:1) (sintetizirani blizu epitopa T stanica izvedenog iz ovalbumina) rabe se za imunizaciju PDAPP miševa. Reverzni izomer Aβ5-1 (SEQ ID NO:2), rabi se kao negativna kontrola. Slika 1B. ELISA titri protiv agregiranog Aβ1-42 značajno su viši tijekom istraživanja u skupinama Aβ5-11 i Aβ15-24 nego u skupini Aβ1-5 (1:14457, p<0,01 i 1:12257, p<0,05 prema 1:3647; ANOVA slijedi post hoc Tukey-jev test). Slika 1C. Nefiksirani kriostatski presjeci mozga netretiranih PDAPP miševa bili su izloženi serumu miševa imuniziranih s Aβ5-1, Aβ3-9, Aβ5-11, ili Aβ15-24 (titar normaliziran na 1:1000 za bojanje). Protutijela na Aβ15-24 nisu vezala amiloidne plakove. Skala predstavlja 500 μm.

Slike 2A-C. Uzimanje topljivog Aβ1-42 od strane protutijela nije povezano sa smanjenim amiloidnim opterećenjem niti neuritičnom patologijom. Slika 2A. Ispitivana je sposobnost seruma iz miševa imuniziranih fragmentima Aβ za uzimanje topljivog radioaktivno obilježenog Aβ1-42 pomoću radioimuno testiranja. Serumi iz svih životinja imuniziranih s Aβ15-24 imaju sposobnost uzimanja topljivog Aβ1-42 (jedan uzorak seruma imao je titar viši od 1:1350 i točan titar nije bio određen), u usporedbi s 27% onih u skupini Aβ1-5 i 3% u skupini Aβ3-9. Slike 2B-C. Amiloidno opterećenje (slika 2B) i neuritična patologija (slika 2C) procjenjeni su putem analize slike sa ʺslijepog mikroskopičaraʺ. Vrijednosti su izražene kao postoci srednje vrijednosti od skupine Aβ5-1 (reverzni izomerni peptid negativne kontrole). Skupina Aβ5-11 procijenjena je odvojeno od ostalih skupina, ali povezano s istom negativnom kontrolnom skupinom kao unutarnjom referentnom skupinom (drugi niz reverznog izomera Aβ5-1, s lijeve strane). Amiloidno opterećenje značajno je smanjeno u skupinama Aβ1-5, Aβ3-9, i Aβ5-11 (p<0,01. Stupići predstavljaju vrijednosti medijana a isprekidane vodoravne crte ukazuju kontrolni nivo. Neuritično opterećenje značajno je smanjeno u skupinama Aβ3-9 i Aβ5-11 (p<0,05). Niti jedna završna točka nije značajno promijenjena imunizacijom sa skupinom Aβ15-24. Statistička analiza provedena je transformacijom kvadratnim korijenom (da bi se normalizirale neparametarske raspodjele), te provedena analizira ANOVA. Zatim je rabljen Dunnett-ov test da bi se usporedilo više skupina Aβ1-5, Aβ3-9, Aβ15-24 s njihovom kontrolnom skupinom Aβ5-1, a Mann-Whitney test za usporedbu skupine Aβ5-11 s njezinom odgovarajućom reverznom kontrolom Aβ5-1.

Iscrpni opis izuma

I. Opći dio

Izum donosi metode za sprječavanje, za učinak na profilaksu, ili za liječenje bolesti povezane s amiloidnim nakupinama pri čemu se rabe fragmenti iz središnjeg ili C-terminalnog područja Aβ. Takvi fragmenti mogu uključivati poliklonalnu smjesu protutijela koja se specifično vežu na topljivi Aβ a ne vežu se na plakove. Protutijela mogu inhibirati nastajanje amiloidnih nakupina Aβ u mozgu pacijenta iz topljivog Aβ, te stoga sprječavati ili liječiti bolest. Fragment Aβ15-24 i pod-fragmenti od 5-10 susjednih amino kiselina pogodni su imunogeni zbog njihovog kapaciteta za stvaranje visokog titra protutijela.

II definicije

U svrhu klasifikacije supstitucija amino kiselina kao konzervativnih ili nekonzervativnih, amino kiseline su podijeljene u skupine kako slijedi: skupina I (hidrofobni postrani lanci): norleucin, met, ala, val, leu, ile; skupina II (neutralni hidrofilni postrani lanci): cys, ser, thr; skupina III (kiseli postrani lanci): asp, glu; skupina IV (bazični postrani lanci): asn, gln, his, lys, arg; skupina V (ostaci koji utječu na orijentaciju lanca): gly, pro; i skupina VI (aromatski postrani lanci): trp, tyr, phe. Konzervativne supstitucije uključuju supstitucije između amino kiselina u istoj skupini. Nekonzervativne supstitucije sastoje se iz izmjene člana jedne od ovih skupina članom druge skupine.

Izraz ʺsvi-Dʺ odnosi se na peptide koji imaju amino kiseline koje sadrže ≥75%, ≥80%, ≥85%, ≥90%, ≥95%, i 100% D-konfiguracije.

Izraz ʺsredstvoʺ rabi se da bi se opisao spoj koji ima ili može imati farmakološko djelovanje. Sredstva uključuju spojeve koji su poznati kao lijekovi, spojeve za koje je ustanovljeno farmakološko djelovanje ali koji su podložni daljnjoj terapijskoj procjeni, te spojeve koji su članovi zbirki i biblioteka koje treba pregledati u traženju farmakološkog djelovanja.

Terapijska sredstva ovog izuma su tipično u osnovi čista bez neželjenih onečišćivala. To znači da je sredstvo tipično najmanje oko 50% w/w (mokra/masa) čistoće, kao i da je u osnovi bez proteina i onečišćivala koja mogu smetati. Ponekad su sredstva najmanje oko 80% w/w i, još pogodnije najmanje 90 ili oko 95% w/w čistoće. Međutim, uporabom konvencionalnih tehnika za pročišćavanje proteina, mogu se dobiti homogeni peptidi od najmanje 99% w/w čistoće. Terapijska sredstva ovog izuma mogu sprječavati, utjecati na profilaksu, ili liječiti bolest vezanu uz amiloidne nakupine.

Specifično vezanje između dvije jedinice znači da te jedinice imaju afinitet jedna prema drugoj koji je najmanje 10, najmanje 100 ili 100 puta veći od afiniteta bilo koje od te dvije jedinice prema kontrolnoj, kao što je nepovezani antigen ili protutijelo prema drugom antigenu. Afinitet jedne jedinice prema drugoj je uobičajeno 107, 108, 109 M-1, ili 1010 M-1. Preferirani su afiniteti veći od 108 M-1. Specifično vezanje poliklonalnog protutijela na epitop unutar Aβ znači da se protutijela u populaciji poliklonalnih protutijela specifično vežu na jedan epitop Aβ pri čemu se ne vežu na druge epitope na Aβ.

Izraz ʺprotutijeloʺ ili ʺimunoglobulinʺ rabi se da bi uključila cjelovita protutijela i njihove vezne fragmente. Tipično, fragmenti se natječu s cjelovitim protutijelima iz kojih su izvedeni za specifično vezanje na fragmente antigena uključujući odvojene teške postrane lance, lake lance Fab, Fab'F(ab')2, Fabc, i Fv. Fragmenti se proizvode rekombinantnim DNA tehnikama, ili putem enzimatskog ili kemijskog razdvajanja cjelovitih imunoglobulina. Izraz ʺprotutijeloʺ također uključuje jedan ili više imunoglobulinskih lanaca koji su kemijski konjugirani s, ili eksprimirani kao, fuzijski proteini s drugim proteinima. Izraz ʺprotutijeloʺ također uključuje dvospecifično protutijelo. Dvospecifično ili bifunkcionalno protutijelo je umjetno hibridno protutijelo koje ima dva različita teško/laka para lanaca i dva različita vezna mjesta. Dvospecifična protutijela mogu se proizvesti različitim metodama uključujući fuziju hibridoma ili vezanje Fab' fragmenata. Vidi, npr., Songsivilai i Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny i sur., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).

Aβ, također poznat i kao β-amiloidni peptid, ili A4 peptid (vidi SAD 4,666,829; Glenner i Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun., 120, 1131 (1984)), je peptid od 39-43 amino kiselina, koji je glavni sastavni dio karakterističnih plakova u Alzheimer-ovoj bolesti. Postoji nekoliko oblika Aβ koji se prirodno pojavljuju. Prirodni humani oblici Aβ odnose se na Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 i Aβ43. Slijed aminokiselina ovih peptida i njihov odnos s APP prekursorom prikazani su na slici 1 u Hardy i sur., TINS 20, 155-158 (1977). Na primjer, Aβ42 ima slijedeću sekvencu:

H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-OH (SEQ ID NO:1).

Aβ41, Aβ40 i Aβ39 razlikuju se od Aβ42 po tome što im nedostaju redom Ala, Ala-Ile, odnosno Ala-Ile-Val na C-terminalnom kraju. Aβ43 se razlikuje od Aβ42 po tome što ima treoninski ostatak na C-terminalu.

APP695, APP751, i APP770 se odnose, redom, na polipeptide duljine 695, 751, odnosno 770 amino kiselinskih ostataka koje kodira humani APP gen. Vidi Kang i sur., Nature, 325, 773 (1987); Ponte i sur., Nature, 331, 525 (1988); i Kitaguchi i sur., Nature, 331, 530 (1988). Amino kiseline unutar humanog amiloidnog prekursorskog proteina (APP) pripisane su brojevima u skladu sa sekvencom izoforme APP770. Izrazi kao što su Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 i Aβ43 odnose se na Aβ pepetide koji redom sadrže amino kiselinske ostatke 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 odnosno 1-43.

Neagregirani Aβ ili njegovi fragmenti predstavljaju monomerne peptidne jedinice. Neagregirani Aβ ili njegovi fragmenti općenito su topljivi, te imaju sposobnost samo-agregiranja da bi nastali topljivi oligomeri. Oligomeri Aβ ili njegovi fragmenti uobičajeno su topljivi i postoje pretežno kao alfa-uzvojnice ili nasumce isprepleteno klupko. Jedna metoda pripremanja monomernog Aβ je otapanje liofiliziranog peptida u bezvodnom DMSO u ultrazvučnoj kupelji. Rezultirajuća otopina se centrifugira da bi se uklonile netopljive čestice. Agregirani Aβ ili njegovi fragmenti, predstavljaju oligomere Aβ ili njegove imunogene fragmente u kojima se monomerne jedinice drže na okupu putem nekovalentnih sila i udružuju se u netopljive skupine beta-ploha. Agregirani Aβ ili njegovi fragmenti, također predstavljaju fibrilarne polimere. Fibrili su obično netopljivi. Neka protutijela vežu bilo topljive Aβ ili njihove fragmente bilo agregirane Aβ ili njihove fragmente. Neka protutijela vežu oba, i topljive Aβ ili njihove fragmente i agregirane Aβ ili njihove fragmente. Neka protutijela vežu se na topljive Aβ i pri tome se ne vežu na plak.

ʺAntigenʺ je jedinka na koju se specifično veže protutijelo.

Izraz ʺepitopʺ ili ʺantigenski determinantʺ odnosi se na mjesto na antigenu na koje odgovaraju B i/ili T stanice. Epitopi B-stanica mogu biti sačinjeni od susjednih amino kiselina ili udaljenih amino kiselina poredanih jedne do druge tercijarnim slaganjem proteina. Epitopi sačinjeni od susjednih amino kiselina tipično se zadržavaju nakon izlaganja denaturirajućim otapalima dok se epitopi sačinjeni tercijarnim slaganjem tipično gube nakon djelovanja denaturirajućih otapala. Epitop tipično uključuje najmanje 3, a uobičajenije, najmanje 5 ili 8-10 amino kiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji. Metode određivanja prostorne konformacije epitopa uključuju, na primjer, kristalografiju x-zrakama i dvodimenzionalnu nuklearnu magnetnu rezonanciju. Vidi, npr., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, svezak 66, Glenn E. Morris, urednik (1966). Protutijela koja prepoznaju isti epitop mogu se prepoznati jednostavnim imuno-testom koji pokazuje sposobnost jednog protutijela da blokira vezanje drugog protutijela na ciljni antigen. T-stanice prepoznaju kontinuirane epitope od oko devet amino kiselina za CD8 stanice ili oko 13-15 amino kiselina za CD4 stanice. T stanice koje prepoznaju epitop mogu se identificirati in vitro testovima koji mjere proliferaciju ovisnu o antigenu, kao što se određuje pomoću ugrađivanja 3H-timidina od strane T-stanica kao odgovor na epitop (Burke i sur., J. Inf. Dis., 170, 1110-19 (1994)), pomoću usmrćivanja stanica ovisnog o antigenu (test citotoksičnog T limfocita, Tigges i sur., J. Immunol., 156, 3901-3910) ili pomoću izlučivanja citokina.

N-terminalni epitop Aβ predstavlja epitop s aminokiselinskim ostacima 1-11. Epitop u C-terminalnom području predstavlja epitop unutar aminokiselinskih ostataka 29-43, i epitop u središnjem području predstavlja epitop s aminokiselinskim ostacima 12-28.

Izraz ʺimunološkiʺ ili ʺimuniʺ odgovor predstavlja razvijanje korisnog humoralnog (posredstvom protutijela) i/ili staničnog (posredstvom antigen-specifičnih T stanica ili njihovih proizvoda izlučivanja) odgovora usmjerenog protiv amiloidnog peptida u pacijenta primaoca. Takav odgovor može biti aktivni odgovor pobuđen primjenom imunogena ili pasivni odgovor pobuđen primjenom protutijela ili temeljnih T-stanica. Stanični imuni odgovor izazvan je prisutnošću polipeptidnih epitopa zajedno s MCH molekulama I razreda ili II razreda da bi se aktivirale antigen specifične CD4+ T stanice pomoćnice i/ili CD8+ citotoksične T stanice. Odgovor također može uključivati aktivaciju monocita, makrofaga, NK stanica, bazofila, dendritičnih stanica, astrocita, mikroglija stanica, eozinofila ili drugih sastavnih dijelova urođenog imuniteta. Prisutnost imunološkog odgovora posredstvom stanica može se odrediti testovima proliferacije (CD4+ T stanica) ili CTL testovima (citotoksični T limfocit) (vidi Burke, gore navedeno; Tigges, gore navedeno). Relativni doprinos humoralnog i staničnog odgovora zaštitnom ili terapijskom učinku imunogena može se razlikovati zasebno izoliranjem protutijela i T-stanica iz imunizirane singenične životinje te mjerenjem zaštitnih ili terapijskih učinaka u drugom subjektu.

ʺImunogeno sredstvoʺ ili ʺimunogenʺ sposobno je pobuditi imunološki odgovor na samog sebe nakon unošenja u životinju, po izboru u spoju s pomoćnim sredstvom.

Izraz ʺgoli polinukleotidʺ odnosi se na polinukleotid koji nije u kompleksu s koloidnim materijalima. Goli polinukleotidi su ponekad klonirani u plazmidnom vektoru.

Izraz ʺpomoćno sredstvoʺ odnosi se na spoj koji kada se primijeni u spoju s antigenom pojačava imuni odgovor na taj antigen, ali kada se primijeni sam ne stvara imuni odgovor na antigen. Pomoćna sredstva mogu pojačati imuni odgovor putem nekoliko mehanizama uključujući obnavljanje limfocita, stimulaciju B i/ili T stanica, te stimulaciju makrofaga.

Izraz ʺpacijentʺ uključuje humane i druge subjekte sisavce koji primaju bilo profilaktički bilo terapijski tretman.

Kompeticija između protutijela određuje se testom u kojem imunoglobulin koji se testira inhibira specifično vezanje referentnog protutijela na zajednički antigen, kao što je Aβ. Poznati su brojni tipovi testova kompetitivnog vezanja, na primjer: neposredni ili posredni radioimuno test čvrste faze (RIA), neposredni ili posredni enzimski imuno test čvrste faze (EIA), sendvič test kompeticije (vidi Stahli i sur., Methods in Enzymology, 9:242-253 (1983)); biotin-avidin EIA čvrste faze (vidi Kirkland i sur., J. Immunol. 137:3614-3619 (1986)); test neposrednog obilježivača čvrste faze, neposredni obilježeni sendvič test čvrste faze (vidi Harlow i Lane, ʺAntibodies, A Laboratory Manualʺ, Cold Spring Harbor Press (1988)); neposredni RIA čvrste faze uz primjenu I-125 kao obilježivača (vidi Morel i sur., Molec. Immunol. 25(1):7-15 (1988)); neposredni biotin-avidin EIA čvrste faze (Cheung i sur., Virology, 176:546-552 (1990)); i neposredni RIA s obilježivačem (Moldenhauer i sur., Scand. J. Immunol., 32:77-82 (1990)). Tipično, takvi testovi uključuju uporabu pročišćenih antigena vezanih na čvrstu površinu ili stanice koje nose oba, neobilježeni test imunoglobulin i obilježeni referentni imunoglobulin. Kompetitivna inhibicija mjeri se određivanjem količine obilježivača vezanog na čvrstu površinu ili stanice u prisutnosti test imunoglobulina. Uobičajeno je test imunoglobulin prisutan u suvišku. Protutijela identificirana testom kompeticije (kompetirajuća protutijela) uključuju protutijela koja se vežu za isti epitop kao i referentno protutijelo te protutijela koja se vežu za susjedni epitop koji je dovoljno blizu epitopu na koji je vezano referentno protutijelo da ne dođe do prostornih smetnji. Obično, kada je kompetirajuće protutijelo prisutno u suvišku, ono će inhibirati specifično vezanje referentnog protutijela na zajednički antigen najmanje 50 ili 75%.

Protutijelo koje se specifično veže za topljivi Aβ predstavlja protutijelo koje se veže za topljivi Aβ s afinitetom od najmanje 107 M-1. Neka protutijela vežu se za topljivi Aβ s afinitetima između 108 M-1 i 1011 M-1.

Protutijelo koje se specifično veže na topljivi Aβ bez specifičnog vezanja na plakove predstavlja protutijelo koje se veže na topljivi Aβ kao što je opisano iznad i ima najmanje deseterostruko ili obično najmanje 100 puta niži afinitet specifičnog vezanja za plakove (tj., Aβ u obliku agregirane β-nabrane plohe) iz kadavera Alzheimer pacijenta ili modela transgenične životinje. Na primjer, takvo se protutijelo može vezati na topljivi Aβ s afinitetom od 109 M-1 te na plakove s afinitetom manjim od 107 M-1. Afinitet takvih protutijela za plakove je obično manji od 107 ili 106 M-1. Takva protutijela se dodatno ili alternativno definiraju intenzitetom fluorescencije relativno prema sporednom kontrolnom protutijelu (npr., protutijelo ili smjesa poliklonalnih protutijela na reverzni izomer Aβ peptida) kada su protutijela u dodiru s plakovima i vezanje se određuje putem označavanja fluorescencijom (kako je opisano u odjeljku Primjeri). Intenzitet fluorescencije protutijela koja se vežu na topljivi Aβ peptid bez vezanja na plakove iznosi unutar faktora pet, ponekad unutar faktora dva a ponekad se ne može razlikovati unutar eksperimentalne pogreške od intenziteta kontrolnog protutijela.

Pripravci ili metode ʺkoji sadržavajuʺ jedan ili više nabrojanih elemenata mogu uključivati druge elemente koji nisu specifično nabrojani. Na primjer, pripravak koji sadrži Aβ peptid obuhvaća oba i izolirani Aβ peptid i Aβ peptid kao komponentu većeg polipeptidnog slijeda.

III. Aβ peptidi za aktivnu imunizaciju

Aβ peptidi za uporabu u metodama ovog izuma su imunogeni peptidi koji nakon primjene u humanog pacijenta ili životinje stvaraju protutijela koja se specifično vežu za jedan ili više epitopa između ostataka 12 i 43 bez stvaranja protutijela koja se specifično vežu za jedan ili više epitopa unutar ostataka 1-11 na Aβ. Protutijela koja se specifično vežu za epitope između ostataka 12 i 43 specifično se vežu na topljivi Aβ bez vezanja na plakove Aβ. Ovi tipovi protutijela mogu se specifično vezati na topljivi Aβ u krvotoku pacijenta ili amiloidnom modelu bez specifičnog vezanja na plakove Aβ nakupina u mozgu pacijenta ili modela. Specifično vezanje protutijela na topljivi Aβ inhibira ugrađivanje Aβ u plakove te time ili sprječava razvijanje plakova u pacijenta ili sprječava daljnji porast veličine ili učestalosti plakova ukoliko su se takvi plakovi već razvili prije primjene tretmana.

Pogodnije, u primijenjenom Aβ fragmentu nedostaje epitop koji bi stvorio odgovor T-stanica na fragment. Općenito, epitopi T-stanica su veći od 10 susjednih amino kiselina. Stoga, su preferirani fragmenti Aβ veličine 5-10 ili pogodnije 7-10 susjednih amino kiselina, tj., dovoljno dugački da stvore odgovor protutijela bez stvaranja odgovora T-stanica. Odsutnost epitopa T-stanica je pogodnija zbog toga što ti epitopi nisu potrebni za imunogeno djelovanje fragmenata, i mogu prouzrokovati neželjene upalne odgovore u dijelu pacijenata (Anderson i sur., (2002) J. Immunol. 168, 3697-3701; Senior (2002) Lancet Neurol. 1, 3). U nekim metodama, fragment je neki drugi fragment osim Aβ13-28, 17-28, 25-35, 35-40, 33-42 ili 35-42. Većina epitopa T-stanica pojavljuje se unutar amino kiselina 14-30 u Aβ.

Fragment Aβ15-24 i njegovi pod-fragmenti od 7-9 susjednih amino kiselina su pogodniji zbog toga što ovi peptidi dosljedno stvaraju visoki imunogeni odgovor na Aβ peptid. Ovi fragmenti uključuju Aβ15-21, Aβ16-22, Aβ17-23, Aβ18-24, Aβ19-25, Aβ15-22, Aβ16-23, Aβ17-24, Aβ18-25, Aβ15-23, Aβ16-24, Aβ17-25, Aβ18-26, Aβ15-24, Aβ16-25 i Aβ15-25. Oznaka Aβ15-21 na primjer, ukazuje na fragment koji uključuje ostatke 15-21 na Aβ i nedostaju mu drugi ostaci s Aβ. Prednost imaju također C-terminalni fragmenti Aβ42 ili 43 od 5-10 te pogodnije 7-10 susjednih amino kiselina. Ovi fragmenti mogu stvoriti odgovor protutijela koji uključuje protutijela specifična za završetak. Ova protutijela imaju prednost po specifičnom vezanju na Aβ42 i Aβ43 bez specifičnog vezanja na Aβ39-41. Ova protutijela vežu se na topljivi Aβ bez vezanja na plakove.

U nekim metodama, fragmenti iz središnjeg ili C-terminalnog područja Aβ primjenjuju se na način koji također uključuje primjenu fragmenta iz N-terminalnog područja. Općenito, takvi fragmenti pobuđuju protutijela koja se specifično vežu na amiloidne plakove i induciraju njihovo čišćenje preko fagocitoznih stanica. Takav odgovor osobito je koristan za čišćenje postojećih nakupina Aβ. Međutim, jednom kada se nakupine očiste, daljnji tretman s fragmentom iz središnjeg ili C-terminalnog područja Aβ da bi se inducirala protutijela na topljivi Aβ ima prednost u sprječavanju daljnjeg nakupljanja Aβ bez rizika od upalnih popratnih učinaka u nekih pacijenata. N-terminalni fragmenti koji započinju ostacima 1-3 Aβ i završavaju ostacima 7-11 Aβ osobito su pogodni. Primjerni N-terminalni fragmenti uključuju Aβ1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 3-7, 1-3, i 1-4.

Ukoliko nije drugačije navedeno, referenca na Aβ uključuje humane amino kiselinske sljedove na koje je ukazano iznad kao i njihove analoge uključujući alelne varijante, varijante vrste i inducirane varijante. Analozi Aβ induciraju protutijela koja se specifično vežu s prirodnim Aβ peptidom (npr., Aβ42). Analozi Aβ tipično se razlikuju od peptida koji se pojavljuju prirodno u do 30% položaja amino kiselina prema do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 promjena položaja. Svako brisanje ili zamjena prirodnih amino kiselinskih ostataka smatra se promjenom položaja kao što je i ubacivanje ostatka bez zamjene. Zamjene amino kiselina često su konzervativne zamjene.

Ukoliko nije drugačije navedeno, referenca na Aβ uključuje fragmente humanih amino kiselinskih sljedova na koje je ukazano iznad kao i njihove analoge uključujući alelne varijante, varijante vrste i inducirane varijante. Analozi Aβ fragmenata induciraju protutijela koja se specifično vežu s prirodnim Aβ peptidom (npr., Aβ42). Analozi Aβ fragmenata tipično se razlikuju od peptida koji se pojavljuju prirodno u do 30% položaja amino kiselina. Na primjer, analog Aβ15-21 može varirati u promjenama položaja do 1, 2, 3, ili 4. Svako brisanje ili zamjena prirodnih amino kiselinskih ostataka smatra se promjenom položaja kao što je i ubacivanje ostatka bez zamjene. Zamjene amino kiselina često su konzervativne zamjene.

Neki analozi Aβ ili Aβ fragmenata također uključuju amino kiseline koje nisu prirodne ili modifikacije na N ili C terminalnim amino kiselinama na jednom, dva, pet, deset ili čak na svim položajima. Na primjer, prirodna aspartanska kiselina na položaju 1 i/ili 7 na Aβ može se zamijeniti s izo-aspartanskom kiselinom. Primjeri amino kiselina koje nisu prirodne su D, alfa, alfa-disupstituirane amino kiseline, N-alkil amino kiseline, laktatna kiselina, 4-hidroksiprolin, gama-karboksiglutamat, epsilon-N,N,N-trimetillizin, epsilon-N-acetillizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, omega-N-metilarginin, β-alanin, ornitin, norleucin, norvalin, hidroksiprolin, tiroksin, gama-amino butirna kiselina, homoserin, citrulin, i izoaspartanska kiselina. Neka terapijska sredstva ovog izuma su cjelokupno D peptidi, npr., cjelokupno D Aβ ili cjelokupno D Aβ fragment, i analozi cjelokupnih D peptida. Fragmenti i analozi mogu se ispitati prema njihovoj profilaktičkoj ili terapijskoj učinkovitosti u transgeničnim mišjim modelima u usporedbi s netretiranim ili placebo kontrolama kao što je opisano niže.

Aβ, njegovi fragmenti, i analozi mogu se sintetizirati peptidnom sintezom čvrste faze ili rekombinantnom ekspresijom, ili se mogu dobiti iz prirodnih izvora. Uređaji za automatsko sintetiziranje peptida su komercijalno dostupni od brojnih dobavljača, kao što je Applied Biosystems, Foster City, Kalifornija. Rekombinantna ekspresija može se raditi na bakterijama, kao što je E. coli, kvascu, stanicama insekata ili stanicama sisavaca. Postupke rekombinantne ekspresije opisali su Sambrook i sur., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY, 2. izdanje, 1989). Neki oblici Aβ peptida također su komercijalno dostupni (npr., American Peptides Company, Inc., Sunnyvale, Kalifornija i California Peptide Research, Inc., Napa, Kalifornija).

Terapijska sredstva također uključuju dulje polipeptide koji uključuju, na primjer, imunogene fragmente Aβ peptida, zajedno s jednom ili više amino kiselina koje stoje s boka Aβ peptida s jedne ili s obje strane. Na primjer, sredstva koja su pogodnija uključuju fuzijske proteine koji se sastoje od segmenta Aβ koji je stopljen s heterolognim slijedom amino kiselina koji inducira odgovor T-stanica protiv heterolognog slijeda amino kiselina a time i odgovor B-stanica protiv Aβ segmenta. Jedna ili više bočno vezanih heterolognih amino kiselina također se mogu rabiti za pokrivanje Aβ peptida kako bi se zaštitio od razgradnje pri proizvodnji, pohranjivanju ili uporabi. Takvi polipeptidi mogu se ispitati prema njihovoj profilaktičkoj ili terapijskoj učinkovitosti u životinjskim modelima u usporedbi s netretiranim ili placebo kontrolama kao što je opisano niže. Terapijska sredstva ovog izuma uključuju imunogene fragmente Aβ na koji su bočno vezani sljedovi polilizina. Sljedovi polilizina mogu se uklopiti na N-kraju, C-kraju, ili na oba N- i C-kraja Aβ ili imunogenog fragmenta Aβ. Aβ peptid, analog, aktivni fragment ili drugi polipeptid mogu se primijeniti u asociranom ili multimetnom obliku ili u disociranom obliku. Terapijska sredstva također uključuju multimere monomernih imunogenih sredstava.

U daljnjoj varijaciji, imunogeni fragment Aβ može se predstaviti virusom ili bakterijom kao dijelom imunogenog pripravka. Nukleinska kiselina koja kodira imunogeni peptid uklopljena je u genom ili epizom virusa ili bakterije. Prema izboru, nukleinska kiselina je uklopljena na takav način da se imunogeni peptid eksprimira kao izlučeni protein ili kao fuzijski protein s vanjskom proteinskom površinom virusa ili transmembranski protein bakterije tako da je peptid izložen. Virusi ili bakterije koji se rabe u takvim metodama trebaju biti nepatogeni ili oslabljeni. Pogodni virusi uključuju adenovirus, HSV, virus venecuelanskog konjskog encefalitisa i druge alfa viruse, virus vezikularnog stomatitisa, i druge rabdo viruse, kravlje boginje i ptičje boginje. Pogodne bakterije uključuju vrste Salmonella i Shigella. Osobito je pogodna fuzija imunogenog peptida s HBsAg na HBV.

Terapijska sredstva također uključuju peptide i druge spojeve koji nemaju nužno značajnu sličnost amino kiselinskog slijeda s Aβ ali usprkos tome služe kao spojevi koji oponašaju Aβ i induciraju sličan imuni odgovor. Na primjer, može se ispitati pogodnost bilo kojih peptida ili proteina koji tvore β-nabrane plohe. Također se mogu rabiti anti-idiotipična protutijela protiv monoklonalnih protutijela na Aβ ili drugi amiloidogenični peptidi. Takva anti-Id protutijela oponašaju antigen i stvaraju imuni odgovor na njega (vidi Essential Immunology (Roit urednik, Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, 6. izdanje), str. 181). Sredstva osim Aβ peptida trebala bi inducirati imunogeni odgovor protiv jednog ili više preferiranih segmenata Aβ nabrojanih iznad (npr., 15-24). Pogodnije, takva sredstva induciraju imunogeni odgovor koji je specifično usmjeren na jedan od ovih segmenata bez da je usmjeren na druge segmente Aβ.

Također se može ispitati pogodnost u bibliotekama nasumice odabranih peptida ili drugih spojeva. Mogu se napraviti biblioteke kombinacija za mnogo tipova spojeva koji se mogu sintetizirati na način korak po korak. Takvi spojevi uključuju polipeptide, spojeve koji oponašaju beta zavoje, polisaharide, fosfolipide, hormone, prostaglandine, steroide, aromatske spojeve, heterocikličke spojeve, benzodiazepine, oligomerne N-supstituirane glicine i oligokarbamate. Velike biblioteke kombinacija spojeva mogu se konstruirati metodom kodiranih sintetskih biblioteka (ESL) opisanom u Affymax, WO 95/35503 i Scripps, WO 95/30642 (svaki od njih uključen je navodom za sve svrhe). Također je moguće napraviti biblioteke peptida metodom izloženog faga. Vidi, npr., Devlin, WO 91/18980.

Na početku se ispitaju prema pogodnosti biblioteke kombinacija i drugi spojevi tako da se odredi njihov kapacitet za specifično vezanje na protutijela ili limfocite (B ili T) za koje je poznato da su specifični za Aβ ili druge amiloidogene peptide. Na primjer, početna ispitivanja mogu se provesti s bilo kojim poliklonalnim serumom ili monoklonalnim protutijelom na Aβ ili njegov fragment. Spojevi se zatim mogu ispitati prema specifičnom vezanju na specifični epitop na Aβ (npr., 15-24). Spojevi se zatim testiraju istim postupcima opisanim za izradu mapa specifičnosti epitopa na protutijelu. Spojevi identificirani takvim ispitivanjima se zatim dalje analiziraju na kapacitet za induciranje protutijela ili reaktivnih limfocita na Aβ ili njegove fragmente. Na primjer, višestruka razrjeđenja seruma mogu se testirati na mikrotitar pločicama koje se prethodno oblože s Aβ ili njegovim fragmentom i može se provesti standardna ELISA za testiranje reaktivnih protutijela na Aβ ili njegov fragment. Zatim se spojevi mogu testirati na profilaktičku i terapijsku učinkovitost u transgeničnih životinja koje su predisponirane za amiloidogeničnu bolest, kao što je opisano u poglavlju Primjeri. Takve životinje uključuju, na primjer, miševe koji nose mutaciju 717 na APP koju su opisali Games i sur., navedeno iznad, i miševe koji nose švedsku mutaciju 670/671 na APP koju su opisali McConlogue i sur., US 5,612,486 i Hisao i sur., Science, 274, 99 (1996); Staufenbiel i sur., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:13287-13292 (1997); Sturchler-Pierrat i sur., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:13287-13292 (1997); Borchelt i sur., Neuron, 19:939-945 (1997)). Isti ispitivački pristup može se primijeniti na druga potencijalna sredstva analoge Aβ i dulje peptide uključujući fragmente Aβ, opisan niže.

IV. Konjugati

Neka sredstva za induciranje imunog odgovora sadrže odgovarajući epitop za indukciju imunog odgovora na LB-ove ali su premali da bi bili imunogeni. U toj situaciji, peptid imunogen može se spojiti sa pogodnom molekulom nosačem da bi se stvorio konjugat koji pomaže izazvati imuni odgovor. Samo jedno sredstvo može se spojiti sa samo jednim nosačem, višestruke kopije sredstva mogu se spojiti s višestrukim kopijama nosača, koji su opet spojeni jedni s drugima, višestruke kopije sredstva mogu biti spojene s jednom kopijom nosača, ili jedna kopija sredstva može biti spojena s višestrukim kopijama nosača, ili različitim nosačima. Pogodni nosači uključuju serumske albumine, hemocijanin priljepka, molekule imunoglobulina, tiroglobulin, ovalbumin, tetanus toksoid, ili toksoid iz drugih patogenih bakterija, kao što su difterija, E. coli, kolera, ili H. pylori, ili oslabljeni derivat toksina. Epitopi T stanica također su pogodne molekule nosača. Neki konjugati mogu nastati spajanjem sredstava ovog izuma s imunostimulacijskom polimernom molekulom (npr., tripalmitoil-S-glicerin cistein (Pam3Cys), manan (polimer manoze), ili glukan (beta 1→2 polimer)), citokinima (npr., IL-1, IL-1 alfa i beta, i RANTES). Imunogena sredstva mogu se također spojiti s peptidima koji pojačavaju transport preko tkiva, kao što je opisano u O'Mahony, WO 97/17613 i WO 97/17614. Imunogeni se mogu spojiti s nosačima sa ili bez amino kiselina koje prave razmak (npr., gly-gly).

Neki konjugati mogu nastati spajanjem sredstava ovog izuma s najmanje jednim epitopom T stanica. Neki epitopi T stanica su mješoviti dok su neki epitopi T stanica univerzalni. Mješoviti epitopi T stanica sposobni su pojačati indukciju imunosti T stanica u cijelom nizu subjekata ispoljavajući niz HLA tipova. Za razliku od mješovitih epitopa T stanica, univerzalni epitopi T stanica sposobni su pojačati indukciju imunosti T stanica u visokom postotku, npr., najmanje 75%, od subjekata koji ispoljavaju niz HLA molekula kodiranih različitim HLA-DR alelima.

Postoji veliki broj epitopa T-stanica koji se pojavljuju prirodno, kao što su, toksoid tetanusa (npr., epitopi P2 i P30), antigen površine hepatitisa B, toksoid hripavca, F protein virusa ospica, glavni protein vanjske membrane Chlamydia trachomitis, toksoid difterije, cirkumsporozit T Plasmodium falciparum, CS antigen Plasmodium falciparum, trioza fosfat izomeraza Schistosoma mansoni, TraT Escherichia coli, i hemaglutinin (HA) virusa gripe. Imunogeni peptidi ovog izuma mogu se također konjugirati s epitopima T-stanica opisanim u Sinigaglia F. i sur., Nature, 336:778-780 (1998); Chicz R.M. i sur., J. Exp. Med., 178:27-47 (1993); Hammer J. i sur., Cell 74:197-203 (1993); Falk K. i sur., Immunogenetics, 39:230-242 (1994); WO 98/23635; i Southwool S. i sur. J. Immunology, 160:3363-3373 (1998) (svaki od njih je navodom uključen ovdje u svojoj potpunosti za sve svrhe). Daljnji primjeri uključuju:

hemaglutinin gripe: HA307-319

malarija CS: T3 epitop EKKIAKMEKASSVFNV (SEQ ID br:4)

antigen površine hepatitisa B: HBsAg19-28 FFLLTRILTI (SEQ ID br:5)

protein toplinskog šoka 65: hsp65153-171 DQSIGDLIAEAMDKVGNEG (SEQ ID br:6)

Calmette-Guerin bacil: qvhfqplppAVVKL (SEQ ID br:7)

toksoid tetanusa: TT830-844 QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID br:8)

toksoid tetanusa: TT947-967 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID br:9)

HIV gp120 T1: KQIINMWQEVGKAMYA (SEQ ID br:10).

Alternativno, konjugati mogu nastati povezivanjem sredstava ovog izuma s najmanje jednim umjetnim epitopom T-stanica sposobnim za vezanje velike količine molekula II razreda MHC, kao što je epitop pan DR (ʺPADREʺ). PADRE je opisan u patentima US 5,736141, WO 95/07707, i u Alexander J i sur., Immunity, 1:751-761 (1994) (svaki od njih je navodom uključen ovdje u svojoj potpunosti za sve svrhe). Preferirani PADRE peptid je AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID br:11), (zajednički ostaci su otisnuti podebljano) gdje je X pogodnije cikloheksilalanin, tirozin ili fenilalanin, pri čemu je cikloheksilalanin najpogodniji.

Imunogena sredstva mogu se povezati s nosačima kemijskom unakrsnom vezom. Tehnike povezivanja imunogena s nosačem uključuju stvaranje disulfidnih poveznica putem N-sukcinimidil-3-(2-piridil-tio) propionata (SPDP) i sukcinimidil 4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilata (SMCC) (ukoliko peptid nema suflhidrilnu skupinu, to se može postići dodavanjem cisteinskog ostatka). Ovi reagensi stvaraju disulfidne veze međusobno i između peptidnog cisteinskog ostatka na jednom proteinu i amidne veze preko epsilon-amino skupine na lizinu, ili druge slobodne amino skupine na drugim amino kiselinama. Razne vrste takvih sredstava koja tvore disulfid/amid opisane su u Immun. Rev. 62, 185 (1982). Druga bifunkcionalna sredstva za spajanje radije tvore tioetere nego disulfidne veze. Mnoga od tih sredstava koja tvore tioeter su komercijalno dostupna i uključuju reaktivne estere 6-maleimidokapronske kiselina, 2-bromooctene kiselina, i 2-jodooctene kiseline, 4-(N-maleimido-metil)cikloheksan-1-karboksilne kiseline. Karboksilne skupine mogu se aktivirati njihovim kombiniranjem sa sukcinimidom ili 1-hidroksil-2-nitro-4-sulfonskom kiselinom, natrijeva sol.

Imunogenost se može unaprijediti dodavanjem ostataka koji prave razmak (npr., gly-gly) između Th epitopa i imunogenog peptida ovog izuma. Osim toga što fizički razdvajaju Th epitop od epitopa B stanica (tj., imunogenog peptida), ostaci glicina mogu razoriti bilo koju umjetnu sekundarnu strukturu stvorenu združivanjem Th epitopa s imunogenim peptidom, i time otkloniti smetnje između odgovora T i/ili B stanica. Konformacijsko razdvajanje između epitopa pomagača i domene koja izaziva protutijelo dakle omogućuje učinkovitije interakcije između ovog imunogena i odgovarajućih Th i B stanica.

Da bi se pojačala indukcija imunosti T stanica u velikom postotku subjekata koji pokazuju različite HLA tipove na sredstvo ovog izuma, može se pripremiti smjesa konjugata s različitim epitopima Th stanica. Ta smjesa može sadržavati smjesu od najmanje dva konjugata s različitim epitopima Th stanica, smjesu od najmanje tri konjugata s različitim epitopima Th stanica, ili smjesu od najmanje četiri konjugata s različitim epitopima Th stanica. Smjesa se može primijeniti s pomoćnim sredstvom.

Imunogeni peptidi također se mogu predstaviti kao fuzijski proteini s nosačima (tj., heterologni peptidi). Imunogeni peptid može za nosač biti povezan na svom amino kraju, svom karboksilnom kraju, ili na oba kraja. Po izboru, u fuzijskom proteinu mogu biti prisutna višestruka ponavljanja imunogenog peptida. Po izboru, imunogeni peptid može se povezati s višestrukim kopijama heterolognog peptida, na primjer, na oba i N- i C- kraja peptida. Po izboru, višestruke kopije imunogenog peptida mogu se povezati s višestrukim kopijama heterolognog peptida, koji su povezani jedan za drugog. Neki peptidi nosači služe za induciranje odgovora T-stanica pomoćnica na peptid nosača. Inducirane T-stanice pomoćnice nadalje induciraju odgovor B-stanica na imunogeni peptid povezan na nosač.

Neki primjeri fuzijskih proteina pogodnih za uporabu u ovom izumu prikazane su niže. Neki od tih fuzijskih proteina sadrže segmente Aβ povezane na epitope tetanus toksoida kao što je opisano u patentima US 5,196,512, EP 378,881 i EP 427,347. Neki fuzijski proteini sadrže segmente Aβ povezane na najmanje jedan PADRE peptid opisan u patentu US 5,726,142. Neki heterologni peptidi su mješoviti epitopi T-stanica, dok su drugi heterologni peptidi univerzalni epitopi T-stanica. U nekim metodama, sredstvo za primjenu je jednostavno jedan fuzijski protein s Aβ segmentom povezanim na heterologni segment u linearnoj konfiguraciji. Terapijska sredstva ovog izuma mogu se predstaviti primjenom formule. Na primjer, u nekim metodama, sredstvo je multimer fuzijskih proteina predstavljeno formulom 2x, gdje je x cijeli broj od 1-5. Pogodnije je da x bude 1, 2 ili 3, pri čemu je 2 najpogodnije. Kada je x dva, takav multimer ima četiri fuzijska proteina povezana u preferiranu konfiguraciju koja se naziva MAP4 (vidi US 5,229,490).

Konfiguracija MAP4 prikazana je niže, pri čemu su granate strukture napravljene započinjanjem sinteze peptida na oba dva kraja, N terminalnom i aminima lizina u postranom lancu. Ovisno o tome koliko je puta lizin uključen u amino kiselinski slijed i koliko mu je puta omogućeno da se grana, rezultirajuća struktura će predstavljati višestruke N krajeve. U ovom primjeru, napravljena su četiri identična N kraja na razgrananoj jezgri koja sadrži lizin. Takva višestrukost uvelike pojačava sposobnost odgovora srodnih B stanica. U primjerima niže, Z predstavlja imunogeni fragment Aβ, a Z1-4 predstavlja imunogeni(e) fragment(e) Aβ. Fragmenti mogu biti isti ili drugačiji jedan od drugoga.

[image]

Drugi primjeri fuzijskih proteina uključuju:

Z-tetanus toksoid 830-844 u MAP4 konfiguraciji:

Z-QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID br:12)

Z-tetanus toksoid 947-967 u MAP4 konfiguraciji:

Z-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID br:13)

Z-tetanus toksoid 830-844 u MAP4 konfiguraciji:

Z-QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID br:14)

Z-tetanus toksoid 830-844 + 947-967 u linearnoj konfiguraciji:

Z-QYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID br:15)

PADRE peptid (svi u linearnim konfiguracijama), gdje je X pogodnije cikloheksilalanin, tirozin ili fenilalanin, pri čemu je cikloheksilalanin najpogodniji-Z:

AKXVAAWTLKAAA-Z (SEQ ID br:16)

Z × 3-PADRE peptid:

Z-Z-Z-AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID br:17)

Z-ovalbumin 323-339 u linearnoj konfiguraciji:

Z-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID br:20)

Daljnji primjeri fuzijskih proteina uključuju:

AKXVAAWTLKAAA-Z-Z-Z-Z (SEQ ID br:18)

Z-AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID br:19)

PKYVKQNTLKLAT-Z-Z-Z (SEQ ID br:21)

Z-PKYVKQNTLKLAT-Z (SEQ ID br:22)

Z-Z-Z-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID br:23)

Z-Z-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID br:24)

Z-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKASSVFNV-QYIKANSKFIGITEL-

FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-Z-

Z-Z-Z-QYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID br:25)

Z-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-Z-

QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-Z (SEQ ID br:26)

Z-QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID br:27) na 2 granatoj smoli: fragmenti mogu biti isti ili drugačiji jedan od drugoga.

[image]

Isti ili slični proteini nosači i metode povezivanja mogu se rabiti za stvaranje imunogena koji će se uporabiti za stvaranje protutijela na Aβ ili imunogeni fragment Aβ. Na primjer, Aβ ili imunogeni fragment Aβ povezani s nosačem mogu se dati laboratorijskoj životinji u proizvodnji monoklonalnih protutijela za Aβ ili imunogeni fragment Aβ.

V. Nukleinske kiseline koje kodiraju terapijska sredstva

Imuni odgovori na amiloidne nakupine mogu se također inducirati primjenom nukleinskih kiselina koje kodiraju segmente Aβ peptida, i njegovih fragmenata, drugih peptida imunogena, ili protutijela i njihovih sastavnih lanaca koji se rabe za pasivnu imunizaciju. Takve nukleinske kiseline mogu biti DNA ili RNA. Segment nukleinske kiseline koji kodira imunogen tipično je povezan s elementima za regulaciju, kao što su promotor i pojačivač, koji dozvoljavaju ekspresiju DNA segmenta u željenoj ciljnoj stanici pacijenta. Za ekspresiju u krvnim stanicama, što je poželjno za indukciju imunog odgovora, elementi promotor i pojačivač iz lakog ili teškog lanca imunoglobulinskog gena ili CMV glavni intermedijerni rani promotor i pojačivač pogodni su za neposrednu ekspresiju. Povezani elementi za regulaciju i kodirajuće sekvence često se kloniraju u vektor. Za primjenu dvolančanih protutijela, dva lanca se mogu klonirati u isti ili odvojene vektore. Nukleinske kiseline koje kodiraju terapijska sredstva ovog izuma mogu također kodirati najmanje jedan epitop T stanica. Ovdje otkrića koja se odnose na uporabu pomoćnih sredstava i na uporabu nosača vrijede uz neophodne promjene i njihovoj uporabi s nukleinskim kiselinama koje kodiraju terapijska sredstva ovog izuma.

Na raspolaganju je niz virusnih vektorskih sustava uključujući retrovirusne sustave (vidi, npr., Lawrie i Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109 (1993)); adenovirusne vektore (vidi, npr., Bett i sur., J. Virol. 67, 5911 (1993)); adeno-asocirane virusne vektore (vidi, npr., Zhou i sur., J. Exp. Med. 179, 1867 (1994)), virusne vektore iz porodice boginja uključujući virus kravljih boginja i viruse ptičjih boginja, virusne vektore iz roda alfa virusa kao što su oni izvedeni iz Sindbis i Semliki Forest virusa (vidi, npr., Dubensky i sur., J. Virol. 70, 508-519 (1996)), venecuelanski virus konjskog encefalitisa (vidi US 5,643,576) i rabdovirusi, kao što je virus vezikularnog stomatitisa (vidi WO 96/34625) i papilomavirusi (Ohe i sur., Human Gene Therapy 6, 325-333 (1995); Woo i sur., WO 94/12629 i Xiao i Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996)).

DNA koja kodira imunogen, ili vektor koji sadrži istu, može se pakirati u liposome. Pogodni lipidi i srodni analozi opisani su u US 5,208,036, 5,264,618, 5,279,833 i 5,283,185. Vektori i DNA koja kodira imunogen mogu se također adsorbirati na čestice nosača ili asocirati s česticama nosača, čiji primjeri uključuju polimere polimetil metakrilat te polilaktide i poli(laktid-ko-glikolide), vidi, npr., McGee i sur., J. Micro. Encap. (1996).

Vektori za gensku terapiju ili gola DNA može se dati in vivo primjenom pojedinačnom pacijentu, tipično sustavnom primjenom (npr., intravenski, intraperitonealno, nazalno, gastralno, intradermalno, intramuskularno, subdermalno, ili intrakranijskom infuzijom) ili topičkom primjenom (vidi, npr., US 5,399,346). Takvi vektori mogu nadalje uključivati olakšavajuća sredstva kao što je bupivacin (US 5,593,970). DNA se također može primijeniti pomoću genske puške. (Vidi Xiao i Brandsma, iznad). DNA koja kodira imunogen istaloži se na površinu mikroskopskih metalnih kuglica. Mikroprojektili se ubrzavaju udarnim valom ili plinom helijem koji se širi, i prodiru u tkiva do dubine od nekoliko slojeva stanica. Na primjer, pogodan je uređaj The AccelTM Gene Delivery Device koji proizvodi Agacetus, Inc. Middleton WI. Kao druga mogućnost, gola DNA može proći kroz kožu u krvotok jednostavno stavljanjem DNA na kožu uz kemijsku ili mehaničku iritaciju (vidi WO 95/05853).

U daljnjoj varijaciji, vektorima kodirani imunogeni mogu se unijeti u stanice ex vivo, kao što su stanice eksplantirane iz pojedinog pacijenta (npr., limfociti, aspirati koštane srži, biopsija tkiva) ili univerzalnog donora hematopoetskih matičnih stanica, nakon čega slijedi ponovna implantacija stanica u pacijenta, obično nakon odabira stanica koje imaju u sebe ugrađen vektor.

VI. Pomoćna sredstva

Imunogena sredstva ovog izuma, kao što su peptidi, ponekad se primjenjuju u kombinaciji s pomoćnim sredstvom. Pomoćno sredstvo povećava titar induciranih protutijela i/ili afinitet vezanja induciranih protutijela ovisno o situaciji ukoliko se peptid rabi sam. Mnogobrojna pomoćna sredstva mogu se rabiti u kombinaciji s imunogenim fragmentom Aβ, da bi se izazvao imuni odgovor. Preferirana pomoćna sredstva uvećavaju unutrašnji odgovor na imunogen bez uzrokovanja konformacijskih promjena na imunogenu koje utječu na kvalitativni oblik odgovora. Preferirana pomoćna sredstva uključuju aluminijev hidroksid i aluminijev fosfat, 3 de-O-acetilirani monofosforil lipid A (MPLTM) (vidi GB 2220211 (RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Montana, novi dio Corixa). StimulonTM QS-21 je triterpenski glikozid ili saponin izoliran iz kore drveta Quillaja Saponaria Molina pronađenog u Južnoj Americi (vidi Kensil i sur., u Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (urednici Powell i Newman, Plenum Press, NY, 1995); US patent br. 5,057,540), (Aquila BioPharmaceuticals, Framingham, MA). Druga pomoćna sredstva su emulzije ulja u vodi (kao što je skvalen ili ulje kikirikija), prema izboru u kombinaciji s imuno stimulansima, kao što je monofosforil lipid A (vidi Stoute i sur., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)), pluronski polimeri, i ubijene mikobakterije. Slijedeće pomoćno sredstvo je CpG (WO 98/40100). Pomoćna sredstva se mogu primijeniti kao komponenta terapijskih pripravaka s aktivnim sredstvom ili se mogu primijeniti odvojeno, prije, istovremeno sa, ili nakon primjene terapijskog sredstva.

Preferirana skupina pomoćnih sredstava su aluminijeve soli (alum), kao što je alum hidroksid, alum fosfat, alum sulfat. Takva pomoćna sredstva mogu se rabiti s ili bez drugih specifičnih imunostimulirajućih sredstava kao što su MPL ili 3-DMP, QS-21, polimerne ili monomerne amino kiseline kao što je poliglutaminska kiselina ili polilizin. Slijedeća skupina pomoćnih sredstava su pripravci emulzije ulja u vodi. Takva pomoćna sredstva mogu se rabiti s ili bez drugih specifičnih imunostimulirajućih sredstava kao što su muramil peptidi (npr., N-acetilmuramil-L-treonil-D-izoglutamin (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-izoglutamin (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-izoglutaminil-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroksifosforiloski)-etilamin (MTP-PE), N-acetilgluksaminil-N-acetilmuramil-L-Al-D-izoglu-L-Ala-dipalmitoksi propilamid (DTP-DPP) teramidTM), ili druge komponente bakterijske stanične stjenke. Emulzije ulja u vodi uključuju (a) MF59 (WO 90/14837), koji sadrži 5% skvalen, 0,5% Tween 80, i 0,5% Span 85 (prema izboru sadrži različite količine MTP-PE) oblikovan u submikronske čestice primjenom uređaja za mikrofluide kao što je Model 110Y (Microfluidics, Newton MA), (b) SAF, koji sadrži 10% skvalena, 0,4% Tween 80, 5% pluronskog blok polimera L121, i thr-MDP, bilo u obliku submikronske emulzije bilo vorteksiranjem stvorene emulzije većih čestica, i (c) RibiTM sustav pomoćnih sredstava (RAS), (Ribi ImmunoChem, Hamilton, MT) koji sadrži 2% skvalena, 0,2% Tween 80, i jednu ili više komponenata bakterijske stanične stjenke iz skupine koja se sastoji od monofosforilipida A (MPL), trehaloza dimikolata (TDM), i skeleta stanične stjenke (CWS), pogodnije MPL + CWS (DetoxTM).

Slijedeća skupina preferiranih pomoćnih sredstava su saponinska pomoćna sredstva, kao što su StimulonTM (QS-21, Aquila, Framingham, MA) ili iz njega stvorene čestice kao što su ISCOMs (imunostimulirajući kompleksi) i ISCOMATRIX. Druga pomoćna sredstva uključuju RC-529, GM-CSF i potpuni Freund-ov adjuvant (CFA) te nepotpuni Freund-ov adjuvant (IFA). Druga pomoćna sredstva uključuju citokine, kao što su interleukini (npr., IL-1 α i β peptidi, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-13, i IL-15), stimulirajući faktor kolonije maktofaga (M-CSF), stimulirajući faktor kolonije granulocit-maktofaga (GM-CSF), faktor tumorske nekroze (TNF), kemokine, kao što su MIP1 α i β i RANTES. Slijedeća skupina pomoćnih sredstava su analozi glikolipida uključujući N-glikozilamide, N-glikoziluree i N-glikozilkarbamate, od kojih je svaki supstituiran na mjestu šećernog ostatka s amino kiselinom, kao imuno-modulatori ili pomoćna sredstva (vidi US patent br. 4,855,283). Proteini toplinskog šoka, npr., HSP70 i HSP90, mogu se također rabiti kao pomoćna sredstva.

Pomoćna sredstva mogu se primijeniti s imunogenom kao jedan jedinstveni pripravak, ili se mogu primijeniti prije, istovremeno ili nakon primjene imunogena. Imunogen i pomoćno sredstvo mogu se pakirati i isporučiti u istoj posudici ili se mogu pakirati u zasebne posudice i pomiješati prije uporabe. Imunogen i pomoćno sredstvo tipično se pakiraju s oznakom koja ukazuje na namijenjenu terapijsku primjenu. Ukoliko su imunogen i pomoćno sredstvo pakirani zasebno, pakiranje tipično uključuje upute za miješanje prije uporabe. Izbor pomoćnog sredstva i/ili nosača ovisi o stabilnosti imunogenog pripravka koji sadrži pomoćno sredstvo, put primjene, raspored doziranja, učinkovitost pomoćnog sredstva u vrsta koje su cijepljene, te, u ljudi, farmaceutski prihvatljivo pomoćno sredstvo je ono koje je potvrđeno ili ga je moguće potvrditi za primjenu u ljudi od strane nadležnih zakonodavnih tijela. Na primjer, potpuni Freund-ov adjuvant nije pogodan za primjenu u ljudi. Alum, MPL i QS-21 su preferirani. Po izboru, dva ili više pomoćnih sredstava mogu se rabiti istovremeno. Preferirane kombinacije uključuju alum s MPL, alum s QS-21, MPL s QS-21, MPL ili RC-529 s GM-CSF, te alum, QS-21 i MPL zajedno. Također, može se rabiti nepotpuni Freund-ov adjuvant (Chang i sur., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173 (1998)), po izboru u kombinaciji s bilo kojim alumom, QS-21, i MPL te svim njihovim kombinacijama.

VII. Pasivna primjena protutijela

Aktivna imunizacija s fragmentima Aβ može se kombinirati s pasivnom primjenom protutijela. Protutijela koja se rabe za pasivnu primjenu mogu biti protutijela na N-terminalne epitope Aβ za indukciju odgovora čišćenja plakova fagocitozom, ili mogu biti protutijela na središnja ili C-terminalna područja Aβ za čišćenje topljivog Aβ. U nekim metodama, prvo se provodi pasivna primjena s protutijelima na N-terminalno područje protutijela da bi se počistile postojeće amiloidne nakupine. Nakon toga, primjenjuje se fragment iz središnjeg ili C-terminalnog područja Aβ da bi se spriječilo daljnje taloženje amiloidnih nakupina iz topljivog Aβ. U drugoj metodi, prvo se provodi aktivna primjena s fragmentom na središnje ili C-terminalno područje Aβ da bi se stvorila protutijela koja čiste topljivi Aβ. Zatim kada nivo protutijela u krvi počne opadati, puni se dodatna doza pasivnom primjenom protutijela koja se specifično vežu na središnji ili C-terminalni epitop Aβ.

Protutijela prikladna za uporabu pasivnom primjenom opisana su u patentima WO 00/72880 i WO 02/46237 i uključena su ovim navodom. Preferirana protutijela koja se specifično vežu na N-terminalni epitop Aβ vežu se na epitop koji započinje na ostacima 1-3 i završava na ostacima 7-11 Aβ. Neka preferirana protutijela specifično se vežu na epitope unutar amino kiselina 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 ili 3-7. Neka preferirana protutijela specifično se vežu na epitop koji započinje na ostacima 1-3i završava na ostacima 7-11 Aβ. Takva protutijela specifično se vežu na amiloidne nakupine ali se mogu ili ne moraju vezati na topljivi Aβ. Neka preferirana protutijela koja se specifično vežu na C-terminalni epitop Aβ specifično se vežu na dugački oblik Aβ koji se pojavljuje prirodno (tj., Aβ42 i Aβ43) bez da se specifično vežu na kratki oblik Aβ koji se pojavljuje prirodno (tj., Aβ39, 40 ili 41). Protutijela na C-terminalne i središnje epitope tipično specifično se vežu na topljivi bez specifičnog vezanja na amiloidne nakupine. Kada se kaže da se protutijelo specifično veže na epitop unutar određenih ostataka, kao što je Aβ 1-5 na primjer, to znači da se protutijelo specifično veže na polipeptid koji sadrži te određene ostatke (tj., Aβ 1-5 u ovom primjeru). Takvo protutijelo nije neophodno u dodiru sa svakim ostatkom unutar Aβ 1-5. Niti svaka pojedina supstitucija ili brisanje amino kiseline unutar Aβ 1-5 neophodno značajno utječe na afinitet vezanja. Specifičnost protutijela prema epitopu može se odrediti, na primjer, kao što je opisano u patentu WO 00/72880.

Protutijela mogu biti poliklonalna ili monoklonalna. Poliklonalni serumi tipično sadrže miješane populacije protutijela koja specifično vežu nekoliko epitopa po duljini Aβ. Međutim, poliklonalni serumi mogu biti specifični za određeni segment Aβ, kao što je Aβ1-10. Preferirana protutijela su himerna, humanizirana (vidi Queen i sur., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989) i WO 90/07861, US 5,693,762, US 5,693,761, US 5,585,089, US 5,530,101 i Winter, US 5,225,539), ili humana (Lonberg i sur., WO 93/12227 (1993); US5,877,397, US 5,874,299, US 5,814,318, US 5,789,650, US 5,770,429, US 5,661,016, US5,633,425, US 5,625,126, US 5,569,825, US 5,545,806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991)). Nekoliko mišjih protutijela različitih specifičnosti vezanja dostupna su kao polazni materijali za pravljenje humaniziranih protutijela. Humani izotip IgG1 preferiran je za protutijela za N-terminalno područje zbog toga što on ima najveći afinitet za humane izotipove za FcRI receptor na fagocitičnim stanicama. Neka protutijela specifično se vežu na Aβ s afinitetom vezanja većim ili jednakim oko 107, 108, 109, ili 1010 M-1.

VIII. Pacijenti podvrgnuti liječenju

Pacijenti podvrgnuti liječenju uključuju pojedince koji su u opasnosti od bolesti ali ne pokazuju simptome, kao i pacijente koji trenutačno pokazuju simptome. U slučaju Alzheimer-ove bolesti, praktički svatko je u opasnosti da oboli od Alzheimer-ove bolesti ukoliko on ili ona poživi dovoljno dugo. Stoga, se metode o kojima se ovdje govori mogu primijeniti profilaktički na opću populaciju bez potrebe za bilo kakvom procjenom rizika po pacijenta. Ove metode su osobito korisne za pojedince kod koji je doista poznat genetički rizik Alzheimer-ove bolesti. Takvi pojedinci uključuju osobe koje imaju rođake koji su oboljeli od bolesti, i one čiji je rizik određen genetičkim ili biokemijskim markerima. Genetički markeri rizika od Alzheimer-ove bolesti uključuju mutacije na APP genu, posebice mutacije na položaju 717 i položajima 670 i 671 koje se nazivaju Hardy-jeva odnosno švedska mutacija (vidi Hardy, TINS, navedeno iznad). Drugi markeri rizika su mutacije na presenilin genima, PS1 i PS2, te ApoE4, obiteljska povijest AD bolesti, hiperkolesterolemija ili ateroskleroza. Pojedinci koji trenutačno pate od Alzheimer-ove bolesti mogu se prepoznati po karakterističnoj demenciji, kao i po prisutnosti čimbenika rizika opisanih iznad. Pored toga, dostupan je niz dijagnostičkih testova za identifikaciju pojedinaca koji imaju AD bolest. Ovi testovi uključuju mjerenje nivoa CSF tau i Aβ42. Povišeni nivo tau i smanjeni nivo Aβ42 ukazuju na prisutnost AD bolesti. Pojedinci koji pate od Alzheimer-ove bolesti mogu se također dijagnosticirati ADRDA kriterijima kao što je raspravljeno u WO 00/72880.

U asimptomatičnih pacijenata, liječenje može započeti u bilo kojem uzrastu (npr., 10, 20, 30). Obično, međutim, nije neophodno započeti liječenje dok pacijent ne navrši 40, 50, 60 ili 70. Liječenje tipično nameće višestruke doze tijekom jednog vremenskog perioda. Liječenje se može pratiti testiranjem protutijela, ili aktiviranih odgovora T-stanica (nuspojava) ili B-stanica na terapijska sredstva (npr., Aβ peptid) tijekom vremena. Ukoliko se odgovor smanjuje, indicira se ʺbusterʺ doza. U slučaju potencijalnih pacijenata od Down-ovog sindroma, liječenje može započeti prije rođenja davanjem terapijskog sredstva majci ili ubrzo nakon rođenja.

IX. Režimi liječenja

Općenito režimi liječenja uključuju primjenu sredstva koje je učinkovito pri izazivanju imunogenog odgovora na Aβ, pogodnije na imunogeni fragment Aβ u pacijenta. U profilaktičkim primjenama, farmaceutski se pripravci ili lijekovi primjenjuju u pacijenta koji je podložan, ili na drugi način u opasnosti od Alzheimer-ove bolesti u količini dovoljnoj da ukloni ili smanji rizik, ublaži jačinu, ili odgodi nastupanje bolesti, uključujući fiziološke, biokemijske, histološke i/ili biheviorističke simptome bolesti, njezine komplikacije i posredne patološke fenotipove koji se pojavljuju tijekom razvoja bolesti. U terapijskim primjenama, sredstvo se daje pacijentu za kojega se sumnja, ili koji je već obolio od takve bolesti režimom koji se sastoji od količine i učestalosti primjene sredstva dovoljnog da liječi, ili u najmanju ruku djelomično zaustavlja, ili spriječi pogoršavanje simptoma bolesti (fizioloških, biokemijskih, histoloških i/ili biheviorističkih), uključujući njezine komplikacije i posredne patološke fenotipove u razvoju bolesti. U nekim metodama, primjenom sredstva smanjuje se ili uklanja miokognitivno oštećenje u pacijenata koji još nisu razvili karakterističnu Alzheimer-ovu patologiju. Količina primjerena za postizanje terapijskog ili profilaktičkog tretmana definira se kao terapijski ili profilaktički učinkovita doza. Kombinacija količine i učestalosti doza primjerena za postizanje terapijskog ili profilaktičkog tretmana definira se kao terapijski ili profilaktički učinkovit režim. U oba ova režima, sredstva se obično primjenjuju u nekoliko doza sve dok se ne postigne dovoljni imuni odgovor. Doza i učestalost primjena primjerena za postizanje terapijskog ili profilaktičkog tretmana definira se kao terapijski ili profilaktički učinkovit režim. Tipično, pacijentov imuni odgovor se prati i daju se ponovljene doze ukoliko imuni odgovor počne slabiti. Imuni odgovor se može pratiti detektiranjem protutijela na Aβ u krvi pacijenta, detektiranjem nivoa Aβ ili plakova u mozgu ili simptoma putem psihometrijskog mjerenja, kao što je MMSE, te ADAS, što predstavlja opsežnu skalu za procjenu statusa i funkcije pacijenata s Alzheimer-ovom bolešću.

Učinkovite doze sredstava i pripravaka ovog izuma, za liječenje gore opisanih stanja variraju ovisno o mnogo različitih čimbenika, uključujući način primjene, ciljno mjesto, fiziološko stanje pacijenta, da li je pacijent ljudsko biće ili životinja, da li se primjenjuju drugi lijekovi, te da li je tretman profilaktički ili terapijski. Obično, pacijent je čovjek ali se mogu liječiti i drugi sisavci osim čovjeka uključujući transgenične sisavce. Doze za liječenje moraju se titrirati da bi se optimizirala sigurnost i učinkovitost. Količina imunogena ovisi o tome da li je primijenjeno pomoćno sredstvo, pri čemu su potrebne veće doze kada nije prisutno pomoćno sredstvo. Količina imunogena za primjenu ponekad varira od 1-500 μg po pacijentu a češće od 5-500 μg po injekciji za primjenu u ljudi. Povremeno, rabi se veća doza od 1-2 mg po injekciji. Masa imunogena također ovisi o omjeru mase imunogenog epitopa unutar imunogena i mase imunogena kao cjeline. Tipično, rabi se 10-3 do 10-5 mikromola imunogenog epitopa za mikrogram imunogena. Vrijeme injektiranja može značajno varirati od jednom dnevno, do jednom godišnje, do jednom u desetljeću. Bilo kojeg dana kojeg je primljena doza imunogena, doza je veća od 1μg/pacijent i obično veća od 10 μg/pacijent ukoliko je primijenjeno i pomoćno sredstvo, te veća od 10 μg/pacijent i obično veća od 100 μg/pacijent ukoliko nije prisutno pomoćno sredstvo. Tipični režim sastoji se od imunizacije nakon čega slijede ʺbusterʺ injekcije u vremenskim intervalima, kao što je interval od 6 tjedana. Drugi režim sastoji se od imunizacije nakon čega slijede ʺbusterʺ injekcije 1, 2 i 12 mjeseci kasnije. Slijedeći režim nameće injekciju svaka dva mjeseca tijekom života. Alternativno, ʺbusterʺ injekcije mogu se davati neredovito kako na to ukaže praćenje imunog odgovora.

Doze za nukleinske kiseline koje kodiraju imunogene kreću se u rasponu od oko 10 ng do 1g, 100 ng do100 mg, 1 μg do 10 mg, ili 30-300 μg DNA po pacijentu. Doze za infektivne virusne vektore variraju od 10-100, ili više, viriona po dozi.

Za pasivnu imunizaciju s protutijelom (u kombiniranim terapijama), doze se kreću od oko 0,0001 do 100 mg/kg, i češće 0,01 do 5 mg/kg, tjelesne težine domaćina. Na primjer doze mogu biti 1 mg/kg tjelesne težine ili 10 mg/kg tjelesne težine ili u području od 1-10 mg/kg ili drugim riječima, 70 mg ili 700 mg odnosno unutar područja od 70-700 mg, za pacijenta teškog 70 kg. Primjerni režim liječenja nameće primjenu jednom svaka dva tjedna ili jednom mjesečno ili jednom svakih 3 do 6 mjeseci. U nekim metodama, dva ili više monoklonalnih protutijela s različitim specifičnostima vezanja primjenjuju se istovremeno, u tom slučaju doze svakog primijenjenog protutijela padaju unutar naznačenih područja. Protutijelo se obično primjenjuje u višestrukim prilikama. Vremenski razmaci između pojedinih doza mogu biti tjedni, mjeseci ili godine. Vremenski razmaci mogu također biti nejednaki kao što je naznačeno prema mjerenju nivoa protutijela na Aβ u krvi pacijenta. U nekim metodama, doze se prilagođava da bi se postigla koncentracija protutijela u plazmi do 1-1000 μg/ml te u nekim metodama 25-300 μg/ml. Alternativno, protutijela se mogu primijeniti kao pripravak s neprekidnim oslobađanjem, u kom slučaju je potrebna manje učestala primjena. Doza i učestalost variraju ovisno o polu-životu protutijela u pacijenta. Općenito, humana protutijela pokazuju najdulji polu-život, nakon kojih slijede humanizirana protutijela, himerna protutijela, i nehumana protutijela. Doza i učestalost primjene može varirati ovisno o tome da li je tretman profilaktički ili terapijski. U profilaktičkim primjenama, relativno niska doza se primjenjuje relativno neučestalim vremenskim razmacima tijekom dugačkog vremenskog perioda. Neki pacijenti nastavljaju primati tretman kroz ostatak život. U terapijskim primjenama, ponekad su potrebne relativno visoke doze u relativno kratkim vremenskim razmacima prije nego se napredovanje bolesti smanji ili zaustavi, a pogodnije sve dok pacijent ne pokaže djelomično ili potpuno poboljšanje simptoma bolesti. Nakon toga, pacijentu se može primijeniti profilaktički režim.

Sredstva za induciranje imunog odgovora mogu se primijeniti parenteralnim, topikalnim, intravenskim, oralnim, supkutanim, intraarterijskim, intrakranijskim, intraperitonejskim, intranazalnim ili intramuskularnim putem za profilaktički i/ili terapijski tretman. Najtipičniji put primjene imunogenog sredstva je supkutani iako drugi putovi mogu biti jednako učinkoviti. Slijedeći najuobičajeniji put je intramuskularno injektiranje. Ovaj tip injektiranja se najtipičnije provodi u mišić ruke ili noge. U nekim metodama, sredstva se injektiraju neposredno u određeno tkivo u kojem su se sakupile nakupine, npr., intrakranijsko injektiranje. Intramuskularno injektiranje ili intravenska infuzija provode se za primjenu protutijela (u kombiniranim terapijama). U nekim metodama, određena protutijela se injektiraju neposredno u lubanju. U nekim metodama, protutijela se primjenjuju kao pripravci ili uređaji s neprekidnim oslobađanjem, kao što je MedipadTM uređaj.

Sredstva ovog izuma često se primjenjuju kao farmaceutski pripravci koji se sastoje od aktivnog terapijskog sredstva, tj., i niza drugih farmaceutski prihvatljivih komponenata. Vidi Remington's Pharmaceutical Science (15. izdanje, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1980). Preferirani oblik ovisi o načinu na koji se namjerava primijeniti sredstvo te o terapijskoj uporabi. Pripravci mogu također uključivati, ovisno o željenoj formulaciji, farmaceutski prihvatljive, netoksične nosače ili diluense, koji su definirani kao prijenosna sredstva koja se uobičajeno rabe da bi se oblikovali farmaceutski pripravci za primjenu u životinja ili ljudi. Diluens se odabire tako da ne utječe na biološku aktivnost kombinacije. Primjeri takvih diluensa su destilirana voda, fosfatom puferirana fiziološka otopina, Ringer-ova otopina, otopina dekstroze, i Hank-ova otopina. Osim toga, farmaceutski pripravak ili formulacija može također sadržavati druge nosače, pomoćna sredstva, ili netoksične, neterapijske, neimunogene stabilizatore i slično.

Farmaceutski pripravci mogu također uključivati velike makromolekule, koje se polako metaboliziraju kao što su proteini, polisaharidi kao što je hitozan, polilaktičke kiseline, poliglikolne kiseline i kopolimere (kao što su lateksom funkcionalizirana sefaroza(TM), agaroza, celuloza, i slično), polimerne amino kiseline, amino kiselinske kopolimere, i lipidne agregate (kao što su kapljice ulja ili liposomi). Pored toga, ovi nosači mogu funkcionirati kao imunostimulirajuća sredstva (tj., pomoćna sredstva).

Za parenteralnu primjenu, sredstva ovog izuma mogu se primijeniti kao injektirajuće doze otopina ili suspenzija tvari u fiziološki prihvatljivom diluensu s farmaceutskim nosačem koji može biti sterilna tekućina kao što su voda, ulja, fiziološka otopina, glicerol, ili etanol. Nadalje, dodatne tvari, kao što su sredstva za vlaženje ili stvaranje emulzije, površinski aktivna sredstva, tvari koje puferiraju pH i slično mogu biti prisutne u pripravcima. Druge komponente farmaceutskih pripravaka su one naftnog, životinjskog, biljnog, ili sintetskog porijekla, na primjer, ulje kikirikija, sojino ulje, i mineralna ulja. Općenito, glikoli kao što je propilen glikol ili polietilen glikol su preferirani tekući nosači, posebice u otopinama za injektiranje. Protutijela se mogu primijeniti u obliku depo-injekcije ili pripravka koji se implantira koji se može oblikovati na takav način da dozvoljava neprekidno oslobađanje aktivnog sastojka. Primjerni pripravak sadrži monoklonalno protutijelo od 5 mg/mL, formulirano u vodenom puferu koji se sastoji od 50 mM L-histidina, 150 mM NaCl, podešen na pH 6,0 s HCl. Pripravci za parenteralnu primjenu su tipično u osnovi sterilni, izotonični i proizvedeni pod GMP uvjetima koje propisuje FDA ili slično nadležno tijelo.

Tipično, pripravci su priređeni za injektiranje, bilo kao tekućine bilo kao suspenzije; prije injektiranja također se mogu prirediti čvrsti oblici pogodni za otopine u, ili suspenzije u, tekućim prijenosnim sredstvima. Pripravci se također mogu prevesti u emulziju ili uklopiti u liposome ili mikro čestice kao što su polilaktid, poliglikolid, ili kopolimer da bi se pojačao učinak pomoćne tvari, kao što je raspravljeno iznad (vidi Langer, Science 249, 1527 (1990) i Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997). Sredstva ovog izuma mogu se primijeniti u obliku depo-injekcije ili pripravka koji se implantira koji se može oblikovati na takav način da dozvoljava neprekidno oslobađanje aktivnog sastojka ili njegovo oslobađanje u pulsovima.

Dodatni oblici pogodni za druge načine primjene uključuju oralne, intranazalne, i pulmonarne oblike, supozitorije, i transdermalne pripravke.

Za supozitorije, sredstva za vezanje i nosači uključuju, na primjer, polialkilen glikole ili trigliceride; takvi supozitoriji mogu se oblikovati iz smjesa koje sadrže aktivni sastojak u području od 0,5% do 10%, pogodnije 1%-2%. Oralni oblici uključuju ekscipijense, kao što su manitol, laktoza, škrob, magnezijev stearat, natrijev saharin, celuloza, i magnezijev karbonat farmaceutske čistoće. Ovi pripravci imaju oblik otopina, suspenzija, tableta, pilula, kapsula, oblika s neprekidnim oslobađanjem ili prašaka te sadrže 10%-95% aktivnog sastojka, pogodnije 25%-70%.

Topička primjena može rezultirati trensdermalnim ili intradermalnim unošenjem. Topička primjena može se olakšati istovremenom primjenom sredstva s toksinom kolere ili njegovim detoksiciranim derivatima ili njegovim podjedinicama ili drugim sličnim bakterijskim toksinima (vidi Glenn i sur., Nature 391, 851 (1998)). Istovremena primjena može se postići primjenom komponenata kao smjese ili kao povezanih molekula koje se dobivaju kemijskim unakrsnim vezanjem ili ekspresijom kao fuzijskog proteina.

Alternativno, transdermalno unošenje može se postići primjenom putem kože ili uporabom transferosoma (Paul i sur., Eur. J. Immunol. 25, 3521-24 (1995); Cevc i sur., Biochem. Biophys. Acta 1368, 201-15 (1998)).

X. Metode praćenja

Izum donosi metode otkrivanja odgovora protutijela na Aβ peptid u pacijenata koji pate od ili su osjetljivi na amiloidogeničnu bolest. Metode su osobito korisne za praćenje tijeka liječenja koje je primijenjeno pacijentu. Metode se mogu rabiti za praćenje i terapijskog tretmana na simptomatičnim pacijentima i profilaktičkog tretmana na asimptomatičnim pacijentima. Neke metode nameću određivanje bazalne vrijednosti odgovora protutijela u pacijenta prije primjene doze imunogenog sredstva, i uspoređivanje te vrijednosti s vrijednošću za imuni odgovor nakon tretmana. Značajan porast (tj., veći od tipične granice eksperimentalne pogreške u ponovljenim mjerenjima istog uzorka, izražene kao jedna standardna devijacija od srednje vrijednosti takvih mjerenja) u vrijednosti odgovora protutijela ukazuje na pozitivan ishod liječenja (tj., da je primjena sredstva postigla ili povećala imuni odgovor). Ako se vrijednost za odgovor protutijela ne poveća značajno, ili se smanji, to ukazuje na negativan ishod liječenja. Općenito govoreći, kod pacijenata koji prolaze kroz početni dio liječenja pomoću imunogenog sredstva očekuje se da pokažu povećavanje odgovora protutijela po uzastopnim dozama, koje konačno dostiže plato. Primjena sredstva općenito se nastavlja dok se odgovor protutijela povećava. Dostizanje platoa je pokazatelj da se primjena liječenja može prekinuti ili smanjiti doza ili učestalost.

U drugim metodama, kontrolna vrijednost (tj., srednja vrijednost i standardna devijacija) odgovora protutijela određena je kontrolnom populacijom. Tipično pojedinci u kontrolnoj populaciji prethodno nisu primili tretman. Mjerene vrijednosti odgovora protutijela u pacijenta nakon primjene terapijskog sredstva uspoređuju se zatim s kontrolnom vrijednošću. Značajan porast prema kontrolnoj vrijednosti (npr., veći od jedne standardne devijacije od srednje vrijednosti) ukazuje na pozitivan ishod liječenja. Izostanak značajnog povećanja ili smanjenje ukazuje na negativni ishod liječenja. Primjena sredstva se općenito nastavlja sve dok se odgovor protutijela povećava relativno prema kontrolnoj vrijednosti. Kao i prije, postizanje platoa relativno prema kontrolnim vrijednostima ukazuje da se primjena liječenja može prekinuti ili smanjiti doza ili učestalost.

U drugim metodama, kontrolna vrijednost odgovora protutijela (tj., srednja vrijednost i standardna devijacija) određuje se iz kontrolne populacije pojedinaca koji su podvrgnuti tretmanu s terapijskim sredstvom i čiji je odgovor protutijela dosegao plato kao odgovor na tretman. Mjerene vrijednosti odgovora protutijela u pacijenta uspoređuju se s kontrolnom vrijednošću. Ukoliko mjedeni nivo u pacijenta nije značajno drugačiji (npr., više od jedne standardne devijacije) od kontrolne vrijednosti, liječenje se može prekinuti. Ako je nivo u pacijenta značajno ispod kontrolne vrijednosti, opravdava se nastavak primjene sredstva. Ako je nivo u pacijenta još uvijek ispod kontrolne vrijednosti, to ukazuje da bi se mogao promijeniti režim liječenja, na primjer, uporaba pomoćnog sredstva, fragmenta ili se treba prebaciti na pasivnu primjenu.

U drugim metodama, u pacijenta koji trenutačno ne prima liječenje ali je bio podvrgnut prethodnom liječenju prati se odgovor protutijela da bi se odredilo da li je potrebno obnavljanje liječenja. Mjerene vrijednosti odgovora protutijela u pacijenta mogu se usporediti s prethodno postignutom vrijednošću odgovora protutijela u pacijenta nakon prethode kure liječenja. Značajan porast relativno prema prethodnom mjerenju (tj., veći od tipične granice pogreške u ponovljenim mjerenjima istog uzorka) ukazuje da liječenje treba nastaviti. Alternativno, vrijednost mjerena u pacijenta može se usporediti s kontrolnom vrijednošću (srednja vrijednost plus standardna devijacija) određenom u populaciji pacijenata koji su bili podvrgnuti kuri liječenja. Alternativno, mjerena vrijednost u pacijenta može se usporediti s kontrolnom vrijednošću u populacijama profilaktički tretiranih pacijenata kod kojih nema simptoma bolesti, ili populacijama terapijski tretiranih pacijenata koji pokazuju poboljšanje karakteristika bolesti. U svim ovim slučajevima, značajno smanjenje relativno prema kontrolnom nivou (tj., više od jedne standardne devijacije) je pokazatelj da se liječenje pacijenta treba nastaviti.

Uzorak tkiva za analizu tipično je krv, plazma, serum, mukoza ili cerebrospinalna tekućina pacijenta. Uzorak se analizira na indikaciju imunog odgovora na bilo koji oblik Aβ peptida, tipično Aβ42 ili peptida rabljenog za imunizaciju. Imuni odgovor može se odrediti iz prisutnosti protutijela specifično vezanih na Aβ peptid. Protutijela se mogu detektirati testom vezanja na ligand koji se specifično veže na protutijela. Tipično je ligand imobiliziran. Vezanje se može detektirati uporabom obilježenih anti-idiotipičnog protutijela.

U kombiniranim režimima uporaba obje vrste primjena, i aktivne i pasivne primjene, mogu se primijeniti slični pristupi praćenja nivoa protutijela koja su rezultat pasivne primjene kao što je opisano u WO 00/72880.

PRIMJERI

Materijali i metode

Aβ fragmenti. Peptidi koji odgovaraju Aβ1-5, Aβ3-9, Aβ5-11, Aβ15-24 i obrnutom slijedu Aβ5-1 sintetizirani su susjedno od 17-amino kiselina epitopa T stanica izvedenom iz ovalbumina (amino kiseline 323-339 - ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID br:3)) na razgrananom peptidnom okviru (jezgra trostrukog lizina s četiri peptidne grane) da bi se proizveo multi-antigenski peptid, kao što je opisao Tam, J.P. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5409-5413. Uzgojena su poliklonalna protutijela (Pab) Aβ1-42 i izolirana je imunoglobulinska frakcija, kao što su prethodno opisali Bard, F. i sur., (2000) Nat. Med. 6, 916-919. Poliklonalna Pab-EL16, Pab-EL17, i Pab-EL20 dobivena su iz seruma PDAPP miševa imuniziranih s peptidima koji odgovaraju Aβ1-7, Aβ15-24, odnosno Aβ3-9 koji su sintetizirani na razgrananom okviru, kao što je opisano iznad. Pab-EL26 se dobiva iz seruma miševa imuniziranih s Aβ(7-1)-42. Peptidi su sintetizirani u AnaSpec, San Jose, CA, SAD.

Postupci imunizacije. 100 μg Aβ fragmenta primijeni se intraperitonealnom injekcijom u potpunom Freund-ovom pomoćnom sredstvu, nakon čega slijede stimulansi sa 100 μg peptida u nepotpunom Freund-ovom pomoćnom sredstvu u 2 do 4 tjedna, te nakon toga mjesečno.

Vezanje protutijela na agregirani i topljivi Aβ1-42. Vezanje serumskih titara (određeni nizom razrjeđenja) i monoklonalnih protutijela na agregirani sintetički Aβ1-42 provedena su putem ELISA kao što su prethodno opisali Schenk i sur., (1999) Nature 400, 173-177. Topljivi Aβ1-42 odnosi se na sintetički Aβ1-42 peptid sonificiran u dimetil sulfoksidu. Serijska razrjeđenja protutijela inukbiraju se s 50000 cpm 125I- Aβ1-42 preko noći na sobnoj temperaturi. 50 μl polu tekućeg muljastog sadržaja koji sadrži 75 mg/ml proteina A sefaroze (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)/200 μg zečjeg protiv mišjeg IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, SAD) inkubira se s razrjeđenim protutijelima kroz 1 sat na sobnoj temperaturi, dva puta ispere, i broji na Wallac gama brojaču (PerkinElmer, Life Science, Grove, IL, SAD). Svi ovi koraci provode se u puferu za radio-imuno test koji se sastoji od 10 mM Tris, 0,5 M NaCl, 1 mg/ml želatine, i 0,5% Nonidet P-40, pH 8,0.

Rezultati

Niz peptida uspoređen je prema njihovoj sposobnosti da potaknu učinkoviti odgovor protutijela in vivo. Dvanaest do trinaest mjeseci stari PDAPP miševi imunizirani su s jednim od tri N-terminalnih peptidna fragmenata (Aβ1-5, Aβ3-9, ili Aβ5-11) ili fragmentom izvedenim iz unutrašnjeg područja peptida (Aβ15-24) (slika 1a). Unutrašnji peptid Aβ15-24 obuhvaća epitop protutijela 266, koji pokazuje visoki afinitet prema topljivom Aβ (Seubert i sur., (1992) Nature 359, 325-327), ne prepoznaje plakove u dijelovima nefiksiranog AD ili PDAPP tkiva. Dakle, bilo je bitno odrediti da li poliklonalni odgovor usmjeren na ovaj peptid može proizvesti protutijela sposobna za prepoznavanje plaka, ili da li je reaktivnost sa samim topljivim Aβ dovoljna da osigura učinkovitost. U ovim istraživanjima peptid s reverznim slijedom, Aβ5-1, služio je kao negativna kontrola. Peptidi su sintetizirani susjedno od 17-amino kiselinskog epitopa T stanica izvedenog iz ovalbumina i predstavljeni su u identičnoj multivalentnoj konfiguraciji (vidi Materijali i metode). Svi peptidi (osim Aβ5-1 reverznog izomera) proizveli su serum koji pomoću ELIZA prepoznaje agregirane sintetičke Aβ1-42, iako su Aβ5-11 i Aβ15-24 proizveli značajno viši titar nego Aβ1-5 (p<0,01 odnosno p<0,05) (slika 1b). Nasuprot tome, jedino su serumi protiv N-terminalnih peptida bili sposobni prepoznati Aβ u plakovima; antiserumi protiv Aβ15-24 nisu vezali plakove unatoč jake reaktivnosti sa sintetički agregiranim peptidom (slika 1c). Također postoje razlike između serumskih skupina u njihovoj sposobnosti za vezanjem topljivog Aβ (slika 2a). Manje od 30% seruma iz miševa imuniziranih s Aβ1-5 ili Aβ3-9 vezali su topljivi peptid (27% odnosno 5%). Nasuprot tome, serumi iz otprilike pola životinja imuniziranih s Aβ5-11, i iz svih životinja imuniziranih s Aβ15-24, vezali su topljivi Aβ1-42.

Budući da stupanj depozicije Aβ može jako varirati sa starenjem PDAPP miševa, istraživanje in vivo je dizajnirano s najmanje 30 životinja u skupini. Podaci učinkovitosti prikazani su za svakog pojedinog miša i izraženi kao postotak bilo amiloidnog opterećenja ili neuritičke distrofije relativno prema srednjoj vrijednosti kontrole (stavljena kao 100%). Imunizacija sa svakim od tri N-terminalna peptida značajno smanjuje amiloidno opterećenje (46-61%, p<0,002) (slika 2b). Nadalje, Aβ3-9 i Aβ5-11 značajno smanjuju neuritičku patologiju (34% odnosno 41%, p<0,05), (slika 2c). Imunizacija s Aβ15-24 nije osigurala zaštitu niti protiv amiloidnog opterećenja niti protiv neuritičke patologije. Ovi rezultati podupiru vezanje plaka kao jednog mehanizma učinkovitosti protutijela. Oni također ukazuju da vezanje topljivog Aβ nije potrebno za smanjenje neuritičke patologije budući da je odgovor protutijela na Aβ3-9 osigurao jaku reaktivnost plaka i najviši nivo zaštite od neuronske distrofije, iako je pokazao najslabiji kapacitet za prepoznavanje topljivog peptida. Protutijela koja se vežu na topljivi Aβ bez vezanja na plakove mogu također imati takvo djelovanje ako se primjene u visokim titrima ili tijekom duljeg vremenskog perioda. Protutijela koja se vežu na topljivi Aβ bez vezanja na plakove mogu također biti korisna u sprječavanju nastajanja i/ili daljnjeg taloženja Aβ. Visoki titar protutijela stvoren imunizacijom s Aβ15-24 ukazuje da su ovaj fragment i njegovi pod-fragmenti osobito korisni za stvaranje visokih titara topljivih protutijela u ovu svrhu.

Iako prikazani izum nije opisan u detalje u svrhu jasnoće razumijevanja, očigledno je da se određene modifikacije mogu provesti u praksi u okviru pridodanih patentnih zahtjeva. Sve publikacije i dokumenti patenata ovdje navedeni uključeni su time u svojoj potpunosti za sve svrhe u istoj mjeri kao da je svaki pojedinačno napomenut. Ukoliko nije drugačije očigledno iz konteksta, svaki element, osobina ili ostvarenje ovog izuma može se rabiti u kombinaciji s bilo kojim drugim.

Claims

1. Metoda spriječavanja bolesti povezane s amiloidnim nakupinama Aβ u mozgu pacijenta, sastoji se od primjene učinkovitog režima fragmenta Aβ, naznačena time da fragment inducira protutijela koja se specifično vežu na Aβ na jednom ili više epitopa između ostataka 12 i 43 bez induciranja protutijela koja se specifično vežu na jedan ili više epitopa između ostataka 1-11, te da fragment nije Aβ13-28, 17-28, 25-35, 35-40, 33-42 ili 35-42, pri čemu se inducirana protutijela specifično vežu na topljivi Aβ u pacijenta čime se inhibira nastajanje amiloidnih nakupina Aβ u mozgu iz topljivog Aβ, te tako utječe na spriječavanje bolesti.

2. Metoda iz zahtjeva 1, naznačena time da fragment nema čitav epitop T-stanica koji inducira odgovor T-stanica na Aβ.

3. Metoda iz zahtjeva 1, naznačena time da inducirana protutijela nemaju kapacitet za specifično vezanje na amiloidne nakupine Aβ.

4. Metoda iz zahtjeva 1, naznačena time da fragment sadrži dio od 5-10 susjednih amino kiselina od Aβ.

5. Metoda iz zahtjeva 1, naznačena time da fragment sadrži dio od 5-10 susjednih amino kiselina unutar Aβ15-24.

6. Metoda iz zahtjeva 1, naznačena time da je fragment odabran iz skupine koja se sastoji od Aβ15-21, Aβ16-22, Aβ17-23, Aβ18-24, Aβ19-25, Aβ15-22, Aβ16-23, Aβ17-24, Aβ18-25, Aβ15-23, Aβ16-24, Aβ17-25, Aβ18-26, Aβ15-24, Aβ16-25, i Aβ15-25.

7. Metoda iz zahtjeva 1, naznačena time da fragment predstavlja C-terminalni fragment koji inducira protutijela koja se specifično vežu na Aβ42 i/ili Aβ43 bez specifičnog vezanja na Aβ39, 40 ili 41.

8. Metoda spriječavanja bolesti povezane s amiloidnim nakupinama Aβ u mozgu pacijenta sastoji se od primjene učinkovitog režima fragmenta Aβ, naznačena time da je fragment odabran iz skupine koja se sastoji od Aβ15-21, Aβ16-22, Aβ17-23, Aβ18-24, Aβ19-25, Aβ15-22, Aβ16-23, Aβ17-24, Aβ18-25, Aβ15-23, Aβ16-24, Aβ17-25, Aβ18-26, Aβ15-24, Aβ16-25, i Aβ15-25, i time utječe na spriječavanje bolesti.

9. Metoda iz zahtjeva 1, naznačena time da metoda nadalje sadrži primjenu fragmenta Aβ koji inducira protutijela koja se specifično vežu na jedan ili više epitopa s Aβ1-11.

10. Metoda iz zahtjeva 9, naznačena time da se fragment Aβ koji inducira protutijela koja se specifično vežu na Aβ na epitopu s Aβ1-11 primjenjuje prije nego što fragment inducira protutijela koja se specifično vežu na Aβ na jednom ili više epitopa između ostataka 12 i 43.

11. Metoda iz zahtjeva 1, naznačena time da nadalje sadrži primjenu protutijela koje se specifično veže na Aβ na epitopu s Aβ1-11.

12. Metoda iz zahtjeva 1, naznačena time da se protutijelo koje se specifično veže na Aβ na epitopu s Aβ1-11 primjenjeuje prije fragmenta koji inducira protutijela koja se specifično vežu na Aβ na jednom ili više epitopa između ostataka 12 i 43.

13. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da je bolest karakterizirana spoznajnim slabljenjem.

14. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da je bolest Alzheimer-ova bolest.

15. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da je bolest Down-ov sindrom.

16. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da je bolest blago spoznajno slabljenje.

17. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da je pacijent ljudsko biće.

18. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da nadalje sadrži praćenje induciranih protutijela u pacijenta.

19. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da je pacijent asimptomatičan.

20. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da je pacijent simptomatičan i da primjena zaustavlja pogoršavanje pacijentovih simptoma.

21. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da je pacijent mlađi od 50 godina.

22. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da pacijent posjeduje naslijeđeni čimbenik rizika koji ukazuje na osjetljivost na Alzheimer-ovu bolest.

23. Metoda iz zahtjeva 19, naznačena time da pacijent nije razvio simptome koji se daju otkriti tijekom pet godina nakon što je prvi puta proveden korak primjene.

24. Metoda iz bilo kojeg od zahtjeva 1-21 i 23, naznačena time da pacijent ne posjeduje poznate čimbenike rizika za Alzeimer-ovu bolest.

25. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da režim sadrži primjenu doze od najmanje 50 mikrograma fragmenta u više dana.

26. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da se fragment primjenjuje s pomoćnim sredstvom koje povećava nivo protutijela koje je inducirao fragment.

27. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da se fragment primjenjuje intraperitonejski, oralno, intranazalno, supkutano, intramuskularno, topički ili intravenski.

28. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da se fragment primjenjuje putem primjene polinukleotida koji kodira fragment, pri čemu se polinukleotid eksprimira da bi proizveo fragment u pacijenta.

29. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da nadalje sadrži praćenje pacijenta vezano za nivo induciranih protutijela u krvi pacijenta.

30. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da se fragment primjenjuje u višestrukim dozama tijekom perioda od najmanje tri mjeseca.

31. Metoda iz zahtjeva 30, naznačena time da doze imaju najmanje 50 mikrograma.

32. Metoda iz zahtjeva 1, naznačena time da je fragment povezan s molekulom nosača da bi stvorio konjugat.

33. Metoda iz bilo kojeg od zahtjeva 32, naznačena time da je nosač heterologni polipeptid.

34. Metoda iz zahtjeva 32, naznačena time da su višestruke kopije fragmenta povezane s molekulom nosača da bi stvorile konjugat.

35. Metoda iz zahtjeva 32, naznačena time da su višestruke kopije fragmenta povezane s višestrukim kopijama molekule nosača, koje su međusobno povezane.

36. Metoda iz zahtjeva 33, naznačena time da heterologni polipeptid sadržava QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID br:8).

37. Metoda iz zahtjeva 33, naznačena time da heterologni polipeptid sadržava amino kiselinski slijed AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID br:11).

38. Metoda iz zahtjeva 33, naznačena time da polipeptid inducira odgovor T-stanica na heterologni polipeptid i time odgovor B-stanica na fragment.

39. Metoda iz zahtjeva 1, naznačena time da nadalje sadrži primjenu pomoćnog sredstva koje povećava titar i/ili afinitet vezanja induciranih protutijela relativno prema primjeni samoga fragmenta.

40. Metoda iz zahtjeva 39, naznačena time da se pomoćno sredstvo i polipeptid primjenjuju zajedno kao pripravak.

41. Metoda iz zahtjeva 39, naznačena time da se pomoćno sredstvo primjenjuje prije polipeptida.

42. Metoda iz zahtjeva 39, naznačena time da se pomoćno sredstvo primjenjuje nakon polipeptida.

43. Metoda iz zahtjeva 39, naznačena time da je pomoćno sredstvo alum.

44. Metoda iz zahtjeva 39, naznačena time da je pomoćno sredstvo MPL.

45. Metoda iz zahtjeva 39, naznačena time da je pomoćno sredstvo QS-21.

46. Metoda iz zahtjeva 39, naznačena time da je pomoćno sredstvo nepotpuno Freund-ovo pomoćno sredstvo.

47. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da je doza fragmenta veća od 10 mikrograma.

48. Metoda liječenja bolesti povezane s amiloidnim nakupinama Aβ u mozgu pacijenta, sastoji se od primjene učinkovitog režima fragmenta Aβ, naznačena time da fragment inducira protutijela koja se specifično vežu na Aβ na jednom ili više epitopa između ostataka 12 i 43 bez induciranja protutijela koja se specifično vežu na jedan ili više epitopa između ostataka 1-11, te da fragment , 33-42 Aβ13-28, 17-28, 25-35, 35-40 ili 35-42, pri čemu se inducirana protutijela specifično vežu na topljivi Aβ u pacijenta čime se inhibira nastajanje amiloidnih nakupina Aβ u mozgu iz topljivog Aβ, te se tako liječi bolest.

49. Metoda iz zahtjeva 48, naznačena time da fragment nema čitav epitop T-stanica koji inducira odgovor T-stanica na Aβ.

50. Metoda iz zahtjeva 48, naznačena time da inducirana protutijela nemaju kapacitet za specifično vezanje na amiloidne nakupine Aβ.

51. Metoda iz zahtjeva 48, naznačena time da fragment sadrži dio od 5-10 susjednih amino kiselina od Aβ.

52. Metoda iz zahtjeva 48, naznačena time da fragment sadrži dio od 5-10 susjednih amino kiselina unutar Aβ15-24.

53. Metoda iz zahtjeva 48, naznačena time da je fragment odabran iz skupine koja se sastoji od Aβ15-21, Aβ16-22, Aβ17-23, Aβ18-24, Aβ19-25, Aβ15-22, Aβ16-23, Aβ17-24, Aβ18-25, Aβ15-23, Aβ16-24, Aβ17-25, Aβ18-26, Aβ15-24, Aβ16-25, i Aβ15-25.

54. Metoda iz zahtjeva 48, naznačena time da fragment predstavlja C-terminalni fragment koji inducira protutijela koja se specifično vežu na Aβ42 i/ili Aβ43 bez specifičnog vezanja na Aβ39, 40 ili 41.

55. Metoda liječenja bolesti povezane s amiloidnim nakupinama Aβ u mozgu pacijenta sastoji se od primjene učinkovitog režima fragmenta Aβ, naznačena time da je fragment odabran iz skupine koja se sastoji od Aβ15-21, Aβ16-22, Aβ17-23, Aβ18-24, Aβ19-25, Aβ15-22, Aβ16-23, Aβ17-24, Aβ18-25, Aβ15-23, Aβ16-24, Aβ17-25, Aβ18-26, Aβ15-24, Aβ16-25, i Aβ15-25, i time se liječi bolest.

56. Metoda iz zahtjeva 55, naznačena time da metoda nadalje sadrži primjenu fragmenta Aβ koji inducira protutijela koja se specifično vežu na jedan ili više epitopa s Aβ1-11.

57. Metoda iz zahtjeva 56, naznačena time da se fragment Aβ koji inducira protutijela koja se specifično vežu na Aβ na epitopu s Aβ1-11 primjenjuje prije nego što fragment inducira protutijela koja se specifično vežu na Aβ na jednom ili više epitopa između ostataka 12 i 43.

58. Metoda iz zahtjeva 48, naznačena time da nadalje sadrži primjenu protutijela koje se specifično veže na Aβ na epitopu s Aβ1-11.

59. Metoda iz zahtjeva 48, naznačena time da se protutijelo koje se specifično veže na Aβ na epitopu s Aβ1-11 primjenjeuje prije fragmenta koji inducira protutijela koja se specifično vežu na Aβ na jednom ili više epitopa između ostataka 12 i 43.

60. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da je bolest karakterizirana spoznajnim slabljenjem.

61. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da je bolest Alzheimer-ova bolest.

62. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da je bolest Down-ov sindrom.

63. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da je bolest blago spoznajno slabljenje.

64. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da je pacijent ljudsko biće.

65. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da nadalje sadrži praćenje induciranih protutijela u pacijenta.

66. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da je pacijent asimptomatičan.

67. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da je pacijent simptomatičan i da primjena zaustavlja pogoršavanje pacijentovih simptoma.

68. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da je pacijent mlađi od 50 godina.

69. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da pacijent posjeduje naslijeđeni čimbenik rizika koji ukazuje na osjetljivost na Alzheimer-ovu bolest.

70. Metoda iz zahtjeva 66, naznačena time da pacijent nije razvio simptome koji se daju otkriti tijekom pet godina nakon što je prvi puta proveden korak primjene.

71. Metoda iz bilo kojeg od zahtjeva 1-68 i 70, naznačena time da pacijent ne posjeduje poznate čimbenike rizika za Alzeimer-ovu bolest.

72. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da režim sadrži primjenu doze od najmanje 50 mikrograma fragmenta u više dana.

73. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da se fragment primjenjuje s pomoćnim sredstvom koje povećava nivo protutijela koje je inducirao fragment.

74. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da se fragment primjenjuje intraperitonejski, oralno, intranazalno, supkutano, intramuskularno, topički ili intravenski.

75. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da se fragment primjenjuje putem primjene polinukleotida koji kodira fragment, pri čemu se polinukleotid eksprimira da bi proizveo fragment u pacijenta.

76. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da nadalje sadrži praćenje pacijenta vezano za nivo induciranih protutijela u krvi pacijenta.

77. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da se fragment primjenjuje u višestrukim dozama tijekom perioda od najmanje tri mjeseca.

78. Metoda iz zahtjeva 77, naznačena time da doze imaju najmanje 50 mikrograma.

79. Metoda iz zahtjeva 55, naznačena time da je fragment povezan s molekulom nosača da bi stvorio konjugat.

80. Metoda iz bilo kojeg od zahtjeva 79, naznačena time da je nosač heterologni polipeptid.

81. Metoda iz zahtjeva 79, naznačena time da su višestruke kopije fragmenta povezane s molekulom nosača da bi stvorile konjugat.

82. Metoda iz zahtjeva 79, naznačena time da su višestruke kopije fragmenta povezane s višestrukim kopijama molekule nosača, koje su međusobno povezane.

83. Metoda iz zahtjeva 80, naznačena time da heterologni polipeptid sadržava QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID br:8).

84. Metoda iz zahtjeva 80, naznačena time da heterologni polipeptid sadržava amino kiselinski slijed AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID br:11).

85. Metoda iz zahtjeva 80, naznačena time da polipeptid inducira odgovor T-stanica na heterologni polipeptid i time odgovor B-stanica na fragment.

86. Metoda iz zahtjeva 55, naznačena time da nadalje sadrži primjenu pomoćnog sredstva koje povećava titar i/ili afinitet vezanja induciranih protutijela relativno prema primjeni samoga fragmenta.

87. Metoda iz zahtjeva 86, naznačena time da se pomoćno sredstvo i polipeptid primjenjuju zajedno kao pripravak.

88. Metoda iz zahtjeva 86, naznačena time da se pomoćno sredstvo primjenjuje prije polipeptida.

89. Metoda iz zahtjeva 86, naznačena time da se pomoćno sredstvo primjenjuje nakon polipeptida.

90. Metoda iz zahtjeva 86, naznačena time da je pomoćno sredstvo alum.

91. Metoda iz zahtjeva 86, naznačena time da je pomoćno sredstvo MPL.

92. Metoda iz zahtjeva 86, naznačena time da je pomoćno sredstvo QS-21.

93. Metoda iz zahtjeva 86, naznačena time da je pomoćno sredstvo nepotpuno Freund-ovo pomoćno sredstvo.

94. Metoda iz bilo kojeg od prethodnih zahtjeva, naznačena time da je doza fragmenta veća od 10 mikrograma.

95. Farmaceutski pripravak naznačen time da sadrži fragment Aβ kao što je definirano u bilo kojem od zahtjeva 48-55 te pomoćno sredstvo.

96. Uporaba fragmenta Aβ učinkovitog za liječenje ili učinak na spriječavanje bolesti povezane s amiloidnim nakupinama Aβ u mozgu pacijenta za proizvodnju lijeka, naznačena time da Aβ fragment inducira protutijela koja se specifično vežu na Aβ na jednom ili više epitopa između ostataka 12 i 43 bez induciranja protutijela koja se specifično vežu na jedan ili više epitopa između ostataka 1-11, te da fragment nije Aβ13-28, 17-28, 25-35, 35-40 ili 35-42, pri čemu se inducirana protutijela specifično vežu na topljivi Aβ u pacijenta čime se inhibira nastajanje amiloidnih nakupina Aβ u mozgu iz topljivog Aβ, te tako utječe na spriječavanje bolesti.

97. Uporaba zahtjeva 96, naznačena time da fragment nema čitav epitop T-stanica koji inducira odgovor T-stanica na Aβ.

98. Uporaba zahtjeva 96, naznačena time da inducirana protutijela nemaju kapacitet za specifično vezanje na amiloidne nakupine Aβ.

99. Uporaba zahtjeva 96, naznačena time da fragment sadrži dio od 5-10 susjednih amino kiselina od Aβ.

100. Uporaba zahtjeva 96, naznačena time da fragment sadrži dio od 5-10 susjednih amino kiselina unutar Aβ15-24.

101. Uporaba zahtjeva 96, naznačena time da je fragment odabran iz skupine koja se sastoji od Aβ15-21, Aβ16-22, Aβ17-23, Aβ18-24, Aβ19-25, Aβ15-22, Aβ16-23, Aβ17-24, Aβ18-25, Aβ15-23, Aβ16-24, Aβ17-25, Aβ18-26, Aβ15-24, Aβ16-25, i Aβ15-25.

102. Uporaba zahtjeva 96, naznačena time da fragment predstavlja C-terminalni fragment koji inducira protutijela koja se specifično vežu na Aβ42 i/ili Aβ43 bez specifičnog vezanja na Aβ39, 40 ili 41.